PL222067B1 - Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor ekspresyjny, komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny, szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania polipeptydu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor ekspresyjny, komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny, szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania polipeptydu. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy stabilnej ekspresji białek rekombinowanych bez konieczności stosowania antybiotyków. W szczególności stabilna ekspresja białek rekombinowanych uzyskiwana z wykorzystaniem szczególnie wydajnego systemu polimeraza/promotor faga T7.

Zaledwie niewielki procent białek organizmów żywych występuje w komórkach w ilości wystarczającej, by umożliwić ich bezpośrednią izolację na dużą skalę. Możliwość produkcji w systemach prokariotycznych polipeptydów, których pozyskiwanie z naturalnych źródeł było trudne lub kosztowne spowodowało przełom w biotechnologii. Do produkcji tych polipeptydów od lat osiemdziesiątych powszechnie stosuje się układy oparte na użyciu obcych dla gospodarza zależnych od DNA polimeraz RNA, do których wprowadza się wektory z promotorami rozpoznawanymi przez te polimerazy. Jednym z najczęściej wykorzystywanych systemów tego typu jest układ, w którym polimeraza faga T7 rozpoznaje promotor faga T7. W układzie tym sekwencja kodująca polimerazę znajduje się w chromosomie bakteryjnym, a rozpoznawana sekwencja promotora jest obecna w wektorze ekspresyjnym.

Taki układ ekspresyjny, wektor i sposób ekspresji docelowego polipeptydu przedstawiono na przykład w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych nr nr 4,952,496 i 5,693,489. W rozwiązaniu opisanym w cytowanych opisach patentowych do komórki gospodarza, takiego jak Escherichia coli, zawierającego gen kodujący polimerazę RNA z faga T7 wprowadza się wektor zawierający docelowy gen związany funkcjonalnie z promotorem rozpoznawanym przez polimerazę RNA z faga T7 i hoduje się komórki gospodarza w znanych warunkach umożliwiających ekspresję.

W wielu wypadkach układ ten okazuje się bardzo wydajny dzięki zastosowaniu silnego promotora faga T7 oraz niezwykle selektywnej i aktywnej polimerazy faga T7. W pełni indukowany system pozwala na uzyskanie wysokiego poziomu ekspresji polipeptydów sięgającego nawet 50% ogólnej produkcji białek syntetyzowanych przez komórki [Metlitskaia L, Cabralda JE, Suleman D, Kerry C, Brinkman J, Bartfeld D, Guarna MM, Recombinant antimicrobial peptides efficiently produced using novel cloning and purification processes, Biotechnol Appl Biochem., (2004 Jun); 39(Pt 3):339-45]. Jednak napotyka się tu także pewne problemy. Jednym z nich jest zmniejszający się w czasie poziom ekspresji docelowego polipeptydu, którego produkcja zachodzi z promotora faga T7. Z problemem tym zmagano się bezskutecznie od początku stosowania systemu wykorzystującego promotor faga T7.

Początkowo sądzono, że obniżanie poziomu ekspresji białka jest spowodowane utratą lub mutacją plazmidu niosącego gen docelowego polipeptydu. W celu ograniczenia niedogodności związanych z optymalizacją ekspresji białek proponowano testowanie bakterii i ich ocenę odnośnie zdolności do wysokiej ekspresji [Studier F W, Moffatt BA, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. (1986) 189; 113-130; Studier FW, Rosenberg AH, Dunn JJ, Dubendorff JW, Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Meth. Enzymol. (1990) 185: 60-89].

Główną przyczynę zmniejszania się w czasie poziomu ekspresji docelowego polipeptydu po raz pierwszy zbadali i opisali Vethanayagam i wsp. [Vethanayagam JG and Flower AM, Decreased gene expression from T7 promoters may be due to impaired production of active T7 RNA polymerase, Microb Cell Fac. (2005 Jan 7); 4:3]. Jest ona związana z pojawiającymi się chromosomalnymi mutacjami w obrębie sekwencji kodującej obcą dla gospodarza zależną od DNA polimerazę RNA faga T7.

Innym problemem w stosowanym układzie ekspresyjnym opartym o działanie systemu polimeraza/promotor faga T7 jak również w innych systemach do ekspresji jest powszechne użycie, genów oporności na antybiotyki. Geny te znajdują się w obrębie wektorów ekspresyjnych i są używane jako markery selekcyjne zarówno do selekcji podczas klonowania jak i namnażania szczepów z wprowadzonym rekombinowanym DNA. Wynika z tego konieczność stosowania antybiotyków w trakcje hodowli tych szczepów. Potrzeba stosowania antybiotyków znacząco wpływa na wzrost kosztów produkcji docelowego białka ze względu na koszt samego odczynnika, jak również koszt utylizacji ścieków pohodowlanych.

W zgłoszeniu patentowym PL 379 905 (opubl. 2007-12-10) opisano kasetę i wektor dla układu ekspresyjnego promotor/polimeraza faga, gdzie promotor fagowy reguluje syntezę docelowego polipeptydu i produkuje białkowy czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie prokariotycznego gospodarza. Pozwala to na eliminację komórek, w których nie zachodzi ekspresja spod promotora fagowego.

PL 222 067 B1

Przedstawiono także komórkę prokariotycznego gospodarza zawierającą wektor, sposób otrzymywania polipeptydu oraz zastosowanie kasety.

Zmniejszający się w czasie poziom ekspresji białek rekombinowanych oraz konieczność stosowania antybiotyków w trakcje prowadzenia hodowli bakteryjnych sprawiają że konwencjonalny system do ekspresji wykorzystujący polimerazę/promotor faga T7 nie jest korzystnym wyborem przy planowaniu produkcji na skalę przemysłową.

Wynalazek rozwiązuje wskazane wyżej problemy i umożliwia stabilną ekspresję docelowego polipeptydu. Stabilną ekspresję białek rekombinowanych uzyskuje się bez konieczności stosowania antybiotyków.

Nieoczekiwanie okazało się, że konstrukcja kasety zapewnia ekspresję docelowego polipeptydu w komórce prokariotycznego gospodarza na poziomie nie niższym niż w standardowo wykorzystywanym układzie zawierającym sam promotor faga T7. Jest to możliwe, ponieważ charakterystyczna dla promotora faga, zwłaszcza T7, wysoka ekspresja skierowana jest głównie na docelowy polipeptyd. Z drugiej strony poziom ekspresji czynnika selekcyjnego jest na drodze doświadczalnej optymalnie dobrany, tzn. jest na tyle wysoki, że umożliwia przeżycie komórce gospodarza, a jednocześnie na tyle niski, że jego symultaniczna ekspresja nie powoduje zmniejszenia ekspresji białka docelowego. Zostało to osiągnięte przez obecność terminatora transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe przed 5' końcem genu kodującego czynnik selekcyjny, a w korzystnym wariancie przez włączenie, przed terminatorem transkrypcji, kodonu stop translacji. Dodatkowo na końcu 5' umieszczono oryginalnie wyznaczoną w trakcie przeprowadzonych doświadczeń niekodującą część sekwencji genu kodującego czynnik selekcyjny (część zawierająca sekwencję Shine-Dalgarno) dla genu aroA. W dostępnej literaturze podawana jest sekwencja Shine-Dalgarno (SD) dla genu aroA [Dunkan K., Coggins J.R. The serC-aroA operon of Escherichia coli A mixed function poeron encoding enzymem from two different aminoacid biosynthetic pathways. (1986) Biochem. J.], która zastosowana w wynalazku/opisywanej kasecie ekspresyjnej nie spełnia swojej funkcji. Dodatkowo wyznaczona niekodująca część sekwencji genu kodującego czynnik selekcyjny była modyfikowana, tak aby uzyskać wariant sekwencji zapewniający optymalny poziom ekspresji genu aroA kodującego białko EPSPS. Opracowano również wariant syntetycznej sekwencji tego typu. Zapewnia on również ekspresję białka EPSPS na odpowiednim poziomie.

Zgodnie z wynalazkiem problem stabilnej wysokiej ekspresji, oraz brak konieczności stosowania presji antybiotykowej w układach, w których stosuje się zależną od DNA polimerazę RNA oraz promotor rozpoznawany przez tę polimerazę, rozwiązano przez opracowanie układu, w którym polimeraza ta rozpoznaje promotor regulujący zarówno syntezę docelowego polipeptydu, jak i czynnika selekcyjnego, warunkującego przeżycie gospodarza. W związku z tym, selekcjonowane są w hodowli prowadzonej z wykorzystaniem opracowanego systemu tylko komórki, które niosą plazmid i jednocześnie mają sprawny układ polimeraza/promotor faga T7. Czynnik selekcyjny, którego produkcja jest uzależniona od sprawnego funkcjonowania systemu polimeraza/promotor faga T7 stanowi związek chemiczny komplementujący defekt genetyczny komórki gospodarza.

Stwierdzono, że kaseta według wynalazku spełnia swoją funkcję, jeśli produkcja czynnika selekcyjnego odbywa się tylko pod kontrolą promotora faga rozpoznawanego specyficznie przez polimerazę faga. Stąd przed 5' końcem genu kodującego czynnik selekcyjny wklonowano terminator transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe. Zapobiega on ekspresji genu kodującego czynnik selekcyjny z promotorów niefagowych obecnych na wektorze ekspresyjnym i rozpoznawanych przez polimerazy gospodarza. Włączenie sekwencji kodującej czynnik selekcyjny tak, aby jego ekspresja zależała wyłącznie od promotora faga powoduje zaprzestanie produkcji tego niezbędnego do przeżycia komórki białka i eliminację komórek, które na skutek mutacji utraciły zdolność produkcji funkcjonalnej polimerazy i/lub, w których w wyniku mutacji, stracił funkcjonalność promotor faga.

Przedmiotem wynalazku jest kaseta ekspresyjna zawierająca promotor fagowy i sekwencję kodującą polipeptyd docelowy, gdzie kaseta jest przedstawiona wzorem P-X-(S)bT-M, w którym P oznacza sekwencję promotora fagowego, X oznacza sekwencję docelową, S oznacza kodon stop translacji, b = 1 (obecny) lub b = 0 (nieobecny) w sekwencji kasety, T oznacza terminator transkrypcji dla promotorów innych niż promotory fagowe, a M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, i w której kodon stop translacji S znajduje się na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji T, i w którym sekwencja M, kodująca czynnik selekcyjny, umieszczona w kasecie, charakteryzująca się tym, że jest sekwencją kodującą białko będące czynnikiem selekcyjnym wybranym z grupy zawierającej markery komplementujące

PL 222 067 B1 defekt genetyczny komórki gospodarza lub ich funkcjonalny fragment, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny stanowi sekwencję aroA, przy czym gospodarzem dla wektora zawierającego kasetę jest szczep E. coli BL21(DE3) z funkcjonalną delecją genu aroA, przy czym kaseta jest przedstawiona na fig. 1.

Korzystnie, gdy sekwencja kodująca czynnik selekcyjny posiada zmodyfikowaną niekodującą część na końcu 5' zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno, w taki sposób, że po transkrypcji do mRNA jest gorzej rozpoznawalna przez rybosomy, przy czym korzystnie wspomniana sekwencja Shine-Dalgarno jest niekodującą częścią genu aroA, który koduje 1-karboksywinylotransferazę 3-fosfoszikimianową (EPSPS).

Korzystnie, gdy sekwencja aroA posiada zmodyfikowaną niekodującą część na końcu 5', zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno, w taki sposób, że po transkrypcji do mRNA jest gorzej rozpoznawalna przez rybosomy, korzystnie wspomniana sekwencja Shine-Dalgarno jest niekodującą częścią genu aroA, który koduje 1-karboksywinylotransferazę 3-fosfoszikimianową (EPSPS).

Korzystnie, gdy terminator transkrypcji promotorów innych niż promotor fagowy jest terminatorem trypotofanowym.

Korzystnie, gdy zawiera promotor wybrany z grupy zawierającej promotory fagowe T7, T3, T5 oraz SP6, korzystnie promotor fagowy T7.

Korzystnie, gdy promotor fagowy jest połączony z nukleotydowym segmentem, którego sekwencja przedstawiona jest na fig. 1 i jako SEQ ID NO: 17, 18.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kasety ekspresyjnej przedstawionej wzorem P-X-(S)bT-M, w którym P oznacza sekwencję promotora fagowego, X oznacza sekwencję docelową, S oznacza kodon stop translacji, b = 1 (obecny) lub b = 0 (nieobecny) w sekwencji kasety, T oznacza terminator transkrypcji dla promotorów innych niż promotory fagowe, a M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, i w którym kodon stop translacji S znajduje się na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji T, i w którym sekwencja M, kodująca czynnik selekcyjny, umieszczona w kasecie, jest sekwencją kodującą białko będące czynnikiem selekcyjnym wybranym z grupy zawierającej markery komplementujące defekt genetyczny komórki gospodarza lub ich funkcjonalny fragment, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny jest sekwencją genu aroA, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny aroA jest sekwencją kodującą 1-karboksywinylotransferazę 3-fosfoszikimianową (EPSPS).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny, charakteryzujący się tym, że zawiera kasetę ekspresyjną określoną powyżej.

Korzystnie, gdy wektor jest wybrany spośród wektorów: pIGKesAroAPA, pIGKesAroAPA-G, pIGKesAroAPA-AGG i/lub pIGKesAroAPA-Km.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny określony powyżej.

Korzystnie, gdy jest nią komórka prokariotycznego gospodarza niosąca gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy.

Korzystnie, gdy jest nią komórka E. coli, korzystnie szczep E. coli BL21(DE3^aroA.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczep bakteryjny, charakteryzujący się tym, że stanowi szczep bakterii E. coli, który pełni funkcję gospodarza, w którym zachodzi ekspresja białka rekombinowanego i białka komplementującego defekt genetyczny gospodarza i, że gospodarzem jest odpowiednio zmodyfikowany szczep E. coli BL21(DE3), a zwłaszcza szczep BL21(DE3^aroA.

Korzystnie, gdy wybranym genem chromosomalnym, którego przeprowadzono delecję jest gen aroA, względnie szczep bakteryjny z delecją innego genu o ile spełniony będzie warunek, że jest to gen z grupy genów, których produkt jest niezbędny do życia komórce, kodujący 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, przy czym białko EPSPS jest zbudowane z 428 aminokwasów, a jego masa molekularna wynosi 46200 Da i że białko EPSPS bierze udział w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych: L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-fenyloalaniny.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu w prokariotycznym gospodarzu w układzie promotor/polimeraza faga, charakteryzujący się tym, że sposób składa się z hodowania komórek prokariotycznego gospodarza zawierających: a) wektor ekspresyjny z kasetą ekspresyjną przedstawioną wzorem P-X-(S)bT-M, w którym w której P oznacza sekwencję promotora fagowego, X oznacza sekwencję docelową, S oznacza kodon stop translacji, b = 1 (obecny) lub b = 0 (nieobecny) w sekwencji kasety, T oznacza terminator transkrypcji dla promotorów innych niż promotory fagowe, a M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza

PL 222 067 B1 ekspresjonującego polipeptyd docelowy, i w którym kodon stop translacji S znajduje się na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji T, i w którym sekwencja M, kodująca czynnik selekcyjny, umieszczona w kasecie, jest sekwencją kodującą białko będące czynnikiem selekcyjnym wybranym z grupy zawierającej markery komplementujące defekt genetyczny komórki gospodarza lub ich funkcjonalny fragment, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny jest sekwencją genu aroA, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny aroA jest sekwencją kodującą EPSPS oraz b) gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach umożliwiających ekspresję docelowego polipeptydu i czynnika selekcyjnego i jednocześnie zahamowanie wzrostu i eliminację komórek, w których brak ekspresji kontrolowanej promotorem fagowym.

W przeprowadzonych doświadczeniach, których wyniki stały się podstawą do opracowania wynalazku, użyto wektor plazmidowy zawierający promotor pochodzący z faga T7. Do wektora tego włączono opisaną kasetę ekspresyjną. Uzyskano wektor ekspresyjny umożliwiający wydajną i stabilną ekspresję białka rekombinowanego bez konieczności stosowania presji antybiotykowej w komórkach E. coli BL21(DE3^aroA. Wektorem ekspresyjnym użytym do włączenia kasety ekspresyjnej może być dowolny plazmid utrzymujący się w danym gospodarzu. Wektor taki musi posiadać odpowiedni promotor. Promotorem takim może być dowolny promotor zarówno konstytutywny jak i indukowany jednakże musi to być promotor z grupy promotorów odczytywanych przez polimerazy nie pochodzące z bakterii. Na końcu 3' sekwencji promotora według wynalazku znajduje się opisana kaseta ekspresyjna umożliwiająca wydajną i stabilną ekspresję białka docelowego. Równocześnie pod kontrolą tego promotora odbywać się będzie ekspresja czynnika komplementującego defekt genetyczny gospodarza.

Opracowywano nowy szczep bakterii E. coli, który pełni funkcje gospodarza. Szczep ten posiada cechy konieczne dla prawidłowego funkcjonowania opracowanego systemu.

Gospodarzem jest odpowiednio zmodyfikowany szczep E. coli BL21(DE3). Jest to szczep BL21(DE3^aroA.

Szczep E. coli BL21(DE3) i jego pochodne zawierają wprowadzony do chromosomu gen kodujący polimerazę RNA faga T7 pod kontrolą promotora lacUV5, rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA. Transkrypcja z promotora lacUV5 jest indukowana przez IPTG. Pomiędzy promotorem a genem kodującym polimerazę RNA T7 znajduje się sekwencja operatorowa, wiążąca białko represorowe blokujące inicjację transkrypcji. Dopiero po związaniu represora z IPTG, co prowadzi do utraty powinowactwa białka do miejsca operatorowego, może rozpocząć się transkrypcja genu polimerazy fagowej. W przypadku wykorzystywania tego systemu do produkcji na dużą skalę korzystne jest zastosowanie alternatywnej metody indukcji, tzw. autoindukcji [Studiem F. W. Protein production by auto-induction In high density shaking cultures. Protein Expo. Purif. 41, 207-234 (2005)]. Jest to metoda oparta na zdolności bakterii do wykorzystywania różnych źródeł węgla i do negatywnej regulacji ekspresji genów na drodze represji katabolicznej. Polimeraza fagowa transkrybuje gen w wektorze ekspresyjnym znajdujący się pod kontrolą promotora rozpoznawanego przez polimerazę RNA T7.

Szczepowi E. coli BL21(DE3) nadano cechy umożliwiające wykorzystanie go w zastrzeganym układzie ekspresyjnym. Osiągnięto to dzięki wprowadzeniu funkcjonalnej delecji jednego z genów chromosomalnych komórki, będącego przykładowym genem z grupy genów, których produkty są niezbędne do przeżycia komórce przy zastosowaniu określonych warunków hodowli. Spowodowało to defekt metaboliczny. W związku z tym defektem jeden lub więcej metabolitów istotnych dla życia komórki nie jest syntetyzowany.

Wybranym genem chromosomalnym, którego przeprowadzono delecję jest gen aroA, kodujący 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (inna nazwa to 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS). Białko EPSPS jest zbudowane z 428 aminokwasów, masa molekularna wynosi 46200 Da. Białko EPSPS bierze udział w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych: L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-fenyloalaniny. Jest to gen, którego produkt białkowy jest niezbędny do przeżycia komórce bakterii. Inaktywacja genu AroA kodującego białko EPSPS prowadzi do bezwzględnej auksotrofii [Monitoring of gene knockout: genome-wide of conditionally essential genes. Lisa K Smith, et al.]. Bakterie z funkcjonalną delecją genu aroA wymagają do wzrostu obecności w podłożu aminokwasów aromatycznych: L-tryptofanu, L-tyrozyny i L-fenyloalaniny oraz związków aromatycznych: kwasu 4-hydroksybenzoesowego, kwasu 4-aminobenzoesowego i kwasu 2,3-dihydroksybenzoesowego. Gen aroA jest przykładowym genem, którego delecja prowadzi do uzyskania szczepu E. coli o nowych właściwościach. W literaturze nie pojawiły się dotychczas doniesienia o uzyskaniu bakterii E. coli szczepu BL21(DE3) z funkcjonalną delecją genu aroA. Również nie pojawiły się dotychczas doniesienia świadczące o wykorzystywaniu bakterii E. coli, w szczególności E. coli szczepu BL216

PL 222 067 B1 (DE3), z delecją w tym genie, ani innym genie powodującym uzyskanie mutantów auksotroficznych, do stabilnej ekspresji białek rekombinowanych oraz selekcji komórek ekspresjonujących białka rekombinowane. Po wprowadzeniu na drodze transformacji wektora ekspresyjnego z kasetą ekspresyjną do komórek E. coli BL21(DE3^aroA, w szczepie tym zachodzi ekspresja białka docelowego oraz białka EPSPS pod kontrolą promotora faga T7. Dzięki ekspresji białka EPSPS warunkowanej prawidłowym funkcjonowaniem systemu polimeraza/promotor T7 możliwa jest stabilna ekspresja białek docelowych dzięki selekcji komórek ekspresjonujących białka docelowe i czynnik selekcyjny. Zasada ta spełnia pierwsze z założeń wynalazku.

W efekcie uzyskano system składający się z wektora ekspresyjnego i odpowiednio przystosowanej komórki gospodarza (szczep bakteryjny), którą jest odpowiednio przystosowany szczep E. coli BL(21)DE3. Dzięki układowi możliwe jest otrzymanie stabilnej w czasie ekspresji białka docelowego. Stabilna w czasie ekspresja białka docelowego zwiększa wydajność produkcji tego białka z danej objętości podłoża hodowlanego, tym samym zmniejszając w istotny sposób koszt jego produkcji.

Drugą zaletą opracowanego systemu jest brak konieczności wykorzystywania genów warunkujących oporność na antybiotyki jako markerów selekcyjnych koniecznych do utrzymywania plazmidów w komórce. Pozwala to na spełnienie wymogów bezpieczeństwa dotyczących nie rozprzestrzeniania w środowisku genów odpowiedzialnych za oporność na antybiotyki. Dodatkowo unika się problemu polegającego na tym, iż w niektórych zastosowaniach terapeutycznych oczyszczonego białka stosowanie antybiotyków może być niepożądane. Brak konieczności stosowania presji antybiotykowej na jakimkolwiek etapie procesu fermentacji znacznie obniży koszty ewentualnej produkcji białka rekombinowanego na skalę przemysłową. Eliminowany jest również dzięki temu problem i koszt utylizacji ścieków zawierających antybiotyki. Możliwość prowadzenia hodowli i uzyskiwania wydajnej ekspresji białek rekombinowanych zgodnie z opisywanym wynalazkiem spełnia drugie z założeń wynalazku.

Dzięki proponowanemu wynalazkowi możliwe będzie użycie niezwykle wydajnego systemu do produkcji białek rekombinowanych polimeraza/promotor fga T7, nie tylko w skali laboratoryjnej, jak to miało miejsce do tej pory, ale również przy produkcji na skalę przemysłową.

Wybór genu chromosomalnego E. coli, którego przeprowadzono funkcjonalną delecję nie jest przypadkowy jak również nie jest oczywisty. Prowadzono szereg prób dotyczących uzyskania optymalnego wariantu szczepu do systemu będącego przedmiotem wynalazku. Trudność dotycząca wyboru odpowiedniego genu lub grupy genów wynika to z kilku powodów. Po pierwsze mimo, iż kompletna sekwencja genomu E. coli została ustalona dla dwu różnych szczepów bakteryjnych MG1665 i W3110 [Aiba H., Baba T., Hayashi H., Inada T., Isono K., Itoh T., Kasai H., Kashimoto K., Kiura S., Kitakawa M. (996) A 570-kb DNA sequence of the Escherichia coli K-12 genome corresponding to the 28.0-40.1 min region on the linkage map. DNA Res., 3:363-377; Ithon T., Aiba H., Baba T., Hayashi K., Inada T., Isono K., Kasai H., Kiura S., Kitakawa M., (1996) A 460-kb DNA sequence of the Escherichia coli K-12 genome corresponding to the 40.1-50.0 min region on the linkage map. DNA Res., 3:379-392; Oshima T., Aiba H., Baba T., Fujita K., Hayashi K., Honjo A., Ikemoto K., Inada T., Itoh T., Kajihara M., (1996) A 718-kb DNA sequence of the Escherichia coli K-12 genome corresponding to the 12.7-28.0 min region on the linkage map. DNA Res., 3:137-155; Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.A., Perna N., Burland V., Rile M., Collado-Vides J., Glasner J.D., Rode C.K., Mayhew G.F. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science, 277:1453-1474; Yamamoto Y., Aiba H., baba T., Hayashi K., Inada T., Isono K., Itoh T., Kiura S., Kitagawa M., Makino K. (1997) Construction of a contigous 874-kb sequence of the Escherichia coli K-12 genome corresponding to 50.0-68.8 min on the linkage map and analysis of its sequence features. DNA Res., 4:91-113], przypisanie funkcji produktom białkowym wszystkich genów nie zostało jak dotąd osiągnięte [Mori H., (2004) From teh sequence to Cell modeling: Comprehensive Functional Genomics In Escherichia coli. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 37:83-92]. Stąd wyłączenie funkcji danego genu może nie spowodować oczekiwanego przerwania określonej ścieżki metabolicznej. Po drugie fakt, iż nie do końca poznane są funkcje genów wiąże się z tym, że w momencie ingerencji spowodujemy nieoczekiwane i niepożądane zaburzenie interakcji szlaków metabolicznych nie bezpośrednio związanych z wyłączanym genem.

Po trzecie wprowadzamy mutację do szczepu E. coli BL21(DE3), który jest szczepem znacznie zmodyfikowanym w stosunku do szczepu dzikiego E. coli. Posiada on szereg mutacji w chromosomie. Są to mutacje w genach lon i ompT. Dodatkowo, jak wspomniano wyżej, szczep ten ma włączony do chromosomu gen kodujący polimerazę RNA faga T7, pod kontrolą promotora lacUV5, rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA. Wyłączenie kolejnego genu, w szczególności genu z grupy gePL 222 067 B1 nów, których produkty są niezbędne do życia komórce, może prowadzić do znaczącego pogorszenia przebiegu procesów komórkowych. Konsekwencją przeprowadzonych zabiegów może być uzyskanie szczepu nie przydatnego do założonego zastosowania jakim jest uzyskanie wydajnej ekspresji białka rekombinowanego.

Poniżej przedstawiono opis próby delecji jednego z genów, z grupy genów, których produkty są niezbędne do życia komórce, zakończoną niepowodzeniem. Potwierdza to fakt iż wybór genu, którego przeprowadzamy delecję w celu uzyskania gospodarza do stabilnej ekspresji nie jest oczywisty i przypadkowy.

Przykładem genu u którego podjęto próbę przeprowadzenia funkcjonalnej delecji w celu otrzymania dogodnego szczepu do opracowanego systemu ekspresji, jest gen asd kodujący dehydrogenazę β-semialdehydu asparaginianowego. Dehydrogenaza β-semialdehydu asparaginianowego stanowi enzym wspólny dla ścieżek syntezy aminokwasów z rodziny kwasu asparaginowego (asparagina, metionina, treonina, lizyna). Białko to jest kodowane przez gen asd, który zgodnie z danymi literaturowymi występuje w chromosomie E. coli w pojedynczej kopii. W efekcie przeprowadzonych doświadczeń, przy zastosowaniu danych warunków wykazano, że nie było możliwe uzyskanie E. coli szczepu BL21(DE3) z funkcjonalną delecją w genie asd. Wykluczono fakt, iż nie możność uzyskania mutantów asd E. coli szczepu BL21(DE3) wynikała z merytorycznie błędnie zaprojektowanego doświadczenia. W tym celu prowadzono równolegle mutagenezę genu asd szczepów E. coli MG1665, TOP10F' i BL21(DE3). Mutanty E. coli w genie asd uzyskiwano i utrzymywano przy życiu za każdym razem dla szczepów E. coli MG1665, TOP10F', natomiast nigdy dla BL21(DE3). Na otrzymany wynik może mieć wpływ mutacja chromosomalna lon oryginalnie występująca w chromosomie szczepu BL21(DE3). Jednym ze skutków tej mutacji jest nadprodukcja mukopolisacharydów przez komórki bakteryjne [Philips i wsp. 1984 MGR KASI]. Poddawany mutagenezie gen asd, koduje białko biorące udział w szlaku biosyntezy kwasu diaminopimelinowego. Związek ten podobnie jak mukopolisacharydy występuje w ścianie komórkowej bakterii. Być może wprowadzenie mutacji w kolejnym genie E. coli szczepu BL21(DE3) związanym z budową ściany komórkowej tych bakterii stanowiło by zbyt duże obciążenie dla komórki.

Odpowiednim czynnikiem selekcyjnym warunkującym przeżycie gospodarza jest czynnik białkowy, którego brak ekspresji w komórce powoduje jej śmierć. Takim defektem może być defekt metaboliczny, który powoduje, że jeden lub więcej metabolitów istotnych dla życia komórki nie jest syntetyzowanych.

Korzystna jest sekwencja kodująca białkowy czynnik selekcyjny wybrany z grupy obejmującej czynnik, zwłaszcza białko, fragment białka, czy białka hybrydowe które komplementują defekt genetyczny gospodarza, albo ich funkcjonalny fragment.

Określenie „funkcjonalny fragment” oznacza część genu kodującą polipeptyd lub białko o właściwościach czynnika selekcyjnego.

Przed końcem 5' końcu sekwencji kodującej czynnik selekcyjny, który w opracowanej kasecie stanowi EPSPS produktem genu aroA, umieszczono niekodujący rejon tego genu zawierający sekwencję Sine-Dalgarno (SD), lub jej syntetyczny odpowiednik. Początkowo sekwencję tą dla genu aroA wyznaczono na podstawie danych literaturowych [Dunkan K., Coggins J.R. The serC-aroA operon of Escherichia coli A mixed function poeron encoding enzymem from two different aminoacid biosynthetic pathways. (1986) Biochem. J.]. Okazało się, że nie można uzyskać optymalnego poziomu ekspresji białka EPSPS przy zastosowaniu tej sekwencji. Na drodze doświadczalnej wyznaczono rejon przed genem aroA zawierający sekwencję SD, dodatkowo wprowadzając modyfikacje 5' końca tego regionu. Dzięki tym zabiegom uzyskano optymalny z punktu widzenia funkcjonowania opracowanego systemu poziom ekspresji czynnika selekcyjnego, tzn. poziom ekspresji czynnika selekcyjnego jest na tyle wysoki, że umożliwia przeżycie komórce gospodarza, a jednocześnie na tyle niski, że jego symultaniczna ekspresja z białkiem docelowym nie powoduje zmniejszenia ekspresji białka docelowego.

W celu ustalenia dogodnej, niekodującej sekwencji przed genem aroA, zawierającej sekwencję SD, sprawdzono działanie systemu z użyciem 4 różnych sekwencji przyłączanych do 5' sekwencji kodującej czynnik selekcyjny: SEQ. ID NO 17, 18, 19, 20.

Korzystne z punktu widzenia wynalazku okazało się użycie sekwencji: SEQ. ID NO 18, 19.

Przykładami sekwencji kodujących czynnik selekcyjny komplementujący defekt genetyczny gospodarza są sekwencje kodujące np. białka niezbędne do przeżycia komórce gospodarza. Mogą to być białka komplementującego auksotrofię bakterii.

PL 222 067 B1

Korzystna jest sekwencja genu aroA kodująca EPSPS.

Szczególnie korzystna jest sekwencja aroA kodująca czynnik oporności na EPSPS, posiadająca zmodyfikowaną część niekodującą na końcu 5', zawierającą region przed genem aroA obejmujący sekwencję Shine-Dalgarno, zmodyfikowaną tak aby była rozpoznawana na mRNA przez rybosomy dając optymalny poziom ekspresji EPSPS.

Odpowiednim terminatorem transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe jest terminator zdolny zapobiec ekspresji czynnika selekcyjnego, warunkującego przeżycie gospodarza, z promotorów obecnych na wektorze ekspresyjnym i rozpoznawanych przez polimerazy bakteryjnego gospodarza.

Sekwencja terminatora transkrypcji może być naturalna lub syntetyczna. Jest korzystnie, jeśli przed 5'-końcem terminatora transkrypcji znajduje się kodon stop translacji.

W korzystnym przykładzie wykonania kaseta zawiera terminator tryptofanowy [Molecular Cell Biology Darnell J. Loodish H., Baltimore D.] o sekwencji zaznaczonej pogrubioną czcionką na SEQ. ID NO 15, 16. Określenie terminator tryptofanowy oznacza miejsce terminacji operonu tryptofanowego (tryp t).

Kaseta według wynalazku może zawierać promotory różnych fagów, zwłaszcza pokrewnych fagowi T7. Korzystny jest promotor wybrany spośród promotorów faga np. T7, T3, T5 i SP6, szczególnie T7. Kaseta według wynalazku może zawierać promotory innych fagów nie należących do rodziny fagów T7, np. promotor pL.

Fagi T3, T5 i SP6 są podobne do T7 [Nucleic Acid Research, 2005, 33,19. Information theory based T7-like promotor models: classification of bacteriophages and differential evolution of promoters and their polymerases. Z. Chen, T.D. Schneider.]. Są fagami litycznymi, kodującymi własną polimerazę RNA, która jest wysoce procesywna i rozpoznaje konserwatywne sekwencje w rejonie pomiędzy pozycją -17 i +6 pz przed miejscem startu mRNA. Promotory tych fagów są silnymi promotorami dla mikroorganizmów i stanowią systemy powszechnie wykorzystywane do otrzymywania rekombinowanych białek.

Docelowy polipeptyd może być kodowany przez dowolną sekwencję kodującą polipeptyd homologiczny lub heterologiczny dla komórki gospodarza. Może to być np. białko o znaczeniu terapeutycznym, diagnostycznym, biokatalitycznym, w tym także białko hybrydowe lub fragment takiego polipeptydu, wydzielane na zewnątrz albo pozostające w komórce. Sekwencją kodującą może być gen strukturalny, cDNA, sekwencja syntetyczna lub półsyntetyczna.

Konstrukcja kasety według wynalazku jest przedstawiona schematycznie na fig. 1, gdzie P oznacza sekwencję fagowego promotora, X oznacza sekwencję kodującą docelowy polipeptyd, S oznacza kodon stop translacji, b wynosi 1 lub 0, T oznacza sekwencję terminatora transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe, a M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy.

W kasecie według wynalazku nukleotydowy segment X-(S)b-T-M jest połączony z promotorem fagowym P.

Kodon stop translacji i sekwencja terminatora transkrypcji gospodarza znajdują się przed końcem 5' sekwencji kodującej czynnik selekcyjny. Kaseta kończy się terminatorem transkrypcji charakterystycznym dla faga, z którego pochodzi promotor, który znajduje się w wektorze ekspresyjnym.

Przykładową korzystną kasetą jest kaseta zawierająca nukleotydowy segment o sekwencji przedstawionej na Seq. ID No. 15, a także kaseta zawierająca nukleotydowy segment o sekwencji przedstawionej na Seq. ID No. 16.

Wynalazek dotyczy także zastosowania kasety ekspresyjnej, zawierającej promotor fagowy funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą polipeptyd docelowy oraz z sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, gdzie pomiędzy sekwencją kodującą polipeptyd docelowy a sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, znajduje się terminator transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe, w konstrukcji wektora dla układu ekspresyjnego promotor/polimeraza faga w komórce gospodarza prokariotycznego.

Jest korzystnie, jeśli na końcu 5' przed terminatorem transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe znajduje się kodon stop translacji.

Rozwiązanie dotyczy również wektora ekspresyjnego charakteryzującego się tym, że posiada kasetę ekspresyjną zawierającą promotor fagowy funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą polipeptyd docelowy oraz z sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, gdzie pomiędzy sekwencją kodującą polipeptyd docelowy

PL 222 067 B1 a sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, znajduje się terminator transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe, przy czym korzystnie, jeśli na końcu 5' przed terminatorem transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe znajduje się kodon stop translacji.

Metody ligowania elementów kasety i wprowadzania do wektora odpowiedniego do klonowania i ekspresji w gospodarzu prokariotycznym, zdolnego do replikacji w tych organizmach, są znane. Znane są również metody wprowadzania odpowiednio zaprojektowanych fragmentów DNA do komórki bakteryjnej tak by na drodze homologicznej rekombinacji uzyskać delecję w chromosomie.

Do konstrukcji wektora według wynalazku dogodnie jest stosować wektor plazmidowy. Takie wektory są znane fachowcom i zawierają zazwyczaj co najmniej jeden z następujących elementów: sekwencję lub kilka sekwencji rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne, sekwencję umożliwiającą replikację, gen markerowy umożliwiający selekcję niosących go komórek.

Konstrukcję kasety i wektora można prowadzić następująco: 1) przygotować najpierw sekwencję całej kasety i włączyć ją do wektora lub 2) fragmenty kasety włączać kolejno do odpowiedniego wektora (który może już zawierać pewne elementy, np. sekwencję promotora fagowego, sekwencję terminatora transkrypcji i inne).

Korzystny jest wektor plazmidowy zawierający promotor fagowy, taki jak promotor faga T7, T3, T5, SP6, pL szczególnie T7, połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą docelowy polipeptyd oraz z sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, taki jak białkowy czynnik selekcyjny wybrany z grupy obejmującej czynnik komplementujący defekt genetyczny gospodarza, albo ich funkcjonalny fragment. Sekwencja kodująca czynnik selekcyjny jest poprzedzona terminatorem transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe i, korzystnie, kodonem stop translacji. Przykładem jest wektor z kasetą o sekwencji przedstawionej jako sek. Nr 15 lub z kasetą o sekwencji przedstawionej jako sek. Nr 16.

Zgodnie z wariantem wynalazku sekwencja kodująca czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, może jednocześnie stanowić gen markera selekcyjnego umożliwiający selekcję komórek niosących wektor.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny z kasetą posiadającą promotor fagowy funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą polipeptyd docelowy oraz z sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, gdzie pomiędzy sekwencją kodującą polipeptyd docelowy a sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, znajduje się terminator transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe, przy czym korzystnie, jeśli na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe znajduje się kodon stop translacji.

Odpowiednim gospodarzem jest prokariotyczna komórka niosąca gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy. Mogą to być inne odpowiednio przystosowane bakterie, w których ma zachodzić ekspresja białka rekombinowanego. Może to być komórka E. coli z defektem genetycznym. Może to być także komórka E. coli posiadająca defekt w genie aroA kodującym EPSPS.

Gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy może być włączony do genomu prokariotycznego gospodarza. Przykładem jest szczep E. coli BL21(DE3). Gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy może być wprowadzony na dodatkowym wektorze (plazmidowym, fagowym). Tym wektorem może być także wektor według wynalazku. Wektor według wynalazku wprowadza się do komórki prokariotycznego gospodarza znanymi sposobami.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu otrzymywania polipeptydu, który polega na tym, że hoduje się komórki prokariotycznego gospodarza zawierające: a) wektor ekspresyjny z kasetą posiadającą promotor fagowy funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą polipeptyd docelowy oraz z sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, gdzie pomiędzy sekwencją kodującą polipeptyd docelowy a sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, znajduje się terminator transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe, oraz b) gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach umożliwiających ekspresję docelowego polipeptydu oraz czynnika selekcyjnego i jednocześnie zahamowanie wzrostu i eliminację komórek, w których brak ekspresji spod promotora fagowego.

Zgodnie z wynalazkiem odpowiednim podłożem do eliminacji komórek, w których brak jest ekspresji spod promotora fagowego, jest podłoże pozbawione określonego składnika niezbędnego dla życia tych komórek. Jest to podłoże optymalne, może też być stosowane podłoże zawierające składniki niezbędne do życia, tzw. podłoże pełne. W wypadku hodowli w podłożu pełnym z wykorzy10

PL 222 067 B1 staniem opisywanego układu, również obserwowano selekcję komórek stabilnie ekspresjonujących białko docelowe.

Ponieważ czynnikiem selekcyjnym jest czynnik białkowy komplementujący genetyczny defekt komórki gospodarza, to środkiem powodującym śmierć komórki lub znacznie spowolnienie jej podziałów w przypadku braku ekspresji tego czynnika będzie środowisko (podłoże) pozbawione składnika uzupełniającego genetyczny defekt. W przypadku komplementacji defektu, np. w genie kodującym EPSPS, jest to pożywka nie zawierająca aminokwasów aromatycznych: L-tryptofanu, L-tyrozyny i L-fenyloalaniny oraz związków aromatycznych: kwasu 4-hydroksybenzoesowego, kwasu 4-aminobenzoesowego i kwasu 2,3-dihydroksybenzoesowego, ewentualnie pożywka pełna. W sposobie według wynalazku stosuje się konwencjonalne podłoża hodowlane dobrane w zależności od użytego organizmu gospodarza. Dla Escherichia coli może to być pożywka, której skład został oryginalnie opracowany w trakcie doświadczeń prowadzących do opracowania opisywanego wynalazku. Jest to pożywka zawierająca fig. 2. Zaletą prowadzenia hodowli z użyciem tej pożywki, w szczególności hodowli prowadzonych na dużą skalę, jest jej stosunkowo niski koszt przy zapewnieniu wzrostu na zadowalającym poziomie (porównywalnym ze wzrostem w pożywkach stosowanych do hodowli na skalę laboratoryjną).

Nieoczekiwanie, w trakcie prowadzonych doświadczeń wykazano również, że opisywany układ do uzyskiwania stabilnej ekspresji bez użycia antybiotyków spełnia swoją funkcję podczas hodowli w pożywce pełnej. Badano poziom ekspresji białka docelowego w hodowli z wykorzystaniem opisywanego wynalazku. Hodowlę tą prowadzono stosując pożywkę VB-MM z dodatkiem aminokwasów aromatycznych: L-tryptofanu, L-tyrozyny i L-fenyloalaniny oraz związków aromatycznych: kwasu 4-hydroksybenzoesowego, kwasu 4-aminobenzoesowego i kwasu 2,3-dihydroksybenzoesowego. Również i w tym wypadku obserwowano selekcję komórek stabilnie ekspresjonujących w czasie białko docelowe. Można przypuszczać, iż obserwowana selekcja podczas hodowli w takiej pożywce wynika z faktu, iż komórki E. coli BL21(DE3) na skutek wprowadzenia funkcjonalnej delecji genu kodującego EPSPS pozbawione są zdolności do produkcji, obok wymienionych związków aromatycznych i aminokwasów aromatycznych, również kilku innych ważnych metabolitów. Wówczas z pożywki pełnej czerpią niezbędne do życia związki aromatyczne i aminokwasy aromatyczne. Pozostałe brakujące metabolity komórka może wytworzyć korzystając ze szlaków innych niż szlak z udziałem EPSPS. Uzyskane wyniki z prowadzenia hodowli w pożywkach z dodatkiem wspomnianych związków aromatycznych i aminokwasów aromatycznych świadczą o tym, że dla E. coli korzystniejsze energetycznie jest nadekspresjonowanie białka docelowego przy równoczesnej produkcji EPSPS i tym samym utrzymanie szlaków metabolicznych z udziałem EPSPS, niż wytworzenie brakujących metabolitów z udziałem szlaków alternatywnych.

Korzystnie, jeśli gen kodujący polimerazę RNA faga jest pod kontrolą indukowalnego promotora, co pozwala na kontrolowanie procesu produkcji polimerazy, a także ekspresji docelowego polipeptydu.

Ekspresja jest wówczas indukowana przez dodatek induktora, jak IPTG (izopropylotiogalaktozyd), autoindukcji lub użyciu innego znanego induktora.

W systemie ekspresyjnym wykorzystującym promotor faga, zwłaszcza T7, polimeraza produkowana jest na niskim poziomie również bez indukcji IPTG czy autoindukcji. Jest to zjawisko określane w literaturze mianem „cieknięcia”. W wynalazku wykorzystano zjawisko „cieknięcia” dzięki czemu nie ma konieczności zmiany pożywki w trakcie hodowli w momencie indukcji. Zapewnia to selekcję komórek już od samego początku hodowli. W związku z tym w układzie selekcja spełnia dwojaką funkcję: pozwala na selekcję komórek gospodarza niosących wektor ekspresyjny (funkcja markera selekcyjnego) oraz tych, które produkują docelowy polipeptyd (funkcja czynnika selekcyjnego), warunkujący przeżycie komórek gospodarza). Dzięki wykorzystaniu zjawiska „cieknięcia” nie ma potrzeby stosowania dodatkowych zabiegów wzbogacania pożywki na wstępnych etapach hodowli poprzedzających indukcję.

Wynalazek umożliwia otrzymanie kilkukrotnie większej ilości docelowego polipeptydu z tej samej objętości hodowli i utrzymanie jego wysokiej stabilnej w czasie produkcji bez konieczności stosowania antybiotyków, co również obniża koszt produkcji, w tym koszt oczyszczania białka i utylizacji ścieków pohodowlanych. Eliminowanie z hodowli komórek nie produkujących docelowego polipeptydu, które rosną i dzielą się szybciej, zapobiega „przerastaniu” hodowli takimi komórkami.

Opisywany wynalazek stanowi korzystniejsze rozwiązanie problemu stabilnej ekspresji niż wynalazek opisany w zgłoszeniu patentowym PL 379 905 (opubl. 2007-12-10). Przewaga jego przejawia się w możliwości znacznie dłuższego prowadzenia hodowli z jednoczesnym utrzymaniem stabilnej

PL 222 067 B1 ekspresji białka docelowego. W związku z tym uzyskuje się znacząco więcej docelowego produktu z danej objętości pożywki. W wynalazku opisanym w patencie nr zgłoszeniu patentowym PL 379 905 (opubl. 2007-12-10) czynnikiem selekcyjnym zapewniającym stabilną ekspresję jest oporność na kanamycynę. Niedoskonałością tego systemu stabilnej ekspresji białka docelowego jest, obok konieczności stosowania antybiotyków, naturalne pojawianie się w trakcje prowadzenia hodowli samorzutnych mutantów opornych na kanamycynę. Mutanty takie nie produkują białka docelowego i dynamicznie „przerastają” hodowlę.

W opisywanym rozwiązaniu problemu wyeliminowano możliwość pojawiania się samorzutnych mutantów. W opracowanym sposobie hodowla po immobilizacji komórek ekspresjonujących symultanicznie białko docelowe i białko niezbędne do przeżycia komórki, może być prowadzona jako hodowla zarówno okresowa, półciągła jak i ciągła.

Rozwiązanie przedstawiono na rysunku oraz opisano za pomocą listy sekwencji, przy czym na rysunku:

figura 1 przedstawia schemat kasety ekspresyjnej, przy czym nukleotydowa sekwencja „Kes” włączona jest do wektora ekspresyjnego pIG w miejsca powstałe po trawieniu nukleazami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll;

figura 2 przedstawia składy podłoży hodowlanych;

figura 3 przedstawia obrazy rozdziałów elektroforetycznych lizatów bakteryjnych z prób pobranych w eksperymencie 1, gdzie ścieżki:

LMW - Wzorzec mas LMW. Zawiera białka o masach: 97, 66, 45, 30, 20,1 i 14,4 kDa.

1, 4, 7, 10. Lizaty bakterii E. coli szczepu BL21(DE3) transformowanych wektorem pIGKesAroAPA4D-G hodowanych w pożywce VB-MM.

Próby odebrane kolejno 2, 8, 10 i 21 godzin po indukcji IPTG.

5, 8, 11. Lizaty bakterii E. coli szczepu BL21(DE3^aroA transformowanych wektorem pIGKesAroAPA4D-G hodowanych w pożywce VB-MM.

Próby odebrane kolejno 2, 8, 10 i 21 godzin po indukcji IPTG.

3, 6, 9, 12. Lizaty bakterii E. coli szczepu BL21(DE3^aroA transformowanych wektorem pIGKesAroAPA4D-G hodowanych w pożywce VB-MM+aa.

Próby odebrane kolejno 2, 8, 10 i 21 godzin po indukcji IPTG.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d I. Konstrukcja szczepu do ekspresji, kasety ekspresyjnej oraz wektorów ekspresyjnych.

Konstrukcja szczepu E. coli BL21(DE3)ńaroA

Wyjściowym szczepem do konstrukcji szczepu E. coli BL21(DE3^aroA był szczep E. coli BL21(DE3). W szczepie tym wprowadzono funkcjonalną delecję genu aroA kodującego 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (EPSPS). W celu uzyskania szczepu E. coli BL21(DE3) z mutacją w genie aroA wykorzystano liniowe fragmenty DNA zawierające gen fosfotransferazy neomycyny (NPTII) wprowadzający oporność na kanamycynę. Gen ten jest otoczony sekwencjami homologicznymi do rejonu na zewnątrz deletowanej sekwencji genu aroA. Przygotowane liniowe fragmenty DNA wprowadzano na drodze elektroporacji do elektrokompetentnych komórek E. coli szczepu BL21(DE3). Krytycznym etapem tej procedury jest zastosowanie wysoce kompetentnych komórek E. coli BL21(DE3). Fragmenty wprowadzano do komórek wykorzystując elektroporator Gene-Pulser X-Cell firmy Biorad, w kuwetach o szczelinie 2 mm, przy zachowaniu następujących parametrów procesu: 2,5 kV, 25 μF, 200 Omów, puls 4,5-5 ms. Po elektroporacji komórki wysiewane były na podłoże hodowlane z dodatkiem aminokwasów aromatycznych: L-tryptofanu, L-tyrozyny i L-fenyloalaniny oraz związków aromatycznych: kwasu 4-hydroksybenzoesowego, kwasu 4-aminobenzoesowego i kwasu 2,3-dihydroksybenzoesowego (przedstawione na fig. 2) oraz z dodatkiem kanamycyny. Uzyskane kolonie testowano w reakcji PCR na obecność genu kodującego NPTII włączonego do chromosomu w miejsce określone sekwencjami homologicznymi. Do reakcji użyto primerów ZaAROA, PrzeAROA i Aro700R SEQ. ID NO: 5, 6, 7. Obraz rozdziału elektroforetycznego w żelu agarozowym mieszaniny po reakcji PCR oraz sekwencjonowanie powielonych i wyizolowanych z agarowych fragmentów DNA potwierdziło uzyskanie bakterii z wprowadzonym genem kodującym NPTII. Gen ten został wprowadzony w ściśle określone sekwencjami homologicznymi miejsce w chromosomie bakterii E. coli BL21(DE3). Tym samym otrzymane wyniki potwierdziły, że w wyniku rekombinacji homologicznej uzyskano E. coli BL21(DE3) z delecją aroA.

PL 222 067 B1

Konstrukcja kasety ekspresyjnej

Z genomu bakterii E. coli szczepu BL21(DE3) powielono w reakcji PCR (PCR1) z użyciem primerów AroA1 (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 1) i AroAk (primer odwrotny, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 3) fragment obejmujący pełną sekwencję nukleotydową genu aroA (1284 pz). Fragment sekwencji primerów AroA1 i AroAk zaprojektowano na podstawie sekwencji genu aroA. Primer wiodący AroA1 wprowadza na końcu 5' cząsteczki DNA fragment sekwencji nukleotydowej kasety ekspresyjnej, primer odwrotny AroAk wprowadza na końcu 3' cząsteczki DNA sekwencję rozpoznawaną przez nukleazę restrykcyjną Hindlll oraz zmianę kodonu stop z TGA na TAA. Mieszaninę po reakcji PCR1 rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym. Powielony fragment DNA o długości 1326 pz wyeluowano z żelu agarozowego, a następnie użyto jako matrycę w kolejnej reakcji PCR (PCR2).

W reakcji PCR2 na matrycy uzyskanej w PCR1 powielono z użyciem primerów AroA2 (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 2) i AroNdeD (primer odwrotny, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 4) fragment o długości 206 pz. Primer wiodący AroA2 wprowadza na końcu 5' cząsteczki DNA fragment sekwencji nukleotydowej kasety ekspresyjnej oraz sekwencję rozpoznawaną przez nukleazę restrykcyjną Sall. Primer odwrotny AroNdeD wprowadza w pozycji 156 cząsteczki DNA zmiany w sekwencji nukleotydowej, zmieniając tyminę na cytozynę. Zmiana ta ma na celu usunięcie z sekwencji miejsca rozpoznawanego przez nukleazę restrykcyjną Ndel. Wprowadzona zmiana w sekwencji nukleotydowej nie powoduje zmian w sekwencji aminokwasowej. Mieszaninę po reakcji PCR2 rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym. Powielony fragment DNA o długości 206 pz wyeluowano z żelu agarozowego, a następnie użyto jako matrycę w kolejnej reakcji PCR (PCR3).

W reakcji PCR3 na matrycy uzyskanej w PCR1 powielono z użyciem primerów AroAk i produktu reakcji PCR2 fragment o długości 1369. Mieszaninę po reakcji PCR3 rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym. Powielony fragment DNA o długości 1369 pz wyeluowano z żelu agarozowego, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi Sall oraz Hindlll i odbiałczono. Otrzymany nukleotydowy segment stanowi kasetę ekspresyjną „KesAroA” obejmującą kodon stop translacji, terminator tryptofanowy oraz gen aroA. Fragment ten ligowano z wektorem trawionym enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll i odbiałczonym po trawieniu. Poprawność sekwencji fragmentu włączonego do wektora zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Otrzymano wektor pIGKesAroA. Jest to wektor z włączoną pod promotorem T7 kasetą ekspresyjną KesAroA.

Kasetę wklonowano do przykładowego wektora z grupy wektorów zawierających polilinker wraz z promotorem rozpoznawanym przez polimerazę RNA z faga T7 oraz sekwencję kodującą kodon stop transkrypcji pochodzący z faga T7.

Konstrukcja wektora pIGKesAroAPA

Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis powielono w reakcji PCR z użyciem primerów PA-4DP (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 11) i PA4DKXho (primer odwrotny, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 13) fragment o długości 429 pz (zgodnie z numeracją sekwencji z GeneBank, numer dostępu AF065404). Primery PA-4DP i PA-4DKXho zaprojektowano na podstawie sekwencji czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis. Primer wiodący wprowadza miejsce rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne EcoRI i Ndel, a odwrotny miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną Sall. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi Ndel oraz Sall, i odbiałczono. Otrzymany fragment ligowano z wektorem pIGKesAroA trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Poprawność sekwencji fragmentu włączonego do wektora zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Otrzymano wektor pIGKesAroAPA z kasetą ekspresyjną zawierającą pod promotorem T7 nukleotydowy segment PA-4D+Stop+Term+aroA.

Konstrukcja wektora pIGKesAroAPA-G

Z plazmidu pIGKesAroA powielono w reakcji PCR (PCR1) z użyciem primerów AroA1zG (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 10) i AroAk (primer odwrotny, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 3) fragment obejmujący pełną sekwencję nukleotydową genu aroA (1284 pz). Fragment sekwencji primerów AroA1zG i AroAk zaprojektowano na podstawie sekwencji genu aroA. Primer wiodący AroA1zG wprowadza na końcu 5' cząsteczki DNA fragment sekwencji nukleotydowej kasety ekspresyjnej, primer odwrotny AroAk wprowadza na końcu 3' cząsteczki DNA sekwencję rozpoznawaną przez nukleazę restrykcyjną Hindlll oraz zmianę kodonu stop z TGA na TAA. Mieszaninę

PL 222 067 B1 po reakcji PCR1 rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym. Powielony fragment DNA o długości 1326 pz wyeluowano z żelu agarozowego, a następnie użyto jako matrycę w kolejnej reakcji PCR (PCR2).

W reakcji PCR2 na matrycy uzyskanej w PCR1 powielono z użyciem primerów AroA2 (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 2) i AroAk. Primer wiodący AroA2 wprowadza na końcu 5' cząsteczki DNA fragment sekwencji nukleotydowej kasety ekspresyjnej oraz sekwencję rozpoznawaną przez nukleazę restrykcyjną Sall. Mieszaninę po reakcji PCR2 rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym. Powielony fragment DNA o długości 1329 pz wyeluowano z żelu agarozowego, a następnie użyto jako matrycę w reakcji PCR (PCR4).

W reakcji PCR3 z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis powielono z użyciem primerów PA-4DP (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 11) i PAzAroA (primer odwrotny, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 12) fragment. Primery PA-4DP i PAzAroA zaprojektowano na podstawie sekwencji czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis. Primer wiodący wprowadza miejsce rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne EcoRI i Ndel, a odwrotny miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną Sall. Primer odwrotny wprowadza na 3' końcu fragment sekwencji komplementarny do 5' końca sekwencji powielanej kasety ekspresyjnej w PCR2. Mieszaninę po reakcji PCR3 rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym. Powielony fragment DNA wyeluowano z żelu agarozowego, a następnie na matrycy uzyskanej w PCR2 powielono w reakcji PCR4 z użyciem primerów AroAk i produktu reakcji PCR2 fragment o długości 1800 pz. Mieszaninę po reakcji PCR4 rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym. Powielony fragment DNA o długości 1800 pz wyeluowano z żelu agarozowego, a nastpnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi Ndel oraz Hindlll i odbiałczono. Otrzymany nukleotydowy segment stanowi gen kodujący czwartą domenę antygenu protekcyjnego i kasetę ekspresyjną „KesAroA” obejmującą kodon stop translacji, terminator tryptofanowy oraz gen aroA. Uzyskany fragment ligowano z wektorem trawionym enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll i odbiałczanym po trawieniu. Poprawność sekwencji fragmentu włączonego do wektora zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Otrzymano wektor pIGKesAroA-G. Jest to wektor z włączonym pod promotorem T7 genem kodującym czwartą domenę antygenu protekcyjnego kasetę ekspresyjną KesAroA.

Konstrukcje wektorów pIGKesAroAPA-AGG i pIGKesAroAPA-Km

Konstrukcje wektorów pIGKesAroAPA-AGG i pIGKesAroAPA-Km uzyskano w analogiczny sposób jak konstrukcję wektora pIGKesAroAPA-G. Do konstrukcji tych wektorów użyto zamiast primera AroA1zG, jak w opisie PCR1 p. „Konstrukcja wektora pIGKesAroAPA-G”, primer AroA1-AGGAGG SEQ. ID NO: 9 do konstrukcji wektora pIGKesAroAPA-AGG i primer AroA1-SDKm SEQ. ID NO: 8 do konstrukcji wektora pIGKesAroAPA-Km.

Konstrukcja wektora porównawczego pIGT7PA

Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis powielono w reakcji PCR z użyciem primerów PA-4DP (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 11) i PA-4DK (primer odwrotny, o sekwencji pokazanej na SEQ. ID NO: 14) fragment o długości 429 pz (zgodnie z numeracją sekwencji z GeneBank, numer dostępu AF065404). Primery PA-4DP i PA-4DK zaprojektowano na podstawie sekwencji czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis. Primer wiodący wprowadza miejsce rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne EcoRI i Ndel, a odwrotny miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną Hindlll. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll, i odbiałczono. Otrzymany fragment, o sekwencji przedstawionej na SEQ. ID NO: 21 ligowano z wektorem pIGT7 trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Poprawność sekwencji fragmentu PA-4D włączonego do wektora zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Otrzymano wektor pIGT7PA.

P r z y k ł a d. Układ ekspresyjny i jego działanie

Działanie układu w obecności kasety w wektorach według wynalazku, w których ekspresja jest oparta na promotorze faga T7, sprawdzono dla docelowego polipeptydu jakim jest białko PA-4D z bakterii.

Plazmidami zawierającymi sprawdzoną wstawkę transformowano komórki E. coli szczep BL21(DE3) i E. coli szczep BL21(DE3^aroA. Szczep E. coli BL21(DE3) i jego pochodne zawierają wprowadzony do chromosomu gen kodujący polimerazę RNA faga T7 pod kontrolą promotora lacUV5, rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA. Transkrypcja z promotora lacUV5 jest indukowa14

PL 222 067 B1 na przez IPTG. Pomiędzy promotorem a genem kodującym polimerazę RNA T7 znajduje się sekwencja operatorowa, wiążąca białko represorowe blokujące inicjację transkrypcji. Dopiero po związaniu represora z IPTG, co prowadzi do utraty powinowactwa białka do miejsca operatorowego, może rozpocząć się transkrypcja genu polimerazy fagowej. Polimeraza fagowa transkrybuje gen w wektorze ekspresyjnym znajdujący się pod kontrolą promotora rozpoznawanego przez polimerazę RNA T7.

Do transformacji komórek E. coli wykorzystano elektroporację jako metodę wprowadzania DNA do kompetentnych komórek bakteryjnych E. coli. Mieszaninę po transformacji wysiano na stałe podłoże VB-MM, inkubowano 15-24 godzin w 37°C, a następnie obserwowano wzrost kolonii niosących plazmidy.

W wyniku transformacji uzyskano bakterie E. coli szczep BL21(DE3) i E. coli szczep BL21(DE3^aroA niosące plazmidy pIGKesAroAPA-AGG, pIGKesAroAPA-G pIGKesAroAPA i/lub pIGKesAroAPA-Km oraz E. coli szczep BL21(DE3) niosące plazmidy pIGT7PA, pIGKesAroAPA, pIGKesAroAPA-Km i/lub pIGKesAroAPA-AGG, pIGKesAroAPA-G.

Po przeprowadzeniu transformacji bakterii E. coli szczepu BL21(DE3^aroA plazmidami pIGKesAroAPA i pIGKesAroAPA+Km nie obserwowano wzrostu na stałym podłożu VB-MM.

Brak wzrostu komórek E. coli szczepu BL21(DE3^aroA transformowanych plazmidami pIGKesAroAPA i pIGKesAroAPA-Km świadczy o braku lub zbyt niskiej ekspresji genu aroA kodującego białko EPSPS z plazmidów. W związku z tym nie dochodzi do komplementacji defektu genetycznego gospodarza, co uniemożliwia wzrost bakterii.

Do dalszych eksperymentów użyto bakterie E. coli szczep BL21(DE3) i E. coli szczep BL21(DE3^aroA niosące plazmidy pIGKesAroAPA-AGG i pIGKesAroAPA-G oraz E. coli szczep BL21(DE3) niosące plazmidy pIGT7PA.

Schemat eksperymentów

Przeprowadzono 2 eksperymenty, w których:

1. Hodowano bakterie • E. coli szczep BL21(DE3^aroA niosące plazmid pIGKesAroAPA-G. Hodowla w podłożu VBMM.

• E. coli szczep BL21(DE3^aroA niosące plazmid pIGKesAroAPA-G. Hodowla w podłożu VBMM+aa.

• E. coli szczep BL21(DE3) niosące plazmid pIGKesAroAPA-G. Hodowla w podłożu VB-MM.

• E. coli szczep BL21(DE3) niosące plazmid pIGT7PA. Hodowla w podłożu VB-MM.

2. Hodowano bakterie • E. coli szczep BL21(DE3).\aroA niosące plazmid pIGKesAroAPA-AGG. Hodowla w podłożu

VB-MM.

• E. coli szczep BL21(DE3).\aroA niosące plazmid pIGKesAroAPA-AGG. Hodowla w podłożu

VB-MM+aa.

• E. coli szczep BL21(DE3) niosące plazmid pIGKesAroAPA-AGG. Hodowla w podłożu VB-MM.

• E. coli szczep BL21(DE3) niosące plazmid pIGT7PA. Hodowla w podłożu VB-MM.

W eksperymentach tych porównywano wydajność systemu modyfikowanego według wynalazku, w stosunku do systemu nie modyfikowanego na przykładzie ekspresji białka docelowego, PA-4D. W tym celu użyto standardowy wektor z promotorem faga T7, do którego wklonowano sekwencję kodującą PA-4D (pIGT7PA) i wektory zmodyfikowane (pIGKesAroAPA-AGG i pIGKesAroAPA-G), zawierający sekwencję kodującą PA-4D jako część nukleotydowego segmentu kasety według wynalazku. Gospodarzem były szczepy E. coli BL21 (DE3^aroA i BL21(DE3).

W eksperymencie 1 sprawdzono poziom ekspresji białka PA-4D w E. coli BL21(DE3^aroA niosącego plazmid pIGKesAroAPA-G w odniesieniu do niosącego ten sam plazmid szczepu BL21(DE3). Hodowle te prowadzono w podłożu VB-MM. Przeprowadzono również kontrolę poziomu ekspresji białka PA-4D uzyskiwanego w E. coli BL21(DE3^aroA niosącym plazmid pIGKesAroAPA-G. Hodowlę tą prowadzono w podłożu VB-MM+aa (podłoże bogate).

Analogicznie w eksperymencie 2 sprawdzono poziom ekspresji białka PA-4D w E. coli BL21(DE3^aroA niosącego plazmid pIGKesAroAPA-AGG w odniesieniu do niosącego ten sam plazmid szczepu BL21(DE3). Przeprowadzono również kontrolę poziomu ekspresji białka PA-4D uzyskiwanego w E. coli BL21(DE3^aroA niosącego plazmid pIGKesAroAPA-AGG. Hodowlę tą prowadzono w podłożu VB-MM+aa (podłoże bogate).

PL 222 067 B1

W obu eksperymentach sprawdzano poziom ekspresji białka PA-4D uzyskiwanego z użyciem nie modyfikowanego systemu ekspresji w układzie polimeraza/promotor faga T7. Hodowla ta była prowadzona w podłożu VB-MM.

W każdym z eksperymentów przeprowadzano ekspresję białek. W tym celu bakterie E. coli szczep BL21(DE3) i BL21(DE3^aroA niosące odpowiedni rekombinowany plazmid hodowano w 3 ml pożywki VB-MM w 37°C przez 3 godziny, po czym rozcieńczono świeżym podłożem VB-MM (1:100) i wytrząsano w 37°C do momentu osiągnięcia A₆₀₀«O,4. Następnie indukowano ekspresję docelowego polipeptydu przez dodanie izopropylotiogalactozydu (IPTG, do końcowego stężenie 0,1 mM) i wytrząsano przez kolejne 21 godzin. W trakcie hodowli prowadzonej po indukcji co 2 godziny pobierano próby do pomiaru A600 i do nałożenia na żel poliakryloamidowy (SDS-PAGE). Obecność i ilość docelowego polipeptydu w komórkach bakteryjnych analizowano poddając lizaty bakteryjne rozdziałowi elektroforetycznemu w 15% żelu SDS-PAGE, zgodnie z metodą opisaną przez Laemmli [Laemmli UK. Cleavage of structurals proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15; 227(5259):680-5]. Białka wizualizowano barwnikiem Coomassie Brillant Blue G.

Obrazy rozdziałów elektroforetycznych lizatów bakteryjnych z prób pobranych w eksperymencie 1 przedstawiono na Fig. 3.

Na rozdziale elektroforetycznym Fig. 3 poziom ekspresji białka PA-4D oznaczono strzałką. Widoczny jest stabilny poziom ekspresji tego białka w czasie w hodowli prowadzonej z wykorzystaniem systemu według wynalazku w porównaniu z poziomem ekspresji tego białka w hodowli ze standardowym układem ekspresyjnym wykorzystującym polimerazę/promotor faga T7. Różnica w poziomie ekspresji widoczna jest w ścieżkach z rozdziałów elektroforetycznych lizatów bakterii pobranych już po 8 godzinach od indukcji ekspresji docelowego polipeptydu. Różnica ta zwiększa się w czasie na niekorzyść poziomu ekspresji w E. coli BL21(DE3) niosącego plazmid pIGKesAroAPA-G. Dodatkowo w tym eksperymencie porównano poziom ekspresji docelowego polipeptydu otrzymywanego w standardowo wykorzystywanym systemie zawierającym sam promotor faga T7 i poziom ekspresji tego docelowego polipeptydu otrzymywanego w układzie według wynalazku. W tym celu użyto standardowy wektor z promotorem faga T7, do którego wklonowano sekwencję kodującą PA-4D (pIGT7PA) i wektory zmodyfikowany (pIGKesAroAPA-AGG i pIGKesAroAPA-G), zawierający sekwencję kodującą PA-4D jako część nukleotydowego segmentu kasety według wynalazku. Z obrazu prób pobranych na wczesnych etapach hodowli (pierwsze 4 godziny po indukcji ekspresji docelowego polipeptydu) wynika, że ekspresja docelowego polipeptydu odbywa się na tym samym poziomie w standardowo wykorzystywanym układzie zawierającym sam promotor faga T7 i układzie według wynalazku. Jest to możliwe, ponieważ w układzie według wynalazku charakterystyczna dla promotora faga T7 wysoka ekspresja skierowana jest głównie na polipeptyd docelowy.

W procesie prowadzonym sposobem według wynalazku z hodowli eliminowane są komórki bakteryjne, w chromosomie których pojawiła się mutacja powodująca brak produkcji funkcjonalnej polimerazy faga T7 i/lub w których, w wyniku mutacji, stracił funkcjonalność promotor faga T7. Funkcjonalna polimeraza i rozpoznawany przez nią promotor faga T7 są niezbędne do uzyskania ekspresji. Oznacza to, że z hodowli eliminowane są komórki bakteryjne nie produkujące docelowego polipeptydu, które rosną i dzielą się szybciej. Unika się więc „przerastania” hodowli komórkami bakteryjnymi nie ekspresjonującymi docelowego polipeptydu.

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kaseta ekspresyjna zawierająca promotor fagowy i sekwencję kodującą polipeptyd docelowy, gdzie kaseta jest przedstawiona wzorem P-X-(S)bT-M, w którym P oznacza sekwencję promotora fagowego, X oznacza sekwencję docelową, S oznacza kodon stop translacji, b = 1 (obecny) lub b = 0 (nieobecny) w sekwencji kasety, T oznacza terminator transkrypcji dla promotorów innych niż promotory fagowe, a M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, i w której kodon stop translacji S znajduje się na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji T, i w którym sekwencja M, kodująca czynnik selekcyjny, jest umieszczona w kasecie, znamienna tym, że sekwencja kodująca białko będące czynnikiem selekcyjnym wybranym z grupy zawierającej markery komplementujące defekt genetyczny komórki gospodarza lub ich funkcjonalny fragment, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny stanowi sekwencję aroA,

   PL 222 067 B1 przy czym gospodarzem dla wektora zawierającego kasetę jest szczep E. coli BL21(DE3) z funkcjonalną delecją genu aroA, przy czym kaseta jest przedstawiona na fig. 1.
2. 2. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja kodująca czynnik selekcyjny posiada zmodyfikowaną niekodującą część na końcu 5' zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno, w taki sposób, że po transkrypcji do mRNA jest gorzej rozpoznawalna przez rybosomy, przy czym korzystnie wspomniana sekwencja Shine-Dalgarno jest niekodującą częścią genu aroA, który koduje 1-karboksywinylotransferazę 3-fosfoszikimianową (EPSPS).
3. 3. Kaseta według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że sekwencja aroA posiada zmodyfikowaną niekodującą część na końcu 5', zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno, w taki sposób, że po transkrypcji do mRNA jest gorzej rozpoznawalna przez rybosomy, korzystnie wspomniana sekwencja Shine-Dalgarno jest niekodującą częścią genu aroA, który koduje 1-karboksywinylotransferazę 3-fosfoszikimianową (EPSPS).
4. 4. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że terminator transkrypcji promotorów innych niż promotor fagowy jest terminatorem trypotofanowym.
5. 5. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera promotor wybrany z grupy zawierającej promotory fagowe T7, T3, T5 oraz SP6, korzystnie promotor fagowy T7.
6. 6. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że promotor fagowy jest połączony z nukleontydowym segmentem, którego sekwencja przedstawiona jest na fig. 1 i jako SEQ ID NO: 15, 16.
7. 7. Zastosowanie kasety ekspresyjnej przedstawionej wzorem P-X-(S)bT-M, w którym P oznacza sekwencję promotora fagowego, X oznacza sekwencję docelową, S oznacza kodon stop translacji, b = 1 (obecny) lub b = 0 (nieobecny) w sekwencji kasety, T oznacza terminator transkrypcji dla promotorów innych niż promotory fagowe, a M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, i w którym kodon stop translacji S znajduje się na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji T, i w którym sekwencja M, kodująca czynnik selekcyjny, umieszczona w kasecie, jest sekwencją kodującą białko będące czynnikiem selekcyjnym wybranym z grupy zawierającej markery komplementujące defekt genetyczny komórki gospodarza lub ich funkcjonalny fragment, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny jest sekwencją genu aroA, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny aroA jest sekwencją kodującą 1-karboksylinylotransferazę 3-fosfoszikimianową (EPSPS).
8. 8. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera kasetę ekspresyjną określoną zastrzeżeniami 1 do 6.
9. 9. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że jest wybrany spośród wektorów: pIGKesAroAPA, pIGKesAroAPA-G, pIGKesAroAPA-AGG i/lub pIGKesAroAPA-Km.
10. 10. Komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny określony którymkolwiek z zastrzeżeń 8 do 9.
11. 11. Komórka według zastrz. 10, znamienna tym, że jest nią komórka prokariotycznego gospodarza niosąca gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy.
12. 12. Komórka według zastrz. 10, znamienna tym, że jest nią komórka E. coli, korzystnie szczep E. coli BL21(DE3^aroA.
13. 13. Szczep bakteryjny, znamienny tym, że stanowi szczep bakterii E. coli, który pełni funkcję gospodarza, w którym zachodzi ekspresja białka rekombinowanego i białka komplementującego defekt genetyczny gospodarza i, że gospodarzem jest odpowiednio zmodyfikowany szczep E. coli BL21(DE3), a zwłaszcza szczep BL21(DE3^aroA.
14. 14. Szczep bakteryjny według zastrz. 13, znamienny tym, że wybranym genem chromosomalnym, którego przeprowadzono delecję jest gen aroA, względnie szczep bakteryjny z delecją innego genu o ile spełniony będzie warunek, że jest to gen z grupy genów, których produkt jest niezbędny do życia komórce, kodujący 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, przy czym białko EPSPS jest zbudowane z 428 aminokwasów, a jego masa molekularna wynosi 46200 Da i że białko EPSPS bierze udział w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych: L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-fenyloalaniny.
15. 15. Sposób wytwarzania polipeptydu w prokariotycznym gospodarzu w układzie promotor/polimeraza faga, znamienny tym, że sposób składa się z hodowania komórek prokariotycznego gospodarza zawierających: a) wektor ekspresyjny z kasetą ekspresyjną przedstawioną wzorem P-X(S)bT-M, w którym w której P oznacza sekwencję promotora fagowego, X oznacza sekwencję docelową S oznacza kodon stop translacji, b = 1 (obecny) lub b = 0 (nieobecny) w sekwencji kasety, T oznacza terminator transkrypcji dla promotorów innych niż promotory fagowe, a M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docePL 222 067 B1 lowy, i w którym kodon stop translacji S znajduje się na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji T, i w którym sekwencja M, kodująca czynnik selekcyjny, umieszczona w kasecie, jest sekwencją kodującą białko będące czynnikiem selekcyjnym wybranym z grupy zawierającej markery komplementujące defekt genetyczny komórki gospodarza lub ich funkcjonalny fragment, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny jest sekwencją genu aroA, i w której sekwencja kodująca czynnik selekcyjny aroA jest sekwencją kodującą EPSPS oraz b) gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach umożliwiających ekspresję docelowego polipeptydu i czynnika selekcyjnego i jednocześnie zahamowanie wzrostu i eliminację komórek, w których brak ekspresji kontrolowanej promotorem fagowym.