KR102201721B1 - 신규한 원핵생물 발현 억제용 sRNA 플랫폼 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 원핵생물 발현 억제용 sRNA 플랫폼 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 원핵생물 발현 억제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 원핵생물 유래의 sRNA 유래의 Hfq 결합부위(Hfq binding site) 및 (ii) 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역을 포함하는 sRNA 및 원핵생물 유래 Hfq를 포함하는 그람 양성균 발현 억제용 조성물, 그 제법 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 합성 sRNA 및 상기 sRNA를 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물은 단일 및 다수의 표적 유전자를 한 번에 조절할 수 있는 장점이 있으며, 유전자 발현을 조절하는 합성 sRNA를 통해 기존의 유전자 결실과정 없이 효과적으로 목적 유전자 발현을 감소시킬 수 있어 재조합 미생물 제조에 유용하며, 특히, 그람 양성균의 유전자 발현 억제에 유용하다. 본 발명을 통해 제조된 재조합 코리네박테리움 균은 합성 sRNA를 통해 미생물 대사 흐름을 조절함으로써 고부가가치 산물을 친환경적이고 재생 가능하게 바이오 기반으로 대량 생산할 수 있는 재조합 미생물이다. 이러한 sRNA를 통해 개발되는 바이오 기반 생산시스템인 재조합 미생물은 날로 늘어나는 원유사용에 따른 환경문제를 해결하면서 기존의 화석 연료를 대체할 수 있어 유용하다.

Description

신규한 원핵생물 발현 억제용 sRNA 플랫폼 및 이의 용도{Novel sRNA platform for Fine-tuning gene expression of bacteria and Uses therof}
본 발명은 신규한 원핵생물 발현 억제용 sRNA 플랫폼 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (i) sprX2, roxS, arnA, surA, ASdes, ASpks, AS1726, AS1890, Mcr1~19, Mpr1~21, B11, B55, C8, F6, G2, ncRv12659, fsrA, crcZ, SR1, 6S-1, ncr1175, ncr982, ncr1241, ncr1015, ncr1241, ncr1575, ncr952, ncr629, cgb_03605, cgb_00105, cgb_20715, IGR-1~12, AS-1~12, sgs2672, sgs3323, sgs3618, sgs4453, sgs4827, sgs2746, sgs3903, sgs4581, sgs5362, sgs5676, sgs6100, sgs6109, scr1906, scr2101, scr3261, scr3261, α3287, scr3558, scr3974, scr4677 및 scr5676로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합부위(Hfq binding site) 및 (ii) 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역을 포함하는 합성 sRNA 및 원핵생물원핵생물 유래 Hfq를 포함하는 원핵생물 발현 억제용 sRNA 플랫폼, 그 제법 및 그 용도에 관한 것이다.
원핵생물인 코리네박테리움(Corynebacterium)은 호기성의 비병원성 미생물로 짧은 막대형의, 포자를 형성하지 않는 그람 양성 세균이다. 코리네박테리움의 게놈은 약 3,309 kb 로 비교적 작은 크기이다. 코리네박테리움은 처음 분리된 이후 현재까지 미생물 발효법에 의한 아미노산 및 핵산 등의 생산에 주로 이용되는 산업 미생물로 사용되고 있다. 코리네박테리움은 아미노산 및 핵산 물질을 다량 생산하는 것 이외에도 생산 균주로 널리 이용될 수 있는 몇 가지 장점을 가진다.
첫째, 이들 균주는 독성물질을 생성하지 않아서 인체 및 가축류에 대한 위험성이 상대적으로 적다. 둘째, 대사 과정이 비교적 단순하고 대장균 등 다른 미생물에서 보이는 효소들의 다중성이 존재하지 않기 때문에 생합성 경로의 조절 양상 역시 대장균의 다른 미생물에 비해 간단하다. 셋째, 외부로 유출되는 단백질이 거의 없기 때문에 아미노산, 핵산의 공업적 생산 시 높은 생산 효율을 얻을 수 있다. 근래 유전자 클로닝, 유전자 증폭, 유전자 불활성화 등의 유전자 재조합 기술의 발전으로 코리네박테리움에서의 아미노산 및 핵산의 대사 경로의 분자유전학 수준에서의 연구가 가능해졌으며 이러한 기술들을 이용하여 대사 회로의 분석 및 조작도 가능하게 되었다.
친환경적이며 재생 가능한 바이오 기반의 생산 시스템 구축은 생물체 내의 대사 회로를 다양한 분자생물학 기술을 통해 조절함으로써 대사의 흐름을 목적 물질을 생산에 최적화하여 얻어질 수 있는데, 우선 목적 물질의 생산에 필요한 대사 흐름을 강화시키기 위해 그와 관련된 효소의 발현을 증가시키는 것과, 세포의 성장 및 목적 물질과 경쟁 관계에 있는 대사 흐름을 막기 위해 해당 유전자의 결실을 유도하는 방법이 있다. 현재 코리네박테리움을 포함한 그람 양성균의 대사를 조절하는 방법 중 하나인 유전자를 결실시키기 위해서 사용되는 방법은 결실시키려 하는 목적 유전자와 상동 서열을 가지는 임의의 서열을 재조합 방법을 통해 치환시키고, 항생제 서열을 목적 유전자 서열 내에 삽입하는 방법 및 항생제 내성 유전자가 제거된 균주 제작을 위해 SacB 유전자를 이용하여 두 번째 선별 과정을 거쳐 기능을 상실한 균을 제작하는 방법이다(Schafer, A et al., Gene, 145(1), 69-73, 1994). 그러나 이런 유전자 결실 방법은 다음과 같은 문제점이 있다.
첫째, 유전자 결실에 소요되는 시간이 다른 방법에 비교하여 상대적으로 길다. 상동 서열을 이용하여 염색체 유전자를 치환하는 첫 번째 선별에 소요되는 시간과, SacB 유전자를 이용한 항생제 내성 유전자가 제거된 균주를 선별해 내기 위한 두 번째 선별과정에 소요되는 시간 등을 고려할 때, 하나의 유전자를 결실하기 위해서는 약 3주일 이상의 시간이 소요된다. 이것은 대사공학적으로 균 내에서 목적 물질을 효율적으로 생산하는 것을 더디게 하는 요소가 된다.
둘째, 항생제 내성 유전자를 결실시키고자 하는 염색체 내에 삽입함으로써 해당 유전자의 활성을 제거하는 방법은 염색체 내에 삽입할 수 있는 항생제의 수가 제한적이기 때문에 결실시킬 수 있는 유전자의 수에 한계가 있다.
셋째, 기존의 유전자 결실 방법에 의해 조작된 염색체에서 결실된 유전자는 복구하기가 어렵다. 아울러, 동일한 유전자 결실을 다른 대상의 균주에 시도할 경우 모든 과정을 처음부터 시도해야만 하므로 그에 따른 많은 시간과 노력이 소요된다.
따라서, 위의 유전자 결실을 위한 한계점들을 극복하기 위해서는, 코리네박테리움 염색체의 서열을 변형하지 않으면서도 목적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있으며, 유전자 발현의 정도를 조절할 수 있고, 동일한 유전자 발현 조절 기능을 코리네박테리움 외의 다른 그람 양성균에도 쉽게 적용할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.
한편, 대장균 등의 그람 음성균에서는 상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들에 의해 합성 sRNA를 이용한 유전자 발현 억제 시스템이 개발된 바 있다(KR 10-1575587, US 9,388,417, Na, D et al., Nat. Biotechnol., 31(2), 170-174, 2013; Yoo, SM et al. Nat. Protoc., 8(9), 1694-1707, 2013). 본 발명자들은 상기 시스템을 이용하여 대장균에서 효율적으로 유전자 발현 억제 및 이를 이용한 카다베린 및 타이로신 생산량이 증가한 균주를 개발하였으며(KR 10-1575587, US 9,388,417, Na, D et al., Nat. Biotechnol., 31(2), 170-174, 2013; Yoo, SM et al. Nat. Protoc., 8(9), 1694-1707, 2013), 추가로 sRNA를 발현시키는 프로모터의 세기를 변화시킴에 따라 다양한 정도의 발현 억제능을 지니는 sRNA 플랫폼을 이용하여 대장균에서의 퓨트레신 및 프롤린의 생산량이 증가한 균주를 개발하였다(KR 10-2015-0142304 A, KR 10-1750855 B1, Noh, M. et al., Cell Systems, 5, 1-9, 2017). 또한 상기 시스템을 클로스트리듐 속 미생물에서 적용하여, 부탄올의 생산량이 증가한 균주를 개발한 바 있다(KR 10-2015-0142305 A, KR 10-1690780 B1, Cho, C. et al., 114(2), 374-383, 2017). 하지만 대장균 유래 sRNA를 도입하였을 때 클로스트리듐 속 미생물에서의 유전자 발현 억제능은 기대보다 낮은 것으로써, 그람 음성균 및 그람 양성균 모두에서 더욱 효율적으로 작동할 수 있는 신규 합성 조절 sRNA 시스템의 개발이 필요하였다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 원핵생물에서 sprX2, roxS, arnA, surA, ASdes, ASpks, AS1726, AS1890, Mcr1~19, Mpr1~21, B11, B55, C8, F6, G2, ncRv12659, fsrA, crcZ, SR1, 6S-1, ncr1175, ncr982, ncr1241, ncr1015, ncr1241, ncr1575, ncr952, ncr629, cgb_03605, cgb_00105, cgb_20715, IGR-1~12, AS-1~12, sgs2672, sgs3323, sgs3618, sgs4453, sgs4827, sgs2746, sgs3903, sgs4581, sgs5362, sgs5676, sgs6100, sgs6109, scr1906, scr2101, scr3261, scr3261, α3287, scr3558, scr3974, scr4677 및 scr5676로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합부위(Hfq binding site) 및 (ii) 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역을 포함하는 합성 sRNA; 와 상기 sRNA를 인식하는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다(Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 멘하이미아(Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium),코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)원핵생물 유래 Hfq 단백질을 동시에 발현시킬 경우, 표적 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경 기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 원핵생물에서 기존 유전자 결실방법의 한계점을 해소하고, 유전자의 발현을 조절할 수 있는 합성 sRNA를 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물, 그 제법 및 용도를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) sprX2, roxS, arnA, surA, ASdes, ASpks, AS1726, AS1890, Mcr1~19, Mpr1~21, B11, B55, C8, F6, G2, ncRv12659, fsrA, crcZ, SR1, 6S-1, ncr1175, ncr982, ncr1241, ncr1015, ncr1241, ncr1575, ncr952, ncr629, cgb_03605, cgb_00105, cgb_20715, IGR-1~12, AS-1~12, sgs2672, sgs3323, sgs3618, sgs4453, sgs4827, sgs2746, sgs3903, sgs4581, sgs5362, sgs5676, sgs6100, sgs6109, scr1906, scr2101, scr3261, scr3261, α3287, scr3558, scr3974, scr4677 및 scr5676로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합부위(Hfq binding site) 및 (ii) 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역을 포함하는 그람 양성균(gram positive bacteria)원핵생물에서 유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 합성 sRNA를 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 발현벡터; 및 상기 발현벡터 또는 복제 가능한 형태의 상기 핵산이 도입되어 있는 재조합 원핵생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 sRNA 및 원핵생물 유래 Hfq를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터; 및 상기 발현벡터 또는 복제 가능한 형태의 상기 핵산이 도입되어 있는 재조합 원핵생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 원핵생물을 배양하여 표적 유전자의 mRNA를 억제하는 단계를 포함하는 원핵생물에서 표적 유전자의 발현 억제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 유용물질 생산을 위한 결실대상 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 상기 표적 유전자의 발현 억제 방법을 사용하여 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 존재하고, 유용물질 생합성 경로에 참여하는 유전자들 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현을 억제시키는 단계; 및
(b) 상기 발현 억제에 따라 유용물질 생산수율이 향상되는 경우, 발현을 억제시킨 유전자를 유용물질 생산을 위한 결실대상 유전자로 선정하는 단계
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 스크리닝된 유전자 또는 스크리닝된 유전자의 조합을 결실시켜 재조합 균주를 제조하는 단계를 포함하는 유용물질 생산균주의 개량방법을 제공한다.
본 발명에 따른 합성 sRNA 및 상기 sRNA를 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물은 단일 및 다수의 표적 유전자를 한 번에 조절할 수 있는 장점이 있으며, 유전자 발현을 조절하는 합성 sRNA를 통해 기존의 유전자 결실과정 없이 효과적으로 목적 유전자 발현을 감소시킬 수 있어 재조합 미생물 제조에 유용하며, 특히, 그람 양성균의 유전자 발현 억제에 유용하다. 본 발명을 통해 제조된 재조합 코리네박테리움 균은 합성 sRNA를 통해 미생물 대사 흐름을 조절함으로써 고부가가치 산물을 친환경적이고 재생 가능하게 바이오 기반으로 대량 생산할 수 있는 재조합 미생물이다. 이러한 sRNA를 통해 개발되는 바이오 기반 생산시스템인 재조합 미생물은 날로 늘어나는 원유사용에 따른 환경문제를 해결하면서 기존의 화석 연료를 대체할 수 있어 유용하다.
도 1의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 표적 유전자 발현 억제용 카세트의 벡터맵이며, (B)는 본 발명의 일 실시예에 따른 표적 유전자 발현 억제용 카세트의 구조도이다.
도 2는 대장균 유래 합성 조절 sRNA를 여러 조합으로 발현시켰을 때 코리네박테리움에서 타겟 형광 단백질의 발현 억제능을 측정한 결과이다. 여기서 Hfq는 대장균 Hfq를 의미하고, Hfqopt는 코리네박테리움 코돈 최적화된 Hfq를 의미하며, antiGFP는 GFP 표적 발현 억제 sRNA를 의미한다.
도 3은 원핵생물을 위한 신규 합성 조절 sRNA를 발현시켰을 때 코리네박테리움의 균주 성장을 측정한 결과이다.
도 4은 원핵생물을 위한 신규 합성 조절 sRNA를 발현시켰을 때 코리네박테리움에서의 타겟 형광 단백질의 발현 억제능을 측정한 결과이다.
도 5는 원핵생물을 위한 신규 합성 조절 sRNA를 발현시켰을 때 코리네박테리움에서의 타겟 형광 단백질 해당 mRNA의 발현량을 측정한 결과이다.
도 6은 합성 조절 sRNA의 표적 mRNA 결합 서열의 길이를 변화시켰을 때 표적 유전자의 발현량(형광 단백질의 발현량)의 변화를 측정한 결과이다.
도 7은 라이신 생산 균주인 코리네박테리움 BE 균주에 lysA 유전자를 표적으로 하는 합성 조절 sRNA를 도입 및 발현시켰을 경우 나타나는 라이신 생산량의 변화를 측정한 결과이다.
도 8은 야생형 코리네박테리움 균주에 pyc 유전자를 표적으로 하는 합성 조절 sRNA를 도입 및 발현시켰을 경우 나타나는 균주 성장의 변화를 측정한 결과이다.
도 9는 RppA를 발현시키는 대장균 (RppA)에 rppA 유전자를 표적으로 하는 pEKEx1-bsuhfq-roxS 플랫폼 기반의 sRNA를 도입하였을 때 (RppA+anti-rppA) 나타나는 플라비올린의 생산량 변화를 측정한 결과이다. NC는 야생형 대장균 대조군으로써 pEKEx1이 형질전환된 균주이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "sRNA (small RNA)"란, 단백질로 번역되지 않으며 상보적 결합을 통해 특정 mRNA의 번역을 효과적으로 억제하는, 보통 염기 서열의 길이가 200개 이하의 짧은 길이의 RNA이다.
본원에서 "리보좀 결합 부위(ribosome binding site)"란, mRNA의 전사를 위하여 리보좀이 mRNA상에 결합하는 부위를 말한다.
본원에서 "유전자"란 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 표적 유전자는 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.
본 발명에서는 원핵생물에서 효과적으로 작동하는 신규 합성 조절 sRNA의 유전자 발현 억제 효과를 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 대장균 유래 sRNA의 Hfq 결합 부위; 및 표적 유전자 mRNA 결합 부위를 포함하는 sRNA와 그람 양성균 유래 sRNA의 Hfq 결합 부위; 및 표적 유전자 mRNA 결합 부위를 포함하는 sRNA를 제작하여 그람 양성균에서의 표적 유전자 발현 억제 효과를 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래의 sRNA에서 추출한 Hfq 결합 영역 및 Hfq 단백질과, GFP(녹색 형광 단백질)의 mRNA에 상보적으로 결합하는 영역을 포함하는 sRNA를 제작하고(도 1), 코리네박테리움에서 유전자 발현 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 기존의 대장균 유래 합성 조절 sRNA에 비하여 그람 양성균 유래 합성 조절 sRNA의 코리네박테리움에서의 발현 억제 효율이 월등히 높다는 것을 확인할 수 있었다(도 2, 도 4).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (i) sprX2, roxS, arnA, surA, ASdes, ASpks, AS1726, AS1890, Mcr1~19, Mpr1~21, B11, B55, C8, F6, G2, ncRv12659, fsrA, crcZ, SR1, 6S-1, ncr1175, ncr982, ncr1241, ncr1015, ncr1241, ncr1575, ncr952, ncr629, cgb_03605, cgb_00105, cgb_20715, IGR-1~12, AS-1~12, sgs2672, sgs3323, sgs3618, sgs4453, sgs4827, sgs2746, sgs3903, sgs4581, sgs5362, sgs5676, sgs6100, sgs6109, scr1906, scr2101, scr3261, scr3261, α3287, scr3558, scr3974, scr4677 및 scr5676로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합부위(Hfq binding site) 및
(ii) 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역을 포함하는 원핵생물에서 유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역은 표적 유전자 mRNA의 리보좀 결합 부위 (Ribosome binding site)와 전체적으로 또는 부분적으로 상보적 결합을 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 원핵생물은 어떤 종류의 원핵생물이건 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 그람 양성균 또는 그람 음성균이며, 더욱 바람직하게는 그람 양성균일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 그람 양성균은 코리네박테리움 (Corynebacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스 (Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 비피도박 테리움(Bifidobacterium)로 구성되는 군 중 어느 하나에 해당될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 원핵생물은 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다(Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 멘하이미아(Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium),코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, sprX2, roxS, arnA, surA, ASdes, ASpks, AS1726, AS1890, Mcr1~19, Mpr1~21, B11, B55, C8, F6, G2, ncRv12659, fsrA, crcZ, SR1, 6S-1, ncr1175, ncr982, ncr1241, ncr1015, ncr1241, ncr1575, ncr952, ncr629, cgb_03605, cgb_00105, cgb_20715, IGR-1~12, AS-1~12, sgs2672, sgs3323, sgs3618, sgs4453, sgs4827, sgs2746, sgs3903, sgs4581, sgs5362, sgs5676, sgs6100, sgs6109, scr1906, scr2101, scr3261, scr3261, α3287, scr3558, scr3974, scr4677 및 scr5676 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site)은는 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역과 연속적으로 위치할 수 있고, 핵산 단편 등 링커에 의하여 연결되는 등 떨어져 위치할 수도 있다.
이때, "상보적 결합"이란, 핵산서열간 서로 염기 짝짓기(base pairing)하는 것을 의미하며, 표적 유전자의 mRNA의 일부 영역과 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역의 서열이 약 70-80% 이상, 바람직하게는 약 80-90% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95-99% 이상 서로 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 본 발명에 있어서, 본 발명의 sRNA는 일반적으로 합성된 것일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
즉, 본 발명에 있어서, 상기 sRNA는 화학적 또는 효소학적으로 합성된 것일 수 있다.
이에 본 발명에 따른 sRNA는 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 화학적 변형은 상기 핵산 분자에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기, 및 아미노기 중 어느 하나로 치환되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 제한되지 않고 핵산 분자의 전달능을 높이기 위해서라면 -Br, -Cl, -R, -R'OR, -SH, -SR, -N3 및 -CN (R= alkyl, aryl, alkylene) 중 어느 하나로도 치환될 수 있다. 또한, 적어도 1종의 뉴클레오티드의 포스페이트 백본이 phosphorothioateform, phosphorodithioate form, alkylphosphonate form, phosphoroamidate form 및 boranophosphate form 중 어느 하나로 치환될 수 있다. 또한, 상기 화학적 변형은 상기 핵산 분자에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), Morpholino, PNA (peptide nucleic acid) 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 다양한 합성 조절 sRNA가 원핵생물 유래의 Hfq 단백질과 함께 조합되어 그람 양성균에 도입될 경우, 유전자 발현 억제 효과가 향상되는 것을 확인할 수 있었다(도 4, 도 5).
따라서 본 발명은 다른 관점에서 상기 sRNA 또는 상기 sRNA 및 원핵생물 유래 Hfq를 코딩하는 핵산 및 이를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 원핵생물은 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다(Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 멘하이미아(Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium),코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 Hfq는 코돈 최적화된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "핵산"은 RNA, DNA 안정화된 RNA 혹은 안정화된 DNA일 수 있다. 이때, "코딩 (encoding)"이란, 상기 sRNA를 암호화하는 것으로서, 상기 sRNA에 상보적인 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 sRNA의 발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.
염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명은 또한, 상기 합성 sRNA를 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 발현벡터; 및 상기 발현벡터 또는 복제 가능한 형태의 상기 핵산이 도입되어 있는 재조합 원핵생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 sRNA를 코딩하는 핵산; 원핵생물 유래 Hfq를 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 각각 포함하는 발현벡터; 및 상기 발현벡터 또는 복제 가능한 형태의 상기 핵산이 도입되어 있는 재조합 원핵생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 sRNA 및 원핵생물 유래 Hfq를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터; 및 상기 발현벡터 또는 복제 가능한 형태의 상기 핵산이 도입되어 있는 재조합 원핵생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 원핵생물은 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다(Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 멘하이미아(Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium),코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
본 발명의 또 다른 관점에서 상기 재조합 원핵생물을 배양하여 타겟 유전자의 mRNA 발현을 억제하는 단계를 포함하는 타겟 유전자의 발현 억제방법에 관한 것이다.
이때, 바람직하게는 상기 sRNA의 발현은 , IPTG 등 유도물질(inducer) 결합에 따라 작동하는 프로모터에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 합성 sRNA의 tight expression을 위해, 외부 inducer를 이용하여 sRNA 발현을 조절할 수 있다. 이때, 구체적으로는 합성 sRNA를 tac 프로모터로 발현시킬 수 있다.
본 발명에 따른 sRNA 및 Hfq는 유용물질 생산을 위한 대상 유전자의 스크리닝을 위하여 사용될 수 있는데, (a) 상기 방법을 사용하여 유용물질 생합성 경로에 참여하는 유전자들 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현을 억제시키는 단계; 및 (b) 상기 발현 억제에 따라 유용물질 생산수율이 향상되는 경우, 발현을 억제시킨 유전자를 유용물질 생산을 위한 결실대상 유전자로 선정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이때, 결실이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시키거나, 또는 해당 효소의 발현 또는 활성을 억제시키는 유전자, 효소 또는 화학물질을 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 억제시키는 것을 포괄하는 개념이다. 아울러, 이와 같이 스크리닝된 결실대상 유전자는 유용물질 생산균주의 개량을 위하여 사용될 수 있다.
즉, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 스크리닝된 유전자 또는 스크리닝된 유전자의 조합을 결실시켜 재조합 균주를 제조하는 단계를 포함하는 유용물질 생산균주의 개량방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "기능의 상실"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 해당 효소의 발현 또는 활성을 억제시키는 유전자, 효소 또는 화학물질을 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 억제시키는 것을 포괄하는 개념이다. 따라서, 특정 유전자의 기능을 상실시키는 방법에 대해서는 기존에 알려진 antisense RNA를 이용한 발현억제, 상동성 재조합 (homologous recombination), 다양한 재조합 효소 (rambda recombinase 등) 발현을 통한 상동성 재조합, 역전사효소와 RNA를 이용한 특정서열 삽입 등의 방법으로 목적하는 특정 유전자 및 그 유전자가 코딩하는 효소의 활성이 억제되는 한 어떤 특정한 방법에 국한되지 않는다.
본 발명은 또한, 타겟 유전자의 mRNA의 2차 구조가 유전자 발현 억제에 영향을 끼친다는 관점에서, 각 유전자를 가장 효율적으로, 예측할 수 있는 방법으로 억제하기 위하여 숙주 mRNA의 모든 2차 구조를 고려하여 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역 (target gene mRNA base-pairing region)을 결정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 (a) 타겟 유전자 및 숙주 균주를 입력하는 단계; (b) 숙주 균주의 모든 유전자의 전사 시작점을 포함하는 RNA 서열을 획득하는 단계; 및 (c) 조건에 따라 sRNA의 타겟 유전자와 상보적으로 결합하는 영역의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조건은 특정 sRNA가 타겟 유전자를 제외한 유전체 상이 다른 유전자와 비특이적 상호작용(off-targeting)을 하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 대장균 유래 합성 조절 sRNA의 성능 확인
코리네박테리움 균주를 그람 양성균들 중 대표로 삼아 해당 균주에서 자주 사용되는 벡터인 pEKEx1(Eikmanns et al., Gene 102(1): 93-98, 1991)을 플랫폼 벡터로 활용키로 하였다 (도 1). 먼저, 기존의 대장균 sRNA 시스템인 Hfq, MicC, anti-GFP 서열을 포함한 여러 요소들이 sRNA의 발현 억제능에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 즉 E. coli W3110 유래 Hfq 유무, Corynebacterium에서의 발현을 위한 Hfq의 코돈 최적화 유무, 및 anti-GFP 서열 유무에 따라 다양한 sRNA 발현 벡터들을 구축하고 pCES208(Yim SS, et al., Biotechnol Bioeng, 110:2959, 2013) 상의 I16 합성 프로모터를 통해 발현되는 GFP와 함께 발현시켜 유전자 발현 억제능을 확인하였다.
본 발명에서 개발한 벡터들의 특징은 하기 표 1과 같다
대장균 sRNA 시스템 테스트용 벡터
벡터명 특징
pEKEx1-ecjhfq 대장균 W3110 유래 Hfq 코딩 유전자 포함
pEKEx1-cglhfq 코돈 최적화 Hfq 코딩 유전자 포함
pEKEx1-micC 대장균 유래 MicC sRNA의 Hfq 결합 영역 포함
pEKEx1-ecjhfq-micC Hfq 코딩 유전자 및 MicC Hfq 결합 영역 모두 포함
pEKEx1-cglhfq-micC 코돈 최적화 Hfq 코딩 유전자 및 MicC Hfq 결합 영역 포함
pEKEx1-micC_antiGFP MicC Hfq 결합 영역 및 GFP mRNA 결합 서열 모두 포함
pEKEx1-ecjhfq-micC-antiGFP Hfq 코딩 유전자, MicC Hfq 결합 영역 GFP 표적 유전자 결합 영역 포함
pEKEx1-cglhfq-micC-antiGFP 코돈 최적화 Hfq 코딩 유전자, MicC Hfq 결합 영역 및 GFP 표적 유전자 결합 영역 포함
우선 pEKEx1 벡터에 대장균 유래 hfq를 도입하기 위하여 pEKEx1 벡터를 EcoRI 및 PstI 제한 효소를 처리한 다음, E. coli W3110의 게놈을 템플릿으로 하여 [서열번호 1]과 [서열번호 2]의 프라이머를 이용하여 PCR을 하여 얻어낸 DNA 조각과 상기 제한 효소를 처리한 pEKEx1 벡터를 Gibson assembly를 통해 접합하여 pEKEx1-ecjhfq 벡터를 제작하였다. 이 때 대장균 유래 hfq의 서열은 [서열번호 3]과 같다.
이와 마찬가지로 대장균 유래 hfq를 코리네박테리움 코돈 최적화한 후(㈜바이오니아를 통해 합성함) pEKEx1 벡터에 도입하기 위하여 동일한 과정을 거쳤는데, 이 때 PCR을 위해 사용한 프라이머들의 서열은 [서열번호 4]와 [서열번호 5]와 같다. 상기 PCR을 통해 제작한 코돈 최적화 Hfq 코딩 유전자는 cglhfq로 명명하였다. 이렇게 제작한 벡터는 pEKEx1-cglhfq라 명명하였다. cglhfq의 서열은 하기 서열번호 28과 같다.
[서열번호 1] 5'- caatttcacacaggaaacagaattc ATGGCTAAGGGGCAATCTTTAC -3'
[서열번호 2] 5'- caccatatctatatctccttgaattc ATTATTCGGTTTCTTCGCTGTCC -3'
[서열번호 3] 5’-
atggctaaggggcaatctttacaagatccgttcctgaacgcactgcgtcgggaacgtgttccagtttctatttatttggtgaatggtattaagctgcaagggcaaatcgagtcttttgatcagttcgtgatcctgttgaaaaacacggtcagccagatggtttacaagcacgcgatttctactgttgtcccgtctcgcccggtttctcatcacagtaacaacgccggtggcggtaccagcagtaactaccatcatggtagcagcgcgcagaatacttccgcgcaacaggacagcgaagaaaccgaataa-3’
[서열번호 4] 5’-caatttcacacaggaaacagaattc ATGGCTAAGGGTCAGTCTCTC-3’
[서열번호 5] 5’-caccatatctatatctccttgaattc ATTACTATTCGGTTTCCTCGG-3’
[서열번호 28] 5‘-
atggctaagggtcagtctctccaggacccattcttgaacgcactgcgtcgcgaacgcgtgcccgtgtccatctatctggtgaacggtattaaacttcagggacagatcgagtccttcgatcagtttgttatcctgctcaagaacacggtctcccagatggtatacaagcatgcgatttcaaccgttgtcccttcccgcccggtgtctcaccactcgaacaatgccggcggcggcacctcctccaactaccaccacggcagcagcgcccaaaacacttccgcacagcaggattccgaggaaaccgaatagtaa-3’
이렇게 hfq를 도입한 후, MicC 기반 sRNA 플랫폼의 도입을 위하여 대장균 유래 hfq (ecjhfq), 코리네박테리움 코돈 최적화 hfq (cglhfq), 또는 hfq가 삽입되지 않은 pEKEx1 벡터에 StuI 제한 효소를 처리한 다음, E. coli W3110 게놈을 템플릿으로 하여 프라이머 [서열번호 6]과 [서열번호 7]을 이용하여 PCR 증폭하여 첫 번째 sRNA 조각을 제작한 후, 이를 또 다시 프라이머 [서열번호 8]과 [서열번호 9]를 이용하여 PCR 증폭하여 micC sRNA 조각을 준비하였다. 이렇게 형성된 DNA 조각을 상기 StuI을 처리한 pEKEx1 기반 벡터들에 Gibson assembly를 이용하여 접합하여 pEKEx1-micC 벡터를 제작하였다. 이 때, pEKEx1-ecjhfq와 pEKEx1-cglhfq 벡터를 상기와 동일하게 StuI으로 처리한 후, 상기 micC sRNA 조각을 Gibson assembly를 이용하여 접합하여 pEKEx1-ecjhfq-micC, pEKEx1-cglhfq-micC 벡터를 제작하였다.
또한, GFP 형광 단백질의 발현 억제를 위한 표적 mRNA 결합 서열이 포함된 sRNA 벡터를 제작하기 위하여 아래와 같은 실험을 진행하였다. 우선 E. coli W3110 게놈을 템플릿으로 하여 프라이머 [서열번호 10]과 [서열번호 7]을 이용하여 첫 번째 sRNA 조각을 증폭하였고, 이를 또 다시 프라이머 [서열번호 8]과 [서열번호9]을 이용하여 PCR 증폭하였다. 각각 StuI 제한 효소를 처리한 pEKEx1-micC 벡터, pEKEx1-ecjhfq-micC 벡터 및 pEKEx1-cglhfq-micC 벡터에 이렇게 생성된 micC-antiGFP sRNA 조각을 Gibson assembly를 이용하여 접합하여, 각각 pEKEx1-micC-antiGFP 벡터, pEKEx1-ecjhfq-micC-antiGFP 벡터, pEKEx1-cglhfq-micC-antiGFP 벡터를 제작하였다.
[서열번호 6] 5’-
ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggAGCTCTCATTTTGCAGATTTgttttagagctagaaatagcaagt-3’
[서열번호 7] 5’-TATAGATATCCCGCGGTATATTAATTAA TATAAACGCAGAAAGGCCC-3’
[서열번호 8] 5’-TGGATGATGGGGCGATTCAGGtatagatatcTTGACAATTAATCATCGGCT-3’
[서열번호 9] 5’-AAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGTATAGATATCCCGCGGTATA-3’
[서열번호 10] 5’-ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtgg GAAAAGTTCTTCTCCTTTACTCAT tttctgttgggccattgcattg-3’
리포터 플라스미드로 사용하기 위한 pCES208-I16-GFP 벡터 구축을 위해서는 기존 연구를 통하여 구축된 GFP 발현 벡터 상에 원활한 사용을 위한 스펙티노마이신 (Spectinomycin) 마커로의 치환을 진행한 후 사용하였다 (Yim, S.S., Biotechnol. Bioeng., 110(11), 2959-2969, 2013).
위와 같이 구축한 벡터들을 각각 코리네박테리움 균주에 형질전환한 후 배양을 진행하였는데, 배양 방법은 다음과 같다. 먼저, pCES208-I16-GFP를 형질전환 후 200μg/L 스펙티노마이신이 첨가된 BHIS 평판 배지(37 g/L Brain Heart Infusion (BHI), 91g/L sorbitol, 15g/L agar)에서 선별하였다.
이렇게 형광 단백질을 발현시킬 수 있는 균주에 표 1의 sRNA 벡터를 도입 하여 카나마이신(Kanamycin)과 스펙티노마이신이 동시 첨가된 BHIS 평판 배지에 다시 선별하였다. 상기 선별한 7종의 재조합 균주들 및 야생형 ATCC13032 균주까지 총 8균주들을 2 mL BHIS 배지(37 g/L Brain Heart Infusion (BHI), 91 g/L sorbitol)가 포함된 테스트튜브에 접종하여 30℃에서 16시간 동안 전배양한 후, 전배양한 배양액을 다음 BHIS 2ml 테스트튜브에 OD600 이 0.1 이 되도록 계산하여 접종하였고, 동시에 IPTG를 1mM 첨가한 후 24시간 배양하였다.
배양 후 세포의 성장 정도를 측정하기 위하여 600 nm 파장 영역에서 OD (optical density)를 측정하였고, 추가적으로 세포 일부를 Phosphate-buffered saline (PBS)를 통해 2번 washing 한 후 다시 1 mL PBS에 분리시켜 FACS (fluorescence-activated cell sorting)을 통하여 형광 단백질 발현 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 다른 모든 플랫폼들에서는 유전자 발현 억제가 거의 일어나지 않았고, 대장균 유래 Hfq, MicC와 anti-GFP를 동시에 발현할 경우, 코리네박테리움에서 35% 정도의 효율로 GFP 발현을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 기존 문헌 (D. Na et al., Nat Biotechnol (2013), 31(2), 170) 또는 특허 (KR 10-1575587-0000)에서 확인된 바와 같은 표적 유전자 발현 억제능보다 낮은 것으로써, 새로운 sRNA 발현 플랫폼의 구축이 필요하였다.
실시예 2: 그람 양성균 유래 신규 sRNA 플랫폼 구축
실시예 1과 같은 방식으로 벡터를 구축하되, Hfq 단백질 및 sRNA Hfq 결합 부위의 종류를 그람 양성균 유래인 것으로 변경하여 벡터를 구축하였다.
각 Hfq 단백질 및 sRNA는 하기 표 2와 같다.
신규 sRNA 구성요소
명칭 특징
bsuhfq Bacillus subtilis 유래 hfq
sauhfq Staphylococcus aureus 유래 hfq
roxS Bacillus subtilis 유래 sRNA scaffold
sprX2 Staphylococcus aureus 유래 sRNA scaffold
arnA Cornyebacterium glutamicum 유래 sRNA scaffold
각 구성요소를 포함하는 벡터를 정리하는 하기 표 3과 같다.
신규 sRNA 벡터 구성
벡터명 특징
pEKEx1-sauhfq-sprX2 스테필로코커스 hfq + sRNA
pEKEx1-sauhfq 스테필로코커스 hfq
pEKEx1-sprX2 스테필로코커스 sRNA
pEKEx1-bsuhfq-roxS 바실러스 hfq + sRNA
pEKEx1-bsuhfq 바실러스 hfq
pEKEx1-roxS 바실러스 sRNA
pEKEx1-arnA 코리네박테리움 sRNA
상기 sRNA 플랫폼 벡터들을 구축하기 위하여, 우선적으로 pEKEx1 벡터에 각 hfq를 삽입하고자 하였고, 이를 위해 pEKEx1 벡터에 EcoRI과 PstI 제한효소를 처리한 다음, Bacillus subtilis 게놈을 템플릿으로 하여 프라이머 [서열번호 11], [서열번호 12]를 이용하여 bsuhfq DNA 조각을 PCR 증폭하였고, 마찬가지로 Staphylococcus aureus 게놈을 템플릿으로 하여 프라이머 [서열번호 13], [서열번호 14]를 이용하여 sauhfq DNA 조각을 PCR 증폭하였다. 이렇게 증폭한 DNA 조각들을 상기 제한효소를 처리한 벡터에 Gibson assembly를 이용하여 접합하였다.
[서열번호 11] 5’-caatttcacacaggaaacagaattc ATGAAACCGATTAATATTCAG-3’
[서열번호 12] 5’-caaaacagccaagcttggctgcag ATTATTCGAGTTCAAGCTGGAC-3’
[서열번호 13] 5’-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTC ATGATTGCAAACGAAAACATC-3’
[서열번호 14] 5’-CAAAACAGCCAAGCTTGGCTG ATTATTCTTCACTTTCAGTAG-3’
그 후, 각 sRNA scaffold를 기존 대장균 발현 용 sRNA 플랫폼 벡터인 pWAS 벡터(KR 10-1575587)에 삽입하였는데, 이 때 pWAS 벡터를 템플릿으로 하여 inverse PCR 기법을 활용하였다. 이 때, arnA의 구축을 위해서는 프라이머 [서열번호 15], [서열번호 16]를 활용하였고, sprX2의 구축을 위해서는 프라이머 [서열번호 17], [서열번호 18]를 활용하였고, roxS의 구축을 위해서는 프라이머 [서열번호 19], [서열번호 20]을 활용하였다.
상기 프라이머들을 활용하여 조작되지 아니한 pWAS 벡터를 템플릿으로 하여 inverse PCR을 진행하였고, 각 DNA 조각들을 DpnI 제한 효소를 통하여 증폭된 DNA 조각만을 남기고 본래 넣어준 템플릿을 제거하였으며, T4 PNK (T4 polynucleotide kinase)를 이용하여 DNA 양 끝에 인산기를 부착시켜, T4 ligase를 통한 접합이 가능토록 하였다. 이렇게 pWAS 벡터 상에 구축된 각 sRNA scaffold들은 이어지는 PCR 증폭 실험에서 템플릿으로 활용하였다.
그 후, GFP 발현 억제를 위한 최종 sRNA 벡터를 구축하였는데, arnA scaffold 기반 플랫폼을 위해서는 프라이머 [서열번호 21], [서열번호 7], sprX2 scaffold 기반 플랫폼을 위해서는 프라이머 [서열번호 22], [서열번호 7], 또한 roxS 기반 플랫폼을 위해서는 프라이머 [서열번호 23], [서열번호 7]을 활용하여 각 pWAS 기반 벡터를 템플릿으로 하여 PCR로 증폭하였다. 이렇게 증폭된 arnA sRNA 조각을 StuI 제한 효소를 처리한 pEKEx1 벡터와 접합하여 pEKEx1-arnA 벡터가 제작되었다. 또한, sprX2 sRNA 조각은 StuI 제한효소를 처리한 pEKEx1 벡터를 pEKEx1-sauhfq 벡터와 각각 접합하여 pEKEx1-sprX2와 pEKEx1-sauhfq-sprX2 벡터가 제작되었다. 마지막 roxS sRNA 조각은 StuI 제한효소를 처리한 pEKEx1 벡터를 pEKEx1-bsuhfq 벡터와 각각 접합하여 pEKEx1-roxS와 pEKEx1-bsuhfq-roxS 벡터가 제작되었다. 이 때 증폭한 각 DNA 조각들은 연이어 [서열번호 8], [서열번호 9]를 이용하여 또다시 증폭한 다음, StuI 제한효소를 처리한 pEKEx1 기반 hfq 발현 벡터에 Gibson assembly를 이용하여 접합하였다(도 1).
그 결과, 도 1의 (A)에 개시된 바와 같이, 프로모터(Ptac)-그람양성균 유래 hfq 코딩 유전자-터미네이터(rrnB) 와 프로모터(Ptac)-타겟 mRNA 결합영역(TBR:target binding region)-sRNA scaffold-터미네이터(T1/TE)의 구조를 가지는 sRNA 발현 카세트를 제조하였다.
[서열번호 15] 5’-aaaggctattcaggggtaatttttt CGGGGGATCCACTAGTTCTAG-3’
[서열번호 16] 5’-aaaagactgttcgggggtaacgatgt CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAAC-3’
[서열번호 17] 5’-acccagtgacatgcttgggtga CGGGGGATCCACTAGTTCTAG-3’
[서열번호 18] 5’-gttttttcttacgatagagagca CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAAC-3’
[서열번호 19] 5’-aagcgcggtttcatatgt CGGGGGATCCACTAGTTCTAG-3’
[서열번호 20] 5’-atcccggcgcggtttcttt CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAAC-3’
[서열번호 21] 5’-ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtgg GAAAAGTTCTTCTCCTTTACTCAT AAAAAATTACCCCTGAATAGCC-3’
[서열번호 22] 5’-ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtgg GAAAAGTTCTTCTCCTTTACTCAT TCACCCAAGCATGTCACTGG-3’
[서열번호 23] 5’-ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtgg GAAAAGTTCTTCTCCTTTACTCAT ACATATGAAACCGCGCTTATC-3’
실시예 3: 구축한 플랫폼에 의한 유전자 발현 억제능 확인
실시예 2에서 구축한 5 종의 신규 sRNA 플랫폼과 기존 최고 효율의 대장균 유래 sRNA 플랫폼을 pCES208-I16-GFP 포함 코리네박테리움 균주에 각각 형질전환한 다음 GFP 형광단백질, mRNA 발현량, 그리고 균주의 성장을 측정하였다.
먼저, 형광 단백질을 발현시킬 수 있는 균주에 실시예 2에서 구축한 sRNA 플랫폼들을 도입하여 카나마이신(Kanamycin)과 스펙티노마이신이 동시 첨가된 BHIS 평판 배지에 선별한 다음 7종의 재조합 균주들 및 야생형 ATCC13032 균주까지 총 8균주들을 2 mL BHIS 배지(37 g/L Brain Heart Infusion (BHI), 91 g/L sorbitol)가 포함된 테스트튜브에 접종하여 30℃에서 16시간 동안 전배양한 후, 전배양한 배양액을 다음 BHIS 2ml 테스트튜브에 OD600 이 0.1 이 되도록 계산하여 접종하였고, 동시에 IPTG를 1mM 첨가한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 세포의 성장 정도를 측정하기 위하여 600 nm 파장 영역에서 OD (optical density)를 측정하였고, 추가적으로 세포 일부를 Phosphate-buffered saline (PBS)를 통해 2번 washing 한 후 다시 1 mL PBS에 분리시켜 FACS (fluorescence-activated cell sorting)을 통하여 형광 단백질 발현 정도를 측정하였다. 또한, sRNA의 존재에 따른 GFP 유전자 해당 mRNA의 발현량 변화를 RT-qPCR (reverse transcriptase-quantitative PCR)을 수행하였는데, 이 때 프라이머 [서열번호 24], [서열번호 25]를 housekeeping mRNA 증폭용으로, [서열번호 26], [서열번호 27]을 GFP mRNA 증폭 용으로 활용하여 진행하였다.
[서열번호 24] 5’-TGCACTACTGGAAAACTACC-3'
[서열번호 25] 5’-TGTAGTTCCCGTCATCTTTG-3’
[서열번호 26] 5’-GAAAACACCATCACCATTC-3’
[서열번호 27] 5’-GTCTGGTAAACCAGGGACTC-3’
그 결과, 우선 sauhfq-sprX2 플랫폼을 제외한 모든 플랫폼들이 형질전환된 균주들이 대조군 균주와 비슷한 성장을 보이는 것을 확인하였다(도 3, NC:아무런 벡터도 도입되지 않은 코리네박테리움, PC: GFP 발현벡터만 도입된 재조합 코리네박테리움).
또한, 도 4에 개시된 바와 같이, ecjhfq-micC의 대장균 유래 sRNA 플랫폼과 비교하였을 때 bsuhfq-roxS 플랫폼의 경우 월등히 높은 타겟 유전자 발현 억제능을 나타내는 것을 확인 할 수 있었으며, 도 5에 개시된 바와 같이, bsuhfq 발현이 있거나 없는 경우 모두 roxS 기반 sRNA를 발현시켰을 경우, mRNA 발현 억제가 거의 없으면서 상당한 형광 단백질 억제능을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 다양한 길이의 표적 mRNA 결합 서열이 표적 유전자 발현 억제능에 미치는 영향 테스트
실시예 3를 통하여 구축한 sRNA 기반 표적 유전자 발현 억제 시스템 (pEKEx1-bsuhfq-roxS)을 다양한 조건에서 적용해보기 위하여 본래 24-bp의 염기 서열로 구성되었던 표적 mRNA 결합 서열을 다양한 길이로 변형한 후, 이에 따른 표적 유전자 발현 억제능을 테스트하고자 하였다. 본 연구진이 테스트하였던 염기서열 길이는 아래 [서열번호 29] ~ [서열번호 41]에 해당하는 16-bp ~ 40-bp로써 모두 GFP 형광단백질 발현 유전자의 개시코돈으로부터의 서열이다. 하지만, 활용 가능한 표적 mRNA 결합 서열의 길이가 위와 같은 염기서열 길이로 한정되지 않는다는 점은 해당 분야의 당업자라면 자명할 것이다. 해당 sRNA 발현 플라스미드들의 구축은 실시예 2와 동일한 방법을 통하여 수행되었다.
[서열번호 29] 5‘-atgagcaaaggagaag-3’
[서열번호 30] 5‘-atgagcaaaggagaagaa-3’
[서열번호 31] 5‘-atgagcaaaggagaagaact-3’
[서열번호 32] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttt-3’
[서열번호 33] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttttc-3’
[서열번호 34] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttttcac-3’
[서열번호 35] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttttcactg-3’
[서열번호 36] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttttcactgga-3’
[서열번호 37] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttttcactggagt-3’
[서열번호 38] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttttcactggagttg-3’
[서열번호 39] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttttcactggagttgtc-3’
[서열번호 40] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttttcactggagttgtccc-3’
[서열번호 41] 5‘-atgagcaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaa-3’
해당 합성 조절 sRNA들의 C. glutamicum 게놈 상의 표적 유전자 발현 억제능을 테스트하기 위하여, 내재적 유전자 bioD의 사이에 H36 프로모터 하에서 발현될 수 있도록 sfGFP 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하였다. 이렇게 구축된 형광 단백질 발현 균주 상에 상기 구축된 13개의 서로 다른 길이의 표적 mRNA 결합 서열을 지니는 sRNA 발현 플라스미드들(pEKEx1-bsuhfq-roxS 플랫폼 기반)을 도입한 후, 항생제가 첨가된 2mL의 BHIS (37 g/L Brain Heart Infusion (BHI), 91 g/L sorbitol) 배지에 해당 균주들을 접종하였다. 균주들은 섭씨 30도, 220rpm에서 24시간 동안 배양하였고, 동일한 조건에서 24시간 동안 계대배양 하였다. 이렇게 배양한 균주들의 sfGFP 형광단백질 발현을 측정한 결과는 도 6과 같다.
도 6에 개시된 바와 같이 표적 mRNA 결합 서열이 20, 22, 24bp일 경우 가장 발현 억제능이 높은 것을 확인하였으며, 표적 특이성 또한 높은 것이 중요하므로 아래의 실시예들에서는 24bp의 길이를 활용하여 실험을 진행하였다.
실시예 5: 코리네박테리움 게놈 상의 표적 유전자에 대한 발현 억제능 확인
5-1. lysA 유전자 발현 억제능 확인
실시예 3를 통하여 구축한 sRNA 기반 표적 유전자 발현 억제 시스템 (pEKEx1-bsuhfq-roxS)을 이용하여 코리네박테리움 게놈 상의 표적 유전자에 대한 발현 억제능을 테스트하고자 하였다. 이를 위하여 아미노산의 일종인 라이신을 과생산할 수 있는 BE 균주를 대상으로 하여 라이신 생합성 최종 단계인 diaminopimelate decarboxylase를 코딩하는 lysA 유전자를 표적으로 하였을 때 실제로 라이신 생산이 줄어드는지 테스트하고자 하였다.
먼저 lysA를 표적으로 하는 sRNA를 실시예 2와 같은 방법을 통하여 pEKEx1-bsuhfq-roxS 플라스미드 상에 구축한 후, 이를 BE 균주에 형질전환하였다. 이렇게 구축한 BE-lysA 균주를 야생형 BE 균주와 함께 플라스크 배양하였을 때의 결과는 도 7과 같다.
플라스크 배양 조건은 다음과 같다. BE 균주는 5mL BHIS (37 g/L Brain Heart Infusion (BHI), 91 g/L sorbitol) 배지에 접종하여 섭씨 30도 200 rpm에 18시간 배양하였다. 18시간 후, BHIS배지에서 배양한 균주를 25mL LM 배지 (40g/L Glucose, 1g/L K2HPO4, 1g/L KH2PO4, 1g/L urea, 20g/L (NH4)2SO4, 10g/L yeast extract, 1g/L MgSO4, 50mg/L CaCl2, 0.1mg/L Biotin, 10mg/L β-alanine, 10mg/L Thiamine-HCl, 10mg/L Nicotinic acid, 5mg/L FeSO4, 5mg/L MnSO4, 2.5mg/L CuSO4, 5mg/L ZnSO4, 2.5mg/L NiCl2, 1.5g/L CaCO3)를 포함하고 있는 300mL 배플 플라스크에 접종하여 섭씨 30도 200rpm에서 24시간 배양하였다. IPTG는 균주들을 접종할 때 함께 첨가하였다.
도 7에 개시된 바와 같이, sRNA에 의한 lysA 발현 억제로 인해 라이신의 생산이 실제로 20.7% 감소하는 것을 확인하였다.
5-2. pyc 유전자 발현 억제능 확인
또 다른 예시로써 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 균주에서 pyruvate decarboxylase를 코딩하는 pyc 유전자를 sRNA의 표적으로 하였을 때 나타나는 표현형의 변화를 관찰하고자 하였다. 기존 문헌에서는 pyc 유전자의 발현을 억제하였을 때 소듐 락테이트를 탄소원으로 하는 배지에서 C. glutamicum의 성장이 현저히 줄어든다고 보고되어 있다 (J. Park et al., Microb. Biotechnol., 2018, 17:4).
이에 따라 pyc를 표적으로 하는 sRNA를 pEKEx1-bsuhfq-roxS 플라스미드 상에 구축한 후, 이를 C. glutamicum ATCC 13032 균주에 형질전환하였다. 이렇게 구축한 WT-pyc 균주를 야생형 균주와 함께 플라스크 배양하였을 때의 결과는 도 8과 같다.
플라스크 배양 조건은 다음과 같다. 균주는 5mL BHIS(37g/L Brain Heart Infusion (BHI), 91g/L sorbitol) 배지에 접종하여 섭씨 30도 200rpm에 18시간 배양하였다. 18시간 후, BHIS배지에서 배양한 균주를 25mL CGXII 배지 (20g/L (NH4)2SO4, 5g/L urea, 1g/L KH2PO4, 1g/L K2HPO4, 0.25g/L MgSO4·7H2O, 42g/L 3-morpholinopropanesulfonic acid(MOPS), 13mg/L CaCl2·2H2O, 10mg/L FeSO4·7H2O, 14mg/L MnSO4·5H2O, 1mg/L ZnSO4·7H2O, 0.3mg/L CuSO4·5H2O, 0.02mg/L NiCl2·6H2O, 0.5mg/L biotin, 30mg/L protocatechuic acid 및 0.5mg/L thiamine)에 20g/L Sodium Lactate가 첨가된 배지를 포함하고 있는 300mL 배플 플라스크에 접종하여 섭씨 30도 200rpm에서 24시간 배양하였다. IPTG는 균주들을 접종할 때 함께 첨가하였다.
도 8에 개시된 바와 같이 sRNA에 의한 pyc 발현 억제로 인해 소듐 락테이트를 탄소원으로 하는 배지에서의 C. glutamicum의 성장이 실제로 83% 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 통하여, 본 발명에서 구축된 합성 조절 sRNA 플랫폼인 pEKEx1-bsuhfq-roxS가 C. glutamicum에서의 표적 유전자 발현 억제를 효과적으로 수행함을 확인할 수 있었다.
실시예 6: pEKEx1-bsuhfq-roxS 합성 조절 sRNA 플랫폼의 다른 균주에서의 적용
실시예 1~5을 통하여 Corynebacterium glutamicum을 대표적인 산업 그람 양성균의 표본으로 하여 그람-양성균에서 효과적으로 작동할 수 있는 합성 조절 sRNA 플랫폼의 구축에 관한 내용을 개시하였다. 본 발명자들은 더 나아가 대표적인 산업 그람-음성균인 대장균을 표본으로 하여 본 발명에서의 합성 조절 sRNA가 모든 산업용 균주에서 효과적으로 적용 가능한 범용 도구로써 활용 가능하다는 것을 증명하고자 하였다.
대장균에서의 표적 유전자의 발현 억제능을 확인하기 위하여, Streptomyces griseus의 rppA 유전자를 도입한 후, 이를 표적 유전자로 하였다. rppA 유전자에게서 발현되는 타입 III 폴리케타이드 생합성 효소는 말로닐-코에이로부터 붉은 색의 플라비올린이라는 색소를 생산한다 (Yang et al. (2018), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 115(40): 9835-9844). 따라서 본 연구진은 rppA 유전자의 발현을 억제하여 플라비올린 생산량의 변화를 살펴보고자 하였다.
이에 따라 대장균 BL21(DE3) 균주에 pTacCDFS-5’UTR-Sgr_rppA 플라스미드를 형질전환하였고, 대조군 균주로써 pEKEx1 플라스미드를 추가로 형질전환함과 동시에 테스트할 균주로써 rppA 표적 sRNA 플라스미드를 추가로 형질전환한 균주를 제작하였다. 이렇게 제작한 균주들을 LB 배지에서 배양하여 플라비올린 생산량을 측정한 결과는 도 9와 같다.
도 9에 개시된 바와 같이 pEKEx1-bsuhfq-roxS 기반 sRNA의 도입을 통하여 플라비올린 생산량이 70.8%만큼 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 대장균으로 대표되는 그람-음성균에서 역시 본 발명의 sRNA 시스템이 효율적으로 표적 유전자 발현을 억제시킬 수 있음이 확인되었다.
대장균은 대표적인 산업적 가치가 큰 그람-음성균이며, 코리네박테리움은 대표적인 산업적 가치가 큰 그람-양성균이다. 본 발명에서는 위와 같은 두 종류의 대표적 균주에서 pEKEx1-bsuhfq-roxS 시스템이 성공적으로 작동함을 보여주었으므로, 본 실시예에 개시된 바와 같이 본 발명의 합성 조절 sRNA는 모든 종류의 원핵생물에 광범위하게 적용이 가능한 범용 툴이라고 할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Novel sRNA platform for Fine-tuning gene expression of bacteria and Uses therof <130> P19-B051 <150> 10-2018-0027544 <151> 2018-03-08 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 47 <212> DNA <213> 1 <400> 1 caatttcaca caggaaacag aattcatggc taaggggcaa tctttac 47 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> 2 <400> 2 caccatatct atatctcctt gaattcatta ttcggtttct tcgctgtcc 49 <210> 3 <211> 309 <212> DNA <213> 3 <400> 3 atggctaagg ggcaatcttt acaagatccg ttcctgaacg cactgcgtcg ggaacgtgtt 60 ccagtttcta tttatttggt gaatggtatt aagctgcaag ggcaaatcga gtcttttgat 120 cagttcgtga tcctgttgaa aaacacggtc agccagatgg tttacaagca cgcgatttct 180 actgttgtcc cgtctcgccc ggtttctcat cacagtaaca acgccggtgg cggtaccagc 240 agtaactacc atcatggtag cagcgcgcag aatacttccg cgcaacagga cagcgaagaa 300 accgaataa 309 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> 4 <400> 4 caatttcaca caggaaacag aattcatggc taagggtcag tctctc 46 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> 5 <400> 5 caccatatct atatctcctt gaattcatta ctattcggtt tcctcgg 47 <210> 6 <211> 78 <212> DNA <213> 6 <400> 6 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggagctct cattttgcag atttgtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> 7 <400> 7 tatagatatc ccgcggtata ttaattaata taaacgcaga aaggccc 47 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> 8 <400> 8 tggatgatgg ggcgattcag gtatagatat cttgacaatt aatcatcggc t 51 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> 9 <400> 9 aaggtgttgc tgactcatac caggtataga tatcccgcgg tata 44 <210> 10 <211> 80 <212> DNA <213> 10 <400> 10 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggaaaag ttcttctcct ttactcattt 60 tctgttgggc cattgcattg 80 <210> 11 <211> 46 <212> DNA <213> 11 <400> 11 caatttcaca caggaaacag aattcatgaa accgattaat attcag 46 <210> 12 <211> 46 <212> DNA <213> 12 <400> 12 caaaacagcc aagcttggct gcagattatt cgagttcaag ctggac 46 <210> 13 <211> 46 <212> DNA <213> 13 <400> 13 caatttcaca caggaaacag aattcatgat tgcaaacgaa aacatc 46 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> 14 <400> 14 caaaacagcc aagcttggct gattattctt cactttcagt ag 42 <210> 15 <211> 46 <212> DNA <213> 15 <400> 15 aaaggctatt caggggtaat tttttcgggg gatccactag ttctag 46 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> 16 <400> 16 aaaagactgt tcgggggtaa cgatgtctcg agccaggcat caaataaaac 50 <210> 17 <211> 43 <212> DNA <213> 17 <400> 17 acccagtgac atgcttgggt gacgggggat ccactagttc tag 43 <210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> 18 <400> 18 gttttttctt acgatagaga gcactcgagc caggcatcaa ataaaac 47 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> 19 <400> 19 aagcgcggtt tcatatgtcg ggggatccac tagttctag 39 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> 20 <400> 20 atcccggcgc ggtttctttc tcgagccagg catcaaataa aac 43 <210> 21 <211> 80 <212> DNA <213> 21 <400> 21 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggaaaag ttcttctcct ttactcataa 60 aaaattaccc ctgaatagcc 80 <210> 22 <211> 78 <212> DNA <213> 22 <400> 22 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggaaaag ttcttctcct ttactcattc 60 acccaagcat gtcactgg 78 <210> 23 <211> 79 <212> DNA <213> 23 <400> 23 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggaaaag ttcttctcct ttactcatac 60 atatgaaacc gcgcttatc 79 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> 24 <400> 24 tgcactactg gaaaactacc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> 25 <400> 25 tgtagttccc gtcatctttg 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> 26 <400> 26 gaaaacacca tcaccattc 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> 27 <400> 27 gtctggtaaa ccagggactc 20 <210> 28 <211> 312 <212> DNA <213> 28 <400> 28 atggctaagg gtcagtctct ccaggaccca ttcttgaacg cactgcgtcg cgaacgcgtg 60 cccgtgtcca tctatctggt gaacggtatt aaacttcagg gacagatcga gtccttcgat 120 cagtttgtta tcctgctcaa gaacacggtc tcccagatgg tatacaagca tgcgatttca 180 accgttgtcc cttcccgccc ggtgtctcac cactcgaaca atgccggcgg cggcacctcc 240 tccaactacc accacggcag cagcgcccaa aacacttccg cacagcagga ttccgaggaa 300 accgaatagt aa 312 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> 29 <400> 29 atgagcaaag gagaag 16 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> 30 <400> 30 atgagcaaag gagaagaa 18 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> 31 <400> 31 atgagcaaag gagaagaact 20 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> 32 <400> 32 atgagcaaag gagaagaact tt 22 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> 33 <400> 33 atgagcaaag gagaagaact tttc 24 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> 34 <400> 34 atgagcaaag gagaagaact tttcac 26 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> 35 <400> 35 atgagcaaag gagaagaact tttcactg 28 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> 36 <400> 36 atgagcaaag gagaagaact tttcactgga 30 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> 37 <400> 37 atgagcaaag gagaagaact tttcactgga gt 32 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> 38 <400> 38 atgagcaaag gagaagaact tttcactgga gttg 34 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> 39 <400> 39 atgagcaaag gagaagaact tttcactgga gttgtc 36 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> 40 <400> 40 atgagcaaag gagaagaact tttcactgga gttgtccc 38 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> 41 <400> 41 atgagcaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa 40

Claims (15)

  1. (i) sprX2, roxS, arnA, surA, ASdes, ASpks, AS1726, AS1890, Mcr1~19, Mpr1~21, B11, B55, C8, F6, G2, ncRv12659, fsrA, crcZ, SR1, 6S-1, ncr1175, ncr982, ncr1241, ncr1015, ncr1241, ncr1575, ncr952, ncr629, cgb_03605, cgb_00105, cgb_20715, IGR-1~12, AS-1~12, sgs2672, sgs3323, sgs3618, sgs4453, sgs4827, sgs2746, sgs3903, sgs4581, sgs5362, sgs5676, sgs6100, sgs6109, scr1906, scr2101, scr3261, scr3261, α3287, scr3558, scr3974, scr4677 및 scr5676로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합부위(Hfq binding site) 및
    (ii) 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역을 포함하는 원핵생물에서 유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA
    여기서, 상기 Hfq 결합부위와 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역은 자연에서는 서로 연결되어 있지 않는 것을 특징으로 함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역은 표적 유전자 mRNA의 리보좀 결합 부위 (Ribosome binding site)의 시작부터 유전자 코딩 서열(coding sequence)의 끝까지에 해당하는 핵산 서열과 전체적으로 또는 부분적으로 상보적 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 sRNA.
  3. 제1항에 있어서, 상기 원핵생물은 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다(Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 멘하이미아(Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium),코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)으로 구성되는 군 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 sRNA.
  4. 제1항의 sRNA를 코딩(encoding)하는 핵산.
  5. 제4항의 핵산이 복제 가능한 형태로 도입되어 있는 재조합 원핵생물.
  6. 제1항의 sRNA를 코딩(encoding)하는 핵산을 포함하는 발현벡터.
  7. 제6항의 발현벡터로 형질전환된 재조합 원핵생물.
  8. 제4항의 핵산 및 원핵생물 유래 Hfq를 코딩하는 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 상기 원핵생물 유래 Hfq는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다(Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 멘하이미아(Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium),코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군 중 어느 하나에서 유래한 것을 특징으로 하는 Hfq.
  10. 제8항의 핵산이 복제 가능한 형태로 도입되어 있는 재조합 원핵생물.
  11. 제4항의 핵산 및 원핵생물 유래 Hfq를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터.
  12. 제11항의 발현벡터가 도입되어 있거나, 제6항의 발현벡터와 원핵생물 유래 Hfq를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 원핵생물.
  13. 제12항의 재조합 원핵생물을 배양하여 표적 유전자의 mRNA를 억제하는 단계를 포함하는 원핵생물에서 표적 유전자의 발현 억제 방법.
  14. 다음 단계를 포함하는 유용물질 생산을 위한 결실대상 유전자의 스크리닝 방법:
    (a) 제13항의 방법을 사용하여 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 존재하고, 유용물질 생합성 경로에 참여하는 유전자들 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현을 억제시키는 단계; 및
    (b) 상기 발현 억제에 따라 유용물질 생산수율이 향상되는 경우, 발현을 억제시킨 유전자를 유용물질 생산을 위한 결실대상 유전자로 선정하는 단계.
  15. 제14항의 방법에 의해 스크리닝된 유전자 또는 스크리닝된 유전자의 조합을 결실시켜 재조합 균주를 제조하는 단계를 포함하는 유용물질 생산균주의 개량방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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