CN112305134A - 曲唑酮的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了曲唑酮的检测方法，包括：制备具有曲唑酮和内标物的至少三种浓度的标准溶液，标准溶液中的内标物的量相同；利用液相色谱仪在检测条件下检测每一种标准溶液，获得标准溶液对应的第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中曲唑酮的浓度和内标物的浓度，拟合曲唑酮的标准曲线方程；取待处理样品离心后的第一上清液；向第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入蛋白沉淀剂，对第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品；利用液相色谱仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中曲唑酮的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

曲唑酮的检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及曲唑酮的检测方法。

背景技术

曲唑酮为一种三唑吡啶衍生物，具有中枢镇静、轻微松弛肌肉作用。

目前，检测样品中曲唑酮含量通常采用的方法为高效液相色谱法。而采用该方法检测通常需要对待测样品进行较复杂的前处理，包括通过氮气吹干以及加复溶液等复杂操作，耗费时间较多，从而导致样品检测时间较长。

发明内容

本发明提供了曲唑酮的检测方法，能够缩短样品检测时间。

为了解决上述问题，本发明实施例提供了曲唑酮的检测方法，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有曲唑酮和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中曲唑酮的浓度和内标物的浓度，拟合曲唑酮的标准曲线方程；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入蛋白沉淀剂，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品；

利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中曲唑酮的浓度。

优选地，为了更准确地检测出待测样品中曲唑酮的浓度，标准溶液和待测样品中的内标物均为2-萘酚，2-萘酚不存在与曲唑酮联合使用导致定量不准的风险。

具体地，系列浓度的标准溶液制备方式如下：

(1)标准储备液的配制

精确称取曲唑酮标准品置于容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。

(2)标准工作液的配制

取适量步骤(1)中标准储备液，用含有60-80％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有500-30000ng/mL曲唑酮的系列标曲混合中间液作为标准工作液，并在-80℃条件下保存。

(3)内标储备液的配制

取内标物2-萘酚标准品置于容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶的标线，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存。

(4)内标工作液的配制

取步骤(3)中内标储备液，用稀释液进行稀释，得到含2-萘酚的内标工作液，并在-80℃保存。

(5)标准溶液的标定

分别移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液和步骤(4)中的内标工作液置于离心管中，分别向各个离心管中加入稀释液，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀0.5-1.5min后，移取上清液作为标准溶液。

为了降低曲唑酮和2-萘酚的工作溶液的挥发性，所以稀释液为含有60-80％甲醇的水溶液。

优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：C18反相色谱柱；

洗脱流动相中的水相包括：含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的水溶液；

洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；

柱温为35-45℃；流速为0.8-1.2mL/min。

具体地，色谱柱包括Waters公司的SunFire C18色谱柱，长度为150mm、内径为4.6mm以及填料粒径为5μm的色谱柱。

具体地，针对水相中的含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的水溶液pH范围包括pH6至pH8，比如，pH 6、pH6.3、pH6.5、pH6.7、pH7、pH7.3、pH7.5、pH7.7以及pH8，其中，洗脱流动相在pH6.7时，则可以含有10mM磷酸二氢钠和5mM磷酸氢二钠的水溶液。

针对柱温来说，35-45℃是指35℃至45℃范围内的任一温度值，比如，35℃、40℃以及45℃。

针对流速来说，0.8-1.2mL/min是指0.8mL/min至1.2mL/min范围内的任一流速，比如，0.8mL/min、1.0mL/min以及1.2mL/min。

优选地，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为：35:65-50:50。

针对洗脱流动相中的水相与有机相的体积比来说，35:65-50:50是指35:65至50:50范围内的任一比例，比如，35:65、40:60、45:55以及50:50。

比如，水相的体积占洗脱流动相体积的40％，有机相的体积占洗脱流动相体积的60％；水相的体积占洗脱流动相体积的45％，有机相的体积占洗脱流动相体积的55％。

具体地，当水相在洗脱流动相中体积占比小于35％时，曲唑酮和内标物的分离度较差，内标物的色谱峰受杂质干扰；当水相在洗脱流动相中体积占比大于50％时，曲唑酮和内标物的保留时间增大，会增大曲唑酮的检测时间，因此，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为35:65-50:50。

优选地，所述检测条件中的荧光检测条件，包括：

激发波长：320nm；发射波长：440nm。

具体地，采用RF-20A检测器，发射光谱扫描模式；荧光检测条件中的响应时间：0.5s；增益：4；灵敏度：中。

具体地，当荧光检测条件中的激发波长低于320nm、发射波长低于440nm时，曲唑酮的响应值下降，会影响对待检测样品的检测灵敏度；而在荧光检测条件中的激发波长大于320nm、发射波长大于440nm时，内标物的响应值下降，导致曲唑酮与内标物的响应至相差太大，影响待测样品检测的准确性，因此，激发波长为320nm；发射波长为440nm。

优选地，

所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中曲唑酮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中曲唑酮的浓度与内标物的浓度的比值。

具体地，若曲唑酮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的x值(即自变量)时，曲唑酮的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)。

若曲唑酮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)时，曲唑酮的浓度与内标物的浓度的比值则为标准曲线方程的x值(即自变量)。

优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，对加入内标物后的第一上清液进行蛋白沉淀的蛋白沉淀剂包括单一的乙腈溶液、单一的甲醇溶液或者乙腈溶液与甲醇溶液任意比例混合后的溶液。

优选地，为了更好的去除杂质，所述第一上清液与所述蛋白沉淀剂的体积比为1:3-1:12。

针对第一上清液和蛋白沉淀剂的体积比来说，1:3-1:12是指1:3至1:12范围内的任一比例，比如，1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11以及1:12。

具体地，当第一上清液的体积为100μL，那么蛋白沉淀剂的体积可以是300μL至1200μL范围内的任一值。

优选地，

所述对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液，包括：

将待处理样品在3000-4000rpm的转速下离心8-12min，取离心后的上清液作为第一上清液。

具体地，通过离心对待处理样品进行初步提纯，以去除部分杂质。可以理解的是，第一上清液为血清、血浆或其他样本。

优选地，

所述向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入蛋白沉淀剂，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min；

顺次加入蛋白沉淀剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，取离心后的第二上清液作为待测样品。

具体地，在向第一上清液内加入内标物后，为了使得两者混合更均匀，可先涡旋混合，再向混合后的第一上清液内加入蛋白沉淀剂，并涡旋混匀，进行蛋白沉淀，以通过蛋白沉淀剂对混合后的第一上清液进行提纯。然后进行高速离心，取离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于无需利用氮气进行吹干浓缩，浓缩后再加入复溶液，如此使得对待检测样品的前处理过程操作更加简单，同时减少前处理所需时间。

针对涡旋转速来说，1500-2000rpm是指1500rpm至2000rpm范围内的任一转速，比如，1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm以及2000rpm。

针对加入内标物之后的涡旋时间来说，0.5-1.5min是指，0.5min至1.5min范围内的任一时间，比如，0.5min、0.6min、0.7min、0.8min、0.9min、1.1min、1.2min、1.3min、1.4min以及1.5min。

针对加入蛋白沉淀剂之后的涡旋时间来说，4-6min是指，4min至6min范围内的任一时间，比如，4min、4.5min、5min、5.5min以及6min。

针对离心转速来说，10000-15000rpm是指10000rpm至15000rpm范围内的任一转速，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm以及15000rpm。

针对加入蛋白沉淀剂之后的离心时间来说，8-12min是指8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min以及12min。

本发明提供了曲唑酮的检测方法，通过液相色谱仪对含有不同浓度的曲唑酮的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物2-萘酚，因此，基于各种浓度标准溶液中的曲唑酮的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到曲唑酮的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理可以进行初步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。再向离心后的第一上清液中加入内标物，进行涡旋混匀，使得内标物均匀分布在第一上清液中，然后加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，进一步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中曲唑酮的含量。由于通过蛋白沉淀即可完成对目标物的提纯，而无需通过氮气吹干以及加复溶液的方式便可完成检测，因此能够缩短待测样品的检测时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的曲唑酮的检测方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的待测样品中的曲唑酮和内标物的色谱图；

图3是本发明一实施例提供的对比例2的色谱图；

图4是本发明一实施例提供的标准工作液中的曲唑酮和内标物的色谱图；

图5是本发明一实施例提供的曲唑酮线性关系图；

图6是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.5mL/min时的色谱图；

图7是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.8mL/min时的色谱图；

图8是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速1.2mL/min时的色谱图；

图9是本发明一实施例提供的柱温30℃，流速1.0mL/min时的色谱图；

图10是本发明一实施例提供的柱温35℃，流速1.0mL/min时的色谱图；

图11是本发明一实施例提供的柱温45℃，流速1.0mL/min时的色谱图；

图12是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为55:45时的色谱图；

图13是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为10:90时的色谱图；

图14是本发明一实施例提供的激发波长300nm、发射波长420nm时的色谱图；

图15是本发明一实施例提供的激发波长340nm、发射波长460nm时的色谱图；

图16是本发明一实施例提供的蛋白沉淀剂为1M的盐酸溶液时的色谱图；

图17是本发明一实施例提供的蛋白沉淀剂为4％的铁氰化钾溶液时的色谱图；

图18是本发明一实施例提供的色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18时的色谱图；

图19是本发明一实施例提供的色谱柱为Waters Xbridge C18时的色谱图；

图20是本发明一实施例提供的内标物环更米特在激发波长320nm、发射波长440nm时的色谱图；

图21是本发明一实施例提供的内标物为环更米特在激发波长235nm、发射波长290nm时的色谱图；

图22是本发明一实施例提供的内标物为维拉帕米在激发波长235nm、发射波长290nm时的色谱图；

图23是本发明一实施例提供的内标物为维拉帕米在激发波长236nm、发射波长306nm时的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前，通常高效液相色谱对待测样品进行检测，待测样品采用地西泮作为内标物，但是地西泮与待测样品曲唑酮联合使用会导致定量不准，影响待测样品检测的准确性。

并且，待测样品的前处理通常使用4.0mL乙酸乙酯与二氯甲烷(体积比为4：1)的混合溶液进行萃取，而萃取剂是由多组分配制而成的，这样就增加了萃取剂的配置难度，增加目标物的检测难度。而且萃取剂的用量较多，这会增加目标物的检测成本，同时导致前处理过程所需时间较长，增加了待测样品中曲唑酮整体的检测时长。

并且，采用标准溶液测定标准曲线方程的过程中还需要加入空白血浆，待测样品的前处理还需要加入复溶液，这样就增加了操作的复杂性，增加了前处理过程所需的时间，从而导致待测样品中曲唑酮整体的检测时间较长。

基于上述问题，本发明实施例提供了曲唑酮的检测方法，如图1所示，包括：

步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有曲唑酮和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

步骤102：利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中曲唑酮的浓度和内标物的浓度，拟合曲唑酮的标准曲线方程；

步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

步骤105：向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入蛋白沉淀剂，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品；

步骤106：利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中曲唑酮的浓度。

在本发明实施例中，通过液相色谱仪对含有不同浓度的曲唑酮的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的曲唑酮的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到曲唑酮的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理可以进行初步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。再向离心后的第一上清液中加入内标物，进行涡旋混匀，使得内标物均匀分布在第一上清液中，然后加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，进一步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中曲唑酮的含量。由于通过蛋白沉淀即可完成对目标物的提纯，而无需通过氮气吹干以及加复溶液的方式便可完成检测，因此能够缩短待测样品的检测时间。

下面以几个实施例对曲唑酮的检测方法进行详细说明。

实施例1：制备系列浓度的标准溶液

(a)标准储备液的配制：

精确称取曲唑酮标准品5mg置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于5mL，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。

(b)标准工作液的配制

取适量步骤(a)中标准储备液，用70％的甲醇水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有500-30000ng/mL曲唑酮的系列标曲混合中间液，并在-80℃条件下保存；

其中，其中不同浓度的标准工作液为含有曲唑酮：500ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、15000ng/mL、20000ng/mL、30000ng/mL的系列溶液。

(c)内标储备液的配制

取2-萘酚标准品5mg置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至5mL，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存。

(d)内标工作液的配制

取适量步骤(c)中内标储备液，用70％的甲醇水溶液作为稀释液进行稀释，得到含2-萘酚10μg/mL的内标工作液，并在-80℃保存。

(e)标准溶液的标定

分别移取步骤(b)中七种不同浓度的标准工作液10μL置于离心管中，向每个离心管中加入10μL的步骤(d)内标工作液，再分别向各个离心管中加入90μL水和1000μL乙腈，混合制成七种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀0.5-1.5min后，移取上清液作为标准溶液。

实施例2：拟合标准曲线方程

利用液相色谱仪对实施例1中七种标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的曲唑酮的标准溶液的色谱图。

从上述曲唑酮的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中曲唑酮和内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的曲唑酮的峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述曲唑酮标准工作液中的浓度与内标物的浓度作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。

上述检测条件包括：

色谱柱：Waters SunFire C18，填料粒径5μm，内径为4.6mm，长度为150mm；

洗脱流动相中的水相包括：含有10mM磷酸二氢钠和5mM磷酸氢二钠的水溶液；

洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为45:55，洗脱时间为6min；

柱温为40℃；流速为1.0mL/min；进样量：5μL。

荧光检测条件：

采用RF-20A检测器，发射光谱扫描模式；激发波长：320nm；发射波长：440nm；响应时间：0.5s；增益：4；灵敏度：中。

需要说明的是，在制备不同浓度的标准溶液后，可按照处理待处理样品时的前处理操作，对不同浓度的标准溶液进行前处理，即，标准溶液中的涡旋转速时间、蛋白沉淀剂、加入蛋白沉淀剂后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间均与待处理样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。

实施例3：待测样品的处理

3.1取待处理血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。

3.2用移液枪移取10μL实施例1中的内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入100μL步骤3.1中的血清或血浆，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，加入蛋白沉淀剂乙腈溶液1000μL，在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，再在14000rpm的转速下高速离心10min后，获得的第二上清液即为待测样品。

实施例4：待测样品的检测

利用液相色谱仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。

从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中曲唑酮的色谱峰面积和待测样品中内标物的色谱峰面积，将待测样品中的曲唑酮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中曲唑酮的浓度。

综上，液相色谱法依靠色谱柱的分离效果，化合物不同的保留时间，及不同的荧光激发波长进行检测，特异性更强。采用纯化学物质2-萘酚作为内标物，避免了曲唑酮与内标物地西泮因联合使用导致的定量不准的问题，大大提高了检测的特异性。

实施例5：针对样品前处理的说明

本方案例1：

(1)10μL内标工作液+100μL血清或血浆，混合1min，得到混合液；

(2)加入1000μL乙腈溶液混合5min进行蛋白沉淀，离心，得到上清液为待测样品。

对比例1：(高效液相色谱法测定人血浆中曲唑酮浓度[J].中国医院药学杂志,2010,30(06):470-472)

(1)20μL内标工作液+1000μL血清或血浆，混合得到混合液；

(2)加入4000μL(二氯甲烷：乙酸乙酯＝1：4萃取剂)混合5min进行萃取，离心，得到上清液；

(3)取上清液，真空干燥；

(4)加100μL甲醇复溶，混匀，得上清液为待测样品。

从本方案例1和对比例1可以看出，本发明的样品使用量仅为对比例样本使用量的10％，更加符合科学伦理道德标准，使得待测人员依从性更高；采用血液样本先经离心预处理，再加乙腈进行蛋白沉淀的前处理方式，相较于对比例1中自行配置的萃取剂和真空干燥，本发明节省了各种萃取剂的配置时间，减少了试剂配制过程的误差，并且避免使用刺激性毒性大的有机试剂。

实施例6：针对检测条件的说明

本申请例2：

(1)色谱柱：Waters公司的SunFire C18色谱柱；

(2)流动相中的水相包括：含有10mM磷酸二氢钠和5mM磷酸氢二钠的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；

(3)流速：1.0mL/min，进样量5μL，分析时间6min。

对比例2：(高效液相色谱法测定人血浆中曲唑酮浓度[J].中国医院药学杂志,2010,30(06):470-472)

(1)色谱柱：美国迪马公司的C18钻石色谱柱；

(2)流动相为0.03mol/L醋酸铵溶液，甲醇；

(3)流速：0.8mL/min，进样量15μL，分析时间7min。

图2为本申请待测样品中曲唑酮和曲唑酮内标的色谱图，图2中的横坐标的单位长度均为0.2，纵坐标的单位长度均为0.5；

图3为对比例2的色谱图。

详见图2和图3，从本申请例2和对比例2可以看出，本发明的样本分析时间为6min，其中曲唑酮的保留时间约为4.5min，曲唑酮内标物的保留时间约为3.6min，相较于对比例2的分析时间短，而且在对比例2中曲唑酮的保留时间为6.157min，曲唑酮内标物的保留时间为5.211min，而且所需进样量为对比例2的33％，因此本申请例2减少了分析时间及流动相等试剂的消耗，降低了成本。

本发明在简化前处理方式，节省分析时间的前提下，得到的测定结果达到了相同甚至更好的结果。

实施例7：曲唑酮的检测方法的线性关系和定量限

制备不同浓度的曲唑酮低浓度样本，分别加入10μL内标工作液，加入10μL各个浓度的曲唑酮低浓度样本，并加入选取不含曲唑酮的空白且含有血清白样本，从而制备得到不同浓度的样本，按本实施例3中的前处理及实施例2中的检测条件进行测定，曲唑酮的检测限和定量限如下述所示，加标浓度见下述表1所示。

表1

其中，以信噪比＝10作为定量限，以信噪比(S/N)＝3作为检测限。

曲唑酮

(1)检测限(LOD)：10ng/mL，S/N＝3。

(2)定量限(LOQ)：28ng/mL，S/N＝10。

由本实施例可知，曲唑酮的检测限及定量限分别为10ng/mL和28ng/mL，灵敏度很高，对曲唑酮含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例8：线性方程的获得

将实施例1中七种不同浓度的标准工作液进行液相色谱仪按照实施例2中的检测条件进行测定，得到各浓度曲唑酮及内标物的色谱图，其中，标准工作液中的曲唑酮和内标2-萘酚的色谱图如图4所示；曲唑酮的保留时间约为4.5min，内标2-萘酚的保留时间约为3.6min。

确定各色谱峰峰面积，以标准品色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，标准工作液浓度与内标工作液中的内标物浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝a*x2+b，并且得系数c；线性方程的测定结果见表2，线性方程图见图5。

表2

检测指标	线性范围	线性方程	相关系数	加权
					曲唑酮-某实施例1	50-3000ng/mL	Y＝1.53487X-0.000415	0.9998	1/X<sup>2</sup>

表2为一次实施例中的线性关系数据，由表2可知，曲唑酮在50-3000ng/mL的线性范围内，相关系数R²＞0.9900，线性关系良好。

实施例9：曲唑酮的检测方法的回收率和精密度

取实施例1中曲唑酮标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，曲唑酮的回收率如表3。曲唑酮在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为101.07％～103.39％，精密度为0.86％～2.58％。

表3曲唑酮加标回收率和精密度

综合上述验证试验，本实施例的回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法检测血液中曲唑酮，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

由图2和图4可见，待测样品中的曲唑酮的保留时间与其标准工作溶液一致，该方法以2-萘酚为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

实施例10：针对流速和柱温的说明

图6至图11分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流速和柱温不同，图6至图11中位于最右侧的右一的色谱峰为曲唑酮的色谱峰，位于最右侧的右二的色谱峰为曲唑酮内标物的色谱峰，比如，在图6中右一的保留时间约为8.5min，为曲唑酮的色谱峰，右二的保留时间约为7.0min，为内标物的色谱峰；图7中右一的保留时间约为5.5min，为曲唑酮的色谱峰，右二的保留时间约为4.5min，为内标物的色谱峰。图6中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2，图7至图11中的横坐标的单位长度均为0.2，纵坐标的单位长度均为0.5。

图6为柱温40℃，流速0.5mL/min时的色谱图；

图7为柱温40℃，流速0.8mL/min时的色谱图；

图8为柱温40℃，流速1.2mL/min时的色谱图；

图9为柱温30℃，流速1.0mL/min时的色谱图；

图10为柱温35℃，流速1.0mL/min时的色谱图；

图11为柱温45℃，流速1.0mL/min时的色谱图。

通过图6至图11可见，流速在1.0mL/min，柱温在35℃至45℃范围内时，曲唑酮和内标物的保留时间均大于3.0min且小于5.0min。

流速在1.0mL/min，柱温在30℃至45℃范围内时，柱温对曲唑酮和内标物的保留时间影响较小，曲唑酮和内标物的保留时间均大于3.0min且小于5.0min，但是柱温较低会导致曲唑酮和内标物的分离度较差，而柱温较高则会影响色谱柱寿命。

由于流速小于0.8mL/min会使得曲唑酮和内标物的保留时间大于7.0min，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的时效性，而流速大于1.2mL/min会使柱压升高，超过色谱柱所能承受的压力，对色谱柱造成不可逆的损伤。

实施例11：针对流动相的说明

图12和图13分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流动相中的水相与有机相的体积比不同，图12至图13中位于最右侧的右一的色谱峰为曲唑酮的色谱峰，位于最右侧的右二的色谱峰为曲唑酮内标物的色谱峰。图12中的横坐标的单位长度为0.2，纵坐标的单位长度为0.2；图13中的横坐标的单位长度为0.2，纵坐标的单位长度为0.5；

图12为洗脱流动相中水相与有机相体积比为55:45时的色谱图；图13为洗脱流动相中水相与有机相体积比为10:90时的色谱图。

通过图12和图13可见，水相在洗脱流动相中体积占比大于50％时，会使得曲唑酮的保留时间大于7.0min，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的时效性；而水相在洗脱流动相中体积占比小于35％时，会使曲唑酮和内标物的分离度变差，且内标物的色谱峰有杂质干扰。

实施例12：针对波长的说明

图14和图15分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为荧光检测条件中的激发波长和发射波长的不同，图14和图15中位于最右侧的右一的色谱峰为曲唑酮的色谱峰，位于最右侧的右二的色谱峰为曲唑酮内标物的色谱峰，比如，在图14中右一的保留时间约为4.4min，为曲唑酮的色谱峰，右二的保留时间约为3.6min，为内标物的色谱峰。图14和图15中的横坐标的单位长度均为0.2，纵坐标的单位长度均为0.5。

图14为激发波长300nm、发射波长420nm时的色谱图；

图15为激发波长340nm、发射波长460nm时的色谱图。

通过图14和图15可见，在荧光检测条件中的激发波长300nm、发射波长420nm时，会使得曲唑酮的响应下降；而在荧光检测条件中的激发波长340nm、发射波长460nm时，会使得内标物的响应值下降，均导致曲唑酮与内标物的响应相差太大，影响待测样品的检测准确性。

实施例13：针对沉淀剂的说明

图16和图17分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为蛋白沉淀剂的不同。图16和图17中位于最右侧的右一的色谱峰为曲唑酮的色谱峰，位于最右侧的右二的色谱峰为曲唑酮内标物的色谱峰。比如，在图16中右一的保留时间约为3.6min，为曲唑酮的色谱峰，右二的保留时间约为3.3min，为内标物的色谱峰；在图17中右一的保留时间约为4.0min，为曲唑酮的色谱峰，右二的保留时间约为3.6min，为内标物的色谱峰。图16和图17中的横坐标的单位长度均为0.2，纵坐标的单位长度均为0.5。

图16为蛋白沉淀剂为1M的盐酸溶液时的色谱图；

图17为蛋白沉淀剂为4％的铁氰化钾溶液时的色谱图。

通过图16和图17可见，蛋白沉淀剂为1M的盐酸溶液和质量分数为4％的铁氰化钾溶液时，曲唑酮和内标物2-萘酚的色谱峰出现了峰形异常，且无法区分曲唑酮和内标物2-萘酚的色谱峰，影响待测样品的检测准确性。

实施例14：针对色谱柱的说明

图18和图19分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为C18反相色谱柱的不同。图18和图19中位于最右侧的右一的色谱峰为曲唑酮的色谱峰，位于最右侧的右二的色谱峰为曲唑酮内标物的色谱峰。图18和图19中的横坐标的单位长度均为0.2，纵坐标的单位长度均为0.5。

图18是色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18时的色谱图；

图19是色谱柱为Waters Xbridge C18时的色谱图。

通过图18和图19可见，色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18时出现了峰形拖尾；而色谱柱为Waters Xbridge C18时曲唑酮和内标物2-萘酚的色谱峰分离度差，均影响待测样品的准确性。

实施例15：针对内标物的说明

图20和图23分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为内标物的不同。图20和图21中的横坐标的单位长度均为0.2，纵坐标的单位长度均为0.5。图22中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2。图23中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为1。

图20是内标物为环更米特在激发波长320nm、发射波长440nm时的色谱图，内标物为环更米特时，其在激发波长320nm、发射波长440nm的检测条件下无荧光响应，仅有曲唑酮的荧光响应。图21是内标物为环更米特在激发波长235nm、发射波长290nm时的色谱图，此时内标物环更米特有荧光响应，但并曲唑酮无荧光响应。因此环更米特不适用于内标物。

图22是内标物为维拉帕米在激发波长320nm、发射波长440nm时的色谱图，内标物为维拉帕米时，其在激发波长320nm、发射波长440nm的荧光检测条件下无荧光响应，仅有曲唑酮的荧光响应。图23是内标物为环更米特在激发波长236nm、发射波长306nm时的色谱图，此时内标物维拉帕米有荧光响应，但曲唑酮无荧光响应。因此维拉帕米不适用于内标物。

需要说明的是，图2和图23的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为信号强度，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个·······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.曲唑酮的检测方法，其特征在于，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有曲唑酮和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中曲唑酮的浓度和内标物的浓度，拟合曲唑酮的标准曲线方程；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入蛋白沉淀剂，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品；

利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中曲唑酮的浓度。

2.根据权利要求1所述的曲唑酮的检测方法，其特征在于，

所述检测条件中的液相条件，包括：

C18反相色谱柱；

洗脱流动相中的水相包括：含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的水溶液；

洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；

柱温为35-45℃；

流速为0.8-1.2mL/min。

3.根据权利要求1所述的曲唑酮的检测方法，其特征在于，

洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为35:65-50:50。

4.根据权利要求1所述的曲唑酮的检测方法，其特征在于，

所述检测条件中的荧光检测条件，包括：

激发波长：320nm；发射波长：440nm。

5.根据权利要求1所述的曲唑酮的检测方法，其特征在于，

所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中曲唑酮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中曲唑酮的浓度与内标物的浓度的比值。

6.根据权利要求1所述的曲唑酮的检测方法，其特征在于，

所述蛋白沉淀剂包括：乙腈溶液和/或甲醇溶液。

7.根据权利要求6所述的曲唑酮的检测方法，其特征在于，

所述第一上清液与所述蛋白沉淀剂的体积比为1:3-1:12。

8.根据权利要求1所述的曲唑酮的检测方法，其特征在于，

所述对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液，包括：

将待处理样品在3000-4000rpm的转速下离心8-12min，取离心后的上清液作为第一上清液。

9.根据权利要求1所述的曲唑酮的检测方法，其特征在于，

所述向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入蛋白沉淀剂，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min；

顺次加入蛋白沉淀剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，取离心后的第二上清液作为待测样品。

10.根据权利要求1至9中任一所述的曲唑酮的检测方法，其特征在于，

所述内标物为2-萘酚。

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