JP4214109B2 - 畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液 - Google Patents
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Description
本発明は残留動物用薬剤の抽出液に関する。より詳細には、畜水産物中に残留する動物用薬剤を測定する際に使用される抽出液に関する。
近年、畜水産物の疾病の予防・治療又は飼育促進のために種々の動物用薬剤が使用されている。畜水産物中の動物用薬剤の残留量を測定（定量）することは、食の安全性を確保する上で極めて重要である。このような状況から、畜水産物中に残留する動物用薬剤に関するポジティブリスト制の導入に伴い、２００品目を超える動物用薬剤の残留量の暫定基準値が定められることとなったが、それらの薬剤について個別に分析を行う公定法では時間的、労力的に対応できなくなる。そこで、多成分を同時にかつ簡易・迅速に分析できる残留物質の分析法の確立が望まれている。
動物用薬剤の中でも、特に抗菌性物質（例えば抗生物質、合成抗菌剤等）は、現在の大量飼育方式により種類・使用量ともに増加傾向がみられており、畜水産物への残留の可能性が指摘されている。
しかし、現在、食品衛生法で定められている動物用薬剤の中でも、スピラマイシン、チルミコシン、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、ネオマイシンなどの抗生物質類やキノキサリンカルボン酸、シロマジンなど極性の高い化合物を多成分同時に分析する手法は開発されておらず、問題となっている。係る多成分同時分析を行うには、検体である畜水産物から複数の残留動物用薬剤を一斉に抽出する必要がある。有機溶媒に可溶性の動物用薬剤については、抽出液として有機溶媒を使用することにより、係る問題を解消し得ることが明らかとなった（例えば、非特許文献１参照）。しかし、有機溶媒難溶性の薬剤については、有機溶剤は使用し得ないので、抽出工程に問題があった。
Howells, L., Sauer, M. J., Analyst, 126, 155-160 (2001)
動物用薬剤の中でも、特に抗菌性物質（例えば抗生物質、合成抗菌剤等）は、現在の大量飼育方式により種類・使用量ともに増加傾向がみられており、畜水産物への残留の可能性が指摘されている。
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Howells, L., Sauer, M. J., Analyst, 126, 155-160 (2001)
上述のように、有機溶媒可溶性の動物用薬剤については、抽出液として有機溶媒を使用することにより問題が解消しえるが、水溶性の動物用薬剤についても一斉抽出液が望まれている。しかし、動物用薬剤の中でも抗菌性物質などは、各々の薬剤が安定に存在し得る条件がそれぞれ異なるので、複数の残留動物用薬剤を変性させることなく且つ効率よく、一斉に抽出することが困難であるという問題があった。
本発明者らは、係る問題点を解消するために種々検討した結果、特定の性状からなる抽出液を使用することにより、複数の残留動物用薬剤を変性させることなく且つ効率よく、一斉に抽出することが可能であることを見出した。本発明は係る知見に基づくものであって、畜水産物中に残留する動物用薬剤、特に抗菌性物質の一斉抽出に有用な抽出液を提供するものである。
本発明者らは、係る問題点を解消するために種々検討した結果、特定の性状からなる抽出液を使用することにより、複数の残留動物用薬剤を変性させることなく且つ効率よく、一斉に抽出することが可能であることを見出した。本発明は係る知見に基づくものであって、畜水産物中に残留する動物用薬剤、特に抗菌性物質の一斉抽出に有用な抽出液を提供するものである。
上記の課題を解決するためになされた本発明は、０．０５〜１％(w/v、以下同様)のメタリン酸を含有し、ｐＨ６.０〜７．０の緩衝液からなる畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液である。特に、残留動物用薬剤が抗菌性物質である場合の抽出に好適に使用され、緩衝液としてはマキルベン緩衝液を使用するのが好ましい。
本発明の抽出液によれば、ｐＨが中性領域であるので、複数の動物用薬剤の安定性を損なうことなく且つ効率的に一斉抽出することができ、またメタリン酸を含むことからゲンタマイシンの抽出も行うことができるという効果を奏する。従って、本発明の抽出液を使用することにより、畜水産物中の残留動物用薬剤の一斉抽出が可能となり、残留量の測定の迅速化・簡便化を図ることができる。
上述のように、動物用薬剤の中でも抗菌性物質は、個々の物質が安定に存在する条件が異なることが一斉抽出の障害となる。係る観点から、本願発明者らは、そのような障害を解消するため、以下の試験を行った。
まず、抽出液の極性に基づいて、対象物質を２つに分けた。対象その１として有機溶媒にも可溶なテトラサイクリン等の２１化合物を選択し、対象その２としては極性が高く有機溶媒に溶けにくいアミノグリコシド系抗生物質４化合物（ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スペクチノマイシン及びゲンタマイシン）を選択した。
まず、牛肉に所定量の対象物質を添加した検体から、pH7.0のマキルベン緩衝液・EDTA・メタノール混合溶媒による抽出及びC18固相抽出カラムを用いた精製による添加回収試験を実施した。
対象１の２１化合物に関しては、２０ｐｐｂの濃度で添加回収試験を行った結果、回収率ならびに変動係数は概ね公定書の基準に準じた結果が得られた。
まず、抽出液の極性に基づいて、対象物質を２つに分けた。対象その１として有機溶媒にも可溶なテトラサイクリン等の２１化合物を選択し、対象その２としては極性が高く有機溶媒に溶けにくいアミノグリコシド系抗生物質４化合物（ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スペクチノマイシン及びゲンタマイシン）を選択した。
まず、牛肉に所定量の対象物質を添加した検体から、pH7.0のマキルベン緩衝液・EDTA・メタノール混合溶媒による抽出及びC18固相抽出カラムを用いた精製による添加回収試験を実施した。
対象１の２１化合物に関しては、２０ｐｐｂの濃度で添加回収試験を行った結果、回収率ならびに変動係数は概ね公定書の基準に準じた結果が得られた。
それに対して、対象２のアミノグリコシド系抗生物質については、これらの化合物をC18固相抽出カラムに吸着させるために抽出液にイオンペア試薬であるヘプタフルオロ酪酸（HFBA）を添加した後にC18固相抽出カラムによる精製を行った。この操作によりストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スペクチノマイシン及びゲンタマイシンが回収される予定だったが、ゲンタマイシンを回収することはできなかった。
この原因を調査するため、C18固相抽出カラム処理をする直前の抽出液に標準物質を添加したところ、検討したすべてのアミノグリコシド系抗生物質が回収された。このことからC18固相抽出カラムによる精製の前の工程、すなわち抽出に問題があることが明らかとなった。
そこで、ゲンタマイシンの抽出方法として公定法に定められた抽出条件である１％メタリン酸（ｐＨ２）を抽出液に用いて検討した結果、ゲンタマイシンの回収が認められた。従来、上記１％メタリン酸（ｐＨ２）は、除タンパク質の目的で使用され、抽出溶媒はメタリン酸添加のため酸性となっていた。
しかし、このような抽出溶媒を用いるとエリスロマイシンなど酸性条件下で不安定な化合物が分解されてしまう。そのため多成分一斉分析法には低ｐＨの抽出液を使用することができない。一方、クロルテトラサイクリンなどアルカリ条件下で不安定になる化合物もあるため、多成分を一斉に測定するためには中性条件下で抽出する必要がある。そこで、中性付近の条件で抽出法を検討した。
しかし、このような抽出溶媒を用いるとエリスロマイシンなど酸性条件下で不安定な化合物が分解されてしまう。そのため多成分一斉分析法には低ｐＨの抽出液を使用することができない。一方、クロルテトラサイクリンなどアルカリ条件下で不安定になる化合物もあるため、多成分を一斉に測定するためには中性条件下で抽出する必要がある。そこで、中性付近の条件で抽出法を検討した。
まず、ゲンタマイシン抽出において、酸性条件による除タンパク質が必要かどうかを調べた。上記公定法ではメタリン酸溶液はｐH２であることから、マキルベン緩衝液を用いてｐH2から６で検討したところゲンタマイシンの回収は認められなかった。よってメタリン酸の存在自体がゲンタマイシンの良好な回収に必要と考えられた。
このような結果から、本発明者らは、後記実施例に示されるように、抽出液の液性及びメタリン酸濃度を種々検討し、液性が中性付近であっても、特定のメタリン酸濃度とすることにより、より具体的には０．０５〜１％のメタリン酸を含有し、ｐＨ６.０〜７．０の緩衝液からなる抽出液を使用することにより、動物用薬剤、特に抗菌性物質をその安定性を損なうことなく一斉に抽出し得ることが明らかとなった。なお、このような濃度・pHのメタリン酸含有緩衝液には、公定法で使用される目的である除タンパク質の効果は認められず、化合物としてのメタリン酸の存在自体が抽出効果に重要であると考えられた。
このような結果から、本発明者らは、後記実施例に示されるように、抽出液の液性及びメタリン酸濃度を種々検討し、液性が中性付近であっても、特定のメタリン酸濃度とすることにより、より具体的には０．０５〜１％のメタリン酸を含有し、ｐＨ６.０〜７．０の緩衝液からなる抽出液を使用することにより、動物用薬剤、特に抗菌性物質をその安定性を損なうことなく一斉に抽出し得ることが明らかとなった。なお、このような濃度・pHのメタリン酸含有緩衝液には、公定法で使用される目的である除タンパク質の効果は認められず、化合物としてのメタリン酸の存在自体が抽出効果に重要であると考えられた。
本発明において、使用される緩衝液は、畜水産物から動物用薬剤の抽出を阻害するものでなければ何れの緩衝液も使用でき、例えばマキルベン緩衝液、ヘペス緩衝液、セーレンセン緩衝液、クラーク−ラプス緩衝液、コルトフ緩衝液などが挙げられ、マキルベン緩衝液が好適に使用される。
本発明においては抽出対象である動物用薬剤の変性を防止するために、抽出液のｐＨは６．０〜７．０に調整される。
また、メタリン酸濃度は０．０５〜１％に調整され、好ましくは０．１〜０．５％である。メタリン酸濃度が０．０５％未満ではゲンタマイシンの抽出ができないおそれがある。
本発明の抽出液は、上記の適当なｐＨの緩衝液に、メタリン酸が上記の濃度となるように添加することにより調製することができる。この際、抽出効率を向上させるため、必要に応じて、ＥＤＴＡなどのキレート剤、メタノールなどの水性有機溶媒を添加してもよい。好ましくは、上記緩衝液：キレート剤：メタノールを、１５：１：４程度の割合からなる抽出液が使用される。
また、メタリン酸濃度は０．０５〜１％に調整され、好ましくは０．１〜０．５％である。メタリン酸濃度が０．０５％未満ではゲンタマイシンの抽出ができないおそれがある。
本発明の抽出液は、上記の適当なｐＨの緩衝液に、メタリン酸が上記の濃度となるように添加することにより調製することができる。この際、抽出効率を向上させるため、必要に応じて、ＥＤＴＡなどのキレート剤、メタノールなどの水性有機溶媒を添加してもよい。好ましくは、上記緩衝液：キレート剤：メタノールを、１５：１：４程度の割合からなる抽出液が使用される。
本発明の抽出液の使用方法は、従前の残留動物用薬剤抽出液と同様にして使用することができ、一例としては、検体である畜水産物に本発明の抽出液を添加してホモジナイズした後、遠心分離などの慣用の手段で分離することにより、抽出液を得ることができる。
上記の検体に対する抽出液の使用量としては、検体と抽出液の比が１：１〜１０（ｗ／ｖ比、以下同様）、好ましくは１：２〜８、より好ましく１：２．５〜５程度となるように調整する。検体１に対する抽出液量が１未満であると抽出が不十分になるおそれがあり、また１０を越えても抽出の点では問題はないが、抽出液量が増えて操作が煩雑になるおそれがある。
検体である畜水産物としては、畜肉（例えば牛肉、豚肉、鶏肉、兎肉、羊肉、アヒル肉等）、水産物（例えばハマチ、タイ、フグ、エビ、ウナギ、コイ、マス、カキ等）が挙げられる。なお、動物用薬剤による環境汚染を調査するような場合には、自然界から採取した動物を検体とすることもできる。
上記の検体に対する抽出液の使用量としては、検体と抽出液の比が１：１〜１０（ｗ／ｖ比、以下同様）、好ましくは１：２〜８、より好ましく１：２．５〜５程度となるように調整する。検体１に対する抽出液量が１未満であると抽出が不十分になるおそれがあり、また１０を越えても抽出の点では問題はないが、抽出液量が増えて操作が煩雑になるおそれがある。
検体である畜水産物としては、畜肉（例えば牛肉、豚肉、鶏肉、兎肉、羊肉、アヒル肉等）、水産物（例えばハマチ、タイ、フグ、エビ、ウナギ、コイ、マス、カキ等）が挙げられる。なお、動物用薬剤による環境汚染を調査するような場合には、自然界から採取した動物を検体とすることもできる。
かくして得られた抽出液は、カラム精製などの常法に準じて精製した後、慣用の測定装置を使用して、残留動物用薬剤が測定される。
精製法としては、例えばC18固相抽出カラムなどが使用され、この際、当該カラムに吸着させるために抽出液にイオンペア試薬であるHFBAを添加してもよい。
また、残留動物用薬剤の測定には高速液体クロマトグラフィー／質量分析法などにより行うことができる。
精製法としては、例えばC18固相抽出カラムなどが使用され、この際、当該カラムに吸着させるために抽出液にイオンペア試薬であるHFBAを添加してもよい。
また、残留動物用薬剤の測定には高速液体クロマトグラフィー／質量分析法などにより行うことができる。
以下、実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
実施例１
以下の方法で、添加回収試験を行った。なお、アミノグリコシド系の添加回収試験は食品衛生法で定められている残留基準値を勘案して２００ｐｐｂの添加量で実施した。
アミノグリコシド系抗生物質（ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン）の標準試料のいずれかを200ppbの濃度になるように添加した、又は添加しなかった（コントロール用）検体（牛肉）５ｇを、０．１％メタリン酸含有ｐH 7マキルベン溶液・EDTA・メタノール混合溶媒２５ｍｌでホモジナイズして抽出した。
抽出後の上澄みを25mlの10mM HFBAで希釈し、C18固相抽出カラム（12cc 500mg)に付加した後、5mM HFBA 5mlで洗浄し、HFBA／MeOH (1:1)20mlで溶出した。
溶出液を濃縮・乾固した後、DMSO／水混合溶媒（1.0ml)で再溶解し、以下の条件でLC/MS/MSによる分析に供し、回収率（％）を求めた。高速液体クロマトグラフィー部分の移動層にはA液（0.3% 酢酸、10mM 酢酸アンモニウム）とB液（20％メタノール含有アセトニトリル）のグラジエントを用い、親水クロマトカラムより流速220μｌ/minで溶出を行った。質量分析は、装置にアプライドバイオシステムズ社API２０００を、イオン化モードはESIポジティブならびにネガティブを用い、Spray Voltage (Pos)：5000、Spray Voltage (Neg)：-4200、ターボガス温度：550 ℃で実施した。
以下の方法で、添加回収試験を行った。なお、アミノグリコシド系の添加回収試験は食品衛生法で定められている残留基準値を勘案して２００ｐｐｂの添加量で実施した。
アミノグリコシド系抗生物質（ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン）の標準試料のいずれかを200ppbの濃度になるように添加した、又は添加しなかった（コントロール用）検体（牛肉）５ｇを、０．１％メタリン酸含有ｐH 7マキルベン溶液・EDTA・メタノール混合溶媒２５ｍｌでホモジナイズして抽出した。
抽出後の上澄みを25mlの10mM HFBAで希釈し、C18固相抽出カラム（12cc 500mg)に付加した後、5mM HFBA 5mlで洗浄し、HFBA／MeOH (1:1)20mlで溶出した。
溶出液を濃縮・乾固した後、DMSO／水混合溶媒（1.0ml)で再溶解し、以下の条件でLC/MS/MSによる分析に供し、回収率（％）を求めた。高速液体クロマトグラフィー部分の移動層にはA液（0.3% 酢酸、10mM 酢酸アンモニウム）とB液（20％メタノール含有アセトニトリル）のグラジエントを用い、親水クロマトカラムより流速220μｌ/minで溶出を行った。質量分析は、装置にアプライドバイオシステムズ社API２０００を、イオン化モードはESIポジティブならびにネガティブを用い、Spray Voltage (Pos)：5000、Spray Voltage (Neg)：-4200、ターボガス温度：550 ℃で実施した。
実施例２
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、０．３％メタリン酸含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、０．３％メタリン酸含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
実施例３
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、０．５％メタリン酸含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、０．５％メタリン酸含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
実施例４
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、１％メタリン酸含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、１％メタリン酸含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
比較例１
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、メタリン酸非含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、メタリン酸非含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
比較例２
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、０．０１％メタリン酸含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
抽出液の０．１％メタリン酸含有ｐH７マキルベン溶液の代わりに、０．０１％メタリン酸含有ｐH６マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例１の通り測定した。
以上の試験の結果を表１に示す。表１に示されるように、実施例１では、全工程の回収率は、ジヒドロストレプトマイシンでは６０％程度、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンでは５０％程度、ゲンタマイシンでは４割弱となった。また４検体での変動係数は１０％台と良好な再現性が得られた。また、実施例２、実施例３、実施例４でも、ほぼ同様な結果が得られた。一方、比較例１と２では、ゲンタマイシンの回収率において、測定に使用できない低い回収率となった。
上記の実施例１、実施例２、実施例３、実施例４にて、LC/MS/MSで得られたクロマトグラムを観察したところ、肉抽出液にはピークがほとんど検出されず定性がしやすく擬陽性が出にくいことがわかった。また、ベースラインも低いことからS/Nから求められる定量下限も数十ｐｐｂ前後まで可能であることがわかった。
上記の実施例１、実施例２、実施例３、実施例４にて、LC/MS/MSで得られたクロマトグラムを観察したところ、肉抽出液にはピークがほとんど検出されず定性がしやすく擬陽性が出にくいことがわかった。また、ベースラインも低いことからS/Nから求められる定量下限も数十ｐｐｂ前後まで可能であることがわかった。
このように、アミノグリコシド系物質については、抽出に従来より低濃度のメタリン酸を加えることにより、中性領域のｐＨでも抽出が可能であり、再現性のある結果が得られることが明らかとなった。
実施例５
前記の対象その１である有機溶媒にも可溶なテトラサイクリン等１９化合物について、実施例１と同様に、０．１％メタリン酸含有ｐH 7マキルベン溶液・EDTA・メタノール混合溶媒を抽出液として使用して添加回収試験を行った。その結果を表２に示す。
表２に示されるように、係る対象その１である物質についても良好な抽出結果が得られた。
前記の結果と併せて、本発明の抽出液を使用することにより、幅広い残留動物用薬剤の抽出が可能になることを確認することができ、抗生物質等の高極性化合物であっても多成分一斉分析の実施が可能となった。
前記の対象その１である有機溶媒にも可溶なテトラサイクリン等１９化合物について、実施例１と同様に、０．１％メタリン酸含有ｐH 7マキルベン溶液・EDTA・メタノール混合溶媒を抽出液として使用して添加回収試験を行った。その結果を表２に示す。
表２に示されるように、係る対象その１である物質についても良好な抽出結果が得られた。
前記の結果と併せて、本発明の抽出液を使用することにより、幅広い残留動物用薬剤の抽出が可能になることを確認することができ、抗生物質等の高極性化合物であっても多成分一斉分析の実施が可能となった。
Claims (4)
- ０．０５〜１％(w/v)のメタリン酸を含有し、ｐＨ６.０〜７．０の緩衝液からなる畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液。
- 動物用薬剤が、抗菌性物質である請求項１記載の畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液。
- 抗菌性物質が、アミノグリコシド系抗生物質である請求項２記載の畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液。
- 緩衝液がマキルベン緩衝液である請求項１〜３の何れかに記載の畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液。
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