KR20230056026A - 조작된 면역 세포의 제조를 위한 벡터-비사용 공정 - Google Patents

조작된 면역 세포의 제조를 위한 벡터-비사용 공정 Download PDF

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KR20230056026A
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펠리프 베도야
조에 젱
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티뮤니티 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

특정 실시양태에서, 조작된 면역 세포를 제조하는 벡터-비사용 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 공정으로부터 수득된 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물이 또한 본원에 개시된다. 추가의 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 공정으로부터 수득된 조작된 면역 세포를 사용하여 질환을 치료하는 방법 및 키트가 본원에 개시된다.

Description

조작된 면역 세포의 제조를 위한 벡터-비사용 공정
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 8월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 63/071,236의 우선권을 주장하는 PCT 출원이며; 그의 전체 내용은 명확하게 본원에 참조로 포함된다.
키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 외인성 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 조작된 T-세포를 사용한 신규한 치료는 일부 유형의 암, 주로 혈액 악성종양에 대한 유망한 면역요법을 발생시켰다.
키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR) T 세포는 특이적 종양-연관 항원을 인식하고 후속적으로 종양 세포를 살해하도록 유전자 변형된 이펙터 면역 세포이다. 이들 세포의 제조는 일반적으로 T 세포의 자극, 이어서 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스를 사용한 세포의 형질도입으로 발현을 위한 CAR 또는 TCR을 코딩하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 현재의 벡터 형질도입, 예컨대 렌티바이러스 벡터 형질도입의 한 가지 제한은 그들이 정지 세포, 예컨대 1차 T 세포 내로의 유전자 전달을 효율적으로 매개하지 못하는 것이다. 이전의 연구는 T 세포의 자극 및 확장이 보다 분화된 T 세포 표현형을 발생시킴을 제시하였다. 비분화된 또는 비자극된 T 세포 집단은 증가된 존속 및 보다 높은 효능, 그러나 낮은 형질감염 효율을 발생시킨다. 또한, 렌티바이러스 벡터를 사용한 입양 요법을 위한 T 세포의 제조는 세포가 수거되고 투여를 위해 제제화될 수 있기 전에 최대 10-12일을 요구한다.
따라서, 비분화된 표현형을 보유하고 제조 시간을 감소시키면서 외인성 면역 수용체를 코딩하는 핵산으로의 T 세포 형질도입의 개선된 방법에 대한 필요가 존재한다. 본 발명은 이들 필요를 다루는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 조작된 면역 세포의 벡터 비사용 제조를 위한 방법 및 공정이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 공정으로부터 수득된 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물이 또한 본원에 개시된다. 추가의 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 공정으로부터 수득된 조작된 면역 세포를 사용하여 질환을 치료하는 방법 및 키트가 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 제조하는 벡터 비사용 방법으로서, (a) 생물학적 샘플로부터 수득된 비자극된 면역 세포의 집단 내로 (i) 유전자-편집 뉴클레아제, (ii) 가이드 RNA, 및 (iii) 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상동성-지정 복구 (HDR) 주형을 형질감염 방법에 의해 전달하고; (b) 집단을 비-확장 조건 하에서 약 72시간 이하 동안 배양하는 것을 포함하며, 여기서 유전자-편집 뉴클레아제 및 가이드 RNA는 복합체를 형성하여 적어도 하나의 비자극된 면역 세포 내의 표적 부위에서 이중-가닥 파단을 생성하고, 여기서 HDR 주형은 표적 부위에서 HDR을 용이하게 하여 집단 내의 적어도 하나의 변형된 비자극된 면역 세포를 생성하는 것인 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 제조하는 벡터-비사용 방법으로서, (a) 생물학적 샘플로부터 비자극된 면역 세포의 풍부화된 집단을 수득하고; (b) 풍부화된 집단 내로 (i) 유전자-편집 뉴클레아제, (ii) 가이드 RNA, 및 (iii) 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상동성-지정 복구 (HDR) 주형을 형질감염 방법에 의해 전달하고; (c) 집단을 비-확장 조건 하에서 배양하는 것을 포함하며, 여기서 유전자-편집 뉴클레아제 및 가이드 RNA는 복합체를 형성하여 집단 내의 복수개의 비자극된 면역 세포 내의 표적 부위에서 이중-가닥 파단을 생성하고, 여기서 HDR 주형은 표적 부위에서 HDR을 용이하게 하여 복수개의 변형된 비자극된 면역 세포를 생성하고, 여기서 집단 내의 비자극된 면역 세포의 약 10% 이상이 변형되는 것인 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 생성하는 벡터-비사용 방법으로서, (a) 비자극된 면역 세포의 집단의 약 10% 이상에서 상동성-지정 복구 (HDR)를 (i) 비자극된 면역 세포의 집단을 유전자-편집 뉴클레아제 및 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상동성-지정 복구 (HDR) 주형과 접촉시키는 것; 및 (ii) 비자극된 면역 세포 내로 유전자-편집 뉴클레아제 및 HDR 주형을 형질감염 방법에 의해 전달하는 것에 의해 유도하고; (b) 비자극된 면역 세포를 비-확장 조건 하에서 약 72시간 이하 동안 배양하며, 그에 의해 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 생성하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 (a) 비자극된 면역 세포의 집단을 가이드 RNA와 접촉시키고, 가이드 RNA를 비자극된 면역 세포 내로 형질감염 방법에 의해 전달하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 임의로 (b) 여기서 유전자-편집 뉴클레아제 및 임의로 가이드 RNA는 하나 이상의 비자극된 면역 세포의 게놈 내의 표적 부위에서 이중 가닥 파단을 생성한다. 추가의 다른 실시양태에서, 이들 방법에서 HDR 주형은 비자극된 면역 세포의 집단의 약 10% 이상에서 표적 부위에서 HDR을 용이하게 한다. 또한, 비자극된 면역 세포의 집단은 생물학적 샘플로부터 수득될 수 있고/거나; CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합의 풍부화된 집단을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 킬러 세포, 자연 킬러 T 세포, 대식세포, 단핵구, B 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 킬러 세포, 자연 킬러 T 세포, 대식세포, 단핵구, B 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 이들의 조합으로 이루어진다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포의 집단은, 예를 들어, 약 500만개의 세포, 1000만개의 세포, 2000만개의 세포, 5000만개의 세포, 1억개의 세포, 5억개의 세포, 10억개의 세포, 20억개의 세포, 30억개의 세포, 40억개의 세포, 50억개의 세포 또는 그 초과를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 형질감염 방법은 (a) 약 10% 내지 약 99%, 약 12% 내지 약 99%, 약 13% 내지 약 99%, 약 15% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 30% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 80%, 약 12% 내지 약 80%, 약 13% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60%의 효율을 제공하고/거나; (b) 약 10%, 12%, 13%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 효율을 제공할 수 있다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 방법은 (a) 약 10% 내지 약 99%, 약 12% 내지 약 99%, 약 13% 내지 약 99%, 약 15% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 30% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 80%, 약 12% 내지 약 80%, 약 13% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60%의; 및/또는 (b) 약 10%, 약 12%, 약 13%, 약 15%, 약 18%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%의 세포 생존율을 제공할 수 있다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, (a) 약 1 pM 내지 약 10 mM의 HDR 주형은 비자극된 면역 세포 내로 전달되고/거나; (b) 약 1 pM 내지 약 10 mM의 유전자-편집 뉴클레아제는 비자극된 면역 세포 내로 전달되고/거나; (c) 약 1 pM 내지 약 10 mM의 가이드 RNA는 비자극된 면역 세포 내로 전달된다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, (a) 유전자-편집 뉴클레아제 대 가이드 RNA의 비는 약 10:1, 약 5:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:5, 또는 약 1:10이고/거나; (b) HDR 주형 대 유전자-편집 뉴클레아제 및 가이드 RNA 사이에 형성된 복합체의 비는 약 5:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 또는 약 1:5이고/거나; (c) HDR 주형 대 유전자-편집 뉴클레아제의 비는 약 5:1, 약 2:1, 1:1, 약 1:2, 또는 약 1:5이다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 복합체는 리보핵단백질 (RNP) 복합체이다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포의 집단은 (a) 비자극된 T 세포, 비자극된 자연 킬러 (NK) 세포, 비자극된 자연 킬러 T (NKT) 세포, 또는 이들의 조합을 포함하고/거나; (b) CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+/CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 비자극된 T 세포를 포함하고/거나; (c) CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합의 풍부화된 집단을 포함한다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 풍부화된 집단은 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 약 100% CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 방법은 비자극된 면역 세포의 집단을 생성하기 전에, 생물학적 샘플을 복수개의 CD4 및/또는 CD8 표지된 마이크로비드, 임의로 자기화된 마이크로비드와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 단계는 (a) 생물학적 샘플을 알부민, 임의로 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함하는 용액과 함께 인큐베이션하는 것; 및/또는 (b) 집단에서 비자극된 세포를 풍부화하는 세포 선택 공정; 및/또는 (c) 풍부화된 비자극된 세포를 최소 배지, HSA, 시토카인, 보충물, 또는 이들의 조합을 포함하는 세포 배지에서 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포는 (a) 비-확장 조건 하에서 약 48시간 이하, 약 36시간 이하, 약 24시간 이하, 또는 약 18시간 이하 동안 배양되고/거나; (b) 비-확장 조건 하에서 약 18시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 또는 약 72시간 동안 배양되고/거나; (c) 추가로 동결보존제 용액에 재현탁되고, 극저온-냉동된다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 형질감염 방법은 전기천공 또는 세포 스퀴징 방법을 포함한다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 (a) 항원-결합 도메인을 포함하거나; (b) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하거나; (c) 세포 표면 수용체 리간드를 포함하거나; 또는 (d) T-세포 수용체 (TCR)를 포함하고/거나; (e) 종양 항원에 결합한다. 또 다른 측면에서, (a) 항원-결합 도메인은 전장 항체 또는 그의 항원-결합 단편, Fab, F(ab)2, 단일특이적 Fab2, 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab2, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 디아바디, 트리아바디, 미니바디, V-NAR, 또는 VhH를 포함하고/거나; (b) CAR은 항원-결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며, 임의로 여기서 CAR은 힌지 영역을 포함한다. 추가의 측면에서, (a) 막횡단 도메인은 인공 소수성 서열, 유형 I 막횡단 단백질의 막횡단 도메인, T 세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, OX40 (CD134), 4-1BB (CD137), ICOS (CD278), CD154, 및 킬러 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR)로부터 유래된 막횡단 도메인으로부터 선택되고/거나; (b) 세포내 도메인은 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고/거나; (c) 세포내 도메인은 TNFR 슈퍼패밀리에서의 단백질, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), PD-1, CD7, LIGHT, CD83L, DAP10, DAP12, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS (CD278), NKG2C, B7-H3 (CD276)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 공동자극 도메인, 및 킬러 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR)로부터 유래된 세포내 도메인, 또는 그의 변이체 중 하나 이상을 포함한다. 추가의 측면에서, (a) 공동자극 도메인은 4-1BB (CD137) 공동자극 도메인을 포함하고/거나; (b) 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 쇄 (CD3ζ), FcγRIII, FcsRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 보유 세포질 수용체, TCR 제타, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d의 세포질 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포내 도메인, 또는 그의 변이체를 포함하고/거나; (c) 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 인간 CD3 제타 쇄 (CD3ζ) 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 추가의 또 다른 측면에서, 세포질 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 쇄 (CD3ζ)를 포함한다.
항원-결합 폴리펩티드가 종양 항원에 결합하는 방법에서, 종양 항원은 (a) 혈액 악성종양과 연관되고/거나; (b) CD19, CD20, CD22, 및 CD33/IL3Ra로부터 선택되고/거나; (c) 고형 종양과 연관되고/거나; (d) ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, PSCA, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, EGFRvIII, GPC2, TnMUC1, GDNF 패밀리 수용체 알파-4 (GFRa4), 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 및 IL13Ra2로부터 선택될 수 있다.
항원-결합 폴리펩티드가 T-세포 수용체 (TCR)를 포함하는 방법에서, TCR은 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함할 수 있고/거나; 야생형 TCR, 고친화성 TCR, 및 키메라 TCR로부터 선택된다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, HDR 주형은 (a) 폴리뉴클레오티드의 상류에 5' 상동성 아암을 추가로 포함하고/거나; (b) 폴리뉴클레오티드의 하류에 3' 상동성 아암을 추가로 포함하고/거나; (c) 이중-가닥 DNA 주형일 수 있고/거나; (d) 이중-가닥 DNA 주형일 수 있으며, 여기서 HDR 주형은 약 2 킬로-염기 쌍 (kb) 내지 약 5 kb, 약 2.3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 4 kb, 약 2.3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 2.3 kb 내지 약 3 kb, 또는 약 4 kb 내지 약 5 kb의 길이이고/거나; (e) 전기천공에 의해 전달될 수 있다. 또 다른 측면에서, 5' 상동성 아암은 (a) 폴리뉴클레오티드에 인접하고/거나; (b) 표적 부위의 5'의 게놈 영역에 대해 상동이고/거나; (c) 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드의 길이이고/거나; (d) 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 추가의 또 다른 측면에서, 3' 상동성 아암은 (a) 폴리뉴클레오티드에 인접하고/거나; (b) 표적 부위의 3'의 게놈 영역에 대해 상동이고/거나; (c) 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드의 길이이고/거나; (d) 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 표적 부위는 TRAC 로커스, 및 임의로 TRAC 로커스의 엑손 1에 있다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 유전자-편집 뉴클레아제는 (a) Cas 뉴클레아제; 및/또는 (b) 아연 핑거 뉴클레아제; 및/또는 (c) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 포함한다. 또 다른 측면에서, Cas 뉴클레아제는 (a) Cas9, 임의로 SpCas9 또는 SaCas9이고/거나; (b) 그리고 가이드 RNA는 비자극된 면역 세포 내로의 전달 전에 복합체로 어셈블리되고/거나; (c) 가이드 RNA는 비자극된 면역 세포 내로의 전달 후에 복합체로 어셈블리된다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 추가의 가이드 RNA를 비자극된 면역 세포 내로 전달하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 (a) 혈액 샘플이고/거나; (b) 혈액 샘플이며, 여기서 혈액 샘플은 전혈 샘플, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플, 또는 성분채집술 샘플이고/거나; (c) 혈액 샘플이며, 여기서 혈액 샘플은 동결보존된 성분채집술 샘플이고/거나; (d) 혈액 샘플이며, 여기서 혈액 샘플은 신선한 성분채집술 샘플이다.
본원에 기재된 모든 방법에 대한 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 비자극된 면역 세포를 지극시켜 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 생성하고, 임의로 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 확장시키는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 변형된 자극된 면역 세포의 집단은 확장 조건 하에서 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 또는 그 초과 동안 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 자극된 면역 세포의 집단이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단, 또는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 포함하고; 임의로 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 대상체에게 투여하거나; 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 대상체에게 투여하거나, 또는 변형된 비자극된 면역 세포의 집단 또는 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암, 예컨대 고형 종양을 갖는다. 본원에 기재된 질환을 치료하는 방법의 다른 측면에서, 암은 혈액 악성종양이다. 본원에 기재된 질환을 치료하는 방법의 추가의 다른 측면에서, 항원-결합 도메인은 암에 의해 발현되는 항원에 대해 특이적이다. 또 다른 측면에서, 생물학적 샘플은 대상체에 대해 자가이다. 대안적으로, 생물학적 샘플은 대상체에 대해 동종이형일 수 있다. 마지막으로, 본원에 기재된 질환을 치료하는 모든 방법에서, 대상체는 인간일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로부터 수득된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단 또는 본원에 기재된 방법으로부터 수득된 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 포함하는 키트가 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 간, 피부, 또는 췌장의 세포로부터 선택되는 변형된 비자극된 세포의 집단을 제조하는 벡터 비사용 방법으로서, (a) 생물학적 샘플로부터 수득된 비자극된 세포의 집단 내로 (i) 유전자-편집 뉴클레아제, (ii) 가이드 RNA, 및 (iii) 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상동성-지정 복구 (HDR) 주형을 형질감염 방법에 의해 전달하고; (b) 집단을 비-확장 조건 하에서 약 72시간 이하 동안 배양하는 것을 포함하며, 여기서 유전자-편집 뉴클레아제 및 가이드 RNA는 복합체를 형성하여 적어도 하나의 비자극된 세포 내의 표적 부위에서 이중-가닥 파단을 생성하고, 여기서 HDR 주형은 표적 부위에서 HDR을 용이하게 하여 집단 내의 적어도 하나의 변형된 비자극된 세포를 생성하는 것인 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 간, 피부, 또는 췌장의 세포로부터 선택되는 변형된 비자극된 세포의 집단을 제조하는 벡터 비사용 방법으로서, (a) 생물학적 샘플로부터 비자극된 세포의 풍부화된 집단을 수득하고; (b) 풍부화된 집단 내로 (i) 유전자-편집 뉴클레아제, (ii) 가이드 RNA, 및 (iii) 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상동성-지정 복구 (HDR) 주형을 형질감염 방법에 의해 전달하고; (c) 집단을 비-확장 조건 하에서 배양하는 것을 포함하며; 여기서 유전자-편집 뉴클레아제 및 가이드 RNA는 복합체를 형성하여 집단 내의 복수개의 비자극된 세포 내의 표적 부위에서 이중-가닥 파단을 생성하고, 여기서 HDR 주형은 표적 부위에서 HDR을 용이하게 하여 복수개의 변형된 비자극된 세포를 생성하고, 여기서 집단 내의 비자극된 세포의 약 10% 이상이 변형되는 것인 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 간 세포는 간세포, 간 성상 세포, 굴모양 내피 세포, 및 쿠퍼 세포 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피부 세포는 각질세포, 멜라노솜, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 및 메르켈 세포 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 췌장 세포는 췌장 알파 세포, 췌장 베타 세포, 췌장 델타 세포, 췌장 감마 세포, 및 췌장 엡실론 세포 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
상기 요약 및 하기 도면의 설명 및 상세한 설명 둘 다는 예시적이고 설명적이다. 이들은 본 개시내용의 추가의 상세사항을 제공하는 것으로 의도되지만, 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 다른 목적, 이점, 및 신규한 특색은 하기 본 개시내용의 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
도 1a-1c는 본원에 기재된 벡터-비사용 제조 공정의 예시적인 개략도를 예시한다. 도 1a는 조작된 면역 세포의 벡터-비사용 제조 공정의 개략도를 예시한다. 도 1b는 임상-등급 벡터-비사용 조작된 T 세포의 제조 공정의 개략도를 예시한다. 도 1c는 동종이형 T-세포 제조 공정의 개략도를 예시한다.
도 2a 및 2b는 조작된 T 세포의 벡터-비사용 제조 공정에 대한 예시적인 개략도를 예시한다. 도 2a는 제0일에서의 제조 공정을 상세화하고, 도 2b는 제0일 내지 제3일/수거에서의 제조 공정을 상세화한다.
도 3a 및 3b는 TRAC-표적화 gRNA를 사용한 CRISPR/Cas9를 통한 비자극된 T 세포에서의 내인성 TCR 발현의 파괴를 예시한다. CRISPR/Cas9 유전자 편집을 수행하여 비자극된 T 세포에서 TCR 알파 불변 (TRAC) 로커스를 표적화하였다. 2개의 CRISPR/Cas9 리보핵단백질 (RNP) 시스템을 시험하였다: 트루컷(Truecut).v2 Cas9 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)) 및 SpyFi Cas9 (알데브론(Aldevron)). 도 3a는 양성 대조군, 트루컷 및 SpyFi에 대한 % CD3 + TCR+/살아있는 세포를 도시한다. 도 3b는 또한 양성 대조군, 트루컷 및 SpyFi에 대한 % CD3 + TCR+/살아있는 세포를 도시한다.
도 4는 이중-가닥 DNA 파단의 상동성-지정 복구를 통해 TRAC 로커스의 엑손 1 내로 EcoRI 부위를 함유하는 공여자 DNA를 도입하기 위한 예시적인 개략도를 예시한다.
도 5a 및 b는 화학적으로-변형된 ssDNA 공여자 또는 "울트라머" 내로의 HDR-매개 삽입을 입증하는 EcoRI로 소화된 PCR 앰플리콘의 겔 전기영동 화상을 예시한다.
도 6은 TRAC 로커스 내로 NY-ESO-1 TCR을 코딩하는 공여자 DNA를 삽입하는 넉-인 전략을 예시하는 예시적인 개략도이다.
도 7은 T-세포 게놈 내로의 GFP HDR 카세트의 표적화된 삽입을 예시한다.
I. 개관
CAR-T 및 TCR 세포는 암 환자에게 흥미로운 가능성을 제공한다. 그러나, CAR-T 및 TCR 세포의 제조에 관하여 몇몇 과제가 현재 존재하며, 이들 과제는 이들 암 치료제의 잠재적 성공에 영향을 미친다. 첫째로, 지금 현재의 CAR-T 및 TCR 제조 공정은 일반적으로 번식을 위해 바이러스 벡터 시스템을 이용한다. 그러나, 이 유형의 번식 방법을 사용하는 것은 세포 수거 전에 약 9일 기간을 발생시킨다. 본 개시내용은 CAR-T 및/또는 TCR 세포 수거까지의 시간을 예를 들어, 약 72시간 이하로 극적으로 감소시키는 놀라운 벡터-비사용 방법을 상세화한다.
본 기술에 존재하고 본 개시내용에 의해 다루어지는 두번째 과제는 생산을 규모 확대할 필요이다. 본 개시내용은 심지어 대규모 생산으로, 허용되는 삽입 효율로 놀랍게 규모화가능한 벡터-비사용 공정을 상세화한다. 특히, 짧은 공정 시간은 공정을 규모 확대하는 능력에 영향을 미친다. 따라서, 대규모 생산 수준으로 수행될 수 있고, 높은 백분율의 삽입 효율을 갖는 짧은 CAR-T 및 TCR 제조 공정이 디자인될 수 있었던 것은 놀라운 것이었다.
본 개시내용의 또 다른 놀라운 측면은 자극된 대 비자극된 세포를 배양하는 것의 영향이다. 일반적으로, 삽입 효율은 자극된 세포로 더 높지만, 제조 공정은 비자극된 세포로 더 용이하다. 한 가지 쟁점은 배지 사이에서 이동하는 세포는 높은 세포 소실을 발생시킨다는 것이다. 또한, 비분화된 세포의 사용은 보다 양호한 산물을 생산할 수 있는데, 이는 비분화된 세포의 사용이 복수개의 상이한 비자극된 면역 세포 집단, 예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 (예를 들어, 상이하지만 균일하지 않은 특성을 갖는 세포)를 발생시킬 수 있기 때문이다. 본원에 기재된 방법은 자극된 세포 (보다 높은 삽입 효율을 생성함) 또는 비자극된 세포 (덜 분화되고 보다 강력한 표현형을 갖는 최종 산물을 생산할 수 있음)와 함께 사용될 수 있다.
이들 이점 및 발견은 하기에 보다 상세하게 기재된다.
II. 조작된 면역 세포를 제조하는 방법
특정 실시양태에서, 변형된 면역 세포 또는 그의 전구 세포 (예를 들어, 변형된 T 세포, 변형된 자연 킬러 (NK) 세포, 변형된 자연 킬러 T (NKT) 세포, 변형된 대식세포, 변형된 단핵구, 변형된 B 세포, 또는 변형된 조혈 줄기 세포)를 제조하는 방법에 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역 세포 또는 그의 전구 세포는 외인성 항원-결합 폴리펩티드를 발현하는 변형된 비자극된 면역 세포 또는 그의 전구 세포 (예를 들어, 변형된 비자극된 T 세포, 변형된 비자극된 NK 세포, 변형된 비자극된 NKT 세포, 변형된 비자극된 대식세포, 변형된 비자극된 단핵구, 변형된 비자극된 B 세포, 또는 변형된 비자극된 조혈 줄기 세포)이다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및/또는 외인성 T 세포 수용체 (TCR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 항원-결합 도메인, 세포 표면 수용체 리간드, 또는 종양 항원에 결합하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은, 예를 들어, 미국 식품 의약청 (FDA) 규정에 따르는 또는 외국 관할권에 있는 미국 FDA의 등가물에 따르는 우수 제조 관행 (GMP) 방법이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포를 제조하는 방법은 면역 세포에 제한되지 않지만, 간, 피부, 및 췌장으로부터의 포유동물 세포를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 면역 세포에 적용가능한 바와 같은 나열된 임의의 및 모든 방법은 간, 피부, 및 췌장으로부터의 세포에 추가로 적용가능하다. 일부 실시양태에서, 간, 피부, 및 췌장으로부터의 세포는 자극으로 처리되지 않는다. 일부 실시양태에서, 간 세포는 간세포, 간 성상 세포, 굴모양 내피 세포, 및 쿠퍼 세포 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피부 세포는 각질세포, 멜라노솜, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 및 메르켈 세포 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 췌장 세포는 췌장 알파 세포, 췌장 베타 세포, 췌장 델타 세포, 췌장 감마 세포, 및 췌장 엡실론 세포 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조작된 또는 변형된 면역 세포 또는 그의 전구 세포를 제조하는 제조 방법은 도 1a에 예시된다. 도 1에 제시된 바와 같이, 생물학적 샘플 (101)은 세포 분리 시스템을 통해 프로세싱되어 풍부화된 비자극된 면역 세포 (102) (예를 들어, 풍부화된 비자극된 CD4+ 및 CD8+ T 세포)의 집단을 생성한다. 다음으로, 풍부화된 비자극된 면역 세포 (102) (예를 들어, 풍부화된 비자극된 CD4+ 및 CD8+ T 세포)는 유전자 편집 시스템 및 주형 (예를 들어, HDR 주형)으로 형질감염되고, 후속적으로 최대 약 72시간 동안 배양되어 변형된 비자극된 면역 세포 (103) (예를 들어, 변형된 비자극된 CD4+ 및 CD8+ T 세포)의 집단을 생성한다. 이어서 변형된 비자극된 면역 세포 (103)는 극저온냉동되어 동결보존된 변형된 비자극된 면역 세포 (104)를 생성한다. 임의로, 변형된 비자극된 면역 세포 (104)는 최대 약 10 내지 약 12일 동안 자극되고 확장되어 변형된 자극된 면역 세포 (105)를 생성할 수 있다. 변형된 자극된 면역 세포 (105)는 추가로 동결보호되어 동결보존된 변형된 자극된 면역 세포 (106)를 생성할 수 있다. 일부 사례에서, 제조 방법은 변형된 면역 세포 또는 그의 전구 세포를 제조하는 벡터-비사용 제조 방법이다. 또한 임상-등급 벡터-비사용 조작된 T 세포 및 동종이형 T-세포의 제조 공정의 개략도를 각각 예시하는 도 1b 및 도 1c를 참조한다. 일부 경우에서, 제조 방법은 형질감염의 효율, 변형된 비자극된 또는 자극된 면역 세포의 수율을 개선시키거나, 세포 생존율을 개선시키거나, 또는 이들의 임의의 조합이다.
A. 비자극된 면역 세포의 선택 및 풍부화
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비자극된 면역 세포는 비자극된 T 세포이다. T 세포는 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 또는 NKT 세포일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포의 집단은 대상체로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어, 대상체로부터의 조직, 유체, 또는 다른 샘플로부터 수거된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 조직 또는 기관 샘플, 예를 들어, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 골, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도선, 비장, 림프절, 또는 종양 조직, 또는 그로부터 유래된 세포이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 유체 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 윤활액, 소변, 또는 땀 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 임의로 전혈 샘플, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플, 또는 성분채집술 샘플로부터 선택되는 혈액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 이종발생성 공급원으로부터의 것, 예를 들어, 마우스, 래트, 비-인간 영장류, 또는 돼지로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 환자로부터의 성분채집술 샘플이다. 일부 실시양태에서, 성분채집술 샘플은 백혈구성분채집술 샘플이다. 일부 실시양태에서, 성분채집술 샘플 (예를 들어, 백혈구성분채집술 샘플)은 면역 세포 또는 면역 세포의 집단의 수거 전에 동결보존된다. 일부 실시양태에서, 성분채집술 샘플 (예를 들어, 백혈구성분채집술 샘플)은 동결보존되지 않은 환자로부터의 신선한 성분채집술 샘플이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 또는 면역 세포의 집단은 풍부화 단계를 포함하는 공정 또는 프로토콜 동안 성분채집술 샘플 (예를 들어, 백혈구성분채집술 샘플)로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포, 특히 비자극된 T 세포의 집단은 하나 이상의 선택 단계, 예를 들어, 하나 초과의 고갈 단계 (예를 들어, 비-면역 또는 비-T 세포의 제거)에서 단리되고 풍부화된다. 일부 사례에서, 단리 단계는 하나 이상의 특성, 예컨대 크기, 밀도, 특정 시약에 대한 민감성 또는 저항성, 및/또는 항체 또는 다른 결합 상대에 대한 친화성, 예를 들어, 면역친화성에 기반한 분리를 포함하는 하나 이상의 분리 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 단리는 동일한 장치 또는 장비를 사용하여 단일 공정 스트림에서 순차적으로 및/또는 동시에 수행된다. 일부 측면에서, 상이한 집단의 단리, 배양, 및/또는 조작은 동일한 출발 조성물 또는 물질로부터, 예컨대 동일한 샘플로부터 수행된다.
일부 측면에서, 비자극된 면역 세포의 집단은 폐쇄된 시스템 또는 장치에서, 및/또는 동일한 용기 또는 용기의 세트, 예를 들어, 동일한 (또는 동일한 세트의) 단위, 챔버, 칼럼, 예를 들어, 자기 분리 칼럼, 튜브, 튜빙 세트, 배양 또는 배양 챔버, 배양 용기, 프로세싱 유닛, 세포 분리 용기, 원심분리 챔버에서 단리된다. 예를 들어, 일부 경우에, 비자극된 면역 세포의 집단의 단리는, 예를 들어, 하나의 용기, 예를 들어, 튜빙 세트로부터 또 다른 것으로 세포 집단, 조성물, 또는 현탁액을 전달할 필요 없이, 단일 또는 동일한 단리 또는 분리 용기 또는 용기의 세트, 예컨대 단일 칼럼 또는 칼럼의 세트, 및/또는 동일한 튜브, 또는 튜빙 세트를 채용한 시스템 또는 장치 상에서 수행된다.
일부 사례에서, 동시 또는 순차적 선택을 채용함으로써, 복수개의 상이한 비자극된 면역 세포 집단, 예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 선택되고/거나, 풍부화되고/거나, 단리된다. 일부 실시양태에서, 단리 단계는 세포에서의 하나 이상의 특이적 분자, 예컨대 표면 마커, 예를 들어, 표면 단백질, 세포내 마커, 또는 핵산의 발현 또는 존재에 기반한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 마커에 기반한 분리를 위한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분리는 친화성- 또는 면역친화성-기반 분리이다. 예를 들어, 단리는 일부 측면에서 예를 들어, 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 상대와의 인큐베이션, 이어서 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 상대에 결합되지 않은 세포로부터의 항체 또는 결합 상대에 결합된 세포의 분리에 의해, 세포의 발현 또는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 발현 수준에 기반한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함한다.
이러한 분리 단계는 시약에 결합된 비자극된 면역 세포가 추가의 사용을 위해 보유되는 양성 선택, 및/또는 항체 또는 결합 상대에 결합되지 않은 세포가 보유되는 음성 선택에 기반할 수 있다. 일부 예에서, 둘 다의 분획은 추가의 사용을 위해 보유된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이질적 집단에서 세포 유형을 특이적으로 확인하는 항체가 이용가능하지 않은 경우 특히 유용할 수 있고, 그에 따라 분리는 목적하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 마커에 기반하여 가장 잘 수행된 다.
분리는 특정한 세포 집단 또는 특정한 마커를 발현하는 세포의 100% 풍부화 또는 제거를 발생시킬 필요는 없다. 예를 들어, 특정한 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현하는 것들의 양성 선택 또는 그에 대한 풍부화는 이러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 발생시킬 필요는 없다. 마찬가지로, 특정한 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현하는 것들의 음성 선택, 제거, 또는 고갈은 이러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하지만, 모든 이러한 세포의 완전한 제거를 발생시킬 필요는 없다. 예를 들어, 일부 측면에서, CD4+ 및 CD8+ 집단의 선택은 집단을 풍부화하지만, 또한 일부 잔류물 또는 작은 백분율의 다른 비-선택된 세포를 포함할 수 있다. 이러한 사례에서, 다른 비-선택된 세포의 잔류 백분율은 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 또는 약 0.1% 이하, 또는 그 미만일 수 있다.
일부 예에서, 다수의 라운드의 분리 단계가 수행될 수 있으며, 여기서 하나의 단계로부터 양성으로 또는 음성으로 선택된 분획은 또 다른 분리 단계, 예컨대 후속 양성 또는 음성 선택으로 처리된다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는 예컨대 세포를 각각 음성 선택을 위해 표적화되는 마커에 대해 특이적인 복수개의 항체 또는 결합 상대와 함께 인큐베이션함으로써, 다수의 마커를 발현하는 세포를 동시에 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다수의 세포 유형은 세포를 다양한 세포 유형 상에 발현되는 복수개의 항체 또는 결합 상대와 함께 인큐베이션함으로써 동시에 양성으로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 양성 또는 음성 선택에 의한 비자극된 T 세포 집단의 선택 및 풍부화는, 예를 들어, 양성으로 또는 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지정된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD4+ T 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지정된 모노클로날 항체의 칵테일은 CD45RA, CCR7, CD62L, CD127 (IL-7Rα), 및/또는 CD132에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지정된 모노클로날 항체의 칵테일은 CD62L, CCR7, 및/또는 CD127 (IL-7Rα)에 대한 항체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지정된 모노클로날 항체의 칵테일은 CD2, CD3, CD27, 및/또는 TCR에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 음성 선택에 의한 CD4- 및 CD8- 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지정된 모노클로날 항체의 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, 및/또는 HLA-DR에 대한 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 별개의 선택을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 제1 선택으로부터의 비-선택된 세포 (CD4- 세포)가 CD8+ T 세포에 대해 풍부화하는 제2 양성 선택을 위한 세포의 공급원으로서 사용되는 CD4+ T 세포에 대한 제1 양성 선택을 포함한다. 다른 측면에서, 방법은 제1 선택으로부터의 비-선택된 세포 (CD8- 세포)가 CD4+ T 세포에 대해 풍부화하는 제2 양성 선택을 위한 세포의 공급원으로서 사용되는 CD8+ T 세포에 대한 제1 양성 선택을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 동시 선택을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 선택되고, CD4- 및 CD8- 세포가 후속적으로 제거되는 양성 선택을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예컨대 세포 표면 마커 또는 마커들의 발현에 기반한 양성 또는 음성 선택에 의해, 예를 들어 상기 기재된 임의의 방법에 의해, 비자극된 면역 세포를 단리하고/거나, 선택하고/거나, 그에 대해 풍부화하는 방법은 면역친화성-기반 선택을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역친화성-기반 선택은 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함하는 1차 인간 T 세포를 함유하는 샘플을 세포 표면 마커 또는 마커들에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 상대와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 결합 상대는 고체 지지체 또는 매트릭스, 예컨대 구 또는 비드, 예를 들어 마이크로비드, 아가로스를 포함하는 나노비드, 자기 비드 또는 상자성 비드에 결합되어 양성 및/또는 음성 선택를 위한 세포의 분리를 허용한다. 일부 실시양태에서, 구 또는 비드는 면역친화성 크로마토그래피를 수행하기 위해 칼럼 내에 패킹될 수 있으며, 여기서 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 1차 인간 T 세포를 함유하는 샘플은 칼럼의 매트릭스와 접촉되고, 후속적으로 그로부터 용리되고 방출된다.
일부 측면에서, 분리되는 비자극된 면역 세포의 샘플 또는 조성물은 작은, 자기화가능한 또는 자기적으로 반응성인 물질, 예컨대 자기적으로 반응성인 입자 또는 미립자, 예컨대 상자성 비드와 함께 인큐베이션된다. 자기적으로 반응성인 물질, 예를 들어, 입자는 일반적으로 분리할 것이 요망되는, 예를 들어, 음성으로 또는 양성으로 선택될 것이 요망되는 세포, 세포들, 또는 세포의 집단 상에 존재하는 분자, 예를 들어, 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합 상대, 예를 들어, 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 이러한 비드는 공지되어 있으며, 일부 측면에서, 디나비즈(DYNABEADS)® (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드), MACS® 비드 (밀테니 비오텍(Miltenyi Biotec), 미국 캘리포니아주 샌 디에고) 또는 스트렙타머(STREPTAMER)® 비드 시약 (IBA, 독일)을 포함하는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다.
인큐베이션은 일반적으로 자기 입자 또는 비드에 부착되는 항체 또는 결합 상대, 또는 이러한 항체 또는 결합 상대에 특이적으로 결합하는 분자, 예컨대 2차 항체 또는 다른 시약이 샘플 내의 세포 상에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건 하에서 수행된다.
일부 측면에서, 샘플은 자기장에 정치되고, 그에 부착된 자기적으로 반응성인 또는 자기화가능한 입자를 갖는 세포는 자석에 유인되고, 비표지된 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택을 위해, 자석에 유인된 세포가 보유되고; 음성 선택을 위해, 유인되지 않은 세포 (비표지된 세포)가 보유된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합은 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 여기서 양성 및 음성 분획은 보유되고, 추가로 프로세싱되거나 추가의 분리 단계로 처리된다.
일부 실시양태에서, 친화성-기반 선택은 자기-활성화 세포 분류 (MACS) (밀테니 비오텍, 미국 캘리포니아주 오번)를 통해서이다. 자기 활성화 세포 분류 (MACS) 시스템은 그에 부착된 자기화된 입자를 갖는 세포의 고-순도 선택이 가능하다. 특정 실시양태에서, MACS는 비-표적 및 표적 종이 외부 자기장의 인가 후에 순차적으로 용리되는 방식으로 작동한다. 즉, 자기화된 입자에 부착된 세포는 제자리에 유지되는 반면, 비부착된 종은 용리된다. 이어서, 이 제1 용리 단계가 완결된 후, 자기장에 트랩되고, 용리되는 것으로부터 방지된 종은 이들이 용리되고 회수될 수 있도록 하는 일부 방식으로 유리된다. 특정 실시양태에서, 비-표적 세포는 표지되고, 세포의 이질적 집단으로부터 고갈된다.
일부 실시양태에서, 비드 또는 다른 표면과 회합되거나 그 상에 코팅된 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 항체는 전장 항체이거나, (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 중쇄 (VH) 영역, 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 단일 쇄 항체 단편, 및 단일 도메인 항체 (예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함하는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체, 예컨대 Fab는 다량체이다. 일부 실시양태에서, 항체, 예컨대 Fab 다량체는 세포 표면 마커와 다가 복합체를 형성한다.
양성 또는 음성 선택에 의한 비자극된 면역 세포의 목적하는 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면 (예를 들어, 입자, 예컨대 비드)의 농도는 달라질 수 있다. 특정 측면에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 것 (예를 들어, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 100억개의 세포/ml, 90억개의 세포/ml, 80억개의 세포/ml, 70억개/ml, 60억개/ml, 또는 50억개/ml의 농도가 사용된다. 한 측면에서, 10억개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가의 한 측면에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억개의 세포/ml로부터의 세포의 농도가 사용된다. 추가의 측면에서, 1억2500만 또는 1억5000만개의 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포의 분리 및 풍부화는 자동화 시스템을 사용하여, 예컨대 예를 들어, 클리니MACS(CliniMACS) 시스템을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 방법은 멸균, 비-발열성 용액에서 공급된 항체-커플링된 자기화가능한 입자를 사용한다. 일부 실시양태에서, 자기 입자로의 세포의 표지화 후, 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서 세포 제조 백을 튜빙 세트에 연결하고, 이를 다시 완충제를 함유하는 백 및 세포 수집 백에 연결한다. 튜빙 세트는 사전-칼럼 및 분리 칼럼을 포함하는 사전-어셈블리된 멸균 튜빙으로 이루어지고, 단지 단일 사용을 위한 것이다. 분리 프로그램의 개시 후, 시스템은 자동적으로 세포 샘플을 분리 칼럼 상으로 적용한다. 표지된 세포는 칼럼 내에 보유되는 반면, 비표지된 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 비표지되고, 칼럼에 보유되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고, 칼럼에 보유된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 후에 칼럼으로부터 용리되고, 세포 수집 백 내에 수집된다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포의 분리 및 풍부화는 자동화 시스템, 예컨대 여과 시스템, 예컨대 LOVO 세포 프로세싱 시스템 (프레세니우스 카비(Fresenius Kabi))과 조합으로 클리니MACS 플러스(CliniMACS Plus) (밀테니) 시스템을 사용하여 수행된다. 일부 사례에서, 비자극된 면역 세포는 스피닝 막 여과 단계에서 상청액으로부터 분리된다. 특히, 특정 컷-오프 범위, 예를 들어, < 4μm의 세포는 상청액과 함께 막공을 통해 통과하고 제거되는 반면, 4μm 초과의 세포는 필터 챔버 내에 보유되고 후속적으로 수거된다. 수거된 세포는 클리니MACS 플러스 시스템을 통해 추가로 프로세싱된다.
일부 실시양태에서, 분리 및 풍부화 단계는 자동화 세척 및 원심분리에 의한 세포의 분획화를 허용하는 세포 프로세싱 유닛을 구비한 시스템을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 분리 및 풍부화 단계는 클리니MACS 프로디지(CliniMACS Prodigy) 시스템 (밀테니 비오텍)을 사용하여 수행된다. 세포 프로세싱 유닛을 갖는 시스템은 또한 공급원 세포 산물의 거시적 층을 식별함으로써 최적 세포 분획화 종점을 결정하는 온보드 카메라 및 화상 인식 소프트웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동적으로 분리된다. 세포 프로세싱 시스템, 예컨대 클리니MACS 프로디지 시스템은 또한 세포 배양 프로토콜, 예컨대, 예를 들어, 세포 분화 및 확장, 항원 로딩, 및 장기 세포 배양을 달성하는 통합된 세포 배양 챔버를 포함할 수 있다. 투입 포트는 배지의 멸균 제거 및 보충을 허용할 수 있고, 세포는 통합 현미경을 사용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660], [Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82], 및 [Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 집단은 다수의 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포가 유체 스트림에서 운반되는 유동 세포계측법을 통해 수집되고 풍부화된다 (또는 고갈된다). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 집단은 정제 규모 (FACS)-분류를 통해 수집되고 풍부화된다 (또는 고갈된다). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 조합으로 미세전자기계 시스템 (MEMS) 칩의 사용에 의해 수집되고 풍부화된다 (또는 고갈된다) (예를 들어, WO 2010/033140, 문헌 [Cho et al., Lab Chip, 10:1567-1573 (2010)]; 및 [Godin et al., J. Biophoton., 1(5):355-376 (2008)] 참조). 둘 다의 경우에, 세포는 다수의 마커로 표지되어, 고순도로 잘-정의된 T 세포 하위세트의 단리를 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포의 분리 및 풍부화는 크기 및 밀도 둘 다에 기반하여 세포를 분리하고 정제하는 세광 시스템을 사용하여 수행된다. 일부 사례에서, 유체는 분리 챔버 내부의 원심분리장 내에 확립된 비자극된 면역 세포 층을 통해 통과한다. 원심분리장에 대해 반대 방향에서 유체의 유동을 달리 함으로써, 시스템은 크기 및 밀도에 따라 입자를 정렬하고 수집한다. 일부 사례에서, 세광 시스템은 테루모(Terumo) BCT로부터의 엘루트라(ELUTRA) 또는 써모피셔로부터의 로테아(ROTEA)이다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포는 하나 이상의 분리 및 풍부화 단계 동안 세포 배지에서 인큐베이션된다. 일부 사례에서, 세포 배지는 완전 세포 배지이다. 일부 사례에서, 세포 배지는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10% FBS를 포함하는 소 태아 혈청 (FBS)-기반 배지이다. 일부 사례에서, 세포 배지는 화학적으로-정의된 배지이다. 일부 사례에서, 세포 배지는 최소 배지이다. 분리 및 풍부화 단계 동안 비자극된 면역 세포를 인큐베이션하기 위한 예시적인 배지는 밀테니 비오텍으로부터의 클리니MACS 완충제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 사례에서, 세포 배지는 배양된 비자극된 면역 세포와 상호작용하지 않으면서 배양 용기의 내표면을 코팅하는 단백질을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 배지는 약 0.1% 내지 약 5% w/v 또는 약 0.5% 내지 약 2% w/v의 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 배지는 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 또는 약 1% w/v의 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 단백질은 단리된 재조합 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 경우에, 단백질은 조작된 드 노보 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 단백질은 천연-발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 경우에, 단백질은 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 HSA)이다.
일부 실시양태에서, 배지는 약 0.1% 내지 약 5% w/v 또는 약 0.5% 내지 약 2% w/v의 알부민 (예를 들어, HSA)을 포함한다. 일부 사례에서, 배지는 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 또는 약 1% w/v의 알부민 (예를 들어, HSA)을 포함한다. 일부 경우에, 알부민 (예를 들어, HSA)은 전장 알부민이다. 다른 경우에, 알부민 (예를 들어, HSA)은, 예를 들어, 신호전달 펩티드를 갖지 않는 그의 단편이다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포는 상기 기재된 분리 및 풍부화 단계 중 하나 이상으로부터 수집되고, 세포 배지에 재현탁된다. 일부 사례에서, 세포 배지는 완전 세포 배지, 임의로 완전 혈청-무함유 및 생체이물-무함유 배지이다. 일부 사례에서, 배지는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10% FBS를 포함하는 소 태아 혈청 (FBS)-기반 배지이다. 일부 사례에서, 세포 배지는 화학적으로 정의된 배지이다. 일부 사례에서, 세포 배지는 최소 배지이다. 일부 사례에서, 세포 배지는 T-세포 보충물, 인간 혈청, 하나 이상의 시토카인, 예컨대 IL-7 및/또는 IL-15, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 사례에서, T-세포 보충물은 약 2.4 % v/v의 최종 농도로 배지에 포함된다. 일부 사례에서, 인간 혈청은 약 5%의 최종 농도로 배지에 포함된다. 일부 사례에서, 배지는 L-글루타민 또는 L-글루타민 치환물 (예를 들어, L-알라닌-L-글루타민)을 임의로 약 2 mM의 최종 농도로 포함한다. 일부 사례에서, 배지는 IL-7을 약 5 ng/mL의 최종 농도로 포함한다. 일부 사례에서, 배지는 IL-15를 약 5 ng/mL의 최종 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배지는 써모피셔로부터의 CTS™ 옵티마이저(OPTMIZER)™, 써모피셔로부터의 글루타맥스(GlutaMAX)™ 보충물, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포의 분리 및 풍부화 단계는 약 2℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 사례에서, 분리 및 풍부화 단계는 약 2℃ 내지 약 37℃, 약 2℃ 내지 약 35℃, 약 2℃ 내지 약 33℃, 약 2℃ 내지 약 30℃, 약 2℃ 내지 약 28℃, 약 2℃ 내지 약 26℃, 약 2℃ 내지 약 25℃, 약 2℃ 내지 약 20℃, 약 2℃ 내지 약 18℃, 약 2℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 약 2℃ 내지 약 8℃, 약 4℃ 내지 약 37℃, 약 4℃ 내지 약 35℃, 약 4℃ 내지 약 33℃, 약 4℃ 내지 약 30℃, 약 4℃ 내지 약 28℃, 약 4℃ 내지 약 26℃, 약 4℃ 내지 약 25℃, 약 4℃ 내지 약 20℃, 약 4℃ 내지 약 18℃, 약 4℃ 내지 약 15℃, 약 4℃ 내지 약 10℃, 약 4℃ 내지 약 8℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 20℃ 내지 약 35℃, 약 20℃ 내지 약 33℃, 약 20℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 28℃, 약 20℃ 내지 약 26℃, 약 20℃ 내지 약 25℃, 약 22℃ 내지 약 25℃, 약 22℃ 내지 약 28℃, 약 24℃ 내지 약 30℃, 약 24℃ 내지 약 28℃, 또는 약 25℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행된다. 일부 경우에, 분리 및 풍부화 단계는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 수행된다. 일부 경우에, 분리 및 풍부화는 약 4℃의 온도에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포는 자가 면역 세포이다. 다른 실시양태에서, 비자극된 면역 세포는 동종이형 면역 세포이다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포의 집단은 복수개의 T 세포, 임의로 복수개의 CD4+ T 세포, 복수개의 CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포의 집단에서 CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 2:1, 약 3:1, 또는 약 4:1이다. 일부 사례에서, 면역 세포의 집단에서 CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:1이다. 일부 사례에서, 면역 세포의 집단에서 CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:2이다. 일부 사례에서, 면역 세포의 집단에서 CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 2:1이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 약 5000만 내지 약 500억개의 풍부화된 비자극된 면역 세포, 임의로 약 5000만 내지 약 10억, 약 1억 내지 약 50억, 약 10억 내지 약 100억, 또는 약 10억 내지 약 500억개의 세포를 산출한다. 일부 사례에서, 풍부화된 비자극된 면역 세포는 약 50-500 mL의 생물학적 샘플의 출발 샘플로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포의 풍부화된 집단은 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100% CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다.
B. 유전자 편집된 비자극된 면역 세포
특정 실시양태에서, 비자극된 면역 세포 (예를 들어, 비자극된 T 세포)는 유전자 편집 시스템에 의해 변형된다. 일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포는 하나 이상의 내인적으로 발현된 유전자의 발현을 파괴하도록 유전자 편집된다. 일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포는 내인성 수용체 (예를 들어, 내인성 T 세포 수용체)의 발현의 감소, 결실, 제거, 넉아웃, 또는 파괴를 갖는다. 일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포는 내인성 유전자 로커스 내로 삽입된 외인성 면역 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 내인성 유전자 로커스는 TRAC이다.
특정 실시양태에서, 비자극된 면역 세포는 내인성 TCR 유전자 산물 (예를 들어, TRAC 및 TRBC의 유전자 산물)의 발현을 파괴하도록 유전자 편집된다. 임의의 이론에 구애되지는 않지만, TRAC 및/또는 TRBC의 발현을 파괴하는 것은 1) 감소된 내인성 TCR 및 외인성 TCR 쌍형성오류, 따라서 자가반응성의 위험의 감소를 발생시키고; 2) 내인성 TCR과의 쌍형성오류를 감소시킴으로써 세포 표면 상의 외인성 TCR 발현을 증진시키고, 따라서 변형된 세포의 효능을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포는 내인성 TRAC 로커스를 파괴하는 유전자 변형 및 외인성 항원-결합 면역 수용체의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 TRAC 로커스를 파괴하는 유전자 변형은 TRAC의 엑손에 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 TRAC의 인트론에 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 TRAC 로커스를 파괴하는 유전자 변형은 TRAC 로커스의 엑손 1에 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 항원-결합 면역 수용체는 CAR이다. 일부 실시양태에서, 외인성 항원-결합 면역 수용체는 TCR이다.
일부 측면에서, 유전자 편집 시스템 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대 군집화된 규칙적으로 산재된 짧은 회문구조 핵산 (CRISPR)-Cas 시스템을 포함한다. CRISPR 시스템 (또한 본원에서 CRISPR-Cas 시스템, Cas 시스템, 또는 CRISPR/Cas 시스템으로 지칭됨)은 Cas 엔도뉴클레아제, 및 세포 내로의 도입 후에 Cas 엔도뉴클레아제가 표적 유전자에서 파단 (예를 들어, 이중 가닥 파단)을 도입하는 것을 가능하게 하는 복합체를 형성하는 표적 유전자에 대해 특이적인 가이드 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 사례에서, Cas9 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) (예를 들어, SpCas9), 에스. 써모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (예를 들어, SaCas9), 또는 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides)의 Cas9 분자로부터 유래되거나 그에 기반한다. 일부 사례에서, Cas9 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 악시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae), 악티노바실루스 플류로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악시도바실루스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 익타니보실루스 수이스(Actinobacillus suis), 악티노미세스(Actinomyces) 종, 시클리필루스 데니트리피칸스(cycliphilus denitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 스미티이(Bacillus smithii), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스(Bacteroides) 종, 블라스토피렐룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디르히즈 오비움(Bradyrhiz obium) 종, 브레비바실루스 라템스포루스(Brevibacillus latemsporus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박테 라드(Campylobacter lad), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 아콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루코티이(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 슬리이바에(Dinoroseobacter sliibae), 유박테리움 돌리쿰(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(gamma proteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacler diazotrophicus), 해모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 해모필로스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라에(Helicobacter mustelae), 일리오바클러 폴리트로푸스(Ilyobacler polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실루스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비이(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세아에(Listeriaceae) 박테리아, 메틸로시스티스(Methylocystis) 종, 메틸로시누스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬쿠스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 네이세리아(Neisseria) 종, 네이세리아 와드스오르티이(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스(Nitrosomonas) 종, 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜라르크토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기이(Ralstonia syzygii), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸(Rhodovulum) 종, 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핀고모나스(Sphingomonas) 종, 스포로락토바실루스 비네아에(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코쿠스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 서브돌리그라눌룸(Subdoligranulum) 종, 티슬렐라 모빌리스(Tislrella mobilis), 트레포네마(Treponema) 종, 또는 베르미네포박터 에이세니아에(Verminephrobacter eiseniae)의 Cas9 분자로부터 유래되거나 그에 기반한다.
일부 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 에스. 피오게네스 (예를 들어, 균주 SF370, MGAS 10270, MGAS 10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 및 SSI- 1), 에스. 써모필루스(S. thermophilus) (예를 들어, 균주 LMD-9), 에스. 슈도포르시누스(S. pseudoporcinus) (예를 들어, 균주 SPIN 20026), 에스. 무탄스(S. mutans) (예를 들어, 균주 UA 159, NN2025), 에스. 마카카에(S. macacae) (예를 들어, 균주 NCTC1 1558), 에스. 갈롤릴리쿠스(S. gallolylicus) (예를 들어, 균주 UCN34, ATCC BAA-2069), 에스. 에퀴네스(S. equines) (예를 들어, 균주 ATCC 9812, MGCS 124), 에스. 디스달락티아에(S. dysdalactiae) (예를 들어, 균주 GGS 124), 에스. 보비스(S. bovis) (예를 들어, 균주 ATCC 700338), 에스. 큼기노수스(S. cmginosus) (예를 들어; 균주 F021 1 ), 에스. 아갈락티아(S. agalactia) (예를 들어, 균주 NEM316, A909), 리스테리아 모노시토게네스 (예를 들어, 균주 F6854), 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua) (엘. 인노쿠아, 예를 들어, 균주 Clip 11262), 엔테로코쿠스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus) (예를 들어, 균주 DSM 15952), 또는 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium) (예를 들어, 균주 1,23,408)의 Cas9 분자로부터 유래된다.
일부 사례에서, 엔도뉴클레아제는 Cas3, Cas8a, Cas8b, Cse1, Csy1, Csn2, Cas4, Cas10 (예를 들어, Cas10d), Cas12a (또는 Cpf1), Cas12b (또는 C2c1), Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13, Cas14, Csm2, 또는 Cmr5를 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 표적 서열에 Cas-RNA 복합체를 지정하는 가이드 RNA (gRNA) 분자이다. 일부 사례에서, 지정은 DNA에의 gRNA의 부분의 혼성화를 통해 (예를 들어, gRNA 표적화 도메인을 통해), 및 RNA-가이드된 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 분자에의 gRNA 분자의 부분의 결합에 의해 (예를 들어, 적어도 gRNA tracr을 통해) 달성된다. 일부 실시양태에서, gRNA 분자는 본원에서 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로 지칭되는 단일 인접한 폴리뉴클레오티드 분자로 이루어진다. 다른 실시양태에서, gRNA 분자는 본원에서 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로 지칭되는, 통상적으로 혼성화를 통해 그들 자신이 회합이 가능한 복수개의, 통상적으로 2개의 폴리뉴클레오티드 분자로 이루어진다.
일부 경우에, gRNA 분자는 임의로 단일 폴리뉴클레오티드 상에 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 상에 있을 수 있는 crRNA 및 tracr을 포함한다. 일부 사례에서, crRNA는 표적화 도메인, 및 tracr과 상호작용하여 깃대 영역을 형성할 수 있는 영역을 포함한다. tracr은 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 분자에 결합하는 gRNA 분자의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, tracr은 Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, tracr은 깃대의 일부를 형성하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 표적 DNA 내의 프로토스페이서 서열을 인식하는, 예를 들어, 그에 상보적인 gRNA 분자의 부분이다.
프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)는 프로토스페이서의 3' 말단에 인접하여 위치하고 Cas 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 2-6 염기 쌍 DNA 서열이다. 일부 사례에서, 각각의 Cas 엔도뉴클레아제는 특이적 PAM 서열을 인식한다. 예시적인 PAM 서열은 에스. 피오게네스 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 NGG 서열; 또는 에스. 써모필루스 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 NGGNG 또는 NNAGAAW 서열을 포함하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 Cas 엔도뉴클레아제가 인식할 PAM 서열과 함께 사용되는 특이적 Cas 엔도뉴클레아제에 기반하여 gRNA 분자를 디자인하는 방법을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA 분자)은 Cas 엔도뉴클레아제로 면역 세포 내로 형질감염된다. 일부 경우에, 약 1, 2, 또는 3개의 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA 분자)은 Cas 엔도뉴클레아제로 면역 세포 내로 형질감염된다. 일부 경우에, 약 3개의 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA 분자)은 Cas 엔도뉴클레아제로 면역 세포 내로 형질감염된다. 일부 경우에 약 2개의 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA 분자)은 Cas 엔도뉴클레아제로 면역 세포 내로 형질감염된다. 일부 경우에, 약 1개의 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA 분자)은 Cas 엔도뉴클레아제로 면역 세포 내로 형질감염된다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템은 TALEN 유전자 편집 시스템이다. TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 인공적으로 생성된다. 전사 활성화제-유사 이펙트 (TALE)는 표적 DNA에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE를 DNA 절단 도메인과 조합함으로써, 임의의 표적 DNA 서열에 특이적인 제한 효소가 생성될 수 있다.
TALE는 크산토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 제12 및 제13 아미노산을 제외하고, 반복된, 고도로 보존된 33-34 아미노산 서열을 함유한다. 이들 2개의 위치는 고도로 가변적이어서, 특이적 뉴클레오티드 인식과 강한 상관관계를 나타내며, 따라서 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다.
TALEN을 생성하기 위해, TALE 단백질은, 예를 들어, 야생형 또는 돌연변이된 Fokl 엔도뉴클레아제를 포함하는 뉴클레아제 (N)에 융합된다. Fokl 도메인은 적절한 배향 및 간격을 갖는 표적 게놈에서의 부위에 대한 고유한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 구축물을 요구하는 이량체로서 기능한다. 특이성 및 오프-타겟 효과는 TALE DNA 결합 도메인 및 Fokl 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별적 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수를 변화시킴으로써 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템은 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 유전자 편집 시스템이다. 아연 핑거 뉴클레아제는 표적 핵산 서열의 하나 이상의 핵산 부위를 변형시키는데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제이다. TALEN 편집 시스템과 유사하게, ZFN은 DNA-결합 도메인에 융합된 Fokl 뉴클레아제 도메인 (또는 그의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우에, DNA-결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거를 포함한다. 아연 핑거는 하나 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조적 모티프이다. 아연 핑거는, 예를 들어, Cys2His2를 포함할 수 있고, 대략 3 -bp 서열을 인식할 수 있다. 공지된 특이성의 다양한 아연 핑거는 조합되어 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 다중-핑거 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
ZFN은 비-회문구조 DNA 부위를 인식한다. 표적 부위를 절단하기 위해, 한 쌍의 ZFN은 이량체화하고, 표적 부위의 반대 가닥에 어셈블리한다. 파지 제시, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 및 포유동물 세포를 포함하는 다양한 선택 및 모듈식 어셈블리 기술은 특이적 서열을 인식하는 아연 핑거 (및 이들의 조합)를 생성하는데 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템은 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템이다. 메가뉴클레아제는 15-40 염기-쌍 절단 부위를 인식하는 인공 뉴클레아제이다. 일부 사례에서, 메가뉴클레아제는 뉴클레아제 활성 및/또는 DNA 인식에 영향을 미치는 그들의 구조적 모티프에 기반하여 패밀리로 그룹화된다. LAGLIDADG 패밀리의 구성원은 보존된 LAGLIDADG 모티프의 1 또는 2개의 카피를 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 사례에서, LAGLIDADG 모티프의 단일 카피를 갖는 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는 동종이량체를 형성하는 반면, LAGLIDADG 모티프의 2개의 카피를 갖는 구성원은 단량체로서 발견된다. GIY-YIG 패밀리 구성원은 70-100개의 잔기 길이이고 4개의 불변 잔기 (이들 중 2개는 활성에 필요함)를 갖는 4 또는 5개의 보존된 서열 모티프를 포함하는 GP -YIG 모듈을 갖는다. His-Cys 박스 메가뉴클레아제는 수백 개의 아미노산 잔기를 포괄하는 영역에 걸쳐 고도로 보존된 일련의 히스티딘 및 시스테인을 특징으로 한다. NHN 패밀리, 구성원은 아스파라긴 잔기에 의해 둘러싸인 보존된 히스티딘의 2개의 쌍을 함유하는 모티프에 의해 정의된다. 예를 들어, 미리 결정된 핵산 서열에 결합하는 변경된 DNA-결합 특이성을 갖는 메가뉴클레아제를 조작하기 위한 전략은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Chevalier et al. (2002), Mol. Cell, 10:895-905]; [Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res 31 : 2952-62]; [Silva et al. (2006) J Mol Biol 361 : 744-54]; [Seligman et al. (2002) Nucleic Acids Res 30: 3870-9]; [Sussman et al. (2004) J Mol Biol 342: 31-41]; [Rosen et al. (2006) Nucleic Acids Res]; [Doyon et al. (2006) J. Am Chem Soc 128: 2477-84]; [Chen et al. (2009) Protein Eng Des Sel 22: 249- 56]; [Arnould S (2006) J Mol Biol. 355: 443-58]; [Smith (2006) Nucleic Acids Res. 363(2): 283- 94]에서 발견될 수 있다.
일부 사례에서, 메가뉴클레아제는 메가뉴클레아제의 N-말단에 융합된 TALE 도메인을 포함하는 메가TAL로 용어화되는 하이브리드 뉴클레아제이다. 일부 경우에, 메가뉴클레아제는 LAGLIDADG 패밀리의 구성원이다.
C. 상동성-지정 복구 (HDR) 주형
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 비자극된 면역 세포는 상동성-지정 복구 메커니즘에 의해 변형된다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상동성-지정 복구 (HDR) 주형은 표적 면역 세포 내로 그리고 폴리뉴클레오티드가 표적 부위 내로 삽입되는 조건 하에서 형질감염된다. 일부 실시양태에서, HDR 주형은 표적 부위에 대해 상류의, 또는 5'의 게놈 서열에 대해 상동인 5' 상동성 아암 및 표적 부위에 대해 하류의, 또는 3'의 게놈 서열에 대해 상동인 3' 상동성 아암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 및/또는 3' 상동성 아암은 폴리뉴클레오티드에 인접한다. 일부 실시양태에서, 5' 상동성 아암은 약 50 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 5' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 또는 약 1000개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 5' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 또는 약 300개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 5' 상동성 아암은 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 3' 상동성 아암은 약 50 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 3' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 또는 약 1000개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 3' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 또는 약 300개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 3' 상동성 아암은 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, HDR 주형의 길이는 약 2 킬로-염기 쌍 (kb) 내지 약 5 kb, 약 2.3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 4 kb, 약 2.3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 2.3 kb 내지 약 3 kb, 또는 약 4 kb 내지 약 5 kb이다. 일부 사례에서, HDR 주형의 길이는 약 2 kb, 약 2.3 kb, 약 2.5 kb, 약 3 kb, 약 4 kb, 또는 약 5 kb이다. 일부 경우에, HDR 주형은 또한 본원에서 울트라머로 지칭된다. 일부 경우에, 항원-결합 폴리펩티드는 항원 수용체, 임의로 CAR 또는 TCR이다.
일부 실시양태에서, HDR 주형은 이중-가닥 DNA (dsDNA) 주형이다. 일부 실시양태에서, dsDNA 주형은 천연 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsDNA 주형은 표적 부위에 대해 상류의, 또는 5'의 게놈 서열에 대해 상동인 5' 상동성 아암 및 표적 부위에 대해 하류의, 또는 3'의 게놈 서열에 대해 상동인 3' 상동성 아암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 및/또는 3' 상동성 아암은 폴리뉴클레오티드에 인접한다. 일부 실시양태에서, 5' 상동성 아암은 약 50 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 5' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 또는 약 1000개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 5' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 또는 약 300개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 5' 상동성 아암은 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 3' 상동성 아암은 약 50 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 3' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 또는 약 1000개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 3' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 또는 약 300개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 3' 상동성 아암은 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, dsDNA 주형의 길이는 약 2 kb 내지 약 5 kb, 약 2.3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 4 kb, 약 2.3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 2.3 kb 내지 약 3 kb, 또는 약 4 kb 내지 약 5 kb이다. 일부 사례에서, dsDNA 주형의 길이는 약 2 kb, 약 2.3 kb, 약 2.5 kb, 약 3 kb, 약 4 kb, 또는 약 5 kb이다.
일부 실시양태에서, HDR 주형은 단일-가닥 DNA (ssDNA) 주형이다. 일부 실시양태에서, ssDNA 주형은 천연 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, ssDNA 주형은 표적 부위에 대해 상류의, 또는 5'의 게놈 서열에 대해 상동인 5' 상동성 아암 및 표적 부위에 대해 하류의, 또는 3'의 게놈 서열에 대해 상동인 3' 상동성 아암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 및/또는 3' 상동성 아암은 폴리뉴클레오티드에 인접한다. 일부 실시양태에서, 5' 상동성 아암은 약 50 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 5' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 또는 약 1000개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 5' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 또는 약 300개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 5' 상동성 아암은 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 3' 상동성 아암은 약 50 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 3' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 또는 약 1000개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 3' 상동성 아암은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 150, 약 160, 약 180, 약 200, 약 220, 약 240, 약 250, 약 260, 약 280, 또는 약 300개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 사례에서, 3' 상동성 아암은 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, ssDNA 주형의 길이는 약 2 kb 내지 약 5 kb, 약 2.3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 4 kb, 약 2.3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 2.3 kb 내지 약 3 kb, 또는 약 4 kb 내지 약 5 kb이다. 일부 사례에서, ssDNA 주형의 길이는 약 2 kb, 약 2.3 kb, 약 2.5 kb, 약 3 kb, 약 4 kb, 또는 약 5 kb이다.
일부 실시양태에서, HDR 주형은 면역 세포 내로 도입되기 전에 플라스미드에 삽입된다. 예시적인 플라스미드는 pBAD/His, pCal-n, pET-3a-c, pET32a-c, pGEX-2T, pTriEx-1, pUC19, pAd5F35, pAd델타F6, 또는 TLCV2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
D. 형질감염
일부 실시양태에서, 유전자-편집 시스템 및 HDR 주형은 비-바이러스 전달 방법을 통해 비자극된 면역 세포 내로 도입된다. 비-바이러스 전달 방법에서, 핵산은 네이키드 DNA이거나 비-바이러스 플라스미드 또는 벡터에 있을 수 있다. 예시적인 비-바이러스 전달 방법은 전기천공, 세포 스퀴징 방법, 인산칼슘, 열 충격, 리포솜 전달, 양이온성 중합체, 지질-중합체, 세포-침투 펩티드, 양이온성 나노캐리어, 수력학적 전달, 초음파, 양이온성 지질, 나노입자, 탄도 DNA 주사, 자기-감염, 및 광-천공을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 유전자-편집 시스템 및 HDR 주형은 전기천공에 의해 비자극된 면역 세포 내로 도입된다. 일부 사례에서, 유전자-편집 시스템 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 가이드 핵산) 및 HDR 주형은 전기천공에 의해 비자극된 면역 세포 내로 동시에 도입된다. 다른 사례에서, 유전자-편집 시스템 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 가이드 핵산)은 먼저 전기천공에 의해 비자극된 면역 세포 내로 동시에 도입되고, 이어서 HDR 주형의 별개의 전기천공이 행해지거나; 또는 대안적으로, HDR 주형은 먼저 전기천공에 의해 비자극된 면역 세포 내로 동시에 도입되고, 이어서 유전자-편집 시스템 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 가이드 핵산)의 별개의 전기천공이 행해진다. 추가의 사례에서, 엔도뉴클레아제, 가이드 핵산, 및 HDR 주형은 전기천공에 의해 비자극된 면역 세포 내로 순차적으로 도입된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 약 1 pM 내지 약 10 mM의 농도로 비자극된 면역 세포 내로 도입된다. 일부 사례에서, 엔도뉴클레아제의 농도는 약 1 pM 내지 약 5 mM, 약 1 pM 내지 약 3 mM, 약 1 pM 내지 약 1 mM, 약 1 pM 내지 약 0.8 mM, 약 1 pM 내지 약 0.5 mM, 약 1 pM 내지 약 0.2 mM, 약 1 pM 내지 약 0.1 mM, 약 1 pM 내지 약 0.09 mM, 약 1 pM 내지 약 0.05 mM, 약 1 pM 내지 약 0.01 mM, 약 1 pM 내지 약 5 μM, 약 1 pM 내지 약 1 μM, 약 1 pM 내지 약 500 nM, 약 1 pM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 10 mM, 약 1 nM 내지 약 5 mM, 약 1 nM 내지 약 3 mM, 약 1 nM 내지 약 1 mM, 약 1 nM 내지 약 0.8 mM, 약 1 nM 내지 약 0.5 mM, 약 1 nM 내지 약 0.2 mM, 약 1 nM 내지 약 0.1 mM, 약 1 nM 내지 약 0.09 mM, 약 1 nM 내지 약 0.05 mM, 약 1 nM 내지 약 0.01 mM, 약 1 nM 내지 약 5 μM, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 약 1 nM 내지 약 500 nM, 약 1μM 내지 약 10 mM, 약 1 μM 내지 약 5 mM, 약 1 μM 내지 약 3 mM, 약 1 μM 내지 약 1 mM, 약 1 μM 내지 약 0.8 mM, 약 1 μM 내지 약 0.5 mM, 약 1 μM 내지 약 0.2 mM, 약 1 μM 내지 약 0.1 mM, 약 1 μM 내지 약 0.09 mM, 약 1 μM 내지 약 0.05 mM, 약 1 μM 내지 약 0.01 mM, 또는 약 1 μM 내지 약 5 μM이다.
일부 실시양태에서, 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA 분자)은 약 1 pM 내지 약 10 mM의 농도로 비자극된 면역 세포 내로 도입된다. 일부 사례에서, 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA 분자)의 농도는 약 1 pM 내지 약 5 mM, 약 1 pM 내지 약 3 mM, 약 1 pM 내지 약 1 mM, 약 1 pM 내지 약 0.8 mM, 약 1 pM 내지 약 0.5 mM, 약 1 pM 내지 약 0.2 mM, 약 1 pM 내지 약 0.1 mM, 약 1 pM 내지 약 0.09 mM, 약 1 pM 내지 약 0.05 mM, 약 1 pM 내지 약 0.01 mM, 약 1 pM 내지 약 5 μM, 약 1 pM 내지 약 1 μM, 약 1 pM 내지 약 500 nM, 약 1 pM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 10 mM, 약 1 nM 내지 약 5 mM, 약 1 nM 내지 약 3 mM, 약 1 nM 내지 약 1 mM, 약 1 nM 내지 약 0.8 mM, 약 1 nM 내지 약 0.5 mM, 약 1 nM 내지 약 0.2 mM, 약 1 nM 내지 약 0.1 mM, 약 1 nM 내지 약 0.09 mM, 약 1 nM 내지 약 0.05 mM, 약 1 nM 내지 약 0.01 mM, 약 1 nM 내지 약 5 μM, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 약 1 nM 내지 약 500 nM, 약 1μM 내지 약 10 mM, 약 1 μM 내지 약 5 mM, 약 1 μM 내지 약 3 mM, 약 1 μM 내지 약 1 mM, 약 1 μM 내지 약 0.8 mM, 약 1 μM 내지 약 0.5 mM, 약 1 μM 내지 약 0.2 mM, 약 1 μM 내지 약 0.1 mM, 약 1 μM 내지 약 0.09 mM, 약 1 μM 내지 약 0.05 mM, 약 1 μM 내지 약 0.01 mM, 또는 약 1 μM 내지 약 5 μM이다.
일부 실시양태에서, HDR 주형은 약 1 pM 내지 약 10 mM의 농도로 비자극된 면역 세포 내로 도입된다. 일부 사례에서, HDR 주형의 농도는 약 1 pM 내지 약 5 mM, 약 1 pM 내지 약 3 mM, 약 1 pM 내지 약 1 mM, 약 1 pM 내지 약 0.8 mM, 약 1 pM 내지 약 0.5 mM, 약 1 pM 내지 약 0.2 mM, 약 1 pM 내지 약 0.1 mM, 약 1 pM 내지 약 0.09 mM, 약 1 pM 내지 약 0.05 mM, 약 1 pM 내지 약 0.01 mM, 약 1 pM 내지 약 5 μM, 약 1 pM 내지 약 1 μM, 약 1 pM 내지 약 500 nM, 약 1 pM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 10 mM, 약 1 nM 내지 약 5 mM, 약 1 nM 내지 약 3 mM, 약 1 nM 내지 약 1 mM, 약 1 nM 내지 약 0.8 mM, 약 1 nM 내지 약 0.5 mM, 약 1 nM 내지 약 0.2 mM, 약 1 nM 내지 약 0.1 mM, 약 1 nM 내지 약 0.09 mM, 약 1 nM 내지 약 0.05 mM, 약 1 nM 내지 약 0.01 mM, 약 1 nM 내지 약 5 μM, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 약 1 nM 내지 약 500 nM, 약 1μM 내지 약 10 mM, 약 1 μM 내지 약 5 mM, 약 1 μM 내지 약 3 mM, 약 1 μM 내지 약 1 mM, 약 1 μM 내지 약 0.8 mM, 약 1 μM 내지 약 0.5 mM, 약 1 μM 내지 약 0.2 mM, 약 1 μM 내지 약 0.1 mM, 약 1 μM 내지 약 0.09 mM, 약 1 μM 내지 약 0.05 mM, 약 1 μM 내지 약 0.01 mM, 또는 약 1 μM 내지 약 5 μM이다.
일부 실시양태에서, 유전자-편집 시스템은 CRISPR-Cas 시스템이다. 일부 사례에서, Cas (예를 들어, Cas9) 엔도뉴클레아제는 약 1 pM 내지 약 10 mM의 농도로 비자극된 면역 세포 내로 도입된다. 일부 사례에서, Cas (예를 들어, Cas9) 엔도뉴클레아제의 농도는 약 1 pM 내지 약 5 mM, 약 1 pM 내지 약 3 mM, 약 1 pM 내지 약 1 mM, 약 1 pM 내지 약 0.8 mM, 약 1 pM 내지 약 0.5 mM, 약 1 pM 내지 약 0.2 mM, 약 1 pM 내지 약 0.1 mM, 약 1 pM 내지 약 0.09 mM, 약 1 pM 내지 약 0.05 mM, 약 1 pM 내지 약 0.01 mM, 약 1 pM 내지 약 5 μM, 약 1 pM 내지 약 1 μM, 약 1 pM 내지 약 500 nM, 약 1 pM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 10 mM, 약 1 nM 내지 약 5 mM, 약 1 nM 내지 약 3 mM, 약 1 nM 내지 약 1 mM, 약 1 nM 내지 약 0.8 mM, 약 1 nM 내지 약 0.5 mM, 약 1 nM 내지 약 0.2 mM, 약 1 nM 내지 약 0.1 mM, 약 1 nM 내지 약 0.09 mM, 약 1 nM 내지 약 0.05 mM, 약 1 nM 내지 약 0.01 mM, 약 1 nM 내지 약 5 μM, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 약 1 nM 내지 약 500 nM, 약 1μM 내지 약 10 mM, 약 1 μM 내지 약 5 mM, 약 1 μM 내지 약 3 mM, 약 1 μM 내지 약 1 mM, 약 1 μM 내지 약 0.8 mM, 약 1 μM 내지 약 0.5 mM, 약 1 μM 내지 약 0.2 mM, 약 1 μM 내지 약 0.1 mM, 약 1 μM 내지 약 0.09 mM, 약 1 μM 내지 약 0.05 mM, 약 1 μM 내지 약 0.01 mM, 또는 약 1 μM 내지 약 5 μM이다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포 내로 도입되는 Cas (예를 들어, Cas9) 엔도뉴클레아제 농도 및 가이드 핵산 농도의 비는 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1이다. 일부 사례에서, Cas 엔도뉴클레아제 및 가이드 핵산의 비는 약 1:1이다. 일부 사례에서, Cas 엔도뉴클레아제 및 가이드 핵산의 비는 약 1:2이다. 일부 사례에서, Cas 엔도뉴클레아제 및 가이드 핵산의 비는 약 1:3이다. 일부 사례에서, Cas 엔도뉴클레아제 및 가이드 핵산의 비는 약 2:1이다. 일부 사례에서, Cas 엔도뉴클레아제 및 가이드 핵산의 비는 약 3:1이다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포 내로 도입되는 CRISPR-Cas 시스템 및 HDR 주형의 비는 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, 약 1:12, 약 1:15, 약 1:18, 약 1:20, 약 1:25, 약 1:30, 약 1:35, 약 1:40, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 약 10:1, 약 12:1, 약 15:1, 약 20:1, 약 30:1, 또는 약 40:1이다. 일부 사례에서, CRISPR-Cas 시스템 및 HDR 주형의 비는 약 1:1이다. 일부 사례에서, CRISPR-Cas 시스템 및 HDR 주형의 비는 약 1:2이다. 일부 사례에서, CRISPR-Cas 시스템 및 HDR 주형의 비는 약 2:1이다.
일부 실시양태에서, 비자극된 면역 세포 내로 도입되는 유전자-편집 뉴클레아제 (예를 들어, 엔도뉴클레아제) 및 HDR 주형의 비는 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 약 10:1이다. 일부 사례에서, 유전자-편집 뉴클레아제 (예를 들어, 엔도뉴클레아제) 및 HDR 주형의 비는 약 1:1이다. 일부 사례에서, 유전자-편집 뉴클레아제 (예를 들어, 엔도뉴클레아제) 및 HDR 주형의 비는 약 1:2이다. 일부 사례에서, 유전자-편집 뉴클레아제 (예를 들어, 엔도뉴클레아제) 및 HDR 주형의 비는 약 2:1이다.
일부 실시양태에서, 전기영동은 약 2℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 사례에서, 전기영동은 약 2℃ 내지 약 37℃, 약 2℃ 내지 약 35℃, 약 2℃ 내지 약 33℃, 약 2℃ 내지 약 30℃, 약 2℃ 내지 약 28℃, 약 2℃ 내지 약 26℃, 약 2℃ 내지 약 25℃, 약 2℃ 내지 약 20℃, 약 2℃ 내지 약 18℃, 약 2℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 약 2℃ 내지 약 8℃, 약 4℃ 내지 약 37℃, 약 4℃ 내지 약 35℃, 약 4℃ 내지 약 33℃, 약 4℃ 내지 약 30℃, 약 4℃ 내지 약 28℃, 약 4℃ 내지 약 26℃, 약 4℃ 내지 약 25℃, 약 4℃ 내지 약 20℃, 약 4℃ 내지 약 18℃, 약 4℃ 내지 약 15℃, 약 4℃ 내지 약 10℃, 약 4℃ 내지 약 8℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 20℃ 내지 약 35℃, 약 20℃ 내지 약 33℃, 약 20℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 28℃, 약 20℃ 내지 약 26℃, 약 20℃ 내지 약 25℃, 약 22℃ 내지 약 25℃, 약 22℃ 내지 약 28℃, 약 24℃ 내지 약 30℃, 약 24℃ 내지 약 28℃, 또는 약 25℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행된다. 일부 경우에, 전기영동은 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행된다. 일부 경우에, 전기영동은 약 25℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행된다. 일부 경우에, 전기영동은 약 25℃ 내지 약 28℃의 온도에서 수행된다.
예시적인 전기천공 기술은 론자(Lonza)로부터의 뉴클레오펙터(NUCLEOFECTOR)™ 플랫폼, 론자로부터의 아막사(Amaxa) 뉴클레오펙터™ II 전기천공 기계, 맥스사이트(MaxCyte)로부터의 유동 전기천공(FLOW ELECTROPORATION)® 기술, 및 바이오-래드(Bio-Rad)로부터의 진 펄서(Gene Pulser) MXCELL™ 전기천공 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 통상의 기술자는 펄스 유형, 펄싱의 지속기간, 전압, 및 사용의 빈도가 기기의 유형 및 세포 유형에 의존하고; 형질감염의 효율의 최적화가 펄스 유형, 펄싱의 지속기간, 전압, 사용의 빈도, 및 엔도뉴클레아제, 가이드 핵산, 및/또는 HDR 주형의 농도에 기반하여 조정될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, HDR 주형은 비자극된 면역 세포의 집단의 약 10% 이상에서 표적 부위에서 HDR을 용이하게 한다. 일부 사례에서, HDR 주형은 비자극된 면역 세포의 집단의 약 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상에서 표적 부위에서 HDR을 용이하게 한다.
일부 실시양태에서, 형질감염 방법의 효율은 약 2% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 99%, 약 8% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 99%, 약 12% 내지 약 99%, 약 13% 내지 약 99%, 약 15% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 30% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 2% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 80%, 약 8% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 12% 내지 약 80%, 약 13% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60%이다. 일부 사례에서, 효율은 약 2%, 약 5%, 약 8%, 약 10%, 약 12%, 약 13%, 약 15%, 약 18%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%이다.
E. 변형된 비자극된 면역 세포
일부 실시양태에서, 유전자-편집 시스템 및 HDR 주형의 비-바이러스 전달 후의 비자극된 면역 세포는 비-확장 조건 하에서 최대 및 약 72시간 동안 배양되어 변형된 비자극된 면역 세포를 생성한다. 일부 사례에서, 비자극된 면역 세포는 약 18시간 내지 약 72시간, 약 18시간 내지 약 36시간, 약 18시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 또는 약 36시간 내지 약 72시간 배양되어 변형된 비자극된 면역 세포를 생성한다. 일부 사례에서, 비자극된 면역 세포는 약 48시간 이하, 약 36시간 이하, 약 24시간 이하, 또는 약 18시간 이하 동안 배양되어 변형된 비자극된 면역 세포를 생성한다. 일부 사례에서, 비자극된 면역 세포는 약 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 또는 약 72시간 동안 배양되어 변형된 비자극된 면역 세포를 생성한다. 일부 경우에, 비자극된 면역 세포는 배양 용기 (예를 들어, 배양 백 또는 생물반응기)에서 약 37℃에서 배양된다. 일부 경우에, 배양 용기는 약 90%, 약 95%, 또는 약 99% 습도를 포함한다. 일부 경우에, 배양 용기는 약 0.5% 이산화탄소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포와 함께 사용되는 세포 배지는 완전 배지, 화학적으로-정의된 배지, 또는 예를 들어, 약 1% 내지 약 10% FBS를 포함하는 소 태아 혈청 (FBS)-기반 배지를 포함한다. 일부 사례에서, 세포 배지는 최소 배지이다. 변형된 비자극된 면역 세포를 배양하기 위한 예시적인 배지는 밀테니 비오텍으로부터의 클리니MACS 완충제 및 써모피셔로부터의 CTS™ 옵티마이저™를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 사례에서, 세포 배지는 배양된 변형된 비자극된 면역 세포와 상호작용하지 않으면서 배양 용기의 내표면을 코팅하는 단백질을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 배지는 약 0.1% 내지 약 5% w/v 또는 약 0.5% 내지 약 2% w/v의 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 배지는 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 또는 약 1% w/v의 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 단백질은 단리된 재조합 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 경우에, 단백질은 조작된 드 노보 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 단백질은 천연-발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 경우에, 단백질은 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 HSA)이다.
일부 실시양태에서, 세포 배지는 약 0.1% 내지 약 5% w/v 또는 약 0.5% 내지 약 2% w/v의 알부민 (예를 들어, HSA)을 포함한다. 일부 사례에서, 배지는 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 또는 약 1% w/v의 알부민 (예를 들어, HSA)을 포함한다. 일부 경우에, 알부민 (예를 들어, HSA)은 전장 알부민이다. 다른 경우에, 알부민 (예를 들어, HSA)은, 예를 들어, 신호전달 펩티드를 갖지 않는 그의 단편이다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단은 약 500만개의 세포, 1000만개의 세포, 2000만개의 세포, 5000만개의 세포, 1억개의 세포, 5억개의 세포, 10억개의 세포, 20억개의 세포, 30억개의 세포, 40억개의 세포, 50억개의 세포, 100억개의 세포, 또는 그 초과를 포함한다. 일부 경우에, 상기 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단은 약 5000만개의 세포 내지 약 50억개의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 상기 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단은 약 5000만개의 세포 내지 약 40억개의 세포를 포함한다.
F. 동결보존
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포는 최대 또는 약 72시간 동안 배양한 후에 동결보존된다. 일부 사례에서, 변형된 비자극된 면역 세포는 배양 용기로부터 수거되고, 동결보존 배지에 재현탁된다. 일부 사례에서, 동결보존 배지는 크리오스터(CRYOSTOR)® CSB 배지 (바이오라이프 솔루션스(BioLife Solutions)) 및 DMSO를 포함한다. 일부 사례에서, DMSO는 2%, 5%, 또는 10% v/v 용액이다. 일부 사례에서, DMSO는 크리오스터® CS5 또는 크리오스터® CS10 (바이오라이프 솔루션스)이다.
일부 경우에, DMSO의 최종 농도는 약 0% v/v 내지 약 7.5% v/v이다. 일부 경우에, DMSO의 최종 농도는 약 2.5% v/v이다. 일부 경우에, DMSO의 최종 농도는 약 5% v/v이다. 일부 경우에, 재현탁 동안의 온도는 약 24℃ 내지 약 28℃이다.
동결보존 배지에서의 재현탁 시, 변형된 비자극된 면역 세포는 극저온냉동되며, 여기서 세포의 온도는 단계식 방법으로 재현탁 온도로부터 약 -80℃로 감소된다. 일부 사례에서, 분당 약 1-5 섭씨 도의 감소는 단계식 방법에 사용된다. 일부 사례에서, 분당 약 1 섭씨 도의 감소는 단계식 방법에 사용된다. 일부 사례에서, 단계식 방법은 약 30분 내지 약 3시간 내에 재현탁 온도로부터 약 -80℃로 온도를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 재현탁 온도는 약 24℃ 내지 약 28℃, 약 26℃ 내지 약 28℃, 또는 약 24℃ 내지 약 26℃이다.
일부 실시양태에서, 극저온냉동된 변형된 비자극된 면역 세포를 생성하는 본원에 기재된 방법은 약 10% 내지 약 99%, 약 12% 내지 약 99%, 약 13% 내지 약 99%, 약 15% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 30% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 80%, 약 12% 내지 약 80%, 약 13% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60%의 세포 생존율을 추가로 제공한다. 일부 경우에, 방법은 약 10%, 약 12%, 약 13%, 약 15%, 약 18%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%의 세포 생존율을 제공한다.
G. 변형된 자극된 면역 세포
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포는 동결보존 전에 임의로 자극된다. 일부 사례에서, 변형된 비자극된 면역 세포는 약 5일 내지 약 12일 자극되고 확장된다. 일부 경우에, 변형된 비자극된 면역 세포는 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 또는 그 초과 동안 자극되고 확장된다. 일부 경우에, 변형된 비자극된 면역 세포는 약 10일 내지 약 12일 동안 자극되고 확장된다.
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포는 비자극된 면역 세포를 자극시킬 수 있는 작용제의 존재 하에서 인큐베이션된다. 비자극된 면역 세포가 T 세포인 일부 사례에서, 작용제는 TCR 복합체의 하나 이상의 성분, 예컨대 CD3 제타 쇄의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있거나, 이러한 복합체 또는 성분을 통한 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 일부 사례에서, 작용제는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 항-4-1BB 항체, 또는 시토카인, 예컨대 IL-2, IL-15, IL-7, 또는 IL-21, 또는 인공 항원-제시 세포 (aAPC)이다. 일부 사례에서, 항체는 고체 지지체, 예컨대 비드의 표면에 추가로 커플링되거나 그 상에 존재한다. 일부 경우에, 작용제는 임의로 3:1 비드 대 세포 비의 디나비즈 인간 T-활성화제 CD3/CD28 (써모피셔); 또는 MACS® GEMP T 세포 트랜스액트(TRANSACT)™ (밀테니 비오텍)이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 변형된 자극된 면역 세포의 집단은 약 500만개의 세포, 약 1000만개의 세포, 약 2000만개의 세포, 약 5000만개의 세포, 약 1억개의 세포, 약 5억개의 세포, 약 10억개의 세포, 약 50억개의 세포, 약 100억개의 세포, 약 200억개의 세포, 또는 그 초과를 포함한다.
일부 실시양태에서, 극저온냉동된 변형된 자극된 면역 세포를 생성하는 본원에 기재된 방법은 약 10% 내지 약 99%, 약 12% 내지 약 99%, 약 13% 내지 약 99%, 약 15% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 30% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 80%, 약 12% 내지 약 80%, 약 13% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60%의 세포 생존율을 추가로 제공한다. 일부 경우에, 방법은 약 10%, 약 12%, 약 13%, 약 15%, 약 18%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%의 세포 생존율을 제공한다.
III. 항원-결합 폴리펩티드
특정 실시양태에서, 외인성 항원-결합 폴리펩티드를 발현하는 변형된 비자극된 면역 세포 또는 변형된 자극된 면역 세포가 본원에 개시된다. 일부 사례에서, 항원-결합 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 다른 사례에서, 항원-결합 폴리펩티드는 T-세포 수용체 (TCR)이다. 추가의 사례에서, 항원-결합 폴리펩티드는 항원-결합 도메인, 세포 표면 수용체 리간드, 또는 종양 항원에 결합하는 폴리펩티드이다.
A. 키메라 항원 수용체
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포 또는 변형된 자극된 면역 세포, 예를 들어, 변형된 비자극된 또는 자극된 T 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현한다. 본 발명의 CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 힌지 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 항원 결합 도메인, 임의의 힌지, 임의의 막횡단 도메인, 임의의 세포내 공동자극 도메인, 및 임의의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 임의의 변형된 세포가 상정되며, 본원의 개시내용의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되고 제조될 수 있다.
항원 결합 도메인은 세포에서의 발현을 위해 CAR의 또 다른 도메인, 예컨대 막횡단 도메인 또는 세포내 도메인 (둘 다 본원의 다른 곳에 기재됨)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원 결합 도메인을 코딩하는 제1 핵산 서열은 막횡단 도메인을 코딩하는 제2 핵산에 작동가능하게 연결되고, 세포내 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열에 추가로 작동가능하게 연결된다.
본원에 기재된 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 임의의 막횡단 도메인, 본원에 기재된 임의의 세포내 도메인 또는 세포질 도메인, 또는 본 발명의 CAR에 포함될 수 있는 본원에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다. 본 발명의 대상 CAR은 또한 본원에 기재된 바와 같은 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 도메인의 각각은 링커에 의해 분리된다.
1. 항원 결합 도메인
CAR의 항원 결합 도메인은 단백질, 탄수화물, 및 당지질을 포함하는 특이적 표적 항원에 결합하기 위한 CAR의 세포외 영역이다. 일부 실시양태에서, CAR은 표적 세포 (예를 들어 암 세포) 상의 표적 항원 (예를 들어 종양 연관 항원)에 대한 친화성을 포함한다. 표적 항원은 표적 세포와 연관된 임의의 유형의 단백질, 또는 그의 에피토프를 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR은 표적 세포의 특정한 상태를 지시하는 표적 세포 상의 표적 항원에 대한 친화성을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 표적 세포 상의 특이적 표적 항원에 대한 친화성을 갖는 본 개시내용의 CAR은 표적-특이적 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적-특이적 결합 도메인은 뮤린 표적-특이적 결합 도메인이고, 예를 들어, 표적-특이적 결합 도메인은 뮤린 기원의 것이다. 일부 실시양태에서, 표적-특이적 결합 도메인은 인간 표적-특이적 결합 도메인이고, 예를 들어, 표적-특이적 결합 도메인은 인간 기원의 것이다.
항원 결합 도메인은 항원에 결합하는 임의의 도메인을 포함할 수 있으며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 비-인간 항체, 및 그의 임의의 단편을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 항원 결합 도메인 부분은 포유동물 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 전장 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 항원 결합 단편 (Fab), 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 단일특이적 Fab2, 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab2, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), dAb, 탠덤 scFv, VhH, V-NAR, 카멜리드, 디아바디, 미니바디, 트리아바디, 또는 테트라바디를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CAR은 하나 이상의 표적 세포 상의 하나 이상의 표적 항원에 대한 친화성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR은 단일 표적 세포 상의 하나 이상의 표적 항원에 대한 친화성을 가질 수 있다. 이러한 실시양태에서, CAR은 이중특이적 CAR, 또는 다중특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 표적 항원에 대한 친화성을 부여하는 하나 이상의 표적-특이적 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 동일한 표적 항원에 대한 친화성을 부여하는 하나 이상의 표적-특이적 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 동일한 표적 항원에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 표적-특이적 결합 도메인을 포함하는 CAR은 표적 항원의 별개의 에피토프에 결합할 수 있다. 복수개의 표적-특이적 결합 도메인이 CAR에 존재하는 경우, 결합 도메인은 탠덤으로 배열될 수 있고, 링커 펩티드에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 2개의 표적-특이적 결합 도메인을 포함하는 CAR에서, 결합 도메인은 폴리펩티드 링커, Fc 힌지 영역, 또는 막 힌지 영역을 통해 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 공유적으로 서로 연결된다.
본원에 사용된 용어 "단일-쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 공유 연결되어 VH::VL 이종이량체를 형성하는 이뮤노글로불린 (예를 들어, 마우스 또는 인간)의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)는 직접적으로 연결되거나, 또는 VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결하거나, VH의 C-말단을 VL의 N-말단과 연결하는 펩티드-코딩 링커 또는 스페이서에 의해 연결된다. 용어 "링커" 및 "스페이서"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인 (예를 들어, Tn-MUC1 결합 도메인)은 N-말단에서 C-말단으로, VH - 링커 - VL의 배열을 갖는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인 (예를 들어, Tn-MUC1 결합 도메인, PSMA 결합 도메인)은 N-말단에서 C-말단으로, VL - 링커 - VH의 배열을 갖는 scFv를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 사용하기 위한 적절한 배열을 선택할 수 있을 것이다.
링커는 전형적으로 유연성을 위한 글리신, 뿐만 아니라 가용성을 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. 링커는 세포외 항원-결합 도메인의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 연결할 수 있다. 링커의 비-제한적 예는 문헌 [Shen et al., Anal. Chem. 80(6):1910-1917 (2008)] 및 WO 2014/087010에 개시되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 제한 없이, 글리신 세린 (GS) 링커, 예컨대 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, 및 (GGGGS)n (여기서 n은 적어도 1의 정수를 나타냄)을 포함하는 다양한 링커 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 링커 서열은 제한 없이, GGSG, GGSGG, GSGSG, GSGGG, GGGSG, GSSSG, GGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS 등을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 사용하기 위한 적절한 링커 서열을 선택할 수 있을 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 도메인 (예를 들어, Tn-MUC1 결합 도메인, PSMA 결합 도메인)은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 여기서 VH 및 VL은 뉴클레오티드 서열 ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggt ggcggcggatct를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS를 갖는 링커 서열에 의해 분리된다.
불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, scFv 단백질은 원래 이뮤노글로불린의 특이성을 보유한다. 단일 쇄 Fv 폴리펩티드 항체는 문헌 [Huston, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)]에 의해 기재된 바와 같이 VH- 및 VL-코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,091,513, 5,132,405 및 4,956,778; 및 미국 특허 공개 번호 20050196754 및 20050196754를 참조한다. 억제 활성을 갖는 길항작용성 scFv는 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Zhao et al., Hybridoma (Larchmt), 27(6):455-51 (2008)]; [Peter et al., J. Cachexia Sarcopenia Muscle (Aug. 12, 2012)]; [Shieh et al., J. Imunol., 183(4):2277-85 (2009)]; [Giomarelli et al., Thromb. Haemost., 97(6):955-63 (2007)]; [Fife et al., J. Clin. Invst., 116(8):2252-61 (2006)]; [Brocks et al., Immunotechnology, 3(3):173-84 (1997)]; [Moosmayer et al., Ther. Immunol., 2(10):31-40 (1995)] 참조). 자극 활성을 갖는 효능작용성 scFv는 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Peter et al., J. Biol. Chem., 25278(38):36740-7 (2003)]; [Xie et al., Nat. Biotech., 15(8):768-71 (1997)]; [Ledbetter et al., Crit. Rev. Immunol., I(5-6):427-55 (1997)]; [Ho et al., BioChim. Biophys. Acta., 1638(3):257-66 (2003)] 참조).
본원에 사용된 "Fab"는 항원에 결합하지만 1가이며 Fc 부분을 갖지 않는 항체 구조의 단편을 지칭하며, 예를 들어, 효소 파파인에 의해 소화된 항체는 2개의 Fab 단편 및 Fc 단편 (예를 들어, 중 (H) 쇄 불변 영역; 항원에 결합하지 않는 Fc 영역)을 생성한다.
일부 사례에서, 항원 결합 도메인은 CAR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 인간 항체, 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 면역 세포는 하기 암 연관 항원 (종양 항원) 중 하나를 표적화하는 CAR을 발현하도록 조작될 수 있다: CD19; CD20; CD22 (Siglec 2); CD37; CD 123; CD22; CD30; CD 171; CS-1 (또한 CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로 지칭됨); C-유형 렉틴-유사 분자- 1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; CD133; 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER1); 강글리오시드 G2 (GD2); 강글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l -4)bDGlcp(l- l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAca-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms- 유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양- 연관 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 암배아 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL- 13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터류킨 11 수용체 알파 (IL- l lRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR- 베타); 단계- 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); 폴레이트 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 연관 (MUC 1); GalNAca1-O-Ser/Thr (Tn) MUC 1 (TnMUC1); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선산 포스파타제 (PAP); 돌연변이된 신장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 카르보닉 안히드라제 IX (CAIX); 프로테아솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gp100); 파단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1 (Abl)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질 (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종-연관 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반- 특이적 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라마이드 (글로보H)의 헥사사카라이드 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2 (UPK2); 티로신-단백질 키나제 Met (c-Met); A형 간염 바이러스 세포성 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3 (PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 로커스 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-la); 흑색종- 연관 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 암 고환 항원- 1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원- 1 (PCTA-1 또는 갈렉틴 8), T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (멜란A 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 리버스 트랜스크립타제 (hTERT); 육종 전위 파단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막횡단 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코스아미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 시클린 B l; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래 동족체 (MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 1B 1 (CYP1B 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)- 유사 (BORIS 또는 각인된 부위의 조절제의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES l); 림프구- 특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 윤활막 육종, X 파단점 2 (SSX2); 진행성 당화반응 최종산물에 대한 수용체 (RAGE-1); 신장 유비쿼터스 1 (RU1); 신장 유비쿼터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장 카르복실 에스테라제; 돌연변이된 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연관 이뮤노글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈- 함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸 -2 (GPC2); 글리피칸-3 (GPC3); NKG2D; KRAS; GDNF 패밀리 수용체 알파-4 (GFRa4); IL13Ra2; Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 이뮤노글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1). 일부 실시양태에서, 면역 세포는 CD19, CD20, CD22, BCMA, CD37, 메소텔린, PSMA, PSCA, Tn-MUC1, EGFR, EGFRvIII, c-Met, HER1, HER2, CD33, CD133, GD2, GPC2, GPC3, NKG2D, KRAS, 또는 WT1을 표적화하는 CAR을 발현하도록 조작된다.
2. 막횡단 도메인
막횡단 도메인에 관하여, CAR은 CAR의 항원 결합 도메인을 세포내 도메인에 연결시키는 막횡단 도메인을 포함하도록 디자인될 수 있다. 대상 CAR의 막횡단 도메인은 세포 (예를 들어, 면역 세포 또는 그의 전구체)의 형질막을 가로지를 수 있는 영역이다. 막횡단 도메인은 세포막, 예를 들어, 진핵 세포막 내로의 삽입을 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CAR의 항원 결합 도메인 및 세포내 도메인 사이에 개재된다.
한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CAR의 도메인 중 하나 이상과 천연적으로 회합된다. 일부 사례에서, 막횡단 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에의 이러한 도메인의 결합을 회피하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
막횡단 도메인은 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막횡단 단백질, 예를 들어, 유형 I 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 공급원이 합성인 경우, 막횡단 도메인은 세포막 내로의 CAR의 삽입을 용이하게 하는 임의의 인공 서열, 예를 들어, 인공 소수성 서열일 수 있다. 본 발명에서의 특정한 용도를 위한 막횡단 영역의 예는 제한 없이, T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD2, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134 (OX-40), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 톨(Toll)-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, 및 TLR9로부터 유래된 (즉, 적어도 그의 막횡단 영역(들)을 포함하는) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우에 이는 우세하게 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 것이다. 특정 예시적인 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막횡단 도메인의 각각의 단부에서 발견될 것이다.
본원에 기재된 막횡단 도메인은 본원에 기재된 임의의 항원 결합 도메인, 본원에 기재된 임의의 공동자극 신호전달 도메인, 본원에 기재된 임의의 세포내 신호전달 도메인, 또는 대상 CAR에 포함될 수 있는 본원에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 힌지 영역을 추가로 포함한다. 본 발명의 대상 CAR은 또한 힌지 영역을 포함할 수 있다. CAR의 힌지 영역은 항원 결합 도메인 및 막횡단 도메인 사이에 위치한 친수성 영역이다. 일부 실시양태에서, 이 도메인은 CAR에 대한 적절한 단백질 폴딩을 용이하게 한다. 힌지 영역은 CAR에 대한 임의적 성분이다. 힌지 영역은 항체의 Fc 단편, 항체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 힌지 서열 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 영역의 예는 제한 없이, CD8a 힌지, 3개의 글리신 (Gly)만큼 작을 수 있는 폴리펩티드로 이루어진 인공 힌지, 뿐만 아니라 IgG (예컨대 인간 IgG4)의 CH1 및 CH3 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 대상 CAR은 항원 결합 도메인을 막횡단 도메인과 연결시키고, 다시 세포내 도메인에 연결시키는 힌지 영역을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 힌지 영역은 표적 세포 상의 표적 항원을 인식하고 그에 결합하는 항원 결합 도메인을 지지할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hudecek et al., Cancer Immunol. Res., 3(2): 125-135 (2015)] 참조). 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 유연성 도메인이며, 따라서 항원 결합 도메인이 세포, 예컨대 종양 세포 상의 표적 항원의 특이적 구조 및 밀도를 최적으로 인식하는 구조를 갖는 것을 허용한다. 힌지 영역의 유연성은 힌지 영역이 많은 상이한 형태를 채택하는 것을 허용한다.
일부 실시양태에서, 힌지 영역은 이뮤노글로불린 중쇄 힌지 영역이다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 수용체로부터 유래된 힌지 영역 폴리펩티드 (예를 들어, CD8-유래 힌지 영역)이다.
힌지 영역은 약 4개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 예를 들어, 약 4개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 또는 약 40개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
적합한 힌지 영역은 용이하게 선택될 수 있고, 임의의 다수의 적합한 길이, 예컨대 약 1개의 아미노산 (예를 들어, Gly) 내지 약 20개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 12개의 아미노산, 예컨대 약 4개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 또는 약 7개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산의 것일 수 있고, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 또는 약 7개의 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 힌지 영역은 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체 (예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n (서열식별번호(SEQ ID NO): 47) 및 (GGGS)n (서열식별번호: 48)을 포함함, 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 유연성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체가 사용될 수 있으며; Gly 및 Ser 둘 다는 상대적으로 비구조화되고, 따라서 성분 사이의 중성 결박제로서 역할을 할 수 있다. 글리신 중합체가 사용될 수 있으며; 글리신은 심지어 알라닌보다 유의하게 더 많은 파이-프사이 공간에 접근하고, 보다 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다 (예를 들어, 문헌 [Scheraga, Rev. Computational. Chem. (1992) 2: 73-142] 참조). 예시적인 힌지 영역은 GGSG (서열식별번호: 29), GGSGG (서열식별번호: 30), GSGSG (서열식별번호: 31), GSGGG (서열식별번호: 32), GGGSG (서열식별번호: 33), GSSSG (서열식별번호: 34) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 힌지 영역은 이뮤노글로불린 중쇄 힌지 영역이다. 이뮤노글로불린 힌지 영역 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 예를 들어, 문헌 [Tan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(1):162-166 (1990)]; 및 [Huck et al., Nucleic Acids Res., 14(4): 1779-1789 (1986)]을 참조한다. 비-제한적 예로서, 이뮤노글로불린 힌지 영역은 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함할 수 있다: DKTHT (서열식별번호: 35); CPPC (서열식별번호: 36); CPEPKSCDTPPPCPR (서열식별번호: 37) (예를 들어, 문헌 [Glaser et al., J. Biol. Chem. (2005) 280:41494-41503] 참조); ELKTPLGDTTHT (서열식별번호: 38); KSCDKTHTCP (서열식별번호: 39); KCCVDCP (서열식별번호: 40); KYGPPCP (서열식별번호: 41); EPKSCDKTHTCPPCP (서열식별번호: 42) (인간 IgG1 힌지); ERKCCVECPPCP (서열식별번호: 43) (인간 IgG2 힌지); ELKTPLGDTTHTCPRCP (서열식별번호: 44) (인간 IgG3 힌지); SPNMVPHAHHAQ (서열식별번호: 45) (인간 IgG4 힌지) 등.
힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 야생형 (천연-발생) 힌지 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1 힌지의 His229는 Tyr로 치환될 수 있고, 그에 따라 힌지 영역은 서열 EPKSCDKTYTCPPCP (서열식별번호: 46)를 포함하며; 예를 들어, 문헌 [Yan et al., J. Biol. Chem. (2012) 287: 5891-5897]을 참조한다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 인간 CD8로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8α 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상 CAR은 서열식별번호: 24에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD8α 막횡단 도메인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 대상 CAR은 CD8α 힌지 도메인 및 CD8α 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD8α 힌지 도메인은 서열식별번호: 26에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상 CAR은 서열식별번호: 28에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 막횡단 도메인을 포함한다.
그의 의도된 기능을 유지하면서, 막횡단 및/또는 힌지 도메인의 허용가능한 변이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 막횡단 도메인 또는 힌지 도메인은 서열식별번호: 23, 25, 및/또는 27에 제시된 임의의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 막횡단 도메인 또는 힌지 도메인은 서열식별번호: 24, 26, 및/또는 28에 제시된 임의의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
막횡단 도메인은 임의의 힌지 도메인과 조합될 수 있고/거나, 본원에 기재된 하나 이상의 막횡단 도메인을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 막횡단 도메인, 예컨대 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD2, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134 (OX-40), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 톨-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, 및 TLR9의 막횡단 영역은 본원에 기재된 임의의 항원 결합 도메인, 본원에 기재된 임의의 공동자극 신호전달 도메인 또는 세포내 도메인 또는 세포질 도메인, 또는 CAR에 포함될 수 있는 본원에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다.
한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우에 이는 우세하게 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 것이다. 예시적인 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막횡단 도메인의 각각의 단부에서 발견될 것이다.
일부 실시양태에서, 대상 CAR은 CAR의 세포외 도메인 및 막횡단 도메인 사이에, 또는 CAR의 세포내 도메인 및 막횡단 도메인 사이에 스페이서 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "스페이서 도메인"은 일반적으로 막횡단 도메인을 폴리펩티드 쇄 중의 세포외 도메인 또는 세포내 도메인 중 어느 하나에 연결하도록 기능하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 스페이서 도메인은 최대 약 300개의 아미노산, 예를 들어, 약 10 내지 약 100개의 아미노산, 또는 약 25 내지 약 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 도메인은 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어, 약 2 내지 약 10개의 아미노산의 길이일 수 있다. 예를 들어, 글리신-세린 이중체는 대상 CAR의 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 사이의 특히 적합한 링커를 제공한다.
따라서, 본 개시내용의 대상 CAR은 본원에 기재된 임의의 막횡단 도메인, 힌지 도메인, 또는 스페이서 도메인을 포함할 수 있다.
3. 세포내 도메인
본 발명의 대상 CAR은 또한 세포내 도메인을 포함한다. CAR의 세포내 도메인은 CAR이 발현되는 세포 (예를 들어, 면역 세포)의 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 세포내 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하고, 세포 (예를 들어, 면역 세포)가 그의 특수화된 기능, 예를 들어, 표적 세포를 손상시키고/거나 파괴하는 것을 수행하도록 지정한다.
CAR의 세포내 도메인 또는 다르게는 세포질 도메인은 CAR이 발현되는 세포의 활성화를 담당한다. 본 발명에 사용하기 위한 세포내 도메인의 예는 표면 수용체, 공동-자극 분자, 및 T 세포에서 신호 전달을 개시하도록 협력하여 작용하는 임의의 분자, 뿐만 아니라 이들 요소의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열의 세포질 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 세포내 도메인은 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포내 도메인은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포내 도메인은 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포내 도메인은 4-1BB 및 CD3 제타를 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동자극 신호전달 도메인은 4-1BB를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타를 포함한다.
한 실시양태에서, CAR의 세포내 도메인은 하나 이상의 공동-자극 분자, 예컨대 TNFR 슈퍼패밀리에서의 단백질, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), PD-1, CD7, LIGHT, CD83L, DAP10, DAP12, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS (CD278), NKG2C, B7-H3 (CD276)으로부터의 적어도 하나의 신호전달 도메인의 임의의 부분을 포함하는 공동자극 신호전달 도메인, 및 킬러 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR)로부터 유래된 세포내 도메인, 그의 임의의 유도체 또는 변이체, 동일한 기능적 능력을 갖는 그의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
세포내 신호전달 도메인의 예는 제한 없이, T 세포 수용체 복합체 또는 임의의 그의 동족체의 ζ 쇄, 예를 들어, η 쇄, FcsRIγ 및 β 쇄, MB 1 (Iga) 쇄, B29 (Ig) 쇄 등, 인간 CD3 제타 쇄, CD3 폴리펩티드 (Δ, δ 및 ε), syk 패밀리 티로신 키나제 (Syk, ZAP 70 등), src 패밀리 티로신 키나제 (Lck, Fyn, Lyn 등), 및 T 세포 형질도입에 수반되는 다른 분자, 예컨대 CD2, CD5 및 CD28을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 쇄, FcyRIII, FcsRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 보유 세포질 수용체, 및 이들의 조합일 수 있다.
세포내 도메인의 다른 예는 TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 통상적인 FcR 감마, FcR 베타 (Fc 엡실론 Rib), CD79a, CD79b, Fc 감마 R11a, DAP10, DAP12, T 세포 수용체 (TCR), CD8, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, KIR 패밀리 단백질, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CD5, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1Id, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD lib, ITGAX, CD11c, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (택타일(Tactile)), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD 162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 톨-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 본원에 기재된 다른 공동-자극 분자, 그의 임의의 유도체, 변이체, 또는 단편, 동일한 기능적 능력을 갖는 공동-자극 분자의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 분자 또는 수용체로부터의 단편 또는 도메인을 포함한다.
세포내 도메인의 추가의 예는 제한 없이, CD3, B7 패밀리 공동자극, 및 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 수용체를 포함하는 제1, 제2, 및 제3 세대 T 세포 신호전달 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 다른 면역 신호전달 수용체의 몇몇 유형의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Park and Brentjens, J. Clin. Oncol., 33(6): 651-653 (2015)] 참조). 추가로, 세포내 신호전달 도메인은 NK 및 NKT 세포에 의해 사용되는 신호전달 도메인 (예를 들어, 문헌 [Hermanson and Kaufman, Front. Immunol., 6: 195 (2015)] 참조), 예컨대 NKp30 (B7-H6) (예를 들어, 문헌 [Zhang et al., J. Immunol., 189(5): 2290-2299 (2012)] 참조), 및 DAP 12 (예를 들어, 문헌 [Topfer et al., J. Immunol., 194(7): 3201-3212 (2015)] 참조), NKG2D, NKp44, NKp46, DAP10, 및 CD3z의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 대상 CAR에 사용하는데 적합한 세포내 신호전달 도메인은 CAR의 활성화에 반응하여 (즉, 항원 및 이량체화제에 의해 활성화됨) 별개의 및 검출가능한 신호 (예를 들어, 세포에 의한 하나 이상의 시토카인의 증가된 생산; 표적 유전자의 전사의 변화; 단백질의 활성의 변화; 세포 거동, 예를 들어, 세포 사멸의 변화; 세포 증식; 세포 분화; 세포 생존; 세포 신호전달 반응의 조정 등)를 제공하는 임의의 목적하는 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 등)의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 DAP10/CD28 유형 신호전달 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 막 결합된 CAR에 공유 부착되지 않지만, 대신 세포질에 확산된다.
본 발명의 대상 CAR에 사용하는데 적합한 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)-함유 세포내 신호전달 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ITAM 모티프는 세포내 신호전달 도메인에서 2회 반복되며, 여기서 ITAM 모티프의 제1 및 제2 사례는 서로로부터 6 내지 8개의 아미노산만큼 분리된다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 3개의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (ITAM), 예컨대 Fc 감마 RI, Fc 감마 RIIA, Fc 감마 RIIC, Fc 감마 RIIIA, FcRL5 (그러나 이에 제한되지는 않음)를 함유하는 인간 이뮤노글로불린 수용체의 신호전달 도메인을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gillis et al., Front. Immunol., 5:254 (2014)] 참조).
적합한 세포내 신호전달 도메인은 ITAM 모티프를 함유하는 폴리펩티드로부터 유래된 ITAM 모티프-함유 부분일 수 있다. 예를 들어, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 임의의 ITAM 모티프-함유 단백질로부터의 ITAM 모티프-함유 도메인일 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 전체 단백질의 전체 서열을 함유할 필요는 없다. 적합한 ITAM 모티프-함유 폴리펩티드의 예는 DAP12, FCER1G (Fc 엡실론 수용체 I 감마 쇄), CD3D (CD3 델타), CD3E (CD3 엡실론), CD3G (CD3 감마), CD3Z (CD3 제타), 및 CD79A (항원 수용체 복합체-연관 단백질 알파 쇄)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 DAP12 (일명 TYROBP; TYRO 단백질 티로신 키나제 결합 단백질; KARAP; PLOSL; DNAX-활성화 단백질 12; KAR-연관 단백질; TYRO 단백질 티로신 키나제-결합 단백질; 킬러 활성화 수용체 연관 단백질; 킬러-활성화 수용체-연관 단백질 등)로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 FCER1G (일명 FCRG; Fc 엡실론 수용체 I 감마 쇄; Fc 수용체 감마-쇄; fc-엡실론 RI-감마; fcR 감마; fceR1 감마; 고친화성 이뮤노글로불린 엡실론 수용체 서브유닛 감마; 이뮤노글로불린 E 수용체, 고친화성, 감마 쇄 등)로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 T-세포 표면 당단백질 CD3 델타 쇄 (일명 CD3D; CD3-델타; T3D; CD3 항원, 델타 서브유닛; CD3 델타; CD3d 항원, 델타 폴리펩티드 (TiT3 복합체); OKT3, 델타 쇄; T-세포 수용체 T3 델타 쇄; T-세포 표면 당단백질 CD3 델타 쇄 등)로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 T-세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 쇄 (일명 CD3e, T-세포 표면 항원 T3/Leu-4 엡실론 쇄, T-세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 쇄, AI504783, CD3, CD3엡실론, T3e 등)로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 T-세포 표면 당단백질 CD3 감마 쇄 (일명 CD3G, T-세포 수용체 T3 감마 쇄, CD3-감마, T3G, 감마 폴리펩티드 (TiT3 복합체) 등)로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 T-세포 표면 당단백질 CD3 제타 쇄 (일명 CD3Z, T-세포 수용체 T3 제타 쇄, CD247, CD3-제타, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ 등)로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD79A (일명 B-세포 항원 수용체 복합체-연관 단백질 알파 쇄; CD79a 항원 (이뮤노글로불린-연관 알파); MB-1 막 당단백질; Ig-알파; 막-결합된 이뮤노글로불린-연관 단백질; 표면 IgM-연관 단백질 등)로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 대상 CAR에 사용하는데 적합한 세포내 신호전달 도메인은 DAP10/CD28 유형 신호전달 쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 대상 CAR에 사용하는데 적합한 세포내 신호전달 도메인은 ZAP70 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 또는 CD66d의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR에서의 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
통상적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 채용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 쇄를 사용하는 것이 필요하지는 않다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 말단절단된 부분은 그것이 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 무손상 쇄 대신 사용될 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하는데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단절단된 부분을 포함한다.
본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인은 본원에 기재된 임의의 공동자극 신호전달 도메인, 본원에 기재된 임의의 항원 결합 도메인, 본원에 기재된 임의의 막횡단 도메인, 또는 CAR에 포함될 수 있는 본원에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다.
또한, 대상 CAR에 사용하는데 적합한 변이체 세포내 신호전달 도메인은 관련 기술분야에 공지되어 있다. YMFM 모티프는 ICOS에서 발견되고, PI3K의 p85 및 p50알파 서브유닛 둘 다를 동원하여 증진된 AKT 신호전달을 발생시키는 SH2 결합 모티프이다. 예를 들어, 문헌 [Simpson et al. (2010) Curr. Opin. Immunol., 22:326-332]을 참조한다. 한 실시양태에서, CD28 세포내 도메인 변이체는 YMFM 모티프를 포함하도록 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열식별번호: 2 또는 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열식별번호: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열식별번호: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD28(YMFM) 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 ICOS 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열식별번호: 12에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 ICOS(YMNM) 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열식별번호: 14에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD2 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열식별번호: 16에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD27 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열식별번호: 18에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 OX40 공동자극 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 각각 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 22에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
특이적 활성을 유지하면서 세포내 도메인의 허용가능한 변이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 세포내 도메인은 서열식별번호: 19 또는 21에 제시된 임의의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 세포내 도메인은 서열식별번호: 20 또는 22에 제시된 임의의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 ICOS 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 CD28 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 CD28 YMFM 변이체 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 CD27 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 OX40 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 예시적인 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 예시적인 실시양태에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 CD2 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
표 1은 본원에 기재된 CAR의 도메인의 예시적인 서열을 예시한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
B. T 세포 수용체
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포 또는 변형된 자극된 면역 세포 (예를 들어, 변형된 비자극된 또는 자극된 T 세포)는 외인성 T 세포 수용체 (TCR)를 발현한다. 임의의 항원 (예를 들어, 고형 종양 항원)에 대한 친화성을 포함하는 TCR을 포함하는 임의의 변형된 세포가 상정되며, 본원의 개시내용의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되고 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 특이적 T 세포 수용체 (TCR) 유전자 (예를 들어, TRAC 및 TRBC 유전자)를 함유하도록 변경되었다. TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 표적 폴리펩티드, 예컨대 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원의 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR은 종양 연관 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일부 사례에서, 예시적인 종양 연관 항원은 NY-ESO-1 (LAGE2, LAGE2B, 또는 암/고환 항원 1), 흑색종-연관 항원 (MAGE), 및 H3.3K27M을 포함한다.
TCR은 항원에 반응하여 T 세포의 활성화에 참여하는 6개의 상이한 막 결합된 쇄로 구성된 디술피드-연결된 이종이량체성 단백질이다. 알파/베타 TCR 및 감마/델타 TCR이 존재한다. 알파/베타 TCR은 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함한다. TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 TCR을 발현하는 T 세포는 통상적으로 알파/베타 T 세포로 지칭된다. 감마/델타 TCR은 TCR 감마 쇄 및 TCR 델타 쇄를 포함한다. TCR 감마 쇄 및 TCR 델타 쇄를 포함하는 TCR을 발현하는 T 세포는 통상적으로 감마/델타 T 세포로 지칭된다. 본 개시내용의 TCR은 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 TCR이다. TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 각각 2개의 세포외 도메인, 가변 영역 및 불변 영역으로 구성된다. TCR 알파 쇄 가변 영역 및 TCR 베타 쇄 가변 영역은 표적 항원에의 TCR의 친화성에 요구된다. 각각의 가변 영역은 표적 항원에의 결합을 제공하는 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. TCR 알파 쇄의 불변 영역 및 TCR 베타 쇄의 불변 영역은 세포막에 대해 근위이다. TCR은 막횡단 영역 및 짧은 세포질 꼬리를 추가로 포함한다. CD3 분자는 TCR 이종이량체와 함께 어셈블리된다. CD3 분자는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)로 공지된 티로신 인산화를 위한 특징적인 서열 모티프를 포함한다. 근위 신호전달 사건은 CD3 분자를 통해 매개되고, 따라서, TCR-CD3 복합체 상호작용은 세포 인식 사건을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 한다.
TCR의 자극은 항원 펩티드를 T 세포 상에 제시하고 TCR과 상호작용하여 일련의 세포내 신호전달 캐스케이드를 유도하는 항원 제시 세포 상의 주요 조직적합성 복합체 분자 (MHC)에 의해 촉발된다. TCR의 결속은 양성 및 음성 신호전달 캐스케이드 둘 다를 개시하며, 이는 세포 증식, 시토카인 생산, 및/또는 활성화-유도된 세포 사멸을 발생시킨다.
본 발명의 TCR은 야생형 TCR, 고친화성 TCR, 및/또는 키메라 TCR일 수 있다. 고친화성 TCR은 야생형 TCR에 비해 표적 항원에 대한 더 높은 친화성을 부여하는 야생형 TCR의 변형의 결과일 수 있다. 고친화성 TCR은 친화성-성숙된 TCR일 수 있다. TCR을 변형시키는 및/또는 TCR의 친화성- 성숙을 위한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. TCR을 조작하고 발현시키는 기술은 각각의 서브유닛을 연결하는 천연 디술피드 가교를 포함하는 TCR 이종이량체의 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (Garboczi, et al., (1996), Nature 384(6605): 134-41; Garboczi, et al., (1996), J Immunol 157(12): 5403-10; Chang et al., (1994), PNAS USA 91 : 1 1408-1 1412; Davodeau et al., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460; Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; 미국 특허 번호 6,080,840).
일부 실시양태에서, 외인성 TCR은 전체 TCR 또는 그의 항원-결합 부분 또는 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, TCR은 ab 형태 또는 gd 형태의 TCR을 포함하는 무손상 또는 전장 TCR이다. 일부 실시양태에서, TCR은 전장 TCR 미만이지만 MHC 분자에 결합된 특이적 펩티드에 결합하는, 예컨대 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 항원 결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은 단지 전장 또는 무손상 TCR의 구조적 도메인의 부분을 함유할 수 있지만, 전체 TCR이 결합하는 펩티드 에피토프, 예컨대 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원-결합 부분은 특이적 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하는데 충분한 TCR의 가변 도메인, 예컨대 TCR의 가변 a 쇄 및 가변 b 쇄를 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 쇄는 펩티드, MHC 및/또는 MHC-펩티드 복합체의 인식에 수반되는 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한다.
일부 실시양태에서, TCR의 가변 도메인은 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 주요 기여자인 초가변 루프, 또는 CDR을 함유한다. 일부 실시양태에서, TCR의 CDR 또는 이들의 조합은 주어진 TCR 분자의 모든 또는 실질적으로 모든 항원-결합 부위를 형성한다. TCR 쇄의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로 CDR과 비교하여 TCR 분자 중에서 더 적은 가변성을 나타내는 프레임워크 영역 (FR)에 의해 일반적으로 분리된다 (예를 들어, 문헌 [Jores et al., PNAS, 87:9138 (1990)]; [Chothia et al., EMBO J., 7:3745 (1988)] 참조; 또한 문헌 [Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 27:55 (2003)] 참조). 일부 실시양태에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식을 위한, 및/또는 펩티드-MHC 복합체의 프로세싱된 펩티드 부분과의 상호작용을 위한 주어진 TCR 가변 영역 상의 3개의 CDR 중에서 가장 중요하다. 일부 맥락에서, 알파 쇄의 CDR1은 특정 항원성 펩티드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, 베타 쇄의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, CDR2는 MHC-펩티드 복합체의 MHC 부분과의 상호작용 또는 그의 인식에 가장 강하게 기여하거나 이를 담당하는 주요 CDR이다. 일부 실시양태에서, b-쇄의 가변 영역은 일반적으로 초항원 결합에 관여하고 항원 인식에 관여하지 않는 추가의 초가변 영역 (CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 있다 (Kotb, Clinical Microbiology Reviews, 8:41 1-426 (1995)).
일부 실시양태에서, TCR은 가변 알파 도메인 (Va) 및/또는 가변 베타 도메인 (Vp) 또는 그의 항원-결합 단편을 함유한다. 일부 실시양태에서, TCR의 α-쇄 및/또는 β-쇄는 또한 불변 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3 Ed., Current Biology Publications, p. 4:33 (1997)] 참조).
일부 실시양태에서, α 쇄 불변 도메인은 TRAC 유전자 (IMGT 명명법)에 의해 코딩되거나 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, β 쇄 불변 영역은 TRBC1 또는 TRBC2 유전자 (IMGT 명명법)에 의해 코딩되거나 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 불변 도메인은 세포막에 인접한다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 쇄에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막-근위 불변 도메인, 및 2개의 막-원위 가변 도메인을 함유하며, 가변 도메인은 각각 CDR을 함유한다.
TCR의 다양한 도메인 또는 영역을 결정하거나 확인하는 것은 통상의 기술자의 수준 내이다. 일부 측면에서, TCR의 잔기는 공지되어 있거나, 국제 면역유전학 정보 시스템 (IMGT) 넘버링 시스템에 따라 확인될 수 있다 (예를 들어 www.imgt.org 참조; 또한, 문헌 [Lefranc et al., Developmental and Comparative Immunology, 2:55-77 (2003)]; 및 [The T Cell Factsbook 2nd Edition, Lefranc and LeFranc Academic Press 2001] 참조). 이 시스템을 사용하면, TCR Va 쇄 및/또는 nb 쇄 내의 CDR1 서열은 잔기 번호 27-38 (경계값 포함) 사이에 존재하는 아미노산에 상응하고, TCR Va 쇄 및/또는 nb 쇄 내의 CDR2 서열은 잔기 번호 56-65 (경계값 포함) 사이에 존재하는 아미노산에 상응하고, TCR Va 쇄 및/또는 nb 쇄 내의 CDR3 서열은 잔기 번호 105-117 사이에 존재하는 아미노산에 상응한다.
일부 실시양태에서, TCR은 예컨대 디술피드 결합 또는 디술피드 결합들에 의해 연결된 2개의 쇄 a 및 b (또는 임의로 g 및 d)의 이종이량체일 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 디술피드 결합을 형성하며, 그에 의해 TCR의 2개의 쇄를 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR은 a 및 b 쇄의 각각에 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있고, 그에 따라 TCR은 불변 도메인에 2개의 디술피드 결합을 함유한다. 일부 실시양태에서, 불변 및 가변 도메인의 각각은 시스테인 잔기에 의해 형성된 디술피드 결합을 함유한다.
일부 실시양태에서, 기재된 바와 같은 세포를 조작하기 위한 TCR은 그에 대해 실질적으로 전장 코딩 서열이 용이하게 입수가능한 공지된 TCR 서열(들), 예컨대 na,b 쇄의 서열로부터 생성된 것이다. 세포 공급원으로부터 V 쇄 서열을 포함하는 전장 TCR 서열을 수득하는 방법은 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, TCR을 코딩하는 핵산은 다양한 공급원으로부터, 예컨대 주어진 세포 또는 세포들 내의 또는 그로부터 단리된 TCR-코딩 핵산의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 또는 공개적으로 입수가능한 TCR DNA 서열의 합성에 의해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR은 생물학적 공급원으로부터, 예컨대 세포로부터, 예컨대 T 세포 (예를 들어 세포독성 T 세포), T-세포 하이브리도마 또는 다른 공개적으로 입수가능한 공급원으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, T-세포는 생체내에서 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, T- 세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 TCR의 서열의 지식으로부터 합성적으로 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 대한 고-친화성 T 세포 클론은 확인되고, 환자로부터 단리되고, 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 인간 면역계 유전자 (예를 들어, 인간 백혈구 항원 시스템, 또는 HLA)로 조작된 트랜스제닉 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원을 참조한다 (예를 들어, 문헌 [Parkhurst et al., Clin Cancer Res., 15: 169-180 (2009)] 및 [Cohen et al., J. Immunol., 175:5799-5808 (2005)] 참조). 일부 실시양태에서, 파지 제시는 표적 항원에 대한 TCR을 단리하는데 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Varela-Rohena et al., Nat. Med., 14: 1390-1395 (2008)] 및 [Li, Nat. Biotechnol., 23:349-354 (2005)] 참조). 일부 실시양태에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 변형되거나 조작된 것이다. 일부 실시양태에서, 지정 진화 방법은 변경된 특성을 갖는, 예컨대 특이적 MHC- 펩티드 복합체에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 TCR을 생성하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 지정 진화는 효모 제시 (Holler et al., Nat. Immunol., 4:55-62 (2003); Holler et al., PNAS USA, 97: 5387-92 (2000)), 파지 제시 (Li et al., Nat. Biotechnol., 23: 349-54 (2005)), 또는 T 세포 제시 (Chervin et al., J. Immunol. Methods, 339:175-84 (2008))를 포함하나 이에 제한되지는 않는 제시 방법에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 제시 접근법은 공지된 모 또는 참조 TCR을 조작하거나, 변형시키는 것을 수반한다. 예를 들어, 일부 경우에, 야생형 TCR은 CDR의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이되고, 목적하는 변경된 특성, 예컨대 목적하는 표적 항원에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 돌연변이체가 선택되는 돌연변이유발된 TCR을 생산하기 위한 주형으로서 사용될 수 있다.
기재된 바와 같은 일부 실시양태에서, TCR은 도입된 디술피드 결합 또는 결합들을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 디술피드 결합은 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 천연 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 천연 시스테인 중 하나 이상 (예를 들어 a 쇄 및 b 쇄의 불변 도메인에서)은 또 다른 잔기로, 예컨대 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 도입된 디술피드 결합은 예컨대 a 쇄 및 b 쇄의 불변 도메인에서 알파 및 베타 쇄 상의 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비-천연 디술피드 결합은 WO 2006/000830 및 WO 2006/037960에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 알파 쇄의 잔기 Thr48 및 베타 쇄의 Ser57에서, 알파 쇄의 잔기 Thr45 및 베타 쇄의 Ser77에서, 알파 쇄의 잔기 TyrIO 및 베타 쇄의 Serl7에서, 알파 쇄의 잔기 Thr45 및 베타 쇄의 Asp59에서 및/또는 알파 쇄의 잔기 Serl5 및 베타 쇄의 Glul5에서 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 TCR에서의 비-천연 시스테인 잔기의 존재 (예를 들어 하나 이상의 비-천연 디술피드 결합을 발생시킴)는 천연 TCR 쇄를 함유하는 미스매칭된 TCR 쌍의 발현에 비해 그것이 도입되는 세포에서 목적하는 재조합 TCR의 생성에 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, TCR 쇄는 막횡단 도메인을 함유한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에, TCR 쇄는 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 측면에서, TCR의 각각의 쇄 (예를 들어 알파 또는 베타)는 하나의 N-말단 이뮤노글로불린 가변 도메인, 하나의 이뮤노글로불린 불변 도메인, 막횡단 영역, 및 C-말단 단부에서 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR은, 예를 들어 세포질 꼬리를 통해, 신호 전달을 매개하는데 수반되는 CD3 복합체의 불변 단백질과 회합된다. 일부 경우에, 구조는 TCR이 CD3 및 그의 서브유닛과 같은 다른 분자와 회합하는 것을 허용한다. 예를 들어, 막횡단 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에서 단백질을 고착시키고, CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 회합할 수 있다. CD3 신호전달 서브유닛 (예를 들어 CD3Y, CD36, CD3s 및 Oυ3z 쇄)의 세포내 꼬리는 TCR 복합체의 신호전달 능력에 수반되는 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유한다.
일부 실시양태에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 실시양태에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 실시양태에서, TCR은 이량체성 TCR (dTCR)이다. 일부 실시양태에서, TCR은 단일-쇄 TCR (sc-TCR)이다. TCR은 세포-결합되거나 가용성 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포의 표면 상에 발현되는 세포-결합된 형태이다. 일부 실시양태에서 dTCR은 TCR a 쇄 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR a 쇄 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩티드, 및 TCR b 쇄 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR b 쇄 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제2 폴리펩티드를 함유하고, 제1 및 제2 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 결합은 천연 이량체성 ab TCR에 존재하는 천연 쇄간 디술피드 결합에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 쇄간 디술피드 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 시스테인은 dTCR 폴리펩티드 쌍의 불변 영역 세포외 서열 내로 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 디술피드 결합 둘 다는 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR은 막에 고착시키는 막횡단 서열을 함유한다. 일부 실시양태에서, dTCR은 가변 a 도메인, 불변 a 도메인, 및 불변 a 도메인의 C-말단에 부착된 제1 이량체화 모티프를 함유하는 TCR a 쇄, 및 가변 b 도메인, 불변 b 도메인, 및 불변 b 도메인의 C-말단에 부착된 제1 이량체화 모티프를 포함하는 TCR b 쇄를 함유하며, 여기서 제1 및 제2 이량체화 모티프는 용이하게 상호작용하여 TCR a 쇄 및 TCR b 쇄를 함께 연결하는 제1 이량체화 모티프에서의 아미노산 및 제2 이량체화 모티프에서의 아미노산 사이에 공유 결합을 형성한다.
일부 실시양태에서, TCR은 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 α 쇄 및 β 쇄를 함유하는 단일 아미노산 가닥인 scTCR이다.
전형적으로, scTCR은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있으며, 예를 들어, WO 1996/13593, WO 1996/18105, WO 1999/18129, WO 2004/033685, WO 2006/037960, WO 2011/044186; 미국 특허 번호 7,569,664; 및 문헌 [Schlueter et al. J. Mol. Biol., 256:859 (1996)]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 Ca 또는 CP 막횡단 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 비-TCR 기원, 예를 들어, CD3z, CD28 또는 B7.1로부터의 막횡단 영역으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 실시양태에서, TCR은 CD3z 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 실시양태에서, TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR 또는 그의 항원 결합 부분은 하나 이상의 특성, 예컨대 결합 특징이 변경된 재조합적으로 생산된 천연 단백질 또는 그의 돌연변이된 형태일 수있다. 일부 실시양태에서, TCR은 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 또는 다른 포유동물 중 하나로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, TCR은 표적 세포 상의 표적 항원에 대한 친화성을 포함한다. 표적 항원은 표적 세포와 연관된 임의의 유형의 단백질, 또는 그의 에피토프를 포함할 수 있다. 예를 들어, TCR은 표적 세포의 특정한 질환 상태를 지시하는 표적 세포 상의 표적 항원에 대한 친화성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 MHC에 의해 프로세싱되고 제시된다.
일부 실시양태에서, TCR은 순차적으로, N-말단에서 C-말단으로 제1 이종 TCR 서브유닛 쇄 (여기서 TCR 서브유닛 쇄는 TCR 서브유닛 쇄의 가변 영역 및 불변 영역을 포함함), 및 제2 이종 TCR 서브유닛 쇄의 가변 영역 및 가변 영역을 코딩하는 핵산 구축물에 의해 코딩된다. 구축물은 제1 이종 TCR 서브유닛 쇄의 가변 영역에 선행하는 제1 자기-절단 펩티드, 및 제1 이종 TCR 서브유닛 쇄 및 제2 TCR 서브유닛 사이의 제2 자기-절단 펩티드를 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 이종 TCR 서브유닛 쇄는 TCRα 쇄이고, 제2 이종 TCR 서브유닛 쇄는 TCRβ 쇄이다. 일부 실시양태에서, 제1 이종 TCR 서브유닛 쇄는 TCRβ 쇄이고, 제2 이종 TCR 서브유닛 쇄는 TCRα 쇄이다.
자기-절단 펩티드의 예는 자기-절단 바이러스 2A 펩티드, 예를 들어, 돼지 테스코바이러스-1 (P2A) 펩티드, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 (T2A) 펩티드, 말 A형 비염 바이러스 (E2A) 펩티드, 또는 수족구병 바이러스 (F2A) 펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 자기-절단 2A 펩티드는 단일 구축물로부터 다수의 유전자 산물의 발현을 허용한다. (예를 들어, 문헌 [Chng et al. "Cleavage efficient 2A peptides for high level monoclonal antibody expression in CHO cells," MAbs, 7(2): 403-412 (2015)] 참조). 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 자기-절단 펩티드는 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 자기-절단 펩티드는 상이하다.
C. 추가의 항원-결합 폴리펩티드
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포 또는 변형된 자극된 면역 세포 (예를 들어, 변형된 비자극된 또는 자극된 T 세포)는 항원-결합 도메인, 세포 표면 수용체 리간드, 또는 종양 항원에 결합하는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 사례에서, 항원-결합 도메인은 세포 표면 단백질 또는 종양 세포 상에 발현된 수용체를 인식하는 항체를 포함한다. 일부 사례에서, 항원-결합 도메인은 종양 항원을 인식하는 항체를 포함한다. 일부 사례에서, 항원-결합 도메인은 전장 항체 또는 그의 항원-결합 단편, Fab, F(ab)2, 단일특이적 Fab2, 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab2, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 디아바디, 트리아바디, 미니바디, V-NAR, 또는 VhH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포 또는 변형된 자극된 면역 세포 (예를 들어, 변형된 비자극된 또는 자극된 T 세포)는 세포 표면 수용체 리간드를 발현한다. 일부 사례에서, 리간드는 종양 세포 상에 발현된 세포 표면 수용체에 결합한다. 일부 경우에, 리간드는 세포 표면 수용체에 결합하는 야생형 단백질 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 사례에서, 리간드는 세포 표면 수용체에 결합하는 전장 단백질 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 일부 경우에, 기능적 단편은 단백질의 전장 버전과 비교하여 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 또는 약 40%의 길이를 포함하지만, 세포 표면 수용체에의 결합을 보유한다. 일부 경우에, 리간드는 세포 표면 수용체에 결합하는 드 노보 조작된 단백질이다. 예시적인 리간드는 표피 성장 인자 (EGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 또는 Wnt3A를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 변형된 비자극된 면역 세포 또는 변형된 자극된 면역 세포 (예를 들어, 변형된 비자극된 또는 자극된 T 세포)는 종양 항원에 결합하는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 사례에서, 종양 항원은 혈액 악성종양과 연관된다. 예시적인 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, CD33/IL3Ra, ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, PSCA, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, EGFRvIII, GPC2, Tn-MUC1, GDNF 패밀리 수용체 알파-4 (GFRa4), 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 및 IL13Ra2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 사례에서, 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, BCMA, CD37, 메소텔린, PSMA, PSCA, Tn-MUC1, EGFR, EGFRvIII, c-Met, HER1, HER2, CD33, CD133, GD2, GPC2, GPC3, NKG2D, KRAS, 또는 WT1을 포함한다. 일부 사례에서, 폴리펩티드는 종양 항원의 리간드, 예를 들어, 종양 항원에 결합하는 전장 단백질, 그의 기능적 단편, 또는 종양 항원에 결합하는 드 노보 조작된 리간드이다. 일부 사례에서, 폴리펩티드는 종양 항원에 결합하는 항체이다.
IV. 조성물
본 발명의 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 비자극된 면역 세포, 또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 자극된 면역 세포를 임의로 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제, 아주반트, 또는 부형제와 조합으로 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스, 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신, 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아주반트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 비경구 투여 (예를 들어, 정맥내 투여)를 위해 제제화된다.
V. 사용 방법
일부 실시양태에서, 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단, 또는 본원에 기재된 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 사례에서, 질환은 암, 임의로 고형 종양 또는 혈액 악성종양이다. 일부 사례에서, 변형된 비자극된 면역 세포 또는 변형된 자극된 면역 세포는 각각 암에 의해 발현되는 항원에 대해 특이적인 항원-결합 도메인을 발현한다.
일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 예시적인 고형 종양은 방광암, 골암, 뇌암 (예를 들어, 신경아교종, 교모세포종, 신경모세포종), 유방암, 결장직장암, 식도암, 안암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 위암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 사례에서, 고형 종양은 뇌암 (예를 들어, 신경아교종, 교모세포종, 신경모세포종), 유방암, 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 췌장암, 또는 전립선암이다. 일부 사례에서, 고형 종양은 전이성 암이다. 일부 경우에, 고형 종양은 재발성 또는 난치성 고형 종양이다.
일부 실시양태에서, 암은 혈액 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 B-세포 악성종양 또는 T-세포 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 림프종, 백혈병, 또는 골수종이다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 호지킨 림프종, 또는 비-호지킨 림프종이다. 예시적인 혈액 악성종양은 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 작은 림프구성 림프종 (SLL), 소포성 림프종 (FL), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 림프절외 변연대 B 세포 림프종, 결절성 변연대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 비-버킷 고등급 B 세포 림프종, 원발성 종격 B-세포 림프종 (PMBL), 면역모구성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연대 림프종, 형질 세포 골수종, 형질세포종, 종격 (흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 또는 림프종모양 육아종증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 사례에서, 혈액 악성종양은 전이성 혈액 악성종양이다. 일부 경우에, 혈액 악성종양은 재발성 또는 난치성 혈액 악성종양이다.
일부 실시양태에서, 질환을 치료하는 방법은 추가의 치료제 또는 추가의 요법을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 추가의 치료제는 화학치료제, 면역치료제, 표적화된 요법, 방사선 요법, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 추가의 치료제는 알킬화제, 예컨대 알트레타민, 부술판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 다카르바진, 로무스틴, 멜팔란, 옥살라플라틴, 테모졸로미드, 또는 티오테파; 항대사물, 예컨대 5-플루오로우라실 (5-FU), 6-메르캅토퓨린 (6-MP), 카페시타빈, 시타라빈, 플록스우리딘, 플루다라빈, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 또는 페메트렉시드; 안트라시클린, 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 또는 이다루비신; 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 토포테칸 또는 이리노테칸 (CPT-11); 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 에토포시드 (VP- 16), 테니포시드, 또는 미톡산트론; 유사분열 억제제, 예컨대 도세탁셀, 에스트라무스틴, 익사베필론, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 또는 비노렐빈; 또는 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 또는 덱사메타손을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 추가의 치료제는 제1-선 요법을 포함한다. 본원에 사용된 "제1-선 요법"은 암을 갖는 대상체에 대한 1차 치료를 포함한다. 일부 사례에서, 암은 원발성 암이다. 다른 사례에서, 암은 전이성 또는 재발성 암이다. 일부 경우에, 제1-선 요법은 화학요법을 포함한다. 다른 경우에, 제1-선 치료는 방사선 요법을 포함한다. 통상의 기술자는 상이한 제1-선 치료가 상이한 유형의 암에 적용가능할 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
일부 경우에, 추가의 치료제는 면역 체크포인트 억제제를 포함한다. 일부 사례에서, 면역 체크포인트 억제제는 억제제, 예컨대 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, 모노클로날 항체, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체), RNAi 분자, 또는 PD-1, PD-L1, CTLA4, PD-L2, LAG3, B7-H3, KIR, CD137, PS, TFM3, CD52, CD30, CD20, CD33, CD27, OX40, GITR, ICOS, BTLA (CD272), CD160, 2B4, LAIR1, TIGHT, LIGHT, DR3, CD226, CD2, 또는 SLAM에 대한 소분자를 포함한다.
예시적인 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 트레멜리무맙, 또는 이필리무맙을 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가의 요법은 방사선 요법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가의 요법은 수술을 포함한다.
VI. 키트 및 제조품
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키트 또는 제조품은 변형된 비자극된 면역 세포 (예를 들어, 변형된 비자극된 T 세포)의 하나 이상의 집단 또는 변형된 자극된 면역 세포 (예를 들어, 변형된 자극된 T 세포)의 하나 이상의 집단을 포함한다. 일부 사례에서, 본원에 기재된 키트 또는 제조품은 하나 이상의 용기, 예컨대 바이알, 튜브 등을 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지, 또는 용기를 추가로 포함하며, 용기(들)의 각각은 본원에 기재된 방법에 사용되는 별개의 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 보틀, 바이알, 시린지, 및 시험 튜브를 포함한다. 한 실시양태에서, 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성된다.
본원에서 제공된 제조품은 패키징 물질을 함유한다. 제약 패키징 물질의 예는 블리스터 팩, 보틀, 튜브, 백, 용기, 보틀, 및 선택된 제제 및 의도된 투여의 방식 및 치료에 적합한 임의의 패키징 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
키트는 전형적으로 내용물을 열거하는 표지 및/또는 사용을 위한 지시서, 및 사용을 위한 지시서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한다. 지시서의 세트는 또한 전형적으로 포함될 것이다.
VII. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.
본원에 사용된 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 언급대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 그의 혼합물을 포함하는 복수개의 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 값이 상기 값을 측정하는데 채용되는 디바이스 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함함을 지시하는데 사용된다. 용어 "약"은 범위를 포함하는 수치 지정, 예를 들어, 온도, 시간, 양, 및 농도 앞에 사용되는 경우, (+) 또는 (-) 15%, 10%, 5%, 3%, 2%, 또는 1 %만큼 달라질 수 있는 근사치를 지시한다.
본 개시내용의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내인 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 채용할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Green and Sambrook eds. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition]; [the series Ausubel et al. eds. (2015) Current Protocols in Molecular Biology]; [the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; [MacPherson et al. (2015) PCR 1 : A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)]; [MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach]; [McPherson et al. (2006) PCR: The Basics (Garland Science)]; [Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual]; [Greenfield ed. (2014) Antibodies, A Laboratory Manual]; [Freshney (2010) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 6th edition]; [Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis]; 미국 특허 번호 4,683,195; 문헌 [Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization]; [Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization]; [Herdewijn ed. (2005) Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications]; [Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation]; [Buzdin and Lukyanov ed. (2007) Nucleic Acids Hybridization: Modern Applications]; [Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))]; [Grandi ed. (2007) In Vitro Transcription and Translation Protocols, 2nd edition]; [Guisan ed. (2006) Immobilization of Enzymes and Cells]; [Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition]; [Miller and Calos eds, (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)]; [Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells]; [Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)]; [Lundblad and Macdonald eds. (2010) Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 4th edition]; 및 [Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th edition]을 참조한다.
"동종이형"은 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 관심의 항원 (예를 들어 종양 연관 항원)에 대한 유의한 공지된 특이적 면역반응 활성을 갖는 이러한 어셈블리 (예를 들어, 무손상 항체 분자, 면역접합체, 또는 그의 변이체)를 지칭한다. 항체 및 이뮤노글로불린은 그들 사이에 쇄간 공유 연결을 갖는 또는 갖지 않는 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 척추동물 시스템에서 기본적인 이뮤노글로불린 구조는 상대적으로 널리 이해되어 있다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 부분을 지칭하고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 키메라 항원 수용체의 항원 결합 도메인은 항체 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체 변이체"는 이들이 천연 발생이 아니도록 변경된 항체의 합성 및 조작된 형태, 예를 들어, 적어도 2개의 중쇄 부분을 포함하지만, 2개의 완전한 중쇄는 아닌 (예컨대, 도메인 결실된 항체 또는 미니바디); 2개 이상의 상이한 항원에 또는 단일 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하도록 변경된 항체의 다중-특이적 형태 (예를 들어, 이중-특이적, 삼중-특이적 등); scFv 분자에 연결된 중쇄 분자 등을 포함한다. 또한, 용어 "항체 변이체"는 항체의 다가 형태 (예를 들어, 3가, 4가 등), 동일한 항원의 3개, 4개 또는 그 초과의 카피에 결합하는 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자로 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역학상-적격 세포의 활성화 중 어느 하나, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 통상의 기술자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 통상의 기술자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 따라서 그 용어가 본원에 사용되는 바와 같이 "항원"을 코딩함을 이해할 것이다. 더욱이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항원이 단지 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 하나 초과의 유전자의 부분적 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 뉴클레오티드 서열은 목적하는 면역 반응을 유발하기 위해 다양한 조합으로 배열됨이 용이하게 명백하다. 더욱이, 통상의 기술자는 항원이 전적으로 "유전자"에 의해 코딩될 필요는 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성되어 생성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있음이 용이하게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "자가"는 동일한 개체로부터 유래되고, 그것이 나중에 개체 내로 재-도입될 수 있는 임의의 물질을 지칭하는 것으로 의미된다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 이펙터 세포 또는 그의 전구 세포 상에 발현하도록 조작되고 항원에 특이적으로 결합하는 인공 T 세포 수용체를 지칭한다. CAR은 입양 세포 전달로의 입양 세포 요법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 입양 세포 전달 (또는 요법)은 환자로부터 T 세포의 제거, 및 T 세포를 특정한 항원에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 선택된 표적, 예를 들어, PSMA, 또는 MUC1에 대한 특이성을 갖는다. CAR은 또한 세포내 활성화 도메인, 막횡단 도메인, 및 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다.
"발현 벡터"는 발현되는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 관련 기술분야에 공지된 모든 것들, 예컨대 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 함유됨) 및 바이러스 (예를 들어, 센다이 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함한다.
용어 "절단"은 예컨대 핵산 분자의 백본에서의 공유 결합의 파괴 또는 펩티드 결합의 가수분해를 지칭한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단 둘 다가 가능하다. 이중-가닥 절단은 2개의 별개의 단일-가닥 절단 사건의 결과로서 일어날 수 있다. DNA 절단은 블런트 단부 또는 엇갈린 단부 중 어느 하나의 생성을 발생시킬 수 있다.
본원에 사용된 "상동"은 2개의 중합체성 분자 사이의, 예를 들어, 2개의 핵산 분자, 예컨대 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이의, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자의 둘 다에서의 서브유닛 위치가 동일한 단량체성 서브유닛에 의해 점유되는 경우; 예를 들어, 2개의 DNA 분자의 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 그 위치에서 상동이다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매칭 또는 상동 위치의 수의 직접적 함수이며; 예를 들어, 2개의 서열에서의 위치의 절반 (예를 들어, 10개의 서브위닛의 길이의 중합체에서 5개의 위치)이 상동인 경우, 2개의 서열은 50% 상동이고; 위치의 90% (예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동인 경우, 2개의 서열은 90% 상동이다.
용어 "비-상동 단부 연결" 또는 NHEJ는 DNA의 가닥의 절단된 또는 니킹된 단부가 상동 주형 핵산에 대한 필요 없이 직접적으로 라이게이션되는 공정을 지칭한다. NHEJ의 복구는 복구 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환, 또는 이들의 조합을 초래할 수 있다.
용어 "상동성-지정 복구" 또는 HDR은 DNA의 가닥의 절단된 또는 니킹된 단부가 상동 주형, 또는 공여자, 핵산의 삽입에 의해 복구되는 공정을 지칭한다. 이것이 일어나는 경우, 원래 DNA 서열은 상동 주형 DNA로 대체된다. 상동 주형 핵산은 게놈에서의 다른 곳에서의 상동 서열 (자매 염색분체, 상동 염색체, 또는 동일한 또는 상이한 염색체 상의 반복된 영역)에 의해 제공될 수 있다. 외인성 주형 핵산은 표적 부위에서 서열의 특이적 HDR-유도된 변화를 수득하도록 도입될 수 있다. 이는 특이적 돌연변이 또는 트랜스진이 커팅 부위에서 도입되는 것을 허용한다. 외인성 주형은 HDR에 의해 도입되는 트랜스진 또는 돌연변이를 코딩하는 단일-가닥 DNA (ssDNA) 주형 또는 이중-가닥 DNA (dsDNA) 주형일 수 있다. 일부 경우에, ssDNA 또는 dsDNA 주형은 표적 커팅 또는 삽입 부위에서 삽입되는 이종 서열을 함유하는 영역에 플랭킹된 2개의 상동 영역, 예를 들어, 5' 단부 및 3' 단부를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "상류"는 게놈에서의 특정한 부위 또는 로커스, 예를 들어, 게놈 편집 시스템에 의해 촉매되는 절단 부위에 대해 5'에서 발견되는 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "하류"는 게놈에서의 특정한 부위 또는 로커스에 대해 3'에서 발견되는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 이를 필요로 하는 대상체에서 목적하는 생리학적, 치료적, 또는 예방적 결과를 달성하는데 유효한 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 제제, 물질, 제약 작용제, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 결과는 포유동물에게 투여되는 경우, 본 발명의 조성물의 부재 하에서 검출되는 면역 방능에 비해 검출가능한 수준의 면역 반응을 유발하는 양을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 면역 반응은 다수의 관련 기술분야에 인식된 방법에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 통상의 기술자는 본원에서 투여되는 조성물의 양이 치료되는 질환 또는 상태, 치료되는 포유동물의 연령 및 건강 및 신체 상태, 질환의 중증도, 투여되는 특정한 화합물 등과 같은 다수의 인자에 기반하여 달라지고 용이하게 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 유효량은 치료되는 대상체의 건강 및 신체 상태, 치료되는 대상체의 분류학적 그룹, 조성물의 제제, 대상체의 의학적 상태의 평가, 및 다른 관련 인자에 따라 대상체 사이에 달라질 수 있다.
"코딩하는"은 뉴클레오티드 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 중 어느 하나를 갖는 생물학적 공정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA에서의 뉴클레오티드의 특이적 서열의 고유한 특성 및 그로부터 생성되는 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우 단백질을 코딩한다. 그의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에서 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의 또는 그 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 B 및/또는 T 세포 반응을 포함하는 면역 반응을 유발할 수 있는 항원 상의 작은 화학 분자로 정의된다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 대부분의 항원은 많은 에피토프를 가지며; 즉, 이들은 다가이다. 일반적으로, 에피토프는 대략 약 10개의 아미노산 및/또는 당의 크기이다. 특정 예시적인 실시양태에서, 에피토프는 약 4-18개의 아미노산, 약 5-16개의 아미노산, 약 6-14개의 아미노산, 약 7-12개의 아미노산, 약 10-12개의 아미노산, 또는 약 8-10개의 아미노산이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일반적으로 분자의 특이적 선형 서열이라기 보다는 전체 3차원 구조가 항원 특이성의 주요 기준이며, 따라서 하나의 에피토프를 또 다른 것으로부터 구별함을 이해하고 있다. 본 개시내용에 기반하면, 본 발명에 사용되는 펩티드는 에피토프일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 그 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "확장시키다"는 T 세포의 수의 증가에서와 같이 수를 증가시키는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 생체외에서 확장된 T 세포는 배양물에 원래 존재하는 수에 비해 수가 증가한다. 또 다른 실시양태에서, 생체외에서 확장된 T 세포는 배양물에서 다른 세포 유형에 비해 수가 증가한다. 본원에 사용된 용어 "생체외에서"는 살아있는 유기체 (예를 들어, 인간)로부터 제거되고 유기체 외부에서 (예를 들어, 배양 디쉬, 시험 튜브, 또는 생물반응기에서) 번식된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 그의 프로모터에 의해 유도된 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
본원에 사용된 "동일성"은 2개의 중합체성 분자 사이의, 특히 2개의 아미노산 분자 사이의, 예컨대, 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열이 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 경우; 예를 들어, 2개의 폴리펩티드 분자의 각각에서의 위치가 아르기닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 그 위치에서 동일하다. 동일성 또는 2개의 아미노산 서열이 정렬에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 정도는 종종 백분율로서 표현된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 매칭하거나 동일한 위치의 수의 직접적 함수이며; 예를 들어, 2개의 서열에서의 위치의 절반 (예를 들어, 10개의 아미노산의 길이의 중합체에서 5개의 위치)이 동일한 경우, 2개의 서열은 50% 동일하고; 위치의 90% (예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 동일한 경우, 2개의 아미노산 서열은 90% 동일하다.
"단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리되지" 않지만, 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된다". 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있거나, 비-천연 환경, 예컨대, 예를 들어, 숙주 세포에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "넉다운"은 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "넉아웃"은 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 제거를 지칭한다.
본원에 사용된 "렌티바이러스"는 레트로비리다에(Retroviridae) 과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 고유하며; 이들은 유의한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있고, 따라서 이들은 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체내에서 유의한 수준의 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "변형된"이란, 본 발명의 분자 또는 세포의 변화된 상태 또는 구조를 의미한다. 분자는 화학적으로, 구조적으로, 및 기능적으로를 포함하는 많은 방식으로 변형될 수 있다. 세포는 핵산의 도입을 통해 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조정하는"이란, 치료 또는 화합물의 부재 하에서의 대상체에서의 반응의 수준에 비해, 및/또는 다르게는 동일하지만 비치료된 대상체에서의 반응의 수준에 비해 대상체에서의 반응의 수준의 검출가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 상기 용어는 천연 신호 또는 반응을 동요시키고/거나 그에 영향을 미치며, 그에 의해 대상체, 예를 들어, 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포괄한다.
본 발명의 맥락에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대한 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
달리 특정되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축중성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 쇄로 정의된다. 더욱이, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본원에 사용된 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환가능하다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 핵산이 단량체성 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적 지식을 갖고 있다. 단량체성 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에 사용된 폴리뉴클레오티드는 제한 없이, 재조합 수단, 즉, 통상적인 클로닝 기술 및 폴리머라제 연쇄 반응 등을 사용한, 및 합성 수단에 의한 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝을 포함하는 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질의 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로에 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 상기 용어는 또한 통상적으로 예를 들어, 관련 기술분야에서 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 지칭되는 짧은 쇄, 및 그의 많은 유형이 있는 일반적으로 관련 기술분야에서 단백질로 지칭되는 보다 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 다른 것들 중에서도, 예를 들어, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "특이성"은 주어진 표적 항원 (예를 들어, 인간 표적 항원)에 특이적으로 결합하는 (예를 들어, 그와 면역반응하는) 능력을 지칭한다. 키메라 항원 수용체는 단일특이적이고, 표적에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 함유할 수 있거나, 또는 키메라 항원 수용체는 다중-특이적이고, 동일한 또는 상이한 표적에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 동일한 표적의 2개의 상이한 (예를 들어, 비-중첩하는) 부분에 대해 특이적이다. 특정 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 하나 초과의 표적에 대해 특이적이다.
항체에 관하여 본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하다"란, 특이적 항원을 인식하지만, 샘플에서의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 그에 결합하지 않는 항체 또는 그의 결합 단편 (예를 들어, scFv)을 의미한다. 예를 들어, 하나의 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종으로부터의 그 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차-종 반응성은 그 자체가 특이적인 것으로 서 항체의 분류를 변경시키지 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 그 자체가 특이적인 것으로서 항체의 분류를 변경시키지 않는다. 일부 사례에서, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체, 단백질, 키메라 항원 수용체, 또는 펩티드와 제2 화학 종의 상호작용에 관하여, 상호작용이 화학 종 상의 특정한 구조 (예를 들어, 항원 결정자 또는 에피토프)의 존재에 의존함을 의미하기 위해 사용될 수 있으며; 예를 들어, 키메라 항원 수용체는 일반적으로 단백질이라기 보다는 특이적 단백질 구조를 인식하고 그에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서, 에피토프 A (또는 유리, 비표지된 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
용어 "비자극된"은 상기 용어가 본원에 사용되는 바와 같이, 그의 동종체 리간드와의 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체)의 결합에 의해 자극되거나 유도되지 않은 면역 세포 (예를 들어, T 세포)의 상태를 지칭한다. 비자극된 T 세포는 또한 "정지" 또는 "나이브" T 세포로 공지될 수 있으며, 관련 기술분야에 공지된 수단에 의해 자극되지 않았다. 비자극된 세포는 CD45RA 및 CD62L을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 집단에서의 다른 세포 (예를 들어, 자극된 T 세포)로부터 세포를 분화시킬 수 있는 마커를 발현한다.
본원에 사용된 "정지"는 그것이 분열하지 않지만, 세포 증식으로 재-진입하는 능력을 보유하는 가역적인 상태에 있는 세포, 바람직하게는 T 세포를 지칭한다. 정지 T 세포는 작은 세포 크기, 낮은 증식 능력, 및 낮은 기저 대사 프로그램을 특징으로 한다. 정지 세포는 분열하고 증식하도록 자극될 수 있다. 정지 세포는 실질적으로 비-증식하고 있는 세포의 집단이다. 정지는 세포 증식 검정, 예컨대 BrdU 검정, EdU 검정, MTT 세포 증식 검정, XTT 세포 증식 검정, WST-1 세포 증식 검정, 및 마커, 예컨대 Ki67 및 증식 세포 핵 항원 (PCNA)의 측정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 수단에 의해 측정될 수 있다.
용어 "자극"이란, 그의 동종체 리간드와의 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체)의 결합에 의해 유도되며, 그에 의해 신호 전달 사건, 예컨대 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달 (그러나 이에 제한되지는 않음)을 매개하는 1차 반응을 의미한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현, 예컨대 TGF-베타의 하향조절, 및/또는 세포골격 구조의 재조직화, 클론 확장, 및 별개의 하위세트로의 분화를 매개할 수 있다.
"자극 분자"는 상기 용어가 본원에 사용된 바와 같이, 항원 제시 세포 상에 존재하는 동종체 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "자극 리간드"는 항원 제시 세포 (예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재하는 경우 T 세포 상의 동종체 결합 상대 (본원에서 "자극 분자"로 지칭됨)와 특이적으로 결합하며, 그에 의해 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포에 의한 1차 반응을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 그 중에서도, 펩티드, 항-CD3 항체, 초효능제 항-CD28 항체, 및 초효능제 항-CD2 항체로 로딩된 MHC 부류 I 분자를 포괄한다.
비자극된 면역 세포 (예를 들어, 변형된 비자극된 면역 세포)를 배양하는 것에 관하여 본원에 사용된 용어 "비-확장 조건"은 면역 세포를 자극시키지 않는 배양 조건을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 비자극된 면역 세포에서 자극 반응을 유도할 자극 분자 또는 자극 리간드를 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 사용된 대상체는 포유동물, 예컨대 비-영장류 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류 (예를 들어, 원숭이 및 인간)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "대상체"는 척추동물, 예컨대 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 제한 없이, 인간, 비-인간 영장류, 야생 동물, 야성화 동물, 농장 동물, 경기 동물, 및 애완동물을 포함한다. 면역 반응이 유발될 수 있는 모든 살아있는 유기체는 대상체 또는 환자일 수 있다. 특정 예시적인 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합이 일어나는데 충분한 조건 하에서 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 부분을 정의하는 게놈 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 항원의 제시에 반응하여 T 세포의 활성화에 참여하는 막 단백질의 복합체를 지칭한다. TCR은 주요 조직적합성 복합체 분자에 결합된 항원을 인식하는 것을 담당한다. TCR은 알파 (a) 및 베타 (β) 쇄의 이종이량체로 구성되지만, 일부 세포에서 TCR은 감마 및 델타 (γ/δ) 쇄로 이루어진다. TCR은 구조적으로 유사하지만 별개의 해부학적 위치 및 기능을 갖는 알파/베타 및 감마/델타 형태로 존재할 수 있다. 각각의 쇄는 2개의 세포외 도메인, 가변 및 불변 도메인으로 구성된다. 일부 실시양태에서, TCR은, 예를 들어, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 킬러 T 세포, 및 감마 델타 T 세포를 포함하는 TCR을 포함하는 임의의 세포 상에서 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질환 상태의 억제, 완화, 또는 근절에 의해 수득된다.
본원에 사용된 용어 "요법"은 질환 또는 그와 관련된 증상의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜, 방법 및/또는 작용제 (예를 들어, CAR-T)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "요법들" 및 "요법"은 생물학적 요법 (예를 들어, 입양 세포 요법), 지지적 요법 (예를 들어, 림프구고갈 요법), 및/또는 관련 기술분야의 통상의 기술자, 예컨대 의료인에게 공지된 질환 또는 그와 관련된 증상의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 유용한 다른 요법을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 공정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나 형질도입된 것이다. 세포는 1차 대상 세포 및 그의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법 (고형 종양의 치료에 지정된 CAR-T 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 투여로부터 초래되는, 질환 또는 그와 관련된 증상의 진행, 중증도, 빈도 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "치료하는"은 또한 치료되는 대상체의 질환 과정을 변경시키는 것을 지칭할 수 있다. 치료의 치료 효과는 제한 없이, 질환의 발생 또는 재발을 예방하는 것, 증상(들)의 경감, 질환의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 질환 진행의 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고, 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 세포 내로의 핵산의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예컨대, 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 센다이 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
Cas 엔도뉴클레아제에 관하여 본원에 사용된 용어 "기반한"은 관심의 참조 또는 표적 Cas 엔도뉴클레아제에 비해 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 Cas 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "완전 배지"는 면역 세포 성장 (예를 들어, T 세포 성장)을 위해 최적화된 세포 배양 배지를 지칭한다. 일부 사례에서, 완전 배지는 단백질, 무기 염, 미량 원소, 비타민, 아미노산, 지질, 탄수화물, 시토카인, 및/또는 성장 인자를 포함하며, 여기서 각각의 성분의 비는 세포 성장을 위해 최적화되었다. 예시적인 단백질은 알부민, 트랜스페린, 피브로넥틴, 및 인슐린을 포함한다. 예시적인 탄수화물은 글루코스를 포함한다. 예시적인 무기 염은 나트륨, 칼륨, 및 칼슘 이온을 포함한다. 예시적인 미량 원소는 아연, 구리, 셀레늄, 및 트리카르복실산을 포함한다. 예시적인 아미노산은 필수 아미노산, 예컨대 L-글루타민 (예를 들어, 알라닐-l-글루타민 또는 글리실-l-글루타민); 또는 비-필수 아미노산 (NEAA), 예컨대 글리신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-프롤린, 및/또는 L-세린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완전 배지는 또한 중탄산나트륨 (NaHCO3), HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산), 페놀 레드, 항생제, 및/또는 β-메르캅토에탄올 중 하나 이상을 포함한다. 일부 사례에서, 완전 배지는 혈청-무함유 배지이다. 일부 사례에서, 완전 배지는 생체이물-무함유 배지이다.
본원에 사용된 용어 "화학적으로 정의된 배지"는 모든 성분의 조성 및 농도가 공지된 세포 배양 배지를 지칭한다. 이는 완전 배지가 조성 및/또는 농도가 공지되지 않은 성분, 예를 들어, 동물-유래 성분을 함유할 수 있다는 점에서 완전 배지와는 상이하다.
일부 사례에서, "생체이물-무함유" 배지는 임의의 동물-유래 (비-인간) 성분을 함유하지 않는다. 일부 사례에서, 생체이물-무함유 배지는 하나 이상의 인간-유래 성분, 예컨대 인간 혈청, 성장 인자, 및 인슐린을 함유한다.
일부 실시양태에서, "혈청-무함유" 배지는 혈청 또는 혈장을 함유하지 않지만, 혈청 또는 혈장으로부터 유래된 성분을 함유할 수 있다. 일부 사례에서, "혈청-무함유" 배지는 동물-유래 성분, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유한다.
일부 실시양태에서, "최소" 배지는 표적 세포의 성장을 위한 최소 필요물을 포함한다. 일부 사례에서, 최소 배지는 무기 염, 탄소 공급원, 및 물을 함유한다. 일부 사례에서, 보충물, 시토카인, 및/또는 단백질, 예컨대 알부민 (예를 들어, HSA)은 최소 배지에 첨가된다. 본원에 사용된 보충물은 미량 원소, 비타민, 아미노산, 지질, 탄수화물, 시토카인, 성장 인자, 또는 이들의 조합을 포함한다.
범위: 본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의성 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범주에 대한 비유연한 제한으로 해석되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기재는 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적 수, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
실시예
이들 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 및 본원에서 제공된 청구범위의 범주를 제한하지 않도록 제공된다.
실시예 1 - 변형된 비자극된 T 세포를 제조하기 위한 일반적 벡터-비사용 제조 방법
변형된 비자극된 T 세포를 도 2에 예시된 바와 같은 방법에 기반하여 제조하였다.
간략하게, 비자극된 T 세포를 신선한 백혈구성분채집술 샘플로부터 프로세싱하였다. 백혈구성분채집술로부터의 T-세포 선택을 클리니MACS 프로디지에 의해 제조업체의 프로토콜에 기반하여 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 양성 선택을 위해 CD4 및 CD8 마이크로비드를 사용하여 수행하였다. 이어서 풍부화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 전기천공 완충제에 재현탁시켰다.
TCR 알파 불변 (TRAC) 로커스를 표적화하는 Cas9 엔도뉴클레아제, gRNA, 및 HDR 주형을 인큐베이션하고, 후속적으로 4D 뉴클레오펙터 (론자) 또는 ATx 또는 GTx 전기천공기 (맥스사이트) 중 어느 하나를 사용함으로써 비자극된 T 세포의 집단 내로 형질감염시켰다. Cas9 엔도뉴클레아제, gRNA, 및 HDR 주형의 비는 1:1:1이었다.
형질감염된 T 세포를 후속적으로 약 72시간 동안 배양한 후, 수거하고, -80℃에서 냉동시켰다.
실시예 2 - TRAC -표적화 gRNA를 갖는 CRISPR/Cas9를 사용한 비자극된 T 세포에서의 내인성 TCR 발현의 파괴
CRISPR/Cas9 유전자 편집을 수행하여 비자극된 T 세포에서 TCR 알파 불변 (TRAC) 로커스를 표적화하였다.
2개의 CRISPR/Cas9 리보핵단백질 (RNP) 시스템을 시험하였다: 트루컷.v2 Cas9 (써모피셔 사이언티픽) 및 SpyFi Cas9 (알데브론). RNP 없이 모의 전기천공된 T 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 RNP 복합체로의 전기천공 후 72시간에 CD3 엡실론 및 TCR 알파/베타 발현에 대해 유동 세포계측법에 의해 분석하였다.
도 3a 및 도 3b는 내인성 TCR을 발현하는 세포의 퍼센트가 RNP로 전기천공되지 않은 양성 대조군 세포와 비교하여 트루컷 또는 SpyFi CRISPR/Cas9 RNP 중 어느 하나로 세포에서 유의하게 더 낮음을 예시한다.
공여자 DNA 주형을 도입하여 파괴된 TRAC 로커스 내로의 HDR-매개 삽입을 시험하였다. 단일-가닥 DNA (ssDNA) 울트라머 올리고뉴클레오티드 및 화학적으로 변형된 ssDNA 공여자를 5' 상동성 아암, 및 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹된 EcoRI 제한 부위로 디자인하였다 (도 4). 상동성 아암을 TRAC 로커스에서의 CRISPR/Cas9 커팅 부위의 상류 및 하류에서 상동성을 갖도록 디자인하였다. ssDNA 공여자를 전기천공을 통해 세포 내로 도입하였다. HDR-매개 삽입을 상동성 아암을 포함하는 삽입의 상류 및 하류의 게놈 서열과 함께 또는 없이 시험하고, 프라이머를 그에 대해 디자인하고, 삽입 부위를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭시켰다.
이어서 PCR 산물을 EcoRI과 함께 인큐베이션하고, 생성된 DNA 단편을 분리하고, 아가로스 전기영동을 사용하여 가시화하였다.
도 5는 EcoRI 소화의 결과를 예시한다. 공여자 DNA의 성공적인 삽입은 CRISPR/Cas9 편집 및 EcoRI에 의한 소화 둘 다를 갖는 레인에서의 저분자량 밴드에 의해 지시된다.
실시예 3 - TRAC 로커스 내로 NY-ESO-1 TCR을 코딩하는 공여자 DNA를 삽입하는 넉-인 전략
도 6은 TRAC 로커스 내로의 NY-ESO-1에 대해 특이적인 조작된 TCR의 HDR-매개 삽입을 위한 전략을 예시한다.
전체 TCRα 및 TCRβ (VJ 영역 단독) 쇄를 함유하는 공여자 DNA를 디자인하였다. CRISPR에 의한 TRAC 엑손 1 부위의 절단 후, 탑재물의 둘 다의 측 상의 상동성 아암은 외인성 TCR의 삽입을 허용한다.
자기-절단 펩티드 (T2A 및 P2A)는 번역 후 제거되어 NY-ESO-1 TCR의 전장 TCRα 및 TCRβ 쇄의 구성적 발현을 발생시킨다.
실시예 4 - T 세포 게놈에서의 특이적 로커스 내로의 표적 단백질을 코딩하는 공여자 DNA의 삽입
녹색 형광 단백질 (GFP HDR 카세트)을 코딩하는 DNA 공여자를 디자인하고, T 세포 게놈 내의 특이적 표적화된 영역 내로 삽입하였다. 상기 기재된 바와 같이, GFP 유전자는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다. 도 7은 각각의 반응에 사용된 DNA 공여자의 양에 따른 상이한 백분율에서의 GFP+ T 세포의 검출을 제시한다.
특정 실시양태가 예시되고 기재되었지만, 하기 청구범위에서 한정된 바와 같은 그의 보다 넓은 측면에서의 기술로부터 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상적인 기술에 따라 변화 및 변형이 그에 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에 예시적으로 기재된 실시양태는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는", "포괄하는", "함유하는" 등은 포괄적으로 및 제한 없이 읽혀질 것이다. 추가로, 본원에서 채용된 용어 및 표현은 설명의 관점으로서 사용되었으고, 제한의 관점으로서가 아니며, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 제시되고 기재된 특색 또는 그의 부분의 임의의 등가물을 제외하는 의도가 없지만, 다양한 변형이 청구된 기술의 범주 내에서 가능함이 인식된다. 추가로, 어구 "본질적으로 이루어진"은 구체적으로 나열된 요소 및 청구된 기술의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 요소를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 어구 "이루어진"은 특정되지 않은 임의의 요소를 배제한다.
본 개시내용은 본 출원에 기재된 특정한 실시양태의 관점에서 제한되지 않아야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것인 바와 같이, 많은 변형 및 변동이 그의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다. 본원에 열거된 것들 외에도, 본 개시내용의 범주 내의 기능적으로 등가의 방법 및 조성물은 상기 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 변형 및 변동은 첨부된 청구범위의 범주 내에 해당하는 것으로 의도된다. 본 개시내용은 청구범위가 권리가 있는 등가물의 전체 범주와 함께, 단지 첨부된 청구범위의 관점에 의해서만 제한되어야 한다. 본 개시내용은 물론 다양할 수 있는 특정한 방법, 시약, 화합물, 또는 조성물에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하는 목적을 위한 것이며, 제한적인 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다.
또한, 본 개시내용의 특색 또는 측면이 마쿠시 군의 관점에서 기재되는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 또한 그에 의해 마쿠시 군의 임의의 개별적 구성원 또는 구성원의 하위군의 관점에서 기재됨을 인식할 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 특히 서면의 설명을 제공하는 관점에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 종점을 포함하여 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 그의 하위범위의 조합을 포괄한다. 임의의 열거된 범위는 적어도 동등한 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 나누어지는 동일한 범위를 충분히 기재하고 가능하게 하는 것으로 용이하게 인식될 수 있다. 비-제한적 예로서, 본원에서 논의된 각각의 범위는 하부 1/3, 중간 1/3 및 상부 1/3 등으로 용이하게 나누어질 수 있다. 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, "최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 나열된 수를 포함하고, 상기 논의된 바와 같은 하위범위로 후속적으로 나누어질 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 범위는 각각의 개별적 구성원을 포함한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 허여된 특허, 및 다른 문서는 각각의 개별적 공보, 특허 출원, 허여된 특허, 또는 다른 문서가 그 전문이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 텍스트에 함유된 정의는 이들이 본 개시내용에서의 정의와 모순되는 범위에서는 배제된다.
다른 실시양태는 하기 청구범위에 제시된다.

Claims (48)

  1. 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 제조하는 벡터 비사용 방법으로서,
    (a) 생물학적 샘플로부터 수득된 비자극된 면역 세포의 집단 내로 (i) 유전자-편집 뉴클레아제, (ii) 가이드 RNA, 및 (iii) 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상동성-지정 복구 (HDR) 주형을 형질감염 방법에 의해 전달하고;
    (b) 집단을 비-확장 조건 하에서 약 72시간 이하 동안 배양하는 것
    을 포함하며,
    여기서 유전자-편집 뉴클레아제 및 가이드 RNA는 복합체를 형성하여 적어도 하나의 비자극된 면역 세포 내의 표적 부위에서 이중-가닥 파단을 생성하고,
    여기서 HDR 주형은 표적 부위에서 HDR을 용이하게 하여 집단 내의 적어도 하나의 변형된 비자극된 면역 세포를 생성하는 것인
    방법.
  2. 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 제조하는 벡터 비사용 방법으로서,
    (a) 생물학적 샘플로부터 비자극된 면역 세포의 풍부화된 집단을 수득하고;
    (b) 풍부화된 집단 내로 (i) 유전자-편집 뉴클레아제, (ii) 가이드 RNA, 및 (iii) 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상동성-지정 복구 (HDR) 주형을 형질감염 방법에 의해 전달하고;
    (c) 집단을 비-확장 조건 하에서 배양하는 것
    을 포함하며,
    여기서 유전자-편집 뉴클레아제 및 가이드 RNA는 복합체를 형성하여 집단 내의 복수개의 비자극된 면역 세포 내의 표적 부위에서 이중-가닥 파단을 생성하고,
    여기서 HDR 주형은 표적 부위에서 HDR을 용이하게 하여 복수개의 변형된 비자극된 면역 세포를 생성하고,
    여기서 집단 내의 비자극된 면역 세포의 약 10% 이상이 변형되는 것인
    방법.
  3. 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 생성하는 벡터-비사용 방법으로서,
    (a) 비자극된 면역 세포의 집단의 약 10% 이상에서 상동성-지정 복구 (HDR)를
    (i) 비자극된 면역 세포의 집단을 유전자-편집 뉴클레아제 및 항원-결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상동성-지정 복구 (HDR) 주형과 접촉시키는 것; 및
    (ii) 비자극된 면역 세포 내로 유전자-편집 뉴클레아제 및 HDR 주형을 형질감염 방법에 의해 전달하는 것
    에 의해 유도하고;
    (b) 비자극된 면역 세포를 비-확장 조건 하에서 약 72시간 이하 동안 배양하며, 그에 의해 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 생성하는 것
    을 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    (a) 비자극된 면역 세포의 집단을 가이드 RNA와 접촉시키고, 가이드 RNA를 비자극된 면역 세포 내로 형질감염 방법에 의해 전달하는 것을 추가로 포함하며, 임의로
    (b) 여기서 유전자-편집 뉴클레아제 및 임의로 가이드 RNA는 하나 이상의 비자극된 면역 세포의 게놈 내의 표적 부위에서 이중 가닥 파단을 생성하는 것인
    방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, HDR 주형이 비자극된 면역 세포의 집단의 약 10% 이상에서 표적 부위에서 HDR을 용이하게 하는 것인 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 비자극된 면역 세포의 집단이
    (a) 생물학적 샘플로부터 수득되고/거나;
    (b) CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합의 풍부화된 집단을 포함하는 것인
    방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비자극된 면역 세포의 집단이 약 500만개의 세포, 1000만개의 세포, 2000만개의 세포, 5000만개의 세포, 1억개의 세포, 5억개의 세포, 10억개의 세포, 20억개의 세포, 30억개의 세포, 40억개의 세포, 50억개의 세포 또는 그 초과를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 방법이
    (a) 약 10% 내지 약 99%, 약 12% 내지 약 99%, 약 13% 내지 약 99%, 약 15% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 30% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 80%, 약 12% 내지 약 80%, 약 13% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60%의 효율을 제공하고/거나;
    (b) 약 10%, 12%, 13%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 효율을 제공하는 것인
    방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 하기의 세포 생존율을 제공하는 것인 방법:
    (a) 약 10% 내지 약 99%, 약 12% 내지 약 99%, 약 13% 내지 약 99%, 약 15% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 30% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 80%, 약 12% 내지 약 80%, 약 13% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60%; 및/또는
    (b) 약 10%, 약 12%, 약 13%, 약 15%, 약 18%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 약 1 pM 내지 약 10 mM의 HDR 주형이 비자극된 면역 세포 내로 전달되고/거나;
    (b) 약 1 pM 내지 약 10 mM의 유전자-편집 뉴클레아제가 비자극된 면역 세포 내로 전달되고/거나;
    (c) 약 1 pM 내지 약 10 mM의 가이드 RNA가 비자극된 면역 세포 내로 전달되는 것인
    방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 유전자-편집 뉴클레아제 대 가이드 RNA의 비가 약 10:1, 약 5:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:5, 또는 약 1:10이고/거나;
    (b) HDR 주형 대 유전자-편집 뉴클레아제 및 가이드 RNA 사이에 형성된 복합체의 비가 약 5:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 또는 약 1:5이고/거나;
    (c) HDR 주형 대 유전자-편집 뉴클레아제의 비가 약 5:1, 약 2:1, 1:1, 약 1:2, 또는 약 1:5인
    방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 리보핵단백질 (RNP) 복합체인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 비자극된 면역 세포의 집단이
    (a) 비자극된 T 세포, 비자극된 자연 킬러 (NK) 세포, 비자극된 자연 킬러 T (NKT) 세포, 또는 이들의 조합을 포함하고/거나;
    (b) CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+/CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 비자극된 T 세포를 포함하고/거나;
    (c) CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합의 풍부화된 집단을 포함하는 것인
    방법.
  14. 제2항 또는 제13항에 있어서, 풍부화된 집단이 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 약 100% CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 비자극된 면역 세포의 집단을 생성하기 전에, 생물학적 샘플을 복수개의 CD4 및/또는 CD8 표지된 마이크로비드, 임의로 자기화된 마이크로비드와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 단계가
    (a) 생물학적 샘플을 알부민, 임의로 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함하는 용액과 함께 인큐베이션하는 것; 및/또는
    (b) 집단에서 비자극된 세포를 풍부화하는 세포 선택 공정; 및/또는
    (c) 풍부화된 비자극된 세포를 최소 배지, HSA, 시토카인, 보충물, 또는 이들의 조합을 포함하는 세포 배지에서 인큐베이션하는 것
    을 추가로 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 비자극된 면역 세포가
    (a) 비-확장 조건 하에서 약 48시간 이하, 약 36시간 이하, 약 24시간 이하, 또는 약 18시간 이하 동안 배양되고/거나;
    (b) 비-확장 조건 하에서 약 18시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 또는 약 72시간 동안 배양되고/거나;
    (c) 추가로 동결보존제 용액에 재현탁되고, 극저온-냉동되는 것인
    방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 방법이 하기를 포함하는 것인 방법:
    (a) 전기천공; 또는
    (b) 세포 스퀴징 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 폴리펩티드가
    (a) 항원-결합 도메인을 포함하거나;
    (b) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하거나;
    (c) 세포 표면 수용체 리간드를 포함하거나; 또는
    (d) T-세포 수용체 (TCR)를 포함하고/거나;
    (e) 종양 항원에 결합하는 것인
    방법.
  20. 제19항에 있어서,
    (a) 항원-결합 도메인이 전장 항체 또는 그의 항원-결합 단편, Fab, F(ab)2, 단일특이적 Fab2, 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab2, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 디아바디, 트리아바디, 미니바디, V-NAR, 또는 VhH를 포함하고/거나;
    (b) CAR이 항원-결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며, 임의로 여기서 CAR이 힌지 영역을 포함하는 것인
    방법.
  21. 제20항에 있어서,
    (a) 막횡단 도메인이 인공 소수성 서열, 유형 I 막횡단 단백질의 막횡단 도메인, T 세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, OX40 (CD134), 4-1BB (CD137), ICOS (CD278), CD154, 및 킬러 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR)로부터 유래된 막횡단 도메인으로부터 선택되고/거나;
    (b) 세포내 도메인이 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고/거나;
    (c) 세포내 도메인이 TNFR 슈퍼패밀리에서의 단백질, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), PD-1, CD7, LIGHT, CD83L, DAP10, DAP12, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS (CD278), NKG2C, B7-H3 (CD276)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 공동자극 도메인, 및 킬러 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR)로부터 유래된 세포내 도메인, 또는 그의 변이체 중 하나 이상을 포함하는 것인
    방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (a) 공동자극 도메인이 4-1BB (CD137) 공동자극 도메인을 포함하고/거나;
    (b) 세포내 신호전달 도메인이 인간 CD3 제타 쇄 (CD3ζ), FcγRIII, FcsRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 보유 세포질 수용체, TCR 제타, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d의 세포질 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포내 도메인, 또는 그의 변이체를 포함하고/거나;
    (c) 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB 공동자극 도메인 및 인간 CD3 제타 쇄 (CD3ζ) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인
    방법.
  23. 제22항에 있어서, 세포질 신호전달 도메인이 인간 CD3 제타 쇄 (CD3ζ)를 포함하는 것인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 종양 항원이
    (a) 혈액 악성종양과 연관되고/거나;
    (b) CD19, CD20, CD22, 및 CD33/IL3Ra로부터 선택되고/거나;
    (c) 고형 종양과 연관되고/거나;
    (d) ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, PSCA, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, EGFRvIII, GPC2, TnMUC1, GDNF 패밀리 수용체 알파-4 (GFRa4), 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 및 IL13Ra2로부터 선택되는 것인
    방법.
  25. 제19항에 있어서, TCR이
    (a) TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하고/거나;
    (b) 야생형 TCR, 고친화성 TCR, 및 키메라 TCR로부터 선택되는 것인
    방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, HDR 주형이
    (a) 폴리뉴클레오티드의 상류에 5' 상동성 아암을 추가로 포함하고/거나;
    (b) 폴리뉴클레오티드의 하류에 3' 상동성 아암을 추가로 포함하고/거나;
    (c) 이중-가닥 DNA 주형이고/거나;
    (d) 이중-가닥 DNA 주형이며, 여기서 HDR 주형은 약 2 킬로-염기 쌍 (kb) 내지 약 5 kb, 약 2.3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 4 kb, 약 2.3 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 2.3 kb 내지 약 3 kb, 또는 약 4 kb 내지 약 5 kb의 길이이고/거나;
    (e) 전기천공에 의해 전달되는 것인
    방법.
  27. 제26항에 있어서, 5' 상동성 아암이
    (a) 폴리뉴클레오티드에 인접하고/거나;
    (b) 표적 부위의 5'의 게놈 영역에 상동이고/거나;
    (c) 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50개의 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드의 길이이고/거나;
    (d) 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이인
    방법.
  28. 제27항에 있어서, 3' 상동성 아암이
    (a) 폴리뉴클레오티드에 인접하고/거나;
    (b) 표적 부위의 3'의 게놈 영역에 상동이고/거나;
    (c) 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 400 뉴클레오티드의 길이이고/거나;
    (d) 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 또는 약 500개의 뉴클레오티드의 길이인
    방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 부위가 TRAC 로커스, 및 임의로 TRAC 로커스의 엑손 1에 있는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자-편집 뉴클레아제가 하기를 포함하는 것인 방법:
    (a) Cas 뉴클레아제; 및/또는
    (b) 아연 핑거 뉴클레아제; 및/또는
    (c) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN).
  31. 제30항에 있어서, Cas 뉴클레아제가
    (a) Cas9, 임의로 SpCas9 또는 SaCas9이고/거나;
    (b) 그리고 가이드 RNA가 비자극된 면역 세포 내로의 전달 전에 복합체로 어셈블리되고/거나;
    (c) 그리고 가이드 RNA가 비자극된 면역 세포 내로의 전달 후에 복합체로 어셈블리되는 것인
    방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 가이드 RNA를 비자극된 면역 세포 내로 전달하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이
    (a) 혈액 샘플이고/거나;
    (b) 혈액 샘플이며, 여기서 혈액 샘플은 전혈 샘플, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플, 또는 성분채집술 샘플이고/거나;
    (c) 혈액 샘플이며, 여기서 혈액 샘플은 동결보존된 성분채집술 샘플이고/거나;
    (d) 혈액 샘플이며, 여기서 혈액 샘플은 신선한 성분채집술 샘플인
    방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 변형된 비자극된 면역 세포를 자극시켜 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 생성하고, 임의로
    (b) 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 확장시키는 것
    을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 변형된 자극된 면역 세포의 집단이 확장 조건 하에서 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 또는 그 초과 동안 배양되는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, 자연 킬러 세포, 자연 킬러 T 세포, 대식세포, 단핵구, B 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 변형된 자극된 면역 세포의 집단.
  39. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 변형된 비자극된 면역 세포의 집단, 또는 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 포함하고; 임의로 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  40. 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른, 변형된 비자극된 면역 세포의 집단을 대상체에게 투여하거나; 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 대상체에게 투여하거나, 또는 제39항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 대상체가 암을 갖는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 암이 고형 종양인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 암이 혈액 악성종양인 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 암에 의해 발현되는 항원에 대해 특이적인 것인 방법.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 대상체에 대해 자가인 방법.
  46. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 대상체에 대해 동종이형인 방법.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  48. 제37항의 변형된 비자극된 면역 세포의 집단 또는 제38항의 변형된 자극된 면역 세포의 집단을 포함하는 키트.
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