RU2746503C1 - Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме - Google Patents

Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме Download PDF

Info

Publication number
RU2746503C1
RU2746503C1 RU2019132947A RU2019132947A RU2746503C1 RU 2746503 C1 RU2746503 C1 RU 2746503C1 RU 2019132947 A RU2019132947 A RU 2019132947A RU 2019132947 A RU2019132947 A RU 2019132947A RU 2746503 C1 RU2746503 C1 RU 2746503C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
plasma
sample
solvent
analysis
group
Prior art date
Application number
RU2019132947A
Other languages
English (en)
Inventor
Джэн Дж. ШИХ
Original Assignee
Медибикон Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Медибикон Инк. filed Critical Медибикон Инк.
Application granted granted Critical
Publication of RU2746503C1 publication Critical patent/RU2746503C1/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/22—Injection in high pressure liquid systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D229/00—Heterocyclic compounds containing rings of less than five members having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/884—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/145555—Hetero-N
    • Y10T436/147777—Plural nitrogen in the same ring [e.g., barbituates, creatinine, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к способам измерения количества флуоресцентного соединения в плазме. В одном варианте способ включает измерение количества флуоресцентного соединения - МВ-102, для чего осуществляют сбор образца плазмы, разбавление образца плазмы по меньшей мере одним растворителем, анализ разбавленного образца при помощи ВЭЖХ для измерения, таким образом, количества соединения в плазме, причем образец плазмы не сушат перед анализом ВЭЖХ и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта. В другом варианте способ включает измерение количества флуоресцентного соединения - МВ-102, для чего осуществляют сбор образца плазмы, добавление к образцу по меньшей мере одного растворителя, вызывая, таким образом, осаждение белков плазмы, удаление осажденных белков плазмы из образца и анализ образца при помощи ВЭЖХ для измерения, таким образом, количества соединения в плазме, причем образец не сушат перед анализом ВЭЖХ и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта. Группа изобретений обеспечивает создание простого и точного способа измерения количества флуоресцентного соединения в плазме. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 12 ил., 3 табл., 14 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США сер. № 62/588606, поданной 20 ноября 2017 года, содержание которой полностью включено посредством ссылки.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Область изобретения в целом относится к детекции и количественному определению флуоресцентного соединения в плазме. Более конкретно, заявка относится к способам анализа и количественного определения (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азандиил))бис(3–гидроксипропановой кислоты) в плазме пациента.
[0003] Анализ низкомолекулярных лекарственных средств в плазме пациента часто требуется как во время, так и после клинических испытаний. Во время клинических испытаний необходимо установить правильную дозу лекарственного средства, чтобы оптимизировать эффективность и минимизировать побочные эффекты. В некоторых случаях слишком малое количество лекарственного средства (то есть минимальная эффективность и терапевтический эффект) может быть таким же вредным, как и слишком большое (то есть неблагоприятные побочные эффекты).
[0004] Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) в почках широко признана как наиболее надежный показатель почечной функции у пациента. Таким образом, существует медицинская потребность в точном измерении СКФ в реальном времени для оценки функции почек в связи с острой или хронической почечной недостаточностью. В настоящее время общепринятой клинической практикой оценки функции почек является измерение уровня креатинина в сыворотке и его 24–часового клиренса для получения расчетной СКФ (рСКФ) на основании уравнений для определения СКФ Фергюсона и Вайкара или Инкера и соавт. Однако недостатком этого метода является отсутствие соответствующей чувствительности и точности, а также задержка во времени из–за того, что необходимо время для обработки образцов в подходящей лаборатории. Кроме того, результаты значительно различаются в зависимости от таких факторов, как возраст, восполнение дефицита воды, мышечная масса, режим питания и т.д.
[0005] Экзогенные радиоизотопные индикаторы СКФ, такие как йогексол (Omnipaque®), показанный на Фиг. 1, обеспечивают достоверную оценку СКФ. Йогексол не метаболизируется и не накапливается в органах пациента. Его распределение соответствует простому градиенту концентрации по капиллярам, и он полностью удаляется путем простой клубочковой фильтрации без канальцевой почечной секреции или реабсорбции. Чтобы использовать йогексол для определения СКФ, образцы крови собирают у пациента в разные моменты времени, после чего проводят тщательный лабораторный анализ. Значение СКФ определяют при помощи PK–анализа данных с использованием моделирующего и имитационного программного обеспечения WinNonlin PK/PD. Это трудоемкий процесс, который предъявляет значительные требования к медицинскому и лабораторному персоналу. Это также требует большого количества времени, поскольку необходимо собрать несколько образцов в течение нескольких часов в дополнение к лабораторному анализу, необходимому впоследствии.
[0006] Хроническая болезнь почек (ХБП) представляет собой медицинское состояние, характеризующееся постепенной потерей функции почек с течением времени. Она включает состояния, которые повреждают почки и уменьшают их способность должным образом удалять продукты жизнедеятельности из кровотока индивидуума. Осложнения ХБП включают высокое кровяное давление, анемию (низкий уровень эритроцитов), слабость костей, плохое алиментарное здоровье, повреждение нервов и повышенный риск сердечных заболеваний. По данным Национального Почечного Фонда, примерно две трети всех случаев ХБП вызваны диабетом или гипертензией. Помимо семейного анамнеза, другие факторы риска заболевания почек включают возраст, этническую принадлежность, гипертензию и диабет. СКФ является лучшим тестом для определения уровня функции почек и оценки стадии ХБП у пациента.
[0007] СКФ является важным тестом для определения уровня функции почек, который определяет стадию ХБП. Как показано ниже, чем ниже СКФ у пациента, тем серьезнее ХБП.
Стадия Описание СКФ
При повышенном риске Увеличение факторов риска (например, диабет, высокое кровяное давление, семейный анамнез, возраст, этническая принадлежность) > 90
1 Поражение почек с нормальной функцией почек > 90
2 Поражение почек с небольшой потерей функции почек 60–89
3a Потеря функции почек от легкой до средней степени 44–59
3b Потеря функции почек от средней до тяжелой степени 30–43
4 Тяжелая степень потери функции почек 15–29
5 Почечная недостаточность; требуется диализ < 15
[0008] Много усилий было направлено на поиск экзогенных флуоресцентных веществ, которые можно обнаружить трансдермально в режиме реального времени. См. US 9480687, US 9114160, US 8722685, US 8115000 и US 8778309 для руководства по этой теме; каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. В дополнение ко многим другим малым молекулам было синтезировано MB–102, флуоресцентное соединение, которое демонстрирует превосходные фотофизические свойства и другие химические и физические характеристики.
[0009] Соединение MB–102, (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азандиил))бис(3–гидроксипропановая кислота), показанное на Фиг. 1, представляет собой находящееся в процессе разработки флуоресцентное средство для определения СКФ в режиме реального времени. Оно излучает сильный флуоресцентный сигнал при 556 нм при возбуждении при 434 нм и в настоящее время проходит клиническое исследование на людях. Важно отметить, что количество MB–102, циркулирующего в кровотоке пациента, и скорость, с которой он выводится почечной фильтрацией, можно измерять трансдермально в режиме реального времени. Это устраняет необходимость в занимающем много времени сборе образцов и лабораторном анализе, позволяя медицинскому персоналу оценивать в реальном времени функцию почек у пациента. Таким образом, существует потребность в проверке точности методов, используемых для определения количества MB–102 в плазме или кровотоке пациента.
[0010] Лабораторный анализ образцов плазмы часто включает осаждение белка, испарение и сушку с последующим восстановлением в растворителе, совместимом с ВЭЖХ. Это трудоемкий процесс, который увеличивает время, необходимое для получения результатов. Другим недостатком методов осаждения белка является необходимость внутреннего стандарта в образце для обеспечения точных результатов. Эти шаги увеличивают время, необходимое для анализа, и создают возможности для ошибок. Таким образом, существует необходимость как в сокращении времени, необходимого для анализа, так и в уменьшении вероятности ошибок.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] В одном аспекте, в настоящей заявке раскрыт способ для измерения количества флуоресцентного соединения в плазме. Способ включает сбор образца плазмы, разбавление образца плазмы по меньшей мере одним растворителем и анализ разбавленного образца при помощи ВЭЖХ, измеряя таким образом количество соединения в плазме. Образец плазмы не сушат перед ВЭЖХ анализом и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта.
[0012] В другом аспекте, в настоящей заявке раскрыт способ для измерения количества флуоресцентного соединения в плазме. Способ включает сбор образца плазмы пациента, добавление к образцу по меньшей мере одного растворителя, вызывая осаждение белков плазмы, удаление осажденных белков плазмы из образца и анализ образца при помощи ВЭЖХ, измеряя таким образом количество соединения в плазме. Образец не сушат перед ВЭЖХ анализом и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0013] Фиг. 1 иллюстрирует структуры MB–102 и йогексола.
[0014] Фиг. 2 представляет собой наложение ВЭЖХ хроматограмм MB–102 при 3,3 нг/мл в 1% плазмы/PBS и контрольного раствора (1% плазмы/PBS).
[0015] Фиг. 3A и 3B иллюстрируют сигнал/шум, коэффициент асимметрии по USP и число теоретических тарелок в соответствии с USP для MB–102 при 0,4 нг/мл в 1% плазмы/PBS для двух различных образцов.
[0016] Фиг. 4 представляет чистоту пика MB–102, добавленного в 1X PBS.
[0017] Фиг. 5 представляет чистоту пика MB–102 в образце плазмы после получения стандартного образца.
[0018] Фиг. 6 представляет график корреляции MB–102 в плазме, полученной от пациентов, на основании результатов испытаний в контрактной лаборатории GMP по сравнению с результатами анализа в собственной лаборатории.
[0019] Фиг. 7 представляет результаты фармакокинетического анализа MB–102 у 12 пациентов в клинических испытаниях.
[0020] Фиг. 8a, 8b и 8c представляют графики, сравнивающие скорости клиренса MB–102 и йогексола у трех пациентов в клинических испытаниях.
[0021] Фиг. 9 представляет график корреляции MB–102 в плазме на основании результатов испытаний либо методом прямого разбавления, либо методом осаждения белка.
[0022] Фиг. 10 представляет график корреляции концентрации MB–102 в плазме, определенной методом прямого разбавления, для образцов, протестированных в собственной лаборатории, в сравнении с образцами, протестированными в контрактной лаборатории GMP.
[0023] Фиг. 11 представляет график корреляции концентрации MB–102 в образцах плазмы, показывающих гемолиз (уровни гемоглобина между 50 мг/дл и 100 мг/дл), протестированных методом прямого разбавления и методом осаждения белка.
[0024] Фиг. 12 представляет график корреляции концентрации MB–120 в образцах плазмы, показывающих гемолиз (уровни гемоглобина между 100 мг/дл и 250 мг/дл), протестированных методом прямого разбавления и осаждения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0025] В настоящей заявке раскрыт способ контроля концентрации флуоресцентного соединения у нуждающегося в этом пациента. Способ включает получение образца плазмы, разбавление образца плазмы по меньшей мере одним растворителем и анализ разбавленного образца при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Важно отметить, что образец не был высушен перед анализом, и при получении образца не был добавлен внутренний стандарт.
[0026] В некоторых вариантах осуществления флуоресцентное соединение представляет собой соединение формулы I, раскрытое в настоящей заявке. Предпочтительно, соединение представляет собой (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азандиил))бис(3–гидроксипропановую кислоту) (MB–102) или ее фармацевтически приемлемую соль, показанную ниже:
Figure 00000001
.
[0027] В некоторых вариантах осуществления образец плазмы получают путем взятия образца крови у пациента и собирают плазму с использованием способов, известных в данной области техники. Плазма может быть получена от человека, животного или из исследования in vitro. Примеры животных, от которых может быть получена плазма, включают, но не ограничиваются этим, собак, кошек, коров, лошадей, свиней, коз, обезьян, крыс и мышей. Предпочтительно, плазму получают от человека. Плазму можно немедленно проанализировать на флуоресцентное соединение или можно хранить для анализа, который будет проводиться через некоторое время. Если образец плазмы хранят для последующего анализа, хранение образца осуществляют так, чтобы минимизировать его разложение. Одним из способов хранения является замораживание образца при температуре –80°С или ниже. Другие способы хранения, признанные в данной области техники, которые предотвращают разложение образца, являются приемлемыми и охватываются настоящим изобретением.
[0028] Перед ВЭЖХ анализом образец разбавляют по меньшей мере одним растворителем. Растворитель может быть водным или органическим. В некоторых аспектах водный растворитель представляет собой насыщенный солевой раствор. В некоторых аспектах используют более одного растворителя. Каждый из растворителей может быть водным или неводным и выбран независимо от другого.
[0029] В некоторых аспектах водный растворитель находится в форме буфера, выбранного из группы, состоящей из фосфата, ацетата, бикарбоната, карбоната, формиата, глюконата, лактата, цитрата, сульфоната, аммония, гуанидиния, HEPES, какодилата, Tris, tris–HCl, малеата, бората, глицината, сукцината, PIPES и любой их комбинации. Предпочтительно, водный растворитель представляет собой фосфатно–солевой буферный раствор (PBS).
[0030] Подходящие неводные растворители включают, но не ограничиваются этим, метанол, этанол, этиленгликоль, этилацетат, гексан, хлороформ, DMF, DMSO, уксусную кислоту, ацетон, ацетонитрил, бутанол, тетрахлорид углерода, диэтиленгликоль, диэтиловый эфир, DME, этиленгликоль, метиленхлорид, нитрометан, петролейный эфир, пропанол, пиридин, толуол, MTBE, триэтиламин, ксилол и бензол. Предпочтительно, органический растворитель смешивается с водой. Наиболее предпочтительно, органический растворитель представляет собой метанол, этанол, ацетонитрил или DMSO. В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой метанол.
[0031] рН буфера должен быть совместим с системой растворителей ВЭЖХ и не вызывать разложения образца плазмы в течение периода времени, необходимого для проведения ВЭЖХ анализа. В некоторых аспектах pH будет составлять от около 2 до 12. В еще одном аспекте pH водного растворителя будет составлять около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11 или около 12. В контексте настоящей заявки термин “около” в отношении рН означает ± 0,5 единиц. В еще одном аспекте pH водного образца примерно соответствует физиологическому значению pH, приблизительно между 7,0 и 7,4.
[0032] Разбавление образца плазмы растворителем нужно осуществлять так, чтобы концентрацию флуоресцентного соединения в плазме можно было легко анализировать при помощи ВЭЖХ. Как известно в данной области техники, если концентрация аналита слишком высока, это может привести к перегрузке колонки и детектора. Это может привести к размыванию границы пика и изменениям времени удерживания аналитов, что может привести к ошибкам в количественном определении и идентификации. Если концентрация аналита слишком низкая, сигнал может быть потерян из–за фонового шума и неправильно определен. Следует избегать любой такой ситуации, чтобы методы, раскрытые в настоящей заявке, давали точные результаты. Нередко образец анализируют только для того, чтобы определить, что концентрация аналитов слишком высока. В таких случаях образец снова разбавляют и повторно анализируют. В некоторых аспектах образец плазмы разбавляют растворителем в соотношении 1:1 об/об (образец:растворитель). В еще одном аспекте соотношение при разбавлении составляет от 1:(0,1–100) об/об. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении составляет от (0,1–100):1 об/об. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении (об/об) составляет 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900 или 1:1000.
[0033] В еще одном аспекте способа для измерения концентрации флуоресцентного соединения в плазме пациента, раскрытого в настоящей заявке, способ включает получение образца плазмы от пациента, добавление по меньшей мере одного растворителя к образцу, чтобы вызвать осаждение белков, удаление осажденных белков из образца и анализ образца при помощи ВЭЖХ. Важно отметить, что образец не был высушен перед анализом и при получении образца не был добавлен внутренний стандарт.
[0034] Флуоресцентное соединение может представлять собой флуоресцентный краситель. Флуоресцентные красители по настоящему изобретению обычно имеют длины волн поглощения, возбуждения и эмиссии, которые находятся в ближней инфракрасной (NIR) или видимой областях спектра около 350 нм или более. Это полезно для диагностических процедур, так как свет видимой и NIR области спектра вряд ли может повредить ткани. Свет, имеющий длину волны около 350 нм или более, имеет тенденцию проникать в ткани, позволяя проводить диагностические процедуры в интересующих тканях, которые могут быть недоступны при использовании ультрафиолетовых волн с длиной волны менее чем около 350 нм. Подходящие флуоресцентные красители включают акридины, акридоны, антрацены, антрациновые линии, антрахиноны, азаазулены, азоазулены, бензолы, бензимидазолы, бензофураны, бензоиндокарбоцианины, бензоиндолы, бензотиофены, карбазолы, кумарины, цианины, дибензофураны, дибензотиофены, дирирроло красители, флавоны, флуоресцеины, имидазолы, индокарбоцианины, индоцианины, индолы, изоиндолы, изохинолины, нафтацендионы, нафталины, нафтохиноны, фенантрены, фенантридины, фенантридины, феноселеназины, фенотиазины, феноксазины, фенилксантены, полифторбензолы, пурины, пиразины, пиразолы, пиридины, пиримидоны, пирролы, квантовые точки, хинолины, хинолоны, родамины, сквараины, тетрацены, тиофены, трифенилметановые красители, ксантены, ксантоны и их производные.
[0035] В некоторых вариантах осуществления флуоресцентное соединение представляет собой соединение формулы I, раскрытое в настоящей заявке. Предпочтительно соединение представляет собой (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азандиил))бис(3–гидроксипропановую кислоту) (“MB–102”) или ее фармацевтически приемлемую соль, показанную ниже:
Figure 00000002
.
[0036] В некоторых вариантах осуществления образец плазмы получают путем взятия образца крови у пациента и плазму выделяют с использованием способов, известных в данной области техники. Плазму можно немедленно проанализировать на флуоресцентное соединение или можно хранить для анализа, который будет проводиться через некоторое время. Если образец плазмы хранят для последующего анализа, хранение образца осуществляют так, чтобы минимизировать его разложение. Одним из способов хранения является замораживание образца при температуре –80°С или ниже. Другие способы хранения, признанные в данной области техники, которые предотвращают разложение образца, являются приемлемыми и охватываются настоящим изобретением.
[0037] В некоторых вариантах осуществления растворитель, который добавляют, чтобы вызвать осаждение белков, представляет собой органический растворитель, выбранный из группы, состоящей из метанола, этанола, этиленгликоля, этилацетата, гексана, хлороформа, DMF, DMSO, уксусной кислоты, ацетона, ацетонитрила, бутанола, тетрахлорида углерода, диэтиленгликоля, диэтилового эфира, DME, этиленгликоля, метиленхлорида, нитрометана, петролейного эфира, пропанола, пиридина, толуола, MTBE, триэтиламина, ксилола и бензола. В некоторых аспектах используют более одного растворителя. Каждый из растворителей может быть водным или неводным и выбран независимо от другого.
[0038] Удаление осажденных белков осуществляют с использованием способов, известных в данной области. Фильтрация и центрифугирование являются двумя способами, охватываемыми настоящим изобретением.
[0039] После удаления осажденных белков образец анализируют непосредственно, или его можно разбавить дополнительным растворителем. Растворитель, используемый для разбавления, может быть водным, неводным или любой их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления водный растворитель представляет собой насыщенный солевой раствор. В еще одном аспекте растворитель представляет собой буфер, выбранный из группы, состоящей из фосфата, ацетата, бикарбоната, карбоната, формиата, глюконата, лактата, цитрата, сульфоната, аммония, гуанидиния, HEPES, какодилата, Tris, tris–HCl, малеата, бората, глицината, сукцината, PIPES и любой их комбинации. Предпочтительно, водный растворитель представляет собой фосфатно–солевой буферный раствор.
[0040] рH водной системы растворителей должен быть совместим с системой растворителей ВЭЖХ и не вызывать разложения образца плазмы в течение периода времени, необходимого для проведения ВЭЖХ анализа. В некоторых аспектах pH будет между около 2 и 12. В еще одном аспекте pH водного растворителя будет составлять около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11 или около 12. В данном контексте, “около” в отношении рН означает ± 0,5 единиц. В еще одном аспекте pH водного образца примерно соответствует физиологическому значению pH, между 7,0 и 7,4.
[0041] В еще одном аспекте растворитель, используемый для разбавления образца перед анализом, представляет собой органический неводный растворитель. Подходящие органические неводные растворители включают, но не ограничиваются этим, метанол, этанол, этиленгликоль, этилацетат, гексан, хлороформ, DMF, DMSO, уксусную кислоту, ацетон, ацетонитрил, бутанол, тетрахлорид углерода, диэтиленгликоль, диэтиловый эфир, DME, этиленгликоль, метиленхлорид, нитрометан, петролейный эфир, пропанол, пиридин, толуол, MTBE, триэтиламин, ксилол и бензол. Предпочтительно, органический растворитель смешивается с водой. Наиболее предпочтительно, органический растворитель представляет собой метанол, этанол, ацетонитрил или DMSO. В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой метанол.
[0042] В еще одном аспекте растворитель, используемый для разбавления образца, включает по меньшей мере два разных растворителя, выбранных из любых возможных комбинаций водных и органических растворителей, раскрытых в настоящей заявке. Кроме того, поскольку для анализа используют ВЭЖХ, систему растворителей выбирают таким образом, чтобы она не мешала детекции аналита.
[0043] Количество растворителя, используемого для осаждения белков и/или подготовки образца для ВЭЖХ анализа, будет варьироваться в зависимости от образца. Как обсуждалось выше, количество необходимого растворителя будет регулироваться таким образом, чтобы ВЭЖХ обеспечивала точные результаты. Этот метод может включать два разведения: а) добавление растворителя, чтобы вызвать осаждение белков, и b) добавление растворителя к супернатанту после удаления осажденных белков. В этом методе объединенное количество растворителя, добавляемого для этих двух стадий, будет влиять на концентрацию аналита в ВЭЖХ анализе. Общее количество растворителя, добавляемого к образцу плазмы, должно быть таким, чтобы концентрация аналита не была слишком высокой или слишком низкой. В некоторых аспектах, образец плазмы разбавляют растворителем в соотношении 1:1 об/об (образец:растворитель), где это относится к отношению образца к объединенному объему растворителей в обоих разведениях. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении составляет от 1:(0,1–100) об/об. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении составляет от (0,1–100):1 об/об. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении (об/об) составляет от 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900 или 1:1000. Соотношение растворителей, используемых в двух разбавлениях может составлять от (0,1–100):(100–0,1) об/об относительно друг друга. В некоторых аспектах может использоваться только стадия разбавления для осаждения белков. Концентрация образца после осаждения белков может быть такой, что не требуется никакого дальнейшего разбавления.
[0044] Как известно в данной области техники, гемолиз крови может быть проблемой при сборе образцов крови у пациента. Существует множество причин гемолиза крови, включая сложность сбора образцов, небезопасные линии, загрязнение, неправильный размер иглы, неправильное смешивание пробирок, неправильно заполненные пробирки для образцов и хранение образцов. Любой гемолиз крови в собранном образце может помешать осуществлению анализа плазмы. Известно, что гемолиз приводит к неточным результатам лабораторных исследований во многих различных видах анализа из–за загрязнения плазмы содержимым гемолизированных эритроцитов. После гемолиза гемоглобин высвобождается в плазму или сыворотку пробы. Одним из общих признаков гемолиза является изменение цвета в плазме или сыворотке пациента. Приблизительную оценку количества гемоглобина в плазме или сыворотке, таким образом, наличие или отсутствие гемолиза, можно сделать визуально, используя таблицу цветов, найденную по ссылке:
http://blog.fisherbioservices.com/avoiding–hemolysis–in–blood–sample–collection–and–processing, содержание которой включено в качестве ссылки. Еще одним признаком гемолиза является уменьшение мутности образца крови из–за уменьшения количества эритроцитов, которые вызывают рассеяние света.
[0045] В некоторых аспектах способы измерения концентрации флуоресцентного соединения в плазме пациента применяют к образцу, где произошел по меньшей мере некоторый гемолиз. В еще одном аспекте способы измерения концентрации MB–102 в плазме пациента применяют к образцам плазмы, где произошел частичный или полный гемолиз.
[0046] В некоторых вариантах осуществления, раскрытых в настоящей заявке, флуоресцентное соединение представляет собой молекулу пиразина формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, где
Figure 00000003
каждый из X1 и X2 независимо представляет собой –CO2R1, –CONR1R2, –CO(AA) или –CONH(PS); каждый из Y1 и Y2 независимо выбран из группы, состоящей из –NR1R2 и
Figure 00000004
;
Z1 представляет собой простую связь, –CR1R2–, –O–, –NR1–, –NCOR1–, –S–, –SO– или –SO2–; каждый из R1 – R2 независимо выбраны из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aH, –CH2(CHOH)aCH3, –CH2(CHOH)aCO2H, –(CHCO2H)aCO2H, –(CH2CH2O)cH, –(CH2CH2O)cCH3, –(CH2)aSO3H, –(CH2)aSO3 –, –(CH2)aSO2H, –(CH2)aSO2 –, –(CH2)aNHSO3H, –(CH2)aNHSO3 –, –(CH2)aNHSO2H, –(CH2)aNHSO2 –,–(CH2)aPO4H3, –(CH2)aPO4H2 –, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO4 3–, –(CH2)aPO3H2, –(CH2)aPO3H– и –(CH2)aPO3 2–; AA представляет собой пептидную цепь, включающую одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из природных и неприродных аминокислот, связанных вместе пептидными или амидными связями, и каждый случай AA может быть таким же или отличаться от любого другого случая; PS представляет собой сульфатированную или несульфатированную полисахаридную цепь, включающую одно или несколько моносахаридных звеньев, связанных гликозидными связями; и ‘a’ представляет собой число от 1 до 10, ‘c’ представляет собой число от 1 до 100, и каждый из ‘m’ и ‘n’ независимо представляет собой число от 1 до 3. В некоторых аспектах по меньшей мере один из X1 и X2 представляет собой –CO(PS) или –CO(AA). В еще одном аспекте оба X1 и X2 представляют собой –CO(AA).
[0047] (AA) представляет собой пептидную цепь, включающую одну или несколько природных или неприродных аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Пептидная цепь (АА) может представлять собой одну аминокислоту, гомополипептидную цепь или гетерополипептидную цепь и может иметь любую подходящую длину. В некоторых вариантах осуществления природная или неприродная аминокислота представляет собой α–аминокислоту. В еще одном аспекте α–аминокислота представляет собой D–α–аминокислоту или L–α–аминокислоту. В полипептидной цепи, включающей две или более аминокислот, каждая аминокислота выбрана независимо от другой(других) во всех аспектах, включая, но не ограничиваясь этим, структуру боковой цепи и стереохимию. Например, в некоторых вариантах осуществления пептидная цепь может включать 1–100 аминокислот, 1–90 аминокислот, 1–80 аминокислот, 1–70 аминокислот, 1–60 аминокислот, 1–50 аминокислот, 1–40 аминокислот, 1–30 аминокислот, 1–20 аминокислот или даже 1–10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидная цепь может включать 1–100 α–аминокислот, 1–90 α–аминокислот, 1–80 α–аминокислот, 1–70 α–аминокислот, 1–60 α–аминокислот, 1–50 α–аминокислот, 1–40 α–аминокислот, 1–30 α–аминокислот, 1–20 α–аминокислот или даже 1–10 α–аминокислот. В некоторых вариантах осуществления аминокислота выбрана из группы, состоящей из D–аланина, D–аргинина, D–аспарагина, D–аспарагиновой кислоты, D–цистеина, D–глутаминовой кислоты, D–глутамина, глицина, D–гистидина, D–гомосерина, D–изолейцина, D–лейцина, D–лизина, D–метионина, D–фенилаланина, D–пролина, D–серина, D–треонина, D–тирозина, D–триптофана и D–валина. В некоторых вариантах осуществления α–аминокислоты пептидной цепи (AA) выбраны из группы, состоящей из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутамина, глутаминовой кислоты, гистидина, гомосерина, лизина и серина. В некоторых вариантах осуществления, α–аминокислоты пептидной цепи (AA) выбраны из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, гомосерина и серина. В некоторых вариантах осуществления пептидная цепь (АА) относится к одной аминокислоте (например, D–аспарагиновой кислоте или D–серину).
[0048] В некоторых вариантах осуществления (АА) представляет собой одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из 21 незаменимой аминокислоты. В других аспектах AA выбран из группы, состоящей из D–аргинина, D–аспарагина, D–аспарагиновой кислоты, D–глутамина, D–глутаминовой кислоты, D–гистидина, D–гомосерина, D–лизина и D–серина. Предпочтительно, AA представляет собой D–аспарагиновую кислоту, глицин, D–серин или D–тирозин. Наиболее предпочтительно, АА представляет собой D–серин.
[0049] В некоторых вариантах осуществления (AA) представляет собой β–аминокислоту. Примеры β–аминокислот включают, но не ограничиваются этим, β–фенилаланин, β–аланин, 3–амино–3–(3–бромфенил)пропионовую кислоту, 3–аминобутановую кислоту, цис–2–амино–3–циклопентен–1–карбоновую кислоту, транс–2–амино–3–циклопентен–1–карбоновую кислоту, 3–аминоизомасляную кислоту, 3–амино–2–фенилпропионовую кислоту, 3–амино–4–(4–бифенилил)масляную кислоту, цис–3–амино–циклогексанкарбоновую кислоту, транс–3–амино–циклогексанкарбоновую кислоту, 3амино–циклопентанкарбоновую кислоту, 3–амино–2–гидрокси–4–фенилмасляную кислоту, 2–(аминометил)фенилуксусную кислоту, 3–амино–2–метилпропионовую кислоту, 3–амино–4–(2–нафтил)масляную кислоту, 3–амино–5–фенилпентановую кислоту, 3–амино–2–фенилпропионовую кислоту, 4–бром–β–Phe–OH, 4–хлор–β–ГомоPhe–OH, 4–хлор–β–Phe–OH, 2–циано–β–ГомоPhe–OH, 2–циано–β–ГомоPhe–OH, 4–циано–β–ГомоPhe–OH, 3–циано–β–Phe–OH, 4–циано–β–Phe–OH, 3,4–диметокси–β–Phe–OH, γ,γ–дифенил–β–ГомоAla–OH, 4–фтор–β–Phe–OH, β–Gln–OH, β–ГомоAla–OH, β–ГомоArg–OH, β–ГомоGln–OH, β–ГомоGlu–OH, β–ГомоHyp–OH, β–ГомоLeu–OH, β–ГомоLys–OH, β–ГомоMet–OH, β2–гомофенилаланин, β–ГомоPhe–OH, β3–ГомоPro–OH, β–ГомоSer–OH, β–ГомоThr–OH, β–ГомоTrp–OH, β–ГомоTrp–OMe, β–ГомоTyr–OH, β–Leu–OH, β–Leu–OH, β–Lys(Z)–OH, 3–метокси–β–Phe–OH, 3–метокси–β–Phe–OH, 4–метокси–β–Phe–OH, 4–метил–β–ГомоPhe–OH, 2–метил–β–Phe–OH, 3–метил–β–Phe–OH, 4–метил–β–Phe–OH, β–Phe–OH, 4–(4–пиридил)–β–ГомоAla–OH, 2–(трифторметил)–β–ГомоPhe–OH, 3–(трифторметил)–β–ГомоPhe–OH, 4–(трифторметил)–β–ГомоPhe–OH, 2–(трифторметил)–β–Phe–OH, 3–(трифторметил)–β–Phe–OH, 4–(трифторметил)–β–Phe–OH, β–Tyr–OH, Этил 3–(бензиламино)пропионат, β–Ala–OH, 3–(амино)–5–гексеновую кислоту, 3–(амино)–2–метилпропионовую кислоту, 3–(амино)–2–метилпропионовую кислоту, 3–(амино)–4–(2–нафтил)масляную кислоту, 3,4–дифтор–β–ГомоPhe–OH, γ,γ–дифенил–β–ГомоAla–OH, 4–фтор–β–ГомоPhe–OH, β–Gln–OH, β–ГомоAla–OH, β–ГомоArg–OH, β–ГомоGln–OH, β–ГомоGlu–OH, β–ГомоHyp–OH, β–ГомоIle–OH, β–ГомоLeu–OH, β–ГомоLys–OH, β–ГомоMet–OH, β–ГомоPhe–OH, β3–гомопролин, β–ГомоThr–OH, β–ГомоTrp–OH, β–ГомоTyr–OH, β–Leu–OH, 2–метил–β–ГомоPhe–OH, 3–метил–β–ГомоPhe–OH, β–Phe–OH, 4–(3–пиридил)–β–ГомоAla–OH, 3–(трифторметил)–β–ГомоPhe–OH, β–Глутаминовую кислоту, β–Гомоаланин, β–Гомоглутаминовую кислоту, β–Гомоглутамин, β–Гомогидроксипролин, β–Гомоизолейцин, β–Гомолейцин, β–Гомометионин, β–Гомофенилаланин, β–Гомопролин, β–Гомосерин, β–Гомотреонин, β–Гомотриптофан, β–Гомотирозин, β–Лейцин, β–Фенилаланин, Пирролидин–3–карбоновую кислоту и β–Dab–OH.
[0050] (PS) представляет собой сульфатированную или несульфатированную полисахаридную цепь, включающую одно или несколько моносахаридных звеньев, связанных гликозидными связями. Полисахаридная цепь (PS) может иметь любую подходящую длину. Например, в некоторых вариантах осуществления полисахаридная цепь может включать 1–100 моносахаридных звеньев, 1–90 моносахаридных звеньев, 1–80 моносахаридных звеньев, 1–70 моносахаридных звеньев, 1–60 моносахаридных звеньев, 1–50 моносахаридных звеньев, 1–40 моносахаридных звеньев, 1–30 моносахаридных звеньев, 1–20 моносахаридных звеньев или даже 1–10 моносахаридных звеньев. В некоторых вариантах осуществления полисахаридная цепь (PS) представляет собой гомополисахаридную цепь, состоящую либо из пентозных, либо гексозных моносахаридных звеньев. В других вариантах осуществления полисахаридная цепь (PS) представляет собой гетерополисахаридную цепь, состоящую из одного или обоих пентозных и гексозных моносахаридных звеньев. В некоторых вариантах осуществления моносахаридные звенья полисахаридной цепи (PS) выбраны из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, маннозы, ксилозы и рибозы. В некоторых вариантах осуществления полисахаридная цепь (PS) относится к одному моносахаридному звену (например, либо к глюкозе, либо фруктозе). В еще одном аспекте полисахаридная цепь представляет собой аминосахар, где одна или несколько гидроксигрупп на сахаре заменены аминогруппой. Соединение с карбонильной группой может осуществляться либо через аминовую, либо через гидрокси группу.
[0051] В некоторых вариантах осуществления, для производного пиразина формулы I по меньшей мере один из Y1 или Y2 представляет собой
Figure 00000005
,
где Z1 представляет собой простую связь, –CR1R2–, –O–, –NR1–, –NCOR1–, –S–, –SO– или –SO2–; и каждый из R1 – R2 независимо выбран из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aH, –CH2(CHOH)aCH3, –CH2(CHOH)aCO2H, –(CHCO2H)aCO2H, –(CH2CH2O)cH, –(CH2CH2O)cCH3, –(CH2)aSO3H,–(CH2)aNHSO3H и –(CH2)aPO3H2; a, c и m имеют значения, определенные выше.
[0052] В еще одном аспекте по меньшей мере один из Y1 и Y2 представляет собой –NR1R2, и R1 – R2 имеют значение, определенное выше. В еще одном аспекте оба Y1 и Y2 представляют собой –NR1R2, и R1 – R2 имеют значение, определенное выше. Альтернативно, R1 и R2 оба независимо выбраны из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aCH3, –(CH2)aSO3H, –(CH2)aNHSO3H и –(CH2)aPO3H2. В еще одном аспекте оба R1 и R2 представляют собой водород.
[0053] Наиболее предпочтительно, пиразин представляет собой
Figure 00000006
,
или его фармацевтически приемлемую соль.
[0054] В любом аспекте пиразинового соединения один или несколько атомов могут альтернативно быть замещены изотопно–меченным атомом того же элемента. Например, атом водорода может быть изотопно помечен дейтерием или тритием; атом углерода может быть изотопно помечен 13C или 14C; атом азота может быть изотопно помечен 14N или 15N. Изотопная метка может быть стабильным изотопом или может быть нестабильным изотопом (то есть радиоактивным). Молекула пиразина может содержать одну или несколько изотопных меток. Изотопная метка может быть частичной или полной. Например, молекула пиразина может быть помечена 50% дейтерием, что придает молекуле сигнатуру, которую можно легко отслеживать масс–спектрометрией или другим методом. В качестве другого примера, молекула пиразина может быть мечена тритием, что придает молекуле радиоактивную сигнатуру, которую можно отслеживать как in vivo, так и ex vivo с использованием методов, известных в данной области техники.
[0055] Фармацевтически приемлемые соли известны в данной области. В любом аспекте в настоящей заявке пиразин может быть в форме фармацевтически приемлемой соли. В качестве примера, а не ограничения, фармацевтически приемлемые соли включают соли, описанные Berge, et al. в J. Pharm. Sci., 66(1), 1 (1977), содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. Соль может быть катионной или анионной. В некоторых вариантах осуществления противоион для фармацевтически приемлемой соли выбран из группы, состоящей из ацетата, бензолсульфоната, бензоата, безилата, бикарбоната, битартрата, бромида, эдетата кальция, камсилата, карбоната, хлорида, цитрата, дигидрохлорида, эдетата, эдизилата, эстолата, эзилата, фумарата, глуцептата, глюконата, глутамата, гликоллиларсанилата, гексилрезорцината, гидрабамина, гидробромида, гидрохлорида, гидроксинафтоата, йодида, изетионата, лактата, лактобионата, малата, малеата, манделата, мезилата, метилбромида, метилнитрата, метилсульфата, муцината, напсилата, нитрата, памоата, пантотената, фосфата, дифосфата, полигалактуроната, салицилата, стеарата, субацетата, сукцината, сульфата, танната, тартрата, теоклата, триэтиодида, адипата, альгината, аминосалицилата, ангидрометиленцитрата, ареколина, аспартата, бисульфата, бутилбромида, камфората, диглюконата, дигидробромида, дисукцината, глицерофосфата, гемисульфата, гидрофторида, гидройодида, метиленбис(салицината), нападисилата, оксалата, пектината, персульфата, фенилэтилбарбитурата, пикрата, пропионата, тиоцианата, тозилата, ундеканоата, бензатина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, меглумина, прокаина, бенетамина, клемизола, диэтиламина, пиперазина, трометамина, алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия, цинка, бария и висмута. Любая функциональная группа в производном пиразина, способная образовывать соль, может необязательно образовывать ее с использованием способов, известных в данной области. В качестве примера, а не ограничения, амингидрохлоридные соли могут быть образованы путем добавления хлористоводородной кислоты к пиразину. Фосфатные соли могут быть образованы путем добавления фосфатного буфера к пиразину. Любая присутствующая кислотная функциональная группа, такая как сульфоновая кислота, карбоновая кислота или фосфоновая кислота, может быть депротонирована при помощи подходящего основания и образованной соли. Альтернативно, аминогруппа может быть протонирована соответствующей кислотой с образованием соли амина. Солевая форма может быть однозарядной, двухзарядной или даже трехзарядной, и когда присутствует более одного противоиона, каждый противоион может быть одинаковым или они могут быть отличными друг от друга.
[0056] Все ссылки в настоящей заявке на “пиразин”, “производное пиразина”, “молекулу пиразина”, “соединение пиразина” или “аналог пиразина” относятся ко всем соединениям формулы I. Кроме того, каждая ссылка на пиразин включает все его фармацевтически приемлемые соли, если конкретно не указано иное. Солевые формы могут быть заряженными или незаряженными и могут быть протонированы для образования соответствующего катиона или депротонированы для образования соответствующего аниона. Все аспекты и варианты осуществления, раскрытые в настоящей заявке, применимы к соединениям формулы I, и конкретные примеры являются только иллюстративными и не ограничивающими объем раскрытия.
[0057] В некоторых аспектах у пациента подозревается или известно, что имеется по меньшей мере одно медицинское нарушение, связанное с почками, и способы, раскрытые в настоящей заявке, используют для определения уровня нарушения функции почек или почечной недостаточности у пациента. В некоторых аспектах пациент имеет расчетную СКФ (рСКФ) или ранее определенную СКФ менее чем 110, менее чем 90, менее чем 60, менее чем 30 или менее чем 15. рСКФ пациента определяют с использованием стандартных медицинских методик, и такие методы известны в данной области. В некоторых аспектах пациент не должен иметь медицинских проблем с почками, или не у него не должно быть подозрений на это. СКФ мониторинг можно проводить как часть общей или обычной оценки состояния здоровья пациента или в качестве меры предосторожности.
[0058] Поскольку увеличение концентрации белка в моче пациента может свидетельствовать о каком–либо типе почечной недостаточности или нарушения функции, способы, раскрытые в настоящей заявке, подходят для пациентов, у которых при анализе мочи наблюдается повышение уровня белка. В некоторых аспектах у пациента повышен уровень белка в моче, что определяют стандартными медицинскими тестами (например, тест–полосками для анализа мочи). В качестве примера, а не ограничения, анализ мочи пациента может показывать увеличение альбумина, увеличение креатинина, увеличение азота мочевины в крови (то есть BUN тест) или любую их комбинацию.
[0059] В некоторых аспектах пациенту ранее был поставлен диагноз по меньшей мере Стадия 1 ХБП. В других аспектах пациенту ранее был поставлен диагноз Стадия 2 ХБП, Стадия 3 ХБП, Стадия 4 ХБП или Стадия 5 ХБП. В еще одном аспекте у пациента еще не диагностирована ХБП, но имеется один или несколько факторов риска, связанных с ХБП. В еще одном аспекте пациент не имеет известных факторов риска ХБП.
Примеры
Получение (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис–(азандиил))–бис(3–гидроксипропановой кислоты) (“MB–102”)
[0060] Образцы MB–102 API получали и анализировали в соответствии с GMP стандартами для использования в двух клинических испытаниях. Следующая процедура является иллюстративной.
Figure 00000007
Стадия 1: Образование дибензил 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)–бис(азандиил))(2R,2'R)–бис(3–гидроксипропаноата)
[0061] В круглодонную колбу объемом 500 мл, снабженную адаптером Клейзена и капельной воронкой, загружали гидрохлорид бензилового эфира D–серина (24,33 г, 105,0 ммоль) и через канюлю добавляли безводный DMF (300 мл). Раствор охлаждали на ледяной бане и перемешивали в течение 15 мин в атмосфере N2. Добавляли по каплям DIPEA (19,16 мл, 110,0 ммоль) через капельную воронку в течение 30 минут, а еще через 30 минут охлаждающую баню убирали и добавляли одной порцией дикислоту (9,91 г, 50,0 ммоль). Суспензию кирпично–красного цвета перемешивали в течение 30 минут и одной порцией добавляли HOBt·H2O (17,61 г, 115,0 ммоль). Через 15 минут реакционную колбу охлаждали на ледяной бане и порциями в течение 15 минут добавляли EDC·HCl (22,05 г, 115,0 ммоль). Полученной суспензии медленно давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи (около 17 часов) в атмосфере N2.
[0062] Темный раствор концентрировали до сиропообразного остатка в высоком вакууме (температура бани 60°C), затем распределяли между EtOAc и milli–Q H2O (по 400 мл каждого). Слои разделяли и водный слой экстрагировали при помощи EtOAc (3 × 200 мл). Объединенные EtOAc экстракты последовательно промывали 0,50 M KHSO4, насыщенным NaHCO3, H2O и насыщенным солевым раствором (по 250 мл каждого). Удаление растворителя при пониженном давлении давало 23,7 г оранжевого твердого вещества. Неочищенный продукт очищали флэш–хроматографией на силикагеле, используя градиент CHCl3:MeOH, с получением бис–амида (19,6 г, 71%) в виде оранжевого твердого вещества: Rf=0,45 [CHCl3:MeOH (9:1, об/об)]. 1H ЯМР (DMSO–d6) δ 8,56 (д, J=8,0 Гц, 2H, обмениваемый с D2O), 7,40–7,33 (м, 10H), 6,76 (с, 4H, обмениваемый с D2O), 5,37 (т, J=5,5 Гц, 2H), 5,20 (м, 4H), 4,66–4,63 (дт, J=8,0, 4,0 Гц, 2H), 3,97–3,93 (м, 2H), 3,81–3,77 (м, 2H). 13C ЯМР (DMSO–d6) δ 170,1, 164,9, 146,4, 135,8, 128,4, 128,0, 127,6, 125,9, 66,2, 61,1, 54,4; ОФ–ЖХ/МС (ESI) m/z 553,3 (M+H)+ (Rt=4,44 мин, 5–95% B/6 мин). Рассчит. для C26H28N6O8: C, 56,52; H, 5,11; N, 15,21. Найдено: C, 56,39; H, 5,11; N, 14,99.
Стадия 2: Образование (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис–(азандиил))–бис(3–гидроксипропановой кислоты)
[0063] Бисамид со Стадии 1 (7,74 г, 14,0 ммоль) гидрировали в присутствии 10% Pd/C (0,774 г) в смеси EtOH:H2O (560 мл; 3:1 об/об). Реакционную смесь продували аргоном и перемешивали в атмосфере водорода (медленное барботирование) при комнатной температуре в течение 5,5 часов. Реакционную смесь снова продували Ar и катализатор удаляли путем фильтрации через целит. Слой промывали смесью EtOH:H2O (400 мл; 1: 1 об./об.) и объединенные фильтраты концентрировали в вакууме. Продукт сушили в высоком вакууме. Остаток растирали с CH3CN с получением MB–102 (4,89 г, 94%) в виде оранжевого порошка. 1H ЯМР (DMSO–d6) δ 8,46 (д, J=8,3 Гц, 2H, обмениваемый с D2O), 6,78 (шир.с, 4H, обмениваемый с D2O), 4,48–4,45 (дт, J=8,1, 3,9 Гц, 2H), 3,88 (дд, J=11,1, 3,9 Гц, 2H), 3,74 (дд, J=11,1, 3,7 Гц, 2H). 13C ЯМР (DMSO–d6) δ 171,6, 164,7, 146,4, 125,9, 61,2, 54,3. ОФЖХ/МС (ESI) m/z 373,2 (M+H)+ (Rt=2,86 мин, 5–95% B/6 мин). Анал. Рассчит. для C12H16N6O8: C, 38,71; H, 4,33; N, 22,57. Найдено: C, 38,44; H, 4,51: N, 22,33.
Получение образца для анализа методом прямого разбавления
[0064] Для получения образца путем прямого разбавления получали калибровочные стандарты, содержащие 0,4, 1,0, 2,0, 4,0, 10,0, 16,0, 40,0, 100,0, 200,0, 400,0 нг/мл, и контроли качества при низком, среднем и высоком уровнях MB–102 в 1% плазмы человека в PBS в день валидационного исследования или анализа образца. Дозируемый раствор MB–102 (18,6 мг/мл), используемый в клиническом исследовании, разводили 1/100 сначала с использованием 1% плазмы человека в PBS для получения исходного раствора 186 мкг/мл MB–102. Этот исходный раствор дополнительно разбавляли 1% плазмы человека в PBS для получения рабочего раствора калибровочного стандарта 2000 нг/мл MB–102 для получения калибровочных стандартов. QC рабочий раствор при (300 нг/мл) также получали из исходного раствора 186 мкг/мл MB–102 путем разбавления раствором 1% плазмы в PBS. Низкий, средний и высокий уровни контролей качества(QC) получали из этого QC рабочего раствора путем разбавления раствором 1% плазмы человека в PBS.
Подготовка образца для анализа методом осаждения белков
[0065] Для получения образцов путем осаждения белков калибровочные стандарты, содержащие 0,4, 1,0, 2,0, 4,0, 10,0, 16,0, 40,0, 100,0, 200,0, 400,0 нг/мл, и контроли качества при низком, среднем и высоком уровнях MB–102 получали следующим образом. Тысячекратную концентрацию MB–102 в 1X PBS получали для каждых стандартов и QC. Эти исходные растворы разбавляли 1/100 плазмой с получением рабочих калибровочных стандартов и QC MB–102 в 99% плазмы/1% PBS. 200 мкл этих рабочих стандартов и QC разделяли на аликвоты в 600 мкл флаконы и хранили при –80°C до использования. С использованием такого же способа ВЭЖХ эти рабочие калибровочные стандарты и QC проверяли на соответствие требованиям и сертифицировали для анализа неизвестных образцов.
Анализ образцов, полученных от пациентов
[0066] Образцы плазмы были получены из двух клинических испытаний. Все образцы плазмы хранили при –80°C до анализа.
[0067] Для образцов, которые анализировали методом прямого разбавления, 10 мкл образца плазмы (оттаивали до комнатной температуры и тщательно смешивали) разбавляли 990 мкл 1X PBS, тщательно смешивали в течение около 10 минут и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 2 минут. Образец непосредственно анализировали методом ВЭЖХ.
[0068] Для образцов, которые анализировали методом осаждения белков, 50 мкл плазмы (оттаивали до комнатной температуры и тщательно смешивали) разбавляли 200 мкл метанола, содержащего 4,5% 1X PBS (об/об), смешивали по меньшей мере в течение 10 секунд и центрифугировали при >4000 об/мин в течение 10 минут. Весь супернатант переносили во второй контейнер. Из этого 50 мкл супернатанта смешивали с 950 мкл 1X PBS. Образец смешивали и анализировали методом ВЭЖХ. С использованием этой процедуры, высушенный супернатант после осаждения белков плазмы удалялся. Часть супернатанта разбавляли непосредственно 1X PBS для ВЭЖХ анализа так, чтобы внутренний стандарт, обычно используемый в методе осаждения белка, не потребовался.
[0069] ВЭЖХ анализ
[0070] Анализы осуществляли на системе Waters Acquity UPLC H Class Chromatography System, снабженной нагревателем колонки, нагревателем/охладителем образца, вакуумным дегазатором, автодозатором, детектором флуоресценции и насосом, способным создавать бинарный градиент. Для анализа использовали аналитическую ВЭЖХ колонку Phenomenex Luna C18 (2), 4,6 × 250 мм, 5 мкм, 100Å (Phenomenex, № по кат. 00G–4252–E0, S/N H15–133556) и Security Guard Cartridge C18, 4 × 3 мм в.д., 5 мкм (Phenomenex, № по кат. KJ0–4282). Программное обеспечение Waters Empower 3, оснащенное системой ВЭЖХ, использовали для настройки анализа, мониторинга анализа и обработки данных. Использовали две подвижные фазы: подвижная фаза A: 0,1% трифторуксусной кислоты в воде (Fisher, Optima® Grade) и подвижная фаза B: 0,1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле (Fisher, Optima® Grade). Температуру колонки устанавливали при 30°С, температуру автодозатора устанавливали при 5°С, длину волны возбуждения устанавливали при 434 нм, а длину волны детекции/эмиссии устанавливали при 556 нм. Скорость счета устанавливали при 5 отсчетов/сек; увеличение PMT устанавливали при 50; температура проточной ячейки представляла собой температуру окружающей среды; объем вводимой пробы составлял 10 мкл. MB–102 элюировал примерно через 3,6 минуты при использовании градиента, показанного ниже.
Время
(мин)		 Скорость потока
(мл/мин)		 % A % B Градиент кривой
0,00 1,1 85 15 6
5,00 1,1 40 60 6
5,05 1,6 10 90 6
6,75 1,6 10 90 6
6,80 1,1 85 15 6
10,00 1,1 85 15 6
Метод валидации
[0071] Используя этот метод ВЭЖХ и подготовку образца, описанные выше, было проведено валидационное исследование для определения прецизионности, точности, линейности, воспроизводимости, стабильности в плазме и растворе образца, стабильности при замораживании–оттаивании, самых низких пределов количественного определения и специфичности. Критерием приемлемости было отклонение данных ± 15% от нормальных значений, за исключением самого низкого предела количественного определения (LLOQ), где оно было установлено как ± 20%. Образцы были проанализированы как в собственной лаборатории, так и в контрактной лаборатории GMP, чтобы обеспечить как достоверность метода, так и точность результатов.
Специфичность и селективность
[0072] Влияние компонентов плазмы на MB–102 и анализ исследовали путем сравнения хроматограмм чистых образцов с образцами, в которые добавляли MB–102. Было определено, что LLQ по меньшей мере в 10 раз превышает уровень шума в контрольных образцах, в то же время было установлено, что LLOD по меньшей мере в три раза превышает уровень шума в контрольных образцах.
Точность и прецизионность
[0073] Подготовку образцов осуществляли в трех повторах при пяти уровнях концентраций MB–102 в 1% плазмы/PBS и анализировали для определения точности. Для определения точности введения проб было сделано десять инжекций образца 200 нг/мл, чтобы убедиться в высокой точности повторных инжекций.
Восстановление
[0074] Восстановление определяли при трех различных концентрациях MB–102 путем сравнения контрольных образцов плазмы с теми образцами плазмы, в которые добавили MB–102. Процент MB–102, выделенного из образцов с добавлением MB–102, определяли как % восстановления.
Стабильность в образце плазмы и стабильность в растворе плазмы
[0075] Оценивали стабильность MB–102 при обработке образцов после длительного хранения образцов плазмы (замороженных при –80°C) и кратковременного хранения (стандартные лабораторные условия, температура окружающей среды с/без воздействия света и 2–8°C) в растворе плазмы. Образцы плазмы испытывали с тремя циклами замораживания/оттаивания (от –80°C до комнатной температуры). Стабильность MB–102 в растворе плазмы при комнатной температуре с/без воздействия света, при 2–8°C и при температуре автодозатора (5°C) оценивали для временных интервалов 24 и 48 часов.
Результаты
[0076] Фиг. 2 иллюстрирует наложение ВЭЖХ хроматограмм MB–102 (3,3 нг/мл в 1% плазмы/PBS) и пустого контроля (1% плазмы/PBS). Длину волны флуоресценции, испускаемой MB–102 при 556 нм, контролировали для количественного определения. 1% белков плазмы в растворе образца не имеют пика, элюируемого при около 3,62 мин, мешающего детекции или количественному определению MB–102.
Валидация метода
[0077] Результаты исследования по валидации метода приведены в таблице 1. Калибровка стандартов MB–102 показала очень хороший линейный ответ больше чем на три порядка величины для концентраций от 0,4 нг/мл до 400 нг/мл, с R² 0,9997, с использованием линейной регрессии с взвешиванием 1/X. LLOQ при 0,4 нг/мл имеют отношение сигнал/шум 15,18, коэффициент асимметрии по USP 1,072 и число теоретических тарелок в соответствии с USP 39934, как показано на Фиг. 3А. Улучшенное отношение сигнал/шум (19,48) было получено при дополнительной корректировке инструмента (Фиг. 3В).
Таблица 1
Результаты валидационного исследования
Концентрация MB–102 (нг/мл) Количество наблюдений Средняя концентрация (нг/мл) RSD (%) % восстановления
380,0 3 384,7 0,73 101,2
160,0 3 159,6 0,80 99,7
60,0 3 59,3 0,76 98,8
20,0 3 19,8 1,46 99,2
3,0 3 2,9 3,20 95,7
Точность вводимых проб
200,0 10 198,5 0,45 99,2
Линейность
0,4 3 0,4 4,30 105,0
1,0 3 1,0 3,39 101,0
2,0 3 2,0 1,44 100,0
4,0 3 4,0 3,40 100,3
10,0 3 9,9 2,08 98,7
16,0 3 15,4 2,33 96,4
40,0 3 39,8 1,20 99,6
100,0 3 99,2 1,35 99,2
200,0 3 199,2 0,45 99,6
400,0 3 402,4 0,49 100,6
Slope 3 1,30E+04 1,61
R² 3 0,9999 0,01
3 цикла замораживания/оттаивания
1,76 3 1,79 1,09 101,7
8,81 3 8,81 1,79 100,0
61,87 3 62,34 1,82 100,8
Стабильность раствора образца при 4°C в течение 48 часов
1,76 3 1,75 2,56 99,4
8,81 3 8,66 2,06 98,3
61,87 3 60,84 3,47 98,3
QC, полученные через три дня, которые хранили при 4°C в течение 48 часов
3,7 1 3,74 N/A 101,1
37,9 1 37,55 N/A 99,1
372,6 1 373,50 N/A 100,2
QC, полученные через три дня, которые хранили при комнатной температуре без света
3,7 1 3,87 N/A 104,6
37,9 1 37,15 N/A 98,0
372,6 1 372,58 N/A 100,0
QC, полученные через три дня, которые хранили при комнатной температуре со светом
3,7 1 3,76 N/A 101,6
37,9 1 36,40 N/A 96,0
372,6 1 364,59 N/A 97,9
Выделение MB–102, добавленного в плазму
0,6 3 0,67 4,24 111,7
6,0 3 6,14 5,48 102,3
60,0 3 60,25 2,9 100,4
[0078] Точность анализа была превосходной, показывая восстановление 99,2%, RSD 0,45% и точность в диапазоне от 95,7% до 101,2% восстановления для всех исследованных условий. Три цикла замораживания/оттаивания показывают, что плазма очень стабильна при –80°C. Стабильность раствора образца, хранящегося при 4°C и при комнатной температуре без света до 48 часов, также очень высокая. При хранении раствора при комнатной температуре со светом в течение 48 часов наблюдается небольшое разложение (~ 1–2%) MB–102. Все три концентрации восстановления добавленного соединения находились в пределах ± 15% добавленного количества. Чтобы определить чистоту пика MB–102, элюированного через 3,62 минуты для неизвестного образца, осуществляли осаждение белков из образца плазмы, супернатант высушивали и восстанавливали в PBS. Получали ВЭЖХ хроматограммы при 445 нм (в режиме PDA). Чистоту MB–102 PDA пика из образца с добавленным соединением в PBS сравнивали с чистотой пика из образца плазмы, взятого из клинического исследования. Результаты, показанные на Фиг. 4 и 5, показали, что пик MB–102, элюируемый через 3,62 минуты, который поглощает при 445 нм, из клинического исследования является чистым.
Анализ образцов от пациентов
[0079] В подтверждение клинических исследований для оценки полезности MB–102 для мониторинга функции почек путем трансдермального измерения флуоресценции получали образцы плазмы из образцов крови, взятых через 0, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 480, 600 и 720 минут у каждого участника исследования. Этот метод был передан в сертифицированную биоаналитическую лабораторию GMP для валидации и анализа образцов плазмы всего клинического исследования. Результаты, полученные из GMP лаборатории, сравнивали с результатами испытаний, полученными в собственной лаборатории, для обеспечения точности и воспроизводимости.
[0080] Образцы плазмы от 12 пациентов из одного и того же исследования использовали в собственной лаборатории для подтверждения результатов GMP лабораторных исследований. Сравнение результатов от этих субъектов, полученных в собственной лаборатории и GMP лаборатории, показано на Фиг. 6. Линейная регрессия корреляции показывает угол наклона 1,018 с R² 0,90303. Данные фармакокинетического анализа этих 12 субъектов показаны на Фиг. 7, и они показывают, что скорость клиренса МВ–102 варьируется между пациентами.
[0081] Поскольку в этом исследовании в качестве эталонного маркера вводили йогексол совместно с МВ–102, сравнение фармакокинетики МВ–102 и йогексола у трех субъектов показано на Фиг. 8а, 8b и 8с. Как показано на фигурах, скорость клиренса МВ–102 параллельна скорости клиренса йогексола для каждого из трех субъектов, как проиллюстрировано. Поэтому MB–102 может действовать аналогично йогексолу для определения СКФ.
[0082] Чтобы лучше понять корреляцию 1,0177, как показано на Фиг. 6, при сравнении измерений, выполненных в собственной лаборатории и в контрактной GMP лаборатории, был исследован традиционный метод подготовки образца плазмы путем осаждения белка для ВЭЖХ анализа. Образцы плазмы от тех же 12 субъектов анализировали с использованием модифицированного метода осаждения белка. График корреляции MB–102, определенный методом прямого разбавления в сравнении с методом осаждения белка, показан на Фиг. 9. Результаты с наклоном корреляции 1,0074 и R² 0,9944 полностью подтверждают достоверность анализа содержания MB–102 в плазме, подготовленной методом прямого разбавления. Подготовка образцов плазмы путем осаждения белка занимает много времени и требует установки дополнительного лабораторного оборудования. Подготовка образцов плазмы путем прямого разведения 1/100 в 1X PBS является простой, быстрой, прецизионной и точной.
[0083] Используя метод осаждения белка, были проанализированы образцы плазмы из клинического исследования 59 субъектов. Результаты сравнивали с результатами, полученными в GMP лаборатории, с использованием метода прямого разбавления. График корреляции этих двух наборов данных показан на Фиг. 10. Был получен наклон корреляции 1,0153 с R² 0,9941. p–Значение (0,579 > 0,05) из этих данных с использованием двухвыборочного t–критерия, предполагающего равные отклонения, указывает на то, что средние значения пар не являются статистически различными.
Анализ образцов крови, показывающих гемолиз
[0084] В процессе разработки способов, раскрытых в настоящем документе, было изучено влияние гемолиза на количественное определение MB–102 в плазме. Клинический протокол для сведения к минимуму гемолиза во время сбора крови и получения плазмы был передан и обсужден с клиницистами на месте испытания; однако среди всех образцов плазмы от 59 субъектов было отмечено несколько образцов с некоторой степенью гемолиза. Более 90% образцов плазмы, полученных из клинического исследования, имели содержание гемоглобина 50 мг/дл и ниже. В некоторых образцах плазмы содержание гемоглобина составляло от 100 до 250 мг/дл. Концентрацию MB–102 в этих образцах сравнивали с использованием методов прямого разбавления и осаждения белка. Результаты на Фиг. 11 представлены для образцов, имеющих содержание гемоглобина между 50 мг/дл и 100 мг/дл. Наклон (1,0194) кривой корреляции показал, что влияние на количественную оценку MB–102 является минимальным, по сравнению с наклоном (1,0153) кривой корреляции, показанной на Фиг. 10.
[0085] Результаты, показанные на Фиг. 12, представлены для образцов, в которых содержание гемоглобина составляет от 100 до 250 мг/дл. Наклон (1,1107) кривой корреляции указывает на влияние на количественное определение MB–102 по сравнению с наклоном (1,0153) кривой корреляции, показанной на Фиг. 10. Поскольку эти четыре образца плазмы были получены от четырех разных субъектов в разные моменты времени сбора образцов, их влияние на определение скорости клиренса и, следовательно, СКФ, не будет значительным.
[0086] Данные этих исследований показывают, что как способы прямого разбавления, так и способы осаждения с флуоресцентной детекцией являются прецизионными и точными и подходящими для анализа MB–102 в плазме человека.

Claims (34)

1. Способ измерения количества флуоресцентного соединения в плазме, включающий:
сбор образца плазмы,
разбавление образца плазмы по меньшей мере одним растворителем и
анализ разбавленного образца при помощи ВЭЖХ для измерения, таким образом, количества соединения в плазме,
где образец плазмы не сушат перед анализом ВЭЖХ и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта,
где флуоресцентное соединение представляет собой
Figure 00000008
или его фармацевтически приемлемую соль.
2. Способ по п. 1, где образец плазмы демонстрирует признаки гемолиза крови.
3. Способ по п. 1, где плазма получена из исследования на людях, животных или in vitro.
4. Способ по п. 1, где по меньшей мере один растворитель представляет собой водный буфер, выбранный из группы, состоящей из фосфата, ацетата, бикарбоната, карбоната, формиата, глюконата, лактата, цитрата, сульфоната, аммония, гуанидиния, HEPES, какодилата, Tris, tris–HCl, малеата, бората, глицината, сукцината, PIPES и любой их комбинации.
5. Способ по п. 1, где по меньшей мере один растворитель представляет собой неводный растворитель, выбранный из группы, состоящей из метанола, этанола, этиленгликоля, этилацетата, гексана, хлороформа, DMF, DMSO, уксусной кислоты, ацетона, ацетонитрила, бутанола, тетрахлорида углерода, диэтиленгликоля, диэтилового эфира, DME, этиленгликоля, метиленхлорида, нитрометана, петролейного эфира, пропанола, пиридина, толуола, MTBE, триэтиламина, ксилола и бензола.
6. Способ по п. 1, где по меньшей мере один растворитель выбран из группы, состоящей из водных растворителей, неводных растворителей и любой их комбинации.
7. Способ по п. 1, где по меньшей мере один растворитель представляет собой PBS.
8. Способ измерения количества флуоресцентного соединения в плазме, включающий:
сбор образца плазмы,
добавление к образцу по меньшей мере одного растворителя, вызывая, таким образом, осаждение белков плазмы,
удаление осажденных белков плазмы из образца и
анализ образца при помощи ВЭЖХ для измерения, таким образом, количества соединения в плазме,
где образец не сушат перед анализом ВЭЖХ и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта,
где флуоресцентное соединение представляет собой
Figure 00000009
или его фармацевтически приемлемую соль.
9. Способ по п. 8, где удаление осажденных белков плазмы включает центрифугирование образца,
центрифугированный образец содержит супернатант и образовавшийся после центрифугирования осадок, и
супернатант разбавляют по меньшей мере одним растворителем перед анализом ВЭЖХ.
10. Способ по п. 8, где образец плазмы демонстрирует признаки гемолиза крови.
11. Способ по п. 8, где плазма получена из исследования на людях, животных или in vitro.
12. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель представляет собой водный буфер, выбранный из группы, состоящей из фосфата, ацетата, бикарбоната, карбоната, формиата, глюконата, лактата, цитрата, сульфоната, аммония, гуанидиния, HEPES, какодилата, Tris, tris–HCl, малеата, бората, глицината, сукцината, PIPES и любой их комбинации.
13. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель представляет собой неводный растворитель, выбранный из группы, состоящей из метанола, этанола, этиленгликоля, этилацетата, гексана, хлороформа, DMF, DMSO, уксусной кислоты, ацетона, ацетонитрила, бутанола, тетрахлорида углерода, диэтиленгликоля, диэтилового эфира, DME, этиленгликоля, метиленхлорида, нитрометана, петролейного эфира, пропанола, пиридина, толуола, MTBE, триэтиламина, ксилола и бензола.
14. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель выбран из группы, состоящей из метанола, PBS и любой их комбинации.
15. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель представляет собой PBS.
16. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель выбран из группы, состоящей из водных растворителей, неводных растворителей и любой их комбинации.
17. Способ по п. 16, где водный растворитель представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор, а неводный растворитель представляет собой метанол.
RU2019132947A 2017-11-20 2018-11-15 Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме RU2746503C1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762588606P 2017-11-20 2017-11-20
US62/588,606 2017-11-20
PCT/US2018/061282 WO2019099672A1 (en) 2017-11-20 2018-11-15 Method for preparing and analyzing fluorescent compounds in plasma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2746503C1 true RU2746503C1 (ru) 2021-04-14

Family

ID=66532776

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019132947A RU2746503C1 (ru) 2017-11-20 2018-11-15 Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме

Country Status (16)

Country Link
US (1) US11674965B2 (ru)
EP (1) EP3713577A4 (ru)
JP (1) JP2020516692A (ru)
KR (2) KR20200007778A (ru)
CN (1) CN110461332A (ru)
AU (1) AU2018369913B2 (ru)
BR (1) BR112019021044A2 (ru)
CA (1) CA3058762A1 (ru)
IL (1) IL269611A (ru)
MX (1) MX2019011901A (ru)
MY (1) MY188418A (ru)
PH (1) PH12019502373A1 (ru)
RU (1) RU2746503C1 (ru)
SG (1) SG11201909366XA (ru)
WO (1) WO2019099672A1 (ru)
ZA (1) ZA201906445B (ru)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113109491A (zh) * 2020-01-13 2021-07-13 四川基因格司法鉴定中心 从生物样本中检测毒药物的通用方法
TW202233586A (zh) * 2020-11-10 2022-09-01 美商麥迪貝肯有限公司 吡𠯤化合物的皮下與肌內注射
EP4313172A1 (en) * 2021-03-31 2024-02-07 Medibeacon Inc. Preparation of substituted diaminopyrazine dicarboxylic acids
US20220315538A1 (en) * 2021-03-31 2022-10-06 Medibeacon Inc. Purification of substituted diaminopyrazine dicarboxylic acids
TW202321203A (zh) * 2021-08-11 2023-06-01 中國大陸商杭州中美華東製藥有限公司 製備作為螢光示蹤劑的吡嗪羧酸類衍生物的方法
CN117881665A (zh) * 2021-08-27 2024-04-12 杭州中美华东制药有限公司 吡嗪类衍生物的晶型及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2575559C2 (ru) * 2010-02-23 2016-02-20 Б.Р.А.Х.М.С Гмбх Способ определения маркера в малом объеме образца биологической жидкости

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4647742B2 (ja) * 2000-03-13 2011-03-09 三菱化学メディエンス株式会社 アスコルビン酸の分析方法及び分析用試薬
US6969592B2 (en) * 2001-09-26 2005-11-29 Pharmacia Italia S.P.A. Method for predicting the sensitivity to chemotherapy
US6909912B2 (en) 2002-06-20 2005-06-21 University Of Florida Non-invasive perfusion monitor and system, specially configured oximeter probes, methods of using same, and covers for probes
AU2004233870B2 (en) 2003-04-24 2009-11-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Noninvasive blood analysis by optical probing of the veins under the tongue
US20060095102A1 (en) 2003-09-17 2006-05-04 Thomas Perez Method and apparatus for sublingual application of light to blood
JP4214109B2 (ja) * 2004-12-16 2009-01-28 日本ハム株式会社 畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液
DE602005020981D1 (de) 2004-12-23 2010-06-10 Mallinckrodt Inc Fluoreszente pyrazinderivate und verfahren zu deren anwendung bei der bewertung der nierenfunktion
DK2029554T3 (da) 2006-06-22 2014-06-10 Medibeacon Llc Pyrazinderivater og anvendelser heraf til nyreovervågning
EP2139485B1 (en) * 2007-04-11 2012-10-17 BioMarin Pharmaceutical Inc. Methods of administering tetrahydrobiopterin, associated compositions, and methods of measuring
CN102770751A (zh) 2010-02-23 2012-11-07 B.R.A.H.M.S有限公司 测定小体积体液样品中的标志物的方法
US20120172677A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Logan Robert J Systems and methods for monitoring and processing biometric data
AU2012249600B2 (en) 2011-04-26 2016-05-19 Incube Labs, Llc Mouthpiece for measurement of biometric data of a diver and underwater communication
WO2016183351A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Medibeacon Inc. Compositions and methods for assessing eye vasculature

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2575559C2 (ru) * 2010-02-23 2016-02-20 Б.Р.А.Х.М.С Гмбх Способ определения маркера в малом объеме образца биологической жидкости

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG et al. High-Performance Liquid Chromatographic-Fluorescent Method to Determine Chloroacetaldehyde, a Neurotoxic Metabolite of the Anticancer Drug Ifosfamide, in Plasma and in Liver Microsomal Incubations//Analytical Biochemistry. - 1999. - V. 273. - N. 1. - P. 117 - 125. *
HUANG et al. High-Performance Liquid Chromatographic-Fluorescent Method to Determine Chloroacetaldehyde, a Neurotoxic Metabolite of the Anticancer Drug Ifosfamide, in Plasma and in Liver Microsomal Incubations//Analytical Biochemistry. - 1999. - V. 273. - N. 1. - P. 117 - 125. RAJAGOPALAN et al. Hydrophilic Pyrazine Dyes as Exogenous Fluorescent Tracer Agents for Real-Time Point-of-Care Measurement of Glomerular Filtration Rate//Journal of Medicinal Chemis-try. - 2011. - V.54. - N.14. - P. 5048-5058. *
POREDDY A. R. et al. Development of fluorescent tracers for the real-time monitoring of renal function //Reporters, Markers, Dyes, Nanoparticles, and Molecular Probes for Biomedical Applications III. - International Society for Optics and Photonics, 2011. - V. 7910. - N. 791010. - P.1-7. *
RAJAGOPALAN et al. Hydrophilic Pyrazine Dyes as Exogenous Fluorescent Tracer Agents for Real-Time Point-of-Care Measurement of Glomerular Filtration Rate//Journal of Medicinal Chemis-try. - 2011. - V.54. - N.14. - P. 5048-5058. *
Технологии лабораторные и клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4.Правила проведения преаналитического этапа:ГОСТ Р 53079.4-2008. - М.: Стандартинформ, 2009. - С.59. *
Технологии лабораторные и клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4.Правила проведения преаналитического этапа:ГОСТ Р 53079.4-2008. - М.: Стандартинформ, 2009. - С.59. POREDDY A. R. et al. Development of fluorescent tracers for the real-time monitoring of renal function //Reporters, Markers, Dyes, Nanoparticles, and Molecular Probes for Biomedical Applications III. - International Society for Optics and Photonics, 2011. - V. 7910. - N. 791010. - P.1-7. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019099672A1 (en) 2019-05-23
US11674965B2 (en) 2023-06-13
AU2018369913B2 (en) 2020-08-20
BR112019021044A2 (pt) 2020-05-12
MX2019011901A (es) 2019-12-05
AU2018369913A1 (en) 2019-10-17
US20190154697A1 (en) 2019-05-23
KR20220021024A (ko) 2022-02-21
EP3713577A1 (en) 2020-09-30
CA3058762A1 (en) 2019-05-23
MY188418A (en) 2021-12-08
SG11201909366XA (en) 2019-11-28
PH12019502373A1 (en) 2020-07-13
ZA201906445B (en) 2020-08-26
KR20200007778A (ko) 2020-01-22
CN110461332A (zh) 2019-11-15
EP3713577A4 (en) 2021-08-18
JP2020516692A (ja) 2020-06-11
IL269611A (en) 2019-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2746503C1 (ru) Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
RU2734776C1 (ru) Способы определения почечной функции
Hsyu et al. Stereoselective renal clearance of pindolol in humans.
Al‐Hadiya Niclosamide: comprehensive profile
US20160047830A1 (en) Lysophosphatidic acid detection
Mora et al. Monitoring the formation of insulin oligomers using a NIR emitting glucose-conjugated BODIPY dye
ES2891088T3 (es) Métodos de diagnóstico, agentes terapéuticos y usos de los mismos
Zhang et al. Combination of changeable π-conjugation and hydrophilic groups for developing water-soluble small-molecule NIR-II fluorogenic probes
Gu et al. A novel fluorescent probe based on β-C-glycoside for quantification of bovine serum albumin
Zhou et al. Fast and sensitive detection of nitroxynil using a chalcone-based supramolecular fluorescent sensor
Muramatsu et al. High-performance liquid chromatographic determination of erdosteine and its optical active metabolite utilizing a fluorescent chiral tagging reagent, R-(−)-4-(N, N-dimethylaminosulfonyl)-7-(3-aminopyrrolidin-1-yl)-2, 1, 3-benzoxadiazole
US8318503B2 (en) Method for determining the amount of conjugated taxane in polyglut acid-taxane conjugates
US11091646B2 (en) Luminescent squaraine rotaxane compounds
CN114790202B (zh) 生物硫醇激活的沉淀染料类高效诊疗一体化探针的制备与应用
RU2713151C1 (ru) Конъюгат флуоресцентного красителя с веществом пептидной природы, включающим псма-связывающий лиганд на основе производного мочевины для визуализации клеток, экспрессирующих псма, способ его получения и применения
CN112851575B (zh) 具有聚集诱导发光性质的比率型溶酶体pH探针及应用
US20230126856A1 (en) Reagents for rapid chiral labeling and analysis of amine containing enantiomers
Nakahara et al. In vivo microdialysis of neurotransmitters and their metabolites
Díaz Pérez Selective inhibitors of SLC6A14
JP5723567B2 (ja) 含窒素複素環式化合物の定量方法
Strobel et al. Syntheses of the sulfoconjugated isomers of norepinephrine and dopamine, controlled by HPLC with ultraviolet detection
JP2006284298A (ja) 大腸腫瘍の診断方法
JP4503228B2 (ja) キノリンオキシド誘導体およびその製造方法
Vajpayee Development of dyes/tracers for analysis of renal functions
CN116271116A (zh) 具有改进结构的68Ga标记的Exendin 4放射性探针及其制备方法