JPH0591866A - プロトクロロフイリドを生産するプレクトネマ属に属する微生物およびその微生物による該色素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 プレクトネマ属に属する微生物由来のｆｒｘ
Ｃ遺伝子およびその周辺配列を用い、該ｆｒｘＣ遺伝子
に対して遺伝子破損処理を行って得た破損ｆｒｘＣ遺伝
子および該周辺配列を含むＤＮＡをプレクトネマ属に属
する宿主微生物に導入し、形質転換することにより得ら
れる、暗条件においてクロロフィルを実質的に生産せ
ず、かつプロトクロロフィリドを生産することを特徴と
するプレクトネマ属に属する変異株微生物、および該変
異株微生物を用いるプロトクロロフィリドの製造法。 【効果】 プロトクロロフィリドが効率的に製造し得
る。プロトクロロフィリドはポルフィリン環を有する抗
癌物質の出発原料となり得、また、天然色素として使用
できる有用なものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は天然色素プロトクロロフ
ィリドを生産するプレクトネマ属に属する変異株微生物
およびその微生物による該色素の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】天然色素プロトクロロフィリドは、クロ
ロフィリドａを経て葉緑素であるクロロフィルａに変換
される色素である。プロトクロロフィリドは、濃度及び
溶媒条件により、黄色から黄緑色、さらに茶色がかった
オレンジ色を呈する色素であり、エーテル中での特徴的
な吸収極大が、431-436,571-574 及び623-625nm 付近に
認められ、エーテル中での蛍光及び、励起スペクトルの
ピークの値は、625nm(励起光430nm)付近及び、431nm(蛍
光625nm)付近という物性を有する。構造としては、ポル
フィリン環の中心にＭｇ原子が配位した化合物であり、
構造式も解明されており、モノビニル体とジビニル体が
知られている。近年、ポルフィリン環を有する抗癌物質
の研究も盛んに行われており、プロトクロロフィリドは
このポルフィリン環を有する抗癌物質の出発原料となり
得る有用なものである。また、濃度及び溶媒条件によ
り、黄色から黄緑色、さらに茶色がかったオレンジ色を
呈する天然色素として、食品等の添加物に利用できるも
のでもある。

【０００３】プロトクロロフィリドからクロロフィリド
ａへの変換は、高等植物では光条件下で起こり、したが
って従来、プロトクロロフィリドは、暗所にて発芽させ
た植物体の芽生え、例えばキュウリ、トウモロコシ、オ
オムギ等から、アセトン−アンモニア水混液中、ホモジ
ナイズして軽油やヘキサンで分配を行い、アセトン相よ
りエーテル抽出し、粗精製物を得、さらにＴＬＣ等のク
ロマトグラフィーにより精製採取していた（ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー 225，第1266−
1272頁，1979年、およびバイオキミカ・エト・バイオフ
ィジュカ・アクタ 286 ,第36-54 頁，1972年）。一
方、下等光合成微生物におけるプロトクロロフィリドか
らクロロフィリドａへの変換経路は、あまり明確に解明
されていないが、ロドシュードモナス・スフェロイデス
（Rhodopseudomonas spheroides ）の変異株ＭＣ−７ま
たは８−３２株から、硫安沈澱、アセトン溶解、エーテ
ル抽出、ＭｇＣＯ₃ 飽和水添加による不純物除去等およ
びＴＬＣ分離等により精製していた（ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー 225，第1266−1272
頁，1979年、およびメソッズ・エンザイモロジー 24 ,
第407-411 頁，1972年）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来より、公知のプロ
トクロロフィリドの製造方法とは別の効率的な製造方法
の開発が待たれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するため、プレクトネマ属に属する微生物を研
究し、天然色素プロトクロロフィリドを生産することを
特徴とするプレクトネマ属に属する変異株微生物を遺伝
操作的に作製することにより、本発明を完成するに至っ
た。即ち、本発明は、暗条件においてクロロフィルを実
質的に生産せず、かつプロトクロロフィリドを生産する
ことを特徴とするプレクトネマ属に属する変異株微生
物、およびその微生物を用いたプロトクロロフィリドの
製造法である。

【０００６】プレクトネマ属に属する微生物は、光合成
能を有するグラム陰性細菌であるラン藻類に分類されて
いる。プレクトネマ属は、Rippkaらの文献（ジャーナル
・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー 111 ,1-16
(1979) ）によれば、Ｌｙｎｇｂｙａ属や、Ｐｈｏｒｍ
ｉｄｉｕｍ属と極めて近縁ないしは同一とされるべき属
であるとされており、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ属との頭文
字をとって、ＬＰＰという分類学上の地位を与え、さら
にＰｌｅｃｔｏｎｅｍａ属は、このなかでｇｒｏｕｐ
Ｂに属する。すなわち、本発明でいうＰｌｅｃｔｏｎｅ
ｍａ属はＬＰＰｇｒｏｕｐ Ｂと同一の意味を持つ。Ｐ
ｌｅｃｔｏｎｅｍａ属は、単細胞性ではなく、細胞が糸
状に並んだ糸状性の形態を持つものである。即ち、細胞
が繊維状に連結したトリコーム（ｔｒｉｃｈｏｍｅ）と
呼ばれる形態を示し、そのトリコームは直鎖である。そ
の増殖は、トリコーム上のとびとびの細胞で分裂が起こ
った後、ランダムな部位でそのトリコームが切断されて
行われる。またトリコームは常に栄養体細胞（ｖｅｇｉ
ｔａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）により構成される。さらに、
トリコームは各細胞が直径の均一であるシリンダー状、
またはウイスキーの樽状の形状で、縦一列に繋がってい
る。

【０００７】野性型のプレクトネマ属に属する微生物
は、光条件および暗条件のどちらにおいても、クロロフ
ィルを生産し、プロトクロロフィリドは殆ど認めること
ができないものであり、その自然変異株も従来知られて
おらず、またプレクトネマ属に属する微生物を含むヘテ
ロシスト（異型細胞）を形成しない糸状性のラン藻類に
おいては、形質転換を行った例がなく、適当な形質変換
体を遺伝子操作的に得ることの確認がなされていないも
のであった。

【０００８】本発明のプレクトネマ属に属する変異株微
生物としては、暗条件においてクロロフィルを実質的に
生産せず、かつプロトクロロフィリドを生産することを
特徴とする微生物であれば、その由来について特に限定
されず、自然突然変異株、あるいは紫外線や変異剤処理
による人工的突然変異株あるいは、後記の遺伝子操作的
手法による変異株であってもよい。本発明においてプレ
クトネマ属の好まし例は、プレクトネマ・ボリアナム
（Plectonema boryanum ）種に属する変異株微生物が挙
げられる。このプレクトネマ・ボリアナムの菌学的性質
および培養法については、文献（メソッズ・イン・エン
ザイモロジー 167, p28-67およびp68-93 (1988) 、ジャ
ーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー 11
1,1-16 (1979) ）に記載の通りである。このプレクトネ
マ・ボリアナムのうち、さらに具体的な例としては、プ
レクトネマ・ボリアナム ＩＡＭ−Ｍ１０１−ＹＦＣ１
００４（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５１５）が挙げられる。

【０００９】本発明の変異株微生物であるプレクトネマ
・ボリアナム ＩＡＭ−Ｍ１０１−ＹＦＣ１００４と、
野性型の親株であるプレクトネマ・ボリアナム ＩＡＭ
−Ｍ１０１とは、暗条件における色素の生産に顕著な差
があるものである。即ち、野性型のプレクトネマ属に属
する微生物が、光条件および暗条件において、クロロフ
ィルを生産し、プロトクロロフィリドの蓄積または菌体
外への漏出が殆どないのに対し、本発明の変異株微生物
は、暗条件においてクロロフィルを実質的に生産せず、
かつプロトクロロフィリドを生産するものである。本発
明の変異株微生物は、光条件下ではプロトクロロフィリ
ドを蓄積または菌体外への漏出をせず、クロロフィルは
生産するが、光条件下で一旦生成されたクロロフィルの
量は、その後微生物を暗条件においても殆ど変わらない
ため、微生物中のクロロフィル量を少なくする必要があ
る場合には、微生物を最初から暗条件で培養・増殖すれ
ばよい。なお、本発明の暗条件とは、場合によっては積
極的に光の照射下に置くことを避ける程度の条件も含む
が、通常は数１０ルクス以下程度である。

【００１０】本発明の変異株微生物を取得するには、下
記のプロトクロロフィリド生産能の簡便なチェック法に
従ってスクリーニングすることにより、本発明の目的の
自然突然変異株、あるいは紫外線や変異剤処理による人
工的突然変異株を取得することができるが、後記の方法
によればさらに効率よく変異株が取得できる。 ＜プロトクロロフィリド生産能の簡便なチェック法＞３
０ｍＭグルコース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭチオ硫酸ナトリウム含有のＢＧ
−１１培地に、１．５％の寒天を添加した寒天培地をガ
ラス製のシャーレに調製する。この寒天培地に、暗所
下、３０℃、２０〜３０日間静置培養してコロニーを形
成せしめ、このシャーレに下から紫外線を照射し、赤い
蛍光を発するコロニーをプロトクロロフィリドの生産が
期待される株として採取する。さらに菌体を熱アセトン
で菌体を粗抽出して、シリカゲルＴＬＣ（展開溶媒；ベ
ンゼン／酢酸エチル／エタノール＝８：２：２ｖ／ｖ）
で検出する。なお、遺伝子操作的に形質転換株を作成
し、その過程において薬物耐性マーカー、例えばカナマ
イシン耐性マーカーを挿入した場合には、その薬物を培
地中に含有して選択する。含有させるカナマイシンの濃
度は、１５μｇ／ｍｌ程度である。

【００１１】また効率よく本発明の変異株微生物を取得
するには、下記の通りの遺伝子操作的技術を用いること
により、遺伝子破損したｆｒｘＣ遺伝子を有することを
特徴とするプレクトネマ属に属する変異株微生物を作成
すればよい。即ち本発明は、プレクトネマ属に属する微
生物由来のｆｒｘＣ遺伝子およびその周辺配列を用い、
該ｆｒｘＣ遺伝子に対して遺伝子破損処理を行って得た
破損ｆｒｘＣ遺伝子および該周辺配列を含むＤＮＡをプ
レクトネマ属に属する宿主微生物に導入し、形質転換す
ることにより得られるプレクトネマ属に属する変異株微
生物である。

【００１２】本発明でｆｒｘＣ遺伝子とは、何もことわ
らない限り、プレクトネマ属に属する微生物由来のｆｒ
ｘＣ（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎより命名）遺伝子を意味す
るものであるが、その機能は従来全く不明であった。本
発明者らは、ｆｒｘＣ遺伝子に遺伝子破損を生じせしめ
たプレクトネマ・ボリアナムを作成したところ、意外に
も、暗条件においてクロロフィルを実質的に生産せず、
かつプロトクロロフィリドを生産する特徴を有すること
を発見し、本発明を完成するに至った。最初、ゼニゴケ
の葉緑体ＤＮＡの全塩基配列の決定の結果、ゼニゴケｆ
ｒｘＣ遺伝子が見つかった。またこの遺伝子のコードす
るペプチドも検出されたが、その機能は全く不明であっ
た。その推定アミノ酸配列が、窒素固定酵素ニトロゲナ
ーゼのコンポーネントの一つであるＦｅ−蛋白質（ｎｉ
ｆＨ遺伝子がコードする蛋白質）とアミノ酸レベルで３
５％前後の有意なホモロジーを示することから、何らか
の関連性が疑われたが、ニトロゲナーゼは原核生物に限
って分布しているとされており、事実、ゼニゴケの葉緑
体にもニトロゲナーゼ活性は検出されないことから、ニ
トロゲナーゼとの関連性は見出されない状況であった。
本発明者らは、ラン藻類の一種であるプレクトネマ・ボ
リアナム中に、ゼニゴケ由来のｆｒｘＣ遺伝子とホモロ
ジーの高い塩基配列が存在することを確認し、ゼニゴケ
由来のｆｒｘＣ遺伝子をプローブとすることにより、プ
レクトネマ・ボリアナムｆｒｘＣ遺伝子を採取し、その
塩基配列を決定・報告した（日本植物生理学会１９８９
年度第２９回シンポジウム）。このプレクトネマ・ボリ
アナム由来のｆｒｘＣ遺伝子は、配列表に記載の塩基配
列を持つものであり（開始コドンGTG から終止コドンTA
A まで表示）、前述のゼニゴケｆｒｘＣ遺伝子とは、ア
ミノ酸レベルで約８３％のホモロジーを有するものであ
った。本発明のｆｒｘＣ遺伝子については、プレクトネ
マ属に属する種々の種・株において変異を有することは
当然に考えられることであり、したがって、本願でいう
ｆｒｘＣ遺伝子とは、上記配列表の配列と塩基配列レベ
ルで通常９０％以上のホモロジーを有するものも含むも
のである。

【００１３】ｆｒｘＣ遺伝子を採取するに当たっては、
後記の必要から、ｆｒｘＣ遺伝子の周辺配列を含めて採
取する必要があるが、プレクトネマ属に属する微生物か
ら公知の方法により遺伝子ライブラリーを調製し、上記
配列表に記載の適宜の塩基配列に対応するプローブを予
め調製し、このプローブを用いて遺伝子ライブラリーか
らｆｒｘＣ遺伝子を採取すればよい。例示すれば、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ等の適宜の制限酵素を用い、プレクトネマ属
に属する微生物のゲノムＤＮＡを切断し、一方Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ等の対応する適宜の制限酵素により開裂したプラ
スミド、例えばプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２
５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８、ｐＵ
Ｃ１９等の開裂断片とライゲーションして組換えプラス
ミドとし、宿主微生物、例えばコンピテント化したエシ
ェリヒア・コリー ＨＢ１０１、同ＤＨ１、同ＭＶ１３
０４、同Ｗ３１１０、同Ｃ６００株等に導入して遺伝子
ライブラリーを調製し、予めＰＣＲ法、ランダムプライ
マーラベリング法、人工合成法等により、前記配列表記
載の配列の全部または一部の配列（またはそれに相補す
る配列）を有する標識プローブを作製し、このプローブ
で前記遺伝子ライブラリーから、コロニーハイブリダイ
ゼーション法によりポジティブ株を得、その株より必要
により適宜の制限酵素でｆｒｘＣ遺伝子を切り出せばよ
い。

【００１４】本発明でｆｒｘＣ遺伝子の遺伝子破損処理
とは、ｆｒｘＣ遺伝子でコードされる蛋白質を発現しな
いように該ｆｒｘＣ遺伝子の全部または一部を改変、分
断、欠損、異質塩基配列の挿入等により変化させるもの
であり、且つその後の形質転換において２重相同組換え
を起こし得る程度の処理を意味する。例えば、ｆｒｘＣ
遺伝子を削除する方法、プロモーターやリボゾームバイ
ンディングサイトを削除または改変する方法、開始コド
ンの削除または機能破損、ｆｒｘＣ遺伝子上流域へのタ
ーミネーターの新たな作成、ｆｒｘＣ遺伝子へ例えば１
または２個の塩基を挿入することによりフレームシフト
させる方法、ｆｒｘＣ遺伝子でコードされる蛋白質の翻
訳を完結させない為に開始コドンより下流で且つ本来の
終止コドンより上流に新たな終止コドンを作製または挿
入する方法、異質塩基配列を挿入する方法等が例示され
るが、特に好ましくは異質塩基配列を挿入する方法が好
ましい。ここで異質塩基配列としては、薬剤耐性マーカ
ーＤＮＡを用いると、プラスミドや最終的な変異株微生
物の選択が簡単になることから特に好ましい。薬剤耐性
マーカーとしては、例えばカナマイシン、アンピシリ
ン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン等の耐性
マーカーが例示され、例えばカナマイシン耐性マーカー
としては、プラスミドｐＫＣ７よりＢａｍＨＩとＥｃｏ
ＲＩとのダブルダイジェッションで得られるＤＮＡ断片
を有利に利用できる（このカナマイシン耐性マーカーは
ネオマイシンの耐性マーカーでもある）。前記の削除や
切断、挿入、改変等のためには適当な制限酵素を用い
て、適当な制限酵素サイトを切断する方法が好ましい。
また、ポイントミューテーションを生ぜしめるには、紫
外線や変異剤により突然変異を生ぜしめてもよいし、適
当な制限酵素を用いて合成または天然由来の塩基配列の
ＤＮＡを挿入してもよい。

【００１５】相同組換えとは、２本鎖ＤＮＡとその２本
鎖ＤＮＡ配列とホモロジーの高い２本鎖ＤＮＡ配列が存
在する場合、即ち互いに相同な配列が存在する場合に、
相同配列中の１ケ所において鎖の切断を経て互いに他方
の鎖への組換え連結が起こることをいい、また互いに相
同な１対の２本鎖ＤＮＡ配列において異なる２ケ所でこ
の相同組換えが起こり、結果として上記２ケ所の組換え
点の間の配列が互いに置換することを２重相同組換えと
言う。即ち、本願においては、野性株のゲノムＤＮＡの
ｆｒｘＣ遺伝子に対し、遺伝子破損ｆｒｘＣ遺伝子およ
びその周辺配列を含むＤＮＡを外部から導入し、破損部
を挟む両遺伝子の相同領域における２重相同組換えによ
り、ゲノムＤＮＡのｆｒｘＣ遺伝子が遺伝子破損ｆｒｘ
Ｃ遺伝子となることを意味する。ｆｒｘＣ遺伝子の周辺
配列とは、上記ｆｒｘＣ遺伝子の周辺、即ち５’末端側
や３’末端側の塩基配列を意味し、５’末端側にはリボ
ゾームバインディングサイトやプロモーター部分が存在
している。

【００１６】２重相同組換えを効率的に生ぜしめるため
には、遺伝子破損ｆｒｘＣ遺伝子の遺伝子破損部分を挟
む両端において、ホモロジーの高いある程度の塩基長を
もつ相同領域が必要とされる。したがって、必要とされ
るｆｒｘＣ遺伝子の周辺配列の塩基長は、遺伝子破損ｆ
ｒｘＣ遺伝子の非破損部分の配列の塩基長を加えて判断
すればよく、その相同領域の塩基長は、上流約０．５ｋ
ｂｐ、下流約１．０５ｋｂｐのｐＭＣ１９（実施例１）
では、２重相同組換えは起こらず、上流約２．３ｋｂ
ｐ、下流約１．０５ｋｂｐのｐＹＦＣ１０（実施例１）
では、２重相同組換えは起こること、およびｆｒｘＣ遺
伝子と配列として類似したｎｉｆＨ遺伝子における２重
相同組換えの本発明者らの実験において、上流約１．２
ｋｂｐ、下流約１．５ｋｂｐのｐＹＦＨ２においても２
重相同組換えは起こることから考えて、上流下流ともに
少なくとも０．５ｋｂｐ以上必要であると結論され、特
に１．０ｋｂｐ以上であればさらに好ましい。相同領域
のホモロジーは高ければ高いほど好ましいが、若干の変
異が入り若干低いホモロジーとなった場合には、適宜塩
基長を長くすればよい。

【００１７】破損ｆｒｘＣ遺伝子および該周辺配列から
なるＤＮＡを作製する方法は、図１および図２の操作手
順に従えばよいが、概略化すると、以下の通りである。
即ち、前述の通り調製したプレクトネマ属に属する微生
物由来のｆｒｘＣ遺伝子（周辺配列を含む）を、例えば
ＨｉｎｄＩＩＩ等の制限酵素によりｆｒｘＣ遺伝子（周
辺配列を含む）を含むＤＮＡ断片となし、ｆｒｘＣ遺伝
子に存在する適宜の制限酵素サイト、例えばＨａｅＩＩ
Ｉ等によりｆｒｘＣ遺伝子を２分し、予め例えばｐＫＣ
７由来のカナマイシン耐性マーカー断片をＢａｍＨＩと
ＥｃｏＲＩのダブルダイジェスションにより切り出して
おき、２分されたｆｒｘＣ遺伝子の間にそのカナマイシ
ン耐性マーカー断片を適当な方法で挿入連結することに
より、破損ｆｒｘＣ遺伝子および該周辺配列からなるＤ
ＮＡが調製される。使用される制限酵素量は適当量であ
ればよいが、例えば、ＤＮＡ１μｇ当たり約１〜１０Ｕ
程度である。このようにして得た破損ｆｒｘＣ遺伝子お
よび該周辺配列からなるＤＮＡは、プラスミドに組み込
まれており、必要により必要な部分だけ切り出してもよ
いが、大腸菌等の宿主微生物中で簡単に増殖し得るもの
であり、環状のＤＮＡの方が次のプレクトネマ属に属す
る宿主微生物への導入が容易であることから、組換えプ
ラスミドのまま用いることが好ましい。

【００１８】本発明に用いられるプレクトネマ属に属す
る宿主微生物は、特に限定されないが、例えば、プレク
トネマ・ボリアナムが例示される。また、２重相同組換
えを効率的に起こさせるために、宿主のｆｒｘＣ遺伝子
およびその周辺配列と、破損ｆｒｘＣ遺伝子および該周
辺配列を含むＤＮＡとの相同領域が十分に一致またはホ
モロジーが高いことが好ましく、したがってｆｒｘＣ遺
伝子（周辺配列を含む）の供与微生物と宿主微生物は同
種とすることが好ましく、さらには親株を宿主微生物と
することが特に好ましい。

【００１９】次いで破損ｆｒｘＣ遺伝子および該周辺配
列からなるＤＮＡを宿主生物に移入する方法としては、
例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム
法、コンピテントセル法、ポリエチレングリコール法等
が挙げられるが、特にエレクトロポレーション法が好ま
しく、その条件は本願の実施例を参考として適宜の条件
とすればよい。このようにして目的とした形質転換体を
得る場合には、耐性マーカーを挿入することによりｆｒ
ｘＣ遺伝子を遺伝子破損した場合には、その耐性マーカ
ーを指標にして選択することができる。また、前述のプ
ロトクロロフィリド生産能の簡便なチェック法によりス
クリーニングし、さらに詳細に検討すればよい。斯くし
て選択された形質転換体である本発明の変異株微生物
は、通常のプレクトネマ属に属する宿主微生物の培養法
に従って培養すればよいが、プロトクロロフィリドの製
造に当たっては、暗条件により培養する。

【００２０】本発明の変異株微生物プレクトネマ・ボリ
アナム ＩＡＭ−Ｍ１０１−ＹＦＣ１００４は、１００
ｍｌのＢＧ−１１液体培地により３０℃暗培養した結
果、プロトクロロフィリドとして約６０〜８０ｎ ｍｏ
ｌ程度がアセトン相に回収されるのに対し、野性型の親
株であるプレクトネマ・ボリアナム ＩＡＭ−Ｍ１０１
では、その１０００分の１程度であった。

【００２１】プロトクロロフィリドの製造における微生
物の培養の形態は液体培養が好ましく、培地の栄養源と
しては、各種の無機塩のみで生育可能であるが、暗所下
においては、その他に同化または利用可能な炭素源、例
えばグルコース等や、窒素源等を添加すればよい。具体
的な培地としては、ＢＧ−１１培地やＭＮ培地（リップ
カ，アールら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイク
ロバイオロジー１９７９、１１１：１−６１）、または
これに例えば３０ｍＭ程度のグルコースを添加した培地
が例示される。場合によっては、培地中にＴｗｅｅｎ８
０等の界面活性剤を添加してもよい。培養温度は、微生
物が生育し、プロトクロロフィリドを生産する範囲で適
宜変更できるが、通常２０〜４２℃程度、好ましくは３
０℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なる
が、プロトクロロフィリドが最高収量に達する時間を見
計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は５
〜３０日間程度、好ましくは約１０日間程度である。次
いで培養後、菌体または培養液を採取して分離、精製す
ればよい。 本発明の変異株微生物は通常、大部分のプ
ロトクロロフィリドを菌体内・菌体膜に蓄積し、一部分
は培地中に漏出する傾向を示すので、プロトクロロフィ
リドは主に菌体から採取すればよく、例えば濾過または
遠心分離等の手段にて菌体を回収し、次いでこの菌体を
ボールミルや超音波による機械的破砕方法やリゾチーム
等の酵素的破砕方法で破砕し、公知の方法、例えば硫安
沈澱、アセトン溶解、エーテル抽出、ＭｇＣＯ₃ 飽和水
添加不純物除去等およびＴＬＣ等の各種クロマトグラフ
ィーを適宜選択組み合わせて分離、精製すればよい。

【００２２】

【発明の効果】本願によれば、プロトクロロフィリドが
効率的に製造し得る変異株微生物を容易に入手し得、該
色素の効率的な製造が可能である。プロトクロロフィリ
ドはポルフィリン環を有する抗癌物質の出発原料となり
得、天然色素として使用できる有用なものである。

【００２３】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はこれらの例によってなんら限定される
ものではない。 実施例１ 遺伝子破損されたｆｒｘＣ遺伝子を含むプラ
スミドｐＹＦＣ１０の構築 （１）プラスミドｐＦＳＣ０３の取得 ＜プレクトネマ・ボリアナムのＤＮＡライブラリーの作
成＞プレクトネマ・ボリアナム（Plectonema boryanum
）ＩＡＭ−Ｍ１０１株（京都大学、加藤哲也博士より
分与）を、予め５０ｍｌのＢＧ−１１液体培地（リップ
カ，アールら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイク
ロバイオロジー１９７９、１１１：１−６１）に３０℃
にて蛍光灯照光下（約６００ルクス）、約１週間振盪培
養して種培養液を得た。次いで、この種培養液を５００
ｍｌのＢＧ−１１液体培地に摂取し、３０℃にて蛍光灯
照光下（約６００ルクス）、１０日間振盪培養をおこな
った。プラクトネマ・ボリアナムＩＡＭ−Ｍ１０１株菌
体を遠心分離により集菌し、この菌体よりチボニらの方
法（チボニ・オーら、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー１９８４、１５９：４０７−４０９）に従って染色
体ＤＮＡを得た。こうして得られた染色体ＤＮＡ約１０
μｇを５０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（日本ジーン
社製）にて３７℃、５時間、Ｍ緩衝液（５０ｍＭ塩化ナ
トリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール）存在
下、合計約１００μｌの反応容積でＤＮＡ切断反応を行
った。こうして得られた染色体のＨｉｎｄＩＩＩ切断反
応液を、マニアテスらの実験書（モルキュラー・クロー
ニング、ティー・マニアティス他、コールド・スプリン
グハーバー・ラボラトリー、１９８２、以下、実験書Ａ
と略す）に示されたフェノール抽出及びエタノール沈殿
処理方法により処理し染色体のＨｉｎｄＩＩＩ切断断片
の沈殿物を得た。こうして得られたＤＮＡ切断断片沈殿
物より残存するエタノール及び水分を減圧乾固により除
去後、この乾固物に対してＴＭ緩衝液（１００ｍＭトリ
ス塩酸、ｐＨ７．５、５ｍＭ塩化マグネシウム）を、１
００μｌ加え溶解し、ＤＮＡ切断断片溶液を得た。上記
のＤＮＡ切断断片溶液１０μｌにｐＢＲ３２２プラスミ
ド由来の線状プラスミドＤＮＡ（ファルマシア社より購
入；ｐＢＲ３２２プラスミド（ボリバー，エフら ジー
ン １９７７，２： ９５）をＨｉｎｄＩＩＩで完全切
断し、更に５’末端を脱リン酸化したもの）１μｇを混
和し、更に宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットＡ液
５０μｌ及び同キットＢ液１５μｌを混和しライゲーシ
ョン反応液を調製し、１６℃一夜保温した。こうして得
られたライゲーション反応液の内５０μｌを、形質転換
能を賦与された大腸菌ＨＢ１０１菌体液（宝酒造より購
入）５００μｌに氷冷下にて混和し、約３０分後、４２
℃の水浴中を用いてヒートショックを２分間与え、ＬＢ
液体培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ，バクト酵母エ
キス５ｇ／ｌ，食塩１０ｇ／ｌ）１０ｍｌを加え、３７
℃１時間靜置した。得られた培養菌体液各１００μｌ
を、５０ｍｇ／ｌの濃度のアンピシリンを含有した合計
２０枚のＬＢ寒天培地プレート（バクトトリプトン１０
ｇ／ｌ，バクト酵母エキス５ｇ／ｌ，食塩 １０ｇ／
ｌ、バクトアガー１．５ｇ／ｌ）表面に滅菌スプレッダ
ーを用いできるだけ均一に広げた。この菌体塗布培地プ
レートを、３７℃にて一夜培養した。こうして得られる
多数のアンピシリン耐性大腸菌コロニーは、ｐＢＲ３２
２のＨｉｄＩＩＩ制限酵素部位にプレクトネマ・ボリア
ナム染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ切断断片を組み込ん
だプラスミドを保持した形質転換体であることが期待さ
れた。即ち、こうしてプレクトネマ・ボリアナム染色体
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ切断断片のＤＮＡライブラリー
を得た。

【００２４】＜プレクトネマ・ボリアナム由来ｆｒｘＣ
遺伝子の採取＞一方、上記で得られた、ＤＮＡライブラ
リーから目的とする、プレクトネマ・ボリアナム由来ｆ
ｒｘＣ遺伝子を含むプラスミドを選択取得する為に、ハ
ナハンらの方法（メソッズ・イン・エンザイモロジー
１９８３、１００：３３３−３４２）によるコロニーハ
イブリダイゼーションを行った。用いたプローブの作製
方法を以下に記述する。先ず、ゼニゴケ由来のｆｒｘＣ
遺伝子をクローン化されたプラスミドＤＮＡであるｐＵ
ＣｆｒｘＣ５（フジタ，ワイら プラント・モルキュラ
ー・バイオロジー１９８９、１３：５５１−５６１）１
μｇを、各々５単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏ
ＲＩ（いずれも日本ジーン社製）にて、Ｍ緩衝液（前
述）存在下、約２０μｌの反応体積で３７℃５時間切断
反応を行なった。この酵素消化で得られたＤＮＡ断片
を、１％の低融点アガロースを用いたゲル電気泳動によ
り分離し、後述のマルチプライムＤＮＡラベリングシス
テム（アマーシャム社）に添付されるマニュアルの方法
にしたがって、目的のバンドを切り出し、滅菌水（１ｇ
のアガロース片に対し３ｍｌの割合）を加え、７分間煮
沸した。こうして得た４６２ｂｐ（塩基対）のＤＮＡ断
片水溶液を、アマーシャム社製のマルチプライムＤＮＡ
ラベリングシステムと〔α−³²Ｐ〕−ｄＣＴＰを用いて
放射ラベルした。このゼニゴケ由来のｆｒｘＣ遺伝子の
放射性プローブＤＮＡ（１０⁹ ｃｐｍ／μｇ）用いて、
前述のごとくに得られたプレクトネマ ボリアナムのＤ
ＮＡライブラリーから、前述したハナハンらの方法（メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー１９８３、１００：３
３３−３４２）で、コロニーハイブリダイゼーションを
行なった。この際、コロニーをレプリカするのに、ニト
ロセルロースフィルター（ＨＡＴＦ、ミリポア社製）を
用い、ハイブリダイゼーション溶液としては、６倍濃度
のＳＳＣ（塩化ナトリウム５２．６ｇ／ｌ、クエン酸ナ
トリウム２６．５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）、０．５％ラウ
リル硫酸ナトリウム、５倍濃度のデーンハルト溶液（フ
ィコール０．５ｇ／ｌ、ポリビニルピロリドン０．５ｇ
／ｌ、牛血清アルブミン（シグマ フラクション Ｖ）
０．５ｇ／ｌ）、１０ｍＭＥＤＴＡ、熱変性サケ精子Ｄ
ＮＡ０．１ｍｇ／ｍｌ及び前述の放射性プローブ約１０
ｎｇ（約１０⁷ ｃｐｍ）を含むものをフィルター当り約
３ｍｌ溶液で用いた。ハイブリダイゼーション反応の温
度は、５０℃とし一夜反応を行った。フィルターの洗浄
は、６倍濃度のＳＳＣ（前述）、０．５％ラウリル硫酸
ナトリウムの溶液で、６５℃にて行った。洗浄されたフ
ィルターは、室温にて自然乾燥の後、Ｘ−線感光フィル
ム（フジフィルム社製）を用いて、感光カセット中にて
一晩感光した。感光したフィルムを現像し、放射性プロ
ーブがハイブリダイズしたコロニーが数個あることを確
認した。これらコロニーの内の１つに含まれるプラスミ
ドをｐＦＳＣ０３と命名した。元のＤＮＡライブラリー
プレートよりｐＦＳＣ０３を保持する菌体をアンピシリ
ン５０ｍｇ／ｌ含むＬＢ液体培地（前述）３ｍｌにて３
７℃にて一晩振盪培養し、ｐＦＳＣ０３を抽出（実験書
Ａ、ｐ．３６８−３６９）した。制限酵素切断により確
認したところｐＦＳＣ０３には、プレクトネマ ボリア
ナムＤＮＡ由来の約３．７ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩＤＮ
Ａ断片がｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に
挿入されていることが判明した。また、この３．７ｋｂ
ｐＤＮＡ断片中にはゼニゴケｆｒｘＣ構造遺伝子産物の
もつアミノ酸一次配列と極めて相同性の高いアミノ酸一
次配列をコードする構造遺伝子が存在することを塩基配
列の決定により確認しており、その配列は配列表の通り
であった（ユーイチ フジタ、ヤスヒロ タカハシ、フ
ミオ ショナイ、 ユタカ オグラ、及び ヒロシマツ
バラ、プラント セル フィジオロジー１９９１、印刷
中）。そして、この構造遺伝子をプレクトネマ・ボリア
ナムに於いてもゼニゴケ同様、ｆｒｘＣ遺伝子と呼び本
明細書中記載している。

【００２５】（２）プラスミドｐＭＣ１９の取得 ＜ｆｒｘＣ遺伝子全部を含有するＤＮＡ断片材料の取得
＞ｐＦＳＣ０３プラスミド２０μｇを全量２００μｌ
で、ＭＨ緩衝液（７５ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、
１ｍＭ ジチオスレイトール）中で、各々４０単位の制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡より購入）およびＰｓｔ
Ｉ（東洋紡より購入）存在下、３７℃一晩切断反応を行
った。こうして得られた反応液をアガロースゲル電気泳
動（アガロース１６００、和光純薬工業、１％ｗ／ｖゲ
ル、実験書Ａ、ｐ．１５０−１７０）を行い、約１．７
ｋｂｐのＤＮＡ切断断片を含むゲル小片をメスにて切り
出した。このゲル小片よりのＤＮＡ回収は、マックスフ
ィールドＮＰ核酸タンパク質回収器（アトー科学機器社
製）を用い電気的に（定電圧５０Ｖ、４５分）行った。
得られた１．７ｋｂｐＤＮＡ断片を含む液を、エタノー
ル沈殿（実験書Ａ、ｐ．４６１−４６２）、減圧乾固処
理することにより、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより
切断を受けた１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片乾燥物を得た。
このＤＮＡ断片乾燥物を５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）に可溶化
した。

【００２６】＜ｆｒｘＣ遺伝子が分断されたＤＮＡ断片
混合物（ｆｒｘＣ−Ｈａ試料）の取得＞更に、こうして
得られた、ＤＮＡ断片水溶液に５．４μｌの１０倍濃度
の上記のＭ緩衝液と、５単位の制限酵素ＨａｅＩＩＩ
（東洋紡社製）を加え全量５５μｌとし、３７℃一晩酵
素切断反応を行った。こうして得られた反応液を、フェ
ノール抽出（実験書Ａ、ｐ．４５８）、エタノール沈殿
（実験書Ａ、ｐ．４６１−４６２）、減圧乾固処理する
ことにより、約０．７ｋｂｐのＰｓｔＩとＨａｅＩＩＩ
制限酵素切断末端を有するＤＮＡ断片（以下、ｆｒｘＣ
−ＵｐＤＮＡ断片と呼ぶ）と約１ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩ
とＨａｅＩＩＩ制限酵素切断末端を有するＤＮＡ断片
（以下、ｆｒｘＣ−ＤｏｗｎＤＮＡ断片と呼ぶ）の混合
乾燥物を得た。このＤＮＡ断片混合乾燥物を５０μｌの
上記のＴＥ緩衝液に可溶化し以下＜ｆｒｘＣ−Ｈａ試料
＞と呼ぶ試料を得た。

【００２７】＜ｐＵＣ１２由来のＤＮＡ断片（ｐＵＣ１
２−ＨｉＨｉ試料）の取得＞並行してｐＵＣ１２プラス
ミド（ヤニッシュ−ペロン・シーら、ジーン（１９８
５）３３：１０３−１１９）１μｇを総反応体積１０μ
ｌで、Ｍ緩衝液（前述）中で、５単位の制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ（東洋紡社製）存在下、３７℃１２時間切断反
応を行った。更に制限酵素ＨｉｎｃＩＩ（東洋紡社製）
５単位と１０倍濃度のＨ緩衝液（１００ｍＭ塩化ナトリ
ウム、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩
化マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール）１μｌ
を上記反応液に添加し３７℃、一晩酵素切断反応を継続
した。この反応液をフェノール抽出（実験書Ａ、ｐ．４
５８）、エタノール沈殿（実験書Ａ、ｐ．４６１−４６
２）、減圧乾固処理することにより、ＨｉｎｃＩＩ及び
ＨｉｎｄＩＩＩにより切断を受けた約２．６ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片乾燥物を得た。このＤＮＡ断片乾燥物を２０μ
ｌのＴＥ緩衝液（前述）に可溶化し、以下＜ｐＵＣ１２
−ＨｉＨｉ試料＞と呼ぶ試料を得た。

【００２８】＜ｐＵＣ１３由来のＤＮＡ断片（ｐＵＣ１
３−ＰｓＨｉ試料）の取得＞同じく、並行してｐＵＣ１
３プラスミド（ヤニッシュ−ペロン・シーら、ジーン
（１９８５）３３：１０３−１１９）１μｇを総反応体
積１０μｌで、制限酵素ＨｉｎｃＩＩ（東洋紡社製）５
単位を及び制限酵素ＰｓｔＩ（東洋紡社製）２．５単位
を含むＨ緩衝液（前述）中で、３７℃、一晩酵素切断反
応を行った。この反応液をフェノール抽出（実験書Ａ、
ｐ．４５８）、エタノール沈殿（実験書Ａ、ｐ．４６１
−４６２）、減圧乾固処理することにより、ＰｓｔＩ及
びＨｉｎｃＩＩにより切断を受けた約２．６ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片乾燥物を得た。このＤＮＡ断片乾燥物を２０μ
ｌのＴＥ緩衝液（前述）に可溶化し、以下＜ｐＵＣ１３
−ＰｓＨｉ試料＞と呼ぶ試料を得た。

【００２９】＜ｐＵＣＨＨ２−８の作製＞上記のごとく
得られた、＜ｆｒｘＣ−Ｈａ試料＞２４μｌ、＜ｐＵＣ
１２−ＨｉＨｉ試料＞１０μｌ、宝酒造社製ＤＮＡライ
ゲーションキットのＡ液２７２μｌ及び同キットのＢ液
３４μｌを混和し、１６℃、１６時間保温した。得られ
た反応液を用いて、塩化カルシウム法（実験書Ａ、ｐ．
２５０−２５１）により形質転換能を賦与された大腸菌
ＴＧ１株（モレキュラー・クローニング・第２版、ジェ
ー・サムブルック他、コールド・スプリング・ラボラト
リー、１９８９、第３巻、ｐ．Ａ．１２）を形質転換処
理し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴ
Ｇ、及び０．０２％ｗ／ｖのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天
培地上で３７℃、一夜培養し、アンピシリン耐性を獲得
した白色のコロニーを多数得た。得られた白色コロニー
の内、数株より、各菌体をアンピシリン５０ｍｇ／ｌ含
むＬＢ液体培地（前述）１ｍｌに植菌し、３７℃、一晩
振盪培養し、それぞれのプラスミドを抽出（実験書Ａ、
ｐ．３６８−３６９）した。それらプラスミドを制限酵
素切断により構造の確認をしたところ、いずれのプラス
ミドも＜ｆｒｘＣ−Ｈａ試料＞由来の約１ｋｂｐの前述
のｆｒｘＣ−ＤｏｗｎＤＮＡ断片が１つ、ｐＵＣ１２の
ＨｉｎｄＩＩＩとＨｉｎｃＩＩ制限酵素部位の間に挿入
されていることが判明した。その内の１つのプラスミド
を，ｐＵＣＨＨ２−８と命名した。

【００３０】＜ｐＵＣＰＨ１の作製＞ ＜ｆｒｘＣ−Ｈａ試料＞１μｌ、＜ｐＵＣ１３−ＰｓＨ
ｉ試料＞９μｌを用い、＜ｐＵＣＨＨ２−８の作成＞と
同様の方法により、約０．７ｋｂｐのｆｒｘＣ−ＵｐＤ
ＮＡ断片が１つ、ｐＵＣ１３のＰｓｔＩとＨｉｎｃＩＩ
制限酵素部位の間に挿入されているプラスミドが得ら
れ、その内の１つのプラスミドを、ｐＵＣＰＨ１と命名
した。

【００３１】＜ｐＵＣＫｍＨＨ７の作製＞上述のごとく
得られたｐＵＣＨＨ２−８プラスミド２μｇをＨ緩衝液
（前述）中で、５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニポンジ
ーン社製）及び５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡社
製）を加え、全量２０μｌにて、３７℃、一晩切断反応
を行った。この反応液をフェノール抽出（実験書Ａ、
ｐ．４５８）、エタノール沈殿（実験書Ａ、ｐ．４６１
−４６２）、減圧乾固処理することにより、ＥｃｏＲＩ
及びＢａｍＨＩにより切断を受けた約３．６ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片乾燥物を得た。このＤＮＡ断片乾燥物を２０μ
ｌのＴＥ緩衝液（前述）に可溶化し、以下＜ｐＵＣＨＨ
２−８−Ｂａ−Ｅｃ試料＞と呼ぶ試料を得た。一方、並
行して、ｐＫＣ７プラスミド（ラオ・アール・エヌら、
ジーン（１９７９）７：７９）１μｇをＨ緩衝液（前
述）中で、５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本ジーン社
製）及び５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡社製）お
よび３単位の制限酵素ＳｃａＩ（日本ジーン社製）を加
え、全量５０μｌにて、３７℃、８時間切断反応を行っ
た。この反応液を、フェノール抽出（実験書Ａ、ｐ．４
５８）、エタノール沈殿（実験書Ａ、ｐ．４６１−４６
２）、減圧乾固処理することにより、ＥｃｏＲＩ及びＢ
ａｍＨＩにより切断を受けた約１．９ｋｂｐのカナマイ
シン耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を含んだ３種のＤＮＡ断
片混合物の乾燥物を得た。このＤＮＡ断片乾燥物を２０
μｌのＴＥ緩衝液（前述）に可溶化し、以下＜ｐＫＣ７
−Ｂａ−Ｅｃ−Ｓｃ試料＞と呼ぶ試料を得た。＜ｐＵＣ
ＨＨ２−８−Ｂａ−Ｅｃ試料＞３μｌ、＜ｐＫＣ７−Ｂ
ａ−Ｅｃ−Ｓｃ試料＞４μｌ、宝酒造社製ＤＮＡライゲ
ーションキットのＡ液５６μｌ及び同キットのＢ液７μ
ｌを混和し、１６℃、１６時間保温した。得られた反応
液を用いて、塩化カルシウム法（実験書Ａ、ｐ．２５０
−２５１）により形質転換能を賦与された大腸菌ＴＧ１
株（前述））を形質転換処理し、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒
天培地上で３７℃、一晩培養し、アンピシリン耐性及び
カナマイシン耐性を獲得したコロニーを多数得た。得ら
れた耐性コロニーの内、１４株より、各菌体をアンピシ
リン５０ｍｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンを含むＬＢ液体培地（前述）１ｍｌに植菌し、３７
℃、一晩振盪培養し、それぞれのプラスミドを抽出（実
験書Ａ、ｐ．３６８−３６９）した。それらプラスミド
を制限酵素切断により構造の確認をしたところ、１４株
中２株から得たプラスミドに＜ｐＫＣ７−Ｂａ−Ｅｃ−
Ｓｃ試料＞由来の約１．９ｋｂｐの前述のカナマイシン
耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が１つ、ｐＵＣＨＨ２−８の
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ制限酵素部位の間に挿入されて
いることが判明した。その内の１つのプラスミドを、ｐ
ＵＣＫｍＨＨ７と命名した。

【００３２】＜ｐＭＣ１９の構築＞こうして得られた，
ｐＵＣＰＨ１と、ＰＵＣＫｍＨＨ７よりｐＭＣ１９を以
下のようにして構築した。ｐＵＣＰＨ１プラスミド２μ
ｇをＨ緩衝液（前述）中で、各々５単位の制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ（日本ジーン社製）及びＳｃａＩ（日本ジーン社
製）を加え、全量２０μｌにて、３７℃、一晩切断反応
を行った。この反応液を、フェノール抽出（実験書Ａ、
ｐ．４５８）、エタノール沈殿（実験書Ａ、ｐ．４６１
−４６２）、減圧乾固処理することにより、ＥｃｏＲＩ
により両端切断を受けた約０．５ｋｂｐのｆｒｘＣ遺伝
子の５’側の一部を含有するＤＮＡ断片を含む３種のＤ
ＮＡ断片の乾燥物を得た。このＤＮＡ断片乾燥物を２０
μｌの滅菌蒸留水に可溶化し、以下＜ｐＵＣＰＨ１−Ｅ
ｃ−Ｓｃ試料＞と呼ぶ試料を得た。一方、並行して、ｐ
ＵＣＫｍＨＨ７プラスミド２μｇをＥｃｏＲＩ緩衝液
（５０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、７ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール）中で、５単位の制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（日本ジーン社製）を加え、全量２０μｌにて、３７
℃、一晩切断反応を行った。この反応液を、フェノール
抽出（実験書Ａ、ｐ．４５８）、エタノール沈殿（実験
書Ａ、ｐ．４６１−４６２）、減圧乾固処理することに
より、ＥｃｏＲＩにより切断を受けたｐＵＣＫｍＨＨ７
プラスミドＤＮＡの乾燥物を得た。このＤＮＡ乾燥物を
２０μｌの滅菌蒸留水に可溶化し、以下＜ｐＵＣＫｍＨ
Ｈ７−Ｅｃ試料＞と呼ぶ試料を得た。＜ｐＵＣＫｍＨＨ
７−Ｅｃ試料＞４μｌ、＜ｐＵＣＰＨ１−Ｅｃ−Ｓｃ試
料＞４μｌ、宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットの
Ａ液４０μｌ及び同キットのＢ液８μｌを混和し、１６
℃、１６時間保温した。得られた反応液を用いて、塩化
カルシウム法（実験書Ａ、ｐ．２５０−２５１）により
形質転換能を賦与された大腸菌ＴＧ１株（前述）を形質
転換処理し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ
／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃、
一晩培養し、アンピシリン耐性及びカナマイシン耐性を
獲得したコロニーを多数得た。得られた耐性コロニーの
内、２４株より、各菌体をアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌ
および５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培
地（前述）１ｍｌに植菌し、３７℃、一晩振盪培養し、
それぞれのプラスミドを抽出（実験書Ａ、ｐ．３６８−
３６９）した。それらプラスミドを制限酵素切断により
構造の確認をしたところ、その内の１つのプラスミドは
＜ｐＵＣＰＨ１−Ｅｃ−Ｓｃ試料＞由来の約０．５ｋｂ
ｐの前述したｆｒｘＣ遺伝子の５’側の一部を含有する
ＤＮＡ断片が１つ、ｐＵＣＫｍＨＨ７のＥｃｏＲＩ制限
酵素部位の間に挿入されていることが判明した。また、
挿入された０．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片の方向性を制
限酵素消化によって確認した。その結果、得るれたプラ
スミドは、本来のｆｒｘＣ遺伝子のＨａｅＩＩＩ部位に
カナマイシン耐性遺伝子がｆｒｘＣの転写方向と同じ向
きに挿入された構造を有していることがわかった。この
プラスミドをｐＭＣ１９と命名した。このｐＭＣ１９を
用い、プラクトネマ・ボリアヌムの形質転換を試みた
が、カナマイシン耐性の変異株が得られなかった。この
ことから、正常ｆｒｘＣ遺伝子と破損ｆｒｘＣ遺伝子と
の間で組換え（２重相同組換えとは限らない）が起こら
なかったと判断された。

【００３３】（３）ｐＹＦＣ１０の構築 ＜ｐＵＣＨＰＨ３の構築＞ｐＭＣ１９で、プラクトネマ
・ボリアヌムの形質転換を行ったが、相同組換えが起こ
らなかったので、ｆｒｘＣ遺伝子の５’側上流のＤＮＡ
部分をｐＭＣ１９に追加することに決め、以下に示す手
順で、ｐＹＦＣ１０の構築を行った。ｐＦＳＣ０３プラ
スミド２μｇをＭ緩衝液（前述）中で、各々５単位の制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（日本ジーン社製）、制限酵素Ｐ
ｖｕＩＩ（ＢＲＬ社製）及び制限酵素ＳｓｐＩ（ＢＲＬ
社製）を加え、全量２０μｌにて、３７℃、一晩切断反
応を行った。こうして得られた反応液に制限酵素Ｐｓｔ
Ｉ（東洋紡社製）５単位と１０倍濃度のＨ緩衝液（前
述）を２．１μｌ加え、３７℃、５時間酵素切断反応を
行った。こうして得られた反応液を、フェノール抽出
（実験書Ａ、ｐ．４５８）、エタノール沈殿（実験書
Ａ、ｐ．４６１−４６２）、減圧乾固処理することによ
り、ＥｃｏＲＩにより切断を受けた約２ｋｂｐのｆｒｘ
Ｃ遺伝子より５’側の部分を含有するＤＮＡ断片を含む
６種のＤＮＡ断片の乾燥物を得た。このＤＮＡ断片乾燥
物を１５μｌのＴＥ緩衝液（前述）に可溶化し、以下＜
ｐＦＳＣ０３−５’試料＞と呼ぶ試料を得た。並行し
て、ｐＵＣＰＨ１プラスミド０．５μｇをＭ緩衝液（前
述）中で、５単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（日本ジー
ン社製）を加え、全量１５μｌにて、３７℃、一晩切断
反応を行った。こうして得られた反応液に制限酵素Ｐｓ
ｔＩ（東洋紡社製）５単位と１０倍濃度のＨ緩衝液（前
述）を１．６μｌ加え、３７℃、５時間酵素切断反応を
行った。この反応液を、フェノール抽出（実験書Ａ、
ｐ．４５８）、エタノール沈殿（実験書Ａ、ｐ．４６１
−４６２）、減圧乾固処理して、ｐＵＣＰＨ１のＨｉｎ
ｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片の乾燥物を得た。こ
のＤＮＡ断片乾燥物を１５μｌのＴＥ緩衝液（前述）に
可溶化し、以下＜ｐＵＣＰＨ１−ＨｉＰｓ試料＞と呼ぶ
試料を得た。こうして得られた、＜ｐＵＣＰＨ１−Ｈｉ
Ｐｓ試料＞５μｌ、＜ｐＦＳＣ０３−５’試料＞５μｌ
を、ライゲーション緩衝液（ＢＲＬ社製）中で、０．５
単位のＴ４ＤＮＡライゲース（ＢＲＬ社製）を加え、全
量２０μｌで、１６℃、１６時間保温した。得られた、
ライゲーション反応液を用いて、塩化カルシウム法（実
験書Ａ、ｐ．２５０−２５１）により形質転換能を賦与
された大腸菌ＴＧ１株（前述）を形質転換処理し、５０
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（前述）
上で３７℃、一晩培養し、アンピシリン耐性を獲得した
コロニーを多数得た。得られた耐性コロニーの内、１２
株より、各菌体をアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬ
Ｂ液体培地（前述）１ｍｌに植菌し、３７℃、一晩振盪
培養し、それぞれのプラスミドを抽出（実験書Ａ、ｐ．
３６８−３６９）した。それらプラスミドを制限酵素切
断により構造の確認をしたところ、その内の９つのプラ
スミドは＜ｐＦＳＣ０３−５’試料＞由来の約２ｋｂｐ
の前述したｆｒｘＣ遺伝子の５’側上流の部分を含有す
るＤＮＡ断片が１つ、ｐＵＣＰＨ１のＨｉｎｄＩＩＩ−
ＰｓｔＩ制限酵素部位の間に挿入されていることが判明
した。こうして得られたプラスミドをｐＵＣＨＰＨ３と
命名した。

【００３４】＜ｐＹＦＣ１０の構築＞ｐＭＣ１９プラス
ミド２μｇをＳａｃＩ緩衝液（６ｍＭ塩化マグネシウ
ム、６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール）中で、８単位の制限酵素ＳａｃＩ
（日本ジーン社製）を加え、全量１００μｌにて、３７
℃、一晩切断反応を行った。この反応液を、６０℃で７
分間加熱処理し、ｐＭＣ１９プラスミドＤＮＡのＳａｃ
Ｉ切断溶液とした。この溶液に２倍濃度のＭＢＮ緩衝液
（４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）、２ｍ
Ｍ塩化亜鉛、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％グリセ
ロール）１００μｌと、１５単位のマングビーンヌクレ
アーゼ（宝酒造社製）を添加し、３７℃１５分間加温し
た。こうして得られた反応液を、フェノール抽出（実験
書Ａ、ｐ．４５８）、エタノール沈殿（実験書Ａ、ｐ．
４６１−４６２）、減圧乾固処理した。得られた、ＤＮ
Ａ含有乾固物を２０μｌのＴＥ緩衝液（前述）に溶解
し、制限酵素ＤｒａＩ（東洋紡社製）８単位と、３μｌ
の１０倍濃度のＭ緩衝液（前述）、７μｌの滅菌水を加
え、３７℃、一晩酵素切断反応を行った。この反応液
を、フェノール抽出（実験書Ａ、ｐ．４５８）、エタノ
ール沈殿（実験書Ａ、ｐ．４６１−４６２）、減圧乾固
処理して、ｐＭＣ１９のＳａｃＩ（但し、切断末端は、
平滑化されている。）、ＤｒａＩ切断ＤＮＡ断片を含む
４種のＤＮＡ断片の乾燥物を得た。このＤＮＡ断片乾燥
物を２０μｌのＴＥ緩衝液（前述）に可溶化し、以下＜
ｐＭＣ１９−ＳａＤｒ試料＞と呼ぶ試料を得た。並行し
て、ｐＵＣＨＰＨ３プラスミド１μｇをＳｍａＩ緩衝液
（２０ｍＭ塩化カルシウム、６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．９）、６ｍＭ塩化マグネシウム、６ｍＭ２−メルカ
プトエタノール）中で、１５単位の制限酵素ＳｍａＩ
（東洋紡社製）を加え、全量５０μｌにて、３０℃、一
晩切断反応を行った。得られた反応液を、６０℃で７分
間加熱してＳｍａＩを失活させ、ｐＵＣＨＰＨ３プラス
ミドのＳｍａＩ切断ＤＮＡ溶液とした。こうして、以下
＜ｐＵＣＨＰＨ３−Ｓｍ試料＞と呼ぶ試料を得た。＜ｐ
ＭＣ１９−ＳａＤｒ試料＞５μｌ、＜ｐＵＣＨＰＨ３−
Ｓｍ試料＞５μｌを、ライゲーション緩衝液（ＢＲＬ社
製）中で、４単位のＴ４ＤＮＡライゲース（ＢＲＬ社
製）を加え、全量２０μｌで、１６℃、１６時間保温し
た。得られた、ライゲーション反応液を用いて、塩化カ
ルシウム法（実験書Ａ、ｐ．２５０−２５１）により形
質転換能を賦与された大腸菌ＴＧ１株（前述）を形質転
換処理し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（前述）上で３
７℃、一晩培養し、アンピシリン耐性及びカナマイシン
耐性を獲得したコロニーを多数得た。得られた耐性コロ
ニーの内、１２株より、各菌体をアンピシリン５０ｍｇ
／ｍｌと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体
培地（前述）１ｍｌに植菌し、３７℃、一晩振盪培養
し、それぞれのプラスミドを抽出（実験書Ａ、ｐ．３６
８−３６９）し、得た。それらプラスミドを制限酵素切
断により構造の確認をしたところ、その内の１つのプラ
スミドは、ｆｒｘＣ遺伝子の一部を含む５’側ＤＮＡを
クローン化しているｐＵＣＨＰＨ３プラスミドのＳｍａ
Ｉ制限酵素部位に、ｐＭＣ１９由来のカナマイシン耐性
遺伝子及びｆｒｘＣの３’側遺伝子を含むＤＮＡ断片が
１つだけ、ｆｒｘＣ遺伝子の転写方向から眺めて、同一
方向に挿入されていた。こうして得られたプラスミドを
ｐＹＦＣ１０と命名した。

【００３５】実施例２ プレクトネマ・ボリアナム（Pl
ectonema boryanum ）ＩＡＭ−Ｍ１０１−ＹＦＣ１００
４の作製 実施例１で得られたプラスミドpYFC10を、塩化セシウム
平衡密度勾配法(Sambrook et al. 1989)により精製し、
TE(10mM Tris-HCl;pH8.0,1mM EDTA)に溶解し(3.0mg/m
l)、以下方法により、プレクトネマ・ボリアナムを形質
転換した。まず、プレクトネマ・ボリアナムＩＡＭ−Ｍ
１０１を50mlのBG-11(Rippka etal. 1979）で静置培養
（１０日間、30℃, 約６００ルクス）した後、菌体を遠
心により集菌した。得られた菌体を、予め氷上で冷やし
ておいた1mM HEPES-KOH （pH7.5）（HEPES ；N-2-hydro
xy-ethylpiperazine-N'-2-ethane sulfonic acid） 50m
l で二回懸濁を繰り返し、さらに、氷冷した50mlの10%
(w/v)グリセロールで二回懸濁を繰り返し、最後に、遠
心によりグリセロールを除き、約1ml の菌体濃縮懸濁液
を得た。この菌体濃縮懸濁液40μｌに2.0 μｌのpYFC10
溶液を加え、エレクトロポレーション用キュベット（電
極間距離;1mm、 Bio-Rad社製）に移し、電気パルスを一
回与えた。電気パルスは、ジーン−パルサー(Bio-Rad社
製）を電界強度1.25kV、静電容量25μＦに、パルス−コ
ントローラーを600 Ωにセットして出力した。その結
果、出力された減衰波は、初期電界強度1.26kV、時定数
9.3 msであった。電気パルスを与えた菌体は、直ちに3m
ｌのBG-11 （5mM グルコース含有）に懸濁し、３日間静
置培養を続けた(30 ℃，約６００ルクス）。形質転換体
の選択のため、この培養液をBG-11 寒天プレート（ 20m
M HEPES-NaOH;pH7.5,5mMグルコース,15 μg/ml 硫酸カ
ナマイシン含有）上に、3mlの3%(w/v) 寒天と混合して
接種した。約二週間後、５つのカナマイシン耐性変異株
が出現した。このうちの１株を、プレクトネマ・ボリア
ナム（Plectonema boryanum ）ＩＡＭ−Ｍ１０１−ＹＦ
Ｃ１００４と命名した（微工研菌寄第１２５１５、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２５１５）。なお実施例３の実験により、
その他の４株については１重相同組換えか不完全な２重
相同組換えが起こったものと判断された。

【００３６】実施例３ YFC1004 株のｆｒｘＣ遺伝子の
破損の同定 実施例２で得られたプレクトネマ・ボリアナム ＩＡＭ
−Ｍ１０１−ＹＦＣ１００４（YFC1004 株と略記するこ
ともある）が、意図したｆｒｘＣ遺伝子破損を伴ってい
るかを、YFC1004 株より抽出したゲノムＤＮＡを試料と
し、ｆｒｘＣ遺伝子断片に対応したプローブを調製し、
このプローブを用いてサザンブロット法による解析を行
なった。即ち、8ml のBG-11 （5mM グルコース, 15μg/
ml 硫酸カナマイシン含有）培地で二週間培養したYFC1
004 株から、アスベルらの記述（カレント・プロトコー
ルズ・イン・モレキュラー・バイオロジーｐｐ２．４．
１−２．４．２，（１９８７））に従って、ゲノムＤＮ
Ａを調製した（収量；約５μg ）。このゲノムＤＮＡ
（1.2 μg ）を、制限酵素EcoRI （10単位；日本ジー
ン）又は、HindIII(14単位；日本ジーン)(或いは、両
方）で消化し、1%アガロースゲルで電気泳動を行ない、
キャピラリー法（サムブルークら；モレキュラー・クロ
ーニング・ア・ラボラトリー・マニュアル ２ｎｄ ｅ
ｄ．（１９８９））により、ナイトラン13膜（ Schleic
her & Schnell 社）に転写した。以後のハイブリダイゼ
ーション及び検出法は、DNA Labelling and Detection
Kit Nonradioactive（Boehinger Mannheim社）に添付さ
れるマニュアルに従って行なった。又、プローブは、ｆ
ｒｘＣ遺伝子に相当する領域をポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）法で増幅し、ジゴキシゲニン-11-dUTPでラベ
ルすることにより調製した（DNA Labelling and Detect
ion Kit Nonradioactive; Boehinger Mannheim社）。こ
こでのＰＣＲ法では、GeneAmpTM DNA Amplification Re
agent Kit （宝酒造社製）を用い、プライマーとして、
プレクトネマ・ボリアナムのｆｒｘＣ遺伝子のＮ末端及
びＣ末端に対応する２種の２７塩基のオリゴヌクレオチ
ド（５’側プライマーとして 5'-CCGGATCCATGAAACCTCGC
AGTGTAT-3'、３’側プライマーとして5'-GCGGATCCGGTTA
GACCATCATCAAAT-3' ）を自動ＤＮＡ合成機Cyclone/Plus
（MilliGen/Biosearch社）で合成して用いた。又、ｆｒ
ｘＣのクローン化プラスミドpFSC03をBamHIで消化した
断片を、鋳型ＤＮＡとして用いた。サザンハイブリダイ
ゼーションの結果、以下のことが判明した。即ち (1)ＥｃｏＲＩで消化されたYFC1004 株染色体には、プ
ローブにより検出されるバンドが元株と異なり２本検出
された。しかもそのサイズは元株が約２．８ｋｂｐであ
ったのに対し、YFC1004 株では約４．２ｋｂｐおよび約
０．４９ｋｂｐであった。 (2)ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたYFC10
04 株染色体には、プローブにより検出されるバンドが
元株と異なり２本検出された。しかもそのサイズは元株
が約１．５ｋｂｐであったのに対し、YFC1004 株では約
２．９ｋｂｐおよび約０．４９ｋｂｐであった。これら
のことから明らかなように、対照とした野生株のパター
ンに比べ、YFC1004 株では、ｆｒｘＣ遺伝子の制限酵素
切断パターンに変化が生じており、しかも、それは予想
される２重相同組換えのそれとよく一致していた。即
ち、実施例２の方法で、プレクトネマ・ボリアナムに対
して二重相同組換え（ダブルリコンビネーション）によ
るｆｒｘＣ遺伝子の特異的破損を起こし得ることを確認
した。

【００３７】実施例４ 暗所におけるYFC1004 株の生育
及びプロトクロロフィリドの産生 実施例２で得られたYFC1004 株を、暗所で30℃にて液体
培養（ 100ml,BG-11（30mM グルコース, 15μg/ml硫酸
カナマイシン含有）：130rpm，エアレーション促進のた
め、300ml の羽根付フラスコ使用）した。その増殖を、
730nm の濁度（ＯＤ₇₃₀ ；日立U-3200型分光光度計で計
測）及び、1ml の培養液中のクロロフィル量について測
定した。尚、クロロフィル量は、タンデュー・デ・マル
サクとホウマルドらの記述（メソッズ・エンザイモロジ
ー１６７：３１８−３２８（１９８８））の方法によ
り、菌体を90%(v/v)メタノールで抽出し、その上清の66
5nmの吸光度（ＯＤ₆₆₅ ；日立U-3200型分光光度計で計
測）から、式； Ｃ（クロロフィル量；μg/ml）＝ＯＤ₆₆₅ ×１３．９ により算出した。その結果以下のことが判明した。 (1)YFC1004 株、元株の両者ともに、ＯＤ₇₃₀ の値が約
０．４から培養をはじめ（０日目）、４日、７日、１０
日、１４日、１６日目の各時点で順に約０．７、約１．
３、約２．０、約３．０、約４．０の値を示した。 (2)同様に０日（培養開始日）、４日、７日、１０日、
１４日、１６日目の各時点での両株の菌体中のクロロフ
ィルの含量は、元株が培養液１ｍｌ当たりにすると順に
約２μｇ（０日目）、約２μｇ、約３μｇ、約３μｇ、
約２．５μｇ、約２．５μｇであった。 したがって、対照として行なった野生株と、YFC1004 株
との間で、ＯＤ₇₃₀ で測定される増殖速度に大差は認め
られないが、クロロフィル量の増加には明らかな差が認
められた。即ち、野生株が、暗所でもクロロフィル合成
を行なうのに対し、YFC1004 株では、増殖に伴うクロロ
フィル量の増加が殆ど認められなかった。菌体のメタノ
ール抽出物の吸収スペクトルを比較すると、YFC1004 株
では、野生株には認められない626nm の吸収極大が観測
された。この吸収極大は、コツァバシスとセンジャーら
が報告（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ４１ｃ：１００
１−１００３（１９８６））しているクロロフィル合成
の中間体プロトクロロフィリドのメタノール中での吸収
極大の値によく一致していることから、YFC1004 の細胞
にプロトクロロフィリドが蓄積していることが示唆され
た。そこで、膜画分での色素分析を行なうため、上記と
同様に暗所で培養した野生株とYFC1004 株の培養液100m
l から菌体を遠心によって集菌し、10mlの水に懸濁し、
氷上にて細胞を超音波により破砕した（出力70%,間欠照
射30秒３回,Sonicator,W-225型,Heat Systems Ultrason
ics 社製）。未破砕細胞を低速遠心（最大3,000xg ）で
除去し、得られた上清画分をさらに、超遠心（最大310,
000xg,１時間）することにより、膜画分を沈澱として回
収した。この膜画分に含まれる色素を、10mlのアセトン
− 0.1Ｎアンモニア（ 9:1,v/v）で抽出し、遠心（最大
18,000xg）により蛋白質を除き、上清画分として回収し
た。次に、この上清画分を分液ロートに移し、等容のヘ
キサンを加えて相分配を行ない、下層のアセトン相を回
収し、再度、１／３容のヘキサンとの間で相分配を行な
った。ベランジャーとレベイツらの文献（ Biochem. Bi
ophys.Res.Commun.88: 365-372. 1979 ）に記載されて
いるように、この相分配によりフィトールによりエステ
ル化されたクロロフィル及びその前駆体は、ヘキサン相
に移り、エステル化されていないポルフィリンやプロト
クロロフィリド等は、アセトン相に残ることが知られて
いる。その結果、得られたYFC1004 からのアセトン相
は、濃い黄色を呈していた。この色素は、434, 573及び
629nm 付近に吸収極大（日立U-3200型分光光度計で計
測）を示し、又、データには示さないが、エーテル中で
の吸収極大が、432,573 及び624nm に認められた。この
吸収極大波長は、ベランジャーとレベイツら（ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー 225，第1266
−1272頁，1980年）が報告しているプロトクロロフィリ
ドのそれとよく一致している。また野生株についても同
様にスペクトルを測定したが、野生株の膜画分にはこの
色素は殆ど含まれていないことが判った。更に、本標品
の蛍光及び、励起スペクトルを測定した。蛍光及び、励
起スペクトルは、島津RF5000型分光蛍光計（１cm角セ
ル）を用いて測定した。蛍光スペクトルでは、440nm の
励起光で631nm のピークを示す蛍光が認められ、その励
起スペクトルは、430nm にピークを示した。データには
示さないが、エーテル中でのピークの値は、625nm(励起
光430nm)及び、431nm(蛍光625nm)であった。これらの値
は、ベランジャーとレベイツらの文献（ Biochem. Biop
hys.Res.Commun. 88: 365-372. 1979 ）が報告している
プロトクロロフィリドのそれとよく一致している。さら
に、公知の方法（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー 225，第1266−1272頁，1979年）に従って
精製し、プロトクロロフィリドを得た。

【００３８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８６１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：プレクトネマ・ボリアナム（Plectonema borya
num ） 株名：ＩＡＭ−Ｍ１０１ 配列の名称：プレクトネマ・ボリアナム由来ｆｒｘＣ遺
伝子

【００３９】 配列 GTGA AACTCGCAGT GTATGGCAAA 24 GGCGGCATCG GCAAATCGAC GACAAGCTGC AACATCTCAG TCGCATTGGC AAAACGCGGC 84 AAAAAGGTTT TACAAATCGG TTGCGATCCC AAGCACGATA GTACGTTTAC CTTGACTGGC 144 TTCTTGATTC CAACCATTAT TGATACGCTT CAGGAAAAGG ACTATCACTA TGAGGATGTC 204 TGGGCTGAAG ATGTTATCTA CAAAGGCTAT GGCGGTGTGG ACTGTGTAGA GGCAGGTGGG 264 CCTCCAGCAG GAGCAGGCTG CGGTGGTTAT GTAGTCGGTG AAACGGTCAA ACTGCTCAAA 324 GAACTGAACG CATTTGACGA ATATGATGTG ATTCTGTTTG ATGTCTTAGG AGACGTGGTT 384 TGTGGCGGAT TCGCTGCTCC ATTGAACTAT GCAGACTATT GCATGATCGT GACAGATAAC 444 GGATTTGATG CGTTGTTTGC AGCAAATCGG ATTGCGGCTT CGGTCAGAGA GAAAGCGCGG 504 ACACATCCAC TACGATTAGC AGGACTGATT GGTAATCGAA CCGCCAAGCG GGATTTGATT 564 GAAAAGTATG TCGATGCAGT TCCGATGCCG ATCTTGGAAG TGTTGCCTTT GATTGAAGAC 624 ATTCGCGTTT CGCGAGTCAA AGGAAAAACC TTGTTTGAAA TGGCGGAGTC TGATCCCTCA 684 TTGAACTATG TGTGTGATTA CTATCTGAAC ATTGCTGATC AGATTTTGGC AAATCCTGAA 744 GGAGTCGTTC CGAAAGATGC TGCCGATCGC GATTTATTCT CGTTGCTGTC TGACTTCTAT 804 CTCAATCCAC AACAGCCAAA AACTGCCGAG GAAGAATTAG ATTTGATGAT GGTCTAA 861

【００４０】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、欠損ｆｒｘＣ遺伝子を有するプラスミ
ドを構築する過程を示したフロー図である。

【００４１】

【図２】図２は、図１に続くフロー図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 暗条件においてクロロフィルを実質的に
   生産せず、かつプロトクロロフィリドを生産することを
   特徴とするプレクトネマ属に属する変異株微生物。
2. 【請求項２】 遺伝子破損したｆｒｘＣ遺伝子を有する
   ことを特徴とするプレクトネマ属に属する変異株微生
   物。
3. 【請求項３】 プレクトネマ属に属する変異株微生物
   が、プレクトネマ属に属する微生物由来のｆｒｘＣ遺伝
   子およびその周辺配列を用い、該ｆｒｘＣ遺伝子に対し
   て遺伝子破損処理を行って得た破損ｆｒｘＣ遺伝子およ
   び該周辺配列を含むＤＮＡをプレクトネマ属に属する宿
   主微生物に導入し、形質転換することにより得られる微
   生物である請求項２に記載の微生物。
4. 【請求項４】 プレクトネマ属に属する変異株微生物
   が、プレクトネマ・ボリアナムである請求項１または２
   に記載の微生物。
5. 【請求項５】 プレクトネマ属に属する変異株微生物
   が、プレクトネマ・ボリアナム ＩＡＭ−Ｍ１０１−Ｙ
   ＦＣ１００４（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５１５）である請求
   項１または２に記載の微生物。
6. 【請求項６】 遺伝子破損処理が、耐性マーカーを該ｆ
   ｒｘＣ遺伝子の中間部に挿入したものである請求項３に
   記載の微生物。
7. 【請求項７】 暗条件においてクロロフィルを実質的に
   生産せず、かつプロトクロロフィリドを生産するプレク
   トネマ属に属する変異株微生物を、培地で暗条件下にて
   培養し、培養物よりプロトクロロフィリドを採取するこ
   とを特徴とするプロトクロロフィリドの製造法。
8. 【請求項８】 遺伝子破損したｆｒｘＣ遺伝子を有する
   ことを特徴とするプレクトネマ属に属する変異株微生物
   を、培地で暗条件下にて培養し、培養物よりプロトクロ
   ロフィリドを採取することを特徴とするプロトクロロフ
   ィリドの製造法。
9. 【請求項９】 プレクトネマ属に属する変異株微生物
   が、プレクトネマ属に属する微生物由来のｆｒｘＣ遺伝
   子およびその周辺配列を用い、該ｆｒｘＣ遺伝子に対し
   て遺伝子破損処理を行って得た破損ｆｒｘＣ遺伝子およ
   び該周辺配列を含むＤＮＡをプレクトネマ属に属する宿
   主微生物に導入し、形質転換することにより得られる微
   生物である請求項８に記載の製造法。
10. 【請求項１０】 プレクトネマ属に属する変異株微生物
    が、プレクトネマ・ボリアナムである請求項７または８
    に記載の製造法。
11. 【請求項１１】 プレクトネマ属に属する変異株微生物
    が、プレクトネマ・ボリアナム ＩＡＭ−Ｍ１０１−Ｙ
    ＦＣ１００４（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５１５）である請求
    項７または８に記載の製造法。