JP2020516692A - 血漿中の蛍光化合物を調製及び分析する方法 - Google Patents

Abstract

血漿中の蛍光化合物の量を測定する方法が開示される。この方法は、血漿試料を収集するステップと、血漿試料を少なくとも１つの溶媒で希釈するステップと、希釈した血漿試料を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析して、血漿中の蛍光化合物の量を測定するステップと、を含む。血漿試料は、ＨＰＬＣ分析前に、乾燥に乾燥させられていない。また、血漿試料には、内部標準物質が添加されていない。【選択図】図１

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年１１月２０日出願の米国特許仮出願第６２／５８８、６０６号に基づく優先権を主張するものである。上記出願の開示内容は、参照により本明細書中に援用される。

（技術分野）
本発明の分野は、一般的に、血漿中の蛍光化合物の検出及び定量化に関する。より詳細には、本出願は、患者の血漿中の（２Ｒ、２´Ｒ）−２、２´−（（３、６−ジアミノピラジン−２、５−ジカルボニル）ビス（アザンジイル））ビス（３−ヒドロキシプロパン酸）を分析及び定量化するための方法に関する。

患者の血漿中の低分子医薬品の分析は、しばしば、臨床試験の期間中及び終了後の両方で必要とされる。臨床試験の期間中は、効能を最適化し、かつ副作用を最小限に抑えるために、医薬品の正しい用量を確立する必要がある。ある場合には、薬の用量が少なすぎること（すなわち、最小の効能及び治療効果）は、薬の用量が多すぎること（すなわち、有害な副作用）と同じくらい有害である。

腎糸球体濾過率（ＧＦＲ）は、患者の腎機能の最も信頼できる評価基準として広く認められている。したがって、急性または慢性の腎機能障害に起因する腎機能を評価するために、ＧＦＲの正確かつリアルタイムな測定についての医療的ニーズが存在する。腎機能の評価における現在の一般的な臨床診察では、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ及びＷａｉｋａｒまたはＩｎｋｅｒらのＧＦＲ方程式に基づいて推定ＧＦＲ（ｅＧＦＲ）を得るために、血清クレアチニン濃度と２４時間クリアランス率と測定する。しかしながら、この方法論は、適切な感度及び正確さを欠き、さらに、適切な研究所で試料を処理する時間を必要とするため時間がかかる。加えて、測定結果は、年齢、水分補給、筋肉量、及び食事などの因子に応じて大幅に変化する。

図１に示すイオヘキソール（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ（登録商標））のような外因性ＧＦＲトレーサ剤は、有効なＧＦＲ評価を提供する。イオヘキソールは、患者の臓器において代謝または貯蔵されない。イオヘキソールの分布は、毛細血管中の単純な濃度勾配にしたがい、尿細管で分泌または再吸収されることなく、単純な糸球体濾過によって完全に消失する。ＧＦＲ測定にイオヘキソールを使用するために、複数の時点で患者から血液試料を収集し、次いで、注意深い研究所分析を行う。ＧＦＲ値は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ＰＫ／ＰＤモデリング及びシミュレーションソフトウェアを用いたデータのＰＫ解析によって求められる。これは、多大な労力を要するプロセスであり、医療従事者及び検査技師に多大な負担を強いる。また、その後に必要とされる研究所分析に加えて、複数の試料を数時間にわたって収集しなければならないので、長い時間を要する。

慢性腎臓病（ＣＫＤ）は、腎機能を経時的に徐々に失うことを特徴とする疾患である。ＣＫＤには、腎臓に障害を与え、患者の血流から老廃物を適切に除去する能力を低下させる疾患が含まれる。ＣＫＤの合併症には、高血圧、貧血（赤血球数減少）、骨脆弱性、栄養不良、神経損傷、心疾患のリスク増加などが含まれる。全米腎臓財団によると、ＣＫＤの全症例の約２／３が、糖尿病または高血圧に起因する。家族歴に加えて、腎臓病の他のリスク因子には、年齢、民族性、高血圧、糖尿病が含まれる。ＧＦＲは、腎機能のレベルを決定し、患者のＣＫＤのステージ（病期）を評価するための最良の評価基準である。

ＧＦＲは、ＣＫＤの病期を決定する腎機能レベルを求めるための重要な評価項目である。以下に示すように、患者のＧＦＲが低いほど、ＣＫＤの重症度はより高くなる。

リアルタイムで経皮的に検出できる外因性蛍光剤を見つけることに多くの努力が向けられてきた。それについての教示は、参照によりその内容全体が本明細書に援用される特許文献１〜５を参照されたい。様々な他の小分子のほかに、ＭＢ−１０２と称される、優れた光物理特性、並びに他の化学的特性及び物理的特性を示す蛍光化合物が合成されている。

図１に示す、ＭＢ−１０２、すなわち、（２Ｒ、２´Ｒ）−２、２´−（（３、６−ジアミノピラジン−２、５−ジカルボニル）ビス（アザンジイル））ビス（３−ヒドロキシプロパン酸）は、リアルタイムなＧＦＲ測定のために開発中の蛍光剤である。この蛍光剤は、４３４ｎｍを励起すると、５５６ｎｍの強力な蛍光信号を発する。また、この蛍光剤は、現在、ヒト臨床試験中である。重要なことには、患者の血流中を循環するＭＢ−１０２の量、及びＭＢ−１０２の腎濾過除去率は、リアルタイムで経皮的に測定することができる。これにより、時間のかかる試料収集及び研究所分析が不要になるだけでなく、患者の腎機能のリアルタイムな評価を医療従事者に提供することができる。したがって、患者の血漿または血流中のＭＢ−１０２の量を定量化するために使用される方法の正確性を検証する必要がある。

血漿試料の研究所分析は、多くの場合、タンパク質の沈殿、蒸発、及び乾燥と、その後の、ＨＰＬＣに適合する溶媒中での再構成を伴う。これは労力を要するプロセスであり、また、結果が得られるまで長い時間がかかる。タンパク質沈殿法の別の短所は、正確な結果を得るためには、試料中に内部標準物質を必要とすることである。これらのステップにより、分析に必要な時間が長くなり、また、エラ−発生の機会が導入される。したがって、分析に必要な時間を短縮し、かつエラ−発生の機会を低減する必要がある。

米国特許第９、４８０、６８７号明細書 米国特許第９、１１４、１６０号明細書 米国特許第８、７２２、６８５号明細書 米国特許第８、１１５、０００号明細書 米国特許第８、７７８、３０９号明細書

一態様では、血漿中の蛍光化合物の量を測定する方法が開示される。この方法は、血漿試料を収集するステップと、血漿試料を少なくとも１つの溶媒で希釈するステップと、希釈した血漿試料を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析して、血漿中の蛍光化合物の量を測定するステップと、を含む。血漿試料は、ＨＰＬＣ分析前に、乾燥に乾燥させられていない。また、血漿試料には、内部標準物質が添加されていない。

別の態様では、血漿中の蛍光化合物の量を測定する別の方法が開示される。この方法は、患者から血漿試料を収集するステップと、血漿試料に少なくとも１つの溶媒を添加して、血漿タンパク質を沈殿させるステップと、沈殿した血漿タンパク質を血漿試料から除去するステップと、血漿試料を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析して、血漿中の蛍光化合物の量を測定するステップと、を含む。血漿試料は、ＨＰＬＣ分析前に、乾燥に乾燥させられていない。また、血漿試料には、内部標準物質が添加されていない。

ＭＢ−１０２及びイオヘキソールの構造を示す。 １％血漿／ＰＢＳ中の３．３ｎｇ／ｍＬのＭＢ−１０２と、対照ブランク（１％血漿／ＰＢＳ）とのＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを示す。 ２つの異なる試料についての、１％血漿／ＰＢＳ中の０．４ｎｇ／ｍＬのＭＢ−１０２の信号／ノイズ、ＵＳＰテーリング係数、及びＵＳＰプレートカウントを示す。 ２つの異なる試料についての、１％血漿／ＰＢＳ中の０．４ｎｇ／ｍＬのＭＢ−１０２の信号／ノイズ、ＵＳＰテーリング係数、及びＵＳＰプレートカウントを示す。 １×ＰＢＳ中に添加されたＭＢ−１０２のピーク純度を示す。 標準試料調製後の血漿試料中のＭＢ−１０２のピーク純度を示す。 患者から取得された血漿中のＭＢ−１０２についての、ＧＭＰ契約研究所での試験結果と院内評価との相関関係を示すグラフである。 臨床試験に参加した１２例の患者における、ＭＢ−１０２の薬物動態解析の結果を示す。 臨床試験に参加した３例の患者における、ＭＢ−１０２とイオヘキソールとのクリアランス率を比較したグラフである。 臨床試験に参加した３例の患者における、ＭＢ−１０２とイオヘキソールとのクリアランス率を比較したグラフである。 臨床試験に参加した３例の患者における、ＭＢ−１０２とイオヘキソールとのクリアランス率を比較したグラフである。 血漿試料中のＭＢ−１０２濃度についての、院内試験での直接希釈法による試験結果と、院内試験でのタンパク質沈殿法による試験結果との相関関係を示すグラフである。 血漿試料中のＭＢ−１０２濃度についての、ＧＭＰ契約研究所での直接希釈法による試験結果と、院内試験でのタンパク質沈殿法による試験結果との相関関係を示すグラフである。 溶血（ヘモグロビン濃度は５０ｍｇ／ｄＬ〜１００ｍｇ／ｄＬの範囲）を示す血漿試料中のＭＢ−１０２濃度についての、直接希釈法による試験結果とタンパク質沈殿法による試験結果との相関関係を示すグラフである。 溶血（ヘモグロビン濃度は１００ｍｇ／ｄＬ〜２５０ｍｇ／ｄＬの範囲）を示す血漿試料中のＭＢ−１０２濃度についての、直接希釈法による試験結果とタンパク質沈殿法による試験結果との相関関係を示すグラフである。

本明細書に開示されるのは、それを必要とする患者の蛍光化合物の濃度をモニタリングする方法である。この方法は、血漿試料を収集するステップと、血漿試料を少なくとも１つの溶媒で希釈するステップと、希釈した血漿試料を高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析するステップとを含む。重要なことには、血漿試料はＨＰＬＣ分析前に乾燥させられておらず、血漿試料に内部標準物質が添加されていない。

いくつかの実施形態では、蛍光化合物は、本明細書の他の箇所に開示された化学式Ｉで表される化合物である。好ましくは、蛍光化合物は、下記に示す、（２Ｒ、２´Ｒ）−２、２´−（（３、６−ジアミノピラジン−２、５−ジカルボニル）ビス（アザンジイル））ビス（３−ヒドロキシプロパン酸）（ＭＢ−１０２）またはその薬学的に許容可能な塩である。

いくつかの態様では、血漿試料は、患者から血液試料を収集することによって用意される。血漿は、当技術分野で既知の方法を用いて収集される。血漿は、ヒト患者、動物、またはインビトロ実験系から収集することができる。血漿を収集可能な動物の例としては、これに限定しないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、サル、ラット、及びマウスが挙げられる。好ましくは、血漿は、ヒト患者から収集される。血漿は、蛍光化合物について直ちに分析されるか、その後の時点での分析のために保存され得る。その後の時点での分析のために血漿試料を保存する場合、試料の保存は、試料の分解を最小限に抑えるように行われる。保存方法の１つは、試料を−８０°Ｃ以下で凍結保存することである。当技術分野で認められている、試料の分解を防止する他の保存方法も許容可能であり、それも本開示に包含される。

ＨＰＬＣ分析の前に、試料は、少なくとも１つの溶媒で希釈される。溶媒は、水性溶媒または有機溶媒であり得る。いくつかの態様では、水性溶媒は、生理食塩水である。いくつかの態様では、２以上の溶媒が使用される。その場合、各溶媒は、水性溶媒であってもよいし、非水性溶媒であってもよく、互いに独立して選択される。

いくつかの態様では、水性溶媒は、リン酸、酢酸、重炭酸、炭酸、ギ酸、グルコン酸、乳酸、クエン酸、スルホン酸、アンモニウム、グアニジニウム、ＨＥＰＥＳ、カコジル酸、トリス、トリス−ＨＣｌ、マレイン酸、ホウ酸、グリシネート、コハク酸、ＰＩＰＥＳ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される緩衝液の形態を有する。好ましくは、水性溶媒は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

適切な非水性溶媒としては、これに限定しないが、メタノール、エタノール、エチレングリコール、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ブタノール、四塩化炭素、ジエチレングリコール、ジエチルエーテル、ＤＭＥ、エチレングリコール、塩化メチレン、ニトロメタン、石油エーテル、プロパノール、ピリジン、トルエン、ＭＴＢＥ、トリエチルアミン、キシレン、及びベンゼンが挙げられる。好ましくは、有機溶媒は、水との混和性を有する。最も好ましくは、有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、またはＤＭＳＯである。一実施形態では、有機溶媒は、メタノールである。

緩衝液のｐＨはＨＰＬＣ溶媒系に適合するようにし、ＨＰＬＣ分析を実施するのに必要な時間内に血漿試料の分解を引き起こさないようにする。いくつかの態様では、ｐＨは、約２〜１２であり得る。さらに別の態様では、水性溶媒のｐＨは、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２であり得る。この文脈において使用するとき、ｐＨに関する「約」は±０．５の範囲を意味する。さらに別の態様では、水性試料のｐＨは、約７．０〜７．４の範囲の略生理学的ｐＨである。

溶媒による血漿試料の希釈は、血漿中の蛍光化合物の濃度がＨＰＬＣで容易に分析されるように行われる。当技術分野で知られているように、検体（試料）の濃度が高すぎると、カラム及び検出器に過負荷をかける恐れがある。検体の濃度が高すぎる場合、ピークテーリング及び検体の保持時間の変化をもたらし、その結果、定量化及び同定における誤差をもたらし得る。一方、検体の濃度が低すぎる場合、信号は、ベースラインノイズ中に失われ、適切に検出されない恐れがある。本明細書に開示される方法が正確な結果を提供するためには、上記の状況（検体の濃度が高すぎる場合及び検体の濃度が低すぎる場合）は両方とも回避する必要がある。検体の濃度が高すぎることを判定するためだけに試料を分析することは、珍しくはない。そのような場合には、試料を再び希釈して再分析する。いくつかの態様では、血漿試料は、１：１ ｖ／ｖ（試料：溶剤）の希釈比で、溶媒で希釈される。さらに別の態様では、希釈比は、１：（０．１〜１００） ｖ／ｖである。さらに別の態様では、希釈比は、（０．１〜１００）：１ ｖ／ｖである。さらに別の態様では、希釈比（ｖ／ｖ）は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００である。

本願明細書に開示される、患者の血漿中の蛍光化合物の濃度を測定する方法のさらに別の態様は、患者から血漿試料を収集するステップと、血漿試料に少なくとも１つの溶媒を加えて、タンパク質を沈殿させるステップと、沈殿したタンパク質を血漿試料から除去するステップと、血漿試料を高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析するステップとを含む。重要なことには、血漿試料はＨＰＬＣ分析前に乾燥させられておらず、血漿試料に内部標準物質が添加されていない。

蛍光化合物は、蛍光色素であり得る。本開示の蛍光色素は、その吸収波長、励起波長、及び発光波長の全てが、約３５０ｎｍまたはそれ以上の近赤外（ＮＩＲ）または可視光のスペクトル範囲内に収まる傾向がある。このことは、診断処置に有益である。可視光及びＮＩＲ光は組織を損傷する恐れが低いためである。約３５０ｎｍまたはそれ以上の波長を有する光は、組織に浸透する傾向があり、これにより、約３５０ｎｍ未満のＵＶ波長を使用した場合には到達できない可能性がある関心組織において診断処置を実施することが可能になる。適切な蛍光染料としては、アクリジン、アクリドン、アントラセン、アントラキノン、アザアズレン、アゾアズレン、ベンゼン、ベンゾイミダゾール、ベンゾフラン、ベンゾインドカルボシアニン、ベンゾインドール、ベンゾチオフェン、カルバゾール、クマリン、シアニン、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、ジピロロ染料、フラボン、フルオレセイン、イミダゾール、インドカルボシアニン、インドシアニン、インドール、イソインドール、イソキノリン、ナフタセンジオン、ナフタレン、ナフトキノン、フェナントレン、フェナントリジン、フェナントリジン、フェノセレナジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フェニルキサンテン、ポリフルオロベンゼン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリジン、ピリミドン、ピロール、量子ドット、キノリン、キノロン、ローダミン、スクアライン、テトラセン、チオフェン、トリフェニルメタン染料、キサンテン、キサントン、及びそれらの誘導体が挙げられる。

いくつかの態様では、蛍光化合物は、本明細書の他の箇所に開示された化学式Ｉで表される化合物である。好ましくは、蛍光化合物は、下記に示す、（２Ｒ、２´Ｒ）−２、２´−（（３、６−ジアミノピラジン−２、５−ジカルボニル）ビス（アザンジイル））ビス（３−ヒドロキシプロパン酸）（ＭＢ−１０２）またはその薬学的に許容可能な塩である。

いくつかの態様では、血漿試料は、患者から血液試料を収集することによって用意される。血漿は、当技術分野で既知の方法を用いて単離される。血漿は、蛍光化合物について直ちに分析されるか、またはその後の時点で分析のために保存され得る。その後の時点での分析のために血漿試料を保存する場合、試料の保存は、試料の分解及び破壊を最小限に抑えるように行われる。保存方法の１つは、試料を−８０°Ｃ以下で凍結保存することである。当技術分野で認められている、試料の分解を防止する他の保存方法も許容可能であり、それも本開示に包含される。

いくつかの態様では、タンパク質沈殿を引き起こすために加えられる溶媒は、メタノール、エタノール、エチレングリコール、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ブタノール、四塩化炭素、ジエチレングリコール、ジエチルエーテル、ＤＭＥ、エチレングリコール、塩化メチレン、ニトロメタン、石油エーテル、プロパノール、ピリジン、トルエン、ＭＴＢＥ、トリエチルアミン、キシレン、及びベンゼンからなる群より選択される有機溶媒である。いくつかの態様では、２以上の溶媒が使用される。その場合、各溶媒は、水性溶媒であってもよいし、非水性溶媒であってもよく、互いに独立して選択される。

沈殿したタンパク質の除去は、当技術分野で既知の方法を用いて行われる。濾過及び遠心分離が、本開示に包含される２つの方法である。

沈殿したタンパク質を除去した後、試料は、直接分析されるか、または追加の溶媒によって希釈され得る。希釈に使用される溶媒は、水性溶媒、非水性溶媒、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、水性溶媒は、生理食塩水である。さらに別の態様では、水性溶媒は、水性溶媒は、リン酸、酢酸、重炭酸、炭酸、ギ酸、グルコン酸、乳酸、クエン酸、スルホン酸、アンモニウム、グアニジニウム、ＨＥＰＥＳ、カコジル酸、トリス、トリス−ＨＣｌ、マレイン酸、ホウ酸、グリシネート、コハク酸、ＰＩＰＥＳ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される緩衝液である。好ましくは、水性溶媒は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

緩衝液のｐＨはＨＰＬＣ溶媒系に適合するようにし、ＨＰＬＣ分析を実施するのに必要な時間内に血漿試料の分解を引き起こさないようにする。いくつかの態様では、ｐＨは、約２〜１２であり得る。さらに別の態様では、水性溶媒のｐＨは、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２であり得る。この文脈において使用するとき、ｐＨに関する「約」は±０．５の範囲を意味する。さらに別の態様では、水性試料のｐＨは、約７．０〜７．４の範囲の略生理学的ｐＨである。

さらに別の態様では、分析前に試料を希釈するのに使用される溶媒は、非水性有機溶媒である。適切な非水性有機溶媒としては、これに限定しないが、メタノール、エタノール、エチレングリコール、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ブタノール、四塩化炭素、ジエチレングリコール、ジエチルエーテル、ＤＭＥ、エチレングリコール、塩化メチレン、ニトロメタン、石油エーテル、プロパノール、ピリジン、トルエン、ＭＴＢＥ、トリエチルアミン、キシレン、及びベンゼンが挙げられる。好ましくは、有機溶媒は、水との混和性を有する。最も好ましくは、有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、またはＤＭＳＯである。一実施形態では、有機溶媒は、メタノールである。

さらに別の態様では、試料を希釈するのに使用される溶媒は、本明細書に開示される水性溶媒及び有機溶媒の任意の可能な組み合わせから選択される少なくとも２つの別個の溶媒を含む。加えて、ＨＰＬＣが分析に用いられるので、検体の検出を妨げない溶媒系が選択される。

タンパク質を沈殿させるのに、及び／またはＨＰＬＣ分析用の試料を用意するのに使用される溶媒の量は、試料によって異なる。本明細書の別の箇所に記載されているように、必要とされる溶媒の量は、ＨＰＬＣが適切な結果を提供するように調節される。この方法では、（ａ）タンパク質を沈殿させるための溶媒添加と、（ｂ）タンパク質沈殿物を除去した後の上清への溶媒添加との２つの希釈が行われる。この方法では、上記の２段階で加えられる溶媒の総量が、ＨＰＬＣ分析における検体の濃度に影響を与える。血漿試料に添加される溶媒の合計量は、検体の濃度が高すぎたり低すぎたりしないようにする。いくつかの態様では、血漿試料は、１：１ ｖ／ｖ（試料：溶剤）の希釈比で、溶媒で希釈される。希釈比は、両方の希釈における溶媒の合計体積に対する試料の比を指す。さらに別の態様では、希釈比は、１：（０．１〜１００） ｖ／ｖである。さらに別の態様では、希釈比は、（０．１〜１００）：１ ｖ／ｖである。さらに別の態様では、希釈比（ｖ／ｖ）は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００である。２つの希釈に使用される溶媒の比は、（０．１〜１００）：（１００〜０．１） ｖ／ｖであり得る。いくつかの態様では、タンパク質沈殿のための希釈ステップのみが行われ得る。タンパク質沈殿後の試料の濃度は、さらなる希釈を必要としない濃度になるようにする。

当技術分野で知られているように、血液試料を患者から収集するとき、血液溶血が問題となり得る。血液溶血には様々な原因があり、そのような原因としては、検体収集の困難さ、安全でないライン、汚染、不適切な針の大きさ、不適切なチューブ結合、不適切に充填された試料チューブ、試料の保管などが挙げられる。収集された試料中の血液溶血は、血漿について実施される分析を妨げる恐れがある。溶血は、溶血した赤血球の成分による血漿の汚染に起因して、様々なタイプの分析において不正確な臨床検査結果をもたらすことが知られている。溶血後、ヘモグロビンが、試料の血漿または血清中に放出される。溶血の一般的な徴候の１つは、患者の血漿または血清における色の変化である。血漿または血清中のヘモグロビン量、すなわち溶血の有無の大まかな推定は、参照によりその教示内容の全体が本明細書に援用される「http://blog.fisherbioservices.com/avoiding-hemolysis-in-blood-sample-collection-and-processing」に記載されたカラーチャートを用いて視覚的に行うことができる。溶血のもう１つの徴候は、光の散乱を引き起こす赤血球の減少に起因する、血液試料の濁りの減少である。

いくつかの態様では、患者の血漿中の蛍光化合物の濃度を測定する方法は、少なくともいくらかの溶血が生じた試料に適用される。さらに別の態様では、患者の血漿中のＭＢ−１０２（蛍光化合物）の濃度を測定する方法は、部分的または完全な溶血が生じた血漿試料に適用される。

本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、蛍光化合物は、下記の化学式Ｉで表される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩である。

式中、
Ｘ^１及びＸ^２は、互いに独立して、-ＣＯ_２Ｒ^１、−ＣＯＮＲ^１Ｒ^２、−ＣＯ（ＡＡ）、及び−ＣＯＮＨ（ＰＳ）からなる群から選択され、
Ｙ^１及びＹ^２は、互いに独立して、ＮＲ^１Ｒ^２、及び

からなる群から選択され、
Ｚ^１は、単結合、−ＣＲ^１Ｒ^２−、−Ｏ−、−ＮＲ^１−、−ＮＣＯＲ^１−、−Ｓ−、−ＳＯ−、及び−ＳＯ_２−からなる群から選択され、
Ｒ^１及びＲ^２は、互いに独立して、Ｈ、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）ａＨ、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ａＣＨ_３、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ａＣＯ_２Ｈ、−（ＣＨＣＯ_２Ｈ）_ａＣＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_３Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_３ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_３Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_３ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ_３、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ^２−、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４ ^３−、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３Ｈ_２、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３Ｈ⁻、及び−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３ ^２−からなる群から選択され、
ＡＡは、ペプチド結合またはアミド結合によって互いに結合された１以上の天然または非天然のアミノ酸を含むポリペプチド鎖であり、ＡＡの各々は、互いに同一であってもよいし異なっていてもよく、
ＰＳは、グリコシド結合によって互いに結合された１以上の単糖単位を含む硫化多糖鎖または非硫化多糖鎖であり、
ａは、１〜１０の範囲の数であり、
ｃは、１〜１００の範囲の数であり、
ｍ及びｎは、互いに独立して、１〜３の範囲の数である。

いくつかの態様では、Ｘ_１及びＸ_２の少なくとも一方が、−ＣＯ（ＰＳ）または−ＣＯ（ＡＡ）である。さらに別の態様では、Ｘ_１及びＸ_２の両方が、−ＣＯ（ＡＡ）である。

（ＡＡ）は、ペプチドまたはアミド結合によって互いに結合された１以上の天然または非天然のアミノ酸を含むペプチド鎖である。ペプチド鎖（ＡＡ）は、単一のアミノ酸、ホモポリペプチド鎖、またはヘテロポリペプチド鎖であり得、任意の適切な長さを有し得る。いくつかの実施形態では、天然または非天然のアミノ酸は、α−アミノ酸である。さらに別の態様では、α−アミノ酸は、Ｄ−α−アミノ酸またはＬ−α−アミノ酸である。ポリペプチド鎖は、２以上のアミノ酸を含み、すべての態様において、各アミノ酸は、互いに独立して、これに限定しないが、側鎖構造及び立体化学構造から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖は、１〜１００個のアミノ酸、１〜９０個のアミノ酸、１〜８０個のアミノ酸、１〜７０個のアミノ酸、１〜６０個のアミノ酸、１〜５０個のアミノ酸、１〜４０個のアミノ酸、１〜３０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、または１〜１０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖は、１〜１００個のα−アミノ酸、１〜９０個のα−アミノ酸、１〜８０個のα−アミノ酸、１〜７０個のα−アミノ酸、１〜６０個のα−アミノ酸、１〜５０個のα−アミノ酸、１〜４０個のα−アミノ酸、１〜３０個のα−アミノ酸、１〜２０個のα−アミノ酸、または１〜１０個のα−アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−システイン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン、グリシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−ホモセリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、及びＤ−バリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖（ＡＡ）のα−アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ホモセリン、リジン、及びセリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖（ＡＡ）のα−アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモセリン、及びセリンからなる基から選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖（ＡＡ）は、単一のアミノ酸（例えば、Ｄ−アスパラギン酸またはＤ−セリン）を指す。

いくつかの実施形態では、（ＡＡ）は、２１の必須アミノ酸からなる群から選択される単一のアミノ酸である。別の態様では、（ＡＡ）は、Ｄ−アルギニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−ホモセリン、Ｄ−リジン、及びＤ−セリンからなる群から選択される。好ましくは、（ＡＡ）は、Ｄ−アスパラギン酸、グリシン、Ｄ−セリン、またはＤ−チロシンである。最も好ましくは、（ＡＡ）は、Ｄ−セリンである。

いくつかの実施形態では、（ＡＡ）は、β−アミノ酸である。β−アミノ酸の例としては、これに限定しないが、β−フェニルアラニン、β−アラニン、３−アミノ−３−（３−ブロモフェニル）プロピオン酸、３−アミノブタン酸、シス−２−アミノ−３−シクロペンテン−１−カルボン酸、トランス−２−アミノ−３−シクロペンテン−１−カルボン酸、３−アミノイソ酪酸、３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸、３−アミノ−４−（４−ビフェニルイル）酪酸、シス−３−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、トランス−３−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、３−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸、２−（アミノメチル）フェニル酢酸、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸、３−アミノ−４−（２−ナフチル）酪酸、３−アミノ−５−フェニルペンタン酸、３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸、４−ブロモ−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−クロロ−β−ホモＰｈｅ−ＯＨ、４−クロロ−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、２−シアノ−β−ホモＰｈｅ−ＯＨ、２−シアノ−β−ホモＰｈｅ−ＯＨ、４−シアノ−β−ホモＰｈｅ−ＯＨ、３−シアノ−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−シアノ−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、３、４−ジメトキシ−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、γ、γ−ジフェニル−β−ホモａｌａ−ＯＨ、４−フルオロ−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、β−Ｇｌｎ−ＯＨ、β−ホモａｌａ−ＯＨ、β−ホモａｒｇ−ＯＨ、β−ホモｇｌｎ−ＯＨ、β−ホモｇｌｕ−ＯＨ、β−ホモｈｙｐ−ＯＨ、β−ホモｌｅｕ−ＯＨ、β−ホモｌｙｓ−ＯＨ、β−ホモｍｅｔ−ＯＨ、β２−ホモフェニルアラニン、β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、β３−ホモｐｒｏ−ＯＨ、β−ホモｓｅｒ−ＯＨ、β−ホモｔｈｒ−ＯＨ、β−ホモｔｒｐ−ＯＨ、β−ホモｔｒｐ−ＯＭｅ、β−ホモｔｙｒ−ＯＨ、β−Ｌｅｕ−ＯＨ、β−Ｌｅｕ−ＯＨ、β−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨ、３−メトキシ−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、３−メトキシ−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−メトキシ−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−メチル−β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、２−メチル−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、３−メチル−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−メチル−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、β−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−（４−ピリジル）−β−ホモａｌａ−ＯＨ、２−（トリフルオロメチル）−β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、３−（トリフルオロメチル）−β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、４−（トリフルオロメチル）−β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、２−（トリフルオロメチル）−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、３−（トリフルオロメチル）−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−（トリフルオロメチル）−β−Ｐｈｅ−ＯＨ、β−Ｔｙｒ−ＯＨ、３−（ベンジルアミノ）プロピオン酸エチル、β−Ａｌａ−ＯＨ、３−（アミノ）−５−ヘキセン酸、３−（アミノ）−２−メチルプロピオン酸、３−（アミノ）−２−メチルプロピオン酸、３−（アミノ）−４−（２−ナフチル）酪酸、３、４−ジフルオロ−β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、γ、γ−ジフェニル−β−ホモａｌａ−ＯＨ、４−フルオロ−β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、β−Ｇｌｎ−ＯＨ、β−ホモａｌａ−ＯＨ、β−ホモａｒｇ−ＯＨ、β−ホモｇｌｎ−ＯＨ、β−ホモｇｌｕ−ＯＨ、β−ホモｈｙｐ−ＯＨ、β−ホモｉｌｅ−ＯＨ、β−ホモｌｅｕ−ＯＨ、β−ホモｌｙｓ−ＯＨ、β−ホモｍｅｔ−ＯＨ、β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、β３−ホモプロリン、β−ホモｔｈｒ−ＯＨ、β−ホモｔｒｐ−ＯＨ、β−ホモｔｙｒ−ＯＨ、β−Ｌｅｕ−ＯＨ、２−メチル−β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、３−メチル−β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、β−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−（３−ピリジル）−β−ホモａｌａ−ＯＨ、３−（トリフルオロメチル）−β−ホモｐｈｅ−ＯＨ、β−グルタミン酸、β−ホモアラニン、β−ホモグルタミン、β−ホモグルタミン、β−ホモヒドロキシプロリン、β−ホモイソロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモメチオニン、β−ホモフェニルアラニン、β−ホモプロリン、β−ホモセリン、β−ホモトレオニン、β−ホモトリプトファン、β−ホモチロシン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、ピロリジン−３−カルボン酸、及びβ−Ｄａｂ−ＯＨが挙げられる。

（ＰＳ）は、グリコシド結合によって互いに結合された１以上の単糖単位を含む硫酸化多糖鎖または非硫酸化多糖鎖である。多糖鎖（ＰＳ）は、任意の適切な長さを有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、多糖鎖は、１〜１００個の単糖単位、１〜９０個の単糖単位、１〜８０個の単糖単位、１〜７０個の単糖単位、１〜６０個の単糖単位、１〜５０個の単糖単位、１〜４０個の単糖単位、１〜３０個の単糖単位、１〜２０個の単糖単位、または１〜１０個の単糖単位も含み得る。いくつかの実施形態では、多糖鎖（ＰＳ）は、ペントース単糖単位またはヘキソース単糖単位からなるホモ多糖鎖である。別の実施形態では、多糖鎖（ＰＳ）は、ペントース単糖単位及びヘキソース単糖単位の一方または両方からなるヘテロ多糖鎖である。いくつかの実施形態では、多糖鎖の単糖単位（ＰＳ）は、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びリボースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、多糖鎖（ＰＳ）は、単一の単糖単位（例えば、グルコースまたはフルクトース）を指す。さらに別の態様では、多糖鎖は、その糖上の１または複数のヒドロキシ基がアミン基で置換されたアミノ糖である。カルボニル基との結合は、アミンまたはヒドロキシ基を介して行うことができる。

いくつかの実施形態では、化学式Ｉのピラジン誘導体において、Ｙ^１及びＹ^２の少なくとも一方は、

である。
Ｚ^１は、単結合、−ＣＲ^１Ｒ^２−、−Ｏ−、−ＮＲ^１−、−ＮＣＯＲ^１−、−Ｓ−、−ＳＯ−、及び−ＳＯ_２−からなる群から選択され、
Ｒ^１及びＲ^２は、互いに独立して、Ｈ、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）ａＨ、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ａＣＨ_３、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ａＣＯ_２Ｈ、−（ＣＨＣＯ_２Ｈ）_ａＣＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_３Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_３ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_３Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_３ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ_３、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ^２−、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４ ^３−、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３Ｈ_２、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３Ｈ⁻、及び−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３ ^２−からなる群から選択され、ａ、ｃ、ｍ及びｎは、上述した通りである。

さらに別の態様では、Ｙ^１及びＹ^２の少なくとも一方、並びに、Ｒ^１及びＲ^２は上述した通りである。さらに別の態様では、Ｙ^１及びＹ^２の両方、並びに、Ｒ^１及びＲ^２は上述した通りである。あるいは、Ｒ^１及びＲ^２は、互いに独立して、Ｈ、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ａＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_３Ｈ、−（ＣＨ^２）_ａＮＨＳＯ_３Ｈ、及び−（ＣＨ_２）ａＰＯ_３Ｈ_２からなる群から選択される。さらに別の態様では、Ｒ^１及びＲ^２は両方とも水素である。

最も好ましくは、ピラジンは、下記の化学式Ｉで表される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩である。

ピラジン化合物のいずれの態様においても、１または複数の原子は、代替的に、同一元素の同位体標識原子で置換してもよい。例えば、水素原子は、重水素またはトリチウムで同位体標識することができ、炭素原子は、^１３Ｃまたは^１４Ｃで同位体標識することができ、窒素原子は、^１４Ｎまたは^１５Ｎで同位体標識することができる。同位体標識は、安定同位体であってもよいし、不安定同位体（すなわち、放射性）であってもよい。ピラジン分子は、１以上の同位体標識を含み得る。同位体標識は、部分的であってもよいし、全体的であってもよい。例えば、ピラジン分子を５０％重水素で標識することによって、質量分析または他の技術によって容易にモニタリングすることができる特徴をピラジン分子に付与することができる。別の例として、ピラジン分子をトリチウムで標識することによって、当技術分野で既知の技術を用いてインビボ及びエクスビボの両方でモニタリングすることができる放射性シグネチャをピラジン分子に付与することができる。

薬学的に許容可能な塩は、当技術分野で既知である。本明細書中のいずれの態様においても、ピラジンは、薬学的に許容可能な塩の形態であり得る。非限定的な例として、薬学的に許容可能な塩としては、参照によりその教示内容の全体が本明細書に援用されるＢｅｒｇｅらによる「Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６６（１）、１（１９７７）」に記載されたものが挙げられる。薬学的に許容可能な塩は、カチオン性であってもよいし、アニオン性であってもよい。いくつかの実施形態において、薬学的に許容可能な塩の対イオンは、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エステル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプチン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硝酸メチル、硫酸メチル、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トリエチオダイド、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アミノサリチル酸、アンヒドロメチレンクエン酸塩、アレコリン、アスパラギン酸、重硫酸塩、臭化ブチル、カンホレート、ジグルコン酸塩、二臭化水素酸塩、二コハク酸塩、グリセロリン酸塩、ジェミ硫酸塩（jemisulfate）、ジュドロフッ化物（judrofluoride）、ジュドロヨウ化物（judroiodide）、メチレンビス（サリチル酸塩）、ナパジシル酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルエチルバルビツール酸塩、ピクリン酸塩、プロピオン酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、ベネタミン、クレミゾール、ジエチルアミン、ピペラジン、トロメタミン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、亜鉛ナトリウム、バリウム、及びビスマスからなる群から選択される。塩を形成することができるピラジン誘導体中の官能基は、任意選択で、当技術分野で既知の方法を用いて形成することができる。非限定的な例として、塩酸アミン塩は、ピラジンに塩酸を添加することによって形成することができる。リン酸塩は、ピラジンにリン酸緩衝液を添加することによって形成することができる。スルホン酸、カルボン酸、またはホスホン酸などの存在する酸性官能基は、適切な塩基及び形成された塩で脱プロトン化することができる。あるいは、アミン基を適切な酸でプロトン化してアミン塩を形成してもよい。塩の形態は、単一に荷電されていてもよく、二重に荷電されていてもよく、または三重に荷電されていてもよく、２以上の対イオンが存在する場合、各対イオンは、他の対イオンの各々と同一であってもよいし異なっていてもよい。

本明細書における「ピラジン」、「ピラジン誘導体」、「ピラジン分子」、「ピラジン化合物」、または「ピラジン類似体」に対するすべての言及は、すべての化学式Ｉの化合物に適用される。加えて、さらに、ピラジンに対する各言及は、特に明記しない限り、そのすべての薬学的に許容可能な塩を含む。塩形態は、荷電していても荷電していなくてもよく、また、プロトン化して適切なカチオンを形成していてもよいし脱プロトン化して適切なアニオンを形成していてもよい。本明細書に開示されたすべての態様及び実施形態は化学式Ｉの化合物に適用可能であり、特定の例は単に説明のためのものであり、本開示の範囲を限定するものではない。

いくつかの態様では、患者は、腎臓に少なくとも１つの医学的問題を有することが疑われるかまたは知られており、本明細書に開示された方法は、その患者の腎機能障害または不全のレベルを測定するために使用される。いくつかの態様では、上記の患者の推定ＧＦＲ（ｅＧＦＲ）または以前に測定されたＧＦＲが、１１０未満、９０未満、６０未満、３０未満、または１５未満である。患者のｅＧＦＲは、当技術分野で既知の標準的な医療技術を用いて測定される。いくつかの態様では、患者は、腎臓に医学的な問題を有していないか、または医学的な問題を有することを疑われていない。ＧＦＲモニタリングは、患者の一般的または定期的な健康評価の一部として、または予防的評価として実施される。

患者の高い尿中タンパク質濃度加は、何らかの腎機能障害または不全を示唆し得るので、本明細書に開示された方法は、尿検査値が高いタンパク質濃度を示す患者に適している。いくつかの態様では、患者は、標準的な医学的検査（例えば、ディップスティック検査）によって測定した場合に、高い尿中タンパク質濃度を有する。非限定的な例として、患者の尿検査値は、高いアルブミン濃度、高いクレアチニン濃度、高い血中尿素窒素濃度（すなわち、ＢＵＮ検査）、またはそれらの任意の組み合わせを示し得る。

いくつかの態様では、患者は、少なくともステージ１のＣＫＤと以前に診断されている。別の態様では、患者は、ステージ２のＣＫＤ、ステージ３のＣＫＤ、ステージ４のＣＫＤ、またはステージ５のＣＫＤと以前に診断されている。さらに別の態様では、患者は、ＣＫＤとまだ診断されていないが、ＣＫＤに関連する１以上の危険因子を有する。さらに別の態様では、患者は、ＣＫＤの既知の危険因子を有していない。

実施例

（２Ｒ、２´Ｒ）−２、２´−（（３、６−ジアミノピラジン−２、５−ジカルボニル）ビス−（アザンジイル））−ビス（３−ヒドロキシプロパン酸）（「ＭＢ−１０２」）の調製

ＭＢ−１０２ＡＰＩの試料を調製し、２つの臨床試験で用いるＧＭＰ基準にしたがって分析した。以下の手順が代表的である。

ステップ１． ジベンジル２、２´−（（３、６−ジアミノピラジン−２、５−ジカルボニル）−ビス（アザンジイル））（２Ｒ、２´Ｒ）−ビス（３−ヒドロキシプロパン酸）の形成

クライゼンアダプタ及び添加漏斗を備えた丸底フラスコ（５００ｍＬ）に、Ｄ−セリンベンジルエステル塩酸塩（２４．３３ｇ、１０５．０ｍｍｏｌ）を入れ、カニューレを用いて無水ＤＭＦ（３００ｍＬ）を添加した。溶液を氷浴中で冷却し、Ｎ_２雰囲気下で１５分間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（１９．１６ｍＬ、１１０．０ｍｍｏｌ）を、添加漏斗を用いて３０分かけて少しずつ添加し、さらに３０分後、冷却浴を除去し、二酸（９．９１ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）を一度に添加した。赤レンガ色の懸濁液を３０分間攪拌し、ＨＯＢｔ−Ｈ_２Ｏ（１７．６１ｇ、１１５．０ｍｍｏｌ）を一度に添加した。１５分後、反応フラスコを氷浴中で冷却し、ＥＤＣ−ＨＣｌ（２２．０５ｇ、１１５．０ｍｍｏｌ）を１５分かけて添加した。その結果得られた懸濁液を室温まで徐々に温め、Ｎ_２下で一晩（約１７時間）撹拌した。

暗色の溶液を高真空（浴温度６０°Ｃ）下でシロップ状の残渣に濃縮し、酢酸エチルとＭｉｌｌｉ−Ｑ水（各４００ｍＬ）とに分配した。それらの層を分離し、水層を酢酸エチル（３回、２００ｍＬ）で抽出した。混ぜ合わせた酢酸エチル抽出物を、０．５０Ｍ ＫＨＳＯ_４、飽和ＮａＨＣＯ_３、水、及びブライン（各２５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。減圧下で溶媒を除去すると、２３．７ｇのオレンジ色の固体が得られた。粗生成物を、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ勾配を用いたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィで精製し、ビスアミド（１９．６ｇ、７１％）をオレンジ色の固体として得た：Ｒｆ０．４５［ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）］。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ８．５６（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ、Ｄ_２Ｏと交換可能）、７．４０−７．３３（ｍ、１０Ｈ）、６．７６（ｓ、４Ｈ、Ｄ_２Ｏと交換可能）、５．３７（ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．２０（ｍ、４Ｈ）、４．６６−４．６３（ｄｔ、Ｊ＝８．０、４．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．９７−３．９３（ｍ、２Ｈ）、３．８１−３．７７（ｍ、２Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１７０．１、１６４．９、１４６．４、１３５．８、１２８．４、１２８．０、１２７．６、１２５．９、６６．２、６１．１、５４．４。ＲＰ−ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ５５３．３（Ｍ＋Ｈ）^＋（Ｒｔ＝４．４４分、５〜９５％ Ｂ／６分）。Ｃ_２６Ｈ_２８Ｎ_６Ｏ_８の元素分析：Ｃ、５６．５２；Ｈ、５．１１：Ｎ、１５．２１。実測値：Ｃ、５６．３９：Ｈ、５．１１；Ｎ、１４．９９。

ステップ２． （２Ｒ、２´Ｒ）−２、２´−（（３、６−ジアミノピラジン−２、５−ジカルボニル）ビス−（アザンジイル））−ビス（３−ヒドロキシプロパン酸）の形成

ステップ１で得られたビスアミド（７．７４ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を、１０％パラジウム／Ｃ（０．７７４ｇ）の存在下で、エタノール：水（５６０ｍＬ；３：１、ｖ／ｖ）中で水素化した。反応混合物をアルゴンによってパージし、室温で５．５時間、水素雰囲気下で（スローバブリング法を用いて）撹拌した。反応混合物を再びアルゴンによってパージし、セライトを通した濾過によって触媒を除去した。セライトベッドをエタノール：水（４００ｍＬ；１：１、ｖ／ｖ）で洗浄し、混ぜ合わせた濾過液を真空中で濃縮した。生成物を高真空下で乾燥させた。残渣をＣＨ_３ＣＮで粉砕し、ＭＢ−１０２（４．８９ｇ、９４％）をオレンジ色の粉末として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ８．４６（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ、Ｄ_２Ｏと交換可能）、６．７８（ｂｒ ｓ、４Ｈ、Ｄ_２Ｏと交換可能）、４．４８−４．４５（ｄｔ、Ｊ＝８．１、３．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．８８（ｄｄ、Ｊ＝１１．１、３．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．７４（ｄｄ、Ｊ＝１１．１、３．７Ｈｚ、２Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１７１．６、１６４．７、１４６．４、１２５．９、６１．２、５４．３。ＲＰ−ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３７３．２（Ｍ＋Ｈ）^＋（Ｒｔ＝２．８６分、５〜９５％ Ｂ／６分）。Ｃ_１２Ｈ_１６Ｎ_６Ｏ_８の元素分析：Ｃ、３８．７１；Ｈ、４．３３：Ｎ、２２．５７。実測値：Ｃ、３８．４４：Ｈ、４．５１；Ｎ、２２．３３。

直接希釈分析用の試料調製

直接希釈分析用の試料調製のために、０．４、１．０、２．０、４．０、１０．０、１６．０、４０．０、１００．０、２００．０、４００．０ｎｇ／ｍＬの濃度の較正基準（calibration standard）、並びにＭＢ−１０２の低、中、及び高の濃度レベルでの品質対照（quality control：ＱＣ）を、妥当性確認試験または試料分析の日に、１％ヒト血漿含有ＰＢＳ中で調製した。臨床試験で使用されたＭＢ−１０２投与溶液（１８．６ｍｇ／ｍＬ）を、まず、１％ヒト血漿含有ＰＢＳで１／１００に希釈して、１８６μｇ／ｍＬのＭＢ−１０２のストック溶液を作製した。このストック溶液を１％ヒト血漿含有ＰＢＳでさらに希釈して、較正基準の調製のための、２０００ｎｇ／ｍＬのＭＢ−１０２の較正基準用ストックを作成した。また、１８６μｇ／ｍＬのＭＢ−１０２ストックを１％ヒト血漿含有ＰＢＳで希釈することによって、３００ｎｇ／ｍＬのＱＣ用ストックを調製した。このＱＣ用ストックを１％ヒト血漿含有ＰＢＳで希釈することによって、低、中、及び高の濃度レベルの品質対照を調製した。

タンパク質沈殿分析用の試料調製

タンパク質沈殿分析用の試料調製のために、０．４、１．０、２．０、４．０、１０．０、１６．０、４０．０、１００．０、２００．０、４００．０ｎｇ／ｍＬの濃度の較正基準、並びにＭＢ−１０２の低、中、及び高の濃度レベルでの品質対照（ＱＣ）を、以下のようにして調製した。１×ＰＢＳ中の１万倍濃度のＭＢ−１０２を、各較正基準及びＱＣ用に調製した。これらのストック溶液を、血漿で１／１００に希釈して、作業用較正基準と、９９％血漿／１％ＰＢＳ中のＭＢ−１０２のＱＣとを作製した。これらの作業用較正基準及びＱＣの２００μＬを、６００μＬバイアルにアリコートし、使用するまで−８０°Ｃで保存した。同一のＨＰＬＣ法を用いて、これらの作業用較正基準及びＱＣを、未知試料の分析のために認定及び認証した。

患者試料の分析

血漿試料は、２つの臨床試験から取得した。すべての血漿試料は、分析するまで−８０°Ｃで保存した。

直接希釈法によって分析される試料については、血漿試料１０μＬ（室温に解凍し、完全に混合させた）を９９０μＬの１×ＰＢＳで希釈し、約１０分間完全に混合させ、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。そして、その試料をＨＰＬＣで直接分析した。

タンパク質沈殿法によって分析される試料については、血漿５０μＬ（室温に解凍し、完全に混合させた）を、１×ＰＢＳ（ｖ／ｖ）を４．５％含有するメタノール２００μＬで希釈し、少なくとも１０秒間混合させ、４０００ｒｐｍ以上で１０分間遠心分離した。すべての上清を、第２の容器に移した。そして、上清５０μＬを、９５０μＬの１×ＰＢＳと混合させた。試料を混合させ、ＨＰＬＣで分析した。この手順では、血漿タンパク質沈殿後の上清の乾燥（dry-down）は不要となる。上清の一部をＨＰＬＣ分析のために１×ＰＢＳで直接希釈する。このため、タンパク質沈殿法で一般的に使用される内部標準物質（internal standard）は不要となる。

ＨＰＬＣ分析

分析は、カラムヒータ、試料ヒータ／冷却器、真空脱ガス装置、自動サンプラー、蛍光検出器、及びバイナリ勾配送達可能ポンプを備えた、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ Ｃｌａｓｓクロマトグラフィシステムにより行った。ＨＰＬＣ分析カラム、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、１００Å（Phenomenex、 Cat. No. 00G-4252-E0、 S/N H15-133556）、及びセキュリティガードカートリッジＣ１８、４×３ｍｍ ＩＤ、５μｍ（Phenomenex、 Cat. No. KJ0-4282）を分析に使用した。ＵＰＬＣシステムを備えたＷａｔｅｒｓ Ｅｍｐｏｗｅｒ３ソフトウェアを、分析セットアップ、分析モニタリング、及びデータ処理に使用した。２つの移動相、移動相Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸（Fisher、Optima（登録商標）グレード）、及び移動相Ｂ：アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸（Fisher Scientific、 Optima（登録商標）グレード）を使用した。カラム温度を３０°Ｃに設定し、オートサンプラー温度を５°Ｃに設定し、励起波長を４３４ｎｍに設定し、検出／発光波長を５５６ｎｍに設定した。計数率は５個／秒に設定した。ＰＭＴゲインは５０に設定した。フローセル温度は周囲温度にした。注入量は１０μＬにした。ＭＢ−１０２は、示された勾配を用いて約３．６分で溶出する。

方法の妥当性確認

このＨＰＬＣ法と本明細書に開示された試料調製を用いて、精度、正確さ、直線性、再現性、血漿及び試料溶液の安定性、凍結解凍安定性、定量下限値、並びに、特異性を決定するために妥当性確認試験を行った。許容基準は、±２０％に設定された定量下限値（lowest limit of quantitation：ＬＬＯＱ）を除いた正常値との±１５％のデータ偏差であった。方法の妥当性と結果の正確さの両方を確認するために、試料を院内とＧＭＰ契約研究所との両方で分析した。

特異性及び選択性

ブランク試料のクロマトグラムを、ＭＢ−１０２が添加された試料のクロマトグラムと比較することにより、血漿成分のＭＢ−１０２との干渉を調べた。ＬＬＱはブランク試料のノイズレベルの少なくとも１０倍であると判断され、一方、ＬＬＯＤはブランク試料のノイズレベルの少なくとも３倍であると判断された。

正確さ及び精度

５つの濃度レベルでの１％血漿／ＰＢＳ中のＭＢ−１０２の試料調製物の３つの複製を作製し、精度測定のために分析した。計器注入の精度測定のために、反復注入が高精度であることを確認するために、２００ｎｇ／ｍＬ試料の１０回の注入を行った。

回収率

血漿試料対照と、ＭＢ−１０２が添加された血漿試料とを比較することによって、３つの異なる濃度のＭＢ−１０２の回収率を測定した。ＭＢ−１０２が添加された血漿試料から回収されたＭＢ−１０２の割合を、回収率（％）として測定した。

血漿試料の安定性及び血漿溶液の安定性

血漿試料の長期貯蔵（−８０°Ｃで凍結）及び血漿溶液の短期貯蔵（ベンチトップ周囲温度２〜８°Ｃ）における試料ハンドリング中のＭＢ−１０２の安定性を評価した。血漿試料を、３つの凍結／融解サイクル（−８０°Ｃ〜室温）について試験した。室温、光暴露あり／光暴露なし、２〜８°Ｃ、及びオートサンプラー温度（５°Ｃ）における、血漿溶液中でのＭＢ−１０２の安定性を、２４時間及び４８時間の時間間隔で評価した。

結果

図２は、ＭＢ−１０２（１％血漿／ＰＢＳ中３．３ｎｇ／ｍＬ）とブランク対照（１％血漿／ＰＢＳ）とのＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを示す。ＭＢ−１０２から放出された５５６ｎｍの蛍光波長を、定量化のためにモニタリングした。試料溶液中の１％の血漿タンパク質は、３．６２分付近で溶出してＭＢ−１０２の検出または定量化を阻害するピークを有さない。

方法の妥当性確認

方法の妥当性確認試験の結果を、表１に要約した。ＭＢ−１０２標準較正は、重み付け１／×の線形回帰を用いて、０．４ｎｇ／ｍＬ〜４００ｎｇ／ｍＬの濃度について、０．９９９７のＲ^２よりも３桁以上高い非常に良好な線形応答を示した。図３Ａに示すように、０．４ｎｇ／ｍＬにおけるＬＬＯＱは、１５．１８の信号／ノイズ比、１．０７２のＵＳＰテーリング係数、及び３９９３４のＵＳＰプレートカウントを有する。向上した信号／ノイズ比（１９．４８）は、機器のさらなる改善（図３Ｂ）により得られた。

分析精度は優れており、試験した全ての条件で、９９．２％の回収率、０．４５％のＲＳＤ、及び９５．７％〜１０１．２％の範囲の精度の回収率を示した。３つの凍結／融解サイクルは、−８０°Ｃで、血漿が非常に安定的であることを示した。光暴露を行わないで、４°Ｃ及び室温で、最大４８時間保存した試料溶液の安定性も非常に安定的であった。光暴露を行って、溶液を室温で４８時間保存した場合、ＭＢ−１０２の小さな分解（１〜２％）が生じた。スパイク回収の３つの濃度はすべて、添加された量の±１５％以内であった。未知試料について３．６２分で溶出したＭＢ−１０２ピークの純度を決定するために、血漿試料をタンパク質沈殿させ、上清を乾燥させ、ＰＢＳ中で再構成した。４４５ｎｍ（ＰＤＡモード）でモニタリングされるＨＰＬＣクロマトグラムを生成した。ＰＢＳ中のスパイク試料から得られたＭＢ−１０２ＰＤＡピーク純度を、臨床試験において収集した血漿試料のピーク純度と比較した。図４及び図５に示す結果は、臨床試験から、４４５ｎｍで吸収する３．６２分で溶出したＭＢ−１０２ピークが純粋であることを示した。

患者から収集した試料の分析

経皮蛍光センシングによる腎機能モニタリングにおけるＭＢ−１０２の有用性を評価するための臨床試験を支援するために、０、５、１０、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４８０、６００及び７２０分の時点に各試験参加者から収集した血液試料から血漿試料を調製した。この方法は、臨床試験全体の血漿試料の妥当性確認及び分析のために、ＧＭＰ公認生物分析研究所に移された。精度及び再現性の両方を確実にするために、ＧＭＰ研究所での試験結果を院内試験の結果と比較した。

同じ試験の１２例の患者から収集した血漿試料を院内で使用して、ＧＭＰ研究所での試験結果を検証した。院内での試験結果とＧＭＰ研究所での試験結果との比較を図６に示す。相関の線形回帰は、１．０１８の傾きを示し、Ｒ_２は０．９９０３であった。これらの１２例の被験者（患者）の薬物動態解析の結果を図７に示す。図７に示すように、ＭＢ−１０２のクリアランス率は患者によって異なる。

本試験では、参照マーカとしてのイオヘキソールを、ＭＢ−１０２と同時に投与した。３例の被験者における、ＭＢ−１０２とイオヘキソールとの薬物動態の比較を、図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃに示す。図示のように、図示された３例の各被験者において、ＭＢ−１０２のクリアランス速度は、イオヘキソールのクリアランス速度に対して平行である。したがって、ＭＢ−１０２は、ＧＦＲ測定のためのイオヘキソールと同様に機能することができる。

院内での測定結果とＧＭＰ契約研究所での測定結果とを比較を表した図６に示したような１．０１７７の相関関係をより良く理解するために、ＨＰＬＣ分析のための、タンパク質沈殿法による血漿試料調製の従来の方法を調べた。同じ１２例の被験者の血漿試料を、改良型タンパク質沈殿法を用いて分析した。直接希釈法及びタンパク質沈殿法で測定したＭＢ−１０２の相関プロットを図９に示す。１．００７４の相関勾配と０．９９４４のＲ^２の結果は、直接希釈法により調製した血漿中のＭＢ−１０２成分の分析の妥当性を強く支持した。タンパク質沈殿法による血漿試料の調製は時間がかかり、追加の実験装置の設置を必要とする。１×ＰＢＳ中での１／１００の直接希釈法による血漿試料の調製は、容易、迅速、精密、かつ正確である。

タンパク質沈殿法を用いて、５９例の被験者の臨床試験から得た血漿試料を分析した。その結果を、ＧＭＰ研究所での直接希釈法による試験結果と比較した。これら２つのデータセットの相関プロットを図１０に示す。１．０１５３の相関勾配と、０．９９４１のＲ^２とが得られた。分散が等しいと仮定した二標本ｔ検定を用いたこのデータから得られたｐ値（０．５７９＞０．０５）は、このペアの平均が統計的に異ならないことを示す。

溶血を示す血液試料の分析

本明細書に開示された方法の開発中に、血漿中のＭＢ−１０２定量化に対する溶血の影響を調べた。採血及び血漿調製中の溶血を最小限に抑えるための臨床プロトコルが伝達され、治験実施施設の臨床医と協議された。しかし、５９例の被験者の全血漿試料のうち、いくつかの試料では、ある程度の溶血が見られた。この臨床試験の血漿試料の９０％以上は、ヘモグロビン濃度が５０ｍｇ／ｄＬ以下であった。いくつかの血漿試料では、ヘモグロビン濃度は約１００〜２５０ｍｇ／ｄＬであった。これらの血漿試料のＭＢ−１０２濃度を、直接希釈法及びタンパク質沈殿法を用いて比較した。図１１は、ヘモグロビン含有量が５０ｍｇ／ｄＬ〜１００ｍｇ／ｄＬの試料についての結果を示す。相関曲線の勾配（１．０１９４）は、図１０に示した相関曲線の勾配（１．０１５３）と比較した場合に、ＭＢ−１０２定量化に対する影響が最小限であることを示す。

図１２は、ヘモグロビン含有量が１００ｍｇ／ｄＬ〜２５０ｍｇ／ｄＬの試料についての結果を示す。相関曲線の勾配（１．１１０７）は、図１０に示した相関曲線の勾配（１．０１５３）と比較した場合の、ＭＢ−１０２定量化に対する影響を示す。これらの４つの血漿試料は、試料収集の異なる時点で４人の異なる被験者から得られたものであるため、クリアランス速度、すなわちＧＦＲの決定に対する影響は有意ではない。

これらの研究で得られたデータは、蛍光検出における直接希釈法とタンパク質沈殿法との両方が高精度かつ正確であり、ヒト血漿中のＭＢ−１０２の分析に適していることを示す。

Claims (20)

1. 血漿中の蛍光化合物の量を測定する方法であって、
   血漿試料を収集するステップと、
   前記血漿試料を少なくとも１つの溶媒で希釈するステップと、
   希釈した前記血漿試料を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析して、前記血漿中の前記蛍光化合物の量を測定するステップと、を含み、
   前記血漿試料はＨＰＬＣ分析前に乾燥させられておらず、前記血漿試料に内部標準物質が添加されていないことを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   前記蛍光化合物は、下記の化学式Ｉで表される化合物、またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする方法。
   

   

   式中、
   Ｘ^１及びＸ^２は、互いに独立して、-ＣＯ_２Ｒ^１、−ＣＯＮＲ^１Ｒ^２、−ＣＯ（ＡＡ）、及び−ＣＯＮＨ（ＰＳ）からなる群から選択され、
   Ｙ^１及びＹ^２は、互いに独立して、ＮＲ^１Ｒ^２、及び
   

   

   からなる群から選択され、
   Ｚ^１は、単結合、−ＣＲ^１Ｒ^２−、−Ｏ−、−ＮＲ^１−、−ＮＣＯＲ^１−、−Ｓ−、−ＳＯ−、及び−ＳＯ_２−からなる群から選択され、
   Ｒ^１及びＲ^２は、互いに独立して、Ｈ、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）ａＨ、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ａＣＨ_３、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ａＣＯ_２Ｈ、−（ＣＨＣＯ_２Ｈ）_ａＣＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_３Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_３ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_３Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_３ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ_３、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ^２−、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４ ^３−、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３Ｈ_２、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３Ｈ⁻、及び−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３ ^２−からなる群から選択され、
   ＡＡは、ペプチド結合またはアミド結合によって互いに結合された１以上の天然または非天然のアミノ酸を含むポリペプチド鎖であり、ＡＡの各々は、互いに同一であってもよいし異なっていてもよく、
   ＰＳは、グリコシド結合によって互いに結合された１以上の単糖単位を含む硫化多糖鎖または非硫化多糖鎖であり、
   ａは、１〜１０の範囲の数であり、
   ｃは、１〜１００の範囲の数であり、
   ｍ及びｎは、互いに独立して、１〜３の範囲の数である。
3. 請求項２に記載の方法であって、
   前記蛍光化合物は、下記の化学式で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする方法。
   

   
4. 請求項１に記載の方法であって、
   前記少なくとも１つの溶媒は、水性溶媒、非水性溶媒、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする方法。
5. 請求項４に記載の方法であって、
   前記少なくとも１つの溶媒は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であることを特徴とする方法。
6. 請求項１に記載の方法であって、
   前記血漿試料は、血液溶血の徴候を示すことを特徴とする方法。
7. 血漿中の蛍光化合物の量を測定する方法であって、
   血漿試料を収集するステップと、
   前記血漿試料に少なくとも１つの溶媒を加えて、血漿タンパク質を沈殿させるステップと、
   沈殿した前記血漿タンパク質を前記血漿試料から除去するステップと、
   前記血漿試料を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析して、前記血漿中の前記蛍光化合物の量を測定するステップと、を含み、
   前記血漿試料はＨＰＬＣ分析前に乾燥させられておらず、前記血漿試料に内部標準物質が添加されていないことを特徴とする方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、
   沈殿した前記血漿タンパク質を前記血漿試料から除去する前記ステップは、
   前記血漿試料を遠心分離するステップを含み、
   遠心分離された前記血漿試料は、上清及び沈殿物を含み、
   前記上清は、前記ＨＰＬＣ分析前に、少なくとも１つの溶媒で希釈されることを特徴とする方法。
9. 請求項７に記載の方法であって、
   前記少なくとも１つの溶媒は、メタノール、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする方法。
10. 請求項７に記載の方法であって、
    前記蛍光化合物は、下記の化学式Ｉで表される化合物、またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする方法。
    

    

    式中、
    Ｘ^１及びＸ^２は、互いに独立して、-ＣＯ_２Ｒ^１、−ＣＯＮＲ^１Ｒ^２、−ＣＯ（ＡＡ）、及び−ＣＯＮＨ（ＰＳ）からなる群から選択され、
    Ｙ^１及びＹ^２は、互いに独立して、ＮＲ^１Ｒ^２、及び
    

    

    からなる群から選択され、
    Ｚ^１は、単結合、−ＣＲ^１Ｒ^２−、−Ｏ−、−ＮＲ^１−、−ＮＣＯＲ^１−、−Ｓ−、−ＳＯ−、及び−ＳＯ_２−からなる群から選択され、
    Ｒ^１及びＲ^２は、互いに独立して、Ｈ、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）ａＨ、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ａＣＨ_３、−ＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ａＣＯ_２Ｈ、−（ＣＨＣＯ_２Ｈ）_ａＣＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_３Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_３ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＳＯ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_３Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_３ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_２Ｈ、−（ＣＨ_２）_ａＮＨＳＯ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ_３、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ_２ ⁻、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４Ｈ^２−、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_４ ^３−、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３Ｈ_２、−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３Ｈ⁻、及び−（ＣＨ_２）_ａＰＯ_３ ^２−からなる群から選択され、
    ＡＡは、ペプチド結合またはアミド結合によって互いに結合された１以上の天然または非天然のアミノ酸を含むポリペプチド鎖であり、ＡＡの各々は、互いに同一であってもよいし異なっていてもよく、
    ＰＳは、グリコシド結合によって互いに結合された１以上の単糖単位を含む硫化多糖鎖または非硫化多糖鎖であり、
    ａは、１〜１０の範囲の数であり、
    ｃは、１〜１００の範囲の数であり、
    ｍ及びｎは、互いに独立して、１〜３の範囲の数である。
11. 請求項１０に記載の方法であって、
    前記蛍光化合物は、下記の化学式で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする方法。
    

    
12. 請求項７に記載の方法であって、
    前記少なくとも１つの溶媒は、水性溶媒、非水性溶媒、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、
    前記水性溶媒はリン酸緩衝食塩水であり、前記非水性溶媒はメタノールであることを特徴とする方法。
14. 請求項７に記載の方法であって、
    前記血漿試料は、血液溶血の徴候を示すことを特徴とする方法。
15. 請求項１に記載の方法であって、
    前記血漿は、ヒト、動物、またはインビトロ実験系に由来することを特徴とする方法。
16. 請求項１に記載の方法であって、
    前記溶媒は、リン酸、酢酸、重炭酸、炭酸、ギ酸、グルコン酸、乳酸、クエン酸、スルホン酸、アンモニウム、グアニジニウム、ＨＥＰＥＳ、カコジル酸、トリス、トリス−ＨＣｌ、マレイン酸、ホウ酸、グリシネート、コハク酸、ＰＩＰＥＳ、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される水性緩衝液であることを特徴とする方法。
17. 請求項１に記載の方法であって、
    前記溶媒は、メタノール、エタノール、エチレングリコール、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ブタノール、四塩化炭素、ジエチレングリコール、ジエチルエーテル、ＤＭＥ、エチレングリコール、塩化メチレン、ニトロメタン、石油エーテル、プロパノール、ピリジン、トルエン、ＭＴＢＥ、トリエチルアミン、キシレン、及びベンゼンからなる群より選択される非水性溶媒であることを特徴とする方法。
18. 請求項７に記載の方法であって、
    前記血漿は、ヒト、動物、またはインビトロ実験系に由来することを特徴とする方法。
19. 請求項７に記載の方法であって、
    前記溶媒は、リン酸、酢酸、重炭酸、炭酸、ギ酸、グルコン酸、乳酸、クエン酸、スルホン酸、アンモニウム、グアニジニウム、ＨＥＰＥＳ、カコジル酸、トリス、トリス−ＨＣｌ、マレイン酸、ホウ酸、グリシネート、コハク酸、ＰＩＰＥＳ、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される水性緩衝液であることを特徴とする方法。
20. 請求項７に記載の方法であって、
    前記溶媒は、メタノール、エタノール、エチレングリコール、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ブタノール、四塩化炭素、ジエチレングリコール、ジエチルエーテル、ＤＭＥ、エチレングリコール、塩化メチレン、ニトロメタン、石油エーテル、プロパノール、ピリジン、トルエン、ＭＴＢＥ、トリエチルアミン、キシレン、及びベンゼンからなる群より選択される非水性溶媒であることを特徴とする方法。

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