CN115201373B - 一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素b检测lc-msms方法 - Google Patents

一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素b检测lc-msms方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC‑MSMS方法，属于氨基糖苷类抗生素的测量技术领域。本发明采用内标法，液相色谱的流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B残留量进行检测，本方法在降低离子对试剂产生的质谱不兼容、产生离子抑制效应等负面影响的同时也能稳定潮霉素B在流动相中的保留。本发明减少了对仪器的污染，不会对负离子模式产生离子抑制，可显著提高检测灵敏度和稳定性，实现了高的选择性和净化效果。本方法具有线性好、检出限低，定量结果准确、稳定、重复性好的特点。

Description

一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC- MSMS方法
技术领域
本发明涉及氨基糖苷类抗生素的测量技术领域，尤其涉及一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC-MSMS方法。
背景技术
潮霉素B是由吸水链霉菌产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成能杀死细菌、真菌和高等真核细胞，可有效控制猪蛔虫、食道口线虫和毛首线虫感染，例如妊娠母猪全价饲料中添加潮霉素B，能保护仔猪在哺乳期间不受蛔虫感染，此外对鸡蛔虫、鸡异刺续虫和禽封闭毛细线虫均有良好的控制效应。根据相关标准中的规定，饲料中全面禁止添加抗生素，潮霉素B作为一种氨基糖苷类抗生素，不在允许使用名单之中，不得在动物性食品中检出，因此非常有必要建立饲料中潮霉素B的检测方法。
目前氨基糖苷类主要的检测方法有酶联免疫法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法等。中国专利CN101398427A公开了一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法，通过使用具有簇特异性的多克隆抗体，实现对氨基糖苷类抗生素的多残留检测。然而酶联免疫法检测存在假阳性和交叉污染现象。中国专利CN113418883A提供了一种基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法，利用紫外数据(K-K0)/K0绘制三维散点图，与标准样品的三维散点图进行比对，确定待测样品所含氨基糖苷类抗生素的种类。然而氨基糖苷类是由两个或多个氨基糖通过苷键与氨基环醇键合而成的一类化合物，需要在柱前或柱后衍生化反应结束后，采用液相色谱-荧光或紫外检测，这些衍生化的方法不仅操作比较繁琐，而且稳定性较差。
由于潮霉素B是一类强极性的碱性药物，在传统的反相色谱柱很难保留，通常需要在流动相中加入离子对试剂来增强化合物保留。离子对试剂的使用会衍生出质谱不兼容、产生离子抑制效应等问题。因此，建立一种准确、高效、减少质谱不兼容性和减少了离子抑制效应的方法是非常必要的。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的问题是提供一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC-MSMS方法。
一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC- MS/MS方法，包括以下步骤：
S1、对待测饲料进行预处理；所述预处理包括提取步骤及净化步骤；所述提取步骤为：将待测饲料加入三氯乙酸溶液混匀，经离心后取上清液，用氨水/乙酸调节pH值，即得提取液，待净化步骤进行净化；所述净化步骤为：将固相萃取柱依次用乙腈、甲酸水溶液、乙酸铵水溶液活化，取所述提取液上样，依次用乙酸铵水溶液、水淋洗，抽干后，用甲酸水溶液分两次洗脱，收集洗脱液，加入七氟丁酸，过 PES滤膜，得到待测液；
S2、通过液相色谱-串联质谱法测定经预处理后的待测液中潮霉素B的残留量。
优选的，所述提取步骤中，以待测饲料的质量为基准，三氯乙酸溶液的用量为4～6mL/g，
进一步的，所述提取步骤中，以待测饲料的质量为基准，三氯乙酸溶液的用量为为5mL/g。
优选的，所述提取步骤中加入均质子，以待测饲料的质量为基准，加入量为1～2颗/g。
进一步的，所述提取步骤中加入均质子，以待测饲料的质量为基准，加入量为1颗/g。
优选的，所述提取步骤的具体方法如下：
称取2±0.02g试样于离心管中，加入内标标准工作液(10μg/mL) 80μL，涡旋混匀30～60s，依次加入10mL 5wt％三氯乙酸水溶液及陶瓷均质子，经涡旋振荡5～10min，再以8000～12000r/min的速率离心 5～10min；离心结束后转移全部上清液于新的50mL离心管中，再用 10mL 5wt％三氯乙酸水溶液对沉淀重复以上提取一次，在次离心后合并上清液，用氨水/乙酸调节pH至8.5±0.2，最后以8000～12000r/min 的速率离心5～10min，取离心后的上清液，得到提取液，备用。
优选的，所述净化步骤的具体方法如下：
PBA固相萃取柱依次用2mL乙腈，3mL 0.5wt％甲酸水溶液，5mL 0.2mol/L的乙酸铵水溶液(pH＝8.5)活化，取所述提取液5mL上样，依次用3mL pH＝8.5的乙酸铵水溶液(0.2mol/L)、3mL水淋洗，抽干后，用2mL 0.5wt％甲酸水溶液分两次洗脱，收集洗脱液，加入洗脱液1wt％的七氟丁酸，过0.2μm PES滤膜，得到待检净化液。
优选的，步骤S2中所述液相色谱采用C18柱，流动相由A相和 B相组成，其中A相为乙酸铵、甲酸与水形成的溶液，B相为乙腈，采用梯度洗脱。
进一步的，所述C18柱填料粒径为2.5～5μm；内径为2.1～4.6mm；柱长为100～250mm。
更进一步的，所述C18柱填料粒径为2.7μm；内径为3.0mm；柱长为100mm。
更一进步的，所述C18柱的型号参数为Poroshell 120 EC-C18， 3.0×100mm，2.7μm。
进一步的，所述A相为乙酸铵、甲酸与水形成的溶液，乙酸铵浓度为0.2～1.0mmol/L，甲酸质量分数为0.1％。
更进一步的，所述A相为乙酸铵、甲酸与水形成的溶液，乙酸铵浓度为0.5mmol/L，甲酸质量分数为0.1％。
进一步的，所述流动相中，按体积比计，A相：B相＝98～10：2～90；流速为0.2～0.4mL/min；进样体积5～20μL；柱温为25～40℃。
更进一步的，所述流动相中，A相与B相的体积比为98～10： 2～90；流速为0.3mL/min；进样体积20μL；柱温为40℃。
进一步的，所述梯度洗脱的梯度依次为：
时间0min，A相体积分数98％，B相体积分数2％；
时间2.0min，A相体积分数98％，B相体积分数2％；
时间2.1min，A相体积分数92％，B相体积分数8％；
时间5.1min，A相体积分数60％，B相体积分数40％；
时间7.0min，A相体积分数10％，B相体积分数90％；
时间8.0min，A相体积分数10％，B相体积分数90％；
后运行时间为3min。
优选的，步骤S2中串联质谱采用电喷雾离子源，采用多反应监测(MRM)或选择离子监测(SRM)中的任一种。
进一步的，步骤S2中串联质谱采用电喷雾离子源，采用多反应监测(MRM)。
优选的，步骤S2中所述串联质谱的离子源模式为ESI(+)，干燥气温度为200～400℃；干燥气流速为5～11L/min；鞘气温度为 200～400℃；鞘气流速为7～15L/min；雾化器压力为35～45psi；毛细管电压为2500～4000V；喷嘴电压为0～500V。
进一步的，步骤S2中所述串联质谱的离子源模式为ESI(+)，干燥气温度为350℃；干燥气流速为7L/min；鞘气温度为350℃；鞘气流速为12L/min；雾化器压力为40psi；毛细管电压为3500V；喷嘴电压为500V。
优选的，步骤S2中所述串联质谱的数据采集参数中，碎裂电压 100～200V，优化为170；碰撞能量为10～40V，保留2～10min。
进一步的，所述数据采集参数中，碎裂电压为170V。
优选的，步骤2中所述串联质谱的参数分别为：
潮霉素B，母离子质荷比(m/z)为528.3，子离子质荷比(m/z) 为352，碎裂电压为170V，碰撞能量为20V，极性为正；
潮霉素B，母离子质荷比(m/z)为528.3，子离子质荷比(m/z) 为177.1*，碎裂电压为170V，碰撞能量为25V，极性为正；
D4-潮霉素B，母离子质荷比(m/z)为532.3，子离子质荷比(m/z) 为354.2，碎裂电压为170V，碰撞能量为24V，极性为正；
D4-潮霉素B，母离子质荷比(m/z)为532.3，子离子质荷比(m/z) 为178.8*，碎裂电压为170V，碰撞能量为32V，极性为正；
其中，*表示定量离子。
优选的，所述提取步骤的方法还可以为：
称取2±0.02g试样于离心管中，加入10mg有机提取助剂、1mL 水，经涡旋振荡5～10min、冷冻干燥，得到预吸附试样；预吸附试样中加入内标标准工作液(10μg/mL)80μL，涡旋混匀30～60s，依次加入10mL 5wt％三氯乙酸水溶液及陶瓷均质子，经涡旋振荡5～10min，再以8000～12000r/min的速率离心5～10min；离心结束后转移全部上清液于新的50mL离心管中，再用10mL 5wt％三氯乙酸水溶液对沉淀重复以上提取一次，在次离心后合并上清液，用氨水/乙酸调节pH至 8.5±0.2，最后以8000～12000r/min的速率离心5～10min，取离心后的上清液，得到提取液，备用。
潮霉素B从饲料样品中溶于提取溶剂的程度将影响最终检测结果的准确性。饲料样品中成分复杂，与提取溶剂形成的混合物粘度较高，由于缺乏微小的硬质提取介质，提取溶剂难以渗透至聚团凝结成块状的饲料颗粒内部，导致潮霉素B经扩散溶于提取溶剂的数值往往小于其真实含量。为了增加潮霉素B在提取步骤中的溶出量，提高检测的准确性，本发明在提取中采用了具有良好吸附及解吸性能的有机提取助剂。该有机提取助剂以5-甲基异苯二醛及蒽-2,6-二胺为原料，经反应形成有机框架内核，再通过丙烯酰胺基葡萄糖与N-羟甲基丙烯酰胺在有机框架内核的表面经聚合制备而成。有机提取助剂具有丰富的吸附位点和较大的比表面积，酰胺基团与潮霉素B中的羟基之间存在氢键作用，潮霉素B的极性强，有机提取助剂可通过极性基团间的相互吸引来促进与潮霉素B的结合；有机框架内核呈立体网络状，具有一定伸缩延展能力，增强了相互作用位点的密度，与饲料中的固态微粒结合面广，利于潮霉素B从饲料中溶出。随着三氯乙酸水溶液的加入，混合液中水分比例与三氯乙酸含量上升，导致潮霉素B 与有机提取助剂的相互作用减弱而发生解吸，潮霉素B溶于溶剂，经净化、检测，结果更接近真实含量。
进一步的，所述有机提取助剂的制备方法如下，以重量份计：
M1、将0.9～1.2份5-甲基异苯二醛与1.9～2.4份蒽-2,6-二胺加入 20～30份1,4-二氧六环，随后添加0.2～0.35份浓度为1.5～3mol/L的醋酸水溶液，经超声处理得到均匀分散的反应混合液，超声处理的频率为28～40kHz，功率为550～800W，处理时间为10～30min；所述反应混合液在无氧条件下升温至110～140℃并反应12～48h，反应结束后将产物冷却至室温，经离心处理收集沉淀，离心速率为4500～9000rpm，处理时间为3～5min；沉淀物采用二氯甲烷洗涤，经干燥得到有机框架内核，备用；
M2、将1.7～2.5份D-氨基葡萄糖、1.1～1.8份碳酸钾和0.03～0.045 份亚硝酸钠溶于4～8份水，在0～4℃冰水浴条件下继续加入0.8～1.2 份丙烯酰氯并混合0.5～2h，得到反应溶液；所述反应溶液升温至室温并反应1.5～3h，加入30～45份无水乙醇以终止反应；反应产物经过滤得滤液、旋转蒸发得到固态的丙烯酰胺基葡萄糖，备用；
M3、另取4～6份所述有机框架内核、4～6份N-羟甲基丙烯酰胺、 2～3份所述丙烯酰胺基葡萄糖与40～80份水混合均匀；随后向该混合液中继续加入0.0025～0.0075份四甲基乙二胺和2.5～3.5份过硫酸铵，升温至55～70℃并聚合反应12～36h，聚合反应结束后，反应产物经离心得沉淀，离心速率为9000～12000rpm，处理时间为3～5min；沉淀经水洗、醇洗、冷冻干燥，得到所述有机提取助剂。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以任意组合，即得本发明各较佳实施例。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明减少了对仪器的污染，不会对负离子模式产生离子抑制，可显著提高检测灵敏度和稳定性；本发明采用具有良好吸附及解吸性能的有机提取助剂促进潮霉素B的溶出，减弱了基质对潮霉素B检测的影响，并配合Agilent Bond Elut PBA固相萃取柱，实现了高的选择性和净化效果；本发明线性好、检出限低，相关系数R2高于0.99，检出限可以达到0.5μg/kg，定量结果准确、稳定、重复性好。
附图说明
图1a为流动相及洗脱梯度分别采用条件1及条件2时，潮霉素B在Poroshell 120HILIC-Z液相色谱柱上的分离图；
图1b为流动相及洗脱梯度采用条件3时，潮霉素B在Poroshell 120 HILIC-Z液相色谱柱上的分离图；
图1c为流动相及洗脱梯度采用条件4时，潮霉素B在Poroshell 120 HILIC-Z液相色谱柱上的分离图；
图2a为上机前溶液中不加入1％七氟丁酸，潮霉素B在Poroshell 120 EC-C18液相色谱柱上的分离图；
图2b为上机前溶液中加入1％七氟丁酸，潮霉素B在Poroshell 120 EC-C18液相色谱柱上的分离图；
图2c为采用氯霉素测定七氟丁酸对负离子模式的影响时的分离图；
图3为实施例1～9净化后的回收率和基质效应测试结果；
图4为本测试方法对标的标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明对照例及实施例中部分原材料参数如下：
陶瓷均质子，0.5cm×0.25cm，河北艺心逸意科技有限公司提供；
Poroshell 120 EC-C18液相色谱柱，安捷伦科技(中国)有限公司提供；
Poroshell 120 HILIC-Z液相色谱柱，安捷伦科技(中国)有限公司提供；
Bond Elut PBA固相萃取柱，安捷伦科技(中国)有限公司提供；
Bond Elut NEXUS WCX固相萃取柱，安捷伦科技(中国)有限公司提供；
磷酸缓冲液配置方法：称取磷酸二氢钾1.36g，用980mL水溶解，分别加入Na2EDTA0.15g和三氯乙酸20g，溶解混匀并定容至1000mL；
5％三氯乙酸溶液配置方法：称取三氯乙酸50g，用950mL水溶解；
乙酸铵缓冲溶液配置方法：称取乙酸铵0.77g，Na2EDTA 0.15g，用500mL水溶解后，加入三氯乙酸50g，溶解混匀并定容至 1000mL。
实施例1
一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC- MS/MS方法，包括以下步骤：
S1、对待测饲料进行预处理；所述预处理分为提取步骤及净化步骤；所述提取步骤的具体方法如下：称取2g试样于50mL聚丙烯离心管中，加入内标标准工作液(10μg/mL)80μL，涡旋混匀30s，依次加入10mL 5wt％三氯乙酸水溶液及2颗陶瓷均质子，经涡旋振荡5min，再以8000r/min的速率离心5min；离心结束后转移全部上清液于新的50mL离心管中，再用10mL 5wt％三氯乙酸水溶液对沉淀重复以上提取一次，在次离心后合并上清液，用氨水/乙酸调节pH至8.5，最后以8000r/min的速率离心5min，取离心后的上清液，得到提取液，备用；所述净化步骤的具体方法如下：Bond Elut PBA固相萃取柱依次用2mL乙腈，3mL0.5wt％甲酸水溶液，5mL 0.2mol/L的乙酸铵水溶液(pH＝8.5)活化，取所述提取液5mL上样，依次用3mL pH＝8.5 的乙酸铵水溶液(0.2mol/L)、3mL水淋洗，抽干后，用2mL 0.5wt％甲酸水溶液分两次洗脱，收集洗脱液，加入洗脱液1wt％的七氟丁酸，过0.2μmPES滤膜，得到待检净化液；
S2、通过液相色谱-串联质谱法测定经预处理后的待测液中潮霉素B的残留量。
所述液相色谱采用Poroshell 120 EC-C18液相色谱柱，所述C18 柱填料粒径为2.7μm，内径为3.0mm，柱长为100mm；流动相由A相和B相组成，其中A相为乙酸铵、甲酸与水形成的溶液，乙酸铵浓度为0.5mmol/L，甲酸质量分数为0.1％，B相为乙腈，采用梯度洗脱；所述流动相中，A相与B相的体积比为98～10：2～90，流速为0.3mL/min，进样体积20μL，柱温为40℃；所述梯度洗脱的梯度依次为：时间0min， A相体积分数98％，B相体积分数2％、时间2.0min，A相体积分数 98％，B相体积分数2％、时间2.1min，A相体积分数92％，B相体积分数8％、时间5.1min，A相体积分数60％，B相体积分数40％、时间7.0min，A相体积分数10％，B相体积分数90％、时间8.0min， A相体积分数10％，B相体积分数90％，后运行时间为3min。
所述串联质谱采用电喷雾离子源，采用多反应监测(MRM)；离子源模式为ESI(+)，干燥气温度为350℃，干燥气流速为7L/min，鞘气温度为350℃，鞘气流速为12L/min，雾化器压力为40psi，毛细管电压为3500V，喷嘴电压为500V，碎裂电压为170V。
实施例2
本实施例的方法和实施例1的方法基本一致，区别仅仅在于：将 Bond Elut PBA固相萃取柱替换为Bond Elut NEXUS WCX固相萃取柱。
实施例3
本实施例的方法和实施例1的方法基本一致，区别仅仅在于：未使用Bond ElutPBA固相萃取柱对提取液进行净化，用直接提取的提取液进行检测。
实施例4
一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC- MS/MS方法，包括以下步骤：
S1、对待测饲料进行预处理；所述预处理分为提取步骤及净化步骤；所述提取步骤的具体方法如下：称取2g试样于50mL聚丙烯离心管中，加入内标标准工作液(10μg/mL)80μL，涡旋混匀30s，依次加入10mL磷酸缓冲溶液及2颗陶瓷均质子，经涡旋振荡5min，再以8000r/min的速率离心5min；离心结束后转移全部上清液于新的 50mL离心管中，再用10mL磷酸缓冲溶液对沉淀重复以上提取一次，在次离心后合并上清液，用氨水/乙酸调节pH至8.5，最后以8000r/min 的速率离心5min，取离心后的上清液，得到提取液，备用；所述净化步骤的具体方法如下：Bond Elut PBA固相萃取柱依次用2mL乙腈，3mL 0.5wt％甲酸水溶液，5mL 0.2mol/L的乙酸铵水溶液(pH＝8.5)活化，取所述提取液5mL上样，依次用3mL pH＝8.5的乙酸铵水溶液 (0.2mol/L)、3mL水淋洗，抽干后，用2mL 0.5wt％甲酸水溶液分两次洗脱，收集洗脱液，加入洗脱液1wt％的七氟丁酸，过0.2μmPES滤膜，得到待检净化液；
S2、通过液相色谱-串联质谱法测定经预处理后的待测液中潮霉素B的残留量。
所述液相色谱采用Poroshell 120 EC-C18液相色谱柱，所述C18 柱填料粒径为2.7μm，内径为3.0mm，柱长为100mm；流动相由A相和B相组成，其中A相为乙酸铵、甲酸与水形成的溶液，乙酸铵浓度为0.5mmol/L，甲酸质量分数为0.1％，B相为乙腈，采用梯度洗脱；所述流动相中，A相与B相的体积比为98～10：2～90，流速为0.3mL/min，进样体积20μL，柱温为40℃；所述梯度洗脱的梯度依次为：时间0min， A相体积分数98％，B相体积分数2％、时间2.0min，A相体积分数 98％，B相体积分数2％、时间2.1min，A相体积分数92％，B相体积分数8％、时间5.1min，A相体积分数60％，B相体积分数40％、时间7.0min，A相体积分数10％，B相体积分数90％、时间8.0min， A相体积分数10％，B相体积分数90％，后运行时间为3min。
所述串联质谱采用电喷雾离子源，采用多反应监测(MRM)；离子源模式为ESI(+)，干燥气温度为350℃，干燥气流速为 7L/min，鞘气温度为350℃，鞘气流速为12L/min，雾化器压力为 40psi，毛细管电压为3500V，喷嘴电压为500V，碎裂电压为170V。
实施例5
本实施例的方法和实施例4的方法基本一致，区别仅仅在于：将 Bond Elut PBA固相萃取柱替换为Bond Elut NEXUS WCX固相萃取柱。
实施例6
本实施例的方法和实施例4的方法基本一致，区别仅仅在于：未使用Bond ElutPBA固相萃取柱对提取液进行净化，用直接提取的提取液进行检测。
实施例7
一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC- MS/MS方法，包括以下步骤：
S1、对待测饲料进行预处理；所述预处理分为提取步骤及净化步骤；所述提取步骤的具体方法如下：称取2g试样于50mL聚丙烯离心管中，加入内标标准工作液(10μg/mL)80μL，涡旋混匀30s，依次加入10mL乙酸铵缓冲溶液及2颗陶瓷均质子，经涡旋振荡5min，再以8000r/min的速率离心5min；离心结束后转移全部上清液于新的 50mL离心管中，再用10mL乙酸铵缓冲溶液对沉淀重复以上提取一次，在次离心后合并上清液，用氨水/乙酸调节pH至8.5，最后以 8000r/min的速率离心5min，取离心后的上清液，得到提取液，备用；所述净化步骤的具体方法如下：Bond Elut PBA固相萃取柱依次用 2mL乙腈，3mL 0.5wt％甲酸水溶液，5mL 0.2mol/L的乙酸铵水溶液(pH＝8.5)活化，取所述提取液5mL上样，依次用3mL pH＝8.5的乙酸铵水溶液(0.2mol/L)、3mL水淋洗，抽干后，用2mL 0.5wt％甲酸水溶液分两次洗脱，收集洗脱液，加入洗脱液1wt％的七氟丁酸，过 0.2μmPES滤膜，得到待检净化液；
S2、通过液相色谱-串联质谱法测定经预处理后的待测液中潮霉素B的残留量。
所述液相色谱采用Poroshell 120 EC-C18液相色谱柱，所述C18 柱填料粒径为2.7μm，内径为3.0mm，柱长为100mm；流动相由A相和B相组成，其中A相为乙酸铵、甲酸与水形成的溶液，乙酸铵浓度为0.5mmol/L，甲酸质量分数为0.1％，B相为乙腈，采用梯度洗脱；所述流动相中，A相与B相的体积比为98～10：2～90，流速为0.3mL/min，进样体积20μL，柱温为40℃；所述梯度洗脱的梯度依次为：时间0min， A相体积分数98％，B相体积分数2％、时间2.0min，A相体积分数 98％，B相体积分数2％、时间2.1min，A相体积分数92％，B相体积分数8％、时间5.1min，A相体积分数60％，B相体积分数40％、时间7.0min，A相体积分数10％，B相体积分数90％、时间8.0min， A相体积分数10％，B相体积分数90％，后运行时间为3min。
所述串联质谱采用电喷雾离子源，采用多反应监测(MRM)；离子源模式为ESI(+)，干燥气温度为350℃，干燥气流速为7L/min，鞘气温度为350℃，鞘气流速为12L/min，雾化器压力为40psi，毛细管电压为3500V，喷嘴电压为500V，碎裂电压为170V。
实施例8
本实施例的方法和实施例7的方法基本一致，区别仅仅在于：将 Bond Elut PBA固相萃取柱替换为Bond Elut NEXUS WCX固相萃取柱。
实施例9
本实施例的方法和实施例7的方法基本一致，区别仅仅在于：未使用Bond ElutPBA固相萃取柱对提取液进行净化，用直接提取的提取液进行检测。
实施例10
本实施例的方法和实施例1的方法基本一致，区别仅仅在于：将 Poroshell 120EC-C18液相色谱柱替换为Poroshell 120 HILIC-Z液相色谱柱，其余尺寸规格保持一致。
实施例11
一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC- MS/MS方法，包括以下步骤：
S1、对待测饲料进行预处理；所述预处理分为提取步骤及净化步骤；所述提取步骤的具体方法如下：称取2试样于50mL聚丙烯离心管中，加入10mg有机提取助剂、1mL水，经涡旋振荡5～10min、冷冻干燥，得到预吸附试样；预吸附试样中加入内标标准工作液 (10μg/mL)80μL，涡旋混匀30s，依次加入10mL 5wt％三氯乙酸水溶液及2颗陶瓷均质子，经涡旋振荡5min，再以8000r/min的速率离心5min；离心结束后转移全部上清液于新的50mL离心管中，再用 10mL 5wt％三氯乙酸水溶液对沉淀重复以上提取一次，在次离心后合并上清液，用氨水/乙酸调节pH至8.5，最后以8000r/min的速率离心 5min，取离心后的上清液，得到提取液，备用；所述净化步骤的具体方法如下：Bond Elut PBA固相萃取柱依次用2mL乙腈，3mL0.5wt％甲酸水溶液，5mL 0.2mol/L的乙酸铵水溶液(pH＝8.5)活化，取所述提取液5mL上样，依次用3mL pH＝8.5的乙酸铵水溶液(0.2mol/L)、 3mL水淋洗，抽干后，用2mL 0.5wt％甲酸水溶液分两次洗脱，收集洗脱液，加入洗脱液1wt％的七氟丁酸，过0.2μmPES滤膜，得到待检净化液；
S2、通过液相色谱-串联质谱法测定经预处理后的待测液中潮霉素B的残留量。
所述有机提取助剂的制备方法如下：
M1、将9g 5-甲基异苯二醛与19g蒽-2,6-二胺加入200g 1,4-二氧六环，随后添加2g浓度为2mol/L的醋酸水溶液，经超声处理得到均匀分散的反应混合液，超声处理的频率为28kHz，功率为550W，处理时间为10min；所述反应混合液在无氧条件下升温至125℃并反应 36h，反应结束后将产物冷却至室温，经离心处理收集沉淀，离心速率为6000rpm，处理时间为5min；沉淀物采用二氯甲烷洗涤，经干燥得到有机框架内核，备用；
M2、将17g D-氨基葡萄糖、11g碳酸钾和0.3g亚硝酸钠溶于40g 水，在0℃冰水浴条件下继续加入8g丙烯酰氯并混合0.5h，得到反应溶液；所述反应溶液升温至室温并反应3h，加入300g无水乙醇以终止反应；反应产物经过滤得滤液、旋转蒸发得到固态的丙烯酰胺基葡萄糖，备用；
M3、另取40g所述有机框架内核、40g N-羟甲基丙烯酰胺、20g 所述丙烯酰胺基葡萄糖与400g水混合均匀；随后向该混合液中继续加入0.025g四甲基乙二胺和25g过硫酸铵，升温至65℃并聚合反应 18h，聚合反应结束后，反应产物经离心得沉淀，离心速率为9000rpm，处理时间为3min；沉淀经水洗、乙醇洗、冷冻干燥，得到所述有机提取助剂。
所述液相色谱采用Poroshell 120 EC-C18液相色谱柱，所述C18 柱填料粒径为2.7μm，内径为3.0mm，柱长为100mm；流动相由A相和B相组成，其中A相为乙酸铵、甲酸与水形成的溶液，乙酸铵浓度为0.5mmol/L，甲酸质量分数为0.1％，B相为乙腈，采用梯度洗脱；所述流动相中，A相与B相的体积比为98～10：2～90，流速为0.3mL/min，进样体积20μL，柱温为40℃；所述梯度洗脱的梯度依次为：时间0min， A相体积分数98％，B相体积分数2％、时间2.0min，A相体积分数 98％，B相体积分数2％、时间2.1min，A相体积分数92％，B相体积分数8％、时间5.1min，A相体积分数60％，B相体积分数40％、时间7.0min，A相体积分数10％，B相体积分数90％、时间8.0min， A相体积分数10％，B相体积分数90％，后运行时间为3min。
所述串联质谱采用电喷雾离子源，采用多反应监测(MRM)；离子源模式为ESI(+)，干燥气温度为350℃，干燥气流速为7L/min，鞘气温度为350℃，鞘气流速为12L/min，雾化器压力为40psi，毛细管电压为3500V，喷嘴电压为500V，碎裂电压为170V。
测试例1
潮霉素B极性极强，在反相色谱柱中保留较弱，而在离子对试剂存在的情况下，可有效降低其极性，增强在反相色谱柱上保留。本测试例比较了分别使用EC-C18色谱柱(上机前溶液中加入1％七氟丁酸)和两性离子固定相HILIC-Z色谱柱时，潮霉素B的峰形及灵敏度，并通过氯霉素检测七氟丁酸对负离子模式的影响。
采用两性离子固定相HILIC-Z色谱柱的测试中，测试乙酸铵浓度分别为20mmol/L及100mmol/L在不同洗脱梯度下的结果。流动相及测试对应的洗脱梯度见表1。
表1
由图1a～c的结果可以看出，潮霉素在HILIC-Z色谱柱上保留较强，不出峰。随着流动相中盐溶液浓度的提高，即乙酸铵浓度由20mM 增加至100mM时，且水相比例提高至70％时，潮霉素B才被洗脱，无法满足定量需求。
采用EC-C18色谱柱的测试中，仅在上机前溶液中加入1％七氟丁酸。使用氯霉素测定七氟丁酸对负离子模式的影响，每隔9～10针潮霉素B样品(≈2h)，以相同的液相条件连续进3针氯霉素标样， RSD＝3.9％(n＝9)。流动相及测试对应的洗脱梯度见表2。
表2
由图2a～b的结果可知，加入1％七氟丁酸可以极大地避免了对仪器系统的污染，同时有助于与潮霉素B结构中的极性基团形成稳定的疏水性离子，增强目标物的保留，使得结果地灵敏度、稳定性提高。由图2c的结果可知，上机前溶液中加入七氟丁酸不会对负离子检测造成影响。
使用EC-C18色谱柱，并在上机前溶液中加入1％七氟丁酸可显著提检测高灵敏度和稳定性，同时进样过程中穿插对氯霉素的检测也证明该方法不会对负离子模式产生离子抑制。
测试例2
本测试例比较了实施例1～9净化后的回收率和基质效应。
由图3的结果可知，直接提取时回收率在88～100％之间，但基质效应太强，表现出强的离子抑制。用乙酸铵缓冲液直接提取时回收率(均为外标法)最高。经过PBA固相萃取净化后，使用乙酸铵缓冲溶液提取时回收率大大降低，5％三氯乙酸提取时回收率略高于磷酸缓冲液。使用WCX净化回收率均较低，不能满足要求。使用5％三氯乙酸溶液提取，PBA固相萃取净化能取到最佳的提取效果。
测试例3
使用内标法定量，以目标物选择离子色谱峰面积和内标物选择离子色谱峰面积比值为纵坐标，以相应的浓度比值为横坐标，绘制标准曲线。本方法标准曲线的线性回归方程见表3。
表3
表3结合图4可以看出，在10～1000ng/mL的浓度范围内，潮霉素B相关系数R2高于0.99，表现出良好的线性。
通过在空白基质中添加待测化合物标准品来确定方法的检出限和定量限，当添加浓度水平达到50μg/kg时，目标物色谱峰的信噪比 (S/N)均大于为3，表明方法的检出限可以达到0.5μg/kg；当添加水平为100μg/kg时，信噪比(S/N)大于10，回收率和重复性均能满足相关国家标准要求，方法的定量限可以达到100μg/kg。
测试例4
采用实施例1的方法，配合饲料、复合预混饲料、浓缩饲料和精料补充料四种不同的饲料为研究基质，选择100、200、1000μg/kg三个加标水平，在每个加标水平下重复测定三次，比较平均回收率及标准偏差。采用实施例11的方法对精料补充料(育肥牛)组进行测试，比较与实施例1的方法的准确度和精密度。不同类型饲料中潮霉素B 添加回收率测试结果见表4。
表4
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各目标化合物的平均加标回收率和相对标准偏差分别在 78.2～112.1％和1.6～7.7％之间，均能满足相关国家标准要求，本发明的方法具有良好的准确度和精密度。实施例11与实施例1相比，对精料补充料(育肥牛)种类饲料的潮霉素B检测更佳准确，其原因可能在于，有机提取助剂具有丰富的吸附位点和较大的比表面积，酰胺基团与潮霉素B中的羟基之间存在氢键作用，潮霉素B的极性强，有机提取助剂可通过极性基团间的相互吸引来促进与潮霉素B的结合；有机框架内核呈立体网络状，具有一定伸缩延展能力，增强了相互作用位点的密度，与饲料中的固态微粒结合面广，利于潮霉素B从饲料中溶出。随着三氯乙酸水溶液的加入，混合液中水分比例与三氯乙酸含量上升，导致潮霉素B与有机提取助剂的相互作用减弱而发生解吸，潮霉素B溶于溶剂，经净化、检测，结果更接近真实含量。

Claims (9)

1.一种流动相中不使用离子对试剂的饲料中潮霉素B检测LC-MSMS方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、对待测饲料进行预处理；所述预处理包括提取步骤及净化步骤；所述提取步骤为：将待测饲料加入三氯乙酸溶液混匀，经离心后取上清液，用氨水/乙酸调节pH值，即得提取液，待净化步骤进行净化；所述净化步骤为：将固相萃取柱依次用乙腈、甲酸水溶液、乙酸铵水溶液活化，取所述提取液上样，依次用乙酸铵水溶液、水淋洗，抽干后，用甲酸水溶液分两次洗脱，收集洗脱液，加入七氟丁酸，过PES滤膜，得到待测液；
S2、通过液相色谱-串联质谱法测定经预处理后的待测液中潮霉素B的残留量；
所述提取步骤的方法为：称取2±0.02g试样于离心管中，加入10mg有机提取助剂、1mL水，经涡旋振荡5~10min、冷冻干燥，得到预吸附试样；预吸附试样中加入10μg/mL内标标准工作液80μL，涡旋混匀30~60s，依次加入10mL 5wt%三氯乙酸水溶液及陶瓷均质子，经涡旋振荡5~10min，再以8000~12000r/min的速率离心5~10min；离心结束后转移全部上清液于新的50mL离心管中，再用10mL 5wt%三氯乙酸水溶液对沉淀重复以上提取一次，在次离心后合并上清液，用氨水/乙酸调节pH至8.5±0.2，最后以8000~12000r/min的速率离心5~10min，取离心后的上清液，得到提取液，备用；
所述有机提取助剂的制备方法如下，以重量份计：
M1、将0.9~1.2份5-甲基异苯二醛与1.9~2.4份蒽-2,6-二胺加入20~30份1,4-二氧六环，随后添加0.2~0.35份浓度为1.5~3mol/L的醋酸水溶液，经超声处理得到均匀分散的反应混合液，超声处理的频率为28~40kHz，功率为550~800W，处理时间为10~30min；所述反应混合液在无氧条件下升温至110~140℃并反应12~48h，反应结束后将产物冷却至室温，经离心处理收集沉淀，离心速率为4500~9000rpm，处理时间为3~5min；沉淀物采用二氯甲烷洗涤，经干燥得到有机框架内核，备用；
M2、将1.7~2.5份D-氨基葡萄糖、1.1~1.8份碳酸钾和0.03~0.045份亚硝酸钠溶于4~8份水，在0~4℃冰水浴条件下继续加入0.8~1.2份丙烯酰氯并混合0.5~2h，得到反应溶液；所述反应溶液升温至室温并反应1.5~3h，加入30~45份无水乙醇以终止反应；反应产物经过滤得滤液、旋转蒸发得到固态的丙烯酰胺基葡萄糖，备用；
M3、另取4~6份所述有机框架内核、4~6份N-羟甲基丙烯酰胺、2~3份所述丙烯酰胺基葡萄糖与40~80份水混合均匀；随后向该混合液中继续加入0.0025~0.0075份四甲基乙二胺和2.5~3.5份过硫酸铵，升温至55~70℃并聚合反应12~36h，聚合反应结束后，反应产物经离心得沉淀，离心速率为9000~12000rpm，处理时间为3~5min；沉淀经水洗、醇洗、冷冻干燥，得到所述有机提取助剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述净化步骤的具体方法如下：PBA固相萃取柱依次用2mL乙腈，3mL 0.5wt%甲酸水溶液，5mL 0.2mol/L的乙酸铵水溶液pH=8.5活化，取所述提取液5mL上样，依次用3mL pH=8.5的0.2mol/L乙酸铵水溶液、3mL水淋洗，抽干后，用2mL 0.5wt%甲酸水溶液分两次洗脱，收集洗脱液，加入洗脱液1wt%的七氟丁酸，过0.2μmPES滤膜，得到待检净化液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：液相色谱采用C18柱，流动相由A相和B相组成，其中A相为乙酸铵、甲酸与水形成的溶液，B相为乙腈，采用梯度洗脱。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：A相为乙酸铵、甲酸与水形成的溶液，乙酸铵浓度为0.2~1.0mmol/L，甲酸质量分数为0.1%。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：流动相中，按体积比计，A相：B相=98~10：2~90；流速为0.2~0.4mL/min；进样体积5~20μL；柱温为25~40℃。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，梯度洗脱的梯度依次为：时间0min，A相体积分数98%，B相体积分数2%；时间2.0min，A相体积分数98%，B相体积分数2%；时间2.1min，A相体积分数92%，B相体积分数8%；时间5.1min，A相体积分数60%，B相体积分数40%；时间7.0min，A相体积分数10%，B相体积分数90%；时间8.0min，A相体积分数10%，B相体积分数90%；后运行时间为3min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：串联质谱采用电喷雾离子源，采用多反应监测MRM或选择离子监测SRM中的任一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：串联质谱的离子源模式为ESI+，干燥气温度为200~400℃；干燥气流速为5~11L/min；鞘气温度为200~400℃；鞘气流速为7~15L/min；雾化器压力为35~45psi；毛细管电压为2500~4000V；喷嘴电压为0~500V。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：串联质谱的数据采集参数中，碎裂电压170V；碰撞能量为10~40V，保留2~10min。
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