CN112697919B - 度洛西汀的检测方法 - Google Patents

度洛西汀的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112697919B
CN112697919B CN202011528868.0A CN202011528868A CN112697919B CN 112697919 B CN112697919 B CN 112697919B CN 202011528868 A CN202011528868 A CN 202011528868A CN 112697919 B CN112697919 B CN 112697919B
Authority
CN
China
Prior art keywords
duloxetine
sample
detected
detection
standard
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011528868.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112697919A (zh
Inventor
魏斌
贾永娟
倪君君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd
Original Assignee
Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd filed Critical Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd
Priority to CN202011528868.0A priority Critical patent/CN112697919B/zh
Publication of CN112697919A publication Critical patent/CN112697919A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112697919B publication Critical patent/CN112697919B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/30—Control of physical parameters of the fluid carrier of temperature
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
    • G01N2030/324—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed speed, flow rate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/60—Construction of the column
    • G01N30/6034—Construction of the column joining multiple columns
    • G01N30/6043—Construction of the column joining multiple columns in parallel

Abstract

本发明提供了度洛西汀的检测方法，包括：制备具有度洛西汀和未含有度洛西汀的空白样本的至少三种浓度的标准溶液，标准溶液中的空白样本的量相同；利用液相色谱仪在检测条件下检测每一种标准溶液，获得标准溶液对应的第一检测结果；根据各个第一检测结果和标准溶液中度洛西汀的浓度，拟合度洛西汀的标准曲线方程；取待处理样品离心后的第一上清液；向第一上清液内加入萃取剂，涡旋混匀，对第一上清液进行萃取，得到待测样品；利用液相色谱仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中度洛西汀的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

度洛西汀的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及度洛西汀的检测方法。
背景技术
度洛西汀为白色或类白色结晶性粉末，在水中略溶，在甲醇中易溶，是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂。
目前，检测样品中度洛西汀含量通常采用的方法为高效液相色谱法。而现有检测方法通常采用单一色谱柱进行检测，增加了等待色谱柱清洗的时间，从而导致样品检测时间较长。
发明内容
本发明提供了度洛西汀的检测方法，能够缩短样品检测时间。
为了解决上述问题，本发明实施例提供了度洛西汀的检测方法，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有度洛西汀和未含有度洛西汀的空白样本的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的空白样本的量相同；
利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果和所述标准溶液中度洛西汀的浓度，拟合度洛西汀的标准曲线方程；
对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
向所述第一上清液内加入萃取剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；
利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中度洛西汀的浓度。
需要说明的是，空白样本包括未含有度洛西汀的血清或血浆；第一上清液包括血清或血浆；萃取后选择为上层有机相。
具体地，可以通过下述步骤制备标准溶液：
(1)标准储备液的配制
精确称取度洛西汀标准品置于容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。
(2)标准工作液的配制
取适量步骤(1)中标准储备液，用含有40％-60％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有320-11520ng/mL度洛西汀的标准工作液，并在-80℃条件下保存。
(3)标准溶液的标定
分别移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液置于离心管中，分别向各个离心管中加入空白样本，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1500-2500rpm下涡旋混匀2-5min后，加入萃取剂进行萃取，得到标准溶液。
为了保证度洛西汀充分溶解，选择甲醇进行溶解；同时为了降低标准工作液反复使用过程中的挥发，确保标准工作液的稳定性，所以度洛西汀的稀释液为含有40％-60％甲醇的水溶液。
优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：
洗脱流动相中的水相包括：含有20-80mM乙酸铵和0.05％-0.3％甲酸的水溶液；
洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；
柱温包括28-50℃；流速包括0.7-1.1mL/min。
具体地，色谱柱包括Thermo公司的AcclaimTM120-C18
Figure BDA0002851490290000021
色谱柱，长度为150mm、内径为3.0mm以及填料粒径为3μm；Waters Atlantis dC18色谱柱，长度为150mm、内径为2.1mm以及填料粒径为3μm。
具体地，液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/160.5M。
针对水相中的乙酸铵来说，20-80mM是指20mM至80mM范围内的任一比例，比如，20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM以及80mM。
针对水相中的甲酸来说，0.05％-0.3％是指0.05％至0.3％范围内的任一值，比如，水相中含有0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％以及0.3％的甲酸。
比如，洗脱流动相中的水相包括：含有50mM乙酸铵和0.2％甲酸的水溶液；有机相包括：乙腈溶液。
具体地，水相中的乙酸铵浓度过大且在对目标物进行检测时，可能存在乙酸铵在色谱柱中析出的情况，已析出的乙酸铵会堵塞色谱柱，影响样品测试。因此，洗脱流动相中的水相包括：含有20-80mM乙酸铵。
针对柱温来说，28-50℃是指28℃至50℃范围内的任一温度值，比如，28℃、30℃、35℃、38℃、40℃、45℃、48℃以及50℃。
针对流速来说，0.7-1.1mL/min是指0.7mL/min至1.1mL/min范围内的任一值，比如，0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min以及1.1mL/min。
所述检测条件中的液相条件，包括：
采用双泵双柱检测模式，其中，
所述双泵双柱检测模式包括：主泵、副泵和两个色谱柱；
所述主泵和所述两个色谱柱中的一个色谱柱在对待测样品进行检测时，采用等度洗脱，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比包括：67％:33％-72％:28％；
所述副泵用于对待测样品检测后的色谱柱进行清洗时采用梯度洗脱，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比包括：
0.00min：0％:100％-10％:90％；
5.50min：0％:100％-10％:90％；
6.00min：67％:33％-72％:28％；
9.50min：67％:33％-72％:28％。
针对主泵的等度洗脱中的水相与有机相的体积比来说，67％:33％-72％:28％是指67％:33％至72％:28％范围内的任一比例，比如，67％:33％、68％:32％、69％:31％、70％:30％、71％:29％以及72％:28％。
比如，水相的体积占洗脱流动相体积的69.5％，有机相的体积占洗脱流动相体积的30.5％；水相的体积占洗脱流动相体积的67.5％，有机相的体积占洗脱流动相体积的32.5％。
具体地，在主泵采用等度洗脱进行检测时，当水相在洗脱流动相中体积占比小于67％时，度洛西汀的色谱峰与杂质峰的分离度较差，易受杂质干扰，影响待测样品的检测准确性；当水相在洗脱流动相中体积占比大于72％时，度洛西汀的出峰时间较晚，导致保留时间增大，增大了待测样品的检测时间。因此，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比包括：67％:33％-72％:28％。
针对副泵的梯度洗脱中的水相与有机相在0.00min和5.50min的体积比，0％:100％-10％:90％是指0％:100％至10％:90％范围内的任一比例，比如，0％:100％、3％:97％、5％:95％、8％:92％以及10％:90％。
针对副泵的梯度洗脱中的水相与有机相在6.00min和9.50min的体积比，67％:33％-72％:28％是指67％:33％至72％:28％范围内的任一比例，比如，67％:33％、68％:32％、69％:31％、70％:30％、71％:29％以及72％:28％。
具体地，在副泵采用梯度洗脱进行清洗时，为了保证去除残留的目标物杂质，在0.00min和5.50min时选择洗脱流动相中水相与有机相的体积比包括：0％:100％-10％:90％；为了平衡色谱柱，在6.00min和9.50min时选择洗脱流动相中水相与有机相的体积比包括：67％:33％-72％:28％。
例如，在副泵采用梯度洗脱进行清洗时，当5.50min水相与有机相的体积比为2％:98％，且6.00min水相与有机相的体积比为69.5％:30.5％时，那么在5.50min至6.00min时间段内，水相则由占比2％逐渐增加至69.5％，有机相由占比98％逐渐降低至30.5％。
由于水相与有机相在洗脱流动相中占比的总和为1，因此，当水相在洗脱流动相中的占比增加时，有机相在洗脱流动相中的占比则相应降低。
优选地，所述检测条件中的荧光检测条件，包括：
荧光检测器的荧光检测条件，包括：
激发波长：285nm；发射波长：340nm。
具体地，采用FLD荧光检测器，发射光谱扫描模式；荧光检测条件中的峰宽：0.1min；灯模式：HighPower；灵敏度：7。
具体地，当荧光检测条件中的激发波长低于285nm、发射波长低于340nm时，度洛西汀的响应值下降甚至无响应，会影响对待测样品的检测灵敏度；当荧光检测条件中的激发波长高于285nm、发射波长高于340nm时，度洛西汀的色谱峰与杂质峰的分离度差，受杂质干扰严重，会影响对待测样品的检测准确性。
优选地，所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中度洛西汀的色谱峰面积，以及所述标准溶液中度洛西汀的浓度。
具体地，若度洛西汀的色谱峰面积作为标准曲线方程的x值(即自变量)时，度洛西汀的浓度作为标准曲线方程的y值(即因变量)。
若度洛西汀的色谱峰面积作为标准曲线方程的y值(即因变量)时，度洛西汀的浓度则为标准曲线方程的x值(即自变量)。
优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，向第一上清液内加入的萃取剂包括：正己烷。
优选地，
所述对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液，包括：
将所述待处理样品在3000-4000rpm的转速下离心8-12min，取离心后的上清液作为第一上清液。
具体地，通过离心对待处理样品进行初步提纯，以去除部分杂质。可以理解的是，第一上清液包括血清或血浆。
优选地，
所述向所述第一上清液内加入萃取剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：
向所述第一上清液内加入所述萃取剂，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合18-22min，并在10000-15000rpm的转速下离心5-12min，移取离心后的第二上清液；
利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合8-12min，并在10000-15000rpm的转速下离心5-12min，取离心后的第三上清液作为待测样品。
具体地，在常温(25℃)下用氮气将移取的第二上清液吹干。
具体地，在向第一上清液内加入萃取剂后，为了混合更均匀，先涡旋混匀，进行萃取，以对混合后的第一上清液进行提纯，然后进行离心，取离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于利用萃取剂萃取后目标物的含量较低，因此为了便于检测，可利用氮气进行吹干，以对第二上清液进行浓缩，浓缩后再加入复溶液，并进行涡旋以使复溶液中的目标物分布均匀。
针对涡旋转速来说，1500-2500rpm是指1500rpm至2500rpm范围内的任一转速，比如，1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、2000rpm、2100rpm、2200rpm、2300rpm、2400rpm以及2500rpm。
针对加入萃取剂之后的涡旋时间来说，18-22min是指18min至22min范围内的任一时间，比如，18min、19min、20min、21min以及22min。
针对加入复溶液之后的涡旋时间来说，8-12min是指8min至12min范围内的任一时间，比如，8min、9min、10min、11min以及12min。
针对离心转速来说，10000-15000rpm是指10000rpm至15000rpm范围内的任一转速，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm以及15000rpm。
针对离心时间来说，5-12min是指5min至12min范围内的任一时间，比如，5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min以及12min。
优选地，所述复溶液包括：含25％-35％乙腈的水溶液。
针对复溶液来说，25％-35％是指25％至35％范围内的任一值，比如，含有25％、28％、30％、32％、34℃以及35％的乙腈。
优选地，为了更好的进行目标物的提取以及杂质的去除，所述第一上清液与所述萃取剂的体积比为1:4-1:6中的任一比例。
针对第一上清液和萃取剂的体积比来说，1:4-1:6是指1:4至1:6范围内的任一比例，比如，1:4、1:4.5、1:5、1:5.5以及1:6。
具体地，当第一上清液的体积为200μL，那么萃取剂的体积可以是800μL至1200μL范围内的任一值。
本发明提供了度洛西汀的检测方法，通过液相色谱仪对含有不同浓度的度洛西汀的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，因此，基于各种浓度标准溶液中的度洛西汀的浓度和多个第一检测结果拟合得到度洛西汀的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得离心后的血清或血浆，加入萃取剂进行萃取，即可得能够检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中度洛西汀的含量。而且无需长时间的色谱分离以及清洗再平衡的过程，耗费时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的度洛西汀的检测方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的待测样品中的度洛西汀的色谱图；
图3是本发明一实施例提供的标准溶液中的度洛西汀的色谱图；
图4是本发明一实施例提供的度洛西汀的线性关系图；
图5是本发明一实施例提供的柱温25℃，流速1.0mL/min时的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的柱温55℃，流速1.0mL/min时的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的柱温45℃，流速0.6mL/min时的色谱图；
图8是本发明一实施例提供的柱温45℃，流速1.2mL/min时的色谱图；
图9是本发明一实施例提供的柱温45℃，流速1.2mL/min时主泵的压力变化图；
图10是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；
图11是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；
图12是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；
图13是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为74％:26％时的色谱图；
图14是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为66％:34％时的色谱图；
图15是本发明一实施例提供的萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图；
图16是本发明一实施例提供的萃取剂为二氯甲烷时的色谱图；
图17是本发明一实施例提供的萃取剂为甲基叔丁基醚时的色谱图；
图18是本发明一实施例提供的萃取剂为乙腈时的色谱图；
图19是本发明一实施例提供的色谱柱为Waters Atlantis dC18时的色谱图；
图20是本发明一实施例提供的色谱柱为Waters Xbridge C18时的色谱图；
图21是本发明一实施例提供的色谱柱为Agilent Extend C18时的色谱图；
图22是本发明一实施例提供的色谱柱为phenomenex Kinetex Polar C18时的色谱图；
图23是本发明一实施例提供的激发波长为285nm、发射波长为310nm时的色谱图；
图24是本发明一实施例提供的激发波长为285nm、发射波长为370nm时的色谱图；
图25是本发明一实施例提供的激发波长为315nm、发射波长为370nm时的色谱图；
图26是本发明一实施例提供的激发波长为255nm、发射波长为340nm时的色谱图；
图27是本发明一实施例提供的激发波长为315nm、发射波长为340nm时的色谱图；
图28是本发明一实施例提供的激发波长为255nm、发射波长为310nm时的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，待测样品采用单一色谱柱进行检测，需要长时间的色谱分离以及清洗再平衡过程，从而使得整体分析时间较长。
并且，待测样品采用混合萃取剂(比如，正己烷和异戊醇的混合溶液、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶液)进行萃取，而萃取剂是由多组分配制而成的，这样就增加了萃取剂的配制难度，同时导致前处理过程所需时间较长，增加了待测样品中度洛西汀整体的检测时长。
基于上述问题，本发明实施例提供了度洛西汀的检测方法，如图1所示，包括：
步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有度洛西汀和未含有度洛西汀的空白样本的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的空白样本的量相同；
步骤102：利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
步骤103：根据各个所述第一检测结果和所述标准溶液中度洛西汀的浓度，拟合度洛西汀的标准曲线方程；
步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
步骤105：向所述第一上清液内加入萃取剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；
步骤106：利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中度洛西汀的浓度。
在本发明实施例中，通过液相色谱仪对含有不同浓度的度洛西汀的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，因此，基于各种浓度标准溶液中的度洛西汀的浓度和多个检测结果拟合得到度洛西汀的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理即可得离心后的血清或血浆，加入萃取剂进行萃取，即可得能够检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中度洛西汀的含量。而且无需长时间的色谱分离以及清洗再平衡的过程，耗费时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。
下面以几个实施例对度洛西汀的检测方法进行详细说明。
实施例1：制备系列浓度的标准溶液
(a)标准储备液的配制：
精确称取度洛西汀标准品10mg置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于5mL，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。
(b)标准工作液的配制
取适量步骤(a)中标准储备液，用含有50％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有320-11520ng/mL度洛西汀的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
其中，不同浓度的标准工作液为含有度洛西汀：320ng/mL、480ng/mL、720ng/mL、1440ng/mL、2880ng/mL、5760ng/mL、11520ng/mL的系列溶液。
(c)标准溶液的标定
用移液器移取步骤(b)中七种不同浓度的标准工作液10μL、190μL空白样本分别置于2.0mL离心管中，并分别在转速为2000rpm下涡旋混匀3min，混合制成七种不同浓度的混合溶液，向上述混合溶液中加入萃取剂进行萃取，得到七种不同浓度的标准溶液，并且七种标准溶液中的空白样本的量相同。
需要说明的是，可按照处理待测样品时的前处理操作，对不同浓度的标准溶液的前处理过程，即，标准溶液中的萃取剂、加入萃取剂后的涡旋时间和转速、复溶液、加入复溶液后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间均与待测样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。
实施例2：拟合标准曲线方程
利用液相色谱仪对实施例1中七种标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的度洛西汀的标准溶液的色谱图。
从上述度洛西汀的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中度洛西汀分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的度洛西汀的峰面积作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述度洛西汀标准工作液中的浓度作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。
上述检测条件包括：
色谱柱：Thermo公司的AcclaimTM120-C18
Figure BDA0002851490290000101
填料粒径3μm，内径为3mm，长度为150mm；
洗脱流动相中的水相包括：含有50mM乙酸铵和0.2％甲酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；
采用双泵双柱检测模式，用于对待测样品进行检测的主泵采用等度洗脱，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为69.5％:30.5％；用于在待测样品检测后清洗色谱柱的副泵采用梯度洗脱，洗脱流动相中水相与有机相的体积比包括：0.00min：2％:98％；5.50min：2％:98％；6.00min：69.5％:30.5％；9.50min：69.5％:30.5％；
柱温为45℃；流速为1.0mL/min，进样量为30μL，分析时间为9.5min。
检测条件中的荧光检测条件，包括：采用FLD荧光检测器，激发波长：285nm；发射波长：340nm，发射光谱扫描模式，荧光检测条件中的峰宽：0.1min；灯模式：HighPower；灵敏度：7。
本实施例中采用的液相色谱仪包括主泵、副泵、自动进样器、柱温箱、检测器和两个相同型号的色谱柱。其中，柱温箱中包括一个十通阀，十通阀的连接方式如表1所示，其中，通过管线和柱温箱十通阀将两个色谱柱与自动进样器、主泵、副泵、检测器、废液管相连接，构成用于实现待测样品检测的液相色谱检测系统。
表1
管线连接方式 十通阀位置
主泵(与自动进样器相连) 4
色谱柱1(入口端) 5
色谱柱1(出口端) 10
检测器(入口端) 1
副泵 6
管线(入口端) 7
管线(出口端) 2
色谱柱2(入口端) 3
色谱柱2(出口端) 8
废液管 9
由表1可知，主泵与自动进样器相连接，通过柱温箱十通阀位置的转变，主泵可以交替实现色谱柱1/色谱柱2的进样分析检测。当柱温箱十通阀中位置1与位置10相连接时，色谱柱1与主泵以及检测器相连接并进样分析，副泵对色谱柱2进行清洗并与废液管相连接。当柱温箱十通阀中位置1与位置2相连接时，色谱柱2与主泵以及检测器相连接并进样分析，副泵对色谱柱1进行清洗并与废液管相连接。如此当采用双泵双柱检测模式时，可以交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测，即主泵对一个色谱柱进行分析检测时，副泵对另一个色谱柱进行清洗，既保证了对色谱柱进行充分的清洗，去除色谱柱内残留的弱极性杂质，又能有效缩短待测样品整体的分析检测时间。
具体地，针对两个相同型号的色谱柱：色谱柱1和色谱柱2，当色谱柱1与自动进样器和检测器连接，色谱柱2与副泵和废液管相连接时，由主泵对色谱柱1中的待测样品进行检测，由副泵对已完成待测样品检测的色谱柱2进行清洗；在色谱柱1完成待测样品的检测，色谱柱2完成清洗后，由色谱柱2与自动进样器和检测器连接，色谱柱1与副泵和废液管相连接，再由主泵对色谱柱2中的待测样品进行检测，由副泵对已完成待测样品检测的色谱柱1进行清洗，从而交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测。
实施例3：待测样品的前处理
3.1取待处理血液至少500μL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。
3.2用移液枪移取200μL步骤3.1中的血清或血浆置于1.5mL离心管中，然后加入1000μL萃取剂(正己烷)后，在2000rpm的转速下涡旋混合20min后，再在14000rpm的转速下离心10min后，取第二上清液(上层有机相)850μL放入另一支1.5mL离心管中，在常温下利用氮气将移取的第二上清液吹干，顺次加入100μL复溶液(含有30％乙腈的水溶液)后，在2000rpm的转速下涡旋混合10min，并在14000rpm的转速下离心10min，取离心后的第三上清液作为待测样品。
具体地，由于正己烷极性较弱，可以有效降低待处理样品中其他杂质干扰成分对目标物的影响，保证对目标物的检测准确性，因此采用单一萃取剂正己烷。
在本发明实施例中，为了提高目标物的响应值，同时保证目标物不易受杂质干扰，采用特异性更强、灵敏度高且抗杂质干扰能力强的FLD荧光检测器。
实施例4：待测样品的检测
利用液相色谱仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。
从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中的度洛西汀的色谱峰面积，将待测样品中的度洛西汀的色谱峰面积作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中的度洛西汀的浓度。
实施例5：针对检测条件的说明
本申请例1：
(1)色谱柱：Thermo公司的AcclaimTM120-C18
Figure BDA0002851490290000121
(填料粒径3μm，内径为3mm，长度为150mm)；
(2)采用双泵双柱检测模式，对待测样品进行检测时采用等度洗脱，其中洗脱流动相中的水相包括：含有50mM乙酸铵和0.2％甲酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；在待测样品检测后清洗色谱柱时采用梯度洗脱；
(3)流速：1.0mL/min，进样量30μL，分析时间9.5min。
对比例1：(RP-HPLC法测定人血浆中盐酸度洛西汀的浓度[J].中国药师,2009,12(11):1545-1546.)
(1)色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(填料粒径5μm，内径为4.6mm，长度为150mm)；
(2)洗脱流动相包括：含有5mM醋酸的水溶液(氨水调节pH为7.5)-甲醇-乙腈(体积比为33％:30％:37％)；等度洗脱；
(3)流速：1.0mL/min，进样量50μL，分析时间13min。
图2为本申请中的待测样品中度洛西汀的色谱图，图2的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为1.0×105。
从图2、本申请例1和对比例1可以看出，本发明的样本分析时间为9.5min，其中度洛西汀的保留时间约为8.2min，相较于对比例1的分析时间短。其次，本申请例1中采用双泵双柱的检测模式，可以交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测，既保证了对色谱柱进行充分的清洗，去除色谱柱内残留的弱极性杂质，又能极大地缩短待测样品整体的分析检测时间。其次，本申请例1采用的洗脱流动相的组成较简单，更加便于操作；而且本申请例1采用的色谱柱的内径较小，使得目标物的扩散减少，从而提高了目标物的响应值，进一步提高了待测样品的检测准确性。
实施例6：度洛西汀的检测方法的检出限和定量限
制备不同浓度的度洛西汀低浓度样本，分别加入10μL各个浓度的度洛西汀低浓度样本和190μL空白样本，混匀后按本实施例3中的前处理以及实施例2中的检测条件进行检测，其中，本实施例中按照浓度由低至高的顺序进行检测，避免检测时浓度高的样本对浓度低的样本产生影响。然后以定量色谱峰面积-浓度作图，得到度洛西汀的标准曲线，结果表明度洛西汀的检出限和定量限分别如下：
(1)检出限(LOD)：1.8ng/mL，信噪比(S/N)为3；
(2)定量限(LOQ)：6.1ng/mL，信噪比(S/N)为10。
由本实施例可知，度洛西汀的检出限及定量限分别为1.8ng/mL和6.1ng/mL，灵敏度很高，对度洛西汀含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。
实施例7：度洛西汀的检测方法的线性方程的获得和线性关系
将实施例1中七种不同浓度的标准溶液利用液相色谱仪按照实施例2中的检测条件进行测定，得到各浓度的度洛西汀的色谱图，其中，标准溶液中的度洛西汀的色谱图如图3所示；图3的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为1.0×106；其中，度洛西汀的保留时间约为8.2min。
确定各色谱峰的峰面积，以度洛西汀色谱峰面积作为标准曲线方程的纵坐标y2，度洛西汀浓度作为标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝a*x2+b，并且得系数c；线性方程的测定结果见表2，线性方程图见图4。
表2
检测指标 线性范围 线性方程 相关系数 加权
度洛西汀-某实施例1 16-576ng/mL y2＝2960.223*x2+16421.92 0.9990 1/X<sup>2</sup>
表2为一次实施例中的线性关系数据，由表2可知，度洛西汀在16-576ng/mL的线性范围内，相关系数R2＞0.9900，线性关系良好。
实施例8：度洛西汀的检测方法的回收率和精密度
取实施例1中度洛西汀标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，度洛西汀的回收率如表3。度洛西汀在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99.46％～106.55％，精密度为0.29％～3.16％。
表3
Figure BDA0002851490290000141
综合上述验证试验，本实施例的回收率，检出限和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法检测血液中度洛西汀，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。
由图2和图3可见，待测样品中的度洛西汀的保留时间与其标准溶液中的度洛西汀的保留时间一致，该方法采用外标法，使得目标化合物的分析时间短、干扰小，特异性强、准确度和灵敏度高。
实施例9：针对流速和柱温的说明
图5至图9分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流速和柱温不同，其中，图9中的横坐标为采集时间(min)，纵坐标为压强大小(Bar)。
图5为柱温25℃，流速1.0mL/min时的色谱图，图5中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为5.0×104，图5中保留时间约为10.5min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图6为柱温55℃，流速1.0mL/min时的色谱图，图6中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为5.0×104，图6中保留时间约为6.9min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图7为柱温45℃，流速0.6mL/min时的色谱图，图7中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为1.0×105，图7中保留时间约为11.9min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图8为柱温45℃，流速1.2mL/min时的色谱图，图8中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为5.0×104，图8中保留时间约为6.9min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图9为柱温45℃，流速1.2mL/min时主泵的压力变化图，图9中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为5.0。
通过图2以及图5至图9可见，当流速为1.0mL/min，柱温低于28℃时，度洛西汀的保留时间增加，导致目标物的检测时间过长，影响待测样品的检测时效性。而柱温高于50℃时，度洛西汀的保留时间有所减小，但出现了较多的杂质峰，同时柱温较高会影响色谱柱寿命，因此，对度洛西汀检测时的柱温范围设置在28℃至50℃范围内，以使目标物的保留时间相对最短。
由于流速小于0.7mL/min时会使得度洛西汀的出峰较晚，保留时间增加，从而导致目标物检测时间过长，影响待测样品的检测效率和时效性。而流速大于1.1mL/min时，度洛西汀出峰较早，保留时间较短，但如图9所示流速过大会使柱压升高，甚至超过色谱柱所能承受的压力，对色谱柱造成不可逆的损伤。
实施例10：针对洗脱流动相的说明
图10至图12分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为洗脱流动相中的水相的不同。
图10为洗脱流动相中的水相为含有0.2％甲酸的水溶液、有机相为乙腈溶液时的色谱图，其中，图10中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为1.0×105，图10中保留时间约为6.06min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图11为洗脱流动相中的水相为蒸馏水、有机相为乙腈溶液时的色谱图，图11中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为1.0×105，图11中无度洛西汀的色谱峰；
图12为洗脱流动相中的水相为含有5mM乙酸铵和0.02％甲酸的水溶液、有机相为乙腈溶液时的色谱图，图12中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为1.0×105，图12中保留时间约为7.1min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰。
通过图2、图10至图12可见，当洗脱流动相的水相中不添加缓冲盐仅添加甲酸时，度洛西汀的色谱峰与杂质的色谱峰分离度差，影响待测样品的检测准确性；当洗脱流动相的水相中不添加甲酸、不添加缓冲盐时，在分析时间内未检测到度洛西汀的色谱峰；当洗脱流动相的水相中添加的甲酸含量低于0.05％、添加的缓冲盐含量低于20mM时，度洛西汀的峰型较差，为拖尾峰，且与杂质峰的分离度较差，影响待测样品的检测准确性。
具体地，水相中的乙酸铵浓度过大且在对目标物进行检测时，存在乙酸铵在色谱柱中析出的情况，已析出的乙酸铵会堵塞色谱柱，影响待测样品的检测。因此，洗脱流动相中的水相包括：含有20-80mM乙酸铵。
具体地，洗脱流动相中的甲酸含量过多时，导致洗脱流动相的pH值过低，从而对色谱柱造成不可逆的损伤，因此，洗脱流动相中的水相包括：含有0.05％-0.3％甲酸。
实施例11：针对洗脱流动相中水相与有机相的体积比的说明
图13和图14分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为洗脱流动相中的水相与有机相的体积比不同。
图13为主泵中洗脱流动相中水相与有机相的体积比为74％:26％时的色谱图，图13中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为2.0×104，图13中保留时间约为8.8min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图14为主泵中洗脱流动相中水相与有机相的体积比为66％:34％时的色谱图，图14中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为2.0×105，图14中保留时间约为4.9min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰。
通过图2、图13和图14可见，在主泵采用等度洗脱进行检测时，水相在洗脱流动相中体积占比小于67％时，度洛西汀的色谱峰与杂质峰的分离度较差，易受杂质干扰，影响待测样品的检测准确性；而水相在洗脱流动相中体积占比大于72％时，度洛西汀的出峰时间较晚，导致其保留时间增大，增大了待测样品的检测时间。
实施例12：针对萃取剂的说明
图15至图18对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为萃取剂的不同。
图15是萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图，图15中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为2.0×105，图15中保留时间约为7.8min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图16是萃取剂为二氯甲烷的色谱图，图16中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为2.0×105，图16中保留时间约为8.0min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图17是萃取剂为甲基叔丁基醚时的色谱图，图17中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为2.0×105，图17中保留时间约为7.7min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图18是萃取剂为乙腈时的色谱图，图18中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为1.0×105，图18中保留时间约为7.7min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰。
通过图15至图18可见，萃取剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚或乙腈时，得到的待测样品的色谱峰为前沿峰或拖尾峰，待测样品中目标物的萃取率低，并且待测样品的色谱峰与杂质峰的分离较差，杂质峰较多，影响待测样品的检测准确性。
实施例13：针对色谱柱的说明
图19至图22对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，主要区别为色谱柱的不同。
图19是色谱柱为Waters Atlantis dC18(填料粒径3μm，内径为2.1mm，长度为150mm)时的色谱图；其中，图19中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为2.0×105，图19中保留时间约为9.3min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图20是色谱柱为Waters Xbridge C18(填料粒径3.5μm，内径为2.1mm，长度为150mm)时的色谱图；其中，图20中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为2.0×105，图20中保留时间约为6.0min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图21是色谱柱为AgilentExtendC18(填料粒径3.5μm，内径为2.1mm，长度为100mm)时的色谱图；其中，图21中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为2.0×105，图21中保留时间约为2.8min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图22是色谱柱为phenomenex Kinetex Polar C18(填料粒径2.6μm，内径为2.1mm，长度为100mm)时的色谱图；其中，图22中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为2.0×105，图22中保留时间约为3.9min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰。
通过图2、图19至图22可见，色谱柱为AcclaimTM120-C18
Figure BDA0002851490290000171
Waters AtlantisdC18时，目标物的色谱峰与杂质峰的分离良好，且符合检测要求；而当色谱柱为AgilentExtend-C18和phenomenex Kinetex Polar C18时，目标物的色谱峰保留较差，且目标物的色谱峰出现拖尾的情况，不符合检测要求，影响待测样品的检测准确性。
实施例14：针对波长的说明
图23至图28对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为检测波长的不同。
图23是激发波长为285nm、发射波长为310nm时的色谱图，图23中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为2.0×105，图23中无度洛西汀的色谱峰；
图24是激发波长为285nm、发射波长为370nm时的色谱图，图24中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为1.0×104，图24中保留时间约为8.2min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图25是激发波长为315nm、发射波长为370nm时的色谱图，图25中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为5.0×103，图25中保留时间约为8.2min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图26是激发波长为255nm、发射波长为340nm时的色谱图，图26中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为1.0×105，图26中保留时间约为8.0min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰；
图27是激发波长为315nm、发射波长为340nm时的色谱图，图27中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为5.0×103，图27中无度洛西汀的色谱峰；
图28是激发波长为255nm、发射波长为310nm时的色谱图，图28中的横坐标的单位长度为0.75，纵坐标的单位长度为5.0×104，图28中保留时间约为8.0min的色谱峰为度洛西汀的色谱峰。
通过图2、图23至图28可见，荧光检测条件中的激发波长低于285nm、发射波长低于340nm时，度洛西汀的响应值下降甚至无响应，影响对待测样品的检测灵敏度，且度洛西汀的色谱峰与杂质峰的分离度差，会影响待测样品的检测准确性。同样当荧光检测条件中的激发波长高于285nm、发射波长高于340nm时，度洛西汀的色谱峰与杂质峰的分离度差，受杂质干扰严重，影响对待测样品的检测准确性；度洛西汀的响应值下降甚至无响应，同时影响对待测样品的检测灵敏度。因此，选择激发波长为285nm；发射波长为340nm。
需要说明的是，图2、图3、图5至图8以及图10至图28的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为信号强度，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个〃....〃”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.度洛西汀的检测方法，其特征在于，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有度洛西汀和未含有度洛西汀的空白样本的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的空白样本的量相同；
利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
所述检测条件中的液相条件中，
色谱柱为：AcclaimTM120-C18 120Å，填料粒径3 μm，内径为3 mm，长度为150 mm；Waters Atlantis dC18，填料粒径3 μm，内径为2.1 mm，长度为150 mm；
洗脱流动相中的水相为：含有20-80 mM乙酸铵和0.05%-0.3%甲酸的水溶液；
洗脱流动相中的有机相为：乙腈溶液；
柱温为：28-50℃；
流速为：0.7-1.1 mL/min；
采用双泵双柱检测模式，其中，
所述双泵双柱检测模式包括：主泵、副泵和两个色谱柱；
所述主泵和所述两个色谱柱中的一个色谱柱在对待测样品进行检测时，采用等度洗脱，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为：67%:33%-72%:28%；
所述副泵用于对待测样品检测后的色谱柱进行清洗时采用梯度洗脱，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为：
0.00 min：0%:100%-10%:90%；
5.50 min：0%:100%-10%:90%；
6.00 min：67%:33%-72%:28%；
9.50 min：67%:33%-72%:28%；
根据各个所述第一检测结果和所述标准溶液中度洛西汀的浓度，拟合度洛西汀的标准曲线方程；
对待处理样品进行离心处理，得到离心后的第一上清液；
向200 μL所述第一上清液内加入正己烷800 μL~1200 μL，在1500-2500 rpm的转速下涡旋混合18-22 min，并在10000-15000 rpm的转速下离心5-12 min，移取离心后的第二上清液；利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在1500-2500 rpm的转速下涡旋混合8-12 min，并在10000-15000 rpm的转速下离心5-12 min，取离心后的第三上清液作为待测样品，复溶液为：含有25%-35%乙腈的水溶液；
利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中度洛西汀的浓度；
所述检测条件中的荧光检测条件，包括：
激发波长：285 nm；发射波长：340 nm。
2.根据权利要求1所述的度洛西汀的检测方法，其特征在于，
所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中度洛西汀的色谱峰面积，以及所述标准溶液中度洛西汀的浓度。
3.根据权利要求1所述的度洛西汀的检测方法，其特征在于，
所述对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液，包括：
将所述待处理样品在3000-4000 rpm的转速下离心8-12 min，取离心后的上清液作为第一上清液。
CN202011528868.0A 2020-12-22 2020-12-22 度洛西汀的检测方法 Active CN112697919B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011528868.0A CN112697919B (zh) 2020-12-22 2020-12-22 度洛西汀的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011528868.0A CN112697919B (zh) 2020-12-22 2020-12-22 度洛西汀的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112697919A CN112697919A (zh) 2021-04-23
CN112697919B true CN112697919B (zh) 2023-02-28

Family

ID=75510389

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011528868.0A Active CN112697919B (zh) 2020-12-22 2020-12-22 度洛西汀的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112697919B (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU228458B1 (en) * 2006-03-13 2013-03-28 Egis Gyogyszergyar Nyrt Duloxetine salts for producing pharmaceutical compositions
ES2906582T3 (es) * 2007-04-11 2022-04-19 Biomarin Pharm Inc Métodos para administrar tetrahidrobiopterina, composiciones asociadas y métodos de medida
CN102866222A (zh) * 2012-09-14 2013-01-09 北京万全德众医药生物技术有限公司 一种用液相色谱法分离测定度洛西汀中间体及其光学异构体的方法
EP3977138A4 (en) * 2019-05-31 2023-08-30 Quest Diagnostics Investments LLC DETERMINATION OF ANTIDEPRESSANTS BY MASS SPECTROMETRY
CN111257486B (zh) * 2019-12-31 2021-07-13 北京回龙观医院(北京心理危机研究与干预中心) 检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN112697919A (zh) 2021-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111855881B (zh) 一种阿齐沙坦中盐酸羟胺的检测方法
CN107529337B (zh) 二去水卫矛醇中杂质的hplc分析
CN112578051A (zh) 拉莫三嗪的检测方法
CN112697919B (zh) 度洛西汀的检测方法
CN114166983B (zh) 一种分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其杂质的分析方法
CN109959739B (zh) 检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法
CN109541062B (zh) 同时测定地表水或污水中个人护理用品浓度的方法
CN111007194B (zh) 一种利用离子色谱定量尼龙单体中钠离子含量的方法
CN110927262A (zh) 一种泊沙康唑中起始物料杂质的检测方法
CN111060621B (zh) 一种注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法
CN108680678A (zh) 测定曲格列汀有关物质的方法
CN103645151A (zh) 一种快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法
CN112697921B (zh) 马普替林的检测方法
CN112305135B (zh) 硫利达嗪的检测方法
CN112305134A (zh) 曲唑酮的检测方法
CN113125587B (zh) 一种托法替尼中间体及其对映异构体的检测方法
CN114137120A (zh) 一种雷帕霉素药物支架中有关物质的检测方法
CN110824059B (zh) 一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法
CN108303478B (zh) 高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法
CN112415117A (zh) 甲氨蝶呤的检测方法
Delgado-Blanca et al. A new approach for automated liquid–liquid extraction in a sequential injection manifold
CN112697918A (zh) 他克莫司的检测方法
CN112285248A (zh) 一种亚硝酸盐的检测方法
CN109254086B (zh) 一种头孢克洛干混悬剂样品中的十二烷基硫酸钠的hplc检测方法
CN112321562A (zh) 一种奥美拉唑碳酸氢钠干混悬剂中杂质的制备方法及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant