JP2023540041A - 人工免疫細胞を製造するベクターフリーのプロセス - Google Patents

人工免疫細胞を製造するベクターフリーのプロセス Download PDF

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Abstract

本明細書に開示されるのは、ある実施形態において、人工免疫細胞を製造するベクターフリー方法である。ある実施形態では、また、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法及びプロセスから得られる人工免疫細胞を含む組成物である。 追加の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法及びプロセスから得られる人工免疫細胞を使用する、疾患を治療する方法及びキットである。

Description

・関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月２７日に出願された米国仮出願第６３／０７１，２３６号の優先権利益を主張するＰＣＴ出願であり、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）又は外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲｓ）を発現するように操作されたＴ細胞を用いた新規治療により、いくつかのタイプの癌、主に血液悪性腫瘍(hematologic malignancies)に対する有望な免疫療法が得られている。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞は、特定の腫瘍関連抗原(tumor-associated antigen)を認識し、その後腫瘍細胞を殺すように遺伝的に修飾されたエフェクター免疫細胞である。
これらの細胞の製造には、一般に、Ｔ細胞の刺激、次いで、ＣＡＲ又はＴＣＲをコードする核酸を発現させるためにレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを用いた細胞の形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）が含まれる。レンチウイルスベクター形質導入等の現在のベクター形質導入の１つの限界は、初代Ｔ細胞等の静止細胞に効率的に遺伝子導入を行うことができないことである。これまでの研究で、Ｔ細胞の刺激と拡張により、より分化したＴ細胞の表現型が得られることが示されている。
未分化又は非刺激のＴ細胞集団は、持続性が高く、高い効果をもたらすが、トランスフェクション（transfection）効率は低い。さらに、レンチウイルスベクターを用いた養子治療（adoptive therapies）用のＴ細胞の製造には、細胞を採取して投与用に調合するまでに最大で１０～１２日間を要する。
従って、未分化表現型を保持し、製造時間を減少させながら、外因性免疫受容体をコードする核酸を用いたＴ細胞形質導入の改良された方法に対する必要性が存在する。
本発明は、これらの必要性に対処する方法を提供する。
ある実施形態において、本明細書において開示されるのは、人工（engineered）免疫細胞を製造するベクターフリー（vector-free）方法及びプロセスである。
いくつかの実施形態において、また、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法及びプロセスから得られた人工免疫細胞を含む組成物である。
追加の実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法及びプロセスから得られる人工免疫細胞を用いた疾患を治療する方法及びキットである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているのは、
修飾非刺激免疫細胞集団（modified unstimulated immune cells）を調製するベクターフリーの方法であって、
（ａ）トランスフェクション法により、生物学的サンプルから得られた非刺激免疫細胞集団に、（ｉ）遺伝子編集ヌクレアーゼ、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む相同性指向性修復（homology-directed repair）（ＨＤＲ）テンプレートを送達する工程、及び、
（ｂ）前記集団を非膨張（non-expansion）条件下で約７２時間又はそれ以下培養する工程、
を含み、
前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡは、複合体（complex）を形成し、少なくとも１つの非刺激免疫細胞内の標的部位（target site）に二本鎖切断（double-stranded break）を生成し（generate）及び
前記ＨＤＲテンプレートは、前記標的部位でのＨＤＲを促進し、前記集団内に少なくとも１つの修飾非刺激免疫細胞を生成する、
方法、である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているのは、
修飾非刺激免疫細胞集団を調製するベクターフリーの方法であって、
（ａ）生物学的サンプルから非刺激性免疫細胞の濃縮集団を得る工程、
（ｂ）トランスフェクション法により、（ｉ）遺伝子編集ヌクレアーゼ、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ及び（ｉｉｉ）抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む相同性指向性修復（ＨＤＲ）テンプレートを、前記濃縮集団に送達する工程、及び、
（ｃ）前記集団を非膨張条件下で培養する工程、を含み、
前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成し、前記集団内の複数の非刺激免疫細胞内の標的部位に二本鎖切断を生成し、
前記ＨＤＲテンプレートは、前記標的部位でのＨＤＲを促進し、前記集団内に複数の（a plurality of）修飾非刺激免疫細胞を生成し、及び
前記集団内の約１０％又はそれ以上の前記非刺激免疫細胞が修飾されている、
方法、である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているのは、
修飾非刺激免疫細胞集団を生成するベクターフリーの方法であって、
（ａ）以下により、非刺激免疫細胞集団の約１０％又はそれ以上において相同性指向性修復（ＨＤＲ）を誘導する工程：
（ｉ）前記非刺激免疫細胞集団を、遺伝子編集ヌクレアーゼ及び抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む相同性指向性修復（ＨＤＲ）テンプレートと接触させる工程、及び、
（ｉｉ）トランスフェクション法により、前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及び前記ＨＤＲテンプレートを前記非刺激免疫細胞内に送達する工程、及び、
（ｂ）非膨張条件下で前記非刺激免疫細胞を約７２時間又はそれ以下培養し、それにより前記修飾非刺激免疫細胞集団を生成する工程、
を含む、方法。
いくつかの実施形態において、この方法は、
（ａ）前記非刺激免疫細胞集団をガイドＲＮＡと接触させ、トランスフェクション法により該ガイドＲＮＡを該非刺激免疫細胞に送達する工程、及び、任意に、
（ｂ）前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及び任意に前記ガイドＲＮＡが、１つ又は複数の非刺激免疫細胞のゲノム内の標的部位に二本鎖切断を発生させる工程、
をさらに含み得る。
さらに他の実施形態では、これらの方法において、前記ＨＤＲテンプレートは、前記非刺激免疫細胞集団の約１０％又はそれ以上において、前記標的部位でのＨＤＲを促進する。
さらに、前記非刺激免疫細胞集団は、生物学的サンプルから得られる、及び／又は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はそれらの組み合わせの濃縮集団を含み得る。
いくつかの態様において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、単球（monocytes）、Ｂ細胞、造血幹細胞、又はこれらの組み合わせ、を含む。
いくつかの態様において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、造血幹細胞、又はそれらの組合せ、からなる。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
前記非刺激免疫細胞集団は、例えば、約５００万細胞、１０００万細胞、２０００万細胞、５０００万細胞、１億細胞、５億細胞、１０億細胞、２０億細胞、３０億細胞、４０億細胞、５０億細胞又はそれ以上を含み得る。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
前記トランスフェクション法は、
（ａ）約１０％から約９９％の、約１２％から約９９％の、約１３％から約９９％の、約１５％から約９９％の、約２０％から約９９％の、約３０％から約９９％の、約４０％から約９９％の、約５０％から約９９％の、約６０％から約９９％の、約７０％から約９９％の、約１０％から約８０％の、約１２％から約８０％の、約１３％から約８０％の、約１５％から約８０％の、約２０％から約８０％の、約３０％から約８０％の、約４０％から約８０％の、約５０％から約８０％の、約２０％から約７０％の又は約３０％から約６０％の、効率を提供し得る、及び／又は、
（ｂ）約１０％、１２％、１３％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の効率を提供し得る。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの態様において、
前記方法は、
（ａ）約１０％から約９９％の、約１２％から約９９％の、約１３％から約９９％の、約１５％から約９９％の、約２０％から約９９％の、３０％から約９９％の、約４０％から約９９％の、約５０％から約９９％の、約６０％から約９９％の、約７０％から約９９％の、約１０％から約８０％の、約１２％から約８０％の、約１３％から約８０％の、約１５％から約８０％の、約２０％から約８０％の、約３０％から約８０％の、約４０％から約８０％の、約５０％から約８０％の、約２０％から約７０％の又は約３０％から約６０％の、及び／又は、
（ｂ）約１０％、約１２％、約１３％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９９％の、細胞生存率（cell viability）を提供し得る。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
（ａ）約１ｐＭから約１０ｍＭの前記ＨＤＲテンプレートが、前記非刺激免疫細胞内に送達される、及び／又は、
（ｂ）約１ｐＭから約１０ｍＭの前記遺伝子編集ヌクレアーゼが、前記非刺激免疫細胞内に送達される、及び／又は、
（ｃ）約１ｐＭから約１０ｍＭの前記ガイドＲＮＡが、非刺激免疫細胞内に送達される。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
（ａ）前記ガイドＲＮＡに対する前記遺伝子編集ヌクレアーゼの比は、約１０：１、約５：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：５又は約１：１０であり、及び／又は、
（ｂ）前記遺伝子編集ヌクレアーゼと前記ガイドＲＮＡとの間に形成される複合体に対する前記ＨＤＲテンプレートの比は、約５：１、約２：１、約１：１、約１：２又は約１：５、及び／又は、
（ｃ）前記遺伝子編集ヌクレアーゼに対する前記ＨＤＲテンプレートの比は、約５：１、約２：１、約１：１、約１：２又は約１：５である。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、前記複合体は、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体である。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
前記非刺激免疫細胞集団は、
（ａ）非刺激Ｔ細胞、非刺激ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、非刺激ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又はこれらの組み合わせを含む、及び／又は、
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞又はそれらの組み合わせを含む、非刺激Ｔ細胞を含む、及び／又は、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はそれらの組み合わせの濃縮集団を含む。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
前記濃縮集団が、約９０％、約９５％、約９９％又は約１００％の、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
前記方法は、前記非刺激免疫細胞の集団を生成する前に、複数のＣＤ４及び／又はＣＤ８標識マイクロビーズ、任意で磁化マイクロビーズと共に生物学的サンプルをインキュベートする工程をさらに含む。
別の態様において、
前記ステップがさらに、
（ａ）アルブミン、任意にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液と前記生物学的サンプルをインキュベートする工程、及び／又は、
（ｂ）前記集団中の前記非刺激細胞を濃縮する細胞選択工程（cell selection process）、及び／又は、
（ｃ）前記濃縮非刺激細胞を、最小培地（minimum media）、ＨＳＡ、サイトカイン、サプリメント又はそれらの組み合わせ、を含む細胞培地中でインキュベートする工程、
を含む。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
前記修飾非刺激免疫細胞が、
（ａ）約４８時間若しくはそれ以下、約３６時間若しくはそれ以下、約２４時間若しくはそれ以下又は約１８時間若しくはそれ以下の間、非膨張条件下で培養される、及び／又は、
（ｂ）約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間又は約７２時間、非膨張条件下で培養される、及び／又は、
（ｃ）さらに凍結保存液に再懸濁され、凍結保存される。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
前記トランスフェクション法は
電気穿孔法（electroporation）、又は、
セルスクイーズ法（cell squeezing method）、
を含む。
本明細書に記載の方法のすべてに関するいくつかの実施形態において、
前記抗原結合ポリペプチドは、
（ａ）抗原結合ドメインを含む、
（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、
（ｃ）細胞表面受容体リガンドを含む、又は、
（ｄ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、及び／又は、
（ｅ）腫瘍抗原に結合する。
別の態様において、
（ａ）前記抗原結合ドメインは、全長（full length）抗体又はその抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、単一特異性（monospecific）Ｆａｂ２、二重特異性（bispecific）Ｆａｂ２、三重特異性（trispecific）Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、ミニボディ（minibody）、Ｖ－ＮＡＲ又はＶｈＨを含む、及び／又は、
（ｂ）前記ＣＡＲが、前記抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、任意選択で、該ＣＡＲがヒンジ領域（hinge region）を含む。
さらなる態様において、
（ａ）前記膜貫通ドメインは、人工疎水性配列（artificial hydrophobic sequence）、Ｉ型膜貫通（transmembrane）タンパク質の膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ１５４及びキラー免疫グロブリン様受容体（killer immunoglobulin-like receptor）（ＫＩＲ）に由来する膜貫通ドメインから選択される、及び／又は、
（ｂ）前記細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達（costimulatory signaling）ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、及び／又は、
（ｃ）前記細胞内ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質（proteins in the TNFR superfamily）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）から得られる細胞内ドメイン又はそれらの変異体、からなる群から選択されるタンパク質の共刺激ドメインを１つ又はそれ以上を含む。
さらに別の態様において
（ａ）前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインを含み、及び／又は
（ｂ）前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）の細胞質シグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部（cytoplasmic tail）、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄ、又はそれらの変異体、及び／又は、
（ｃ）前記細胞内シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインとヒトＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
さらに別の態様において、前記細胞質シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）を含む。
抗原結合ポリペプチドが腫瘍抗原に結合する方法において、
前記腫瘍抗原が、
（ａ）血液学的悪性腫瘍に関連し得る、及び／又は、
（ｂ）ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａから選択され得る、及び／又は、
（ｃ）固形腫瘍に関連し得る、及び／又は、
（ｄ）ＲＯＲ１、メソセリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ２、ＴｎＭＵＣ１、ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ－４（ＧＦＲａ４）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びＩＬ１３Ｒａ２から選択され得る。
前記抗原結合ポリペプチドがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含んでいる方法において、
前記ＴＣＲは、
ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含み得る、及び／又は、
野生型ＴＣＲ、高親和性ＴＣＲ及びキメラＴＣＲから選択される。
本明細書に記載された方法のすべてについて、いくつかの実施形態では、
前記ＨＤＲテンプレートが、
（ａ）前記ポリヌクレオチドの上流に５’相同性アームをさらに含むことができる、及び／又は、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの下流に３’相同性アームをさらに含むことができる、及び／又は、
（ｃ）二本鎖ＤＮＡテンプレートであり得る、及び／又は
（ｄ）二本鎖ＤＮＡテンプレートであり得、前記ＨＤＲテンプレートは、約２キロ塩基対（ｋｂ）から約５ｋｂ、約２．３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約４ｋｂ、約２．３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約３ｋｂ、約２．３ｋｂから約３ｋｂ又は約４ｋｂから約５ｋｂまでの長さを有する、及び／又は、
（ｅ）電気穿孔法により送達され得る。
別の態様において、
前記５’相同性アームは、
（ａ）前記ポリヌクレオチドに隣接することができ、及び／又は、
（ｂ）前記標的部位のゲノム領域５’と相同であり得、及び／又は、
（ｃ）約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０から約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドまでの長さであり得、及び／又は、
（ｄ）約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００の長さのヌクレオチドであり得る。
さらに別の態様において、
前記３’相同性アームは、
（ａ）前記ポリヌクレオチドに隣接することができ、及び／又は、
（ｂ）前記標的部位のゲノム領域３’と相同であり得、及び／又は、
（ｃ）約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０から約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドまでの長さであり得、及び／又は、
（ｄ）約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００の長さのヌクレオチドであり得る。
本明細書に記載された方法のすべてについて、いくつかの実施形態では、前記標的部位が、ＴＲＡＣ遺伝子座、及び任意でＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１である。
本明細書に記載された方法のすべてについて、いくつかの実施形態では、
前記遺伝子編集ヌクレアーゼは、
（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ、及び／又は、
（ｂ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（zinc finger nuclease）、及び／又は、
（ｃ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector nuclease）（ＴＡＬＥＮ）、を含む。
別の態様において、
前記Ｃａｓヌクレアーゼは、
（ａ）Ｃａｓ９、任意でＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９であり、及び／又は、
（ｂ）及び前記ガイドＲＮＡは、非刺激免疫細胞に送達する前に複合体に集合する、及び／又は、
（ｃ）前記ガイドＲＮＡは、非刺激免疫細胞に送達された後、複合体に集合する。
本明細書に記載された方法のすべてについて、いくつかの実施形態では、
前記方法は、前記非刺激免疫細胞に、１つ又は複数の追加のガイドＲＮＡを送達する工程をさらに含む。
本明細書に記載された方法のすべてについて、いくつかの実施形態では、
前記生物学的サンプルは、
（ａ）血液サンプルである、及び／又は、
（ｂ）血液サンプルであり、該血液サンプルは、全血（whole blood）サンプル、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル又はアフェレシス（apheresis）サンプルである、及び／又は、
（ｃ）血液サンプルであり、該血液サンプルは、凍結保存されるアフェレシスサンプルである、及び／又は、
（ｄ）血液サンプルであり、該血液サンプルは、フレッシュ（ｆｒｅｓｈ）であるアフェレシスサンプルである。
本明細書に記載された方法のすべてについて、いくつかの実施形態では、前記方法は、前記修飾非刺激免疫細胞を刺激して、修飾刺激免疫細胞集団を生成する工程、及び、任意に、前記修飾刺激免疫細胞集団を拡大する工程を、さらに含む。
別の態様において、
前記修飾刺激免疫細胞集団は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日又はそれ以上、拡大条件下で培養され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法によって生成された修飾非刺激免疫細胞集団である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法によって生成された修飾刺激免疫細胞集団である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法によって生成された修飾非刺激免疫細胞集団又は本明細書に記載の方法によって生成された修飾刺激免疫細胞集団を含み、任意に、薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、それを必要とする対象における疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の方法によって生成された修飾非刺激免疫細胞集団を対象に投与すること若しくは本明細書に記載の方法によって生成された修飾刺激免疫細胞集団を対象に投与すること、又は、修飾非刺激免疫細胞集団若しくは修飾刺激免疫細胞集団を含む組成物を投与すること、を含む。
いくつかの実施形態において、前記対象は、固形腫瘍のような癌を有する。
本明細書に記載の疾患を治療する方法の他の態様において、前記癌は血液悪性腫瘍である。
本明細書に記載の疾患を治療する方法のさらに他の態様において、前記抗原結合ドメインは、前記癌によって発現される抗原に特異的である。
別の態様において、前記生物学的サンプルは、前記対象に対して自己由来（autologous）である。
あるいは、前記生物学的サンプルは、前記対象に対して同種異形（allogeneic）であることができる。
最後に、疾患を処置するすべての方法において、前記対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法から得られる修飾非刺激免疫細胞集団又は本明細書に記載の方法から得られる修飾刺激免疫細胞集団を含むキットである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、
肝臓、皮膚又は膵臓の細胞から選択される修飾非刺激細胞集団を調製するベクターフリーの方法であり、
（ａ）トランスフェクション法により、生物学的サンプルから得られた非刺激細胞集団に、（ｉ）遺伝子編集ヌクレアーゼ、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む相同性指向性修復（ＨＤＲ）テンプレートを送達する工程
（ｂ）前記集団を非膨張条件下で約７２時間又はそれ以下培養する工程を含み、
前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成し、少なくとも１つの非刺激免疫細胞内の標的部位に二本鎖切断を生成し、
前記ＨＤＲテンプレートは、前記標的部位でのＨＤＲを促進し、前記集団内に少なくとも１つの修飾非刺激免疫細胞を生成する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、肝臓、皮膚、又は膵臓の細胞から選択される修飾非刺激細胞集団を調製するベクターフリーの方法であり、
（ａ）生物学的サンプルから非刺激細胞の濃縮集団を得る工程、
（ｂ）トランスフェクション法により、（ｉ）遺伝子編集ヌクレアーゼ、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ及び（ｉｉｉ）抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む相同性指向性修復（ＨＤＲ）テンプレートを、前記濃縮集団に送達する工程、及び、
（ｃ）前記集団を非膨張条件下で培養する工程、を含み、
前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、複合体を形成し、前記集団内の複数の非刺激細胞内の標的部位に二本鎖切断を生成し、
前記ＨＤＲテンプレートは標的部位でのＨＤＲを促進し、複数の修飾非刺激細胞を生成し、前記集団内の約１０％又はそれ以上の非刺激細胞が修飾されている。
いくつかの実施形態において、肝細胞は、肝細胞、肝星状細胞、類洞内皮細胞、及びクッパー細胞のうちの１つ又は複数から選択されてもよい。
いくつかの実施形態において、皮膚細胞は、ケラチノサイト、メラノソーム、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、及びメルケル細胞のうちの１つ又は複数から選択され得てもよい。
いくつかの実施形態において、膵臓細胞は、膵臓アルファ細胞、膵臓ベータ細胞、膵臓デルタ細胞、膵臓ガンマ細胞、及び膵臓イプシロン細胞のうちの１つ以上から選択されてもよい。
前述の概要と、以下の図面説明及び詳細な説明の両方は、例示的及び説明的である。これらは、本開示の更なる詳細を提供することを意図しているが、限定するものとして解釈されるものではない。他の目的、利点、及び新規な特徴は、本開示の以下の詳細な説明から当業者にとって容易に明らかになるであろう。
図１Ａ～１Ｃは、本明細書に記載のベクターフリー製造プロセスの例示的な概略図である。 図１Ａは、人工免疫細胞のベクターフリー製造プロセスの概略を例示する。図１Ｂは、臨床グレードのベクターフリーの人工Ｔ細胞の製造プロセスの概略を例示する。図１Ｃは、同種異形Ｔ細胞製造プロセスの概略図を示す。
図２Ａ及び図２Ｂは、人工Ｔ細胞のベクターフリー製造プロセスに関する例示的な概略図である。図２Ａは、０日目の製造プロセスを詳述し、図２Ｂは、０日目から３日目／採取（Harvest）の製造工程を詳述する。
図 ３Ａ及び３Ｂは、ＴＲＡＣ標的化ｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による非刺激Ｔ細胞における内因性ＴＣＲ発現の破壊を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を、非刺激Ｔ細胞におけるＴＣＲアルファ定数（ＴＲＡＣ）遺伝子座を標的とするために行った。２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）システム（Ｔｒｕｅｃｕｔ．ｖ２ Ｃａｓ９（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＳｐｙＦｉ Ｃａｓ９（Ａｌｄｅｖｒｏｎ））をテストした。図３Ａは、ポジティブコントロール、Ｔｒｕｅｃｕｔ及びＳｐｙＦｉのＣＤ３＋ＴＣＲ＋／生細胞（Live Cells）の％を描写している。図３Ｂは、ポジティブコントロール、Ｔｒｕｅｃｕｔ及びＳｐｙＦｉのＣＤ３＋ＴＣＲ＋／生細胞の割合も示している。
図４は、二本鎖ＤＮＡ切断の相同性指向性修復により、ＥｃｏＲＩ部位を含むドナーＤＮＡをＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１に導入する工程に関する例示的な概略図である。
図５Ａ及びＢは、化学修飾ｓｓＤＮＡドナー又は「ウルトラマー（ultramers）」へのＨＤＲ媒介挿入を示すためにＥｃｏＲＩで消化したＰＣＲアンプリコンのゲル電気泳動画像を示す。
図６は、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲをコードするドナーＤＮＡをＴＲＡＣ遺伝子座に挿入するノックイン戦略（knock-in strategy）を示す例示的な概略図である。
図７は、Ｔ細胞ゲノムへのＧＦＰ ＨＤＲカセットの標的挿入を示す図である。
・詳細な説明
１．概要
ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＣＲ細胞は、がん患者に対してエキサイティングな期待を提供する。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ細胞の製造に関連するいくつかの課題が現在存在し、これらの課題は、これらの癌治療薬の成功の可能性に影響を与える。
まず、現在のＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲの製造プロセスでは、一般的に増殖（propagation）にウイルスベクターシステムが利用されている。しかし、このタイプの増殖方法を使用すると、細胞採取前に約９日間の期間が生じる。
本開示は、ＣＡＲ－Ｔ及び／又はＴＣＲ細胞採取までの時間を劇的に短縮し、例えば、約７２時間又はそれ未満に短縮する驚くべきベクターフリーの方法を詳述する。
現在の技術に存在し、本開示によって対処される第２の課題は、生産をスケールアップする必要性である。
本開示は、大規模生産であっても、許容可能な挿入効率で驚くほどスケールアップ可能なベクターフリープロセスを詳述する。特に、短いプロセス時間は、プロセスをスケールアップする能力に影響を与える。
したがって、大規模生産レベルで行うことができ、高い割合の挿入効率を有する、短いＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ製造プロセスを設計することができることは驚くべきことであった。
本開示の別の驚くべき態様は、刺激細胞対非刺激細胞の培養の影響である。一般に、挿入効率は刺激細胞の方が高いが、製造工程は非刺激細胞の方が簡単である。一つの問題は、培地間で細胞を移動させると、高い細胞損失が生じることである。
さらに、未分化細胞の使用は、複数の異なる非刺激免疫細胞集団、例えば、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、異なる、均一ではない特性を有する細胞）をもたらすことができるため、より良い製品を製造することができる。
本明細書に記載の方法は、刺激細胞（より高い挿入効率を生じる）又は非刺激細胞（より分化していない、より強力な表現型（phenotypes）を有する最終生成物を生じることができる）を用いて使用することができる。
これらの利点及び発見は、以下により詳細に説明される。
ＩＩ．人工免疫細胞の製造方法
ある実施形態において、本明細書に開示されるのは、修飾免疫細胞又はその前駆体細胞（例えば、修飾Ｔ細胞、修飾ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、修飾ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、修飾マクロファージ、修飾単球、修飾Ｂ細胞又は修飾造血幹細胞）を調製する方法である。）
いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞又はその前駆細胞は、外因性抗原結合ポリペプチドを発現する修飾非刺激免疫細胞又はその前駆細胞（例えば、修飾非刺激Ｔ細胞、修飾非刺激ＮＫ細胞、修飾非刺激ＮＫＴ細胞、修飾非刺激マクロファージ、修飾非刺激単球、修飾非刺激Ｂ細胞、又は修飾非刺激造血幹細胞）である。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又は外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含んでなる。
いくつかの実施形態では、前記抗原結合ポリペプチドは、抗原結合ドメイン、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原に結合するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の規制に準拠した、又は外国の管轄区域における米国ＦＤＡの同等物に準拠した、適正製造基準（ＧＭＰ）法である。
いくつかの実施形態において、人工細胞の製造方法は、免疫細胞に限定されず、肝臓、皮膚、及び膵臓からの哺乳動物細胞をさらに含む。
本明細書に記載される免疫細胞に適用可能であるとして援用されるあらゆる方法は、肝臓、皮膚、及び膵臓からの細胞にもさらに適用可能である。
いくつかの実施形態において、肝臓、皮膚、及び膵臓からの細胞は、刺激に供されない。
いくつかの実施形態において、肝細胞は、肝細胞、肝星状細胞、類洞内皮細胞、及びクッパー細胞のうちの１つ又は複数から選択され得る。
いくつかの実施形態において、皮膚細胞は、ケラチノサイト、メラノソーム、メラノサイト、ランゲルハンス細胞及びメルケル細胞のうちの１つ又は複数から選択され得る。
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、膵臓アルファ細胞、膵臓ベータ細胞、膵臓デルタ細胞、膵臓ガンマ細胞、及び膵臓イプシロン細胞のうちの１つ又は複数から選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、人工若しくは修飾免疫細胞又はその前駆体細胞を調製する製造方法が、図１Ａに示されている。
図１に示すように、生物学的サンプル１０１は、細胞分離システム(cell separation system)を通して処理され(processed)、濃縮非刺激免疫細胞１０２（例えば、濃縮非刺激ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が生成する。
次に、前記濃縮非刺激免疫細胞１０２（例えば、濃縮された非刺激ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）は、遺伝子編集システム及びテンプレート（例えば、ＨＤＲテンプレート）でトランスフェクトされ、続いて最大約７２時間培養され、修飾非刺激免疫細胞１０３（例えば、修飾非刺激ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が生成する。
次いで、前記修飾非刺激免疫細胞１０３は、凍結保存され、凍結保存修飾非刺激免疫細胞１０４が生成する。任意に、前記修飾非刺激免疫細胞１０４は、修飾刺激免疫細胞１０５を生成するために、最大約１０日から約１２日間刺激され、拡張され得る。
前記修飾刺激免疫細胞１０５はさらに、凍結保存された修飾刺激免疫細胞１０６を生成するために凍結保護することができる。
いくつかの実施態様において、前記製造方法は、修飾免疫細胞又はその前駆細胞を調製するベクターフリーの製造方法である。また、臨床グレードの人工Ｔ細胞及び同種異形Ｔ細胞のベクターフリーの製造プロセスの概略をそれぞれ示す図１Ｂ及び図１Ｃを参照されたい。
場合によって、前記製造方法は、トランスフェクションの効率、修飾非刺激若しくは刺激免疫細胞の収率、細胞生存率又はそれらの任意の組み合わせを改善する。
Ａ．非刺激性免疫細胞の選択と濃縮
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の非刺激免疫細胞は、非刺激Ｔ細胞である。
前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、又はＮＫＴ細胞であり得る。 例示的な実施形態では、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、非刺激免疫細胞の集団は、対象からの生物学的サンプル、例えば、対象からの組織、流体、又は他のサンプルから採取される。
いくつかの実施形態では、前記生物学的サンプルは、組織又は器官サンプル、例えば、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、頸部、精巣、卵巣、扁桃、脾臓、リンパ節若しくは腫瘍組織又はそれらに由来する細胞である。
いくつかの実施形態では、前記生物学的サンプルは、流体サンプル、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿又は汗のサンプルである。
いくつかの実施形態では、前記生物学的サンプルは、血液サンプルであり、任意選択で、全血サンプル、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル又はアフェレシスサンプルから選択される。
いくつかの実施形態において、サンプルは、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類又はブタのような異種起源からのものである。
いくつかの実施形態では、前記生物学的サンプルは、患者からのアフェレシスサンプルである。
いくつかの実施形態では、前記アフェレシスサンプルは、白血球サンプルである。
いくつかの実施形態では、前記アフェレシスサンプル（例えば、白血球サンプル）は、免疫細胞又は免疫細胞の集団の採取の前に凍結保存される。
いくつかの実施形態では、前記アフェレシスサンプル（例えば、白血球サンプル）は、凍結保存されていない患者からの新鮮なアフェレシスサンプルである。
いくつかの実施形態では、前記免疫細胞又は免疫細胞集団は、濃縮ステップを含むプロセス又はプロトコル（protocol）の間にアフェレシスサンプル（例えば、白血球サンプル）から得られる。
いくつかの実施形態では、非刺激免疫細胞、特に非刺激Ｔ細胞集団は、１つ又は複数の選択ステップ、例えば、１つ以上の枯渇ステップ（例えば、非免疫細胞又は非Ｔ細胞の除去）において単離（isolated）及び濃縮される。
いくつかの例において、前記単離ステップは、サイズ、密度、特定の試薬に対する感受性又は耐性、及び／又は抗体又は他の結合パートナーに対する親和性、例えば免疫親和性等の１つ又は複数の特性に基づく分離を含む、１つ又は複数の分離ステップをさらに含む。
いくつかの態様において、前記単離は、単一のプロセスストリーム（process stream）において同じ装置（apparatus）又は機器（equipment）を順次使用して、及び／又は同時に実施される。
いくつかの態様において、前記異なる集団の単離、培養、及び／又は操作（engineering）は、同じ出発組成物又は材料から、例えば同じサンプルから実施される。
いくつかの態様において、非刺激免疫細胞集団は、閉鎖システム又は装置において、及び／又は同じ容器（vessel）若しくは容器セット、例えば同じ（又は同じセットの）ユニット、チャンバー、カラム、例えば、磁気分離カラム、チューブ、チューブセット、培養若しくは栽培チャンバー、培養容器、処理ユニット（processing unit）、細胞分離容器、遠心分離チャンバーにおいて隔離される。
例えば、いくつかの場合によって、前記非刺激免疫細胞集団の分離は、例えば、細胞集団、組成物又は懸濁液を１つの容器、例えばチューブセットから別の容器に移す必要なく、例えば単一のカラム又はカラムのセット、及び／又は同一のチューブ、又はチューブセット等の単一又は同一の単離（isolation）又は分離（separation）容器又は容器セットを採用するシステム又は装置で実施される。
いくつかの実施態様では、同時又は連続的な選択を採用することにより、複数の異なる非刺激免疫細胞集団、例えばＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞が、選択、濃縮及び／又は単離される。
いくつかの実施形態において、前記分離ステップは、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー、又は核酸等の、細胞内の１つ又は複数の特定の分子の発現又は存在に基づく、異なる細胞タイプの分離を含む。
いくつかの実施形態では、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の既知の方法を使用することができる。
いくつかの実施形態では、前記分離は、親和性又は免疫親和性ベース（immunoaffinity-based）の分離である。
例えば、いくつかの態様における前記分離は、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体又は結合パートナーとのインキュベーションによる、１つ又は複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞の発現又は発現レベルに基づく細胞及び細胞集団の分離、次いで、一般に洗浄ステップ及び抗体又は結合パートナーに結合した細胞と、抗体又は結合パートナーに結合しなかった細胞からの分離が続く。
このような分離ステップは、前記試薬に結合した前記非刺激免疫細胞をさらなる使用のために保持するポジティブ選択、及び／又は抗体又は結合パートナーに結合していない前記細胞を保持するネガティブ選択に基づくことができる。
いくつかの例では、両方のフラクションがさらなる使用のために保持される。


いくつかの態様において、ネガティブ選択は、異種集団における細胞タイプを特異的に同定する抗体が利用できない場合に特に有用であり、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて分離を行うのが最適であるように思われる。
分離は、特定の細胞集団又は特定のマーカーを発現する細胞の１００％濃縮又は除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現しているような特定のタイプの細胞のポジティブ選択又は濃縮は、そのような細胞の数又はパーセントを増加させることを意味するが、マーカーを発現していない細胞の完全な不在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現しているような特定のタイプの細胞のネガティブ選択、除去、又は枯渇は、そのような細胞の数又は割合を減少させることを意味するが、そのような細胞全ての完全な除去をもたらす必要はない。
例えば、いくつかの態様において、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団の選択は、当該集団を濃縮するが、他の非選択細胞のいくつかの残留又は小パーセントを構成することも可能である。そのような例では、他の非選択細胞の残留割合は、約１０％未満、若しくは、に等しい、約９％未満、若しくは、に等しい、約８％未満、若しくは、に等しい、約７％未満、若しくは、に等しい、約６％未満、若しくは、に等しい、約５％未満、若しくは、に等しい、約４％未満、若しくは、に等しい、約３％未満、若しくは、に等しい、約２％未満、若しくは、に等しい、約１％未満、若しくは、に等しい、約０．５％未満、若しくは、に等しい、若しくは約０．１％未満、若しくは、に等しい、又は、それら未満としてもよい。
いくつかの例では、分離ステップの複数のラウンド(round)を実施することができ、あるステップからのポジティブ又はネガティブに選択された画分は、その後のポジティブ又はネガティブに選択するような別の分離ステップに供される。
いくつかの例では、ネガティブセレクションの対象となるマーカーにそれぞれ特異的な複数の抗体または結合パートナーと細胞をインキュベートすること等により、単一の分離ステップで、複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇させることができる。同様に、複数の細胞タイプは、様々な細胞タイプを発現する複数の抗体又は結合パートナーと細胞をインキュベートすることによって、同時にポジティブの選択を行うことができる。
いくつかの実施形態では、ポジティブ又はネガティブ選択による非刺激Ｔ細胞集団の選択及び濃縮は、例えば、ポジティブ又はネガティブ選択された細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせで達成することができる。
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテル（cocktail）は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒα）、及び／又はＣＤ１３２に対する抗体を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、及び／又はＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒα）に対する抗体を含む。
追加の実施形態では、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２７、及び／又はＴＣＲに対する抗体を含む。
いくつかの実施形態において、ネガティブ選択によりＣＤ４－及びＣＤ８－細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、及び／又はＨＬＡ－ＤＲに対する抗体を含む。
いくつかの実施形態では、前記方法は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の別個の選択を含んでいる。
いくつかの態様において、前記方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する第１のポジティブ選択を含み、その際、第１の選択からの非選択細胞（ＣＤ４－細胞）が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮する第２のポジティブ選択のための細胞源として使用される。
他の態様において、前記方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する第１のポジティブ選択を含み、その際、第１の選択からの非選択細胞（ＣＤ８－細胞）が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮する第２の位置選択のための細胞源として使用される。
いくつかの実施形態では、前記方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の同時選択を含む。
いくつかの態様において、前記方法は、ポジティブ選択を含み、その際、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が選択され、その後ＣＤ４－及びＣＤ８－細胞が除去される。
いくつかの実施形態では、細胞表面マーカー又はマーカーの発現に基づくポジティブ又はネガティブ選択、例えば、上述の方法のいずれかによって、非刺激免疫細胞を単離、選択、及び／又は濃縮する方法は、免疫親和性に基づく選択を含み得る。
いくつかの実施形態において、免疫親和性ベースの選択は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を含む初代ヒトＴ細胞等の細胞を含むサンプルを、細胞表面マーカー又はマーカーに特異的に結合する抗体又は結合パートナーに接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又は結合パートナーは、ポジティブ及び／又はネガティブ選択のための細胞の分離を可能にするために、球体又はビーズ、例えばマイクロビーズ、アガロースを含むナノビーズ、磁気ビーズ又は常磁性ビーズ等の固体支持体又はマトリックスに結合する。
いくつかの実施形態では、前記球体又はビーズは、免疫親和性クロマトグラフィーを実現するためにカラムに充填することができ、この場合、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を含む初代ヒトＴ細胞等の細胞を含むサンプルは、カラムのマトリックスと接触し、続いてそこから溶出又は放出される。
いくつかの態様において、分離すべき非刺激免疫細胞のサンプル又は組成物は、磁気応答性粒子又は微粒子、例えば常磁性ビーズ等の、小型で磁化可能な又は磁気応答性材料とインキュベートされる。
前記磁気応答性材料、例えば、粒子は、一般に、分離することが望まれる細胞（cell）、細胞（cells）若しくは細胞集団上に存在する分子、例えば、表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば、抗体に直接又は間接的に付着している、例えば、ネガティブ又はポジティブの選択をすることが望まれるものである。
このようなビーズは知られており、いくつかの態様において、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＭＡＣＳ（登録商標）ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）又はＳＴＲＥＰＴＡＭＥＲ（登録商標）ビーズ試薬（ＩＢＡ、ドイツ）を含む種々のソースから商業的に入手可能である。
インキュベーションは、一般に、前記磁性粒子又はビーズに付着している抗体又は前記結合パートナー、又はそのような抗体又は結合パートナーに特異的に結合する二次抗体又は他の試薬等の分子が、サンプル内の細胞上に存在すれば細胞表面分子に特異的に結合するような条件下に行われる。
いくつかの態様において、前記サンプルは磁場に置かれ、それに付着した磁気応答性又は磁化可能な粒子を有するそれらの細胞は、磁石に引き寄せられ、標識されていない細胞から分離されるであろう。ポジティブ選択では、磁石に引き寄せられる細胞が保持され、ネガティブ選択では、引き寄せられない細胞（非標識細胞）が保持される。
いくつかの態様では、ポジティブ選択とネガティブ選択の組み合わせが同じ選択ステップ中に行われ、ポジティブ画分とネガティブ画分が保持され、さらに処理されるか、さらなる分離ステップに供される。
いくつかの実施形態では、前記親和性ベース選択は、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．）を介して行われる。
前記磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）システムは、磁化された粒子が付着した細胞を高純度で選択することが可能である。
ある実施形態では、ＭＡＣＳは、外部磁場の印加後に非標的種及び標的種が順次溶出されるモードで動作する。すなわち、磁化された粒子に付着した細胞は、付着していない種が溶出される間、その場に保持される。そして、この最初の溶出ステップが完了した後、磁場に捕捉されて溶出が阻止された種は、溶出及び回収できるように何らかの方法で解放される。ある実施形態では、非標的細胞は標識され、細胞の不均一な集団から枯渇する。
いくつかの実施形態では、ビーズ又は他の表面に関連する（associated）又はコーティングされた細胞表面マーカーを特異的に結合する抗体は、全長抗体であるか、又はその抗原結合フラグメントであり、（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、抗原を特異的に結合できる可変重鎖（ＶＨ）領域、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む単鎖抗体フラグメント及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ｎａｎｏｂｏｄｙ）フラグメントである。
いくつかの実施形態では、前記抗体は、Ｆａｂフラグメントである。
いくつかの実施形態では、前記抗体は、一価、二価又は多価であり得る。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ等の抗体は、多量体である。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ多量体等の抗体は、細胞表面マーカーと多価の複合体を形成する。
ポジティブ選択又はネガティブ選択による非刺激免疫細胞の所望の集団の単離のために、細胞及び表面（例えば、ビーズのような粒子）の濃度を変化させることができる。
ある態様では、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を大幅に減少させる（例えば、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。
例えば、１つの態様では、１００億細胞／ｍｌ、９０億細胞／ｍｌ、８０億細胞／ｍｌ、７０億／ｍｌ、６０億／ｍｌ、又は５０億／ｍｌの濃度が使用される。
一態様では、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。
別の一態様では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度が使用される。
さらなる態様において、１億２５００万細胞／ｍｌ又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。
いくつかの実施形態では、非刺激免疫細胞の分離及び濃縮は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを使用するような自動化システムを使用して実施される。
いくつかの態様において、前記方法は、滅菌された非発熱性(non-pyrogenic )溶液中で供給される抗体結合磁化可能粒子を使用する。
いくつかの実施形態において、磁性粒子で細胞を標識した後、細胞を洗浄して余分な粒子を除去する。次に、細胞調製バッグがチューブセットに接続され、このチューブセットは、バッファーを含むバッグ及び細胞収集バッグに接続される。前記チューブセットは、プレカラム（pre-column）と分離カラム(separation column)を含む、あらかじめ組み立てられた滅菌済チューブで構成されており、１回のみ使用できる。分離プログラムを開始すると、システムは自動的に細胞サンプルを分離カラムに適用します。ラベル付けされた細胞は前記カラム内に保持され、ラベル付けされていない細胞は一連の洗浄ステップによって除去される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用するための前記細胞集団は、非標識であり、前記カラム内に保持されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法と共に使用するための前記細胞集団は、標識されており、前記カラム内に保持される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法と共に使用するための前記細胞集団は、磁場の除去後に前記カラムから溶出し、前記細胞収集バッグ内に収集される。
いくつかの実施形態では、非刺激免疫細胞の分離及び濃縮は、ＬＯＶＯ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ）等の濾過システムと組み合わせたＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）システム等の自動システムを使用して実施される。）
いくつかの実施態様において、非刺激免疫細胞は、回転膜濾過ステップにおいて上澄みから分離される。特に、あるカットオフ範囲、例えば＜４μｍの細胞は、上清とともに膜孔を通過して除去されるが、４μｍを超える細胞はフィルターチャンバー内に保持され、その後、採取される。採取細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｌｕｓシステムを通じてさらに処理される。
いくつかの実施形態では、分離及び濃縮ステップは、遠心分離による細胞の自動洗浄及び分画を可能にする細胞処理ユニットを備えたシステムを使用して実施される。
いくつかの態様において、前記分離及び濃縮ステップは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実施される。細胞処理ユニットを有するシステムは、搭載されたカメラと、細胞産物源の巨視的な層を判別することによって最適な細胞分画終点（endpoint）を決定する画像認識ソフトウェアとを含むこともできる。例えば、末梢血は、赤血球層、白血球層、血漿層に自動的に分離される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム等の細胞処理システムは、例えば、細胞の分化及び拡大、抗原の装填、並びに長期細胞培養等の細胞培養プロトコルを達成する統合（integrated）細胞培養チャンバーを含むこともできる。入力ポートは、培地の滅菌的な除去及び補充を可能にし、細胞は、統合顕微鏡を使用して監視され得る。例えば、Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82及び Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体流で運ばれるフローサイトメトリー（flow cytometry）を介して収集され、濃縮（又は枯渇）される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、分取スケール（preparative scale)（ＦＡＣＳ）－ソーティング(sorting）を介して収集され、濃縮される（又は枯渇する）。ある実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、ＦＡＣＳベースの検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップの使用によって収集及び濃縮（又は枯渇）される（例えば、WO2010/033140, Cho et al., Lab Chip, 10:1567-1573 (2010)及び Godin et al., J. Biophoton., 1(5):355-376 (2008)を参照されたい）。
いずれの場合も、細胞を複数のマーカーで標識することができ、高純度で十分に定義されたＴ細胞サブセット（subset）の単離が可能である。
いくつかの実施形態では、非刺激免疫細胞の分離及び濃縮は、サイズ及び密度の両方に基づき細胞を分離及び精製するエルトリエーションシステム（elutriation system）を使用して実施される。

ある実施態様では、流体は、分離チャンバー内の遠心場内に設けられた非刺激免疫細胞層を通過する。遠心場と反対方向に流体の流れを変えることで、システムはサイズと密度に応じた粒子を整列させ収集する。
いくつかの実施形態では、溶出システムは、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ社のＥＬＵＴＲＡ又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社のＲＯＴＥＡである。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の分離及び濃縮ステップの間、非刺激免疫細胞は、細胞培地中でインキュベートされる。
いくつかの実施態様では、前記細胞培地は、完全な（complete)細胞培地である。
いくつかの実施態様では、前記細胞培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）ベースの培地、例えば、約１％～約１０％のＦＢＳを含む。
いくつかの実施態様では、前記細胞培地は、化学的に定義された培地である。
いくつかの実施態様では、前記細胞培地は、最小培地である。分離及び濃縮ステップ中に非刺激免疫細胞をインキュベートするための例示的な培地としては、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳバッファーが挙げられるが、これらに限定はされない。
いくつかの実施態様において、前記細胞培地は、培養された非刺激免疫細胞と相互作用することなく培養容器の内面を被覆するタンパク質をさらに含んでなる。
いくつかの実施態様において、前記培地は、約０．１％～約５％ｗ／ｖ又は約０．５％～約２％ｗ／ｖのタンパク質を含む。
いくつかの態様において、前記培地は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％又は約１％ｗ／ｖのタンパク質を含む。
いくつかの態様において、前記タンパク質は、単離された組換えタンパク質又はそのフラグメントである。
いくつかの実施態様において、前記タンパク質は、操作されたデノボポリペプチド（de novo polypeptide）である。
いくつかの態様において、前記タンパク質は、天然に存在するタンパク質又はそのフラグメントである。
いくつかの態様において、前記タンパク質は、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン又はＨＳＡ）である。
いくつかの実施態様において、前記培地は、約０．１％から約５％ｗ／ｖ又は約０．５％から約２％ｗ／ｖのアルブミン（例えば、ＨＳＡ）を含む。
いくつかの実施態様において、前記培地は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％又は約１％ｗ／ｖのアルブミン（例えばＨＳＡ）を含む。
いくつかの態様において、アルブミン（例えば、ＨＳＡ）は、全長アルブミンである。
他の態様では、アルブミン（例えば、ＨＳＡ）は、例えば、シグナル伝達ペプチドを含まない、そのフラグメントである。
いくつかの実施形態では、上述の分離及び濃縮ステップの１つまたは複数から収集された前記非刺激免疫細胞は、細胞培地中に再懸濁される。
いくつかの実施態様では、前記細胞培地は、完全な細胞培地、任意選択で完全な無血清及びゼノフリー（Xeno-free）培地である。
いくつかの実施態様において、前記培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）ベースの培地、例えば、約１％から約１０％のＦＢＳを含む。
いくつかの実施態様において、前記細胞培地は、化学的に定義された培地である。
いくつかの実施態様では、前記細胞培地は、最小培地である。
いくつかの実施態様では、前記細胞培地は、Ｔ細胞サプリメント、ヒト血清、ＩＬ－７及び／又はＩＬ－１５等の１つ又は複数のサイトカイン、又はそれらの組合せを更に含む。
いくつかの実施態様では、前記Ｔ細胞サプリメントは、約２．４％ｖ／ｖの最終濃度で培地に含まれる。
いくつかの実施態様では、前記ヒト血清は、約５％の最終濃度で培地中に含まれる。
いくつかの実施態様では、前記培地は、Ｌ－グルタミン又はＬ－グルタミン代替物（例えば、Ｌ－アラニン－Ｌ－グルタミン）を、任意に約２ｍＭの最終濃度で含む。
いくつかの実施態様において、前記培地は、約５ｎｇ／ｍＬの最終濃度でＩＬ－７を含む。
いくつかの実施態様では、前記培地は、約５ｎｇ／ｍＬの最終濃度でＩＬ－１５を含む。
いくつかの実施態様では、前記細胞培地は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＣＴＳ（登録商標） ＯＰＴＭＩＺＥＲ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標） Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、又はそれらの組合せを含む。
いくつかの実施態様において、非刺激免疫細胞の分離及び濃縮ステップは、約２℃～約４０℃の温度で実施される。
いくつかの実施態様において、前記分離及び濃縮ステップは、約２℃から約３７℃、約２℃から約３５℃、約２℃から約３３℃、約２℃から約３０℃、約２℃から約２８℃、約２℃から約２６℃、約２℃から約２５℃、約２℃から約２０℃、約２℃から約１８℃、約２℃から約１５℃、約２℃から約１０℃、約２℃から約８℃、約４℃から約３７℃、約４℃から約３５℃、約４℃から約３３℃、約４℃から約３０℃、約４℃から約２８℃、約４℃から約２６℃、約４℃から約２５℃、約４℃から約２０℃、約４℃から約１８℃、約４℃から約１５℃、約４℃から約１０℃、約４℃から約８℃、約２０℃から約３７℃、約２０℃から約３５℃、約２０℃から約３３℃、約２０℃から約３０℃、約２０℃から約２８℃、約２０℃から約２６℃、約２０℃から約２５℃、約２２℃から約２５℃、約２２℃から約２８℃、約２４℃から約３０℃、約２４℃から約２８℃、又は約２５℃から約３０℃の温度範囲で実施される。
いくつかの態様において、前記分離及び濃縮ステップは、約２℃から約８℃の温度で実施される。
いくつかの態様において、前記分離及び濃縮は、約４℃の温度で実施される。
いくつかの実施形態では、前記非刺激免疫細胞は、自己免疫細胞である。
他の実施形態では、非刺激免疫細胞は同種異形免疫細胞である。
いくつかの実施形態では、前記非刺激免疫細胞集団は、複数のＴ細胞、任意に複数のＣＤ４＋Ｔ細胞、複数のＣＤ８＋Ｔ細胞又はそれらの組合せを含む。
いくつかの実施態様では、前記免疫細胞集団におけるＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約２：１、約３：１又は約４：１である。
いくつかの実施態様では、免疫細胞の集団におけるＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、約１：１である。
いくつかの実施態様において、前記免疫細胞集団におけるＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、約１：２である。
いくつかの実施態様では、前記免疫細胞集団におけるＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、約２：１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、約５０００万から約５００億個の濃縮非刺激免疫細胞、任意で約５０００万から約１０億、約１億から約５０億、約１０億から約１００億又は約１０億から約５００億個の細胞を産生する。
いくつかの実施態様では、濃縮された非刺激免疫細胞は、約５０から５００ｍＬの生物学的サンプルの出発サンプルから得られる。
いくつかの実施形態では、前記非刺激免疫細胞の濃縮集団は、約７５％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はそれらの組合せを含む。
Ｂ．遺伝子編集された非刺激の免疫細胞
ある実施形態では、非刺激免疫細胞（例えば、非刺激Ｔ細胞）が、遺伝子編集システムによって修飾される。
いくつかの実施形態では、前記非刺激免疫細胞は、１つ又は複数の内因性発現遺伝子の発現を破壊するように遺伝子編集される。
いくつかの実施形態では、前記非刺激免疫細胞は、内因性受容体（例えば、内因性Ｔ細胞受容体）の発現の減少、欠失、排除、ノックアウト（knockout）又は破壊を有する。
いくつかの実施形態において、前記非刺激免疫細胞は、内因性遺伝子座に挿入された外因性免疫受容体（例えば、ＣＡＲ又はＴＣＲ）を有する。
いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子座は、ＴＲＡＣである。
ある実施形態では、非刺激免疫細胞は、内因性ＴＣＲ遺伝子生成物（例えば、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣの遺伝子生成物）の発現を破壊するように遺伝学的に編集される。
いかなる理論にも拘束されることなく、ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣの発現を破壊することは、１）内因性ＴＣＲと外因性ＴＣＲとのミスペア（mispairing）が減少し、したがって自己反応性のリスクが減少する、及び２）内因性ＴＣＲとのミスペアが減少することによって細胞表面上の外因性ＴＣＲ発現が増強され、したがって修飾細胞の有効性が増加する。
いくつかの実施形態において、非刺激免疫細胞は、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座を破壊し、外因性抗原結合免疫受容体を挿入する遺伝子修飾を含む。
いくつかの実施形態において、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座を破壊するための前記遺伝子修飾は、ＴＲＡＣのエクソンにある。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子修飾は、ＴＲＡＣのイントロンにある。
いくつかの実施形態において、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座を破壊するための前記遺伝子修飾は、ＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１内にある。
いくつかの実施形態において、前記外因性抗原結合免疫受容体は、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態では、前記外因性抗原結合免疫レセプターは、ＴＣＲである。
いくつかの態様において、前記遺伝子編集システムは、クラスタ化規則的インタースペル化短回文核酸（clustered regularly interspersed short palindromic nucleic acid）（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステム等のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含む。ＣＲＩＳＰＲシステム（本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｃａｓシステム又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとも呼ばれる）は、細胞への導入後にＣａｓエンドヌクレアーゼが標的遺伝子に切断（例えば、二本鎖切断）を導入できる複合体を形成する、標的遺伝子に特異なＣａｓエンドヌクレアーゼ及びガイド核酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含む。
いくつかの実施態様において、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、例えば、S. pyogenes（例えば、ＳｐＣａｓ９）、S.thermophiles、Staphylococcus aureus(例えば、ＳａＣａｓ９）又はNeisseria meningitidesのＣａｓ９分子に由来するか又はこれらに基づいている。
いくつかの実施態様において、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、例えば、Acidovorax avenae、Actinobacillus pleuropneumoniae、Actinobacillus succinogenes、Actinobacillus suis、Actinomyces sp.、cycliphilus denitrificans、Aminomonas paucivorans、Bacillus cereus、Bacillus smithii、Bacillus thuringiensis、Bacteroides sp.、Blastopirellula marina、Bradyrhiz obium sp.、Brevibacillus latemsporus、Campylobacter coli、Campylobacter jejuni、Campylobacter lad、Candidatus Puniceispirillum、Clostridiu cellulolyticum、Clostridium perfringens、Corynebacterium accolens、Corynebacterium diphtheria、Corynebacterium matruchotii、Dinoroseobacter sliibae、Eubacterium dolichum、gamma proteobacterium、Gluconacetobacler diazotrophicus、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus sputorum、Helicobacter canadensis、Helicobacter cinaedi、Helicobacter mustelae、Ilyobacler polytropus、Kingella kingae、Lactobacillus crispatus、Listeria ivanovii、Listeria monocytogenes、Listeriaceae bacterium、Methylocystis sp.、Methylosinus trichosporium、Mobiluncus mulieris、Neisseria bacilliformis、Neisseria cinerea、 Neisseria flavescens、Neisseria lactamica. Neisseria sp.、Neisseria wadsworthii、 Nitrosomonas sp.、Parvibaculum lavamentivorans、Pasteurella multocida、Phascolarctobacterium succinatutens、Ralstonia syzygii、Rhodopseudomonas palustris、 Rhodovulum sp.、Simonsiella muelleri、Sphingomonas sp.、Sporolactobacillus vineae、 Staphylococcus lugdunensis、Streptococcus sp.、Subdoligranulum sp.、Tislrella mobilis、 Treponema sp.、or Verminephrobacter eiseniaeに由来するか又はこれらに基づいている。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＳＦ３７０株、ＭＧＡＳ１０２７０株、ＭＧＡＳ１０７５０株、ＭＧＡＳ２０９６株、ＭＧＡＳ３１５株、ＭＧＡＳ５００５株、ＭＧＡＳ６１８０株、ＭＧＡＳ９４２９株、ＮＺ１３１株及びＳＳＩ－１株）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ＬＭＤ－９株）、Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ（例えば、ＳＰＩＮ２００２６株）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（例えば、ＵＡ１５９株、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．ｍａｃａｃａｅ（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｌｉｃｕｓ（例えば、ＵＣＮ３４株、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－２０６９株）、Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ（例えば、ＡＴＣＣ９８１２株、ＭＧＣＳ１２４株）、Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ（例えば、ＧＧＳ１２４株）、Ｓ．ｂｏｖｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、Ｓ．ｃｍｇｉｎｏｓｕｓ（例えば、Ｆ０２１ １株）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａ（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（例えば、Ｆ６８５４株）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ（例えば、ＤＳＭ１５９５２株）又はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ （例えば、１，２３，４０８株）のＣａ９分子由来である。
いくつかの実施態様において、前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０（例えば、Ｃａｓ１０ｄ）、Ｃａｓ１２ａ（又はＣｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（又はＣ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、Ｃｓ２又はＣｍｒ５を含む。
いくつかの実施形態において、前記ガイド核酸は、Ｃａｓ－ＲＮＡ複合体を標的配列に方向付けるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子である。
いくつかの実施形態において、方向付けは、ｇＲＮＡの一部のＤＮＡへのハイブリダイゼーション（例えば、ｇＲＮＡターゲティングドメインを介して）、及びｇＲＮＡ分子の一部のＲＮＡガイドヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子への結合（例えば、少なくともｇＲＮＡ ｔｒａｃｒを介して）により達成される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、本明細書において「単一（single）ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる、単一の連続したポリヌクレオチド分子からなる。
他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、複数の、通常は２つの、ポリヌクレオチド分子からなり、それ自体が、通常はハイブリダイゼーションを通じて会合可能であり、本明細書では「デュアル（dual）ガイドＲＮＡ」又は「ｄｇＲＮＡ」と称される。
いくつかの実施態様において、前記ｇＲＮＡ分子は、任意に単一のポリヌクレオチド上又は別々のポリヌクレオチド上にあることができるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒを含む。
いくつかの実施態様において、前記ｃｒＲＮＡは、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒと相互作用して旗竿（flagpole）領域を形成する領域とを含む。前記ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子に結合するｇＲＮＡ分子の一部を含む。
いくつかの実施形態では、前記ｔｒａｃｒは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）に特異的に結合する核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、前記ｔｒａｃｒは、旗竿の一部を形成する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記ターゲティングドメインは、前記標的ＤＮＡ内のプロトスペーサー（protspacer）配列を認識する、例えば、これに相補的である、ｇＲＮＡ分子の一部である。
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、プロトスペーサーの３’末端に隣接して位置し、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識される２～６塩基対ＤＮＡ配列である。
いくつかの実施態様において、各Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、特定のＰＡＭ配列を認識する。
例示的なＰＡＭ配列には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって認識されるＮＧＧ配列又はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって認識されるＮＧＧＮＧ又はＮＮＡＧＡＡＷ配列（ここでＮは任意のヌクレオチド）を含む。当業者であれば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが認識するであろうＰＡＭ配列とともに使用される特定のＣａｓエンドヌクレアーゼに基づいて、ｇＲＮＡ分子を設計する方法を理解するであろう。
いくつかの実施形態では、１つ若しくは複数の、２つ若しくは複数の、３つ若しくは複数の又は４つ若しくは複数のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを有する免疫細胞内にトランスフェクトされる。
いくつかの態様において、約１、２、又は３個のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを有する免疫細胞内にトランスフェクトされる。
いくつかの態様では、約３個のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを有する免疫細胞内にトランスフェクトされる。
いくつかの態様において、約２個のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを有する免疫細胞内にトランスフェクションされる。
いくつかの態様では、約１個のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを有する免疫細胞内にトランスフェクトされる。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集システムは、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集システムである。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂（cleavage）ドメインに融合させることによって人工的に製造される。
転写活性化因子様効果（ＴＡＬＥ）は、標的ＤＮＡに結合するように操作することができる。
操作されたＴＡＬＥをＤＮＡ開裂ドメインと組み合わせることで、任意の標的ＤＮＡ配列に特異的な制限酵素を製造することができる。
ＴＡＬＥは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌によって分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目と１３番目のアミノ酸を除いて、繰り返し、高度に保存された３３～３４個のアミノ酸配列を含んでいる。これら２つの位置は、特異的なヌクレオチド認識と強い相関を示し、非常に可変的であるため、標的ＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。
ＴＡＬＥＮを製造するために、ＴＡＬＥタンパク質は、例えば、野生型又は変異型Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ（Ｎ）と融合される。Ｆｏｋｌドメインは二量体として機能し、標的ゲノムの部位に適切な向きと間隔で固有のＤＮＡ結合ドメインを持つ２つの構築物（construction）を必要とする。特異性及びオフターゲット(off-target)効果は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋｌ開裂ドメインの間のアミノ酸残基数及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数を変えることによって調節することができる。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集システムは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集システムである。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的核酸配列の１つ又は複数の核酸部位を修飾するために使用することができる人工ヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮ編集システムと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋｌヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、前記ＤＮＡ結合ドメインは、１つ又は複数のジンクフィンガーを含む。ジンクフィンガーは、１つ又は複数の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質構造モチーフである。ジンクフィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２からなり、凡そ３－ｂｐ配列を認識することができる。既知の特異性を有する種々のジンクフィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５又は１８－ｂｐの配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを生成することができる。
ＺＦＮは、非パリンドローム（non-palindromic）ＤＮＡ部位を認識する。標的部位を切断するために、一対のＺＦＮは二量化し、前記標的部位の反対側の鎖（strands）に集合する。特定の配列を認識するジンクフィンガー（およびその組み合わせ）を生成するために、ファージディスプレイ（phage display）、酵母ワンハイブリッドシステム（yeast one-hybrid systems）、バクテリアワンハイブリッドおよびツーハイブリッドシステム（bacterial one-hybrid and two-hybrid systems）、哺乳類細胞等、様々な選択およびモジュールアセンブリ技術（modular assembly techniques）が利用可能である。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集システムは、メガヌクレアーゼ遺伝子編集システムである。メガヌクレアーゼは、１５～４０塩基対の開裂部位を認識する人工ヌクレアーゼである。
いくつかの実施態様において、メガヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性及び／又はＤＮＡ認識に影響を与えるその構造モチーフに基づいてファミリーにグループ分けされる。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコピーを１つ又は２つ有することによって特徴付けられる。
いくつかの例では、前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコピーを１つ有する前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、ホモ二量体（homodimers）を形成するが、前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコピーを２つ有するメンバーはモノマーとして見出される。ＧＩＹ－ＹＩＧファミリーのメンバーは、７０～１００残基の長さのＧＰ－ＹＩＧモジュールを有し、４つの不変残基を持つ４又は５つの保存配列モチーフを含み、そのうちの２つが活性に必要である。Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスメガヌクレアーゼは、数百アミノ酸残基にわたる領域で、高度に保存された一連のヒスチジンとシステインによって特徴づけられる。ＮＨＮファミリーは、アスパラギン残基で囲まれた２対の保存されたヒスチジンを含むモチーフによってメンバーが定義されている。ＤＮＡ結合特異性が変更されたメガヌクレアーゼを操作するための戦略、例えば、所定の核酸配列に結合するための戦略は、当技術分野で知られており、例えば、Chevalier et al. (2002), Mol. Cell, 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res 31 : 2952-62; Silva et al. (2006) J Mol Biol 361 : 744-54; Seligman et al. (2002) Nucleic Acids Res 30: 3870-9; Sussman et al. (2004) J Mol Biol 342: 31-41; Rosen et al. (2006) Nucleic Acids Res; Doyon et al. (2006) J. Am Chem Soc 128: 2477-84; Chen et al. (2009) Protein Eng Des Sel 22: 249- 56; Arnould S (2006) J Mol Biol. 355: 443-58; Smith (2006) Nucleic Acids Res. 363(2): 283- 94.に見出される。
いくつかの実施態様において、前記メガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼのＮ末端に融合したＴＡＬＥドメインを含むｍｅｇａＴＡＬと呼ばれるハイブリッドヌクレアーゼである。
いくつかの実施態様では、前記メガヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーである。
Ｃ．相同性指向性修復（ＨＤＲ）テンプレート
ある実施形態では、本明細書に記載の非刺激免疫細胞は、相同性指向性修復機構によって修飾される。
いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む相同性指向性修復（ＨＤＲ）テンプレートが、ポリヌクレオチドが標的部位に挿入される条件下で、標的免疫細胞にトランスフェクトされる。
いくつかの実施形態では、前記ＨＤＲテンプレートは、標的部位に対して上流、すなわち５’のゲノム配列に相同な５’相同性アームと、標的部位に対して下流、すなわち３’のゲノム配列に相同な３’相同性アームを含む。
いくつかの実施形態では、前記５’及び／又は３’相同性アームは、ポリヌクレオチドに隣接する。
いくつかの実施形態では、前記５’相同性アームは、約５０から約１０００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０から約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドまでの長さである。
いくつかの実施態様では、前記５’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００又は約１０００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施態様では、前記５'相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０又は約３００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施態様では、前記５’相同性アームは、約５０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施態様では、前記３’相同性アームは、約５０から約１０００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０から約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの例では、前記３’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００又は約１０００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの例では、前記３’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０又は約３００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施態様では、前記３’相同性アームは、約５０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、前記ＨＤＲテンプレートの長さは、約２キロ塩基対（ｋｂ）から約５ｋｂ、約２．３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約４ｋｂ、約２．３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約３ｋｂ、約２．３ｋｂから約３ｋｂ又は約４ｋｂから約５ｋｂである。
いくつかの例では、前記ＨＤＲテンプレートの長さは、約２ｋｂ、約２．３ｋｂ、約２．５ｋｂ、約３ｋｂ、約４ｋｂ又は約５ｋｂである。
いくつかの態様において、前記ＨＤＲテンプレートは、本明細書においてウルトラマーとも称される。
いくつかの態様において、前記抗原結合ポリペプチドは、抗原受容体、任意選択でＣＡＲ又はＴＣＲである。
いくつかの実施形態では、前記ＨＤＲテンプレートは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）テンプレートである。
いくつかの実施形態では、前記ｄｓＤＮＡテンプレートは、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又はそれらの組合せを含む。
いくつかの実施形態では、前記ｄｓＤＮＡテンプレートは、標的部位に対して上流、すなわち５’のゲノム配列に相同な５’相同性アームと、標的部位に対して下流、すなわち３’のゲノム配列に相同な３’相同性アームを含む。
いくつかの実施形態では、前記５’及び／又は３’相同性アームは、ポリヌクレオチドに隣接する。
いくつかの実施形態では、前記５’相同性アームは、約５０ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドまでの長さである。
いくつかの実施形態では、前記５’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００又は約１０００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの例では、前記５’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０又は約３００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの例では、前記５’相同性アームは、約５０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、前記３’相同性アームは、約５０ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドまでの長さである。
いくつかの実施形態では、前記３’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００又は約１０００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施態様では、前記３’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０又は約３００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの例では、前記３’相同性アームは、約５０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態において、前記ｄｓＤＮＡテンプレートの長さは、約２ｋｂから約５ｋｂ、約２．３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約４ｋｂ、約２．３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約３ｋｂ、約２．３ｋｂから約３ｋｂ又は約４ｋｂから約５ｋｂである。
いくつかの例では、ｄｓＤＮＡテンプレートの長さは、約２ｋｂ、約２．３ｋｂ、約２．５ｋｂ、約３ｋｂ、約４ｋｂ又は約５ｋｂである。
いくつかの実施形態では、前記ＨＤＲテンプレートは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）テンプレートである。
いくつかの実施形態では、前記ｓｓＤＮＡテンプレートは、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せを含む。
いくつかの実施形態では、前記ｓｓＤＮＡテンプレートは、標的部位に対して上流、すなわち５’のゲノム配列に相同な５’相同性アームと、標的部位に対して下流、すなわち３’のゲノム配列に相同な３’相同性アームを含む。
いくつかの実施形態において、前記５’及び／又は３’相同性アームは、ポリヌクレオチドに隣接する。
いくつかの実施形態において、前記５’相同性アームは、約５０ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、前記５’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００又は約１０００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの例では、前記５’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０又は約３００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの例では、前記５’相同性アームは、約５０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、前記３’相同性アームは、約５０ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドまでの長さである。
いくつかの実施形態では、前記３’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００又は約１０００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの例では、前記３’相同性アームは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１５０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２５０、約２６０、約２８０又は約３００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの例では、前記３’相同性アームは、約５０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、前記ｓｓＤＮＡテンプレートの長さは、約２ｋｂから約５ｋｂ、約２．３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約４ｋｂ、約２．３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約３ｋｂ、約２．３ｋｂから約３ｋｂ又は約４ｋｂから約５ｋｂである。
いくつかの例では、前記ｓｓＤＮＡテンプレートの長さは、約２ｋｂ、約２．３ｋｂ、約２．５ｋｂ、約３ｋｂ、約４ｋｂ又は約５ｋｂである。
いくつかの実施形態では、前記ＨＤＲテンプレートは、免疫細胞内に導入される前にプラスミドに挿入される。例示的なプラスミドとしては、これらに限定はされないが、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ、ｐＣａｌ－ｎ、ｐＥＴ－３ａ－ｃ、ｐＥＴ３２ａ－ｃ、ｐＧＥＸ－２Ｔ、ｐＴｒｉＥｘ－１、ｐＵＣ１９、ｐＡｄ５Ｆ３５、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、又はＴＬＣＶ２が挙げられる。
Ｄ．トランスフェクション
いくつかの実施形態では、前記遺伝子編集システム及び前記ＨＤＲテンプレートは、非ウイルス性送達方法（non-viral delivery method）を通じて、非刺激免疫細胞に導入される。非ウイルス性送達方法では、核酸は裸のＤＮＡであるか、非ウイルス性プラスミド又はベクターに含まれ得る。例示的な非ウイルス性送達方法としては、それらに限定されないが、電気穿孔法、セルスクイーズ法、リン酸カルシウム、熱ショック（heat shock）、リポソーム送達、カチオン性ポリマー、脂質ポリマー、細胞透過ペプチド（cell-penetrating peptides）、カチオン性ナノキャリア、流体力学的送達(hydrodynamic delivery)、超音波、カチオン性脂質、ナノ粒子、弾道ＤＮＡ注入（ballistic DNA injection）、磁気感染（magneto-fection）及び光ポーリング（photo-poration）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記遺伝子編集システム及びＨＤＲテンプレートは、電気穿孔法によって非刺激免疫細胞に導入される。
いくつかの例では、前記遺伝子編集システム（例えば、前記エンドヌクレアーゼ及び／又は前記ガイド核酸）及びＨＤＲテンプレートは、電気穿孔法によって、非刺激免疫細胞に同時に導入される。
他の例では、前記遺伝子編集システム（例えば、前記エンドヌクレアーゼ及び／又は前記ガイド核酸）は、最初に電気穿孔法を行い、その後、前記ＨＤＲテンプレートの別個の電気穿孔法を行うことにより、同時に非刺激免疫細胞に導入される、又は、代替的に、前記ＨＤＲテンプレートは、最初に電気穿孔法を行い、その後、遺伝子編集システム（例えば、前記エンドヌクレアーゼ及び／又は前記ガイド核酸）の別個の電気穿孔法を行うことにより、同時に非刺激免疫細胞へ導入される。
さらなる例では、前記エンドヌクレアーゼ、前記ガイド核酸、及び前記ＨＤＲテンプレートは、電気穿孔法によって、前記非刺激免疫細胞に順次導入される。
いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、約１ｐＭから約１０ｍＭの濃度で、非刺激免疫細胞に導入される。
いくつかの実施態様において、エンドヌクレアーゼの濃度は、約１ｐＭから約５ｍＭ、約１ｐＭから約３ｍＭ、約１ｐＭから約１ｍＭ、約１ｐＭから約０．８ｍＭ、約１ｐＭから約０．５ｍＭ、約１ｐＭから約０．２ｍＭ、約１ｐＭから約０．１ｍＭ、約１ｐＭから約０．０９ｍＭ、約１ｐＭから約０．０５ｍＭ、約１ｐＭから約０．０１ｍＭ、約１ｐＭから約５μＭ、約１ｐＭから約１μＭ、約１ｐＭから約５００ｎＭ、約１ｐＭから約１００ｎＭ、約１ｎＭから約１０ｍＭ、約１ｎＭから約５ｍＭ、約１ｎＭから約３ｍＭ、約１ｎＭから１ｍＭ、約１ｎＭから約０．８ｍＭ、約１ｎＭから約０．５ｍＭ、約１ｎＭから約０．２ｍＭ、約１ｎＭから約０．１ｍＭ、約１ｎＭから約０．０９ｍＭ、約１ｎＭから約０．０５ｍＭ、約１ｎＭから約０．０１ｍＭ、約１ｎＭから約５μＭ、約１ｎＭから約１μＭ、約１ｎＭから約５００ｎＭ、約１μＭから約１０ｍＭ、約１μＭから約５ｍＭ、約１μＭから約３ｍＭ、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約０．８ｍＭ、約１μＭから約０．５ｍＭ、約１μＭから約０．２ｍＭ、約１μＭから約０．１ｍＭ、約１μＭから約０．０９ｍＭ、約１μＭから約０．０５ｍＭ、約１μＭから約０．０１ｍＭ又は約１μＭから約５μＭである。
いくつかの実施形態では、前記ガイド核酸（例えば、前記ガイドＲＮＡ分子）は、約１ｐＭから約１０ｍＭの濃度で非刺激免疫細胞へ導入される。
いくつかの例では、前記ガイド核酸の濃度（例えば、前記ガイドＲＮＡ分子）は、約１ｐＭから約５ｍＭ、約１ｐＭから約３ｍＭ、約１ｐＭから約１ｍＭ、約１ｐＭから約０．８ｍＭ、約１ｐＭから約０．５ｍＭ、約１ｐＭから約０．２ｍＭ、約１ｐＭから約０．１ｍＭ、約１ｐＭから約０．０９ｍＭ、約１ｐＭから約０．０５ｍＭ、約１ｐＭから約０．０１ｍＭ、約１ｐＭから約５μＭ、約１ｐＭから約１μＭ、約１ｐＭから約５００ｎＭ、約１ｐＭから約１００ｎＭ、約１ｎＭから約１０ｍＭ、約１ｎＭから約５ｍＭ、約１ｎＭから約３ｍＭ、約１ｎＭから約１ｍＭ、約１ｎＭから約０．８ｍＭ、約１ｎＭから約０．５ｍＭ、約１ｎＭから約０．２ｍＭ、約１ｎＭから約０．１ｍＭ、約１ｎＭから約０．０９ｍＭ、約１ｎＭから約０．０５ｍＭ、約１ｎＭから約０．０１ｍＭ、約１ｎＭから約５μＭ、約１ｎＭから約１μＭ、約１ｎＭから約５００ｎＭ、約１μＭから約１０ｍＭ、約１μＭから約５ｍＭ、約１μＭから約３ｍＭ、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約０．８ｍＭ、約１μＭから約０．５ｍＭ、約１μＭから約０．２ｍＭ、約１μＭから約０．１ｍＭ、約１μＭから約０．０９ｍＭ、約１μＭから約０．０５ｍＭ、約１μＭから約０．０１ｍＭ、又は約１μＭから約５μＭである。
いくつかの実施形態では、前記ＨＤＲテンプレートは、約１ｐＭから約１０ｍＭの濃度で、非刺激免疫細胞に導入される。
いくつかの実施態様では、前記ＨＤＲテンプレートの濃度は、約１ｐＭから約５ｍＭ、約１ｐＭから約３ｍＭ、約１ｐＭから約１ｍＭ、約１ｐＭから約０．８ｍＭ、約１ｐＭから約０．５ｍＭ、約１ｐＭから約０．２ｍＭ、約１ｐＭから約０．１ｍＭ、約１ｐＭから約０．０９ｍＭ、約１ｐＭから約０．０５ｍＭ、約１ｐＭから約０．０１ｍＭ、約１ｐＭから約５μＭ、約１ｐＭから約１μＭ、約１ｐＭから約５００ｎＭ、約１ｐＭから約１００ｎＭ、約１ｎＭから約１０ｍＭ、約１ｎＭから約５ｍＭ、約１ｎＭから約３ｍＭ、約１ｎＭから１ｍＭ、約１ｎＭから約０．８ｍＭ、約１ｎＭから約０．５ｍＭ、約１ｎＭから約０．２ｍＭ、約１ｎＭから約０．１ｍＭ、約１ｎＭから約０．０９ｍＭ、約１ｎＭから約０．０５ｍＭ、約１ｎＭから約０．０１ｍＭ、約１ｎＭから約５μＭ、約１ｎＭから約１μＭ、約１ｎＭから約５００ｎＭ、約１μＭから約１０ｍＭ、約１μＭから約５ｍＭ、約１μＭから約３ｍＭ、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約０．８ｍＭ、約１μＭから約０．５ｍＭ、約１μＭから約０．２ｍＭ、約１μＭから約０．１ｍＭ、約１μＭから約０．０９ｍＭ、約１μＭから約０．０５ｍＭ、約１μＭから約０．０１ｍＭ又は約１μＭから約５μＭである。
いくつかの実施形態では、前記遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。
いくつかの例では、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）エンドヌクレアーゼは、約１ｐＭから約１０ｍＭの濃度で非刺激免疫細胞へ導入される。
いくつかの実施態様において、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）エンドヌクレアーゼの濃度は、約１ｐＭから約５ｍＭ、約１ｐＭから約３ｍＭ、約１ｐＭから約１ｍＭ、約１ｐＭから約０．８ｍＭ、約１ｐＭから約０．５ｍＭ、約１ｐＭから約０．２ｍＭ、約１ｐＭから約０．１ｍＭ、約１ｐＭから約０．０９ｍＭ、約１ｐＭから約０．０５ｍＭ、約１ｐＭから約０．０１ｍＭ、約１ｐＭから約５μＭ、約１ｐＭから約１μＭ、約１ｐＭから約５００ｎＭ、約１ｐＭから約１００ｎＭ、約１ｎＭから約１０ｍＭ、約１ｎＭから約５ｍＭ、約１ｎＭから約３ｍＭ、約１ｎＭから約１ｍＭ、約１ｎＭから約０．８ｍＭ、１ｎＭから約０．５ｍＭ、約１ｎＭから約０．２ｍＭ、約１ｎＭから約０．１ｍＭ、約１ｎＭから約０．０９ｍＭ、約１ｎＭから約０．０５ｍＭ、約１ｎＭから約０．０１ｍＭ、約１ｎＭから約５μＭ、約１ｎＭから約１μＭ、約１ｎＭから約５００ｎＭ、約１μＭから約１０ｍＭ、約１μＭから約５ｍＭ、約１μＭから約３ｍＭ、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約０．８ｍＭ、約１μＭから約０．５ｍＭ、約１μＭから約０．２ｍＭ、約１μＭから約０．１ｍＭ、約１μＭから約０．０９ｍＭ、約１μＭから約０．０５ｍＭ、約１μＭから約０．０１ｍＭ、又は約１μＭから約５μＭである。
いくつかの実施形態では、非刺激免疫細胞に導入される前記Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）エンドヌクレアーゼ濃度と前記ガイド核酸濃度の比は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１又は１０：１である。
いくつかの例では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼと前記ガイド核酸の比は、約１：１である。
いくつかの例では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼと前記ガイド核酸の比は、約１：２である。
いくつかの例では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼと前記ガイド核酸の比は、約１：３である。
いくつかの例では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼと前記ガイド核酸の比は、約２：１である。
いくつかの例では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼと前記ガイド核酸の比は、約３：１である。
いくつかの実施形態では、非刺激免疫細胞に導入される前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと前記ＨＤＲテンプレートの比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１２、約１：１５、約１：１８、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１２：１、約１５：１、約２０：１、約３０：１又は約４０：１である。
いくつかの例では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと前記ＨＤＲテンプレートの比は、約１：１である。
いくつかの例では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと前記ＨＤＲテンプレートの比は、約１：２である。
いくつかの例では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと前記ＨＤＲテンプレートの比は、約２：１である。
いくつかの実施形態では、非刺激免疫細胞に導入される前記遺伝子編集ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及び前記ＨＤＲテンプレートの比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１又は約１０：１である。
いくつかの例では、前記遺伝子編集ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）と前記ＨＤＲテンプレートの比は、約１：１である。
いくつかの例では、前記遺伝子編集ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）と前記ＨＤＲテンプレートの比は、約１：２である。
いくつかの例では、前記遺伝子編集ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）と前記ＨＤＲテンプレートの比は、約２：１である。
いくつかの実施形態では、前記電気泳動は、約２℃から約４０℃の温度で実施される。
いくつか例では、前記電気泳動は、約２℃から約３７℃、約２℃から約３５℃、約２℃から約３３℃、約２℃から約３０℃、約２℃から約２８℃、約２℃から約２６℃、約２℃から約２５℃、約２℃から約２０℃、約２℃から約１８℃、約２℃から約１５℃、約２℃から約１０℃、約２℃から約８℃、約４℃から約３７℃、約４℃から約３５℃、約４℃から約３３℃、約４℃から約３０℃、約４℃から約２８℃です、約４℃から約２６℃、約４℃から約２５℃、約４℃から約２０℃、約４℃から約１８℃、約４℃から約１５℃、約４℃から約１０℃、約４℃から約８℃、約２０℃から約３７℃、約２０℃から約３５℃、約２０℃から約３３℃、約２０℃から約３０℃、約２０℃から約２８℃、約２０℃から約２６℃、約２０℃から約２５℃、約２２℃から約２５℃、約２２℃から約２８℃、約２４℃から約３０℃、約２４℃から約２８℃又は約２５℃から約３０℃の温度で実施される。
いくつかの場合では、前記電気泳動は、約２０℃から約３０℃の温度で実施される。
いくつかの場合では、前記電気泳動は、約２５℃から約３０℃の温度で実施される。
いくつかの場合では、前記電気泳動は、約２５℃から約２８℃の温度で実施される。
例示的な電気穿孔法テクノロジーとして、これらに限定されないが、Ｌｏｎｚａ社のＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（登録商標）プラットフォーム、Ｌｏｎｚａ社のＡｍａｘａ ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（登録商標）ＩＩ電気穿孔法機、ＭａｘＣｙｔｅ社のＦＬＯＷ ＥＬＥＣＴＲＯＰＯＲＡＴＩＯＮ（登録商標）テクノロジー、及びＢｉｏ－Ｒａｄ社のＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＭＸＣＥＬＬ（登録商標）電気穿孔法システムが挙げられる。当業者であれば、パルスの種類、パルスの持続時間、電圧及び使用頻度は、装置の種類及び細胞の種類に依存すること並びにトランスフェクション効率の最適化は、パルスの種類、パルスの持続時間、電圧、使用頻度、及び、エンドヌクレアーゼ、ガイド核酸、及び／又はＨＤＲテンプレートの濃度に基づいて調節できることを理解する。
いくつかの実施形態では、前記ＨＤＲテンプレートは、非刺激免疫細胞集団の約１０％又はそれ以上において、標的部位でのＨＤＲを促進する。
いくつかの例では、前記ＨＤＲテンプレートは、非刺激免疫細胞集団の約２０％若しくはそれ以上、３０％若しくはそれ以上、４０％若しくはそれ以上、５０％若しくはそれ以上、６０％若しくはそれ以上、７０％若しくはそれ以上、８０％若しくはそれ以上、９０％若しくはそれ以上又は９５％若しくはそれ以上において標的部位でのＨＤＲを促進する。
いくつかの実施形態では、前記トランスフェクション法の効率は、約２％から約９９％、約５％から約９９％、約８％から約９９％、約１０％から約９９％、約１２％から約９９％、約１３％から約９９％、約１５％から約９９％、約２０％から約９９％、３０％から約９９％、約４０％から約９９％、約５０％から約９９％、約６０％から約９９％、約７０％から約９９％、約２％から約８０％、約５％から約８０％、約８％から約８０％、約１０％から約８０％、約１２％から約８０％、約１３％から約８０％、約１５％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約２０％から約７０％又は約３０％から約６０％である。
いくつかの例では、前記効率は約２％、約５％、約８％、約１０％、約１２％、約１３％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９９％である。
Ｅ．修飾非刺激性免疫細胞
いくつかの実施形態では、前記遺伝子編集システム及び前記ＨＤＲテンプレートの非ウイルス送達後の非刺激免疫細胞を、最大で約７２時間、非膨張条件下で培養し、修飾非刺激免疫細胞を生成する。
いくつかの例では、前記非刺激免疫細胞を、約１８時間から約７２時間、約１８時間から約３６時間、約１８時間から約２４時間、約２４時間から約７２時間、約２４時間から約３６時間又は約３６時間から約７２時間、培養し、修飾非刺激免疫細胞を生成する。
いくつかの例では、前記非刺激免疫細胞を、約４８時間若しくはそれ以下、約３６時間若しくはそれ以下、約２４時間若しくはそれ以下又は約１８時間若しくはそれ以下、培養して、修飾非刺激免疫細胞を生成する。
いくつかの例では、前記非刺激免疫細胞を、約１８時間、２４時間、３６時間、４８時間又は約７２時間、培養して、修飾非刺激免疫細胞を生成する。
いくつかの場合では、前記非刺激免疫細胞は、培養容器（例えば、培養バッグ又はバイオリアクター）内で約３７℃で培養される。
いくつかの場合では、前記培養容器は、約９０％、約９５％又は約９９％の湿度を含む。
いくつかの場合では、前記培養容器は、約０．５％の二酸化炭素を含む。
いくつかの実施形態では、修飾非刺激免疫細胞と共に使用される前記細胞培地は、完全培地、化学的に定義された培地、又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）ベースの培地、例えば、約１％～約１０％のＦＢＳを含む培地を含んでいる。
いくつかの例では、前記細胞培地は、最小培地である。前記修飾非刺激免疫細胞を培養するための例示的な培地としては、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社のＣＴＳ（登録商標） ＯＰＴＭＩＺＥＲ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
いくつかの例では、前記細胞培地は、培養された前記修飾非刺激免疫細胞と相互作用することなく培養容器の内表面を被覆するタンパク質をさらに含む。
いくつかの場合では、前記培地は、約０．１％～約５％ｗ／ｖ又は約０．５％～約２％ｗ／ｖのタンパク質を含む。
いくつかの場合では、前記媒体は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％又は約１％のタンパク質ｗ／ｖを含む。
いくつかの場合では、前記タンパク質は、単離された組換えタンパク質又はそのフラグメントである。
いくつかの場合では、前記タンパク質は、操作されたデノボ(de novo)ポリペプチドである。
いくつかの場合では、前記タンパク質は、天然に存在するタンパク質又はそのフラグメントである。
いくつかの態様において、前記タンパク質は、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン又はＨＳＡ）である。
いくつかの実施形態では、前記細胞培地は、約０．１％～約５％ｗ／ｖ又は約０．５％～約２％ｗ／ｖのアルブミン（例えば、ＨＳＡ）を含む。
いくつかの例では、前記培地は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％又は約１％ｗ／ｖのアルブミン（例えばＨＳＡ）を含む。
いくつかの場合では、アルブミン（例えば、ＨＳＡ）は、全長アルブミンである。
他の場合では、前記アルブミン（例えば、ＨＳＡ）は、例えば、シグナル伝達ペプチドを含まない、そのフラグメントである。
いくつかの実施形態では、上述の方法によって生成された前記修飾非刺激免疫細胞集団は、約５００万細胞、１０００万細胞、２０００万細胞、５０００万細胞、１億細胞、５億細胞、１０億細胞、２０億細胞、３０億細胞、４０億細胞、５０億細胞、１００億細胞又はそれ以上を含む。
いくつかの場合では、上述の方法によって生成された前記修飾非刺激免疫細胞集団は、約５０００万細胞～約５０億細胞を含む。
いくつかの場合では、上述の方法によって生成された前記修飾非刺激免疫細胞集団は、約５０００万細胞～約４０億細胞を含む。
Ｆ．凍結保存
いくつかの実施形態では、前記修飾非刺激免疫細胞は、最大約７２時間培養した後、凍結保存される。
いくつかの例では、前記修飾非刺激免疫細胞は、培養容器から採取され、凍結保存培地に再懸濁される。
いくつかの例では、前記凍結保存培地は、ＣＲＹＯＳＴＯＲ（登録商標）ＣＳＢ培地（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）及びＤＭＳＯを含む。
いくつかの例では、前記ＤＭＳＯは、２％、５％又は１０％ｖ／ｖ溶液である。
いくつかの例では、前記ＤＭＳＯは、ＣＲＹＯＳＴＯＲ（登録商標）ＣＳ５又はＣＲＹＯＳＴＯＲ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）である。
いくつかの場合では、前記ＤＭＳＯの最終濃度は、約０％ｖ／ｖから約７．５％ｖ／ｖである。
いくつかの場合では、前記ＤＭＳＯの最終濃度は、約２．５％ｖ／ｖである。
いくつかの場合では、前記ＤＭＳＯの最終濃度は、約５％ｖ／ｖである。
いくつかの場合では、再懸濁中の温度は、約２４℃から約２８℃である。
前記凍結保存培地に再懸濁した後、前記修飾非刺激免疫細胞を凍結保存し、その際、細胞の温度を再懸濁温度から約－８０℃までステップワイズ方法で低下させる。
いくつかの例では、１分あたり約１～５℃の減少が、前記ステップワイズ方法で使用される。
いくつかの例では、１分間に約１℃の減少が、前記ステップワイズ方式で使用される。
いくつかの例では、前記ステップワイズ方法は、約３０分～約３時間以内に前記再懸濁温度から約－８０℃まで温度を下げることを含む。
いくつかの場合では、前記再懸濁温度は、約２４℃から約２８℃、約２６℃から約２８℃又は約２４℃から約２６℃である。
いくつかの実施形態では、凍結修飾非刺激免疫細胞を生成する本明細書に記載の方法は、約１０％から約９９％、約１２％から約９９％、約１３％から約９９％、約１５％から約９９％、約２０％から約９９％、３０％から約９９％、約４０％から約９９％、約５０％から約９９、約６０％から約９９％、約７０％から約９９％、約１０％から約８０％、約１２％から約８０％、約１３％から約８０％、約１５％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約２０％から約７０％又は約３０％から約６０％の細胞生存性（cell viability）を提供する。
いくつかの場合では、前記方法は、約１０％、約１２％、約１３％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９９％の細胞生存性を提供する。
Ｇ．修飾刺激免疫細胞
いくつかの実施形態では、修前記飾非刺激免疫細胞は、凍結保存の前に任意に刺激される。
いくつかの例、前記修飾非刺激免疫細胞は、約５日～約１２日間刺激され、拡大される。
いくつかの場合では、前記修飾非刺激免疫細胞は、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間又はそれ以上刺激され、拡大される。
いくつかの場合では、前記非刺激免疫細胞は、約１０日間から約１２日間まで刺激され、拡張される。
いくつかの実施形態において、前記修飾非刺激免疫細胞は、当該非刺激免疫細胞を刺激することができる薬剤（agent）の存在下でインキュベートされる。
前記非刺激免疫細胞がＴ細胞であるいくつかの例では、前記薬剤は、ＣＤ３ゼータ鎖等のＴＣＲ複合体の１つ又は複数の構成要素（components）の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができるか、又はそのような複合体又は構成要素を介したシグナル伝達を活性化することが可能である。
いくつかの例、前記薬剤は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗４－１ＢＢ抗体又はＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７又はＩＬ－２１等のサイトカイン又は人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）である。
いくつかの例では、前記抗体はさらに、ビーズ等の固体支持体の表面に結合されるか、又はその上に存在する。
いくつかの場合では、前記薬剤は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、任意で、ビーズ対細胞比が３：１で、又は、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＥＭＰ Ｔ細胞 ＴＲＡＮＳＡＣＴ（登録商標）（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって生成された前記修飾刺激免疫細胞集団は、約５００万細胞、約１０００万細胞、約２０００万細胞、約５０００万細胞、約１億細胞、約５億細胞、約１０億細胞、約５０億細胞、約１００億細胞、約２００億細胞又はそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、凍結修飾刺激免疫細胞を生成する本明細書に記載の方法は、約１０％から約９９％、約１２％から約９９％、約１３％から約９９％、約１５％から約９９％、約２０％から約９９％、３０％から約９９％、約４０％から約９９％、約５０％から約９９、約６０％から約９９％、約７０％から約９９％、約１０％から約８０％、約１２％から約８０％、約１３％から約８０％、約１５％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約２０％から約７０％又は約３０％から約６０％の細胞生存性を提供する。
いくつかの場合では、前記方法は、約１０％、約１２％、約１３％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９９％の細胞生存性を提供する。
ＩＩＩ．抗原結合ポリペプチド
ある実施形態では、本明細書に開示されるのは、外来性抗原結合ポリペプチドを発現する修飾非刺激免疫細胞又は修飾刺激免疫細胞である。
いくつかの例では、前記抗原結合ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
他の例では、前記抗原結合ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
追加の例では、前記抗原結合ポリペプチドは、抗原結合ドメイン、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原に結合するポリペプチドである。
Ａ．キメラ抗原レセプター
いくつかの実施形態では、修飾非刺激免疫細胞又は修飾刺激免疫細胞、例えば、修飾非刺激又は刺激Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現している。本発明のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。本明細書に記載の、任意の抗原結合ドメイン、任意のヒンジ、任意の膜貫通ドメイン、任意の細胞内共刺激ドメイン及び任意の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含む任意の修飾細胞が想定され（envisioned）、本明細書の開示を考慮して当業者が容易に理解し製造することができる。
前記抗原結合ドメインは、細胞内での発現のために、本明細書の他の箇所に記載されている膜貫通ドメイン又は細胞内ドメイン等のＣＡＲの別のドメインに作動可能に連結され得る。
一実施形態では、抗原結合ドメインをコードする第１の核酸配列は、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸に作動可能に連結され、さらに細胞内ドメインをコードする第３の核酸配列に作動可能に連結されている。
本明細書に記載の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の膜貫通ドメインのいずれか、本明細書に記載の細胞内ドメイン若しくは細胞質ドメインのいずれか又は本発明のＣＡＲに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインのいずれかと組み合わせることができる。
本発明の主題ＣＡＲは、本明細書に記載されるようなスペーサードメイン（spacer domain）を含むこともできる。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合ドメイン、前記膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの各々は、リンカー（linker）によって分離されている。
１．抗原結合ドメイン
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、タンパク質、炭水化物及び糖脂質を含む特定の標的抗原に結合するためのＣＡＲの細胞外領域（extracellular region）である。
いくつかの実施形態において、前記ＣＡＲは、標的細胞（例えば、癌細胞）上の標的抗原（例えば、腫瘍関連（associated）抗原）に対する親和性を含んでいる。前記標的抗原は、前記標的細胞に関連する（associated）任意のタイプのタンパク質、又はそのエピトープを含んでもよい。例えば、前記ＣＡＲは、前記標的細胞の特定の状態を示す、標的細胞上の標的抗原に対する親和性を含んでもよい。
本明細書に記載されるように、標的細胞上の特定の標的抗原に対する親和性を有する本開示のＣＡＲは、標的特異的結合ドメイン（target-specific binding domain）を含んでよい。
いくつかの実施形態では、前記標的特異的結合ドメインは、マウス標的特異的結合ドメインであり、例えば、前記標的特異的結合ドメインは、マウス由来である。
いくつかの実施形態において、前記標的特異的結合ドメインは、ヒト標的特異的結合ドメインであり、例えば、標的特異的結合ドメインは、ヒト由来である。
前記抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインを含むことができ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、及びそれらの任意のフラグメントを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
したがって、一実施形態では、前記抗原結合ドメイン部分は、哺乳類抗体又はそのフラグメントを含む。
いくつかの実施形態では、前記抗原結合ドメインは、全長抗体からなる。
いくつかの実施形態では、前記抗原結合ドメインは、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一特異性（monospecific）Ｆａｂ２、二重特異性（bispecific）Ｆａｂ２、三重特異性（trispecific）Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｄＡｂ、タンデム（tandem）ｓｃＦｖ、ＶｈＨ、Ｖ－ＮＡＲ、カメリド（camelid）、ダイアボディ（diabody）、ミニボディ（minibody）、トリアボディ（triabody）、又はテトラボディ（tetrabody）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、１つ又は複数の標的細胞上の１つ又は複数の標的抗原に対する親和性を有し得る。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、単一の標的細胞上の１つ又は複数の標的抗原に対して親和性を有し得る。
そのような実施形態では、前記ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲ、又は多重特異性（multispecific）ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、前記ＣＡＲは、１つ又は複数の標的抗原に対する親和性を付与する１つ又は複数の標的特異的結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、前記ＣＡＲは、同じ標的抗原に対する親和性を付与する１つ又は複数の標的特異的結合ドメインを含む。例えば、同じ標的抗原に親和性のある１つ又は複数の標的特異的結合ドメインを含むＣＡＲは、標的抗原の異なるエピトープに結合することができる。ＣＡＲに複数の標的特異的結合ドメインが存在する場合、前記結合ドメインはタンデムに配置され、リンカーペプチドによって分離され得る。例えば、２つの標的特異的結合ドメインを含むＣＡＲでは、前記結合ドメインは、ポリペプチドリンカー、Ｆｃヒンジ領域、又は膜ヒンジ領域を介して、単一のポリペプチド鎖上で互いに共有結合で連結されている。
本明細書で使用する場合、「単鎖可変フラグメント」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、免疫グロブリン（例えば、マウス又はヒト）の重鎖（heavy chains）（ＶＨ）及び軽鎖(light chains)（ＶＬ）の可変領域を共有結合してＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を形成する融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）は直接結合するか、ペプチドをコードするリンカー又はスペーサーによって結合し、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端、又はＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端が連結される。
本明細書において、「リンカー」及び「スペーサー」という用語は、互換的に用いられる。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合ドメイン（例えば、Ｔｎ－ＭＵＣ１結合ドメイン）は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ－リンカー－ＶＬという構成を有するｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合ドメイン（例えば、Ｔｎ－ＭＵＣ１結合ドメイン、ＰＳＭＡ結合ドメイン）は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ－リンカー－ＶＨという構成を有するｓｃＦｖを含む。当業者であれば、本発明で使用するために適切な構成を選択することができるであろう。
前記リンカーは、典型的には、柔軟性のためにグリシンを豊富に含み、また、溶解性のためにセリン又はスレオニンを含む。前記リンカーは、前記細胞外抗原結合ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結することができる。
前記リンカーの非限定的な例としては、Shen et al., Anal. Chem. 80(6):1910-1917 (2008)及び ＷＯ２０１４／０８７０１０に開示されており、それらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
様々なリンカー配列が当技術分野で知られており、限定されないが、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ただし、ｎは少なくとも１の整数を表す）等のグリシン・セリン（ＧＳ）リンカーが挙げられる。
例示的なリンカー配列は、限定されないが、ＧＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＳＧ、ＧＳＳＳＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ等を含むアミノ酸配列であり得る。当業者であれば、本発明で使用するために適切なリンカー配列を選択することができるであろう。
一実施形態では、本発明の抗原結合ドメイン（例えば、Ｔｎ－ＭＵＣ１結合ドメイン、ＰＳＭＡ結合ドメイン）は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有するリンカー配列によって分離されており、これは、ヌクレオチド配列ｇｇｔｇｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃｇｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇｇｔｃｇｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｔｃｔを含む核酸配列によってコード化され得る。
定数領域を除去し、リンカーを導入したにもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は元の（original）免疫グロブリンの特異性を保持する。一本鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Huston, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)に記載されているように、ＶＨ－及びＶＬ－エンコード配列を含む核酸から発現することができる。
また、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、同第４，９５６，７７８号、米国特許公開第２００５０１９６７５４号及び同第２００５０１９６７５４号を参照ください。阻害活性を有する拮抗型ｓｃＦｖが記載されている（例えば、Zhao et al., Hybridoma (Larchmt), 27(6):455-51 (2008); Peter et al., J. Cachexia Sarcopenia Muscle (Aug. 12, 2012); Shieh et al., J. Imunol., 183(4):2277-85 (2009); Giomarelli et al., Thromb. Haemost., 97(6):955-63 (2007); Fife et al., J. Clin. Invst., 116(8):2252-61 (2006); Brocks et al., Immunotechnology, 3(3):173-84 (1997); Moosmayer et al., Ther. Immunol., 2(10):31-40 (1995)を参照されたい。）。刺激活性を有するアゴニスティック（Agonistic）ｓｃＦｖが記載されている（例えば、Peter et al., J. Biol. Chem., 25278(38):36740-7 (2003); Xie et al., Nat. Biotech., 15(8):768-71 (1997); Ledbetter et al., Crit. Rev. Immunol., I(5-6):427-55 (1997); Ho et al., BioChim. Biophys. Acta., 1638(3):257-66 (2003)を参照されたい。)。
本明細書で使用する「Ｆａｂ」は、抗原に結合するが一価でＦｃ部分を持たない抗体構造のフラグメントを指し、例えば、酵素パパイン(enzyme papain)で消化した抗体は、２つのＦａｂフラグメントとＦｃフラグメント（例えば、重（Ｈ）鎖一定領域、抗原に結合しないＦｃ領域）を生成する。
いくつかの例では、前記抗原結合ドメインは、前記ＣＡＲが最終的に使用されるのと同じ種に由来し得る。例えば、ヒトで使用する場合、前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインは、本明細書の他の箇所に記載されているようなヒト抗体又はそのフラグメントを含んでもよい。
従って、例えば本明細書に記載の方法によって得られた免疫細胞は、以下の癌関連（associated）抗原（腫瘍抗原）のうちの１つを標的とするＣＡＲを発現するように操作することができる：ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２（シグレック（Siglec）２）；ＣＤ３７；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット（subset）１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９及び１９Ａ２４とも呼ばれる）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１又はＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；ＣＤ１３３；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）；ガングリオシド（ganglioside）Ｇ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（maturation）（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連（associated）糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；カルシノエンブリオニック（Carcinoembryonic）抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）；メソセリン（Mesothelin）；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１ｒＲａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスティシン（Testisin）又はＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；段階特異的胚性抗原４（ＳＳＥＡ－４）；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン（Mucin）１，細胞表面関連（cell surface associated）（ＭＵＣ １）；ＧａｌＮＡｃａ１－Ｏ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｔｎ）ＭＵＣ １（ＴｎＭＵＣ１）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ（Prostase）；前立腺酸性ホスファターゼ（prostatic acid phosphatase）（ＰＡＰ）；伸長因子２変異（mutated）（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソメ(Prosome)、マクロペイン(Macropain))サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）．糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；ブレークポイントクラスター領域(breakpoint cluster region)（ＢＣＲ）とアベルソン マウス白血病ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ１（Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1）（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシル(Fucosyl)ＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシド ＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（ｌ－４）ｂＤＧｌｃｐ（ｌ－ｌ）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量メラノーマ関連（associated）抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グリコセラミドのグロボＨ六糖部分（GloboH）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ユーロプラキン２（ＵＰＫ２）；チロシン－プロテインキナーゼＭｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、Ｋ９遺伝子座（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein)（ＴＡＲＰ）；ウィルムス(Wilms)腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－ｌａ）；メラノーマ結合関連（associated）１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥｌ）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体(angiopoietin-binding cell surface receptor)２（Ｔｉｅ２）；メラノーマ癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロスタイン(prostein)；生存（surviving）；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１又はＧａｌｅｃｔｉｎ８）、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴＩ）；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座ブレークポイント(sarcoma translocation breakpoints)；メラノーマアポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアボックスタンパク質(paired box protein)Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリン(Cyclin)Ｂｌ；v-myc トリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog）（ＭＹＣＮ）；Ｒａｓ ホモログ ファミリー メンバーＣ(Ras Homolog Family Member C)（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；チトクロームＰ４５０１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ １）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガープロテイン）様（CCCTC-Binding Factor (Zinc Finger Protein)- Like）（ＢＯＲＩＳ又はインプリンティング部位の制御因子の兄弟(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)）、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ １）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカー（anchor）蛋白質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫；Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）；高度糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎ユビキタス１（ＲＵ１）；腎ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒト乳頭腫ウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸内カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２変異体（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連（associated）免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチン領域ファミリー１２のメンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－２（ＧＰＣ２）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；ＮＫＧ２Ｄ；ＫＲＡＳ；ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ４（ＧＦＲａ４）；ＩＬ１３Ｒａ２；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；及び免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）。
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３７、メソセリン、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＧＤ２、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＲＡＳ又はＷＴ１、を標的とするＣＡＲを発現するように操作される。
２．膜貫通型ドメイン
前記膜貫通ドメインに関して、前記ＣＡＲは、該ＣＡＲの抗原結合ドメインを細胞内ドメインに接続する膜貫通ドメインを含むように操作することができる。対象ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞（例えば、免疫細胞又はその前駆体）の原形質膜をまたぐ（spanning）ことができる領域である。前記膜貫通ドメインは、細胞膜、例えば、真核細胞膜に挿入するためのものである。
いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＣＡＲの抗原結合ドメインと細胞内ドメインとの間に介在する。
一実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＡＲのドメインの１つ又は複数と自然に関連（associated）する。
いくつかの例では、前記膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのかかるドメインの結合を避けるように、アミノ酸置換によって選択又は変更され得る。
前記膜貫通ドメインは、天然由来又は合成由来のいずれかに由来し得る。ソースが天然である場合、前記ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質、例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来し得る。ソースが合成である場合、前記膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞膜への挿入を容易にする任意の人工配列、例えば、人工疎水性配列であり得る。本発明で特に使用する膜貫通ドメインの例としては、限定されないが、T細胞受容体のアルファ、ベータ若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ－４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９に由来する（即ち、少なくとも膜貫通ドメインを含む）膜貫通ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシンやバリン等の疎水性残基が主体となって含まれる。
ある例示的な実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されることになる。
本明細書に記載の膜貫通ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインのいずれか、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのいずれか、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインのいずれか、又は対象ＣＡＲに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインのいずれかと組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ヒンジ領域をさらに含む。本発明の対象ＣＡＲは、ヒンジ領域を含むこともできる。前記ＣＡＲのヒンジ領域は、前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインの間に位置する親水性領域である。
いくつかの実施形態では、このドメインは、ＣＡＲのための適切なタンパク質折り畳みを促進する。前記ヒンジ領域は、ＣＡＲのオプション部品である。前記ヒンジ領域は、抗体のＦｃフラグメント、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工ヒンジ配列又はそれらの組み合わせから選択されるドメインを含み得る。
ヒンジ領域の例としては、ＣＤ８ａヒンジ、３つのグリシン（Ｇｌｙ）やＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４等）のＣＨ１及びＣＨ３ドメインと同じくらい小さいポリペプチドでできた人工ヒンジ等が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の対象ＣＡＲは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを接続するヒンジ領域を含み、この領域は、今度は、細胞内ドメインに接続する。
例示的な実施形態では、前記ヒンジ領域は、抗原結合ドメインが標的細胞上の標的抗原を認識して結合することを支持することができる（例えば、Hudecek et al., Cancer Immunol. Res., 3(2): 125-135 (2015)を参照されたい。）
いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、柔軟等メインであるため、前記抗原結合ドメインは、腫瘍細胞等の細胞上の標的抗原の特定の構造及び密度を最適に認識するための構造を有することができる。前記ヒンジ領域の柔軟性により、ヒンジ領域は様々なコンフォメーションをとることができる。
いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。
いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、受容体由来のヒンジ領域ポリペプチド（例えば、ＣＤ８由来のヒンジ領域）である。
前記ヒンジ領域は、約４アミノ酸から約５０アミノ酸、例えば、約４アミノ酸から約１０アミノ酸、約１０アミノ酸から約１５アミノ酸、約１５アミノ酸から約２０アミノ酸、約２０アミノ酸から約２５アミノ酸、約２５アミノ酸から約３０アミノ酸、約３０アミノ酸から約４０アミノ酸、又は約４０アミノ酸から約５０アミノ酸の長さを有することができる。
適切なヒンジ領域は、容易に選択することができ、多数の適切な長さのいずれか、例えば、約１個のアミノ酸（例えば．Ｇｌｙ）から約２０アミノ酸、約２アミノ酸から約１５アミノ酸、約３アミノ酸から約１２アミノ酸、約４アミノ酸から約１０アミノ酸、約５アミノ酸から約９アミノ酸、約６アミノ酸から約８アミノ酸又は約７アミノ酸から約８アミノ酸を含み、約１、約２、約３、約４、約５、約６又は約７アミノ酸となり得る。
例えば、ヒンジ領域は、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４７）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４８）（但し、ｎは少なくとも１の整数）、を含み、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー及び当技術分野において知られている他の柔軟なリンカーを含む。グリシンやグリシン－セリンポリマーを使用することができ、GlyおよびSerの両方が比較的構造化されておらず(unstructured)、したがって成分間の中性テザーとして機能することができる。グリシンポリマーを使用することができ、グリシンは、アラニンよりもかなり多くのファイ－プサイ(phi-psi)空間にアクセスし、長い側鎖を持つ残基よりもはるかに制限が少ない（例えば、Scheraga, Rev. Computational. Chem. (1992) 2: 73-142を参照されたい。）。
例示的なヒンジ領域は、ＧＧＳＧ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３０）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３１）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３２）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３４）等のアミノ酸配列からなり得るが、これらに限定はない。
いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列は、当技術分野で知られている、例えば、Tan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(1):162-166 (1990); 及びHuck et al., Nucleic Acids Res., 14(4): 1779-1789 (1986)が挙げられる。
非限定的な例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含み得る：ＤＫＴＨＴ（配列番号３５）；ＣＰＰＣ（配列番号３６）；ＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲ（配列番号３７）（例えば、Glaser et al., J. Biol. Chem. (2005) 280:41494-41503）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号３８）；ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号 ＮＯ： ３９）；ＫＣＣＶＤＣＰ（配列番号４０）；ＫＹＧＰＰＣＰ（配列番号４１）；ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４２）（ヒトＩＧＧ１ヒンジ）；ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号４３）（ヒトＩＧＧ２ヒンジ）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号４４）（ヒトＩＧＧ３ヒンジ）；ＳＰＮＭＶＰＨＡＨＨＡＱ（配列番号４５）（ヒトＩＧＧ４ヒンジ）。
前記ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の、ヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態では、前記ヒンジ領域は、野生型（天然に存在する）ヒンジ領域と比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換及び／又は挿入及び／又は欠失を含み得る。
例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジのＨｉｓ２２９は、前記ヒンジ領域が配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＹＴＣＰＰＣＰ（配列番号４６）を含むように、Ｔｙｒで置換され得る；例えば、Yan et al., J. Biol. Chem. (2012) 287: 5891-5897を参照されたい。
一実施形態では、ヒンジ領域は、ヒトＣＤ８、又はその変異体由来のアミノ酸配列からなり得る。
一実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、対象ＣＡＲは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、これは、配列番号２４に記載のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされてもよい。
別の実施形態では、対象ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジドメインとＣＤ８α膜貫通ドメインとを含む。
一実施形態では、前記ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号２６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされ得る。
一実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインからなる。
いくつかの実施形態において、対象ＣＡＲは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ２８膜貫通ドメインを含み、これは、配列番号２８に記載のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされ得る。
前記膜貫通ドメイン及び／又はヒンジドメインの許容できるバリエーションは、その意図する機能を維持しながら、当業者に知られているであろう。例えば、いくつかの実施形態において、膜貫通ドメイン又はヒンジドメインは、配列番号２３、２５及び／又は２７に記載されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の、配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
例えば、いくつかの実施形態において、膜貫通ドメイン又はヒンジドメインは、配列番号２４、２６、及び／又は２８に記載されているヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸配列によりコードされている。
前記膜貫通ドメインは、任意のヒンジドメインと組み合わせてもよく、及び／又は、本明細書に記載の１つ又は複数の膜貫通ドメインを含んでもよい。
本明細書に記載の膜貫通ドメイン、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β又はゼータ鎖の膜貫通領域、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４．ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ－４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９は、本明細書に記載の抗原結合ドメインのいずれか、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメイン又は細胞内ドメイン又は細胞質ドメインのいずれか、又はＣＡＲに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインのいずれかと組み合わせることができる。
一実施形態では、前記膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシン及びバリン等の疎水性残基が主体となって含まれる。
例示的な実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見られることになる。
いくつかの実施形態において、対象ＣＡＲは、前記ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、又は前記ＣＡＲの細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサドメインをさらに含んでもよい。本明細書で使用する場合、「スペーサードメイン」という用語は、一般に、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメイン又は細胞内ドメインに連結する機能を有する任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大約３００アミノ酸、例えば、約１０～約１００アミノ酸、又は約２５～約５０アミノ酸を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、短いオリゴ又はポリペプチドリンカー、例えば、長さが約２～約１０アミノ酸の間であってもよい。例えば、グリシン－セリンダブレット（doublet）は、前記対象ＣＡＲの前記膜貫通ドメインと前記細胞内シグナル伝達ドメインとの間に特に適したリンカーを提供する。
したがって、本開示の主題ＣＡＲは、本明細書に記載の膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン又はスペーサードメインのいずれかを含んでもよい。
３．細胞内ドメイン
本発明の主題ＣＡＲはまた、細胞内ドメインを含む。前記ＣＡＲの細胞内ドメインは、該ＣＡＲが発現している細胞（例えば、免疫細胞）のエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する役割を担う。前記細胞内ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞（例えば、免疫細胞）がその特殊な機能、例えば、標的細胞に危害を加える、及び／又は破壊することを実行するように指示する。
前記ＣＡＲの細胞内ドメイン又はそうでなければ細胞質ドメインは、ＣＡＲが発現している細胞の活性化を担う。本発明で使用する細胞内ドメインの例としては、表面受容体の細胞質部分、共刺激分子、及びＴ細胞におけるシグナル伝達を開始するために協調して作用する任意の分子、ならびにこれらの要素の任意の誘導体又は変異体、及び同じ機能能力を有する任意の合成配列が挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、前記細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
ある実施形態では、前記細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
ある実施形態では、前記細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
ある実施形態では、前記細胞内ドメインは、４－１ＢＢ及びＣＤ３ゼータを含む。
ある実施形態では、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢを含む。
ある実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータを含む。
一実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ、その誘導体又は変種、及び、同じ機能能力を有するその合成配列、及びそれらの組み合わせ）由来の細胞内ドメインの少なくとも一つのシグナル伝達ドメイン等の１つ又は複数の共刺激分子の任意の部分を含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
前記細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、限定されないが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖又はそのホモログ、例えば、η鎖、ＦｃｓＲＩγ及びβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇａ）鎖、Ｂ２９（Ｉｇ）鎖等、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、ε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ２８等のＴ細胞形質導入（transduction）に関わる他の分子が挙げられる。
一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、細胞質受容体を有する免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、及びこれらの組み合わせであり得る。
前記細胞内ドメインの他の例としては、１つ又は複数の分子又は受容体、これらに限定されないが、ＴＣＲ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８６、コモン（common）ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲ１１ａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ９、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＫＩＲファミリータンパク質、リンパ球機能関連（associated）抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１Ｉｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｉｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、本明細書に記載の他の共刺激分子、それらの誘導体、変異体又はフラグメント、同じ機能性能力を有する共刺激分子の合成配列、及びそれらの組合せ、
由来のフラグメント又はドメインが挙げられる。
細胞内ドメインの追加の例としては、限定されないが、ＣＤ３、Ｂ７ファミリー共刺激、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー受容体を含む第１、第２、及び第３世代のＴ細胞シグナル伝達タンパク質を含む他の種々の免疫シグナル伝達受容体のいくつかのタイプの細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、Park and Brentjens, J. Clin. Oncol., 33(6): 651-653 (2015)を参照されたい。）が挙げられる。
さらに、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫ及びＮＫＴ細胞（例えば、Hermanson and Kaufman, Front. Immunol., 6: 195 (2015)を参照されたい。）、例えば、ＮＫｐ３０（Ｂ７－Ｈ６）(例えば、Zhang et al., J. Immunol., 189(5): 2290-2299 (2012)を参照されたい)、及びＤＡＰ１２(例えば、Topfer et al., J. Immunol., 194(7): 3201-3212 (2015)を参照されたい。)のシグナル伝達ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０、及び、ＣＤ３ｚ、によって使用されるシグナル伝達ドメインを含んでもよい。
本発明の対象ＣＡＲにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインには、明確で検出可能なシグナル（例えば、細胞による１つ又は複数のサイトカインの産生物増加、標的遺伝子の転写の変化、タンパク質活性の変化；細胞挙動の変化、例えば、ＣＡＲの活性化（すなわち、抗原と二量化剤によって活性化される）に応答して、細胞死；細胞増殖；細胞分化；細胞生存；細胞シグナル伝達反応の調節等）を提供する任意の所望のシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、以下に記載するように、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６等）のＩＴＡＭモチーフを含む。
いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖を含む。
いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、膜結合ＣＡＲに共有結合しておらず、代わりに細胞質内に拡散している。
本発明の対象ＣＡＲにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインには、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）－含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭモチーフは、細胞内シグナル伝達ドメインにおいて２回繰り返され、ＩＴＡＭモチーフの第１及び第２のインスタンス（instance）は、６から８のアミノ酸によって互いに分離されている。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、３つのＩＴＡＭモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩＡ、ＦｃガンマＲＩＩＣ、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ、ＦｃＲＬ５等の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むヒト免疫グロブリン受容体のシグナル伝達ドメインを含む（例えば、Gillis et al., Front. Immunol., 5:254 (2014)を参照されたい）。
好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含むポリペプチドに由来するＩＴＡＭモチーフ含有部分(ITAM motif-containing portion)とすることができる。例えば、適切な細胞内シグナル伝達ドメインは、任意のＩＴＡＭモチーフ含有タンパク質由来のＩＴＡＭモチーフ含有ドメインであり得る。したがって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する全タンパク質の全配列を含む必要はない。好適なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃε受容体Ｉガンマ鎖）、ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３デルタ）、ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３イプシロン）、ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３ガンマ）、ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ゼータ）、及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合関連（associated）タンパク質アルファ鎖）。
一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯＢＰ；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；ＫＡＲＡＰ；ＰＬＯＳＬ；ＤＮＡＸ－活性化タンパク質１２；ＫＡＲ－結合タンパク質；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；キラー活性化受容体結合タンパク質；キラー活性化受容体結合タンパク質等としても知られている）由来である。
一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦＣＥＲ１Ｇ（ＦＣＲＧ；Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖；Ｆｃ受容体ガンマ鎖；ｆｃイプシロンＲＩガンマ；ｆｃＲガンマ；ｆｃｅＲ１ガンマ；高親和性免疫グロブリンε受容体サブユニットγ；免疫グロブリンＥ受容体、高親和性ガンマ鎖等としても知られている。）由来である。
一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖（ＣＤ３Ｄ；ＣＤ３－ＤＥＬＴＡ；Ｔ３Ｄ；ＣＤ３抗原、デルタサブユニット；ＣＤ３デルタ；ＣＤ３ｄ抗原、デルタポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）；ＯＫＴ３、デルタ鎖；Ｔ細胞受容体Ｔ３デルタ鎖；Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖等としても知られている）由来である。
一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ－４イプシロン鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、Ｔ３ｅ等としても知られている。）由来である。
一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ガンマ鎖（ＣＤ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ガンマ鎖、ＣＤ３－ガンマ、Ｔ３Ｇ、ガンマポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）等としても知られている。）由来である。
一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺ等としても知られている。）由来である。
一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連（associated）タンパク質アルファ鎖；ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン関連（associated）アルファ）；ＭＢ－１膜糖タンパク質；Ｉｇ－アルファ；膜結合免疫グロブリン関連（associated）タンパク質；表面ＩＧＭ関連（associated）タンパク質等としても知られている）由来である。
一実施形態において、本開示の対象ＣＡＲにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖を含む。
一実施形態では、本開示の対象ＣＡＲにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインは、ＺＡＰ７０ポリペプチドのことを含む。
いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ６６ｄの細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータの細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。
通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を採用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。前記細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分(truncated portion)を使用する場合、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、その切断部分をインタクト（intact）鎖の代わりに使用することができる。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含む。
本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのいずれか、本明細書に記載の抗原結合ドメインのいずれか、本明細書に記載の膜貫通ドメインのいずれか又はＣＡＲに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインのいずれかと組み合わせることができる。
さらに、対象ＣＡＲでの使用に適した変異細胞内シグナル伝達ドメインは、当技術分野で知られている。ＹＭＦＭモチーフはＩＣＯＳに存在し、ＰＩ３Ｋのｐ８５とｐ５０アルファの両サブユニットをリクルート(recruit)し、ＡＫＴシグナルを増強するＳＨ２結合モチーフである。例えば、Simpson et al. (2010) Curr. Opin. Immunol., 22:326-332を参照されたい。
一実施形態では、ＣＤ２８細胞内ドメイン変異体は、ＹＭＦＭモチーフを含むように生成され得る。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、これは配列番号２又は３に記載のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされてもよい。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ２８共刺激ドメインを含み、これは、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む核酸配列によりコードされてもよい。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ２８（ＹＭＦＭ）共刺激ドメインを含み、これは、配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸配列によってコード化されてもよい。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＩＣＯＳ共刺激ドメインを含み、これは、配列番号９又は配列番号１０に記載の塩基配列を含む核酸配列によってコードされてもよい。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＩＣＯＳ（ＹＭＮＭ）共刺激ドメインを含み、これは、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされてよい。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ２共刺激ドメインを含み、これは、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされてもよい。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ２７共刺激ドメインを含み、これは、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされてもよい。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＯＸ４０共刺激ドメインを含み、これは、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされてもよい。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１９又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含み、これはそれぞれ配列番号２０又は配列番号２２に記載の塩基配列を含む核酸配列によってコードされてもよい。
特異的な活性を維持しながら、前記細胞内ドメインの許容できるバリエーションは、当業者に知られているであろう。
例えば、いくつかの実施形態では、前記細胞内ドメインは、配列番号１９又は２１に記載されているアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
例えば、いくつかの実施形態において、前記細胞内ドメインは、配列番号２０又は２２に記載されているヌクレオチド配列のいずれかと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８ ＹＭＦＭ変異体共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２７共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＯＸ４０共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
例示的な一実施形態において、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
例示的な一実施形態において、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
表１は、本明細書に記載のＣＡＲのドメインの例示的な配列を示すものである。
Figure 2023540041000002
Figure 2023540041000003
Figure 2023540041000004
Ｂ．Ｔ細胞レセプター
いくつかの実施形態では、修飾非刺激免疫細胞又は修飾刺激免疫細胞（例えば、修飾非刺激又は刺激Ｔ細胞）は、外来性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現している。任意の抗原（例えば、固形腫瘍抗原）に対して親和性を有するＴＣＲを含む任意の修飾細胞が想定され、本明細書の開示に鑑みて当業者が容易に理解し製造することができる。
いくつかの実施形態では、前記標的細胞は、特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ遺伝子）を含むように改変(altered)されている。ＴＣＲ又はその抗原結合部分には、腫瘍、ウイルス又は自己免疫タンパク質の抗原等の標的ポリペプチドのペプチドエピトープ又はＴ細胞エピトープを認識するものが含まれる。
いくつかの実施形態において、前記ＴＣＲは、腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
いくつかの実施態様において、例示的な腫瘍関連抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＬＡＧＥ２、ＬＡＧＥ２Ｂ、又は癌／精巣抗原１）、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）及びＨ３．３Ｋ２７Ｍを含む。
ＴＣＲは、６つの異なる膜結合鎖からなるジスルフィド結合ヘテロ二量体タンパク質であり、抗原に応答したＴ細胞の活性化に関与している。アルファ／ベータＴＣＲとガンマ／デルタＴＣＲが存在する。アルファ／ベータＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を含む。ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を含むＴＣＲを発現するＴ細胞は、一般にアルファ／ベータＴ細胞と呼ばれる。ガンマ／デルタＴＣＲは、ＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を含む。ＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖からなるＴＣＲを発現するＴ細胞は、一般にガンマ／デルタＴ細胞と呼ばれている。本開示のＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含むＴＣＲである。ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖は、それぞれ可変領域と定常（constant）領域という２つの細胞外ドメインで構成されている。ＴＣＲアルファ鎖可変領域とＴＣＲベータ鎖可変領域は、ＴＣＲが標的抗原に親和するために必要な領域である。各可変領域は３つの超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、標的抗原との結合を提供する。ＴＣＲアルファ鎖の定常領域とＴＣＲベータ鎖の定常領域は、細胞膜の近傍にある。ＴＣＲはさらに、膜貫通領域と短い細胞質尾部を含む。ＣＤ３分子はＴＣＲヘテロ二量体と一緒に組み合わされる。ＣＤ３分子は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られているチロシンリン酸化のための特徴的な配列モチーフを含む。近傍のシグナル伝達イベントは、ＣＤ３分子を介して行われるため、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体の相互作用は、細胞認識イベントの媒介に重要な役割を果たす。
ＴＣＲの刺激は、抗原ペプチドをＴ細胞に提示する抗原提示細胞上の主要組織適合性複合体分子（ＭＨＣ）によって引き起こされ、ＴＣＲと相互作用して一連の細胞内シグナル伝達カスケードを誘発する。ＴＣＲが関与することで、細胞増殖、サイトカイン産生、活性化誘導性細胞死をもたらす正負両方のシグナル伝達カスケードが開始されます。
本発明のＴＣＲは、野生型ＴＣＲ、高親和性ＴＣＲ及び／又はキメラＴＣＲであり得る。高親和性ＴＣＲは、野生型ＴＣＲと比較して標的抗原に対して高い親和性を付与する野生型ＴＣＲに対する修飾の結果であってもよい。高親和性ＴＣＲは、親和性成熟（matured）ＴＣＲであってもよい。ＴＣＲ及び／又はＴＣＲの親和性成熟を修飾する方法は、当業者に知られている。ＴＣＲを工学的に発現させる技術には、それぞれのサブユニットを連結するネイティブなジスルフィドブリッジ（bridge）を含むＴＣＲヘテロ二量体の生産が含まれるが、これらに限定されない（Garboczi, et al., (1996), Nature 384(6605): 134-41; Garboczi, et al., (1996), J Immunol 157(12): 5403-10; Chang et al., (1994), PNAS USA 91 : 1 1408-1 1412; Davodeau et al., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460; Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; U.S. Pat. No. 6,080,840)。
いくつかの実施形態では、外来性ＴＣＲは、完全なＴＣＲ又はその抗原結合部分若しくは抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態において、前記ＴＣＲは、ａｂ形又はｇｄ形のＴＣＲを含む、インタクト(intact)又は全長ＴＣＲである。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、全長ＴＣＲよりも少ないが、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合する等、ＭＨＣ分子に結合した特定のペプチドに結合する抗原結合部分である。
いくつかの場合では、ＴＣＲの抗原結合部分又はフラグメントは、完全長又はインタクトなＴＣＲの構造ドメインの一部しか含まないが、それでも完全なＴＣＲが結合するＭＨＣ－ペプチド複合体等のペプチドエピトープを結合することが可能であり得る。
いくつかの場合では、抗原結合部は、特定のＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン、例えばＴＣＲの可変ａ鎖及び可変ｂ鎖を含む。
一般に、ＴＣＲの可変鎖は、ペプチド、ＭＨＣ及び／又はＭＨＣ－ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲの可変ドメインは、超可変ループ、すなわちＣＤＲを含み、これは一般に、抗原認識及び結合能力ならびに特異性に対して主として貢献するものである。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲのＣＤＲ又はその組み合わせは、所定のＴＣＲ分子の抗原結合部位の全て又は実質的に全てを形成する。ＴＣＲ鎖の可変領域内の種々のＣＤＲは、一般にフレームワーク領域（ＦＲ）によって分離され、このフレームワーク領域は、ＣＤＲと比較して、一般にＴＣＲ分子間でより少ない変動を示す（例えば、Jores et al, PNAS, 87:9138 (1990); Chothia et al., EMBO J., 7:3745 (1988)を参照されるか、Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 27:55 (2003)を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、抗原結合又は特異性を担う主要なＣＤＲであるか、又は抗原認識、及び／又はペプチド－ＭＨＣ複合体の処理されたペプチド部分との相互作用について、所定のＴＣＲ可変領域上の３つのＣＤＲの中で最も重要である。
いくつかの状況では、アルファ鎖のＣＤＲ１は、ある種の抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することができる。
いくつかの状況では、ベータ鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用することができる。
いくつかの状況では、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ－ペプチド複合体のＭＨＣ部分との相互作用又は認識に最も強く寄与するか、又はそれを担う主要なＣＤＲである。
いくつかの実施形態では、ｂ鎖の可変領域は、一般に超抗原結合に関与し、抗原認識には関与しない、さらなる超可変領域（ＣＤＲ４又はＨＶＲ４）を含み得る（Kotb, Clinical Microbiology Reviews, 8:41 1-426 (1995)）。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、可変アルファドメイン（Ｖａ）及び／又は可変ベータドメイン（Ｖｐ）又はそれらの抗原結合フラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲのアルファ鎖及び／又はベータ鎖はまた、定数ドメイン（constant domain）、膜貫通ドメイン及び／又は短い細胞質尾部を含み得る（例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3 Ed., Current Biology Publications, p. 4:33 (1997)を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、前記アルファ鎖定数ドメインは、ＴＲＡＣ遺伝子（ＩＭＧＴ命名法）によってコードされるか、又はその変異体である。
いくつかの実施形態において、前記ベータ鎖定数領域は、ＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２遺伝子（ＩＭＧＴ命名法）によりコードされるか、又はその変異体である。
いくつかの実施形態では、前記定数ドメインは、細胞膜に隣接している。
例えば、いくつかの場合では、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜近位定数ドメイン(membrane-proximal constant domains)、及び２つの膜遠位可変ドメイン(membrane-distal variable domains)を含み、これらの可変ドメインはそれぞれＣＤＲを含む。
ＴＣＲの様々なドメイン又は領域を決定又は識別することは、当業者のレベルの範囲内である。
いくつかの態様において、ＴＣＲの残基は、知られているか、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）番号付けシステムに従って特定することができる（例えば、www.imgt.org; see also, Lefranc et al., Developmental and Comparative Immunology, 2:55-77 (2003)、及びThe T Cell Factsbook 2nd Edition, Lefranc and LeFranc Academic Press 2001を参照されたい。）。このシステムを用いると、ＴＣＲ Ｖａ鎖及び／又はｎｂ鎖内のＣＤＲ１配列は、残基番号２７～３８の間（両端を含む）に存在するアミノ酸に対応し、ＴＣＲ Ｖａ鎖及び／又はｎｂ鎖内のＣＤＲ２配列は、残基番号５６～６５の間（両端を含む）に存在するアミノ酸に対応し、ＴＣＲ Ｖａ鎖及び／又はｎｂ鎖内のＣＤＲ３配列は残基番号１０５～１１７の間（両端を含む）に存在するアミノ酸に対応する。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、１つのジスルフィド結合又は複数のジスルフィド結合等によって連結された２つの鎖ａ及びｂ（又は任意にｇ及びｄ）のヘテロ二量体であってもよい。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲの定数ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによってＴＣＲの２つの鎖を連結する短い連結配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、該ＴＣＲが定数ドメインにおいて２つのジスルフィド結合を含むように、ａ鎖及びｂ鎖の各々に追加のシステイン残基を有することができる。
いくつかの実施形態において、前記定数ドメイン及び前記可変ドメインの各々は、システイン残基によって形成されるジスルフィド結合を含む。
いくつかの実施形態において、記載されるように細胞を操作するためのＴＣＲは、実質的に全長のコード化配列が容易に入手可能である、ｎａ、ｂ鎖の配列等の既知のＴＣＲ配列から生成したものである。Ｖ鎖配列を含む全長ＴＣＲ配列を細胞源から取得する方法はよく知られている。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードする核酸は、所定の一つの細胞又は複数の細胞内または細胞から単離されたＴＣＲをコードする核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅又は公的に利用可能なＴＣＲ ＤＮＡ配列の合成等、様々なソースから得ることができる。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、生物学的源、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマ又は他の公知の源等から細胞等から得られる。
いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、インビボで分離された細胞から得ることができる。
いくつかの実施形態では、Ｔ－細胞は、培養されたＴ－細胞ハイブリドーマ又はクローンであることができる。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ又はその抗原結合部分は、前記ＴＣＲの配列の知識（knowledge）から合成的に生成することができる。
いくつかの実施形態では、標的抗原（例えば、癌抗原）に対する高親和性Ｔ細胞クローンが同定され、患者から単離され、細胞に導入される。
いくつかの実施形態において、標的抗原のＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、又はＨＬＡ）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて生成されている。例えば、腫瘍抗原（例えば、Parkhurst et al., Clin Cancer Res., 15: 169-180 (2009)及びCohen et al., J. Immunol., 175:5799-5808 (2005)を参照のこと）が参照できる。
いくつかの実施形態において、ファージディスプレイ（Phage display）は、標的抗原に対するＴＣＲを単離するために使用される（例えば、Varela-Rohena et al., Nat. Med., 14: 1390-1395 (2008) and Li, Nat. Biotechnol., 23:349-354 (2005)を参照のこと。）。
いくつかの実施形態において、前記ＴＣＲ又はその抗原結合部分は、修飾又は操作されたものである。
いくつかの実施形態では、指向性進化法(directed evolution)は、特定のＭＨＣ－ペプチド複合体に対するより高い親和性等、変化した特性を有するＴＣＲを生成するために使用される。
いくつかの実施形態において、指向性進化は、限定されるものではないが、酵母ディスプレイ(Holler et al., Nat. Immunol., 4:55-62 (2003); Holler et al., PNAS USA,97: 5387-92 (2000))、ファージディスプレイ（Li et al., Nat. Biotechnol., 23: 349-54 (2005)）、又はＴ細胞ディスプレイ（Chervin et al., J. Immunol. Methods, 339:175-84 (2008)）に含まれる、ディスプレイ法により達成される。
いくつかの実施形態では、ディスプレイアプローチは、既知の、親又は参照ＴＣＲを操作する、又は修正することを含む。例えば、いくつかの場合では、野生型ＴＣＲを、ＣＤＲの１つ又は複数の残基が変異した変異型(mutagenized)ＴＣＲを製造するためのテンプレートとして使用することができ、所望の標的抗原に対する高い親和性等、所望の変更特性を有する変異体が選択される。
記載されるようないくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、導入された１つ又は複数のジスルフィド結合を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ネイティブなジスルフィド結合は存在しない。
いくつかの実施形態では、ネイティブな鎖間ジスルフィド結合を形成するネイティブなシステイン（例えば、ａ鎖及びｂ鎖の前記定数ドメインにおいて）の１つ又は複数は、セリン又はアラニン等の別の残基に置換されている。
いくつかの実施形態では、導入されたジスルフィド結合は、アルファ鎖及びベータ鎖の非システイン残基、例えば、ａ鎖及びｂ鎖の定数ドメインにおいて、システインに変異させることによって形成することができる。ＴＣＲの例示的な非ネイティブジスルフィド結合は、ＷＯ２００６／０００８３０及びＷＯ２００６／０３７９６０に記載されている。
いくつかの実施形態では、システインは、アルファ鎖のＴｈｒ４８及びベータ鎖のＳｅｒ５７残基、アルファ鎖のＴｈｒ４５及びベータ鎖のＳｅｒ７７残基、アルファ鎖のＴｙｒＩＯ及びベータ鎖のＳｅｒｌ７残基、アルファ鎖のＴｈｒ４５及びベータ鎖のＡｓｐ５９残基及び／又はアルファ鎖のＳｅｒｌ５及びベータ鎖のＧｕｌｕｌ５残基に導入され得る。
いくつかの実施形態では、組換えＴＣＲにおける非ネイティブシステイン残基（例えば、１つ又は複数の非ネイティブジスルフィド結合をもたらす）の存在は、ネイティブＴＣＲ鎖を含むミスマッチＴＣＲペア（pair）の発現よりも、それが導入された細胞における所望の組換えＴＣＲの産生を有利にできる。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、正に荷電している。
いくつかの場合では、前記ＴＣＲ鎖は、細胞質尾部を含み得る。
いくつかの態様では、ＴＣＲの各鎖（例えば、アルファ又はベータ）は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定数ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端の短い細胞質尾部を保有し得る。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、例えば細胞質尾部を介して、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体の不変タンパク質と関連している。
いくつかの場合では、前記構造は、前記ＴＣＲがＣＤ３やそのサブユニットのような他の分子と関連する（associate）ことを可能にする。
例えば、膜貫通領域を持つ定数ドメインを含むＴＣＲは、タンパク質を細胞膜に固定し（anchor）、ＣＤ３シグナル伝達装置又は複合体の不変サブユニットと関連することができる。ＣＤ３シグナル伝達サブユニット（ＣＤ３Ｙ、ＣＤ３６、ＣＤ３ｓ、Ｏウプシロン３ｚ鎖等）の細胞内尾部には、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する１つ又は複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ又はＩＴＡＭｓを含む。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、全長ＴＣＲである。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、抗原結合部分である。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃ－ＴＣＲ）である。前記ＴＣＲは、細胞結合型であっても、可溶性型であってもよい。
いくつかの実施形態では、提供される方法の目的のために、前記ＴＣＲは、細胞の表面で発現する細胞結合型である。
いくつかの実施形態では、前記ｄＴＣＲは、ＴＣＲ ａ鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲ ａ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合した第１のポリペプチドと、ＴＣＲ ｂ鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲ ｂ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合した第２のポリペプチドとを含み、前記第１及び第２のポリペプチドはジスルフィド結合により連結されている。
いくつかの実施形態では、前記結合は、ネイティブな二量体ａｂ ＴＣＲに存在するネイティブな鎖間ジスルフィド結合に対応し得る。
いくつかの実施形態では、前記鎖間ジスルフィド結合は、ネイティブＴＣＲに存在しない。
例えば、いくつかの実施形態では、１つ又は複数のシステインがｄＴＣＲポリペプチドペアの定常領域細胞外配列に組み込まれることができる。
いくつかの場合では、ネイティブと非ネイティブの両方のジスルフィド結合が望ましい場合もある。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、膜に固定（anchor）するための膜貫通配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｄＴＣＲは、可変ａドメイン、定数ａドメイン及び前記定数ａドメインのＣ末端に付着した第１の二量化モチーフを含むＴＣＲ ａ鎖、並びに可変ｂドメイン、定数ｂドメイン及び定数ｂドメインのＣ末端に付着した第１の二量化モチーフを含むＴＣＲ ｂ鎖を含み、第１及び第２の二量化モチーフは、容易に相互作用して、ＴＣＲ ａ鎖及びＴＣＲ ｂ鎖を一緒につなぐ第１の二量化モチーフのアミノ酸と第２の二量化モチーフのアミノ酸との間に共有結合を形成する。
いくつかの実施形態において、前記ＴＣＲは、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合することができるα鎖及びβ鎖を含む単一アミノ酸鎖であるｓｃＴＣＲである。
典型的には、ｓｃＴＣＲは、当業者に公知の方法を用いて生成することができ、例えば、ＷＯ１９９６／１３５９３、ＷＯ１９９６／１８１０５、ＷＯ１９９９／１８１２９、ＷＯ２００４／０３３６８５、ＷＯ２００６／０３７９６０、ＷＯ２０１１／０４４１８６、米国特許第Ｎｏ．７，５６９，６６４号及びSchlueter et al. J. Mol. Biol., 256:859 (1996)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、Ｃａ又はＣＰ膜貫通ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、非ＴＣＲ由来、例えば、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８又はＢ７．１由来の膜貫通領域であり得る。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、細胞質配列に対応する配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、ＣＤ３とＴＣＲ複合体を形成することが可能である。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ又はその抗原結合部分は、結合特性等の１つ又は複数の特性が変更された、組換え生産された天然タンパク質又はその変異型であってもよい。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット又は他の哺乳類等の様々な動物種のうちの１つに由来し得る。
いくつかの実施形態において、前記ＴＣＲは、標的細胞上の標的抗原に対する親和性を含んでいる。前記標的抗原は、前記標的細胞に関連する（associated）任意のタイプのタンパク質、又はそのエピトープを含むことができる。例えば、前記ＴＣＲは、前記標的細胞の特定の疾患状態を示す標的細胞上の標的抗原に対する親和性を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、前記標的抗原は、ＭＨＣによって処理され、提示される（presented）。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、第１の異種ＴＣＲサブユニット鎖を順次コードする核酸構築物(construct)によってコードされ、前記ＴＣＲサブユニット鎖は、ＴＣＲサブユニット鎖の可変領域及び定数領域、ならびに第２の異種ＴＣＲサブユニット鎖の可変領域及び可変領域を含む。前記構築物は、第１の異種ＴＣＲサブユニット鎖の可変領域に先行する第１の自己開裂ペプチド、及び第１の異種ＴＣＲサブユニット鎖と第２のＴＣＲサブユニットとの間の第２の自己開裂ペプチドをさらにコードする。
いくつかの実施形態では、前記第１の異種ＴＣＲサブユニット鎖は、ＴＣＲα鎖であり、前記第２の異種ＴＣＲサブユニット鎖は、ＴＣＲβ鎖である。
いくつかの実施形態では、前記第１の異種ＴＣＲサブユニット鎖は、ＴＣＲβ鎖であり、前記第２の異種ＴＣＲサブユニット鎖はＴＣＲα鎖である。
自己開裂ペプチドの例としては、これらに限定されないが、自己開裂ウイルス２Ａペプチド、例えば、ブタテスコウイルス－１（Ｐ２Ａ）ペプチド、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）（Ｔ２Ａ）ペプチド、馬鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）ペプチド又は口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）ペプチドが挙げられる。自己開裂２Ａペプチドは、１つの構築物（construct）から複数の遺伝子生成物を発現させることができる（例えば、Chng et al. "Cleavage efficient 2A peptides for high level monoclonal antibody expression in CHO cells," MAbs, 7(2): 403-412 (2015)を参照されたい。）。
いくつかの実施形態では、前記第１及び第２の自己開裂ペプチドは、同じである。
いくつかの実施形態では、前記第１及び第２の自己開裂ペプチドは、異なる。
Ｃ．抗原結合ポリペプチドの追加
いくつかの実施形態では、前記修飾非刺激免疫細胞又は修飾刺激免疫細胞（例えば、修飾非刺激又は刺激Ｔ細胞）は、抗原結合ドメイン、細胞表面受容体リガンド、又は腫瘍抗原に結合するポリペプチドを発現する。
いくつかの例では、前記抗原結合ドメインは、細胞表面タンパク質又は腫瘍細胞上に発現する受容体を認識する抗体を含む。
いくつかの例では、前記抗原結合ドメインは、腫瘍抗原を認識する抗体を含む。
いくつかの例では、前記抗原結合ドメインは、全長抗体又はその抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、Ｖ－ＮＡＲ又はＶｈＨを含む。
いくつかの実施形態では、前記修飾非刺激免疫細胞又は修飾刺激免疫細胞（例えば、修飾非刺激又は刺激Ｔ細胞）は、細胞表面受容体リガンドを発現する。
いくつかの例では、前記リガンドは、腫瘍細胞上に発現する細胞表面受容体に結合する。
いくつかの場合では、前記リガンドは、前記細胞表面レセプターに結合する野生型タンパク質又はその変異体を含む。
いくつかの例では、前記リガンドは、前記細胞表面受容体に結合する全長タンパク質又はその機能性フラグメントを含む。
いくつかの場合では、前記機能性フラグメントは、タンパク質の全長バージョンと比較して、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％又は約４０％の長さを含むが、前記細胞表面受容体への結合は保持される。
いくつかの場合では、前記リガンドは、前記細胞表面の受容体に結合するＤｅ Ｎｏｖｏ操作タンパク質(de novo engineered protein)である。例示的なリガンドとしては、これらに限定されないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、又はＷｎｔ３Ａ等が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記修飾非刺激免疫細胞又は修飾刺激免疫細胞（例えば、修飾非刺激又は刺激Ｔ細胞）は、腫瘍抗原に結合するポリペプチドを発現する。
いくつかの例では、前記腫瘍抗原は血液学的悪性腫瘍に関連（associated）している。例示的な腫瘍抗原としては、これらに限定されないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＲＯＲ１、メソセリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ２、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ４（ＧＦＲａ４）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びＩＬ１３Ｒａ２等が挙げられる。
いくつかの実施態様では、前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３７、メソセリン、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＧＤ２、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＲＡＳ又はＷＴ１を含む。
いくつかの実施態様において、前記ポリペプチドは、前記腫瘍抗原のリガンド、例えば、前記腫瘍抗原に結合する全長タンパク質、その機能性フラグメント、又は腫瘍抗原に結合するｄｅ ｎｏｖｏ操作リガンドである。
いくつかの例では、前記ポリペプチドは、前記腫瘍抗原に結合する抗体である。
ＩＶ．組成物
本発明の組成物は、本明細書に記載の修飾非刺激免疫細胞又は本明細書に記載の修飾刺激免疫細胞、任意に、１つ又は複数の薬学的又は生理学的に許容できる担体、希釈剤、アジュバント又は賦形剤と組み合わせて含んでよい。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等の緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン等の炭水化物、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はグリシン等のアミノ酸、抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは非経口投与（例えば、静脈内投与）用に製剤化される。
Ｖ．使用方法
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、対象における疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の修飾非刺激免疫細胞集団又は本明細書に記載の修飾刺激免疫細胞集団を対象に投与することを含んでいる。
いくつかの実施態様では、前記疾患は、癌、任意で固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である。
いくつかの実施態様において、修飾非刺激免疫細胞又は修飾刺激免疫細胞はそれぞれ、癌によって発現される抗原に特異的である抗原結合ドメインを発現する。
いくつかの実施形態では、前記癌は、固形腫瘍である。例示的な固形腫瘍としては、これらに限定されないが、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍（例えば、神経膠腫、膠芽腫、神経芽細胞腫）、乳癌、大腸癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、腎癌、肺癌、メラノーマ、中皮腫、卵巣癌、すい臓癌、前立腺癌又は胃癌が挙げられる。
いくつかの例では、前記固形腫瘍は、脳腫瘍（例えば、神経膠腫、膠芽腫、神経芽細胞腫）、乳癌、肺癌、メラノーマ、中皮腫、卵巣癌、膵臓癌又は前立腺癌である。
いくつかの例では、前記固形腫瘍は、転移性癌である。
いくつかの場合では、前記固形腫瘍は、再発又は難治性の固形腫瘍である。
いくつかの実施形態において、癌は、血液学的悪性腫瘍である。
いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は、Ｂ細胞悪性腫瘍又はＴ細胞悪性腫瘍である。
いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は、リンパ腫、白血病又は骨髄腫である。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である。
例示的な血液悪性腫瘍としては、これららに限定されないが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節内辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高グレードＢ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞性リンパ球性白血病、リンパ球形質性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性胸水リンパ腫又はリンパマトイド肉芽腫症が挙げられる。
いくつかの例では、前記血液悪性腫瘍は、転移性血液悪性腫瘍である。
いくつかの場合では、前記血液悪性腫瘍は、再発性又は難治性の血液悪性腫瘍である。
いくつかの実施形態において、疾患を処置する方法は、対象に追加の治療剤を投与する又は追加の治療をさらに含む。
いくつかの場合では、本明細書に開示される追加の治療薬は、化学療法剤、免疫療法剤、標的療法、放射線療法又はそれらの組み合わせを含む。例示的な追加の治療剤には、これらに限定されないが、アルトレタミン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ロムスチン、メルファラン、オキサラプラチン、テモゾロマイド又はチオテパ等のアルキル化剤、；５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、カペシタビン、シタラビン、フロクスリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート又はペメトレキセド等の代謝拮抗剤；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン又はイダルビシン等のアントラサイクリン；トポテカン又はイリノテカン（ＣＰＴ－１１）等のトポイソメラーゼＩ阻害剤；エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド又はミトコキサントロン等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；ドセタキセル、エストラムスチン、イクサベピロン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビノレルビン等の分裂阻害剤；又はプレドニゾン、メチルプレドニゾロン又はデキサメタゾン等のコルチコステロイド等が挙げられる。
いくつかの場合では、追加の治療剤は、第一選択療法（first-line therapy）を含み。本明細書で使用する場合、「第一選択療法」は、癌を有する対象のための一次治療を含んでいる。
いくつかの例では、前記癌は、原発性癌である。
他の例では、前記癌は、転移性又は再発性の癌である。
いくつかの場合では、前記第一選択療法は、化学療法を含む。
他の場合では、前記第一選択治療は、放射線治療を含む。当業者であれば、異なる第一選択治療が異なるタイプの癌に適用され得ることを容易に理解するであろう。
いくつかの態様では、前記追加治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含んでなる。
いくつかの例では、前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗体又はそのフラグメント等の阻害剤（例えば、、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化抗又はキメラ抗体）、ＲＮＡｉ分子、又はＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、ＫＩＲ、ＣＤ１３７、ＰＳ、ＴＦＭ３、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＴＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＣＤ２２６、ＣＤ２又はＳＬＡＭに対する低分子を含む。
例示的なチェックポイント阻害剤としては、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、トレメリムマブ、又はイピリムマブが挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記追加療法は、放射線療法を含んでいる。
いくつかの実施形態では、追加療法は、手術を含んでいる。
ＶＩ．キットと製造品
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキット又は製造品は、修飾非刺激免疫細胞（例えば、修飾非刺激Ｔ細胞）の１つ又は複数の集団又は修飾刺激免疫細胞（例えば、修飾刺激Ｔ細胞）の１つ又は複数の集団を含む。
いくつかの例では、本明細書に記載のキット又は製造品は、バイアル、チューブ等の１つ又は複数の容器を受け入れるように区画されたキャリア、パッケージ、又は容器をさらに含み、容器のそれぞれは、本明細書に記載の方法で使用する別々の要素のうちの１つを含んでいる。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管等が挙げられる。
一実施形態では、前記容器は、ガラスやプラスチック等の様々な材料から形成される。
本明細書で提供される製造物品は、包装材を含む。医薬品包装材料の例としては、これらに限定されないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、及び選択された製剤及び意図された投与及び治療の様式に適した任意の包装材料が挙げられる。
キットは、通常、内容物及び／又は使用方法を記載したラベル、及び使用方法を記載したパッケージの挿入物を含む。また、通常、説明書も同梱される。
ＶＩＩ．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における通常の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本開示の実施又は試験において、本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を使用することができるが、好適な方法及び材料が本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを示さない限り、複数の参照語を含む。例えば、「細胞（a cell）」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
本明細書で使用する場合、「約(about)」という用語は、値が、値を決定するために採用されている装置又は方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。数値指定、例えば温度、時間、量、濃度（範囲を含む）の前に使用される「約（about）」という用語は、（＋）又は（－）１５％、１０％、５％、３％、２％又は１％によって変化する可能性がある近似値を示す。
本開示の実施は、特に断らない限り、当業者の技術範囲内である組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来技術を採用することになる。
例えば、Green and Sambrook eds. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition; the series Ausubel et al. eds. (2015) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (2015) PCR 1 : A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; McPherson et al. (2006) PCR: The Basics (Garland Science); Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Greenfield ed. (2014) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2010) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 6th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Herdewijn ed. (2005) Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Buzdin and Lukyanov ed. (2007) Nucleic Acids Hybridization: Modern Applications; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Grandi ed. (2007) In Vitro Transcription and Translation Protocols, 2nd edition; Guisan ed. (2006) Immobilization of Enzymes and Cells; Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition; Miller and Calos eds, (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Lundblad and Macdonald eds. (2010) Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 4th edition; and Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th editionを参照されたい。
「同種異系（Allogeneic）」とは、同じ種の異なる動物に由来するあらゆる材料を指す。
本明細書で使用する場合、「抗体（antibody）」は、目的の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対する重要な既知の特異的免疫反応活性を有するそのような集合体（例えば、インタクトの抗体分子、免疫アドヘシン又はそれらの変異体）を指す。抗体や免疫グロブリンは、軽鎖と重鎖を含み、その間に鎖間共有結合があっても、なくてもよい。脊椎動物系の免疫グロブリンの基本構造は、比較的よく理解されています。
「抗体フラグメント」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトの抗体の抗原性決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体等が挙げられる。
例えばキメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体変異体（antibody variants）を含む。本明細書で使用される場合、「抗体変異体」という用語には、天然に存在しないように合成及び操作された形態の抗体、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが２つの完全な重鎖ではない抗体（例えば、ドメイン削除抗体又はミニボディ）；２つ又はそれ以上の異なる抗原又は単一の抗原上の異なるエピトープに結合するように改変した多特異的形態の抗体（例えば、二特異性、三特異性等）；重鎖分子をｓｃＦｖ分子等に結合したもの等が挙げられる。さらに、「抗体変異体」という用語には、多価の形態の抗体（例えば、３価、４価等、同じ抗原の３、４又はそれ以上のコピーに結合する抗体）が含まれる。
本明細書で使用される「抗原」又は「Ａｇ」という用語は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫反応には、抗体産生、特定の免疫担当細胞の活性化のいずれか、あるいは両方が関与してもよい。当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質又はペプチドを含むあらゆる高分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来することもできる。当業者であれば、免疫反応を引き起こすタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、したがって、本明細書においてその用語が使用される「抗原」をコードすることを理解する。さらに、当業者であれば、抗原は遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解できるであろう。本発明は、これらに限定されないが、１つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列、及びこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を引き出すために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者であれば、抗原が「遺伝子」によってコード化されている必要は全くないことを理解できるであろう。抗原は、合成して生成することもできるし、生物学的サンプルに由来することもできることは、容易に明らかである。このような生物学的サンプルは、これらに限定されないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞又は生物学的流体が含み得る。
本明細書で使用される場合、「自己の（autologous）」という用語は、後に個体に再導入される可能性のある同じ個体に由来する任意の材料を指すことを意図している。
本明細書で使用する用語「キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor）」又は「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞又はその前駆体細胞上で発現し、抗原と特異的に結合するように設計された人工Ｔ細胞受容体を指す。ＣＡＲは、養子細胞移植による養子細胞療法に使用することができる。
いくつかの実施形態では、養子細胞移植（又は治療）は、患者からＴ細胞を除去すること、及び特定の抗原に特異的な受容体を発現するようにＴ細胞を修飾することを含む。
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、選択された標的、例えば、ＰＳＭＡ又はＭＵＣ１に対する特異性を有する。ＣＡＲはまた、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含み得る。
「発現ベクター（expression vector）」とは、発現させるべきヌクレオチド配列に作動的に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現に必要な十分なシス作用要素を含んでいる。発現のための他の要素は、宿主細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系で供給することができる。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸又はリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、センダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）等の当該分野で知られているものをすべて含む。
「開裂（cleavage）」という用語は、核酸分子のバックボーンやペプチド結合の加水分解のような共有結合の切断を意味します。開裂は、これらに限定されないが、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を含む、様々な方法によって開始することができる。一本鎖の開裂と二本鎖の開裂の両方が可能である。二本鎖開裂は、２つの異なる一本鎖開裂イベントの結果として発生し得る。ＤＮＡの開裂は、平滑末端又は千鳥状末端が生成され得る。
本明細書で使用される「相同性(homologous)」は、２つの高分子分子間、例えば、２つの核酸分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子、又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方のサブユニットの位置が同じモノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、その位置で相同である。２つの配列の相動性は、一致する又は同一である位置の数の直接的な関数である。例えば、２つの配列の位置の半分（例えば、長さ１０サブユニットのポリマー中の５つの位置）が同一であれば、２つの配列は５０％同一であり、９０％の位置（例えば、１０個のうちの９個）が一致又は同一であれば、２つの配列は９０％同一である。
「非相同性末端接合（non-homologous end joining）」又はＮＨＥＪという用語は、ＤＮＡ鎖の開裂した又は傷ついた末端が、相同性テンプレート核酸を必要とせずに直接結紮されるプロセスを意味する。ＮＨＥＪの修復は、修復部位の１つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換又はそれらの組み合わせをもたらすことができる。
「相同性指向性修復(homology-directed repair)」又はＨＤＲという用語は、ＤＮＡ鎖の開裂した又は傷ついた末端が、相同性テンプレート又はドナー、核酸の挿入によって修復されるプロセスを指す。このとき、元のＤＮＡ配列は、相同性テンプレートＤＮＡに置き換えられる。前記相同性テンプレート核酸は、ゲノムの他の場所（姉妹染色体、相同染色体又は同一若しくは異なる染色体上の反復領域）の相同配列によって提供することができる。外来性テンプレート核酸を導入することで、標的部位の配列のＨＤＲによる特異的な変化を得ることができる。これにより、切断部位に特定の変異や導入遺伝子を導入することができる。前記外来テンプレートは、ＨＤＲによって導入される導入遺伝子又は変異をコードする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）テンプレート又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）テンプレートであってよい。
いくつかの場合では、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡテンプレートは、標的カット又は挿入部位に挿入される異種配列を含む領域を挟む２つの相同性領域、例えば５’末端と３’末端を含む。
本明細書で使用される「上流（upstream）」という用語は、ゲノム内の特定の部位又は遺伝子座、例えば、ゲノム編集システムによって触媒される開裂部位の５’に見出される核酸配列を意味する。本明細書で使用される「下流（downstream）」という用語は、ゲノム中の特定の部位又は遺伝子座の３’に見出される核酸配列を意味する。
本明細書で互換的に使用される「有効量(effective amount)」又は「治療上有効量(therapeutically effective amount)」は、それを必要とする対象において所望の生理学的、治療的又は予防的な結果を達成するのに有効な、本明細書に記載の化合物、製剤、材料、医薬剤又は組成物の量を指す。そのような結果には、これらに限定されないが、哺乳類に投与したときに、本発明の組成物の非存在下で検出された免疫応答と比較して、検出可能なレベルの免疫応答を引き起こす量が含まれ得る。前記免疫応答は、多くの技術的に認知された方法によって容易に評価することができる。当業者であれば、本明細書に投与される組成物の量は、治療される疾患又は状態、治療される哺乳類の年齢及び健康状態及び身体状態、疾患の重症度、投与される特定の化合物等の多くの要因に基づいて変化し、容易に決定できることを理解するであろう。有効量は、治療される対象の健康及び身体状態、治療される対象の分類群、組成物の製剤、対象の病状の評価、及び他の関連要因に応じて、対象間で変化し得る。
「エンコード(encoding)」とは、遺伝子、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列が、ヌクレオチドの規定配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の規定配列とその結果得られる生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成用のテンプレートとなる固有の特性のことをいう。このように、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写と翻訳が細胞又は他の生物系でタンパク質を生成する場合、タンパク質をコードする。遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用されるコード鎖（そのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表で提供される）と非コード鎖の両方を、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードするものと呼ぶことができる。
本明細書で使用される「内因性(endogenous)」とは、生物、細胞、組織又はシステム由来の、又はその内部で生成される任意の物質を指す。
本明細書で使用される「エピトープ(epitope)」という用語は、Ｂ及び／又はＴ細胞応答を誘導する、免疫応答を誘発することができる抗原上の小さな化学分子として定義される。抗原は１つ又は複数のエピトープを持つことができる。ほとんどの抗原は多くのエピトープを持ち、すなわち多価である。一般的にエピトープは、約１０個のアミノ酸又は糖の大きさである。
特定の例示的な実施形態では、前記エピトープは、約４～１８アミノ酸、約５～１６アミノ酸、約６～１４アミノ酸、約７～１２アミノ酸、約１０～１２アミノ酸又は約８～１０アミノ酸である。当業者は、一般に、分子の特定の直鎖配列ではなく、全体の三次元構造が抗原特異性の主な基準であり、したがって、あるエピトープと別のエピトープを区別することを理解する。本開示に基づき、本発明で用いられるペプチドは、エピトープであり得る。
本明細書で使用される場合、「外因性(exogenous)」という用語は、生物、細胞、組織又はシステムの外から導入された、又は生成された任意の材料を指す。
本明細書で使用される用語「拡大する(expand)」は、Ｔ細胞の数の増加のように、数が増えることを意味する。
一実施形態では、生体外(ex vivo)で拡張されたＴ細胞は、培養物中に元々存在した数と比較して、相対的に数が増加する。
別の実施形態では、生体外で増殖したＴ細胞は、培養中の他の細胞種と比較して数が増加する。本明細書で使用される「生体外(ex vivo)」とは、生体（例えば、ヒト）から取り出し、生体外（例えば、培養皿、試験管、バイオリアクター内）で増殖させた細胞を指す。
本明細書で使用される「発現(expression)」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
本明細書で使用される「同一性(identity)」は、２つのポリマー分子間、特に２つのアミノ酸分子間、例えば、２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を意味する。２つのアミノ酸配列の同じ位置に同じ残基がある場合。例えば、２つのポリペプチド分子のそれぞれの位置がアルギニンによって占められている場合、その位置では同一である。アライメント(alignment)において、２つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を持つ同一性又はその程度は、しばしばパーセントで表される。２つのアミノ酸配列の同一性は、一致する又は同一である位置の数の直接的な関数である。例えば、２つの配列の位置の半分（例えば、長さ１０アミノ酸のポリマー中の５つの位置）が同一であれば、２つの配列は５０％同一であり、９０％の位置（例えば、１０個のうちの９個）が一致又は同一であれば、２つのアミノ酸配列は９０％同一である。
「単離されている(isolated)」とは、自然の状態から変化した、又は取り除かれたことを意味する。例えば、生体内に天然に存在する核酸やペプチドは、「単離されてい」ないが、同じ核酸やペプチドが天然状態の共存物質から一部又は完全に分離されたものは、「単離されて」いるる。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することもできるし、例えば宿主細胞のような非天然の環境下で存在することもできる。
本明細書で使用される「ノックダウン(knockdown)」という用語は、１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現の減少を意味する。
本明細書で使用される「ノックアウト(knockout)」という用語は、１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現のアブレーション8ablation)を意味する。
本明細書で使用される「レンチウイルス(lentivirus)」は、レトロウイルス科の属を意味する。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも、分裂していない細胞に感染することができるという特徴があり、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送り込むことができるため、遺伝子導入ベクターの中でも最も効率的な方法のひとつといえる。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは、すべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、生体内で有意なレベルの遺伝子導入を実現する手段を提供するものである。
本明細書で使用される「修飾された(modified)」という用語は、本発明の分子又は細胞の変化した状態又は構造を意味する。分子は、化学的、構造的、機能的等、さまざまな方法で修飾されてもよい。核酸の導入により、細胞を修飾することができる。
本明細書で使用される「調節する(modulating)」という用語は、治療又は化合物の非存在下での対象における応答のレベルと比較して、及び／又は他の同一だが未治療の対象における応答のレベルと比較して、対象における応答のレベルを検出可能に増加又は減少することを媒介することを意味する。この用語は、ネイティブ（native）のシグナル又は応答を妨害及び／又は影響し、それによって対象（例えば、ヒト）における有益な治療応答を媒介することを包含する。
本発明の文脈では、一般的に存在する核酸塩基の以下の略号が使用される。「Ａ」は、アデノシン、「Ｃ」は、シトシン、「Ｇ」は、グアノシン、「Ｔ」は、チミジン、「Ｕ」は、ウリジンを意味する。
特に指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮退版であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句（phrase）は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列があるバージョンでイントロンを含むことができる程度にイントロンを含むこともできる。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドの重合体である。したがって、本明細書で使用する核酸及びポリヌクレオチドは互換性がある。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それが加水分解されて単量体の「ヌクレオチド」になることができるという一般的な知識を有している。前記単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書で使用するポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術及びポリメラーゼ連鎖反応等を用いた、組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、及び合成手段によって得られる、当技術分野で利用可能なあらゆる核酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を意味する。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含んでいなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を含むことができる最大アミノ酸数は制限されない。ポリペプチドは、２つ又はそれ以上のアミノ酸がペプチド結合で結合したペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、一般にペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーとも当技術分野で呼ばれる短い鎖と、一般にタンパク質と当技術分野で呼ばれる長い鎖の両方を指し、多くの種類が存在する。「ポリペプチド」として、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質等が挙げられる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド又はそれらの組合せを含む。
「特異性(specificity)」という用語は、所定の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）を特異的に結合する（例えば、免疫反応する）能力を指す。キメラ抗原受容体は、標的を特異的に結合する１つ又は複数の結合部位を含む単特異的なものであってもよいし、キメラ抗原受容体は、同一又は異なる標的を特異的に結合する２つ又はそれ以上の結合部位を含む多特異的なものであってもよい。
ある実施形態では、キメラ抗原受容体は、同じターゲットの２つの異なる（例えば、重ならない）部分に対して特異的である。
ある実施形態では、キメラ抗原受容体は、１つ以上の標的に特異的である。
抗体に関して本明細書で使用する「特異的に結合する（specifically binds）」という用語は、サンプル中の特定の抗原を認識するが、他の分子を実質的に認識又は結合しない抗体又はその結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を意味する。例えば、ある種の抗原に特異的に結合する抗体は、１つ又は複数の種からその抗原に結合することもある。しかし、このような異種間反応性は、それ自体で抗体の特異性の分類を変えることはない。
別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立遺伝子型にも結合することがある。しかし、このような交差反応性は、それ自体で抗体の特異性の分類を変えるものではない。
いくつかの場合では、「特異的結合（specific binding）」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、キメラ抗原受容体、又はペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存していることを意味する。例えば、キメラ抗原受容体は、一般的にタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識し結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識 「Ａ」と抗体を含む反応において、エピトープ「Ａ」を含む分子（又は遊離の非標識Ａ）が存在すると、抗体に結合した標識Ａの量は減少する。
本明細書で使用される「非刺激（unstimulated）」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合によって刺激又は誘導されていない免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の状態を意味する。非刺激Ｔ細胞は、「静止(quiescent)」又は「ナイーブ（naive）」Ｔ細胞としても知られており、当技術分野で知られている手段によって刺激されていない。非刺激細胞は、集団内の他の細胞（例えば、刺激Ｔ細胞）から細胞を分化させる可能性のあるマーカーを発現しており、これにはＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌが含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用する「静止(quiescent)」とは、細胞、好ましくはＴ細胞が分裂しない可逆的な状態にあるが、細胞増殖に再突入する能力を保持しているものをいう。静止Ｔ細胞は、細胞サイズが小さく、増殖能力が低く、基礎代謝プログラムが低いという特徴がある。静止細胞は、刺激を与えて分裂及び増殖させることができる。静止細胞とは、実質的に増殖していない細胞集団である。静止は、ＢｒｄＵアッセイ、ＥｄＵアッセイ、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ、ＸＴＴ細胞増殖アッセイ、ＷＳＴ－１細胞増殖アッセイ等の細胞増殖アッセイ、Ｋｉ６７や増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）等のマーカーの測定等、多くの手段で測定できるがこれに限定されない。
「刺激（stimulation）」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合により、それによってシグナル伝達事象、例えば、これに限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達の媒介、によって引き起こされる一次応答を意味している。刺激は、ＴＧＦ－ベータのダウンレギュレーション及び／又は細胞骨格構造の再編成、クローン拡大、異なるサブセットへの分化等の特定分子の発現変化を媒介する。
本明細書で使用される「刺激性分子（stimulatory molecule）」とは、抗原提示細胞上に存在する同種の刺激性リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
本明細書で使用される「刺激性リガンド（stimulatory ligand）」とは、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）上に存在する場合、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（ここでは「刺激性分子（stimulatory molecule）」と呼ぶ）と特異的に結合でき、それによって活性化、免疫応答の開始、増殖等（これらに限らない）を含むＴ細胞による一次応答を媒介できるリガンドをいう。刺激性リガンドは当技術分野でよく知られており、特に、ペプチドを搭載したＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体等を包含している。
本明細書で使用される場合、非刺激免疫細胞（例えば、修飾非刺激免疫細胞）の培養に関する「非膨張条件」という用語は、免疫細胞を刺激しない培養条件を意味する。
いくつかの実施形態において、前記培養培地は、非刺激免疫細胞において刺激応答を誘導するような刺激分子又は刺激リガンドを含んでいない。
本明細書で使用される場合、「対象(subject)」及び「患者(patient)」という用語は互換的に使用される。本明細書で使用されるように、対象は、非霊長類（例えば、牛、豚、馬、猫、犬、ラット等）又は霊長類（例えば、猿及びヒト）等の哺乳動物であり得る。
ある実施形態では、本明細書で使用される「対象」という用語は、哺乳類等の脊椎動物を指す。哺乳類には、ヒト、ヒト以外の霊長類、野生動物（wild animals）、野性動物(feral animals)、農耕動物、スポーツ動物、ペット等が含まれるが、これらに限定されない。免疫応答が惹起され得る生体であれば、対象又は患者であってもよい。
ある例示的な実施形態では、対象は、ヒトである。
「標的部位(target site)」又は「標的配列(target sequence)」とは、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合しうる核酸の部分を規定するゲノム核酸配列を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」という用語は、抗原の提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体を指す。前記ＴＣＲは、主要組織適合性複合体分子に結合した抗原を認識する役割を担っている。ＴＣＲは、アルファ（ａ）鎖とベータ（ｂ）鎖のヘテロ二量体で構成されているが、一部の細胞では、ガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖で構成されている。ＴＣＲは、アルファ／ベータとガンマ／デルタ型があり、構造的には似ているが、解剖学的な位置や機能は異なる。各鎖は、可変ドメインと定数ドメインの２つの細胞外ドメインで構成されている。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞及びガンマデルタＴ細胞を含む、ＴＣＲを含む任意の細胞上で修飾され得る。
本明細書で使用される「治療的(therapeutic)」という用語は、治療及び／又は予防を意味する。治療効果とは、疾患状態の抑制、寛解、根絶によって得られるものである。
本明細書で使用される場合、「治療(therapy)」という用語は、疾患又はそれに関連する症状の予防、管理、治療及び／又は改善において使用することができる任意のプロトコル、方法及び／又は薬剤（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）を意味する。
いくつかの実施形態において、「治療(therapies)」及び「治療(therapy)」という用語は、医療従事者等の当業者に知られている、疾患又はそれに関連する症状の予防、管理、治療及び／又は改善に有用な生物学的療法（例えば、養子細胞療法）、支持療法（例えば、リンパ切除療法）及び／又は他の療法を指す。
本明細書で使用される「トランスフェクト(transfected)」又は「形質転換(transformed)」又は「形質導入(transduced)」という用語は、外来性核酸が宿主細胞に移行又は導入されるプロセスを指す。トランスフェクト」又は「形質転換」又は「形質導入」された細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。前記細胞には、主要な対象細胞及びその子孫が含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療(treat)」、「処置(treatment)」及び「治療する(treatment)」という用語は、１つ又は複数の療法（固形腫瘍の治療に向けられたＣＡＲ－Ｔ療法を含むが、これに限定されない）の投与によって生じる、疾患(disease)又はそれに関連する症状(symptom)の進行、重症度、頻度及び／又は期間の低減又は改善について言及する。
本明細書で使用される「治療する」という用語は、治療される対象の疾患経過を変化させることを指すこともできる。治療効果としては、疾患の発生又は再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の軽減、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、寛解又は予後の改善等が挙げられるが、これらに限定されない。
「ベクター(vector)」とは、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質組成物のことである。線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当技術分野で知られている。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。また、核酸の細胞内への移行を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等も含まれると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるように、Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関して「に基づく(based on)」という用語は、関心のある参照又は標的Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するＣａｓ分子を意味する。
本明細書で使用される場合、「完全培地(complete media)」及び「完全培地(complete medium)」という用語は、免疫細胞の増殖（例えば、Ｔ細胞の増殖）に最適化されている細胞培養培地を意味する。
いくつかの例では、完全培地は、タンパク質、無機塩、微量元素、ビタミン、アミノ酸、脂質、炭水化物、サイトカイン及び／又は成長因子等を含み、各成分の比が細胞増殖に最適化されている場合もある。例示的なタンパク質としては、アルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン及びインスリンが挙げられる。例示的な炭水化物としては、グルコースが挙げられる。例示的な無機塩としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン及びカルシウムイオンが挙げられる。例示的な微量元素としては、亜鉛、銅、セレン、トリカルボン酸が挙げられる。例示的なアミノ酸としては、Ｌ－グルタミン（例えば、アラニル－Ｌ－グルタミン又はグリシル－Ｌ－グルタミン）等の必須アミノ酸又はグリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン及び／又はＬ－セリン等の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、完全培地は、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、フェノールレッド、抗生物質及び／又はβ－メルカプトエタノールの１又は複数を含むこともある。
いくつかの実施態様において、完全培地は無血清培地である。
いくつかの例では、完全媒体はゼノフリー媒体である。
本明細書で使用される場合、「化学的に定義された培地(chemically defined media)」という用語は、すべての成分の組成及び濃度が既知である細胞培養媒体を意味する。完全培地(complete media)と異なるのは、完全培地が、組成及び／又は濃度が不明な成分、例えば動物由来成分を含む場合がある点である。
いくつかの例では、「ゼノフリー(xeno-free)」培地は、動物由来（非ヒト）の成分を含んでいない。
いくつかの例では、ゼノフリー培地は、ヒト血清、成長因子、インスリン等の１つ又は複数のヒト由来成分を含む。
いくつかの実施形態では、「無血清(serum-free)」培地は血清又は血漿を含まないが、血清又は血漿に由来する成分を含んでもよい。
いくつかの例では、「無血清」培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物由来成分を含む。
いくつかの実施形態では、「最小(minimum)」培地は、標的細胞の増殖に必要な最小限のものを含んでいる。
いくつかの例では、最小培地は、無機塩、炭素源及び水を含む。
いくつかの例では、サプリメント、サイトカイン及び／又はアルブミン（例えば、ＨＳＡ）のようなタンパク質が前記最小培地に添加される。本明細書で使用される場合、サプリメントは、微量元素、ビタミン、アミノ酸、脂質、炭水化物、サイトカイン、成長因子又はそれらの組み合わせを含む。
・範囲
本開示全体を通して、本発明の様々な態様は、範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜的かつ簡潔にするためのものであり、本発明の範囲を融通無碍に限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、ある範囲の記述は、その範囲内の個々の数値だけでなく、可能なすべてのサブレンジ（subrange）を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１～６のような範囲の記述は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６等のサブレンジと、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６等が具体的に開示されていると考えるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
これらの実施例は、説明のためにのみ提供され、本明細書に提供される請求項の範囲を限定するものではない。
実施例１－修飾非刺激Ｔ細胞を調製するための一般的なベクターフリーの製造方法
図２に示されるような方法に基づいて、修飾非刺激Ｔ細胞を調製した。
簡単に言うと、非刺激Ｔ細胞は、新鮮な白血球サンプルから処理した。白血球からのＴ細胞選択は、製造者のプロトコールに基づき、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のポジティブ選択のためにＣＤ４及びＣＤ８マイクロビーズを使用して、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙで実施した。濃縮されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、その後、電気穿孔法バッファーに再懸濁された。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、及びＴＣＲアルファ定数（ＴＲＡＣ）遺伝子座を標的とするＨＤＲテンプレートをインキュベートし、続いて、４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）又はＡＴｘ若しくはＧＴｘ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（ＭａｘＣｙｔｅ）を使用して、非刺激Ｔ細胞の集団にトランスフェクトされた。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、及びＨＤＲテンプレートの比は、１：１：１であった。
続いて、トランスフェクトされたＴ細胞を、採取前に約７２時間培養し、－８０℃で凍結した。
実施例２－ＴＲＡＣ標的化ｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた非刺激Ｔ細胞における内因性ＴＣＲ発現の破壊
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を行い、非刺激Ｔ細胞のＴＣＲアルファ定数（ＴＲＡＣ）遺伝子座を標的とした。
２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）システム：Ｔｒｕｅｃｕｔ．ｖ２ Ｃａｓ９（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＳｐｙＦｉ Ｃａｓ９（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）を試験した。ＲＮＰを含まないモック電気穿孔法を行ったＴ細胞をポジティブコントロールとして使用した。ＲＮＰ複合体による電気穿孔法から７２時間後に、ＣＤ３ イプシロン及びＴＣＲ アルファ／ベータの発現についてフローサイトメトリーで細胞を分析した。
図３Ａ及び図３Ｂは、内因性ＴＣＲを発現する細胞のパーセントが、ＲＮＰを電気穿孔法しなかったポジティブコントロール細胞と比較して、Ｔｒｕｅｃｕｔ又はＳｐｙＦｉ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰのいずれかを有する細胞において著しく低いことを図示する。
破壊されたＴＲＡＣ遺伝子座へのＨＤＲを介した挿入を試験するために、ＤＮＡドナーテンプレートを導入した。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウルトラマーオリゴヌクレオチド及び化学修飾ｓｓＤＮＡドナーは、５’相同性アーム及び３’相同性アームに挟まれたＥｃｏＲＩ制限部位、（図４）で設計された。相動性アームは、ＴＲＡＣ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９カット部位の上流と下流で相同性を持つように設計されている。ｓｓＤＮＡドナーは、電気穿孔法により細胞内に導入された。ＨＤＲを介した挿入の有無を検証し、相動性アームを含む挿入の上流と下流のゲノム配列にプライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で該挿入部位を増幅した。
次に、ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩとインキュベートし、得られたＤＮＡフラグメントをアガロース電気泳動で分離及び可視化した。
図５は、ＥｃｏＲＩによる消化の結果を示している。ＤＮＡドナーへの挿入の成功は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集とＥｃｏＲＩによる消化の両方を実施したレーンの低分子量バンドによって示される。
実施例３－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲをコードするドナーＤＮＡをＴＲＡＣ遺伝子座に挿入するノックイン戦略
図６は、ＮＹ－ＥＳＯ－１に特異的な人工ＴＣＲをＴＲＡＣ遺伝子座に挿入するＨＤＲを介した戦略を示している。
完全なＴＣＲα及びＴＣＲβ（ＶＪ領域のみ）鎖を含むＤＮＡドナーを設計した。ＣＲＩＳＰＲによるＴＲＡＣエクソン１部位の開裂後、ペイロード（payload）の両側の相動性アームにより、外来性ＴＣＲの挿入が可能である。
自己開裂ペプチド（Ｔ２Ａ及びＰ２Ａ）は翻訳後に除去され、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの完全長ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖が構成的に発現する。
実施例４－標的タンパク質をコードするＤＮＡドナーのＴ細胞ゲノムの特定の遺伝子座への挿入
緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡドナー（ＧＦＰ ＨＤＲカセット）を設計し、Ｔ細胞ゲノム内の特定の標的領域に挿入した。上記のように、ＧＦＰ遺伝子は、５’相動性アームと３’相動性アームで挟まれていた。図７は、各反応に使用したＤＮＡドナーの量に応じて、ＧＦＰ＋Ｔ細胞の検出率が異なることを示す。
ある実施形態を図示し、説明したが、以下の特許請求の範囲に定義されるような、より広い局面での技術から逸脱することなく、当業者の通常の技術に従って、そこに変更及び修正を加えることができることが理解されねばならない。
本明細書で例示的に説明した実施形態は、本明細書で特に開示されていない１つの又は複数の要素、１つ又は複数の限定がない場合にも好適に実施することができる。したがって、例えば、「含む(comprising)」、「含む（including）、「含む(containing)」等という用語は、拡大解釈され、制限されないものとする。さらに、本明細書で採用された用語及び表現は、説明の用語として使用されており、制限の用語ではなく、このような用語及び表現の使用において、示され、説明された特徴又はその一部の任意の等価物を排除する意図はないが、請求された技術の範囲内で種々の変更が可能であることは認識される。さらに、「本質的に～からなる（consisting essentially of）」という表現は、具体的に言及された要素、及び請求された技術の基本的かつ新規な特性に重大な影響を与えない追加要素を含むと理解されるであろう。「からなる（consisting of）」という表現は、指定されていない要素を排除するものである。
本開示は、本願に記載されたある実施形態の点で限定されるべきものではない。当業者には明らかなように、その精神と範囲から逸脱することなく、多くの修正と変形を行うことができる。本明細書に列挙したものに加えて、本開示の範囲内の機能的に等価な方法及び組成物は、前述の説明から当業者には明らかであろう。このような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることを意図している。本開示は、添付の請求項の条件によってのみ限定されるものであり、そのような請求項が権利を有する等価物の全範囲に沿って限定される。本開示は、特定の方法、試薬、化合物、又は組成物に限定されないことを理解され、これらはもちろん変化し得る。また、本明細書で使用される用語は、ある実施形態を説明する目的のみのものであり、限定することを意図していないことを理解されたい。
さらに、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループの観点から説明される場合、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバー又はサブグループの観点からも説明されることを認識するであろう。
当業者には理解されるであろうが、あらゆる目的、特に文章による説明を提供する観点から、本明細書に開示されたすべての範囲は、終点を含む、そのサブレンジ及びサブレンジの組み合わせのあらゆる可能性も包含する。リストアップされたどの範囲も、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分解することを十分に説明し可能であると容易に認識することができる。非限定的な例として、ここで議論される各範囲は、下位３分の１、中位３分の１、上位３分の１等に容易に分解され得る。また、当業者には理解されるように、「～まで（up to）」、「少なくとも(at least)」、「～より大きい(greater than)」、「～より小さい(less than)」等のすべての言語は、言及された数を含み、上で議論したように、その後、サブレンジに分解することができる範囲を指している。最後に、当業者には理解されるであろうが、範囲は個々の数値（menber）を含む。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、発行済み特許、及びその他の文書は、個々の刊行物、特許出願、発行済み特許、又はその他の文書が、その全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる文章に含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する範囲において除外される。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載されている。

Claims (48)

  1. 修飾非刺激免疫細胞集団を調製するベクターフリーの方法であって、
    （ａ）トランスフェクション法により、生物学的サンプルから得られた非刺激免疫細胞集団に、（ｉ）遺伝子編集ヌクレアーゼ、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む相同性指向性修復（ＨＤＲ）テンプレートを送達する工程、及び、
    （ｂ）前記集団を非膨張条件下で約７２時間又はそれ以下培養する工程、
    を含み、
    前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成し、少なくとも１つの非刺激免疫細胞内の標的部位に二本鎖切断を生成し、及び
    前記ＨＤＲテンプレートは、前記標的部位でのＨＤＲを促進し、前記集団内に少なくとも１つの修飾非刺激免疫細胞を生成する、
    方法。
  2. 修飾非刺激免疫細胞集団を調製するベクターフリーの方法であって、
    （ａ）生物学的サンプルから非刺激性免疫細胞の濃縮集団を得る工程、
    （ｂ）トランスフェクション法により、（ｉ）遺伝子編集ヌクレアーゼ、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ及び（ｉｉｉ）抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む相同性指向性修復（ＨＤＲ）テンプレートを、前記濃縮集団に送達する工程、及び、
    （ｃ）前記集団を非膨張条件下で培養する工程、を含み、
    前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成し、前記集団内の複数の非刺激免疫細胞内の標的部位に二本鎖切断を生成し、及び、
    前記ＨＤＲテンプレートは、前記標的部位でのＨＤＲを促進し、前記集団内に複数の修飾非刺激免疫細胞を生成し、及び
    前記集団内の約１０％又はそれ以上の前記非刺激免疫細胞が修飾されている、
    方法。
  3. 修飾非刺激免疫細胞集団を生成するベクターフリーの方法であって、
    （ａ）以下により、非刺激免疫細胞集団の約１０％又はそれ以上において相同性指向性修復（ＨＤＲ）を誘導する工程：
    （ｉ）前記非刺激免疫細胞集団を、遺伝子編集ヌクレアーゼ及び抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む相同性指向性修復（ＨＤＲ）テンプレートと接触させる工程、及び、
    （ｉｉ）トランスフェクション法により、前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及び前記ＨＤＲテンプレートを前記非刺激免疫細胞内に送達する工程、及び、
    （ｂ）非膨張条件下で前記非刺激免疫細胞を約７２時間又はそれ以下培養し、それにより前記修飾非刺激免疫細胞集団を生成する工程、
    を含む、方法。
  4. （ａ）前記非刺激免疫細胞集団をガイドＲＮＡと接触させ、トランスフェクション法により該ガイドＲＮＡを該非刺激免疫細胞に送達する工程、及び、任意に
    （ｂ）前記遺伝子編集ヌクレアーゼ及び任意に前記ガイドＲＮＡが、１つ又は複数の非刺激免疫細胞のゲノム内の標的部位に二本鎖切断を発生させる工程、
    をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＨＤＲテンプレートが、前記非刺激免疫細胞集団の約１０％又はそれ以上において、標的部位でのＨＤＲを促進する、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 前記非刺激免疫細胞集団が、
    （ａ）生物学的サンプルから得られ、及び／又は、
    （ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はそれらの組み合わせの濃縮集団を含む、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記非刺激免疫細胞集団が、約５００万細胞、１０００万細胞、２０００万細胞、５０００万細胞、１億細胞、５億細胞、１０億細胞、２０億細胞、３０億細胞、４０億細胞、５０億細胞又はそれ以上を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記トランスフェクション法が、
    （ａ）約１０％から約９９％の、約１２％から約９９％の、約１３％から約９９％の、約１５％から約９９％の、約２０％から約９９％の、約３０％から約９９％の、約４０％から約９９％の、約５０％から約９９％の、約６０％から約９９％の、約７０％から約９９％の、約１０％から約８０％の、約１２％から約８０％の、約１３％から約８０％の、約１５％から約８０％の、約２０％から約８０％の、約３０％から約８０％の、約４０％から約８０％の、約５０％から約８０％の、約２０％から約７０％の又は約３０％から約６０％の、効率を提供する、及び／又は、（ｂ）約１０％、１２％、１３％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の効率を提供する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法であって、
  9. 前記方法が、
    （ａ）約１０％から約９９％の、約１２％から約９９％の、約１３％から約９９％の、約１５％から約９９％の、約２０％から約９９％の、３０％から約９９％の、約４０％から約９９％の、約５０％から約９９％の、約６０％から約９９％の、約７０％から約９９％の、約１０％から約８０％の、約１２％から約８０％の、約１３％から約８０％の、約１５％から約８０％の、約２０％から約８０％の、約３０％から約８０％の、約４０％から約８０％の、約５０％から約８０％の、約２０％から約７０％の又は約３０％から約６０％の、及び／又は、
    （ｂ）約１０％、約１２％、約１３％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９９％の、細胞生存率を提供する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. （ａ）約１ｐＭから約１０ｍＭの前記ＨＤＲテンプレートが、前記非刺激免疫細胞内に送達される、及び／又は、
    （ｂ）約１ｐＭから約１０ｍＭの前記遺伝子編集ヌクレアーゼが、前記非刺激免疫細胞内に送達される、及び／又は、
    （ｃ）約１ｐＭから約１０ｍＭの前記ガイドＲＮＡが、非刺激免疫細胞内に送達される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. （ａ）前記ガイドＲＮＡに対する前記遺伝子編集ヌクレアーゼの比は、約１０：１、約５：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：５又は約１：１０であり、及び／又は、
    （ｂ）前記遺伝子編集ヌクレアーゼと前記ガイドＲＮＡとの間に形成される複合体に対する前記ＨＤＲテンプレートの比は、約５：１、約２：１、約１：１、約１：２又は約１：５、及び／又は、
    （ｃ）前記遺伝子編集ヌクレアーゼに対する前記ＨＤＲテンプレートの比は、約５：１、約２：１、約１：１、約１：２又は約１：５である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記複合体は、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記非刺激免疫細胞の集団が、
    （ａ）非刺激Ｔ細胞、非刺激ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、非刺激ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又はこれらの組み合わせを含む、及び／又は、
    （ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞又はそれらの組み合わせを含む、非刺激Ｔ細胞を含む、及び／又は、
    （ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はそれらの組み合わせの濃縮集団を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記濃縮集団が、約９０％、約９５％、約９９％又は約１００％の、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はそれらの組み合わせを含む、請求項２又は１３に記載の方法。
  15. 前記非刺激免疫細胞の集団を生成する前に、複数のＣＤ４及び／又はＣＤ８標識マイクロビーズ、任意で磁化マイクロビーズと共に生物学的サンプルをインキュベートする工程をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ステップがさらに、
    （ａ）アルブミン、任意にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液と前記生物学的サンプルをインキュベートする工程、及び／又は、
    （ｂ）前記集団中の前記非刺激細胞を濃縮する細胞選択工程、及び／又は、
    （ｃ）前記濃縮非刺激細胞を、最小培地、ＨＳＡ、サイトカイン、サプリメント又はそれらの組み合わせ、を含む細胞培地中でインキュベートする工程、
    を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記修飾非刺激免疫細胞が、
    （ａ）約４８時間又はそれ以下、約３６時間又はそれ以下、約２４時間又はそれ以下、又は約１８時間又はそれ以下の間、非膨張条件下で培養される、及び／又は、
    （ｂ）約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、又は約７２時間、非膨張条件下で培養される、及び／又は、
    （ｃ）さらに凍結保存液に再懸濁され、凍結保存される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記トランスフェクション法が
    （ａ）電気穿孔法、又は、
    （ｂ）セルスクイーズ法、
    を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記抗原結合ポリペプチドが、
    （ａ）抗原結合ドメインを含む、
    （ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、
    （ｃ）細胞表面受容体リガンドを含む、又は、
    （ｄ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、及び／又は、
    （ｅ）腫瘍抗原に結合する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. （ａ）前記抗原結合ドメインが、全長抗体又はその抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、ミニボディ（minibody）、Ｖ－ＮＡＲ又はＶｈＨを含む、及び／又は、
    （ｂ）前記ＣＡＲが、前記抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、任意選択で、該ＣＡＲがヒンジ領域を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. （ａ）前記膜貫通ドメインは、人工疎水性配列、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ１５４及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に由来する膜貫通ドメインから選択される、及び／又は、
    （ｂ）前記細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、及び／又は、
    （ｃ）前記細胞内ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）から得られる細胞内ドメイン又はそれらの変異体、からなる群から選択されるタンパク質の共刺激ドメインを１つ又はそれ以上を含む、
    請求項２０に記載の方法。
  22. （ａ）前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインを含み、及び／又は
    （ｂ）前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）の細胞質シグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄ、又はそれらの変異体、及び／又は、
    （ｃ）前記細胞内シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインとヒトＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記腫瘍抗原が、
    （ａ）血液学的悪性腫瘍に関連する、及び／又は、
    （ｂ）ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａから選択される、及び／又は、
    （ｃ）固形腫瘍に関連する、及び／又は、
    （ｄ）ＲＯＲ１、メソセリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ２、ＴｎＭＵＣ１、ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ－４（ＧＦＲａ４）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びＩＬ１３Ｒａ２から選択される、請求項２０に記載の方法。
  25. 前記ＴＣＲは、
    （ａ）ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む、及び／又は、
    （ｂ）野生型ＴＣＲ、高親和性ＴＣＲ及びキメラＴＣＲから選択される、請求項１９に記載の方法。
  26. 前記ＨＤＲテンプレートが、
    （ａ）前記ポリヌクレオチドの上流に５’相同性アームをさらに含む、及び／又は、
    （ｂ）前記ポリヌクレオチドの下流に３’相同性アームをさらに含む、及び／又は
    （ｃ）二本鎖ＤＮＡテンプレートである、及び／又は
    （ｄ）二本鎖ＤＮＡテンプレートであり、前記ＨＤＲテンプレートは、約２キロ塩基対（ｋｂ）から約５ｋｂ、約２．３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約５ｋｂ、約３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約４ｋｂ、約２．３ｋｂから約４ｋｂ、約２ｋｂから約３ｋｂ、約２．３ｋｂから約３ｋｂ又は約４ｋｂから約５ｋｂまでの長さを有する、及び／又は、
    （ｅ）電気穿孔法により送達される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記５’相同性アームは、
    （ａ）前記ポリヌクレオチドに隣接している、及び／又は、
    （ｂ）標的部位のゲノム領域５’と相同である、及び／又は、
    （ｃ）約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０から約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドまでの長さである、及び／又は、
    （ｄ）約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００の長さのヌクレオチドである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記３’相同性アームは、
    （ａ）前記ポリヌクレオチドに隣接している、及び／又は、
    （ｂ）標的部位のゲノム領域３’と相同である、及び／又は、
    （ｃ）約５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約５０から約３００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、又は約３００ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドまでの長さである、及び／又は、
    （ｄ）約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０又は約５００の長さのヌクレオチドである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記標的部位が、ＴＲＡＣ遺伝子座、及び任意でＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記遺伝子編集ヌクレアーゼは、
    （ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ、及び／又は、
    （ｂ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及び／又は、
    （ｃ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記Ｃａｓヌクレアーゼは、
    （ａ）Ｃａｓ９、任意でＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９であり、及び／又は、
    （ｂ）及び前記ガイドＲＮＡは、非刺激免疫細胞に送達する前に複合体に集合する、及び／又は、
    （ｃ）及び前記ガイドＲＮＡは、非刺激免疫細胞に送達された後、複合体に集合する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記非刺激免疫細胞に、１つ又は複数の追加のガイドＲＮＡを送達する工程をさらに含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記生物学的サンプルが、
    （ａ）血液サンプルである、及び／又は、
    （ｂ）血液サンプルであり、該血液サンプルは、全血サンプル、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル又はアフェレシスサンプルである、及び／又は、
    （ｃ）血液サンプルであり、該血液サンプルは、凍結保存されるアフェレシスサンプルである、及び／又は、
    （ｄ）血液サンプルであり、該血液サンプルは、フレッシュであるアフェレシスサンプルである、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. （ａ）前記修飾非刺激免疫細胞を刺激して、修飾刺激免疫細胞集団を生成する工程、及び、任意に、
    （ｂ）前記修飾刺激免疫細胞集団を拡大する工程を、さらに含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記修飾刺激免疫細胞集団を、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日又はそれ以上、拡大条件下で培養する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、造血幹細胞又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法によって生成された、修飾非刺激免疫細胞集団。
  38. 請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法により生成された、修飾刺激免疫細胞集団。
  39. 請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法により生成された修飾非刺激免疫細胞集団又は請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法により生成された修飾刺激免疫細胞集団を含み、任意に、薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
  40. 請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法又は請求項３９に記載の組成物によって、前記修飾非刺激免疫細胞集団を前記対象に投与する又は前記修飾刺激免疫細胞集団を前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患を治療する方法。
  41. 前記対象が癌を有する、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記癌が固形腫瘍である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記癌が血液学的悪性腫瘍である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記抗原結合ドメインが、前記癌によって発現される抗原に特異的である、請求項４０～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記生物学的サンプルが対象に対して自己のものである、請求項４０～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記生物学的サンプルが対象に対して同種異系である、請求項４０～４４のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記対象がヒトである、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 請求項３７に記載の修飾非刺激免疫細胞集団又は請求項３８に記載の修飾刺激免疫細胞集団を含む、キット。
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