CN111830177B - 氯硝西泮的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了氯硝西泮的检测方法，包括：制备具有氯硝西泮和内标物的至少三种浓度的标准溶液，标准溶液中的内标物的量相同；利用液质联用仪在检测条件下检测每一种标准溶液，获得标准溶液对应的第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中氯硝西泮的浓度和内标物的浓度，拟合氯硝西泮的标准曲线方程；取待处理样品离心后的第一上清液；向第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对第一上清液进行萃取，得到待测样品；利用液质联用仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中氯硝西泮的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

氯硝西泮的检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及氯硝西泮的检测方法。

背景技术

氯硝西泮为一种苯二氮卓类衍生物，是一种广谱抗癫痫药，多用于治疗各型癫痫和惊厥，治疗焦虑状态和失眠，对舞蹈症及各类神经痛也有一定的疗效。

目前，检测样品中氯硝西泮含量通常采用的方法为高效液相色谱法。而才用该方法检测通常需要对待测样品进行较复杂的前处理，耗费时间较多，从而导致样品检测时间较长。

发明内容

本发明提供了氯硝西泮的检测方法，能够缩短样品检测时间。

为了解决上述问题，本发明实施例提供了氯硝西泮的检测方法，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有氯硝西泮和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中氯硝西泮的浓度和内标物的浓度，拟合氯硝西泮的标准曲线方程；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；

利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中氯硝西泮的浓度。

优选地，为了更准确地检测出待测样品中氯硝西泮的浓度，标准溶液和待测样品中的内标物均为硝西泮。

具体地，系列浓度的标准溶液制备方式如下：

(1)标准储备液的配制

精确称取氯硝西泮标准品置于容量瓶中，用甲醇水溶液作为稀释液进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为一年。

(2)标准工作液的配制

取适量步骤(1)中标准储备液，用稀释液进行稀释混合，得到含有50-2000ng/mL氯硝西泮的系列标曲混合中间液作为标准工作液，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。

(3)内标储备液的配制

取内标物硝西泮标准品置于容量瓶中，用稀释液进行溶解，并定容至容量瓶的标线，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。

(4)内标工作液的配制

取步骤(3)中内标储备液，用稀释液进行稀释，得到含硝西泮的内标工作液，并在-80℃保存，有效期1年。

(5)标准溶液的标定

分别移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液和步骤(4)中的内标工作液置于离心管中，分别向各个离心管中加入稀释液，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1500-2500rpm下涡旋混匀0.5-2min后，移取上清液作为标准溶液。

为了提高氯硝西泮和硝西泮的溶解性，同时避免因标准储备液、标准工作液、内标工作液和内标储备液在低温保存时发生凝结，所以稀释液中的甲醇和水的体积比＝1:1-10:1。

优选地，

所述检测条件中的液相条件，包括：

长度为150mm、内径为2.1mm以及填料粒径为5μm的色谱柱；

洗脱流动相为含有0.01％-0.3％甲酸的水溶液和含有0.01％-0.3％甲酸的甲醇；

柱温为20-40℃；

流速为0.3-0.4mL/min。

具体地，色谱柱包括Waters公司的Atlantis dC18色谱柱。

针对流动相中的水相来说，0.01％-0.3％甲酸的水溶液是指水相中含有0.01％至0.3％范围内任一值的甲酸，比如，含有0.01％的甲酸、含有0.05％的甲酸、含有0.1％的甲酸、含有0.15％的甲酸、含有0.2％的甲酸、含有0.25％的甲酸以及含有0.3％的甲酸。

针对流动相中的有机相来说，0.01％-0.3％甲酸的甲醇是指有机相中含有0.01％至0.3％范围内任一值的甲酸，比如，含有0.01％的甲酸、含有0.05％的甲酸、含有0.1％的甲酸、含有0.15％的甲酸、含有0.2％的甲酸、含有0.25％的甲酸以及含有0.3％的甲酸。

针对柱温来说，20-40℃是指20℃至40℃范围内的任一温度值，比如，20℃、25℃、30℃、35℃以及40℃。

针对流速来说，0.3-0.4mL/min是指0.3mL/min至0.4mL/min范围内的任一流速，比如，0.3mL/min、0.35mL/min以及0.4mL/min。

优选地，

所述洗脱流动相采用等度洗脱；

含有0.01％-0.3％甲酸的水溶液和含有0.01％-0.3％甲酸的甲醇的体积比为：15:85。

优选地，

所述检测条件中的质谱条件，包括：

采用ESI离子源，正离子扫描模式和反应监测模式；加热气流速：12L/min；加热气温度：350℃；雾化电压：40psi；毛细管电压：4500psi。

优选地，

所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中氯硝西泮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中氯硝西泮的浓度与内标物的浓度的比值。

具体地，若氯硝西泮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的x值时，氯硝西泮的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的y值。

若氯硝西泮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的y值时，氯硝西泮的浓度与内标物的浓度的比值则为标准曲线方程的x值。

优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，对加入内标物后的第一上清液进行萃取的萃取剂为乙酸乙酯。

优选地，

所述向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合0.5-1min；

顺序加入萃取剂，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合3-10min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心8-15min，移取离心后的第二上清液；

利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合1-3min，取第三上清液作为待测样品。

具体地，在向第一上清液内加入内标物后，为了使得两者混合更均匀，可在高转速下涡旋混合，再向混合后的第一上清液内加入萃取剂，并涡旋混匀，进行萃取，以通过萃取剂对混合后的第一上清液进行提纯，然后进行高速离心，去离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于利用萃取剂萃取后目标物的含量较低，因此为了便于检测，可利用氮气进行吹干，以对第二上清液进行浓缩，浓缩后再加入复溶液，并进行涡旋以使复溶液中的目标物分布均匀，还可以防止目标物含量过高不利于检测。

可以理解的是，第一上清液为血清或血浆。

针对涡旋转速来说，1500-2500rpm是指1500rpm至2500rpm范围内的任一转速，比如，1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、2000rpm、2100rpm、2200rpm、2300rpm、2400rpm以及2500rpm。

针对加入内标物之后的涡旋时间来说，0.5-1min是指，0.5min至1min范围内的任一时间，比如，0.5min、0.6min、0.7min、0.8min、0.9min以及1min。

针对加入萃取剂之后的涡旋时间来说，3-10min是指，3min至10min范围内的任一时间，比如，3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min以及10min。

针对离心转速来说，10000-15000rpm是指10000rpm至15000rpm范围内的任一转速，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm以及15000rpm。

针对加入萃取剂之后的离心时间来说，8-15min是指8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min、12.5min、13min、13.5min、14min、14.5min以及15min。

针对加入复溶液之后的涡旋时间来说，1-3min是指1min至3min范围内的任一时间，比如，1min、1.5min、2min、2.5min以及3min。

优选地，为了氯硝西泮和硝西泮更好的溶解，第二上清液吹干后加入的复溶液包括70-85％的甲醇水溶液。

优选地，为了更好的溶解第二上清液，

所述第二上清液与所述复溶液的体积比为：1:2.5-1:10。

针对第二上清液和复溶液的体积比来说，1:2.5-1:10是指1:2.5至1:10范围内的任一比例，比如，1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9以及1:10。

具体地，当未吹干前的第二上清液的体积为100μL，那么复溶液的体积可以是250μL至1000μL范围内的任一值。

本发明提供了氯硝西泮的检测方法，通过液质联用仪对含有不同浓度的氯硝西泮的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的氯硝西泮的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到氯硝西泮的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理可以进行初步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。再向离心后的第一上清液中加入内标物，进行涡旋混匀，使得内标物均匀分布在第一上清液中，然后加入萃取剂进行萃取，进一步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。利用质谱联用仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中氯硝西泮的含量。由于通过萃取即可完成对目标物的提纯，而无需通过衍生化法完成检测，因此可以缩短待测样品的检测时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的氯硝西泮的检测方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的待测样品中的氯硝西泮的色谱图；

图3是本发明一实施例提供的待测样品中的氯硝西泮内标的色谱图；

图4是本发明一实施例提供的对比例2.1的色谱图；

图5是本发明一实施例提供的对比例2.2的色谱图；

图6是本发明一实施例提供的氯硝西泮标准品的色谱图；

图7是本发明一实施例提供的硝西泮标准品的色谱图；

图8是本发明一实施例提供的氯硝西泮线性关系图谱；

图9是本发明一实施例提供的氯硝西泮线性关系图谱；

图10是本发明一实施例提供的柱温20℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图11是本发明一实施例提供的柱温15℃，流速0.4mL/min时的色谱图；

图12是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.2mL/min时的色谱图；

图13是本发明一实施例提供的柱温45℃，流速0.2mL/min时的色谱图；

图14是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.4mL/min时的色谱图；

图15是本发明一实施例提供的柱温20℃，流速0.2mL/min时的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前，检测待测样品中氯硝西泮通常采用衍生化法，利用衍生化试剂与氯硝西泮中的目标官能团反应生成衍生物，基于衍生物与氯硝西泮的质量比来判断待测样品中氯硝西泮的含量。但是，衍生化试剂通常稳定性较差，这样就增加了衍生化试剂的存储难度，从而增加检测待测样品中氯硝西泮的难度。并且衍生化试剂与待测样品中氯硝西泮反应需要在一定温度、PH值等条件下进行，这就进一步增加待测样品中氯硝西泮的检测难度，并且衍生化反应需要的时间较长，这就增加了待测样品中氯硝西泮整体的检测时长。

基于上述问题，本发明实施例提供了氯硝西泮的检测方法，如图1所示，包括：

步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有氯硝西泮和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

步骤102：利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中氯硝西泮的浓度和内标物的浓度，拟合氯硝西泮的标准曲线方程；

步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

步骤105：向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；

步骤106：利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中氯硝西泮的浓度。

在本发明实施例中，通过液质联用仪对含有不同浓度的氯硝西泮的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的氯硝西泮的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到氯硝西泮的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理可以进行初步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。再向离心后的第一上清液中加入内标物，进行涡旋混匀，使得内标物均匀分布在第一上清液中，然后加入萃取剂进行萃取，进一步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。利用质谱联用仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中氯硝西泮的含量。由于通过萃取即可完成对目标物的提纯，而无需通过衍生化法完成检测，因此可以缩短待测样品的检测时间。

下面以几个实施例对氯硝西泮的检测方法进行详细说明。

实施例1：制备系列浓度的标准溶液

(a)标准储备液的配制：

精确称取氯硝西泮标准品5mg置于5mL容量瓶，用甲醇：水＝7：3的稀释液进行溶解，并定容于5mL，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为一年。

(b)标准工作液的配制

取适量步骤(a)中标准储备液A，用甲醇：水＝7：3的稀释液进行稀释混合，得到含有50-2000ng/mL氯硝西泮的系列标曲混合中间液C，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月；

其中，其中不同浓度的标准工作液为含有氯硝西泮：50ng/mL、100ng/mL200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL的系列溶液。

(c)内标储备液的配制

取硝西泮标准品5mg置于5mL容量瓶，用甲醇：水＝7：3的稀释液进行溶解，并定容至5mL，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。

(d)内标工作液的配制

取适量步骤(c)中内标储备液，用甲醇：水＝7：3的稀释液进行稀释，得到含硝西泮200ng/mL的内标工作液，并在-80℃保存，有效期1年。

(e)标准溶液的标定

分别移取步骤(b)中七种不同浓度的标准工作液10μL置于离心管中，向每个离心管中加入10μL的步骤(d)内标工作液，再分别向各个离心管中加入甲醇：水＝7：3的稀释液，混合制成七种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1500-2500rpm下涡旋混匀0.5-2min后，移取上清液作为标准溶液。

实施例2：拟合标准曲线方程

利用液质联用仪对实施例1中七种标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的氯硝西泮的标准溶液的色谱图。

从上述氯硝西泮的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中氯硝西泮和内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的氯硝西泮的峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述氯硝西泮标准工作液中的浓度与内标物的浓度作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。

上述检测条件包括：

色谱柱：Waters Atlantis dC18，填料粒径5μm，内径为2.1mm，长度为150mm；

洗脱流动相：含体积比为0.01％-0.3％甲酸的水，和含体积比为0.01％-0.3％甲酸的甲醇，洗脱时间为2.5min；

柱温为30℃；

流速为0.3mL/min；

进样量：2μL。

串联质谱条件：

采用ESI离子源(电喷雾离子源)，正离子扫描模式，选择反应监测模式；Gas Flow(加热气流速)：12L/min；Gas Temp(加热气温度)：350℃；Nebuliaer(雾化电压)：40psi；Capillary(毛细管电压)：4500psi。

需要说明的是，在制备不同浓度的标准溶液后，可按照处理待处理样品时的前处理操作，对不同浓度的标准溶液进行前处理，即，标准溶液中的涡旋转速时间、沉淀蛋白试剂、加入沉淀蛋白试剂后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间均与待处理样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。

进一步地，液质联用仪中的质谱仪的参数如下表1所示：

表1

物质名称	保留时间	母离子	子离子	Dwell	Fragmentor	CE	CAV
								氯硝西泮(定量)	1/.m6i2n8	316.2	270.1	200	160	25	7
氯硝西泮(定性)	1.628	316.2	241.1	200	160	34	7
								硝西泮(定量)	1.633	282.1	236.1	200	140	25	7
硝西泮(定性)	1.632	282.1	237.1	200	140	25	7

其中，Dwell离子的驻留时间，Fragmentor为碎裂电压，CE为碰撞电压，CAV为线性加速电压。

实施例3：待测样品的处理

3.1取待处理血液至少2ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。

3.2用移液枪移取10μL实施例1中的内标工走也与1.5mL的离心管中，然后加入100μL步骤3.1中的血清或血浆，在2000rpm的转速下涡旋混合0.5min后，加入乙酸乙酯800μL，在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，移取600μL离心后上清液至新的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将该上清液吹干，移取100μL的甲醇至上清吹干的1.5mL离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合2min后，获得的上清液即为待测样品。

实施例4：待测样品的检测

利用液质联用仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。

从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中氯硝西泮的色谱峰面积和待测样品中内标物的色谱峰面积，将待测样品中的氯硝西泮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中氯硝西泮的浓度。

综上，液相色谱法依靠色谱柱的分离效果，化合物不同的保留时间，及不同的紫外吸收波长进行检测，不是对待测分子直接检测，特异性较低。由于生物样本成分复杂，可能存在相同的保留时间及相同的紫外吸收波长的物质对待测成分进行干扰。而本专利不但使用了液相色谱串联质谱进行分析，同时采用了两种离子对进行检测，如表1所示，大大提高了检测的特异性。

实施例5：针对本发明的准确性的评价

英国Therapeutic Drugs(TDM)LGC室间比对，该项目室间比对每年进行12次，每次分三个水平的样本，12次共36个浓度的样本比对全部通过，以下为随机选取的四次实施例比对结果。由表2可知，测定结果与靶值的偏差均在10％以内，准确度良好。

表2

实施例6：针对样品前处理的说明

本方案例1：

(1)10μL内标工作液+100μL血清或血浆，混合0.5min，得到混合液；

(2)加入800μL乙酸乙酯混合5min进行萃取，离心，得到上清液；

(3)取上清液600μL，氮气吹干；

(4)加100μL甲醇复溶，混匀，得上清液为待测样品。

对比例1(专利号：CN108303488A)

(1)10μL内标+200μL血液，混合0.5min，得到混合液；

(2)加入1250μL(二氯甲烷：乙酸乙酯＝1：3萃取剂)混合5min进行萃取，离心，得到上清液；

(3)取上清液1000μL，氮气吹干；

(4)加100μL(甲醇：水＝1：1)复溶，混匀，得上清液为待测样本。

从本方案例1和对比例1可以看出，本发明的样品使用量仅为对比例样本使用量的50％，更加符合科学伦理道德标准，使得待测人员依从性更高；采用血液样本直接加乙酸乙酯进行萃取，加甲醇复溶的前处理方式，相较于对比例1中自行配置的萃取剂及自行配置的复溶液，本发明节省了各种萃取剂及复溶液的配置时间，减少了试剂配制过程的误差，并且避免使用刺激性毒性大的有机试剂。

实施例7：用于说明检测条件的说明

本申请例2：

(1)色谱柱：Waters公司的Atlantis dC18色谱柱；

(2)流动相为乙腈(0.1％甲酸)，水(0.1％甲酸)；

(3)流速：0.3mL/min，进样量2μL，分析时间2.5min。

对比例2.1：(专利申请号：CN108303488A)

(1)色谱柱：Waters公司的SunFireC18。

(2)流动相为乙腈(0.05％甲酸)，水(0.05％甲酸)；

(3)流速：0.4mL/min，进样量30μL，分析时间6.5min。

对比例2.2：(专利申请号：CN108445113A)

(1)色谱柱：固相萃取柱为SHISEIDO，MF-Ph-1；分析色谱柱为Waters公司的SunFireC18；

(2)萃取柱及分析柱的流动相分别为：水和20：12：68＝乙腈：甲醇：水；

(3)固相萃取及分析柱的流速分别为2mL/min和0.6mL/min，进样量100μL，分析时间9min。

详见图2至图5，其中，图2为本申请待测样品中氯硝西泮的色谱图，图3为本申请待测样品中氯硝西泮内标的色谱图，图4为对比例2.1的色谱图，图5为对比例2.2的色谱图。从本申请例2和对比例2.1可以看出，本发明的样本分析时间仅为对比例2.1的38％，减少了时间及流动相等试剂的消耗；从本申请例2和对比例2.2可以看出，本发明使分析时间由9min减小到2.5min，相同样本量的情况下节省3.6倍的时间，更减少了在固相萃取柱等的消耗，降低成本，同时降低了不同人员配制流动相对实验结果带来差异的发生率。

本发明在简化前处理方式，节省分析时间的前提下，得到的测定结果达到了相同甚至更好的结果。

实施例8：氯硝西泮的检测方法的线性关系和定量限

选取不含氯硝西泮的空白且含有血清或血浆的空白样本，加入标准品制成含氯硝西泮浓度为5ng/mL的低浓度样本，采用空白样本将上述低浓度样本进行不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的样本，加入10μL内标工作液，按本实施例3中的前处理及实施例2中的检测条件进行测定，氯硝西泮的检测限和定量限如下述所示，稀释倍数及实际浓度见下述表3所示。

表3

稀释倍数	2	4	5	6	7	8	10	15	20	22
											实际浓度(ng/mL)	2.500	1.250	1.000	0.833	0.714	0.625	0.500	0.333	0.250	0.227

其中，以信噪比＝10作为定量限，以信噪比＝3作为检测限。

氯硝西泮

(1)检测限(LOD)：0.227ng/mL，S/N＝3。

(2)定量限(LOQ)：0.714ng/mL，S/N＝10。

由本实施例可知，氯硝西泮的检测限及定量限分别为0.227ng/mL和0.714ng/mL，灵敏度很高，对氯硝西泮含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例9：线性方程的获得

将实施例1中七种不同浓度的标准工作液进行液质联用仪按照实施例2中的检测条件进行测定，得到各浓度氯硝西泮及内标物的色谱图，其中，标准工作液中的氯硝西泮的色谱图如图6所示，标准工作液中的氯硝西泮内标的色谱图如图7所示；氯硝西泮和内标硝西泮的保留时间分别为1.628min，1.632min。

确定各色谱峰峰面积，以标准品色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，标准工作液浓度与混合内标工作液中的内标物浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝a*x2+b，并且得系数c、d；线性方程的测定结果见表4，线性方程图谱见图8和图9。

表4

表4为两次实施例中的线性关系数据，由表可知，氯硝西泮在5-200ng/mL的线性范围内，相关系数R²＞0.9900，线性关系良好。

实施例10：氯硝西泮的检测方法的回收率和精密度

取实施例1中氯硝西泮标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，氯硝西泮的回收率如表5。氯硝西泮在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为101.12％～105.59％，精密度为2.28％～5.05％。

表5氯硝西泮加样回收率

综合上述验证试验，本实施例的回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法检测人血液中氯硝西泮，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

由图2、图3、图6和图7可见，待测样品中的氯硝西泮的保留时间与其标准工作溶液一致，该方法以硝西泮为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

实施例11：针对流速和柱温的说明

图10至图15分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流速和柱温不同，图10至图15中位于图谱上方的均为氯硝西泮标准品的色谱图，位于图谱下方的均为硝西泮标准品的色谱图。

图10为柱温20℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图11为柱温15℃，流速0.4mL/min时的色谱图；

图12为柱温40℃，流速0.2mL/min时的色谱图；

图13为柱温45℃，流速0.2mL/min时的色谱图；

图14为柱温40℃，流速0.4mL/min时的色谱图；

图15为柱温20℃，流速0.2mL/min时的色谱图。

通过图6、图7、图10至图15可见，流速在0.3mL/min，柱温在20℃至30℃范围内时，氯硝西泮和内标物的保留时间均大于0.5min且小于2.5min。

流速在0.4mL/min，柱温对于氯硝西泮和内标物的保留时间影响较小，氯硝西泮和内标物的保留时间均大于0.5min且小于2.5min。

流速在0.2mL/min，柱温在20℃至45℃范围内时，对于氯硝西泮和内标物的保留时间影响相对较小。

由于柱温较低时，会影响氯硝西泮和内标物的溶解性，因此，对于氯硝西泮和内标物检测时的柱温范围设置在20℃至40℃，以使在保证目标物溶解性的前提下，使得目标物的保留时间相对最短。由于流速小于0.3mL/min会使得氯硝西泮和内标物的保留时间大于2.5min，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的时效性，而流速大于0.4mL/min会使柱压升高，超过色谱柱所能承受的压力，对色谱柱造成不可逆的损伤。

需要说明的是，图2和图15的横坐标均为采集时间，纵坐标均为离子信号强度。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.氯硝西泮的检测方法，其特征在于，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有氯硝西泮和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中氯硝西泮的浓度和内标物的浓度，拟合氯硝西泮的标准曲线方程；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，在1500-2500 rpm的转速下涡旋混合0.5-1min；

顺序加入萃取剂，在1500-2500 rpm的转速下涡旋混合3-10min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心8-15min，移取离心后的第二上清液；

利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在1500-2500 rpm的转速下涡旋混合1-3min，取第三上清液作为待测样品；

所述复溶液包括：70-85%的甲醇水溶液；

所述第二上清液与所述复溶液的体积比为：1:2.5-1:10；

利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中氯硝西泮的浓度；

所述检测条件中的液相条件，包括：

长度为150mm、内径为2.1mm以及填料粒径为5μm的Waters Atlantis dC18色谱柱；

洗脱流动相采用等度洗脱，所述等度洗脱含有0.01%-0.3%甲酸的水溶液和含有0.01%-0.3%甲酸的甲醇的体积比为：15:85；

所述萃取剂包括：乙酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的氯硝西泮的检测方法，其特征在于，

所述检测条件中的质谱条件，包括：

采用ESI离子源，正离子扫描模式和反应监测模式；加热气流速：12 L/min；加热气温度：350℃；雾化电压：40 psi；毛细管电压：4500 psi。

3.根据权利要求1所述的氯硝西泮的检测方法，其特征在于，

所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中氯硝西泮的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中氯硝西泮的浓度与内标物的浓度的比值。

4.根据权利要求1至3中任一所述的氯硝西泮的检测方法，其特征在于，

所述内标物为硝西泮。

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