WO2016093606A1 - rnpA 유전자 발현감소를 통한 재조합단백질의 제조방법 - Google Patents

rnpA 유전자 발현감소를 통한 재조합단백질의 제조방법 Download PDF

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WO2016093606A1
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expression
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이상엽
정해나
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the production of a recombinant protein in a recombinant microorganism, and more particularly, by using a recombinant microorganism in which sRNAs for a gene encoding a protein of interest and a gene encoding ribonuclease P are introduced. And to improve the production of recombinant proteins.
  • E. coli is the most widely used, and the research on this is the most widely conducted (Choi et al. Sci., 66: 876, 2006; Lee, Trends Biotechnol., 14:98, 1996).
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a protein expression system for increasing the production of non-expressing foreign proteins.
  • ribonuclease P When the expression of the rnpA gene, which is part of ribonuclease P), was reduced, it was confirmed that the expression of the non-expressing foreign protein was increased, thereby completing the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a protein of interest by culturing the recombinant microorganism.
  • the present invention provides a recombinant vector for expressing a target protein containing a gene encoding a protein of interest and an sRNA for a gene encoding ribonuclease P and a recombinant microorganism into which the recombinant vector is introduced. do.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism into which a gene encoding a protein of interest and an sRNA for a gene encoding ribonuclease P are introduced.
  • the present invention also comprises the steps of (a) culturing the recombinant microorganism to induce the expression of the protein of interest to produce the protein of interest; And (b) provides a method for producing a protein of interest comprising the step of obtaining the produced protein of interest.
  • the present invention also expresses a target protein by culturing a recombinant microorganism into which a gene encoding the target protein is introduced. Producing; And obtaining the produced protein of interest, in order to enhance the expression of the protein of interest, the method for producing the protein of interest, characterized in that to reduce the expression of ribonuclease P to provide.
  • sRNA 1 is a genetic map of the plasmid pTetly2glyAN-rnpA (sRNA).
  • Figure 2 shows the results of observing the expression level of the 16 times silk protein and 32 repeated silk protein by SDS-PAGE.
  • Lane 1 marker showing protein standard molecular weight
  • lanes 2 and 3 expression of strains transformed with plasmid pSH16, respectively, at OD600 0.4
  • lanes 4 and 5 transformed with plasmids pSH16 and pACYC184-rnpA (sRNA)
  • the resulting strains were expressed in OD600 0.4, respectively
  • lanes 6 and 7 the strains transformed with plasmid pSH32 were expressed in OD600 0.4, respectively
  • lanes 8 and 9 were transformed with plasmids pSH32 and pACYC184-rnpA (sRNA).
  • sRNA Induced expression of the transformed strain at OD600 0.4
  • FIG. 3 shows the results of observing the expression level of the 64 repeated silk proteins by SDS-PAGE (lane 1: marker showing protein standard molecular weight; lane 2: pSH64 transformed strain was expressed at OD600 0.4 Result 3: Expression of the strain transformed with plasmid pSH64 and pACYC184-rnpA (sRNA) at OD600 0.4 respectively)
  • 4A shows the results of observing the expression level of the 96-time repeated silk protein by SDS-PAGE (lane 1: marker showing protein standard molecular weight; lane 2: pSH96 transformed strain was expressed at OD600 0.4).
  • Result 3 Expression of the strain transformed with plasmid pSH96 and pACYC184-rnpA (sRNA) at OD600 0.4 respectively)
  • Figure 4b shows that the strains transformed with plasmids pSH96 and pSH96 and pTetgly2glyAN-rnpA (sRNA), respectively, were expressed at OD600 0.4, and then measured using a digitometer to measure the SDS-PAGE. The results are shown.
  • Figure 5 shows the results of observing the expression level of the silk protein repeated 128 times by SDS-PAGE (lane 1: marker showing the protein standard molecular weight; lane 2: pSH128 transformed strain was expressed in OD600 0.4 Result 3: Expression of the strain transformed with plasmid pSH128 and pACYC184-rnpA (sRNA) at OD600 0.4 respectively)
  • Figure 6 is a graph showing the result of confirming that the intracellular mRNA increases according to the decrease in the expression of rnpA gene.
  • FIG. 7 is a graph showing the yield of silk protein repeated 96 times by fed-batch culture (FIG. 7A) and electrophoresis results (FIG. 7B).
  • Figure 8 shows the results of electrophoresis confirming the increase in expression for other expression proteins other than silk protein using the rnpA gene expression reduction system of the present invention.
  • (a) shows the results of observing maleic enzyme (sfcA) expression level by SDS-PAGE (lane 1: marker showing protein standard molecular weight; lane 2: expression induced only BL21 (DE3); lanes 3 and 4) : Result of inducing strains transformed with sfcA at OD600 0.4; Lanes 5 and 6: Resulting expression of strains transformed with sfcA and rnpA (sRNA) at OD600 0.4).
  • sfcA maleic enzyme
  • (b) shows the result of observing Cat2 expression level by SDS-PAGE (Lane 1: Marker showing protein standard molecular weight; Lanes 2 and 3: Expression of the Cat2 transformed strain at OD600 0.4; Lane 4 and 5: Expression of the strain transformed with Cat2-rnpA (sRNA) at OD600 0.4).
  • (c) shows the result of observing srtA expression level by SDS-PAGE (Lane 1: Marker showing protein standard molecular weight; lanes 2 and 3: srtA transformed strain at OD600 0.4; 4 and 5: Expression of the strain transformed with srtA-rnpA (sRNA) at OD600 0.4).
  • (d) shows the result of observing CYP73A5 expression level by SDS-PAGE (Lane 1: Marker showing protein standard molecular weight; Lanes 2 and 3: Induced expression of strain transformed with CYP73A5 at OD600 0.4; Lane 4 and 5: Expression of the strain transformed with CYP73A5-rnpA (sRNA) at OD600 0.4).
  • (e) shows the results of observing the CYP98A3 expression level by SDS-PAGE (lane 1: marker showing the protein standard molecular weight; lanes 2 and 3: the result of inducing the expression of the strain transformed with CYP98A3 at OD600 0.4; 4 and 5: Expression of the strain transformed with CYP73A5-rnpA (sRNA) at OD600 0.4).
  • warm expression protein means a protein having a molecular weight of 50 kDa or more.
  • the present invention relates to a recombinant vector for expressing a target protein containing a gene encoding a protein of interest and an sRNA for a gene encoding ribonuclease P and a recombinant microorganism transformed with the recombinant vector.
  • the target protein may be, but is not limited to, a protein such as an egg-expressing protein, a silk protein, an antibody, an enzyme, a cytochrome, and a sortase A.
  • the sRNA may be characterized in that the sRNA for the rnpA gene, the sRNA may be characterized by having any one of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, but reduces the expression of rnpA gene As long as it is allowed, it is not limited thereto.
  • microorganisms for protein production that can be used include Escherichia, Pseudomoas, Saccharomyces, etc., preferably Escherichia microorganisms. It may be, and most preferably may be E. coli. In particular, E. coli is known that genetic information and culture conditions are widely used industrially has the advantage that it can be easily industrialized.
  • a gene encoding a silk protein modified from a spiderline protein obtained from Nephila clavipes, a base sequence encoding a glycine tRNA, and an expression of an RNP gene, which is part of ribonuclease P, are reduced.
  • the silk protein is a repeating protein having a structure in which a specific amino acid sequence (SGRGGLGGTGAGMAAAAAMGGAGQGGYGGLGSQG) is repeated, and the expression of silk protein repeated 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, and 128 times is determined by ribonuclease P. It has been shown to increase dramatically by reducing the expression of RnPA (rnpA) gene, which is part of. In addition, eGFP, sfcA, and full-length IgG antibodies were also found to increase dramatically by reducing the expression of RNP gene (rnpA) which is part of ribonuclease P.
  • the gene encoding the malic enzyme (malic) (sfcA), the gene encoding sortase A (srtA), the gene encoding 4-hydroxybutyrate coenzyme A transferase using the rnpA gene reduction system of the present invention ( Cat2) and cytochrome P450 genes (CYP73A5; cinnamate 4-hydrosylase and CYP98A3) were identified.
  • sfcA malic enzyme
  • srtA sortase A
  • CYP73A5 cinnamate 4-hydrosylase and CYP98A3
  • the present invention relates to a recombinant microorganism into which a gene encoding a protein of interest and an sRNA for a gene encoding ribonuclease P are introduced.
  • the sRNA for the gene encoding the target protein and the gene encoding ribonuclease P may be present in each vector or inserted into the chromosome of the microorganism.
  • the present invention comprises the steps of (a) culturing the recombinant microorganism to induce the expression of the target protein in the recombinant microorganism to produce the target protein; And (b) relates to a method for producing a refractory target protein comprising the step of obtaining the produced target protein.
  • a recombinant recombinant E. coli is prepared, which reduces the expression of a gene encoding a silk protein, a base sequence encoding a glycine tRNA, and an RNP gene (rnpA), which is part of ribonuclease P, and the recombinant As a result of culturing E. coli, it was confirmed that the production of protein three times or more improved.
  • the protein of interest is preferably a protein of 50 kDa or more having a large size as a poorly expressed protein, and may be, for example, a protein such as silk protein, an antibody, an enzyme, cytochrome, sortase A, and the like. It is not.
  • the present invention is to express the target protein by culturing a recombinant microorganism into which the gene encoding the target protein is introduced? Producing; And obtaining the produced protein of interest, in order to enhance the expression of the protein of interest, the method for producing the protein of interest, characterized in that to reduce the expression of ribonuclease P It is about.
  • the protein of interest may be characterized in that the protein or the molecular weight of 50kDa or more, it may be characterized by adding a substance that inhibits the expression of the ribonuclease P.
  • sRNA small RNA
  • sRNA small RNA
  • ribosome binding site refers to the site where the ribosomes bind on the mRNA for transcription of the mRNA.
  • gene should be considered in the broadest sense and may encode a structural or regulatory protein.
  • the regulatory protein includes a transcription factor, a heat shock protein or a protein involved in DNA / RNA replication, transcription and / or translation.
  • the target gene to be suppressed expression may exist as an extrachromosomal component.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, plasmids and “vectors" are sometimes used interchangeably in the context of the present invention.
  • a typical plasmid vector that can be used for this purpose is (a) a replication initiation point that allows for efficient replication to include several to several hundred plasmid vectors per host cell, and (b) a host transformed with a plasmid vector. It has a structure comprising an antibiotic resistance gene that allows cells to be selected and (c) a restriction enzyme cleavage site into which a foreign DNA fragment can be inserted. Synthetic oligonucleotide adapters or linkers can be used to vector and foreign DNA can easily be ligated After ligation, the vector must be transformed into a suitable host cell Transformation can be accomplished by calcium chloride method or electroporation (Neumann, et al., EMBO J). , 1: 841, 1982), etc. As the vector used for the expression of the sRNA according to the present invention, an expression vector known in the art may be used.
  • Sequences are "operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to enable gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s).
  • the DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to the DNA for the polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequence is in contact, and in the case of a secretory leader, is in contact and present within the reading frame.
  • enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • the present invention also relates to a recombinant microorganism into which an expression vector containing the nucleic acid encoding the sRNA is introduced.
  • transformation means introducing DNA into a host so that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • PCR was performed using Pfu polymerase (SolGent, Korea), and the reaction conditions were as follows. The first denaturation was performed once at 95 ° C. for 5 minutes, after which the second denaturation was carried out at 95 ° C. for 30 seconds, the annealing at 57 ° C. for 180 seconds, and the extension at 72 ° C. for 60 seconds. This was repeated 28 times. This was followed by one last extension at 72 ° C. for 5 minutes.
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis to obtain a purified 5000bp PCR product. It was then reacted with the restriction enzyme DpnI (New England Biolabs, USA) for 1 hour, and then ligated with pTetlgy2glyAN vector with T4 DNA ligase (ligase, Roche, Germany), which was transformed into E. coli dH5 ⁇ (FhuA2 lac (del) U169 phoA glnV44 lacZ (del) M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17, Invitrogen).
  • DpnI New England Biolabs, USA
  • the transforming strain was selected from LB agar solid medium (tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, agar 15 g / L) containing 34 mg / L chloramphenicol.
  • Plasmid pTetgly2glyAN-rnpA (sRNA) was obtained (FIG. 1).
  • the produced recombinant plasmid was cut and confirmed by restriction enzyme, and confirmed by analyzing the nucleotide sequence.
  • Plasmid pSH16a (Lee et al., Why and Applications of Chem. Eng., 8: 3969, 2002) was digested with restriction enzymes SpeI and NheI (New England Biolabs, USA) to obtain 1.7 kb fragments with restriction enzyme SpeI.
  • the recombinant plasmid pSH32 was obtained by linkage with the cut plasmid pSH16a. The orientation of linked inserts was confirmed by treatment of restriction enzymes SpeI and NheI.
  • a recombinant plasmid pSH48 was prepared by linking a 1.7 kb fragment obtained by digesting plasmid pSH16a with restriction enzymes SpeI and NheI with plasmid pSH32 cut with restriction enzyme SpeI.
  • a recombinant plasmid pSH64 was constructed by linking a plasmid pSH32 digested with restriction enzymes SpeI and NheI with a plasmid pSH32 cut with restriction enzyme SpeI.
  • a recombinant plasmid pSH80 was constructed by linking a plasmid pSH48 cut from plasmid pSH48 with restriction enzymes SpeI and NheI with plasmid pSH32 cut with restriction enzyme SpeI.
  • a recombinant plasmid pSH96 was constructed by linking a 1.74 kb fragment of plasmid pSH16 digested with restriction enzymes SpeI and NheI with plasmid pSH80 cut with restriction enzyme SpeI.
  • a recombinant plasmid pSH112 was constructed by linking a 3.4 kb fragment obtained by digesting plasmid pSH32 with restriction enzymes SpeI and NheI with plasmid pSH80 cut with restriction enzyme SpeI.
  • a recombinant plasmid pSH128 was constructed by linking a 7.8 kb fragment obtained by digesting plasmid pSH64 with restriction enzymes SpeI and NheI with plasmid pSH64 cut with restriction enzyme SpeI. The orientation of each inserted insert was confirmed by cutting with restriction enzymes SpeI and NheI.
  • sRNA plasmid pTetgly2glyAN-rnpA
  • silk protein obtained in Example 1 were used.
  • pSH80, pSH96 and pSH112 were transformed into E.
  • Plasmids pACYC184 and pSH16, pSH32, pSH64 E. coli BL21 (DE3) strains transformed with one type of pSH96 and pSH128 were used. The transformed strains were inoculated in 10 ml LB liquid medium (Tryptone 10 g / L, yest extract 5 g / L, NaCl 5 g / L) containing 34 mg / L chloramphenicol and 25 mg / L kanamycin and 1% arabinose. The shaker was incubated at 25 ° C. at 220 rpm, and then shaken at 220 ° C. at 37 ° C. with the same medium conditions.
  • strains transformed with plasmids pSH9696 and pTetgly2glyAN were expressed in OD600 0.4, respectively, and the SDS-PAGE was measured using a densitometer, and the averaged results are shown in FIG. 4B, and were performed with plasmid pSH128. The results are shown in FIG.
  • Example 4 Confirmation of increase of mRNA by decreasing expression of rnpA gene by sRNA system
  • rnpA gene which is a part of ribonuclease P
  • sRNA system it was confirmed whether my mRNA is increased.
  • the plasmids pTetgly2glyAN-rnpA (sRNA) and pSH32 obtained in Example 1 were transferred to Escherichia coli BL21 (DE3) (F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene (New). England Biolabs, USA).
  • strains of E. coli BL21 (DE3) transformed with plasmids pACYC184 and pSH32 were used.
  • Transformed strains were inoculated in 10 ml LB liquid medium (Tryptone 10 g / L, yest extract 5 g / L, NaCl 5 g / L) containing 34 mg / L chloramphenicol and 25 mg / L kanamycin and 1% arabinose
  • the shaker was incubated at 25 ° C. at 220 rpm, and then shaken at 220 ° C. at 37 ° C. with the same medium conditions.
  • 1mM IPTG was added to induce silk protein gene expression.
  • the culture medium was sampled, and ribonucleic acid (RNA) was extracted from the obtained cell pellet by centrifugation at 10,000 g for 10 minutes at 4 ° C.
  • RNA ribonucleic acid
  • RNA was mixed for 1 minute after addition of 1 ml trizol, left at room temperature for 5 minutes, and then mixed for 15 seconds by adding 20% of chloroform in a total volume, followed by centrifugation at 13,000 rpm for 15 minutes. Then, the resulting supernatant was transferred to a new tube, the same amount of isopropanol was added carefully mixed and then centrifuged again at 13,000 rpm for 30 minutes, the supernatant was discarded and 1 ml of 70% ethanol was added again to 13,000 rpm. After 5 minutes centrifugation at and repeated again, dried at room temperature, and dissolved in 30ul RNase-free distilled water.
  • qPCR was performed using Rocketstrip (Bioneer, Korea). After adjusting the extracted ribonucleic acid to 500ng, 2 ⁇ l of dN9 primer was added, and the total volume was adjusted to 20 ⁇ l with RNase-free distilled water.
  • the PCR reaction conditions were as follows: The first annealing was performed at 30 ° C. for 150 seconds. Complementary nucleic acid synthesis (cDNA synthesis) was carried out at 60 °C 1 hour, after which the heat inactivation (heat inactivation) was performed at 95 °C 300 seconds.
  • the fed-batch fermentation is carried out using a 6.6 L fermenter (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co.) with 1.6 L of R / 2 medium, 10 g / L glucose, 0.7 g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O and antibiotics (50 ⁇ g / mL kanamycin and / or 35 ⁇ g / mL chloramphenicol) was added, and air saturation was controlled while increasing agitation to 1000 rpm to adjust dissolved oxygen to 40%.
  • a 6.6 L fermenter Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co.
  • antibiotics 50 ⁇ g / mL kanamycin and / or 35 ⁇ g / mL chloramphenicol
  • Feeding solution 700g / L glucose, 20g / L MgSO4 ⁇ 7H2O was used as the feeding solution, the pH was adjusted by using 28% (v / v) ammonia solution, expressed by 1mM IPTG when the OD600 was about 70 Sampling was carried out at intervals of 2 hours for 8 hours after induction, and cell growth and protein concentration obtained are shown in FIG. 7. As a result, 0.9 g / L of protein was obtained by 30% more than the known 0.7 g / L.
  • the gene encoding the malic enzyme (malic) (sfcA, SEQ ID NO: 6), the gene encoding sortase A (srtA, SEQ ID NO: 7), 4-hydroxybutyrate coenzyme Expression of a gene encoding A transferase (Cat2, SEQ ID NO: 8) and cytochrome P450 gene (CYP73A5; cinnamate 4-hydrosylase: SEQ ID NO: 9 and CYP98A3: SEQ ID NO: 10) was confirmed. Sortase A gene was synthesized from Bioneer, sfcA, Cat2, CYP73A5 and CYP98A3 gene was obtained by PCR using the following primers.
  • sfcA_F 5'- CCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • Cat2_F 5'- GAATTCATGGAGTGGGAAGAGATATATA? 3 '(SEQ ID NO: 13)
  • Cat2_R 5'- GGTACCCTAAAATCTCTTTTTAAATTCATT-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • CYP73A5_F 5'-GCGAAGCTTACAGTTCCTTGGTTTCATAA-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • CYP73A5_R 5'-GTACATATGATGGACCTCCTCTTGCTGG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • CYP98A3_F 5'- GGATCCATGTCGTGGTTTCTAATAGC? 3 '(SEQ ID NO: 17)
  • CYP98A3_R 5'-GAATTCTTACATATCGTAAGGCACGC-3 '(SEQ ID NO: 18)
  • sRNA SEQ ID NO: 1
  • sfcA SrtA
  • Cat2 genes of rnpA were inserted into pET30a (+) and pTac15k (Addgene, USA), respectively, to obtain a recombinant vector, one each of E. coli BL21 (DE3).
  • pET30a (+)
  • pTac15k Additional vector
  • E. coli BL21 E. coli BL21 (DE3).
  • a strain transformed with a vector in which the sfcA, srtA and Cat2 genes were inserted into pET30a and pTac15k was used.
  • the transformed strains were inoculated in 10 ml LB liquid medium (Tryptone 10 g / L, yest extract 5 g / L, NaCl 5 g / L) containing 34 mg / L chloramphenicol and 25 mg / L kanamycin and 1% arabinose.
  • the shaker was incubated at 25 ° C. at 220 rpm, and then shaken at 220 ° C. at 37 ° C. with the same medium conditions. Then, when the culture medium had an OD of 0.4, 1 mM IPTG was added to induce the expression of each protein.
  • the culture medium was sampled, and the obtained culture medium was centrifuged at 10,000 g for 10 minutes at 4 ° C., and the obtained cell pellet was dissolved in TE buffer solution and 5 ⁇ Laemmli sample buffer solution. Equal amounts (0.024 mg) of samples were separated using 10% SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad, USA) solution.
  • malic enzyme malic
  • sortase A 4-hydroxybutyrate coenzyme A transferase
  • cytochrome P450 cinnamon 4-hydrosylase and CYP98A3
  • the present invention by reducing the expression of the rnpA gene it is possible to significantly enhance the expression of the target protein, especially the high molecular weight of the non-expression protein is useful for increasing the protein productivity.

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Abstract

본 발명은 재조합 미생물에서, 난발현 재조합 단백질의 생산을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA가 되입되어 있는 재조합 미생물을 이용하여, 난발현 재조합 단백질의 생산을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, rnpA 유전자의 발현 감소를 통해 큰 크기의 재조합 단백질, 난발현 단백질 및 유용 단백질의 발현을 획기적으로 증진시킬 수 있다.

Description

rnpA 유전자 발현감소를 통한 재조합단백질의 제조방법
본 발명은 재조합 미생물에서, 재조합 단백질의 생산을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA가 도입되어 있는 재조합 미생물을 이용하여, 재조합 단백질의 생산을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
유전자 조작 기술의 발전으로 박테리아 및 여러 동식물들을 이용한 유용 단백질의 대량생산 연구가 많이 이루어지고 있다. 대장균을 포함한 박테이라, P. pastoris 같은 효모 등 유용 단백질을 대량 생산하는데 사용되는 숙주세포들이 존재 하나 대장균이 가장 널리 이용되고 있으며, 이에 관한 연구도 가장 많이 이루어지고 있다 (Choi et al., Chem. Eng. Sci., 66: 876, 2006; Lee, Trends Biotechnol., 14:98, 1996).
그러나, 생산하고자 하는 유용 단백질의 사이즈가 자연적으로 존재하는 단백질보다 크거나 발현이 어려울 경우 많은 문제점들이 도출되고 있다. 단백질의 크기가 클 경우 메신저 리보 핵산 (messanger RNA: mRNA)의 부족으로 인해 단백질의 번역과정 자체에 어려움을 겪어 원하는 전체 크기의 단백질 발현이 어렵다. 또한, 대장균 내에서 자연적으로 존재하는 단백질이 아닌 재조합 단백질의 경우 프로테아제의 의한 분해 (proteolysis) 및 리보핵산분해효소(RNase)에 의한 mRNA 분해에 의해 단백질 발현에 어려움이 있다(GoBringer et al., J Bacteriol., 188: 6816, 2006; Olson et al., PLoS Pathog., 7(2): e1001287, 2011; Jung et al., Biochem Biophys Res Commun., 186(3):1463, 1992; Altman et al., Phil Trans R Soc., 366, 2011; Turrini et al., PLos One., 7(3): e32456, 2012).
이에, 본 발명자들은 난발현성 외래단백질의 생산을 증가시키기 위한 단백질 발현시스템을 개발하고자 예의 노력한 결과, 상기 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입시켜, 외래단백질을 발현시킴에 있어서, 리보뉴클레이즈 P(ribonuclease P)의 일부인 rnpA 유전자의 발현을 감소시킬 경우, 난발현성 외래단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 주된 목적은 난발현성 외래단백질의 생산을 증가시키기 위하여, 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA를 함유하는 목적단백질 발현용 재조합 벡터 및 상기 재조합벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질의 발현을 유도하여 목적단백질을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생산된 목적단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 목적단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 발현? 생산하는 단계; 및 상기 생산된 목적단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법에 있어서, 목적단백질의 발현을 증진시키기 위하여, 리보뉴클레이즈 P의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.
도 1은 플라스미드 pTetly2glyAN-rnpA(sRNA)의 유전자 지도이다.
도 2는 16번 반복된 실크 단백질과 32번 반복된 실크 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2와 3: 플라스미드 pSH16으로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 각각 발현 유도시킨 결과; 레인 4와 5: 플라스미드 pSH16와 pACYC184-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 각각 발현 유도시킨 결과; 레인 6과 7: 플라스미드 pSH32으로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 각각 발현 유도시킨 결과; 레인 8과 9: 플라스미드 pSH32와 pACYC184-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 각각 발현 유도시킨 결과)
도 3은 64번 반복된 실크 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2: pSH64로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도시킨 결과; 3: 플라스미드 pSH64와 pACYC184-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 각각 발현 유도시킨 결과)
도 4a은 96번 반복된 실크 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2: pSH96으로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도시킨 결과; 3: 플라스미드 pSH96과 pACYC184-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 각각 발현 유도시킨 결과)
도 4b는 플라스미드 pSH96 그리고 pSH96와 pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)로 각각 형질전환 된 균주를 OD600 0.4에서 각각 발현 유도시킨 후 수행한 SDS-PAGE를 덴지토미터를 이용하여 측정한 후 단백질 발현량을 평균한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 128번 반복된 실크 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2: pSH128으로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도시킨 결과; 3: 플라스미드 pSH128과 pACYC184-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 각각 발현 유도시킨 결과)
도 6은 rnpA 유전자의 발현감소에 따른 세포내 mRNA가 증가하는지를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 유가식 배양에 의한 96번 반복된 실크 단백질의 생산량을 나타낸 그래프(도 7a) 및 전기영동 결과이다(도 7b).
도 8은 본 발명의 rnpA 유전자의 발현감소 시스템을 이용한 실크단백질 이외의 다른 난발현 단백질에 대한 발현증가를 확인한 전기영동 결과를 나타낸 것이다. (a) 는 말릭 엔자임 (sfcA) 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2: BL21(DE3)만 발현 유도시킨 결과; 레인 3 과 4: sfcA로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과; 레인 5와6: sfcA와 rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과). (b)는 Cat2 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2와3: Cat2로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과; 레인 4와5: Cat2-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과). (c) 는 srtA 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2와3: srtA로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과; 레인 4와5: srtA-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과). (d)는 CYP73A5 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2와3: CYP73A5로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과; 레인 4와5: CYP73A5-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과). (e) 는 CYP98A3 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2와3: CYP98A3로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과; 레인 4와5: CYP73A5-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 발현 유도 시킨 결과).
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
본 발명에서는 리보뉴클레이즈 P의 발현을 감소시켜 세포내 유용 단백질의 mRNA 농도를 증가시켜, 종래 재조합 미생물에서 원활하게 생산되지 못했던, 재조합 미생물에서 재조합 난발현 단백질의 발현을 향상시키는 방법을 개발하였다.
본 발명에서는 sRNA를 사용한 sRNA 시스템을 사용하여, 리보뉴클리에이즈 P(ribonuclease P)의 일부인 rnpA 유전자의 발현을 감소시킨 결과, 단발현 단백질인 고분자량의 실크단백질의 발현이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명에서 "난발현 단백질"이란 분자량 50kDa 이상의 단백질을 의미한다.
따라서, 일관점에서, 본 발명은 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA를 함유하는 목적단백질 발현용 재조합 벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 목적단백질은 난발현 단백질, 실크단백질, 항체, 효소, 사이토크롬, sortase A 등의 단백질 일 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 sRNA는 rnpA 유전자에 대한 sRNA인 것을 특징으로할 수 있으며, 상기 sRNA는 서열번호 1~3 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, rnpA 유전자의 발현을 감소시키는 한, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 사용할 수 있는 단백질 생산용 미생물로는 에스케리치아 (Escherichia), 슈도모나스 (Pseudomoas), 시카로마이세스 (Saccharomyces) 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 에스케리치아 (Escherichia) 미생물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균일 수 있다. 특히, 대장균은 산업적으로 많이 사용되고 있는 유전정보 및 배양조건이 알려져 있어 쉽게 산업화 할 수 있다는 장점이 있다.
발명의 일 양태에서는 Nephila clavipes에서 얻은 거미줄 (dragline silk) 단백질을 변형시킨 실크 단백질을 코딩하는 유전자와 글리신 tRNA를 코딩하는 염기 서열과 리보뉴클레이즈 P의 일부인 알엔피에이 (rnpA) 유전자 발현을 감소시키는 형질전환된 재조합 대장균을 제작하고, 상기 재조합 대장균을 배양한 결과, 3배 이상의 단백질의 생산이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 실크단백질은 특정 아미노산 염기서열 (SGRGGLGGTGAGMAAAAAMGGAGQGGYGGLGSQG)이 반복된 구조를 가지는 반복 단백질로 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 및 128번 반복된 실크 단백질의 발현이 리보뉴클레이즈 P의 일부인 알엔피에이 (rnpA) 유전자 발현을 감소시킴으로써 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, eGFP, sfcA, 그리고 full-length의 IgG 항체 또한 리보뉴클레이즈 P의 일부인 알엔피에이 (rnpA) 유전자 발현을 감소함으로써 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.
길이가 긴 재조합 단백질, 난발현 단백질의 생산이 리보뉴클레이즈 P의 일부인 알엔피에이 (rnpA) 유전자 발현 감소를 통해 증가되는 결과를 보면, 길이에 따라 메신저 리보 핵산 (messenger RNA)의 분해가 단백질 발현에 큰 영향을 미치고, 이에 해당하는 유전자를 감소시킴으로써 목적단백질 과발현에 유용하다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
본 발명의 다른 양태에서는 본 발명의 rnpA 유전자 감소 시스템을 이용하여 말릭 효소(malic)를 코딩하는 유전자(sfcA), sortase A를 코딩하는 유전자(srtA), 4-hydroxybutyrate coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자(Cat2) 및 cytochrome P450 유전자(CYP73A5; cinnamate 4-hydrosylase 와 CYP98A3)의 발현을 확인하였으며, 그 결과, rnpA 유전자의 sRNA와 상기 각 단백질을 코딩하는 유전자를 함께 발현하는 균주의 경우, sRNA가 발현되지 않는 균주에 비하여, 높은 단백질 발현량을 나타내는 것을 확인하였다(도 8).
다른 관점에서, 본 발명은 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA는 각각의 벡터에 존재하거나, 미생물의 염색체 상에 삽입되어 존재할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 상기 재조합 미생물에서 목적단백질의 발현을 유도하여 목적단백질을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생산된 목적단백질을 수득하는 단계를 포함하는 난발현성 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 실크 단백질을 코딩하는 유전자와 글리신 tRNA를 코딩하는 염기 서열과 리보뉴클레이즈 P의 일부인 알엔피에이 (rnpA) 유전자 발현을 감소시키는 형질전환된 재조합 대장균을 제작하고, 상기 재조합 대장균을 배양한 결과, 3배 이상의 단백질의 생산이 향상되는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에서는 eGFP, sfcA 및 full-length의 IgG 항체를 코딩하는 유전자와 rnpA 유전자의 sRNA를 동시에 발현시킴으로서, 상기 단백질들의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 목적단백질은 난발현성 단백질로 사이즈가 큰 단백질50kDa이상의 단백질인 것이 바람직하고, 예를 들면, 실크단백질, 항체, 효소, 사이토크롬, sortase A 등의 단백질 일 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 목적단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 발현? 생산하는 단계; 및 상기 생산된 목적단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법에 있어서, 목적단백질의 발현을 증진시키기 위하여, 리보뉴클레이즈 P의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 목적단백질은 난발현 단백질 또는 분자량 50kDa이상의 단백질인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 리보뉴클레이즈 P의 발현을 억제시키는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "sRNA (small RNA)"란, 단백질로 번역되지 않으며 상보적 결합을 통해 특정 mRNA의 번역을 효과적으로 억제하는, 보통 염기 서열의 길이가 200개 이하의 짧은 길이의 RNA이다.
본원에서 "리보좀 결합 부위(ribosome binding site)"란, mRNA의 전사를 위하여 리보좀이 mRNA상에 결합하는 부위를 말한다.
본원에서 "유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 표적 유전자는 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.
본원에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 sRNA의 발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.
염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명은 또한, 상기 sRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재조합 플라스미드 pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)의 제작
유전자 조작을 위한 모든 과정은 표준화된 방법을 따랐다 (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
pTetlgy2glyAN 벡터(대한민국등록특허 1147860호)에 sRNA 시스템을 도입하기 위하여, 유전자 조작을 수행하였고, rnpA 유전자의 번역에 관여 하는 리보좀 바인딩 사이트를 확보하기 위하여 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머를 사용하여 inverse-PCR을 수행하여, rnpA의 sRNA(서열번호 1)를 수득하였다.
서열번호 4: 5' -cctgggaaatgcgagcttaaccactttctgttgggccattgcattg -3'
서열번호 5: 5' -GCAACCATTATCACCGCCA -3'
PCR은 Pfu 폴리머라제 (polymerase) (SolGent, 한국)를 사용하였으며, 반응 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성 (denaturation)은 95℃에서 5 분간 한 번하였으며, 이 후 두 번째 변성은 95℃에서 30 초간, 결합 (annealing)은 57℃에서 180 초간, 연장 (extension)은 72℃에서 60 초간 수행하였으며, 이를 28 회 반복하였다. 이 후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한 번 수행하였다.
상기 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동하여, 정제된 5000bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 DpnI (New England Biolabs, 미국)로 1시간 반응시킨 후, T4 DNA 리가아제 (ligase, Roche, 독일)로 pTetlgy2glyAN 벡터와 라이게이션시키고, 이를 대장균 dH5α (FhuA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17, Invitrogen)에 형질전환시켰다.
형질전환 균주는 34 mg/L 클로람페니콜 (chloramphenicol)을 포함한 LB 아가 고체배지 (트립톤 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L, 아가 15 g/L)에서 선택하여, 재조합 플라스미드 pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)를 수득하였다 (도 1). 제작된 재조합 플라스미드는 제한효소로 잘라서 확인하고, 염기서열을 분석하여 확인하였다.
실시예 2: 고분자량의 실크 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드의 제작
큰 크기의 난발현 유전자인 Nephila clavipes 유래 거미줄 (dragline silk) 단백질을 변형시킨 실크 단백질을 코딩하는 유전자를 32번 반복되도록 함유하는 재조합 플라스미드를 제작하기 위하여, 실크 단백질을 코딩하는 유전자가 16번 반복되는 플라스미드 pSH16a (Lee et al., Theories and Applications of Chem. Eng., 8:3969, 2002)를 제한효소 SpeI과 NheI(New England Biolabs, 미국)으로 절단하여 1.7 kb의 조각을 얻어, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH16a와 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH32를 수득하였다. 연결된 인서트 (insert)의 방향은 제한효소 SpeI과 NheI을 처리하여 확인하였다.
같은 방법으로, 플라스미드 pSH16a를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 1.7 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH32와 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH48를 제작하였다. 플라스미드 pSH32를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 3.4 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH32와 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH64를 제작하였다. 플라스미드 pSH48를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 5.1 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH32와 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH80을 제작하였다. 플라스미드 pSH16를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 1.74 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH80과 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH96을 제작하였다. 플라스미드 pSH32를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 3.4 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH80과 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH112를 제작하였다. 플라스미드 pSH64를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 7.8 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH64와 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH128을 제작하였다. 각각 연결된 인서트 (insert)의 방향은 제한효소 SpeI과 NheI으로 잘라서 확인하였다.
실시예 3: sRNA 시스템에 의한 알엔피에이 (rnpA) 유전자의 발현 감소를 통한 실크 단백질 발현의 증가확인
실크 단백질 생산에 있어서 글리신 tRNA 유전자 동시 과량발현과 ribonuclease P (rnpA) 유전자 발현을 sRNA시스템을 이용하여 감소시킨 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1에서 수득한 플라스미드 pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)와 실크 단백질을 코딩하는 유전자를 각각 16번, 32번, 48번, 64번, 80번 96번 및 112번 반복하여 함유하는 플라스미드 pSH16, pSH32, pSH48, pSH64. pSH80, pSH96 및 pSH112을 각각 1종 씩 대장균 BL21(DE3) (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 형질전환시켰다.
대조군으로 플라스미드 pACYC184와 pSH16, pSH32, pSH64. pSH96 및 pSH128을 각각 1종 씩 형질전환된 대장균 BL21 (DE3) 균주를 사용하였다. 이렇게 형질전환된 균주들을 34mg/L 클로람페니콜과 25mg/L 카나마이신 및 1% 아라비노즈가 포함된 10ml LB 액체배지 (트립톤 10 g/L, yest extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 접종하여 25℃에서 220rpm에서 진탕배양하고, 이후, 같은 상기 배지 조건과 37℃에서 220rpm으로 진탕배양하였다. 이후, 배양액의 OD가 0.4 일 때, 1mM IPTG를 첨가하여 실크 단백질 유전자 발현을 유도하였다. 발현 유도 4 시간 후에 배양액을 샘플링하고, 채취된 배양액을 4℃, 10,000 g에서 10분간 원심분리를하여 수득한 세포펠렛을 TE 완충용액과 5x Laemmli 샘플 완충용액에 녹였다. 동량(0.024 mg)의 샘플을 10% SDS-PAGE를 이용해 분리하고, Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad, 미국) 용액으로 염색하여, GS-710 Calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad, 미국)를 이용하여 정량하였다 (도 2~4).
또한, 플라스미드 pSH9696과 pTetgly2glyAN로 형질전환된 균주를 OD600 0.4에서 각각 발현 유도시킨 후 수행한 SDS-PAGE를 덴지토미터를 이용하여 측정한 후 평균한 결과를 도 4b에 나타내었으며, 플라스미드 pSH128로 수행한 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과, ribonuclease P (rnpA)의 발현 감소를 통해 16번 반복된 실크 단백질의 발현은 대조군에 비해 150% 정도 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 32번 반복된 실크 단백질의 발현은 대조군에 비하여 300% 정도 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 48번 반복된 실크단백질의 발현은 300%, 64번 반복된 실크단백질의 발현은 300%, 80번 반복된 실크단백질의 발현은 300%, 112번 반복된 실크단백질의 발현은 200%, 128번 반복된 실크단백질의 발현은 150% 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: sRNA 시스템에 의한 rnpA 유전자의 발현 감소를 통한 mRNA의 증가 확인
본 실시예에서는 재조합, 난발현, 및 유용 단백질 생산에 있어서 메신저 리보 핵산의 분해를 막기 위해 ribonuclease P의 일부인 rnpA 유전자의 발현을 sRNA 시스템을 도입하여 감소시켰으며, 상기 rnpA 유전자의 발현감소에 따른 세포내 mRNA가 증가하는지를 확인하였다.
먼저, 실시예 1에서 수득한 플라스미드 pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)와 pSH32를 대장균 BL21 (DE3) (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 형질전환 시켰다.
대조군으로 플라스미드 pACYC184와 pSH32로 형질전환한 대장균 BL21 (DE3) 균주를 사용하였다. 형질전환된 균주들을 34 mg/L 클로람페니콜과 25mg/L 카나마이신 및 1% 아라비노즈가 포함된 10ml LB 액체배지 (트립톤 10 g/L, yest extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 접종하여 25℃에서 220rpm에서 진탕배양하고, 이후, 같은 상기 배지 조건과 37℃에서 220rpm으로 진탕배양하였다. 이후, 배양액의 OD가 0.4 일 때, 1mM IPTG를 첨가하여 실크 단백질 유전자 발현을 유도하였다. 발현 유도 4 시간 후에 배양액을 샘플링하고, 채취된 배양액을 4℃, 10,000 g에서 10분간 원심분리를하여 수득한 세포펠렛으로부터 리보핵산(RNA)를 추출하였다.
RNA의 추출은 1ml 트라이졸을 추가 후 1분 동안 혼합하고 5분 상온에 방치 한 후 전체 부피의 20%의 클로포름을 추가하여 15초 동안 혼합 후 13,000 rpm에서 15분동안 원심분리하였다. 이후 생성된 상층액을 새 튜브에 옮긴 후 같은 동량의 아이소프로파놀을 추가하여 조심스럽게 혼합 후 다시 13,000 rpm에 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 버린 후 70% 에탄올 1ml을 추가하여 다시 13,000 rpm에서 5분 원심분리 후 다시 반복 후 상온에서 건조키고, 30㎕의 RNase-free 증류수에 녹였다. 추출한 리보핵산을 상보핵산(complementary DNA: cDNA)으로 치환하기 위해 Rocketstrip (Bioneer, 한국)을 사용하여 qPCR을 진행하였다. 추출한 리보핵산을 500ng으로 맞춘 후 dN9 프라이머 2㎕를 첨가하고, RNase-free 증류수로 총 부피 20㎕로 맞추었으며, PCR 반응조건은 다음과 같다: 첫 번째 결합 (annealing)은 30℃에서 150 초간, 상보핵산 합성 (cDNA synthesis)은 60℃에서 1시간 수행하였으며, 이 후 불활성화 (heat inactivation)는 95℃에서 300초간 수행하였다.
제작된 상보핵산을 이용하여 RT-PCR를 진행하기 위해 총 부피 20㎕에 RNase-free 증류수 8㎕, SYBR Green Mastermix (Enzynomics, 한국) 10 ㎕, 1/10으로 희석한 상보핵산 1㎕, 그리고 프라이머 각각 0.5㎕씩 첨가하여 맞춰주었으며, 반응조건은 다음과 같다: 첫 번째 활성화 (activation)은 95℃에서 10분간, 이후 두번 째 변성 (denaturation)은 95℃ 에서 30초간, 결합 (annealing)은 60℃ 에서 30초간, 그리고 연장 (extension)은 72℃에서 30초간 수행하고 이를 총 45번 반복하였다. Melting curve를 확인하기 위하여 55℃에서 95℃까지 0.5℃씩 증가 시켜 5초간 반응시켜 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 ribonuclease P (rnpA)의 발현이 감소된 세포의 경우, 리보핵산 수가 24배 많은 것을 확인하였으며, 이는 ribonuclease P (rnpA)의 발현 감소에 의하여, 리보핵산의 분해가 방지되는 것을 의미한다.
실시예 5: 유가식 발효에 의한 거미실크 단백질 생산량 증가 확인
실시예 3에서 제작한 플라스미드 pSH96과 pACYC184-rnpA(sRNA)로 형질전환된 균주를 유가식 배양으로 배양하여, 단백질 생산량 증가를 확인하였다.
유가식 발효는 6.6L 발효기 (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co.) 사용으로 1.6L의 R/2 배지와 10g/L glucose, 0.7g/L MgSO4·7H2O와 항생제 (50 μg/mL kanamycin and/or 35 μg/mL chloramphenicol)를 첨가하였으며, 용존산소를 40%로 조절하기 위하여, agitation을 1000rpm까지 증가시키면서 공기포화도(air saturation)을 조절하였다. 피딩용액(feeding solution)으로는 700g/L glucose, 20g/L MgSO4·7H2O를 사용하였고 pH는 28% (v/v) 암모니아 용액을 사용하여 조절하였으며, OD600이 약 70이 되었을 때 1mM IPTG로 발현을 유도 후 8시간동안 2시간 간격으로 샘플링 진행하였으며, 세포성장과 수득되는 단백질 농도를 도 7에 나타내었다. 그 결과, 기존의 0.7g/L로 알려진 것 보다 30% 증가한 0.9g/L의 단백질을 얻을 수 있었다.
실시예 6: rnpA 유전자 발현 감소를 통한 그 외 단백질 발현의 증가확인
본 발명의 rnpA 유전자 감소 시스템을 이용하여 실크단백질 코딩 유전자 외에 말릭 효소(malic)를 코딩하는 유전자(sfcA, 서열번호 6), sortase A를 코딩하는 유전자(srtA, 서열번호 7), 4-hydroxybutyrate coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자(Cat2, 서열번호 8) 및 cytochrome P450 유전자(CYP73A5; cinnamate 4-hydrosylase:서열번호 9 와 CYP98A3:서열번호 10)의 발현을 확인하였다. Sortase A 유전자는 Bioneer에서부터 합성하였으며, sfcA, Cat2, CYP73A5 및 CYP98A3 유전자는 하기 프라이머를 이용하여 PCR로 수득하였다.
sfcA_F: 5’- CCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT-3’(서열번호 11)
sfcA_R: 5’- TCTAGATTAGATGGAGGTACGGCGGTA-3’(서열번호 12)
Cat2_F: 5’- GAATTCATGGAGTGGGAAGAGATATATA ?3’(서열번호 13)
Cat2_R: 5’- GGTACCCTAAAATCTCTTTTTAAATTCATT-3’(서열번호 14)
CYP73A5_F: 5‘-GCGAAGCTTACAGTTCCTTGGTTTCATAA-3’(서열번호 15)
CYP73A5_R: 5‘-GTACATATGATGGACCTCCTCTTGCTGG-3’(서열번호 16)
CYP98A3_F: 5'- GGATCCATGTCGTGGTTTCTAATAGC ?3'(서열번호 17)
CYP98A3_R: 5'-GAATTCTTACATATCGTAAGGCACGC-3'(서열번호 18)
rnpA의 sRNA(서열번호 1)와 sfcA,srtA 및 Cat2 유전자를 각각 pET30a (+)와(Addgene, 미국) pTac15k (Addgene, 미국)에 삽입하여 재조합 벡터를 수득하고, 각각 1종 씩 대장균 BL21 (DE3) 균주에 형질전환시켰다. 대조군으로는 pET30a와 pTac15k에 sfcA,srtA 및 Cat2 유전자를 각각 삽입한 벡터로 형질전환된 균주를 사용하였다.
이렇게 형질전환된 균주들을 34mg/L 클로람페니콜과 25mg/L 카나마이신 및 1% 아라비노즈가 포함된 10ml LB 액체배지 (트립톤 10 g/L, yest extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 접종하여 25℃에서 220rpm에서 진탕배양하고, 이후, 같은 상기 배지 조건과 37℃에서 220rpm으로 진탕배양하였다. 이후, 배양액의 OD가 0.4 일 때, 1mM IPTG를 첨가하여 각 단백질의 발현을 유도하였다. 발현 유도 4 시간 후에 배양액을 샘플링하고, 채취된 배양액을 4℃, 10,000 g에서 10분간 원심분리를하여 수득한 세포펠렛을 TE 완충용액과 5x Laemmli 샘플 완충용액에 녹였다. 동량(0.024 mg)의 샘플을 10% SDS-PAGE를 이용해 분리하고, Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad, 미국) 용액으로 염색하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, rnpA의 sRNA와 함께 발현된 말릭 효소(malic), sortase A, 4-hydroxybutyrate coenzyme A transferase (Cat2) 와 cytochrome P450(cinnamate 4-hydrosylase 와 CYP98A3)는 rnpA의 sRNA가 삽입되지 않은 벡터에서 발현된 단백질들보다 현저히 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따르면, rnpA 유전자의 발현 감소를 통해 목적단백질, 특히 분자량이 큰 난발현 단백질의 발현을 획기적으로 증진시킬 수 있어 단백질 생산성을 높이는데 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (15)

  1. 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA를 함유하는 목적단백질 발현용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목적단백질은 난발현 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 sRNA는 rnpA 유전자에 대한 sRNA인 것을 특징으로하는 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 sRNA는 서열번호 1~3 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제2항에 있어서, 상기 단백질은 실크단백질, 항체, 싸이토크롬, 효소 및 sortase A로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. 제1항의 재조합벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  7. 목적단백질을 코딩하는 유전자와 리보뉴클레이즈 P를 코딩하는 유전자에 대한 sRNA가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 목적단백질은 난발현 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 sRNA는 rnpA 유전자에 대한 sRNA인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 sRNA는 서열번호 1~3 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 다음 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법:
    (a) 제5항 또는 제6항의 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 발현시키는 단계; 및
    (b) 상기 발현된 목적단백질을 수득하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 목적단백질은 난발현 단백질 또는 분자량 50kDa이상의 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 목적단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 발현. 생산하는 단계; 및 상기 생산된 목적단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법에 있어서,
    목적단백질의 발현을 증진시키기 위하여, 배양단계에서 리보뉴클레이즈 P의 발현을 감소시키는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 목적단백질은 난발현 단백질 또는 분자량 50kDa 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 리보뉴클레이즈 P의 발현을 억제시키는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
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