KR20100102118A - 테트라피롤 화합물의 제조 방법 및 테트라피롤 화합물 - Google Patents

테트라피롤 화합물의 제조 방법 및 테트라피롤 화합물 Download PDF

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Abstract

유전자 ypjD(b2611) 가 변이에 의해 발현할 수 없게 된 대장균을 배지에서 배양하고, 그 배지로부터 포르피린 고리 구조를 갖는 테트라피롤 화합물을 얻는다.

Description

테트라피롤 화합물의 제조 방법 및 테트라피롤 화합물 {PROCESS FOR PRODUCTION OF PYRROLE COMPOUND}
본 발명은 테트라피롤 화합물의 제조 방법 및 테트라피롤 화합물에 관한 것이다.
포르피린이나 클로로필 등의 테트라피롤 화합물은, 항암제 등의 의약품으로서 중요한 화합물이고, 그 외에, 식품 첨가물이나, 일렉트로닉스 분야에 있어서의 산화 환원 촉매 등에도 사용되고 있다. 이와 같은 테트라피롤 화합물은, 일반적으로는, 화학적인 합성법에 의해 제조되고 있다. 그러나, 이 화학적 합성법에서는, 특정한 제조 장치나 촉매 등을 필요로 한다는 문제가 있고, 또, 화학적 합성법에 따라서는, 사용하는 용제 등이 원인이 되어, 환경에 악영향을 미칠 우려도 있었다.
이에 대하여, 미생물을 사용하여 테트라피롤 화합물을 제조하는 방법이 제안되어 있다. 예를 들어, 광합성 세균인 플렉토네마속에 속하는 변이주 미생물을 배양하고, 배양물로부터 프로토클로로피리드를 채취하는 방법이 알려져 있다 (예를 들어, 특허문헌 1 참조). 또, 광합성 세균을 배양함으로써 테트라피롤 화합물을 회수하는 방법이 알려져 있다 (예를 들어, 특허문헌 2 및 3 참조). 또한 아스로박터족에 속하는 미생물을 특정의 화합물을 함유하는 배지에서 배양하고, 배양물로부터 우로포르피린을 채취하는 방법이 알려져 있다 (예를 들어, 특허문헌 4 참조).
일본 공개특허공보 평5-91866호 일본 공개특허공보 평5-244937호 일본 공개특허공보 2000-23691호 일본 공개특허공보 평5-38295호
그러나, 특허문헌 1 의 방법에서는, 프로토클로로피리드를 균체로부터 채취해야 하고, 구체적으로는, 균체의 세포를 파쇄한 후, 추출법 등에 의해 분리, 정제할 필요가 있다. 또, 특허문헌 2 ∼ 4 에 기재된 방법에서는, 배지에 테트라피롤 화합물의 전구체인 5-아미노레블린산을 함유시켜야만 했다.
본 발명의 과제는, 상기 서술한 종래 기술의 문제점을 해결하는 것에 있고, 대장균을 사용하여, 테트라피롤 화합물의 전구체를 사용하지 않고, 간편하게 테트라피롤 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 테트라피롤 화합물의 제조 방법은, 유전자 ypjD(b2611) 가 변이에 의해 발현할 수 없게 된 대장균을 배지에서 배양하고, 그 배지로부터 포르피린 고리 구조를 갖는 테트라피롤 화합물을 얻는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 배지 중에서 이온이 되는 금속 원소 또는 이온으로서 해리되는 금속 원소를 함유한 화합물을 원료로서 그 배지에 첨가하고, 그 금속이 함유된 테트라피롤 화합물을 얻는 것을 특징으로 한다.
상기 테트라피롤 화합물이, 포르피린 고리에 4 개의 메틸기, 4 개의 에틸에스테르 또는 아세트산기 (프로피온산기) 를 함유하는 화합물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 테트라피롤 화합물의 제조 방법은 또, 유전자 ypjD(b2611) 가 변이에 의해 발현할 수 없게 된 대장균을, 배지 중에서 이온이 되는 Mn 또는 이온으로서 해리되는 Mn 을 함유하는 화합물을 원료로서 첨가한 배지에서 배양하고, 그 배지로부터 Mn 이 중심에 배위된 포르피린 고리 구조를 갖는 테트라피롤 화합물을 얻는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 테트라피롤 화합물은, 식 : [C36H36O8N4·Mn(Ⅲ)]+ 를 갖는다.
본 발명에 의하면, 대장균, 특히 유전자 ypjD(b2611) 가 변이에 의해 발현할 수 없게 된 대장균을 배지에서 배양하고, 이 배지로부터 포르피린 고리 구조를 갖는 테트라피롤 화합물을 회수할 수 있기 때문에, 전구체를 사용하지 않고, 간편하게 테트라피롤 화합물을 제공할 수 있다는 효과를 얻는다.
도 1 은, 실시예 1 에서 얻어진 생성물에 대한, TOF-MS 법에 의한 질량 분석 결과를 나타내는 스펙트럼이다.
도 2 는, 실시예 1 에서 얻어진 생성물의 구조식이다.
도 3 은, 실시예 1 에서 얻어진 시료 1 에 대한 1H NMR 스펙트럼이다.
도 4 는, 실시예 1 에서 얻어진 시료 1 에 대한 13C NMR 스펙트럼이다.
도 5 는, 실시예 1 에서 얻어진 시료 1 에 대한 HSQC 스펙트럼이다.
도 6 은, 실시예 1 에서 얻어진 시료 1 에 대한 COSY 스펙트럼이다.
도 7 은, 실시예 1 에서 얻어진 시료 1 에 대한 HMBC 스펙트럼이다.
도 8 은, 실시예 1 에서 얻어진 시료 1 에 대한 NOESY 스펙트럼이다.
도 9 는, 실시예 1 에서 얻어진 시료 1 에 대한 NOESY 스펙트럼이다.
도 10 은, 실시예 1 에서 얻어진 시료 2 에 대한 1H NMR 스펙트럼이다.
도 11 은, 실시예 1 에서 얻어진 시료 2 에 대한 13C NMR 스펙트럼이다.
도 12 는, 실시예 1 에서 얻어진 시료 2 에 대한 NEOSY 스펙트럼을 확대하여 나타낸다.
도 13 은, 실시예 1 에서 얻어진 시료 2 에 대해 상대 존재량을 나타내는 스펙트럼이다.
도 14 는, ESI-MS 로 실시한 분석의 결과를 나타낸다.
도 15 는, 실시예 1 에서 얻어진 생성물을 열 분해 GC-MS 에 의해 분석한 결과를 나타낸다.
도 16 은, 실시예 2 에서 얻어진 생성물을 열 분해 GM-MS 에 의해 분석한 결과를 나타낸다.
도 17 은, 실시예 2 에서 얻어진 생성물을 ESI-MS 질량 분석한 결과를 나타낸다.
도 18 은, 실시예 2 에서 얻어진 생성물의 MS/MS 측정 결과를 나타낸다.
도 19 는, 실시예 2 에서 얻어진 생성물의 흡광 스펙트럼이다.
도 20 은, 실시예 2 에서 얻어진 생성물의 XPS 원소 분석의 결과를 나타낸다.
도 21 은, 실시예 5 에서 얻어진 녹색의 색조를 띤 배양 생성물의 TOF-MS 법에 의한 질량 스펙트럼이다.
도 22 는, 실시예 5 에서 얻어진 녹색의 색조를 띤 생성물의 흡광 광도 곡선을 나타내는 그래프이다.
본 발명에 관련된 테트라피롤 화합물의 제조 방법의 실시형태에 의하면, 대장균을 바람직하게는 빈영양 배지에서 배양하고, 이 빈영양 배지로부터 테트라피롤 화합물을 분리·회수함으로써, 포르피린 고리 구조를 갖는 테트라피롤 화합물이 제조된다. 즉, 본 발명은, 배지 중에 대장균을 배양, 증식시키는 과정에서 대장균에 테트라피롤 화합물을 생성시키고, 배지 중에 분비된 테트라피롤 화합물을 회수함으로써, 테트라피롤 화합물을 제조하는 것이다. 배지로서 빈영양 배지를 사용하는 것이 바람직한 것은, 배지 중에 있는 천연물 등의 성분이 테트라피롤 화합물을 분리할 때의 장해가 되는 것을 방지하기 때문이다. 빈영양 배지로는, 글루코오스 또는 락토오스를 함유하는 것이 바람직하게 사용되는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 대장균은, 유전자 ypjD(b2611) 가 변이에 의해 발현할 수 없게 된 것인 것이 바람직하다. 예를 들어, K12 주 및 BL21 주에서 유래한 대장균 등을 들 수 있다. 예를 들어, K12 주에서 유래한, 유전자 ypjD(b2611) 가 변이에 의해 발현할 수 없게 된 대장균이 바람직하게 사용된다. 유전자 ypjD(b2611) 가 변이에 의해 발현할 수 없게 된 대장균주로는, 예를 들어, 유전자 ypjD(b2611) 의 트랜스포존 삽입 변이주가 있다. 이 변이주에서는, 유전자 ypjD(b2611) 의 발현이 부분적으로 또는 완전히 결실된 상태에 있다. 또한, K12 주는, 예를 들어 내셔널 바이오 리소스로부터 입수할 수 있고, BL21 주는, 예를 들어 타카라 바이오로부터 입수할 수 있다. 또, 유전자 ypjD(b2611) 의 트랜스포존 삽입 변이주로는, 예를 들어, 내셔널 바이오 리소스로부터 입수할 수 있는 JD23504 등이 있다.
본 실시형태에 있어서는, 먼저, 대장균을 빈영양 배지 중에서 배양한다. 이 때, 대장균을 빈영양 배지 이외의 적당한 배지, 예를 들어 LB 배지 등의 배지 중에서 전 (前) 배양하고, 얻어진 전 배양물을 빈영양 배지에 접종하여 본 (本) 배양하는 것이 바람직하다.
대장균의 배양 조건은, 대장균에 대한 일반적인 조건이면 된다. 이것은, 대장균을 전 배양하고 나서 배지를 바꾸어 빈영양 배지 중에서 본 배양하였을 경우, 어느 쪽의 배양 조건에 대해서도 동일하다. 예를 들어, LB 배지를 사용하여, 15 ∼ 40 ℃ 의 온도에서 6 시간 ∼ 24 시간에 걸쳐 전 배양한 후, 얻어진 세포 현탁액을, 빈영양 배지 중에서, 20 ∼ 40 ℃ 의 온도에서 12 시간 ∼ 96 시간에 걸쳐 본 배양한다. 이로써, 배지 중에서 세포가 증식하여, 목적으로 하는 테트라피롤 화합물에 특유의 색조를 띤 배양물 (생성물) 이 얻어진다.
다음으로, 상기의 배양물로부터, 이하와 같이 하여, 목적으로 하는 테트라피롤 화합물을 분리한다.
구체적으로는, 배양물을 원심 분리하여 얻어진 상청액을 여과한 후, 예를 들어, 이온 교환 수지 칼럼 또는 역상 칼럼 등을 사용하여, 여과액으로부터 테트라피롤 화합물을 흡착, 분리한다. 예를 들어, 배양물을 원심 분리기에 넣어 세포를 침전시키고, 배양물 (생성물) 을 함유하는 상청액을 얻는다. 다음으로, 이 상청액을, 소정의 포어 사이즈 (예를 들어, 0.22 ㎛) 의 필터로 여과한 후, 상기 칼럼을 사용하여 이온 교환 수지에 흡착시킨다. 이어서, 예를 들어, 20 % 아세토니트릴-0.1 % 트리플루오로아세트산 용액 등을 사용하여 이온 교환 수지로부터 생성물을 용출시킨 후, 동결 건조시킨다. 또한, 이 경우의 용출에는, 유기 용매에 산 또는 알칼리의 용액을 함유한 것을 사용할 수도 있다. 본 실시형태에 의하면, 1 종류 또는 2 종류 이상의 테트라피롤 화합물이 얻어지고, 예를 들어, 500 ㎖ 의 세포 현탁액으로부터 수 ∼ 수십 ㎎ 의 테트라피롤 화합물을 얻을 수 있다.
상기의 조작에 의해 분리된 생성물을, NMR (Nuclear Magnetic Resonance ; 핵자기 공명) 등에 의해 분석하면, 테트라피롤 화합물이 함유되어 있는 것을 확인할 수 있다. 또, 이 생성물을 흡광 광도 분석하면, 색소에 특유의 파장역에 흡수를 갖는 화합물인 것을 알 수 있다. 많은 경우, 클로로필, 헴 또는 프탈로시아닌에 유사한 2 봉성의 피크를 나타내는 색소 화합물이다. 이러한 색소 화합물은, 광에 의해 전자가 여기되는 광 촉매나 전자 전달체로서 유용하다. 또, 수용액 중에서, 혹은, 세포막을 개재하여 산화 환원 반응과 관련되므로, 전지에서도 기능하는 것으로 생각된다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 대장균을 사용하여, 포르핀, 포르피린 및 포르피린 착물 등의 포르피린류와 같은 테트라피롤 화합물 및 금속을 함유하는 테트라피롤 화합물 또는 착물을 제조할 수 있기 때문에, 화학적 합성법에 의한 경우와 같이, 목적으로 하는 화합물의 종류에 따른 제조 장치나 촉매 등을 필요로 하지 않고, 또, 용제를 사용할 필요도 없어, 환경에 악영향을 미칠 우려도 적다. 또, 대장균을 배양할 때에는, 배지 중에 5-아미노레블린산 등의 테트라피롤 화합물의 전구체를 첨가할 필요가 없고, 또한 테트라피롤 화합물은, 배지 중에 분비된 것을 회수하면 되어, 균체로부터 채취할 필요는 없다. 즉, 본 발명에 의하면, 대장균의 배양이나 테트라피롤 화합물의 회수에 특정의 화합물이나 장치를 필요로 하지 않기 때문에, 간편하게 테트라피롤 화합물을 제조할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 테트라피롤 화합물은, 의료, 식품 및 일렉트로닉스 등의 여러 산업 분야에 있어서의 용도에 이용될 수 있다.
본 실시형태에 있어서는, 빈영양 배지에, 이 배지 중에서 이온이 되는 금속 원소 또는 이온으로서 해리되는 금속 원소를 함유한 화합물을 첨가하고, 이 금속을 함유하는 테트라피롤 화합물 또는 착물을 얻을 수도 있다. 금속으로는, 배지 중에서 이온이 되는 것이면 된다. 이와 같은 금속을 함유하는 화합물은, 산성, 알칼리성 또는 중성의 수용액에 가용이다. 상기 금속 원소로는, 예를 들어, 금 (Au), 구리 (Cu), 칼륨 (K), 망간 (Mn), 아연 (Zn) 및 루테늄 (Ru) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 금속을 들 수 있다. 또, 금속은, 무기 금속 화합물 또는 유기 금속 화합물 상태로 첨가할 수도 있다. 무기 금속 화합물로는, 예를 들어, 상기 금속의 황산염, 탄산염, 질산염, 티오황산염, 산화물, 질화물 또는 할로겐화물 등을 들 수 있다. 또, 유기 금속 화합물로는, 예를 들어, 금티오말산나트륨 및 말산아연 등을 들 수 있다.
이와 같이, 빈영양 배지에, 이 배지 중에서 이온이 되는 금속 원소 또는 이온으로서 해리되는 금속 원소를 함유한 화합물을 첨가함으로써, 금속의 종류에 따른 색조의 테트라피롤 화합물 또는 착물이 얻어진다. 요컨대, 배지 중에서 대장균을 배양하면, 대장균의 세포 내에 도입된 금속 원소 또는 금속 화합물이, 대장균의 유전자 작용에 의해, 각각의 금속이 발휘하는 색조를 띤 화합물로 변화된다. 그 후, 이 화합물은, 세포로부터 생성물으로서 토출되므로, 배지 중으로부터 회수함으로써 색소로서 유용한 화합물을 얻을 수 있다. 원하는 색조의 화합물을 얻기 위해서는, 그 색조에 따른 금속을 선택하면 되고, 화학적 합성법에 의한 경우와 같이, 목적으로 하는 화합물의 종류마다 새로운 방법을 개발할 필요가 없다. 또한, 얻어진 화합물은, 광 촉매나 전지 등의 분야 외에, 광 기억 매체, 정보 기억 매체, 전자 이동 매체, 반도체 소자 및 전극 등에도 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기의 실시형태에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 대해 서술한다.
실시예 1
유전자 ypjD(b2611) 의 트랜스포존 삽입 변이주 (내셔널 바이오 리소스 JD23504) 를, 2 ㎖ 의 LB 배지 (Bacto-tryptone : 1 %, Bacto-yeast extract : 0.5 %, NaCl : 0.5 %) 에 있어서, 37 ℃ 의 온도에서 12 시간에 걸쳐 전 배양하였다. 얻어진 세포 현탁액 1 ㎖ 를, 1 ℓ의 탈이온수 중에 KH2PO4 를 9 g, K2HPO4 를 21 g, (NH4)2SO4 를 2 g, 시트르산 2 수화물을 1 g, 글루코오스를 3.6 g 및 MgSO4 를 100 ㎎ 용해시킨 수용액 중에 첨가하고, 37 ℃ 의 온도에서 24 시간에 걸쳐 본 배양하였다.
배양액의 색은, 본 배양을 개시한 시점에서 무색이었지만, 24 시간 경과 후에는 핑크색이 되었다. 이 배양액을 원심 분리기에 넣어 세포를 침전시키고, 얻어진 상청액을 포어 사이즈 0.22 ㎛ 의 필터로 여과하였다. 이어서, 여과액을 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통과시킨 후, 수지에 흡착된 배양물을, 20 % 아세토니트릴-0.1 % 트리플루오로아세트산 용액에서 용출시켜, 용출물을 동결 건조시켰다. 이로써, 핑크색을 띤 생성물이 얻어졌다.
이 생성물에 대해, 이하에 기재하는 각종 기기 분석을 실시한 결과, 도 1 에 나타내는 구조를 갖고 있는 테트라피롤 화합물인 것이 확인되었다. 도 1 중의 기호 A ∼ G 는, 도 4 에 나타내는 13C NMR 스펙트럼의 기호에 대응하고, 그 밖의 도면에 있어서도 동일하다. 또, 생성물을 NMR 에 의해 분석한 결과, 테트라피롤 화합물이 함유되어 있는 것이 확인되었다. 또한 ICP (Inductively Coupled Plasma) 질량 분석에 의해 칼륨 (K) 이 검출된 점에서, K 와 이온 결합 혹은 착물을 형성하는 화합물로서 회수된다. 추가로 또, 흡광 광도 분석을 실시한 결과, 도 2 에 나타내는 바와 같이, 소렛 밴드를 포함하는 포르피린 특유의 2 봉성의 피크가 확인되었다. 도 2 에서는, 파장 395 ㎚ 와 파장 549 ㎚ 에 각각 피크가 있다. 이 점에서, 생성물은, 자유 전자가 이동할 수 있는 유기 색소인 것을 확인할 수 있었다.
상기에서 얻어진 테트라피롤 화합물을 상이한 용매에 용해하고 (시료 1 및 시료 2), 2 차원 NMR 측정 (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) 하고, 그 스펙트럼을 해석하여, 구조 해석을 실시하였다.
시료 1 에 관해서는, 시료를 CD3OD 에 용해하고, 이하의 조건에서 NMR 측정을 실시하였다.
·장치 : INOVA500 형 (varian 사 제조)
·공명 주파수: 499.8 MHz (1H)
·기준 : 3.31 ppm (CD2HOD, 1H NMR)
49.421 ppm (CD3OD, 13C NMR)
·적산 횟수 : 1H NMR(16 회), 13C NMR (53428), COSY (16 회), NOESY (8 회), HSQC (32 회), HMBC (128 회)
·그 외 : NOESY 의 혼합 시간은 400 msec 로 설정하였다.
또, 시료 2 에 관해서는, 시료를 CD3CN : D2O : CD3COOD = 90 : 10 : 0.1 의 용매에 용해하고, 이하의 조건에서 NMR 측정을 실시하였다.
·장치 : INOVA600 형 (varian 사 제조)
·공명 주파수 : 599.8 MHz (1H)
·기준 : 1.92 ppm (CD2HCN, 1H NMR)
1.28 ppm (CD3CN, 13C NMR)
·적산 횟수 : 1H NMR (64 회), 13C NMR (50000), COSY (16 회), NOESY (16 회), HSQC (32 회), HMBC (128 회)
·그 외 : NOESY 의 혼합 시간은 400 msec 로 설정하였다.
시료 1 에 관한 구조 해석 :
도 3 에 1H NMR 스펙트럼을 나타내었다 (용매 : CD3OD). 그 결과, 10.0 ∼ 10.5 ppm 부근 (d), 4.3 ppm 부근 (f), 3.6 ppm 부근 (g), 및 3.2 ppm 부근 (e) 에, 목적 성분에서 유래하는 것으로 추측되는 시그널이 관측되었다. 각각의 시그널 강도비는, 대략 1 : 2 : 3 : 2 였다. 이 d ∼ g 는 기타 도면에 있어서도 동일하다.
도 4 에 13C NMR 스펙트럼을 나타내었다. B, C 의 시그널로부터 방향족인 것으로 추정되었다.
여기에서, 1H NMR 의 d 시그널은, 화학 시프트값으로부터 보아, 통상에서는 볼 수 없는 특징적인 시그널이고, 또한, 방향족 화합물인 것을 고려하면, 포르피린 골격을 후보로서 생각되었다. 이하에서 서술하는 바와 같이, 2 차원 NMR 스펙트럼 (도 5 ∼ 9) 을 포르피린으로서 해석하면 모순 없이 해석할 수 있었다. 또, 도 1 의 추정 구조와 유사한 화합물은, J.org.Chem.Vol.164, No.21, 1999 (7973-7982) 에 보고되어 있고, 1H NMR 의 화학 시프트값은, 꽤 양호한 일치를 나타내고 있는 점에서도, 포르피린 구조는 타당했다.
이하, 2 차원 NMR 의 해석에 대해 설명한다.
도 5 에 HSQC 스펙트럼을 나타내었다. HSQC 스펙트럼은, J1 CH 를 검출하는 측정법이다. 해석 결과를 도면 중에 기재하였다. 프로톤 시그널에 대해, 직접 결합하는 탄소 번호의 대문자로 번호를 붙였다.
도 6 에 COSY 스펙트럼을 나타내었다. COSY 스펙트럼은, 1H-1H 간의 스핀 결합을 검출하는 측정법이다. 해석의 결과, f 와 e 가 스핀 결합되어 있는 것을 알 수 있고, 시그널 강도비 및 F 와 E 의 화학 시프트값으로부터, -CH2-CH2-X 일 가능성이 높은 것으로 생각되었다. 여기에서 X 는, 구조가 불명확한 미확정 성분이다.
도 7 에 HMBC 스펙트럼을 나타내었다. HMBC 스펙트럼은, Jn CH (n = 2 ∼ 4 정도) 를 검출하는 측정법으로서, 이종 핵 원격 결합 상관 스펙트럼이 얻어진다. 이 스펙트럼을 해석한 결과, (e,A), (e,B), (e,F), (g,B), (g,C), (f,A), (f,B), (f,C), (f,E) 등의 상관이 얻어진다. 이들 상관은, 도 1 에 나타내는 추정 구조와 모순되지 않았다.
도 8 및 도 9 에 NOESY 스펙트럼을 나타내었다. NOESY 스펙트럼은, 자화 (磁化) 의 교환을 검출하는 측정법으로서, 교차 완화에 의한 자화 이동으로부터, 핵 스핀 간의 거리에 관한 정보를 얻을 수 있다. 스펙트럼을 해석한 결과, (g,e), (f,g), (f,e), (d,f), (d,e), (d,g) 에 NOE 상관이 관측되었다. 이들 NOE 상관은, 도 1 에 나타내는 추정 구조를 지지하는 것이었다.
시료 2 에 관한 구조 해석 :
도 10 에 1H NMR 스펙트럼을, 도 11 에 13C NMR 스펙트럼을 나타내었다 (용매 : CD3CN : D2O : CD3COOD = 90 : 10 : 0.1). 도 10 중에서 사각 프레임으로 둘러싼 시그널은 불순물이다. 상기한 시료 1 의 스펙트럼과 비교한 결과, 주성분의 구조가 동일한 것으로 추측되었다. 이것은, COSY, NOESY, HSQC, 및 HMBC 의 각 스펙트럼의 해석 결과로부터도 지지되었다.
도 12 에, 시료 2 의 NOESY 스펙트럼을 확대하여 나타내었다. d 프로톤이 4 종으로 분리되어 관측되는 점에서, 낮은 자장 (숫자가 작은 쪽) 에서 d1 내지 d4 라고 번호를 붙였다. NOE 상관을 이하에 정리하였다.
·d1 및 d4 는 메틸기와 -CH2-CH2-X 모두 NOE 상관이 있었다.
·d2 는 CH2-CH2-X 와만 NOE 상관이 있었다.
·d3 는 메틸기와만 NOE 상관이 있었다.
이것과, 메틸기끼리나 -CH2-CH2-X 끼리에 NOE 상관이 명확하게 관측되지 않은 점에서, 도 1 의 측사슬의 배치가 얻어졌다.
13C 시그널 및 1H 시그널의 번호를 붙이는 데 있어서는, 거의 동일한 영역에서 관측되는 시그널을 하나로 묶어 번호를 붙였다. 이것은, 포르피린의 골격이 반복 구조이기 때문에, 미세한 귀속이 곤란하기 때문이다. 반복 개수에 관해서는, 메틸기 (g) 가 4 개 관측되고 있는 점에서 4 개로 추측된다.
이상과 같이, 시료 1 및 2 의 분석 결과로부터, 도 1 의 구조를 얻을 수 있었다. 단, 측사슬인 메틸기 및 -CH2-CH2-X 의 각각은 합계 4 개이면 되고, 부가 부위는 도 1 에 나타낸 8 지점 중 어느 장소에서도 데이터와 모순은 없고, 도 1 에 나타낸 부가 위치에 한정되지 않는다.
다음으로, -CH2-CH2-X 에 있어서의 X 에 상당하는 부분에 대해 검토하였다.
상기에서 얻어진 생성물에 대해, 이하의 분석을 실시하였다.
(1) 열 분해 GC/MS 에 의한 정성 분석 :
TFA 등의 제거를 위해, 시료를 가열로 내에서, 280 ℃ × 10 min 가열한 후, 600 ℃ 에서 열 분해시켜, 분해물을, 이하에 기재하는 가스 크로마토그래피/질량 분석 장치 (이하, 「GC/MS」로 칭한다) 에 의해 분리 분석하였다.
장치명 : Agilent Technologies 제조 HP5973 형 질량 선택형 검출기 부착
HP6890 형 가스 크로마토그래피
FRONTIER LAB 제조 PY-2020iD 가열로식 열분해 장치
측정 시료 : 시료 2 ㎎ 에 AcCN 를 1 ㎖ 첨가한 용액을 시료 컵에 0.5 ㎖ 주입하고, 질소 퍼지로 AcCN 를 제거하였다.
(2) 일렉트로 스프레이-질량 분석 장치에 의한 분석 :
용액 중 성분의 분자량을 조사하기 위해서, 이하에 기재하는 일렉트로 스프레이-질량 분석 장치 (이하, 「ESI-MS」로 칭한다) 에 의한 분석을 실시하였다.
장치명 : Applied Biosystems 제조 Qstar
도입 용매 : AcCN/0.05 % 포름산 수용액 (50/50)
도입 방법 : 30 μℓ 의 루프를 사용하여 측정 용액을 직접 도입하였다.
측정 모드 : Positive mode
측정 용액 : 시료 2 ㎎ 에 AcCN 를 1 ㎖ 첨가한 용액을 바이알 병에 소량 채취 후, 도입 용매에서 약 100 ppm 으로 희석하였다.
상기 GC/MS 에 의해 실시한 분석의 결과, 시료로부터 이산화탄소가 검출되었다. 또, 상기 ESI-MS 에 의해 실시한 분석의 결과 (도 14), 분자량 59 의 프래그먼트 이온 (피크는 4 개) 이 검출된 것으로부터, 이 프래그먼트는, 에틸에스테르 또는 아세트산기 (프로피온산기) 를 함유하는 것이 확인되었다.
또한 상기 생성물을 열 분해 GC-MS 에 의해 분석한 결과, 도 15 에 나타내는 바와 같이, 주된 성분은 피롤 화합물이었다. 이것은 각 성분의 질량스펙트럼을 데이터 베이스와 조합 (照合) 함으로써 확인할 수 있고, 분자 중에 피롤 고리의 구조를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또, 상세한 분자량에 대해서는, 도 13 에 나타내는 바와 같이, 수소 이온이 부가된 이온으로서 검출되고, 분자량 655.2760-1.0078 = 654.2682 가 얻어졌다. 이상에 의해, 측사슬에 에틸에스테르 혹은 아세트산기 (프로피온산기) 4 개와, 메틸기 4 개를 함유하는 분자량 654, 분자식 C36H38O8N4 의 포르피린 화합물인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2
유전자 ypjD(b2611) 의 트랜스포존 삽입 변이주 (내셔널 바이오 리소스 JD23504) 를, 2 ㎖ 의 LB 배지 (Bacto-tryptone : 1 %, Bacto-yeast extract : 0.5 %, NaCl : 0.5 %) 에 있어서, 37 ℃ 의 온도에서 12 시간에 걸쳐 전 배양하였다. 얻어진 세포 현탁액 1 ㎖ 를, 1 ℓ 의 탈이온수 중에 MnCl2 를 20 ㎎, 시트르산 2 수화물을 1 g, 글루코오스를 3.6 g 및 MgSO4 를 100 ㎎ 용해시킨 수용액 중에 첨가하고, 37 ℃ 의 온도에서 24 시간에 걸쳐 본 배양하였다.
배양액의 색은, 본 배양을 개시한 시점에서 무색이었지만, 24 시간 경과 후에는 적갈색이 되었다. 이 배양액을 원심 분리기에 넣어 세포를 침전시키고, 얻어진 상청액을 포어 사이즈 0.22 ㎛ 의 필터로 여과하였다. 이어서, 여과액을 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통과시킨 후, 수지에 흡착된 배양물을, 20 % 아세토니트릴-0.1 % 트리플루오로아세트산 용액에서 용출시켜, 용출물을 동결 건조시켰다. 이로써, 적갈색을 띤 생성물이 얻어진다.
추가로 상기 생성물을 열 분해 GC-MS 로 분석한 결과, 도 16 에 나타내는 바와 같이, 주된 성분은 피롤 화합물이었다. 이것은 각 성분의 질량 스펙트럼을 데이터 베이스와 조합함으로써 확인할 수 있고, 분자 중에 피롤 고리의 구조를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또, ESI-MS 질량 분석의 결과로부터, 이 화합물의 분자량이 707 이고 (도 17), 또한 MS/MS 측정에 의해 분자량 59 의 프래그먼트가 순차 4 개 검출된 것 (도 18), 실시예 1 과 동일하게, 열 분해 GC/MS 분석에 의해 CO2 가 검출된 점에서, 에틸에스테르 혹은 아세트산기 (프로피온산기) 가 합계 4 개 함유되어 있는 것을 알 수 있었다. 오렌지색의 색조를 나타내는 동일 생성물의 흡광 스펙트럼을 도 19 에 나타낸다.
또, XPS 원소 분석으로부터 (도 20), Mn 이 함유되어 있는 것을 알 수 있고, 이상에 나타낸 상세한 질량 분석의 결과로부터, 본 실시예의 생성물은, 실시예 1의 생성물과 공통의 포르피린 화합물 구조를 갖는 화합물인 것이 확인되어, 실시예 1 의 생성물의 질량 654.2682 와 본 실시예의 생성물의 질량 (도 17 에 나타내는 바와 같이, 분자량 707.1905 가 얻어진다) 의 상세한 질량 차로부터, 본 실시예의 생성물은, 실시예 1 의 생성물로부터 중앙의 수소 2 개가 탈리되고, 그곳에 3 가의 Mn 이온이 배위된 것 (분자량 654.2682 － 1.0078 × 2 ＋ 54.9380 (Mn 의 질량 수) = 707.1906 이 얻어져, 실측값과 거의 일치한다) 인 것이 분명해졌다.
이상에 의해, 측사슬에 -CH2-CH2-COOH (프로피온산기) 4 개와, 메틸기 4 개를 함유하는 분자량 (이온 질량) : 707, 이온식 : [C36H36O8N4·Mn(Ⅲ)]＋ 의 포르피린 화합물인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3
유전자 ypjD(b2611) 의 트랜스포존 삽입 변이주 (내셔널 바이오 리소스 JD23504) 를, 2 ㎖ 의 LB 배지 (Bacto-tryptone : 1 %, Bacto-yeast extract : 0.5 %, NaCl : 0.5 %) 에 있어서, 37 ℃ 의 온도에서 12 시간에 걸쳐 전 배양하였다. 얻어진 세포 현탁액 1 ㎖ 를, 1 ℓ 의 탈이온수 중에 금 티오말산나트륨을 25 ㎎, 시트르산 2 수화물을 1 g, 글루코오스를 3.6 g 및 MgSO4 를 100 ㎎ 용해시킨 수용액 중에 첨가하고, 37 ℃ 의 온도에서 24 시간에 걸쳐 본 배양하였다.
배양액의 색은, 본 배양을 개시한 시점에서 무색이었지만, 24 시간 경과 후에는 황색이 되었다. 이 배양액을 원심 분리기에 넣어 세포를 침전시키고, 얻어진 상청액을 포어 사이즈 0.22 ㎛ 의 필터로 여과하였다. 이어서, 여과액을 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통과시킨 후, 수지에 흡착된 배양물을, 20 % 아세토니트릴-0.1 % 트리플루오로아세트산 용액에서 용출시켜, 용출물을 동결 건조시켰다. 이로써, 황색을 띤 생성물이 얻어졌다. 이 생성물에 대해, ICP 질량 분석을 실시한 결과, 금 (Au) 이 함유되어 있는 것이 확인되었다. 추가로, 이 생성물을 열 분해 GC-MS 에 의해 분석한 결과, 주된 성분은 피롤 화합물이고, 분자 중에 피롤 고리의 구조를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4
유전자 ypjD(b2611) 의 트랜스포존 삽입 변이주 (내셔널 바이오 리소스 JD23504) 를, 2 ㎖ 의 LB 배지 (Bacto-tryptone : 1 %, Bacto-yeast extract : 0.5 %, NaCl : 0.5 %) 에 있어서, 37 ℃ 의 온도에서 12 시간에 걸쳐 전 배양하였다. 얻어진 세포 현탁액 1 ㎖ 를, 1 ℓ 의 탈이온수 중에 CuCl2 를 20 ㎎, 시트르산 2 수화물을 1 g, 글루코오스를 3.6 g 및 MgSO4 를 100 ㎎ 용해시킨 수용액 중에 첨가하고, 37 ℃ 의 온도에서 24 시간에 걸쳐 본 배양하였다.
배양액의 색은, 본 배양을 개시한 시점에서 무색이었지만, 24 시간 경과 후에는 청록색이 되었다. 이 배양액을 원심 분리기에 넣어 세포를 침전시키고, 얻어진 상청액을 포어 사이즈 0.22 ㎛ 의 필터로 여과하였다. 이어서, 여과액을 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통과시킨 후, 수지에 흡착된 배양물을, 20 % 아세토니트릴-0.1 % 트리플루오로아세트산 용액으로 용출시켜, 용출물을 동결 건조시켰다. 이로써, 녹색을 띤 생성물이 얻어졌다. 이 생성물에 대해, ICP 질량 분석을 실시한 결과, 구리 (Cu) 가 함유되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 이 생성물을 열분해 GC-MS 에 의해 분석한 결과, 주된 성분은 피롤 화합물이고, 분자 중에 피롤 고리의 구조를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5
유전자 ypjD(b2611) 의 트랜스포존 삽입 변이주 (내셔널 바이오 리소스 JD23504) 를, 2 ㎖ 의 LB 배지 (Bacto-tryptone : 1 %, Bacto-yeast extract : 0.5 %, NaCl : 0.5 %) 에 있어서, 37 ℃ 의 온도에서 12 시간에 걸쳐 전 배양하였다. 얻어진 세포 현탁액 1 ㎖ 를, 1 ℓ 의 탈이온수 중에 ZnCl2 를 17 ㎎, 시트르산 2 수화물을 1 g, 글루코오스를 3.6 g 및 MgSO4 를 100 ㎎ 용해시킨 수용액 중에 첨가하고, 37 ℃ 의 온도에서 24 시간에 걸쳐 본 배양하였다.
배양액의 색은, 본 배양을 개시한 시점에서 무색이었지만, 24 시간 경과 후에는 붉은 빛을 띤 녹색이 되었다. 이 배양액을 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 처리함으로써, 녹색을 띤 생성물이 얻어졌다.
이 녹색의 색조를 띤 배양 생성물은, TOF-MS 법에 의한 질량 분석의 결과, 도 21 에 나타내는 바와 같이 분자량이 307 ∼ 1294 의 범위에 들어가는 혼합물이며, 또, ICP 질량 분석법에 의해 생성물이 아연을 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 도 22 에 나타내는 흡광 광도 곡선으로부터 분명한 바와 같이, 372 ㎚ 및 445 ㎚ 에 2 개의 피크를 나타내었다. 추가로, 이 생성물을 열 분해 GC-MS 에 의해 분석한 결과, 주된 성분은 피롤 화합물이고, 분자 중에 피롤 고리의 구조를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6
유전자 ypjD(b2611) 의 트랜스포존 삽입 변이주 (내셔널 바이오 리소스 JD23504) 를, 2 ㎖ 의 LB 배지 (Bacto-tryptone : 1 %, Bacto-yeast extract : 0.5 %, NaCl : 0.5 %) 에 있어서, 37 ℃ 의 온도에서 12 시간에 걸쳐 전 배양하였다. 얻어진 세포 현탁액 1 ㎖ 를, 1 ℓ의 탈이온수 중에 RuCl3 를 10 ㎎, 시트르산 2 수화물을 1 g, 글루코오스를 3.6 g 및 MgSO4 를 100 ㎎ 용해시킨 수용액 중에 첨가하고, 37 ℃ 의 온도에서 24 시간에 걸쳐 본 배양하였다.
배양액의 색은, 본 배양을 개시한 시점에서 무색이었지만, 24 시간 경과 후에는 청록색이 되었다. 이 배양액을 원심 분리기에 넣어 세포를 침전시키고, 얻어진 상청액을 포어 사이즈 0.22 ㎛ 의 필터로 여과하였다. 이어서, 여과액을 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통과시킨 후, 수지에 흡착된 배양물을, 20 % 아세토니트릴-0.1 % 트리플루오로아세트산 용액에서 용출시켜, 용출물을 동결 건조시켰다. 이로써, 녹색을 띤 생성물이 얻어졌다. 이 생성물에 대해, ICP 질량 분석을 실시한 결과, 루테늄 (Ru) 이 함유되어 있는 것이 확인되었다. 추가로, 이 생성물을 열 분해 GC-MS 에 의해 분석한 결과, 주된 성분은 피롤 화합물이고, 분자 중에 피롤 고리의 구조를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 의해 얻어진 테트라피롤 화합물은, 광 촉매나 전지 등의 분야 외에, 광 기억 매체, 정보 기억 매체, 전자 이동 매체, 반도체 소자 및 전극 등의 기술 분야에서 이용할 수 있다.

Claims (5)

  1. 유전자 ypjD(b2611) 가 변이에 의해 발현할 수 없게 된 대장균을 배지에서 배양하고, 그 배지로부터 포르피린 고리 구조를 갖는 테트라피롤 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 테트라피롤 화합물의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 배지 중에서 이온이 되는 금속 원소 또는 이온으로서 해리되는 금속 원소를 함유한 화합물을 원료로서 그 배지에 첨가하고, 그 금속이 함유된 피롤 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 피롤 화합물의 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 테트라피롤 화합물이, 포르피린 고리에 4 개의 메틸기, 4 개의 에틸에스테르 또는 아세트산기 (프로피온산기) 를 함유하는 화합물인 것을 특징으로 하는 테트라피롤 화합물의 제조 방법.
  4. 유전자 ypjD(b2611) 가 변이에 의해 발현할 수 없게 된 대장균을, 배지 중에서 이온이 되는 Mn 또는 이온으로서 해리되는 Mn 을 함유한 화합물을 원료로서 첨가한 배지에서 배양하고, 그 배지로부터 Mn 이 중심에 배위된 포르피린 고리 구조를 갖는 테트라피롤 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 테트라피롤 화합물의 제조 방법.
  5. 식 : [C36H36O8N4·Mn(Ⅲ)]＋ 를 갖는 제 3 항에 기재된 테트라피롤 화합물.
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