CN116529385A - 用于制造工程化免疫细胞的无载体方法 - Google Patents

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Abstract

在某些实施方案中，本文公开了制造工程化免疫细胞的无载体方法。在一些实施方案中，本文还公开了包含从本文所述的方法和过程获得的工程化免疫细胞的组合物。在另外的实施方案中，本文公开了使用从本文所述的方法和过程获得的工程化免疫细胞治疗疾病的方法和试剂盒。

Description

用于制造工程化免疫细胞的无载体方法
相关申请的交叉引用
本申请是要求2020年8月27日提交的美国临时申请号63/071,236的优先权权益的PCT申请；将所述美国临时申请的全部内容通过引用明确地并入本文。
背景技术
使用经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)或外源T细胞受体(TCR)的T细胞的新型治疗已经为一些类型的癌症(主要是血液恶性肿瘤)提供了有希望的免疫疗法。
嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)T细胞是经基因修饰以识别特异性肿瘤相关抗原并随后杀伤肿瘤细胞的效应免疫细胞。这些细胞的制造通常包括刺激T细胞，然后使用病毒载体(如慢病毒载体)转导细胞，以引入编码CAR或TCR的核酸以用于表达。当前载体转导(如慢病毒载体转导)的一个限制是它们无法有效地介导基因转移到休眠细胞(如原代T细胞)中。先前的研究已经表明，T细胞的刺激和扩增会导致更分化的T细胞表型。未分化或未刺激的T细胞群导致增加的持久性和更高的功效，但是转染效率低。此外，使用慢病毒载体制造用于过继疗法的T细胞需要长达10-12天的时间，然后才能收获细胞并配制用于施用。
因此，存在对于用编码外源免疫受体的核酸进行T细胞转导同时保留未分化的表型并缩短制造时间的改善的方法的需要。本发明提供了解决这些需求的方法。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了用于无载体制造工程化免疫细胞的方法和过程。在一些实施方案中，本文还公开了包含从本文所述的方法和过程获得的工程化免疫细胞的组合物。在另外的实施方案中，本文公开了使用从本文所述的方法和过程获得的工程化免疫细胞治疗疾病的方法和试剂盒。
在一些实施方案中，本文公开了一种制备经修饰的未刺激的免疫细胞群体的无载体方法，所述方法包括：(a)通过转染方法将(i)基因编辑核酸酶、(ii)指导RNA和(iii)包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的同源定向修复(HDR)模板递送到从生物样品获得的未刺激的免疫细胞群体中；以及(b)将所述群体在非扩增条件下培养约72小时或更短时间，其中所述基因编辑核酸酶和所述指导RNA形成复合物以在至少一个未刺激的免疫细胞内的靶位点处产生双链断裂，并且其中所述HDR模板促进所述靶位点处的HDR以在所述群体内产生至少一个经修饰的未刺激的免疫细胞。
在一些实施方案中，本文公开了一种制备经修饰的未刺激的免疫细胞群体的无载体方法，所述方法包括：(a)从生物样品获得富集的未刺激的免疫细胞群体；(b)通过转染方法将(i)基因编辑核酸酶、(ii)指导RNA和(iii)包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的同源定向修复(HDR)模板递送到所述富集的群体中；以及(c)将所述群体在非扩增条件下培养；其中所述基因编辑核酸酶和所述指导RNA形成复合物以在所述群体内的多个未刺激的免疫细胞内的靶位点处产生双链断裂，并且其中所述HDR模板促进所述靶位点处的HDR以产生多个经修饰的未刺激的免疫细胞，并且其中所述群体内约10％或更高的未刺激的免疫细胞被修饰。
在一些实施方案中，本文公开了一种产生经修饰的未刺激的免疫细胞群体的无载体方法，所述方法包括：(a)通过以下方式在约10％或更高的未刺激的免疫细胞群体中诱导同源定向修复(HDR)：(i)使所述未刺激的免疫细胞群体与基因编辑核酸酶和包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的同源定向修复(HDR)模板接触；并且(ii)通过转染方法将所述基因编辑核酸酶和所述HDR模板递送到所述未刺激的免疫细胞中；以及(b)将所述未刺激的免疫细胞在非扩增条件下培养约72小时或更短时间，从而产生所述经修饰的未刺激的免疫细胞群体。在一些实施方案中，此方法可以进一步包括(a)使所述未刺激的免疫细胞群体与指导RNA接触并且通过转染方法将所述指导RNA递送到所述未刺激的免疫细胞，以及任选地(b)其中所述基因编辑核酸酶和任选地所述指导RNA在一个或多个未刺激的免疫细胞的基因组内的靶位点处产生双链断裂。在又另一个实施方案中，在这些方法中，所述HDR模板在约10％或更高的未刺激的免疫细胞群体中促进所述靶位点处的HDR。此外，所述未刺激的免疫细胞群体可以从生物样品获得；和/或可以包含CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合的富集的群体。在一些方面，所述免疫细胞包含T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞、造血干细胞或其组合。在一些方面，所述免疫细胞由T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞、造血干细胞或其组合组成。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述未刺激的免疫细胞群体可以包含例如约500万个细胞、1000万个细胞、2000万个细胞、5000万个细胞、1亿个细胞、5亿个细胞、10亿个细胞、20亿个细胞、30亿个细胞、40亿个细胞、50亿个细胞或更多。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述转染方法可以(a)提供从约10％至约99％、从约12％至约99％、从约13％至约99％、从约15％至约99％、从约20％至约99％、从30％至约99％、从约40％至约99％、从约50％至约99％、从约60％至约99％、从约70％至约99％、从约10％至约80％、从约12％至约80％、从约13％至约80％、从约15％至约80％、从约20％至约80％、从约30％至约80％、从约40％至约80％、从约50％至约80％、从约20％至约70％或从约30％至约60％的效率；和/或(b)提供约10％、12％、13％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的效率。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述方法可以提供以下的细胞活力：(a)从约10％至约99％、从约12％至约99％、从约13％至约99％、从约15％至约99％、从约20％至约99％、从30％至约99％、从约40％至约99％、从约50％至约99％、从约60％至约99％、从约70％至约99％、从约10％至约80％、从约12％至约80％、从约13％至约80％、从约15％至约80％、从约20％至约80％、从约30％至约80％、从约40％至约80％、从约50％至约80％、从约20％至约70％或从约30％至约60％；和/或(b)约10％、约12％、约13％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，(a)将约1pM至约10mM的HDR模板递送到所述未刺激的免疫细胞中；和/或(b)将约1pM至约10mM的基因编辑核酸酶递送到所述未刺激的免疫细胞中；和/或(c)将约1pM至约10mM的指导RNA递送到所述未刺激的免疫细胞中。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，(a)所述基因编辑核酸酶与指导RNA的比率为约10:1、约5:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:5或约1:10；和/或(b)所述HDR模板与在所述基因编辑核酸酶与所述指导RNA之间形成的复合物的比率为约5:1、约2:1、约1:1、约1:2或约1:5；和/或(c)所述HDR模板与所述基因编辑核酸酶的比率为约5:1、约2:1、1:1、约1:2或约1:5。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述复合物是核糖核酸蛋白(RNP)复合物。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述未刺激的免疫细胞群体：(a)包含未刺激的T细胞、未刺激的自然杀伤(NK)细胞、未刺激的自然杀伤T(NKT)细胞或其组合；和/或(b)包含含有CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞或其组合的未刺激的T细胞；和/或(c)包含CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合的富集的群体。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述富集的群体包含约90％、约95％、约99％或约100％的CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在产生所述未刺激的免疫细胞群体之前，将所述生物样品与多个CD4和/或CD8标记的微珠、任选地磁化的微珠一起孵育的步骤。在另一方面，所述步骤进一步包括：(a)将所述生物样品与包含白蛋白、任选地人血清白蛋白(HSA)的溶液一起孵育；和/或(b)用于富集所述群体中的未刺激的细胞的细胞选择过程；和/或(c)将所述富集的未刺激的细胞在包含基础培养基、HSA、细胞因子、补充剂或其组合的细胞培养基中孵育。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，将所述经修饰的未刺激的免疫细胞：(a)在非扩增条件下培养约48小时或更短时间、约36小时或更短时间、约24小时或更短时间、或约18小时或更短时间；和/或(b)在非扩增条件下培养约18小时、约24小时、约36小时、约48小时或约72小时；和/或(c)进一步重悬于低温保存溶液中并且低温冷冻。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述转染方法包括电穿孔或细胞挤压方法。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述抗原结合多肽：(a)包含抗原结合结构域；(b)包含嵌合抗原受体(CAR)；(c)包含细胞表面受体配体；或(d)包含T细胞受体(TCR)；和/或(e)与肿瘤抗原结合。在另一方面，(a)所述抗原结合结构域包含全长抗体或其抗原结合片段、Fab、F(ab)2、单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、三抗体、微型抗体、V-NAR或VhH；和/或(b)所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且任选地其中所述CAR包含铰链区。在进一步的方面中，(a)所述跨膜结构域选自人工疏水性序列，I型跨膜蛋白，T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，OX40(CD134)，4-1BB(CD137)，ICOS(CD278)，CD154和衍生自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的跨膜结构域；和/或(b)所述细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域和细胞内信号传导结构域；和/或(c)所述细胞内结构域包含选自TNFR超家族中的蛋白质CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS(CD278)、NKG2C、B7-H3(CD276)的蛋白质的共刺激结构域和衍生自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞内结构域或其变体中的一个或多个。在又进一步的方面，(a)所述共刺激结构域包含4-1BB(CD137)共刺激结构域；和/或(b)所述细胞内信号传导结构域包含选自以下的细胞内结构域或其变体：人CD3ζ链(CD3ζ)的胞质信号传导结构域、FcγRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、带有胞质受体的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d；和/或(c)所述细胞内信号传导结构域包含4-1BB共刺激结构域和人CD3ζ链(CD3ζ)胞质信号传导结构域。在又另一方面，所述胞质信号传导结构域包含人CD3ζ链(CD3ζ)。
在其中抗原结合多肽与肿瘤抗原结合的方法中，所述肿瘤抗原可以(a)与血液恶性肿瘤相关；和/或(b)选自CD19、CD20、CD22和CD33/IL3Ra；和/或(c)与实体瘤相关；和/或(d)选自ROR1、间皮素、c-Met、PSMA、PSCA、叶酸受体α、叶酸受体β、EGFRvIII、GPC2、TnMUC1、GDNF家族受体α-4(GFRa4)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)和IL13Ra2。
在其中所述抗原结合多肽包含T细胞受体(TCR)的方法中，所述TCR可以包含TCRα链和TCRβ链；和/或选自野生型TCR、高亲和力TCR和嵌合TCR。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述HDR模板可以(a)进一步包含所述多核苷酸上游的5’同源臂；和/或(b)进一步包含所述多核苷酸下游的3’同源臂；和/或(c)为双链DNA模板；和/或(d)可以为双链DNA模板，其中所述HDR模板的长度为从约2千碱基对(kb)至约5kb、从约2.3kb至约5kb、从约3kb至约5kb、从约3kb至约4kb、从约2kb至约4kb、从约2.3kb至约4kb、从约2kb至约3kb、从约2.3kb至约3kb或从约4kb至约5kb；和/或(e)通过电穿孔递送。在另一方面，所述5’同源臂可以(a)与所述多核苷酸相邻；和/或(b)与所述靶位点的5’端的基因组区同源；和/或(c)长度为从约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸；和/或(d)长度为约50、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。在又另一方面，所述3’同源臂可以(a)与所述多核苷酸相邻；和/或(b)与所述靶位点的3’端的基因组区同源；和/或(c)长度为从约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸；和/或(d)长度为约50、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述靶位点位于TRAC基因座，以及任选地所述TRAC基因座的外显子1中。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述基因编辑核酸酶包含：(a)Cas核酸酶；和/或(b)锌指核酸酶；和/或(c)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。在另一方面，所述Cas核酸酶：(a)是Cas9，任选地SpCas9或SaCas9；和/或(b)在递送到所述未刺激的免疫细胞中之前与所述指导RNA组装成复合物；和/或(c)在递送到所述未刺激的免疫细胞中之后与所述指导RNA组装成复合物。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括将一种或多种另外的指导RNA递送到所述未刺激的免疫细胞中。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述生物样品：(a)是血液样品；和/或(b)是血液样品，其中所述血液样品为全血样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品或单采术样品；和/或(c)是血液样品，其中所述血液样品是低温保存的单采术样品；和/或(d)是血液样品，其中所述血液样品是新鲜的单采术样品。
在本文所述的所有方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括刺激所述经修饰的未刺激的免疫细胞以产生经修饰的刺激的免疫细胞群体，以及任选地扩增所述经修饰的刺激的免疫细胞群体。在另一方面，可以将所述经修饰的刺激的免疫细胞群体在扩增条件下培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天或更长时间。
在一些实施方案中，本文公开了一种通过本文所述的方法产生的经修饰的未刺激的免疫细胞群体。
在一些实施方案中，本文公开了一种通过本文所述的方法产生的经修饰的刺激的免疫细胞群体。
在一些实施方案中，本文公开了一种组合物，所述组合物包含通过本文所述的方法产生的经修饰的未刺激的免疫细胞群体，或通过本文所述的方法产生的经修饰的刺激的免疫细胞群体；任选地包含药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用通过本文所述的方法产生的经修饰的未刺激的免疫细胞群体；或向所述受试者施用通过本文所述方法产生的经修饰的刺激的免疫细胞群体，或者施用包含所述经修饰的未刺激的免疫细胞群体或经修饰的刺激的免疫细胞群体的组合物。
在一些实施方案中，所述受试者患有癌症，如实体瘤。在本文所述的治疗疾病的方法的其他方面，所述癌症是血液恶性肿瘤。在本文所述的治疗疾病的方法的又其他方面中，所述抗原结合结构域对由所述癌症表达的抗原具有特异性。在另一方面，所述生物样品对于所述受试者而言是自体的。可替代地，所述生物样品对于所述受试者而言可以是同种异体的。最后，在本文所述的治疗疾病的所有方法中，所述受试者可以是人。
在一些实施方案中，本文公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含从本文所述的方法获得的经修饰的未刺激的免疫细胞群体或从本文所述的方法获得的经修饰的刺激的免疫细胞群体。
在一些实施方案中，本文公开了一种制备选自肝脏、皮肤或胰腺的经修饰的未刺激的细胞群体的无载体方法，所述方法包括：(a)通过转染方法将(i)基因编辑核酸酶、(ii)指导RNA和(iii)包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的同源定向修复(HDR)模板递送到从生物样品获得的未刺激的细胞群体中；以及(b)将所述群体在非扩增条件下培养约72小时或更短时间，其中所述基因编辑核酸酶和所述指导RNA形成复合物以在至少一个未刺激的细胞内的靶位点处产生双链断裂，并且其中所述HDR模板促进所述靶位点处的HDR以在所述群体内产生至少一个经修饰的未刺激的细胞。
在一些实施方案中，本文公开了一种制备选自肝脏、皮肤或胰腺的经修饰的未刺激的细胞群体的无载体方法，所述方法包括：(a)从生物样品获得富集的未刺激的细胞群体；(b)通过转染方法将(i)基因编辑核酸酶、(ii)指导RNA和(iii)包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的同源定向修复(HDR)模板递送到富集的群体中；以及(c)将所述群体在非扩增条件下培养；其中所述基因编辑核酸酶和所述指导RNA形成复合物以在所述群体内的多个未刺激的细胞内的靶位点处产生双链断裂，并且其中所述HDR模板促进所述靶位点处的HDR以产生多个经修饰的未刺激的细胞，并且其中所述群体内约10％或更高的未刺激的细胞被修饰。
在一些实施方案中，所述肝脏细胞可以选自肝细胞、肝星形细胞、肝窦内皮细胞和库普弗细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述皮肤细胞可以选自角化细胞、黑素体、黑素细胞、朗格汉斯细胞和梅克尔细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述胰腺细胞可以选自胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺γ细胞和胰腺ε细胞中的一种或多种。
前述发明内容以及以下附图说明和具体实施方式两者都是示例性和说明性的。它们旨在提供本公开文本的进一步细节，但不应解释为是限制性的。从以下具体实施方式中本领域技术人员将清楚本公开文本的其他目的、优点和新颖特征。
附图说明
图1A-图1C示出了本文所述的无载体制造过程的示例性示意图。图1A示出了工程化免疫细胞的无载体制造过程的示意图。图1B示出了临床级无载体工程化T细胞的制造过程的示意图。图1C示出了同种异体T细胞制造过程的示意图。
图2A和图2B示出了工程化T细胞的无载体制造过程的示例性示意图。图2A详细说明了第0天的制造过程并且图2B详细说明了第0天至第3天/收获的制造过程。
图3A和图3B示出了使用靶向TRAC的gRNA经由CRISPR/Cas9破坏未刺激的T细胞中的内源TCR表达。进行CRISPR/Cas9基因编辑以靶向未刺激的T细胞中的TCRα恒定(TRAC)基因座。测试了两种CRISPR/Cas9核糖核酸蛋白(RNP)系统：Truecut.v2 Cas9(ThermoFisherScientific)和SpyFi Cas9(Aldevron)。图3A描绘了阳性对照、Truecut和SpyFi的CD3+TCR+/活细胞％。图3B还描绘了阳性对照、Truecut和SpyFi的CD3+TCR+/活细胞％。
图4示出了经由双链DNA断裂的同源定向修复将含有EcoRI位点的供体DNA引入TRAC基因座的外显子1中的示例性示意图。
图5A和图5B示出了用EcoRI消化的PCR扩增子的凝胶电泳图像，以证明HDR介导的在经化学修饰的ssDNA供体或“超聚体”中的插入。
图6是示出了将编码NY-ESO-1TCR的供体DNA插入到TRAC基因座中的敲入策略的示例性示意图。
图7示出了将GFP HDR盒靶向插入T细胞基因组中。
具体实施方式
I.概述
CAR-T和TCR细胞为癌症患者提供了令人兴奋的前景。然而，目前存在一些与制造CAR-T和TCR细胞相关的挑战，并且这些挑战影响了这些癌症治疗剂的潜在成功。首先，目前的CAR-T和TCR制造过程通常利用病毒载体系统进行繁殖。然而，使用这种类型的繁殖方法会导致在细胞收获之前大约9天的时间段。本公开文本详细描述了出乎意料的无载体方法，所述方法将到CAR-T和/或TCR细胞收获的时间极大地减少，例如，减少至约72小时或更短时间。
本发明技术存在的并且由本公开文本解决的第二个挑战是需要扩大生产。本公开文本详细说明了一种无载体过程，所述过程可惊人地扩大且具有可接受的插入效率，即使在大规模生产的情况下也是如此。具体地，短的过程时间会影响扩大所述过程的能力。因此，惊人地是，可以设计短的CAR-T和TCR制造过程，这可以以大规模生产水平完成，并且具有高的插入效率百分比。
本公开文本的另一个出乎意料的方面是培养刺激的细胞相比于未刺激的细胞的影响。通常，用刺激的细胞的插入效率更高，但是用未刺激的细胞的制造过程更容易。一个问题是在培养基之间移动细胞会导致高细胞损失。此外，未分化细胞的使用可以产生更好的产物，因为未分化细胞的使用可以导致多个不同的未刺激的免疫细胞群体，例如CD4+或CD8+T细胞(例如，具有不同且不均匀特性的细胞)。本文所述的方法可以与刺激的细胞(产生更高的插入效率)或未刺激的细胞(可以产生具有较少分化和更有效表型的最终产物)一起使用。
这些优点和发现将在下文更详细地描述。
II.制造工程化免疫细胞的方法
在某些实施方案中，本文公开了制备经修饰的免疫细胞或其前体细胞(例如，经修饰的T细胞、经修饰的自然杀伤(NK)细胞、经修饰的自然杀伤T(NKT)细胞、经修饰的巨噬细胞、经修饰的单核细胞、经修饰的B细胞或经修饰的造血干细胞)的方法。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞或其前体细胞是表达外源抗原结合多肽的经修饰的未刺激的免疫细胞或其前体细胞(例如，经修饰的未刺激的T细胞、经修饰的未刺激的NK细胞、经修饰的未刺激的NKT细胞、经修饰的未刺激的巨噬细胞、经修饰的未刺激的单核细胞、经修饰的未刺激的B细胞或经修饰的未刺激的造血干细胞)。在一些实施方案中，所述抗原结合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)和/或外源T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，所述抗原结合多肽包含抗原结合结构域、细胞表面受体配体或与肿瘤抗原结合的多肽。在一些实施方案中，所述方法是药品生产质量管理规范(GMP)方法，例如，符合美国食品和药物管理局(FDA)规定或符合外国管辖范围内的美国FDA的等效规定。
在一些实施方案中，制造工程化细胞的方法不限于免疫细胞，但进一步包括来自肝脏、皮肤和胰腺的哺乳动物细胞。适用于本文所述的免疫细胞的任何和所有方法进一步适用于来自肝脏、皮肤和胰腺的细胞。在一些实施方案中，未对来自肝脏、皮肤和胰腺的细胞进行刺激。在一些实施方案中，肝脏细胞可以选自肝细胞、肝星形细胞、肝窦内皮细胞和库普弗细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，皮肤细胞可以选自角化细胞、黑素体、黑素细胞、朗格汉斯细胞和梅克尔细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，胰腺细胞可以选自胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺γ细胞和胰腺ε细胞中的一种或多种。
在一些实施方案中，制备工程化或经修饰的免疫细胞或其前体细胞的制造方法展示于图1A中。如图1所示，通过细胞分离系统处理生物样品101以产生富集的未刺激的免疫细胞102(例如，富集的未刺激的CD4+和CD8+T细胞)群体。接下来，将富集的未刺激的免疫细胞102(例如，富集的未刺激的CD4+和CD8+T细胞)用基因编辑系统和模板(例如，HDR模板)转染并且随后培养长达约72小时以产生经修饰的未刺激的免疫细胞103(例如，经修饰的未刺激的CD4+和CD8+T细胞)群体。然后将经修饰的未刺激的免疫细胞103低温冷冻以产生低温保存的经修饰的未刺激的免疫细胞104。任选地，可以刺激和扩增经修饰的未刺激的免疫细胞104长达约10至约12天以产生经修饰的刺激的免疫细胞105。可以将经修饰的刺激的免疫细胞105进一步低温冷冻保护以产生低温保存的经修饰的刺激的免疫细胞106。在一些情形下，所述制造方法是制备经修饰的免疫细胞或其前体细胞的无载体制造方法。还参见图1B和图1C，它们分别说明了临床级无载体工程化T细胞和同种异体T细胞的制造过程的示意图。在一些情况下，所述制造方法提高了转染的效率、经修饰的未刺激的或刺激的免疫细胞的产量，提高了细胞活力或其任何组合。
A.未刺激的免疫细胞的选择和富集
在一些实施方案中，本文所述的未刺激的免疫细胞是未刺激的T细胞。所述T细胞可以是细胞毒性T细胞、调节性T细胞或NKT细胞。在示例性实施方案中，所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方案中，从来自受试者的生物样品(例如，来自受试者的组织、流体或其他样品)收获未刺激的免疫细胞群体。在一些实施方案中，所述生物样品是组织或器官样品，例如肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体、脾脏、淋巴结或肿瘤组织或源自其的细胞。在一些实施方案中，所述生物样品是流体样品，例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液或汗液样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品，任选地选自全血样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品或单采术样品。在一些实施方案中，所述样品来自异种来源，例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。
在一些实施方案中，所述生物样品是来自患者的单采术样品。在一些实施方案中，所述单采术样品是白细胞单采术样品。在一些实施方案中，在收获免疫细胞或免疫细胞群体之前低温保存单采术样品(例如，白细胞单采术样品)。在一些实施方案中，所述单采术样品(例如，白细胞单采术样品)是来自患者的尚未低温保存的新鲜单采术样品。在一些实施方案中，在包括富集步骤的过程或方案期间，从单采术样品(例如，白细胞单采术样品)获得免疫细胞或免疫细胞群体。
在一些实施方案中，在一个或多个选择步骤(例如，多于一个耗尽步骤(例如，去除非免疫细胞或非T细胞))中分离和富集未刺激的免疫细胞群体，特别是未刺激的T细胞。在一些情形下，所述分离(isolation)步骤进一步包括一个或多个分离(separation)步骤，包括基于一种或多种特性(如大小、密度、对特定试剂的敏感性或抗性)和/或对抗体或其他结合配偶体的亲和力(例如免疫亲和力)的分离。在一些方面，使用相同的装置或设备在单个过程流中依序和/或同时进行分离。在一些方面，从相同的起始组合物或材料(如从相同的样品)进行不同群体的分离、培养和/或工程化。
在一些方面，在封闭的系统或装置中和/或在相同的器皿或器皿组(例如，相同的(或相同组的)单元、小室、柱(例如，磁分离柱)、管、管组、培养室或培育室、培养器皿、处理单元、细胞分离器皿、离心室)中分离未刺激的免疫细胞群体。例如，在一些情况下，在如下系统或装置上进行未刺激的免疫细胞群体的分离，所述系统或装置采用单个或相同的分离(isolation)或分离(separation)器皿或器皿组(如单个柱或柱组)和/或相同的管或管组，例如无需将细胞群体、组合物或悬浮液从一个器皿(例如，管组)转移到另一个器皿。
在一些情形下，通过采用同时或依序选择，选择、富集和/或分离多个不同的未刺激的免疫细胞群体，例如CD4+或CD8+T细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括基于细胞中的一种或多种特定分子(如表面标记物(例如表面蛋白)、细胞内标记物或核酸)的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于细胞中一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的表达或表达水平分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性结合至此类标记的抗体或结合配偶体，之后通常进行洗涤步骤，并分离已经结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞。
这样的分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合试剂的未刺激的免疫细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至所述抗体或结合配偶体的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得特异性鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除了所需群体以外的细胞表达的标记物来进行分离的情况下，阴性选择可能特别有用。
所述分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群体或表达特定标记物的细胞。例如，对特定类型的细胞(如表达标记物的那些细胞)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但是不需要使不表达标记物的细胞完全不存在。同样，对特定类型的细胞(如表达标记物的那些细胞)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但是不需要使所有此类细胞完全去除。例如，在一些方面，CD4+和CD8+群体的选择使所述群体富集，但是也可以包含一些残余的或小百分比的其他未选择的细胞。在这种情形下，残余的其他未选择的细胞的百分比可以小于约或等于约10％、小于约或等于约9％、小于约或等于约8％、小于约或等于约7％、小于约或等于约6％、小于约或等于约5％、小于约或等于约4％、小于约或等于约3％、小于约或等于约2％、小于约或等于约1％、小于约或等于约0.5％或小于约或等于约0.1％或更少。
在一些例子中，可以进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记物的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记物具特异性)一起孵育。同样，可以通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育来对多种细胞类型同时进行阳性选择。
在一些实施方案中，可以例如使用针对对于阳性或阴性选择细胞而言独特的表面标记物的抗体的组合实现通过阳性或阴性选择对未刺激的T细胞群体的选择和富集。在一些实施方案中，针对存在于CD4+T细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物包含针对CD45RA、CCR7、CD62L、CD127(IL-7Rα)和/或CD132的抗体。在一些实施方案中，针对存在于CD8+T细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物包含针对CD62L、CCR7和/或CD127(IL-7Rα)的抗体。在另外的实施方案中，针对存在于CD4+和/或CD8+T细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物包含针对CD2、CD3、CD27和/或TCR的抗体。在一些实施方案中，通过阴性选择针对存在于CD4-和CD8-细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16和/或HLA-DR的抗体。
在一些实施方案中，所述方法包括CD4+和CD8+T细胞的单独选择。在一些方面，所述方法包括对CD4+T细胞的第一阳性选择，其中将来自第一选择的未选择的细胞(CD4-细胞)用作第二阳性选择的细胞来源以富集CD8+T细胞。在其他方面，所述方法包括CD8+T细胞的第一阳性选择，其中将来自第一选择的未选择的细胞(CD8-细胞)用作第二阳性选择的细胞来源以富集CD4+T细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括CD4+T细胞和CD8+T细胞的同时选择。在一些方面，所述方法包括阳性选择，其中选择CD4+和CD8+T细胞，并且随后去除CD4-和CD8-细胞。
在一些实施方案中，例如通过上文所述的任一种方法，如通过基于一种或多种细胞表面标记物的表达的阳性或阴性选择进行的分离、选择和/或富集未刺激的免疫细胞的方法可以包括基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案中，所述基于免疫亲和力的选择包括使含有细胞(如包含CD4+和CD8+细胞的原代人T细胞)的样品与抗体或结合配偶体接触，所述抗体或结合配偶体与所述一种或多种细胞表面标记物特异性地结合。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如球体或珠，例如微珠、纳米珠(包括琼脂糖)、磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。在一些实施方案中，可以将球或珠填充至柱中以实现免疫亲和色谱，其中使含有细胞(如原代人T细胞，含有CD4+和CD8+细胞)的样品与所述柱的基质接触，随后从所述柱洗脱或释放。
在一些方面，将要分离的未刺激的免疫细胞的样品或组合物与小的、可磁化的或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠)一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性地结合。这样的珠是已知的并且可从多种来源购得，在一些方面，所述来源包括(Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、/>珠(Miltenyi Biotec，圣地亚哥，加利福尼亚州)或/>珠试剂(IBA，德国)。
孵育通常在如下条件下进行：由此附着至磁性颗粒或磁珠的抗体或结合配偶体或者与此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果在样品内的细胞上存在)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且附接有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性选择和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或使其经历进一步的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，奥本，加利福尼亚州)进行的。磁激活细胞分选(MACS)系统能够对附着有磁化颗粒的细胞进行高纯度选择。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作：其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附着至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成此第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中而免于被洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群耗尽。
在一些实施方案中，特异性结合与珠或其他表面上缔合或包被在珠或其他表面上的细胞表面标记物的抗体是全长抗体或其抗原结合片段，包括(Fab)片段、F(ab′)2片段、Fab′片段、Fv片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、包括单链可变片段(scFv)在内的单链抗体片段和单结构域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。在一些实施方案中，所述抗体是Fab片段。在一些实施方案中，所述抗体可以是单价的、二价的或多价的。在一些实施方案中，所述抗体(如Fab)是多聚体。在一些实施方案中，所述抗体(如Fab多聚体)与细胞表面标记物形成多价复合物。
对于通过阳性或阴性选择分离所希望的未刺激的免疫细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒，如珠)的浓度。在某些方面中，可能希望显著减小将珠与细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞浓度)，以确保细胞与珠的最大接触。例如，在一方面，使用100亿个细胞/ml、90亿个细胞/ml、80亿个细胞/ml、70亿/ml、60亿/ml或50亿/ml的浓度。在一方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一方面中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。
在一些实施方案中，使用自动化系统(例如像，使用CliniMACS系统)进行未刺激的免疫细胞的分离和富集。在一些方面，所述方法使用抗体偶联的可磁化颗粒，所述可磁化颗粒在无菌、无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞之后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组由预装配的无菌管路(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序之后，系统自动地将细胞样品施加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述方法一起使用的细胞群在去除磁场之后从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋内。
在一些实施方案中，使用自动化系统(如CliniMACS Plus(Miltenyi)系统)与过滤系统(如LOVO细胞处理系统(Fresenius Kabi))组合进行未刺激的免疫细胞的分离和富集。在一些情形下，将未刺激的免疫细胞在旋转膜过滤步骤中与上清液分离。具体地，具有一定截止范围(例如<4μm)的细胞连同上清液一起穿过膜孔并被去除，而大于4μm的细胞则被保留在过滤室内并随后收获。通过CliniMACS Plus系统进一步处理收获的细胞。
在一些实施方案中，使用配备有细胞处理单元的系统进行分离和富集步骤，所述细胞处理单元允许通过离心对细胞进行自动洗涤和分级。在一些方面，使用CliniMACSProdigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和富集步骤。具有细胞处理单元的系统还可以包括机载相机和图像识别软件，所述图像识别软件通过辨识源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，将外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。细胞处理系统(如CliniMACS Prodigy系统)还可以包括集成的细胞培育室，所述细胞培育室完成细胞培养方案，例如像细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82和Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中针对多种细胞表面标记染色的细胞携载于流体流中。在一些实施方案中，通过制备规模(FACS)分选来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群体(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人,Lab Chip,10:1567-1573(2010)；和Godin等人,J.Biophoton.,1(5):355-376(2008))。在两种情况下，可以用多种标记物来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确限定的T细胞子集。
在一些实施方案中，使用淘析系统进行未刺激的免疫细胞的分离和富集，所述淘析系统根据大小和密度两者分离和纯化细胞。在一些情形下，流体通过在分离室内的离心场内建立的未刺激的免疫细胞层。通过以与离心场相反的方向改变流体的流动，系统根据尺寸和密度排列并收集颗粒。在一些情形下，淘析系统是来自Terumo BCT的ELUTRA或来自ThermoFisher的ROTEA。
在一些实施方案中，在所述一个或多个分离和富集步骤期间将所述未刺激的免疫细胞在细胞培养基中孵育。在一些情形下，所述细胞培养基是完全细胞培养基。在一些情形下，所述细胞培养基是基于胎牛血清(FBS)的培养基，例如包含从约1％至约10％FBS。在一些情形下，所述细胞培养基是化学成分确定的培养基。在一些情形下，所述细胞培养基是基础培养基。用于在分离和富集步骤期间孵育未刺激的免疫细胞的示例性培养基包括但不限于来自Miltenyi Biotech的CliniMACS缓冲液。
在一些情形下，所述细胞培养基进一步包含覆盖培养器皿的内表面而不与培养的未刺激的免疫细胞相互作用的蛋白质。在一些情况下，所述培养基包含从约0.1％至约5％w/v或从约0.5％至约2％w/v的蛋白质。在一些情况下，所述培养基包含约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1％w/v的蛋白质。在一些情况下，所述蛋白质是分离的重组蛋白质或其片段。在一些情况下，所述蛋白质是工程化的从头合成多肽。在一些情况下，所述蛋白质是天然存在的蛋白质或其片段。在一些情况下，所述蛋白质是白蛋白(例如，人血清白蛋白或HSA)。
在一些实施方案中，所述培养基包含从约0.1％至约5％w/v或从约0.5％至约2％w/v的白蛋白(例如，HSA)。在一些情形下，所述培养基包含约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1％w/v的白蛋白(例如，HSA)。在一些情况下，所述白蛋白(例如，HSA)是全长白蛋白。在其他情况下，所述白蛋白(例如，HSA)是其片段，例如，不含信号肽。
在一些实施方案中，将从上述分离和富集步骤中的一个或多个收集的未刺激的免疫细胞重悬于细胞培养基中。在一些情形下，所述细胞培养基是完全细胞培养基，任选地完全无血清且无外源物质(xeno-free)培养基。在一些情形下，所述培养基是基于胎牛血清(FBS)的培养基，例如包含从约1％至约10％ FBS。在一些情形下，所述细胞培养基是化学成分确定的培养基。在一些情形下，所述细胞培养基是基础培养基。在一些情形下，所述细胞培养基进一步包含T细胞补充剂、人血清、一种或多种细胞因子(如IL-7和/或IL-15)、或其组合。在一些情形下，所述T细胞补充剂以约2.4％v/v的最终浓度包含在培养基中。在一些情形下，所述人血清以约5％的最终浓度包含在培养基中。在一些情形下，所述培养基包含任选地最终浓度为约2mM的L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺替代物(例如，L-丙氨酸-L-谷氨酰胺)。在一些情形下，所述培养基包含最终浓度为约5ng/mL的IL-7。在一些情形下，所述培养基包含最终浓度为约5ng/mL的IL-15。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含来自ThermoFisher的CTSTM OPTMIZERTM、或来自ThermoFisher的GlutaMAXTM补充剂、或其组合。
在一些实施方案中，在从约2℃至约40℃的温度下进行所述未刺激的免疫细胞的分离和富集步骤。在一些情形下，在以下温度下进行分离和富集步骤：从约2℃至约37℃、约2℃至约35℃、约2℃至约33℃、约2℃至约30℃、约2℃至约28℃、约2℃至约26℃、约2℃至约25℃、约2℃至约20℃、约2℃至约18℃、约2℃至约15℃、约2℃至约10℃、约2℃至约8℃、约4℃至约37℃、约4℃至约35℃、约4℃至约33℃、约4℃至约30℃、约4℃至约28℃、约4℃至约26℃、约4℃至约25℃、约4℃至约20℃、约4℃至约18℃、约4℃至约15℃、约4℃至约10℃、约4℃至约8℃、约20℃至约37℃、约20℃至约35℃、约20℃至约33℃、约20℃至约30℃、约20℃至约28℃、约20℃至约26℃、约20℃至约25℃、约22℃至约25℃、约22℃至约28℃、约24℃至约30℃、约24℃至约28℃或约25℃至约30℃。在一些情况下，在从约2℃至约8℃的温度下进行分离和富集步骤。在一些情况下，在约4℃的温度下进行分离和富集。
在一些实施方案中，所述未刺激的免疫细胞是自体免疫细胞。在其他实施方案中，所述未刺激的免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一些实施方案中，所述未刺激的免疫细胞群体包含多个T细胞，任选地多个CD4+T细胞、多个CD8+T细胞或其组合。在一些实施方案中，免疫细胞群体中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约2:1、约3:1或约4:1。在一些情形下，免疫细胞群体中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为约1:1。在一些情形下，免疫细胞群体中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为约1:2。在一些情形下，免疫细胞群体中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为约2:1。
在一些实施方案中，本文所述的方法产生从约5000万至约500亿个富集的未刺激的免疫细胞，任选地从约5000万至约10亿、从约1亿至约50亿、从约10亿至约100亿或从约10亿至约500亿个细胞。在一些情形下，所述富集的未刺激的免疫细胞是从约50-500mL生物样品的起始样品获得的。
在一些实施方案中，所述富集的未刺激的免疫细胞群体包含约75％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。
B.基因编辑的未刺激的免疫细胞
在某些实施方案中，将未刺激的免疫细胞(例如，未刺激的T细胞)通过基因编辑系统进行修饰。在一些实施方案中，将未刺激的免疫细胞进行基因编辑以破坏一种或多种内源表达的基因的表达。在一些实施方案中，所述未刺激的免疫细胞具有内源受体(例如，内源T细胞受体)表达的减少、缺失、消除、敲除或破坏。在一些实施方案中，所述未刺激的免疫细胞具有插入到内源基因座中的外源免疫受体(例如，CAR或TCR)。在一些实施方案中，所述内源基因座是TRAC。
在某些实施方案中，将未刺激的免疫细胞进行基因编辑以破坏内源TCR基因产物(例如，TRAC和TRBC的基因产物)的表达。不受任何理论约束，破坏TRAC和/或TRBC的表达会导致1)减少的内源TCR和外源TCR错配，从而降低自身反应性的风险；以及2)通过减少与内源TCR的错配来增强细胞表面上的外源TCR表达，从而提高了经修饰的细胞的功效。
在一些实施方案中，未刺激的免疫细胞包含用于破坏内源TRAC基因座的基因修饰以及外源抗原结合免疫受体的插入。在一些实施方案中，用于破坏内源TRAC基因座的基因修饰是在TRAC的外显子中。在一些实施方案中，所述基因修饰是在TRAC的内含子中。在一些实施方案中，用于破坏内源TRAC基因座的基因修饰是在TRAC基因座的外显子1中。在一些实施方案中，所述外源抗原结合免疫受体是CAR。在一些实施方案中，所述外源抗原结合免疫受体是TCR。
在一些方面，所述基因编辑系统包含RNA指导的核酸酶，如规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统。CRISPR系统(在本文中也称为CRISPR-Cas系统、Cas系统或CRISPR/Cas系统)包含对靶基因具有特异性的Cas核酸内切酶和指导核酸序列，所述指导核酸序列在引入细胞中后形成复合物，所述复合物使Cas核酸内切酶能够在靶基因处引入断裂(例如，双链断裂)。
在一些实施方案中，所述Cas核酸内切酶包括Cas9核酸内切酶。在一些情形下，所述Cas9核酸内切酶衍生自或基于例如酿脓链球菌(S.pyogenes)(例如，SpCas9)、嗜热链球菌(S.thermophiles)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，SaCas9)或脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)的Cas9分子。在一些情形下，所述Cas9核酸内切酶衍生自或基于例如以下的Cas9分子：燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线杆菌属物种(Actinomycessp.)、反硝化嗜环菌(cycliphilus denitrificans)、氨基单胞菌(Aminomonaspaucivorans)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、类杆菌属物种(Bacteroides sp.)、滨海芽生螺旋菌(Blastopirellula marina)、慢生根瘤菌属物种(Bradyrhiz obium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus latemsporus)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lad)、CandidatusPuniceispirillum、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、马氏棒状杆菌(Corynebacteriummatruchotii)、Dinoroseobacter sliibae、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、伽马变形菌(gammaproteobacterium)、固氮葡萄糖乙酸杆菌(Gluconacetobacler diazotrophicus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、痰嗜血杆菌(Haemophilus sputorum)、加拿大幽门螺杆菌(Helicobacter canadensis)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、雪貂螺杆菌(Helicobacter mustelae)、营养泥杆菌(Ilyobacler polytropus)、金格杆菌(Kingella kingae)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、依氏利斯特菌(Listeriaivanovii)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌科(Listeriaceae)细菌、甲基孢子菌属物种(Methylocystis sp.)、甲基弯曲菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、杆菌状奈瑟菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、金黄奈瑟氏球菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏球菌(Neisseria lactamica.)、奈瑟氏菌属物种(Neisseria sp.)、瓦兹沃氏奈瑟菌(Neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌属物种(Nitrosomonas sp.)、Parvibaculum lavamentivorans、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、琥珀酸嗜酸杆菌(Phascolarctobacterium succinatutens)、梅毒雷氏菌(Ralstonia syzygii)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属物种(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌属物种(Sphingomonas sp.)、葡萄芽孢杆菌(Sporolactobacillus vineae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、Subdoligranulumsp.、运动替斯崔纳菌(Tislrella mobilis)、密螺旋体属物种(Treponemasp.)、或艾森氏蠕形杆菌(Verminephrobacter eiseniae)。
在一些实施方案中，所述Cas9核酸内切酶衍生自以下的Cas9分子：酿脓链球菌(例如，菌株SF370、MGAS 10270、MGAS 10750、MGAS2096、MGAS315、MGAS5005、MGAS6180、MGAS9429、NZ131和SSI-1)、嗜热链球菌(例如，菌株LMD-9)、假豕链球菌(S.pseudoporcinus)(例如，菌株SPIN 20026)、变形链球菌(S.mutans)(例如，菌株UA 159，NN2025)、猕猴链球菌(S.macacae)(例如，菌株NCTC1 1558)、解没食子酸链球菌(S.gallolylicus)(例如，菌株UCN34，ATCC BAA-2069)、马链球菌(S.equines)(例如，菌株ATCC 9812，MGCS 124)、停乳链球菌(S.dysdalactiae)(例如，菌株GGS 124)、牛链球菌(S.bovis)(例如，菌株ATCC 700338)、S.cmginosus(例如；菌株F021 1)、无乳链球菌(S.agalactia)(例如，菌株NEM316,A909)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(例如，菌株F6854)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)((L.innocua)，例如菌株Clip 11262)、意大利肠球菌(Enterococcus italicus)(例如，菌株DSM 15952)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)(例如，菌株1,23,408)。
在一些情形下，所述核酸内切酶包含Cas3、Cas8a、Cas8b、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10(例如，Cas10d)、Cas12a(或Cpf1)、Cas12b(或C2c1)、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas13、Cas14、Csm2或Cmr5。
在一些实施方案中，所述指导核酸是指导所述Cas-RNA复合物至靶序列的指导RNA(gRNA)分子。在一些情形下，所述指导是通过使一部分gRNA与DNA杂交(例如，通过gRNA靶向结构域)，并且通过使一部分gRNA分子(例如，至少通过gRNA tracr)与RNA指导的核酸酶或其他效应分子结合完成的。在一些实施方案中，gRNA分子由单个连续多核苷酸分子组成，在本文中称为“单指导RNA”或“sgRNA”。在其他实施方案中，gRNA分子由多个(通常为两个)多核苷酸分子组成，所述多核苷酸分子本身能够缔合(通常通过杂交)，在本文中称为“双指导RNA”或“dgRNA”。
在一些情况下，gRNA分子包含crRNA和tracr，其可以任选地在单个多核苷酸上或在单独的多核苷酸上。在一些情形下，所述crRNA包含靶向结构域和与tracr相互作用以形成旗杆区域的区域。所述tracr包含与核酸酶或其他效应分子结合的gRNA分子的部分。在一些实施方案中，所述tracr包含与Cas核酸内切酶(例如，Cas9)特异性结合的核酸序列。在一些实施方案中，所述tracr包含形成所述旗杆的一部分的核酸序列。在一些实施方案中，所述靶向结构域是所述gRNA分子的识别所述靶DNA内的原型间隔子序列(例如与其互补)的部分。
原型间隔子邻近基序(PAM)是位于原型间隔子3’末端附近并被Cas核酸内切酶识别的2-6个碱基对DNA序列。在一些情形下，每个Cas核酸内切酶识别特定的PAM序列。示例性PAM序列包括由酿脓链球菌Cas9核酸内切酶识别的NGG序列；或由嗜热链球菌Cas9核酸内切酶识别的NGGNG或NNAGAAW序列，其中N是任何核苷酸。本领域技术人员将理解如何基于与Cas核酸内切酶将识别的PAM序列一起使用的特定的Cas核酸内切酶来设计gRNA分子。
在一些实施方案中，将一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或者四种或更多种指导核酸(例如，指导RNA分子)与Cas核酸内切酶一起转染到免疫细胞中。在一些情况下，将约一种、两种或三种指导核酸(例如，指导RNA分子)与Cas核酸内切酶一起转染到免疫细胞中。在一些情况下，将大约三种指导核酸(例如，指导RNA分子)与Cas核酸内切酶一起转染到免疫细胞中。在一些情况下，将大约两种指导核酸(例如，指导RNA分子)与Cas核酸内切酶一起转染到免疫细胞中。在一些情况下，将大约一种指导核酸(例如，指导RNA分子)与Cas核酸内切酶一起转染到免疫细胞中。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统是TALEN基因编辑系统。TALEN是通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而人工产生的。转录激活因子样效应子(TALE)可以被工程化为与靶DNA结合。通过将工程化TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对任何靶DNA序列具有特异性的限制酶。
TALE是黄单胞菌属细菌分泌的蛋白质。DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸序列，其中第12和第13个氨基酸除外。这两个位置是高度可变的，显示出与特异性核苷酸识别的强相关性，因此可以被工程化为与靶DNA序列结合。
为了产生TALEN，将TALE蛋白与核酸酶(N)融合，所述核酸酶包括例如野生型或突变的Fokl核酸内切酶。Fokl结构域作为二聚体起作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，以使靶基因组中的位点具有合适的取向和间距。特异性和脱靶效应可以通过改变TALE DNA结合结构域与Fokl切割结构域之间的氨基酸残基数量以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数量来调节。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统是锌指核酸酶(ZFN)基因编辑系统。锌指核酸酶是一种人工核酸酶，其可用于修饰靶核酸序列的一个或多个核酸位点。与TALEN编辑系统类似，ZFN包含与DNA结合结构域融合的Fokl核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。锌指是由一个或多个锌离子稳定的小蛋白质结构基序。锌指可以包括例如Cys2His2，并且可以识别大约3bp的序列。可以将各种已知特异性的锌指组合以产生识别约6、9、12、15或18bp序列的多指多肽。
ZFN识别非回文DNA位点。为了切割靶位点，将一对ZFN二聚化并且组装到靶位点的相对链上。各种选择和模块化组装技术可用于产生识别特定序列(包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞)的锌指(及其组合)。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统是大范围核酸酶基因编辑系统。大范围核酸酶是一种人工核酸酶，其识别15-40个碱基对的切割位点。在一些情形下，大范围核酸酶根据其影响核酸酶活性和/或DNA识别的结构基序而分为几个家族。LAGLIDADG家族的成员的特征在于具有保守LAGLIDADG基序的一个或两个拷贝。在一些情形下，具有LAGLIDADG基序的单个拷贝的LAGLIDADG大范围核酸酶形成同二聚体，而具有LAGLIDADG基序的两个拷贝的成员被发现为单体。GIY-YIG家族成员具有GP-YIG模块，所述模块的长度为70-100个残基并且包括具有四个不变残基的四个或五个保守序列基序，其中两个是活性所必需的。His-Cys盒大范围核酸酶的特征在于在包含数百个氨基酸残基的区域内一系列高度保守的组氨酸和半胱氨酸。NHN家族的成员由含有两对被天冬酰胺残基包围的保守组氨酸的基序定义。用于工程化具有改变的DNA结合特异性(例如与预定核酸序列结合的特异性)的大范围核酸酶策略是本领域已知的，并且可以在例如以下文献中找到：Chevalier等人(2002),Mol.Cell,10:895-905；Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res 31:2952-62；Silva等人(2006)J Mol Biol 361:744-54；Seligman等人(2002)Nucleic Acids Res 30:3870-9；Sussman等人(2004)J Mol Biol 342:31-41；Rosen等人(2006)Nucleic Acids Res；Doyon等人(2006)J.Am Chem Soc 128:2477-84；Chen等人(2009)Protein Eng Des Sel 22:249-56；Arnould S(2006)J Mol Biol.355:443-58；Smith(2006)Nucleic Acids Res.363(2):283-94。
在一些情形下，所述大范围核酸酶是称为megaTAL的杂合核酸酶，其包含与大范围核酸酶的N末端融合的TALE结构域。在一些情况下，所述大范围核酸酶是LAGLIDADG家族的成员。
C.同源定向修复(HDR)模板
在某些实施方案中，本文所述的未刺激的免疫细胞通过同源定向修复机制进行修饰。在一些实施方案中，将包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的同源定向修复(HDR)模板转染到靶免疫细胞中，并且借此在一定条件下将所述多核苷酸插入靶位点。在一些实施方案中，所述HDR模板包含与所述靶位点上游或5’端的基因组序列同源的5’同源臂以及与所述靶位点下游或3’端的基因组序列同源的3’同源臂。在一些实施方案中，所述5’和/或3’同源臂与所述多核苷酸相邻。在一些实施方案中，所述5’同源臂的长度为从约50至约1000个核苷酸、约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸。在一些实施方案中，所述5’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸。在一些情形下，所述5’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280或约300个核苷酸。在一些情形下，所述5’同源臂的长度为约50、约100、约150、约200、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。在一些实施方案中，所述3’同源臂的长度为从约50至约1000个核苷酸、从约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸。在一些实施方案中，所述3’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸。在一些情形下，所述3’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280或约300个核苷酸。在一些情形下，所述3’同源臂的长度为约50、约100、约150、约200、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。在一些实施方案中，所述HDR模板的长度为从约2千碱基对(kb)至约5kb、从约2.3kb至约5kb、从约3kb至约5kb、从约3kb至约4kb、从约2kb至约4kb、从约2.3kb至约4kb、从约2kb至约3kb、从约2.3kb至约3kb或从约4kb至约5kb。在一些情形下，所述HDR模板的长度为约2kb、约2.3kb、约2.5kb、约3kb、约4kb或约5kb。在一些情况下，所述HDR模板在本文中也称为超聚体(ultramer)。在一些情况下，所述抗原结合多肽是抗原受体，任选地CAR或TCR。
在一些实施方案中，所述HDR模板是双链DNA(dsDNA)模板。在一些实施方案中，所述dsDNA模板包含天然核苷酸、经修饰的核苷酸或其组合。在一些实施方案中，所述dsDNA模板包含与所述靶位点上游或5’端的基因组序列同源的5’同源臂以及与所述靶位点下游或3’端的基因组序列同源的3’同源臂。在一些实施方案中，所述5’和/或3’同源臂与所述多核苷酸相邻。在一些实施方案中，所述5’同源臂的长度为从约50至约1000个核苷酸、从约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸。在一些实施方案中，所述5’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸。在一些情形下，所述5’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280或约300个核苷酸。在一些情形下，所述5’同源臂的长度为约50、约100、约150、约200、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。在一些实施方案中，所述3’同源臂的长度为从约50至约1000个核苷酸、从约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸。在一些实施方案中，所述3’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸。在一些情形下，所述3’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280或约300个核苷酸。在一些情形下，所述3’同源臂的长度为约50、约100、约150、约200、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。在一些实施方案中，所述dsDNA模板的长度为从约2kb至约5kb、从约2.3kb至约5kb、从约3kb至约5kb、从约3kb至约4kb、从约2kb至约4kb、从约2.3kb至约4kb、从约2kb至约3kb、从约2.3kb至约3kb或从约4kb至约5kb。在一些情形下，所述dsDNA模板的长度为约2kb、约2.3kb、约2.5kb、约3kb、约4kb或约5kb。
在一些实施方案中，所述HDR模板是单链DNA(ssDNA)模板。在一些实施方案中，所述ssDNA模板包含天然核苷酸、经修饰的核苷酸或其组合。在一些实施方案中，所述ssDNA模板包含与所述靶位点上游或5’端的基因组序列同源的5’同源臂以及与所述靶位点下游或3’端的基因组序列同源的3’同源臂。在一些实施方案中，所述5’和/或3’同源臂与所述多核苷酸相邻。在一些实施方案中，所述5’同源臂的长度为从约50至约1000个核苷酸、从约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸。在一些实施方案中，所述5’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸。在一些情形下，所述5’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280或约300个核苷酸。在一些情形下，所述5’同源臂的长度为约50、约100、约150、约200、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。在一些实施方案中，所述3’同源臂的长度为从约50至约1000个核苷酸、从约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸。在一些实施方案中，所述3’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸。在一些情形下，所述3’同源臂的长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约240、约250、约260、约280或约300个核苷酸。在一些情形下，所述3’同源臂的长度为约50、约100、约150、约200、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。在一些实施方案中，所述ssDNA模板的长度为从约2kb至约5kb、从约2.3kb至约5kb、从约3kb至约5kb、从约3kb至约4kb、从约2kb至约4kb、从约2.3kb至约4kb、从约2kb至约3kb、从约2.3kb至约3kb或从约4kb至约5kb。在一些情形下，所述ssDNA模板的长度为约2kb、约2.3kb、约2.5kb、约3kb、约4kb或约5kb。
在一些实施方案中，将所述HDR模板插入质粒中，然后引入免疫细胞中。示例性质粒包括但不限于pBAD/His、pCal-n、pET-3a-c、pET32a-c、pGEX-2T、pTriEx-1、pUC19、pAd5F35、pAdδF6或TLCV2。
D.转染
在一些实施方案中，通过非病毒递送方法将基因编辑系统和HDR模板引入未刺激的免疫细胞中。在非病毒递送方法中，所述核酸可以是裸DNA或在非病毒质粒或载体中。示例性非病毒递送方法包括但不限于电穿孔、细胞挤压方法、磷酸钙、热休克、脂质体递送、阳离子聚合物、脂质聚合物、细胞穿透肽、阳离子纳米载体、流体动力递送、超声、阳离子脂质、纳米颗粒、弹道DNA注射、磁转染和光致穿孔。
在一些实施方案中，通过电穿孔将基因编辑系统和HDR模板引入未刺激的免疫细胞中。在一些情形下，通过电穿孔将基因编辑系统(例如，核酸内切酶和/或指导核酸)和HDR模板同时引入未刺激的免疫细胞中。在其他情形下，首先通过电穿孔将基因编辑系统(例如，核酸内切酶和/或指导核酸)引入未刺激的免疫细胞中，然后进行单独电穿孔将HDR模板同时引入；可替代地，首先通过电穿孔将HDR模板引入未刺激的免疫细胞中，然后进行单独电穿孔将基因编辑系统(例如，核酸内切酶和/或指导核酸)同时引入。在另外的情形下，通过电穿孔将核酸内切酶、指导核酸和HDR模板依序引入未刺激的免疫细胞中。
在一些实施方案中，将所述核酸内切酶以从约1pM至约10mM的浓度引入未刺激的免疫细胞中。在一些情形下，所述核酸内切酶的浓度为从约1pM至约5mM、约1pM至约3mM、约1pM至约1mM、约1pM至约0.8mM、约1pM至约0.5mM、约1pM至约0.2mM、约1pM至约0.1mM、约1pM至约0.09mM、约1pM至约0.05mM、约1pM至约0.01mM、约1pM至约5μM、约1pM至约1μM、约1pM至约500nM、约1pM至约100nM、约1nM至约10mM、约1nM至约5mM、约1nM至约3mM、约1nM至约1mM、约1nM至约0.8mM、约1nM至约0.5mM、约1nM至约0.2mM、约1nM至约0.1mM、约1nM至约0.09mM、约1nM至约0.05mM、约1nM至约0.01mM、约1nM至约5μM、约1nM至约1μM、约1nM至约500nM、约1μM至约10mM、约1μM至约5mM、约1μM至约3mM、约1μM至约1mM、约1μM至约0.8mM、约1μM至约0.5mM、约1μM至约0.2mM、约1μM至约0.1mM、约1μM至约0.09mM、约1μM至约0.05mM、约1μM至约0.01mM或约1μM至约5μM。
在一些实施方案中，将所述指导核酸(例如，指导RNA分子)以从约1pM至约10mM的浓度引入未刺激的免疫细胞中。在一些情形下，所述指导核酸(例如，指导RNA分子)的浓度为从约1pM至约5mM、约1pM至约3mM、约1pM至约1mM、约1pM至约0.8mM、约1pM至约0.5mM、约1pM至约0.2mM、约1pM至约0.1mM、约1pM至约0.09mM、约1pM至约0.05mM、约1pM至约0.01mM、约1pM至约5μM、约1pM至约1μM、约1pM至约500nM、约1pM至约100nM、约1nM至约10mM、约1nM至约5mM、约1nM至约3mM、约1nM至约1mM、约1nM至约0.8mM、约1nM至约0.5mM、约1nM至约0.2mM、约1nM至约0.1mM、约1nM至约0.09mM、约1nM至约0.05mM、约1nM至约0.01mM、约1nM至约5μM、约1nM至约1μM、约1nM至约500nM、约1μM至约10mM、约1μM至约5mM、约1μM至约3mM、约1μM至约1mM、约1μM至约0.8mM、约1μM至约0.5mM、约1μM至约0.2mM、约1μM至约0.1mM、约1μM至约0.09mM、约1μM至约0.05mM、约1μM至约0.01mM或约1μM至约5μM。
在一些实施方案中，将所述HDR模板以从约1pM至约10mM的浓度引入未刺激的免疫细胞中。在一些情形下，所述HDR模板的浓度为从约1pM至约5mM、约1pM至约3mM、约1pM至约1mM、约1pM至约0.8mM、约1pM至约0.5mM、约1pM至约0.2mM、约1pM至约0.1mM、约1pM至约0.09mM、约1pM至约0.05mM、约1pM至约0.01mM、约1pM至约5μM、约1pM至约1μM、约1pM至约500nM、约1pM至约100nM、约1nM至约10mM、约1nM至约5mM、约1nM至约3mM、约1nM至约1mM、约1nM至约0.8mM、约1nM至约0.5mM、约1nM至约0.2mM、约1nM至约0.1mM、约1nM至约0.09mM、约1nM至约0.05mM、约1nM至约0.01mM、约1nM至约5μM、约1nM至约1μM、约1nM至约500nM、约1μM至约10mM、约1μM至约5mM、约1μM至约3mM、约1μM至约1mM、约1μM至约0.8mM、约1μM至约0.5mM、约1μM至约0.2mM、约1μM至约0.1mM、约1μM至约0.09mM、约1μM至约0.05mM、约1μM至约0.01mM或约1μM至约5μM。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统是CRISPR-Cas系统。在一些情形下，将Cas(例如，Cas9)核酸内切酶以从约1pM至约10mM的浓度引入未刺激的免疫细胞中。在一些情形下，Cas(例如，Cas9)核酸内切酶的浓度为从约1pM至约5mM、约1pM至约3mM、约1pM至约1mM、约1pM至约0.8mM、约1pM至约0.5mM、约1pM至约0.2mM、约1pM至约0.1mM、约1pM至约0.09mM、约1pM至约0.05mM、约1pM至约0.01mM、约1pM至约5μM、约1pM至约1μM、约1pM至约500nM、约1pM至约100nM、约1nM至约10mM、约1nM至约5mM、约1nM至约3mM、约1nM至约1mM、约1nM至约0.8mM、约1nM至约0.5mM、约1nM至约0.2mM、约1nM至约0.1mM、约1nM至约0.09mM、约1nM至约0.05mM、约1nM至约0.01mM、约1nM至约5μM、约1nM至约1μM、约1nM至约500nM、约1μM至约10mM、约1μM至约5mM、约1μM至约3mM、约1μM至约1mM、约1μM至约0.8mM、约1μM至约0.5mM、约1μM至约0.2mM、约1μM至约0.1mM、约1μM至约0.09mM、约1μM至约0.05mM、约1μM至约0.01mM或约1μM至约5μM。
在一些实施方案中，引入未刺激的免疫细胞中的Cas(例如，Cas9)核酸内切酶浓度与指导核酸浓度的比率为约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10,2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在一些情形下，Cas核酸内切酶与指导核酸的比率为约1:1。在一些情形下，Cas核酸内切酶与指导核酸的比率为约1:2。在一些情形下，Cas核酸内切酶与指导核酸的比率为约1:3。在一些情形下，Cas核酸内切酶与指导核酸的比率为约2:1。在一些情形下，Cas核酸内切酶与指导核酸的比率为约3:1。
在一些实施方案中，引入未刺激的免疫细胞中的CRISPR-Cas系统与HDR模板的比率为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:12、约1:15、约1:18、约1:20、约1:25、约1:30、约1:35、约1:40、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约12:1、约15:1、约20:1、约30:1或约40:1。在一些情形下，CRISPR-Cas系统与HDR模板的比率为约1:1。在一些情形下，CRISPR-Cas系统与HDR模板的比率为约1:2。在一些情形下，CRISPR-Cas系统与HDR模板的比率为约2:1。
在一些实施方案中，引入未刺激的免疫细胞中的基因编辑核酸酶(例如，核酸内切酶)与HDR模板的比率为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。在一些情形下，基因编辑核酸酶(例如，核酸内切酶)与HDR模板的比率为约1:1。在一些情形下，基因编辑核酸酶(例如，核酸内切酶)与HDR模板的比率为约1:2。在一些情形下，基因编辑核酸酶(例如，核酸内切酶)与HDR模板的比率为约2:1。
在一些实施方案中，在从约2℃至约40℃的温度下进行电泳。在一些情形下，在以下温度下进行电泳：从约2℃至约37℃、约2℃至约35℃、约2℃至约33℃、约2℃至约30℃、约2℃至约28℃、约2℃至约26℃、约2℃至约25℃、约2℃至约20℃、约2℃至约18℃、约2℃至约15℃、约2℃至约10℃、约2℃至约8℃、约4℃至约37℃、约4℃至约35℃、约4℃至约33℃、约4℃至约30℃、约4℃至约28℃、约4℃至约26℃、约4℃至约25℃、约4℃至约20℃、约4℃至约18℃、约4℃至约15℃、约4℃至约10℃、约4℃至约8℃、约20℃至约37℃、约20℃至约35℃、约20℃至约33℃、约20℃至约30℃、约20℃至约28℃、约20℃至约26℃、约20℃至约25℃、约22℃至约25℃、约22℃至约28℃、约24℃至约30℃、约24℃至约28℃或约25℃至约30℃。在一些情况下，在从约20℃至约30℃的温度下进行电泳。在一些情况下，在从约25℃至约30℃的温度下进行电泳。在一些情况下，在从约25℃至约28℃的温度下进行电泳。
示例性电穿孔技术包括但不限于来自Lonza的NUCLEOFECTORTM平台、来自Lonza的Amaxa NUCLEOFECTORTM II电穿孔机器、来自MaxCyte的FLOW 技术、和来自Bio-Rad的Gene Pulser MXCELLTM电穿孔系统。熟练的技术人员将理解，脉冲类型、脉冲持续时间、电压和使用频率取决于仪器的类型和细胞类型；并且可以基于脉冲类型、脉冲持续时间、电压、使用频率以及核酸内切酶、指导核酸和/或HDR模板的浓度来调节转染效率的优化。
在一些实施方案中，所述HDR模板在约10％或更高的未刺激的免疫细胞群体中促进所述靶位点处的HDR。在一些情形下，所述HDR模板在约20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、或95％或更高的未刺激的免疫细胞群体中促进所述靶位点处的HDR。
在一些实施方案中，所述转染方法的效率为从约2％至约99％、从约5％至约99％、从约8％至约99％、从约10％至约99％、从约12％至约99％、从约13％至约99％、从约15％至约99％、从约20％至约99％、从30％至约99％、从约40％至约99％、从约50％至约99％、从约60％至约99％、从约70％至约99％、从约2％至约80％、从约5％至约80％、从约8％至约80％、从约10％至约80％、从约12％至约80％、从约13％至约80％、从约15％至约80％、从约20％至约80％、从约30％至约80％、从约40％至约80％、从约50％至约80％、从约20％至约70％或从约30％至约60％。在一些情形下，所述效率为约2％、约5％、约8％、约10％、约12％、约13％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％。
E.经修饰的未刺激的免疫细胞
在一些实施方案中，将基因编辑系统和HDR模板的非病毒递送后的未刺激的免疫细胞在非扩增条件下培养长达约72小时，以产生经修饰的未刺激的免疫细胞。在一些情形下，将所述未刺激的免疫细胞培养从约18小时至约72小时、从约18小时至约36小时、从约18小时至约24小时、从约24小时至约72小时、从约24小时至约36小时或从约36小时至约72小时以产生经修饰的未刺激的免疫细胞。在一些情形下，将所述未刺激的免疫细胞培养约48小时或更短时间、约36小时或更短时间、约24小时或更短时间或约18小时或更短时间以产生经修饰的未刺激的免疫细胞。在一些情形下，将所述未刺激的免疫细胞培养约18小时、24小时、36小时、48小时或约72小时以产生经修饰的未刺激的免疫细胞。在一些情况下，将所述未刺激的免疫细胞在约37℃下在培养器皿(例如，培养袋或生物反应器)中培养。在一些情况下，所述培养器皿包含约90％、约95％或约99％湿度。在一些情况下，所述培养器皿包含约0.5％二氧化碳。
在一些实施方案中，与经修饰的未刺激的免疫细胞一起使用的细胞培养基包括完全培养基、化学成分确定的培养基或基于胎牛血清(FBS)(例如包含从约1％至约10％FBS)的培养基。在一些情形下，所述细胞培养基是基础培养基。用于培养经修饰的未刺激的免疫细胞的示例性培养基包括但不限于来自Miltenyi Biotech的CliniMACS缓冲液和来自ThermoFisher的CTSTM OPTMIZERTM。
在一些情形下，所述细胞培养基进一步包含包被培养器皿的内表面而不与培养的经修饰的未刺激的免疫细胞相互作用的蛋白质。在一些情况下，所述培养基包含从约0.1％至约5％w/v或从约0.5％至约2％w/v的蛋白质。在一些情况下，所述培养基包含约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1％w/v的蛋白质。在一些情况下，所述蛋白质是分离的重组蛋白质或其片段。在一些情况下，所述蛋白质是工程化的从头合成多肽。在一些情况下，所述蛋白质是天然存在的蛋白质或其片段。在一些情况下，所述蛋白质是白蛋白(例如，人血清白蛋白或HSA)。
在一些实施方案中，所述细胞培养基包含从约0.1％至约5％w/v或从约0.5％至约2％w/v的白蛋白(例如，HSA)。在一些情形下，所述培养基包含约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1％w/v的白蛋白(例如，HSA)。在一些情况下，所述白蛋白(例如，HSA)是全长白蛋白。在其他情况下，所述白蛋白(例如，HSA)是其片段，例如，不含信号肽。
在一些实施方案中，由上述方法产生的经修饰的未刺激的免疫细胞群体包含约500万个细胞、1000万个细胞、2000万个细胞、5000万个细胞、1亿个细胞、5亿个细胞、10亿个细胞、20亿个细胞、30亿个细胞、40亿个细胞、50亿个细胞、100亿个细胞或更多。在一些情况下，由上述方法产生的经修饰的未刺激的免疫细胞群体包含从约5000万个细胞至约50亿个细胞。在一些情况下，由上述方法产生的经修饰的未刺激的免疫细胞群体包含从约5000万个细胞至约40亿个细胞。
F.低温保存
在一些实施方案中，将所述经修饰的未刺激的免疫细胞在培养长达或约72小时后低温保存。在一些情形下，将所述经修饰的未刺激的免疫细胞从培养器皿收获并且重悬于低温保存培养基中。在一些情形下，所述低温保存培养基包含CSB培养基(BioLife Solutions)和DMSO。在一些情形下，所述DMSO是2％、5％或10％v/v溶液。在一些情形下，所述DMSO是/>CS5或/>CS10(BioLife Solutions)。
在一些情况下，所述DMSO的最终浓度为从约0％v/v至约7.5％v/v。在一些情况下，所述DMSO的最终浓度为约2.5％v/v。在一些情况下，所述DMSO的最终浓度为约5％v/v。在一些情况下，重悬期间的温度为从约24℃至约28℃。
重悬于低温保存培养基后，将所述经修饰的未刺激的免疫细胞低温冷冻，其中所述细胞的温度以逐步方法从重悬温度降低至约-80℃。在一些情形下，所述逐步方法中使用约1-5摄氏度/分钟的降低。在一些情形下，所述逐步方法中使用约1摄氏度/分钟的降低。在一些情形下，所述逐步方法包括在约30分钟至约3小时内将温度从重悬温度降低至约-80℃。在一些情况下，所述重悬温度为从约24℃至约28℃、从约26℃至约28℃或从约24℃至约26℃。
在一些实施方案中，本文所述的产生低温冷冻的经修饰的未刺激的免疫细胞的方法进一步提供了以下的细胞活力：从约10％至约99％、从约12％至约99％、从约13％至约99％、从约15％至约99％、从约20％至约99％、从30％至约99％、从约40％至约99％、从约50％至约99％、从约60％至约99％、从约70％至约99％、从约10％至约80％、从约12％至约80％、从约13％至约80％、从约15％至约80％、从约20％至约80％、从约30％至约80％、从约40％至约80％、从约50％至约80％、从约20％至约70％或从约30％至约60％。在一些情况下，所述方法提供了约10％、约12％、约13％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％的细胞活力。
G.经修饰的刺激的免疫细胞
在一些实施方案中，在低温保存之前，任选地刺激所述经修饰的未刺激的免疫细胞。在一些情形下，刺激所述经修饰的未刺激的免疫细胞并且将其扩增约5天至约12天。在一些情况下，刺激所述经修饰的未刺激的免疫细胞并且将其扩增约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天或更长时间。在一些情况下，刺激所述经修饰的未刺激的免疫细胞并且将其扩增约10天至长达约12天。
在一些实施方案中，将所述经修饰的未刺激的免疫细胞在能够刺激未刺激的免疫细胞的药剂的存在下孵育。在未刺激的免疫细胞是T细胞的一些情形下，所述药剂能够激活TCR复合物的一个或多个组分(如CD3ζ链)的一个或多个细胞内信号传导结构域，或者能够通过此类复合物或组分激活信号传导。在一些情形下，所述药剂是抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗4-1BB抗体或细胞因子(如IL-2、IL-15、IL-7或IL-21)、或人工抗原呈递细胞(aAPC)。在一些情形下，将所述抗体与固体支持物(如珠)的表面进一步偶联或所述抗体存在于其上。在一些情况下，所述药剂是Dynabeads人T-激活剂CD3/CD28(ThermoFisher)，任选地以3:1珠与细胞的比率；或GEMP T细胞TRANSACTTM(Mitenyi Biotec)。
在一些情况下，通过本文所述的方法产生的经修饰的刺激的免疫细胞群体包含约500万个细胞、约1000万个细胞、约2000万个细胞、约5000万个细胞、约1亿个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约100亿个细胞、约200亿个细胞或更多。
在一些实施方案中，本文所述的产生低温冷冻的经修饰的刺激的免疫细胞的方法进一步包括提供以下的细胞活力：从约10％至约99％、从约12％至约99％、从约13％至约99％、从约15％至约99％、从约20％至约99％、从30％至约99％、从约40％至约99％、从约50％至约99％、从约60％至约99％、从约70％至约99％、从约10％至约80％、从约12％至约80％、从约13％至约80％、从约15％至约80％、从约20％至约80％、从约30％至约80％、从约40％至约80％、从约50％至约80％、从约20％至约70％或从约30％至约60％。在一些情况下，所述方法提供了约10％、约12％、约13％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％的细胞活力。
III.抗原结合多肽
在某些实施方案中，本文提供了表达外源抗原结合多肽的经修饰的未刺激的免疫细胞或经修饰的刺激的免疫细胞。在一些情形下，所述抗原结合多肽是嵌合抗原受体(CAR)。在其他情形下，所述抗原结合多肽是T细胞受体(TCR)。在另外情形下，所述抗原结合多肽是抗原结合结构域、细胞表面受体配体或与肿瘤抗原结合的多肽。
A.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，所述经修饰的未刺激的免疫细胞或经修饰的刺激的免疫细胞(例如，经修饰的未刺激的或刺激的T细胞)表达嵌合抗原受体(CAR)。本发明的CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、铰链结构域和细胞内信号传导结构域。任何包含含有本文所述的任何抗原结合结构域、任何铰链、任何跨膜结构域、任何细胞内共刺激结构域和任何细胞内信号传导结构域的CAR的经修饰的细胞是可设想的，并且可以由本领域技术人员根据本文的公开内容容易地理解和制备。
抗原结合结构域可以与CAR的另一个结构域(如跨膜结构域或细胞内结构域，这两者均在本文其他地方描述)可操作地连接以用于在细胞中表达。在一个实施方案中，编码抗原结合结构域的第一核酸序列与编码跨膜结构域的第二核酸可操作地连接，并且进一步与编码细胞内结构域的第三核酸序列可操作地连接。
本文所述的抗原结合结构域可以与本文所述的任何跨膜结构域、本文所述的任何细胞内结构域或胞质结构域、或本文所述的可以包含在本发明的CAR中的任何其他结构域组合。本发明的主题CAR还可以包含如本文所述的间隔子结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域中的每一个均通过接头隔开。
1.抗原结合结构域
CAR的抗原结合结构域是CAR的细胞外区域以用于结合特定的靶抗原，包括蛋白质、碳水化合物和糖脂。在一些实施方案中，CAR包括对靶细胞(例如癌细胞)上的靶抗原(例如肿瘤相关抗原)的亲和力。靶抗原可以包括与靶细胞缔合的任何类型的蛋白质或其表位。例如，CAR可以包括对靶细胞上的靶抗原的亲和力，所述靶抗原指示靶细胞的特定状态。
如本文所述，本公开文本的对靶细胞上的特异性靶抗原具有亲和力的CAR可以包含靶特异性结合结构域。在一些实施方案中，所述靶特异性结合结构域是鼠靶特异性结合结构域，例如，所述靶特异性结合结构域是鼠来源的。在一些实施方案中，所述靶特异性结合结构域是人靶特异性结合结构域，例如，所述靶特异性结合结构域是人来源的。
抗原结合结构域可以包括与抗原结合的任何结构域，并且可以包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体及其任何片段。因此，在一个实施方案中，所述抗原结合结构域部分包括哺乳动物抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包括全长抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗原结合片段(Fab)，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab2、单链可变片段(scFv)、dAb、串联scFv、VhH、V-NAR、骆驼抗体(camelid)、双抗体、微型抗体、三抗体或四抗体。
在一些实施方案中，本公开文本的CAR可以对一个或多个靶细胞上的一种或多种靶抗原具有亲和力。在一些实施方案中，CAR可以对单个靶细胞上的一种或多种靶抗原具有亲和力。在这此类实施方案中，所述CAR是双特异性CAR或多特异性CAR。在一些实施方案中，所述CAR包含赋予对一种或多种靶抗原的亲和力的一个或多个靶特异性结合结构域。在一些实施方案中，所述CAR包含赋予对相同靶抗原的亲和力的一个或多个靶特异性结合结构域。例如，包含对相同靶抗原具有亲和力的一个或多个靶特异性结合结构域的CAR可以结合靶抗原的不同表位。当CAR中存在多个靶特异性结合结构域时，所述结合结构域可以串联排列并且可以通过接头肽隔开。例如，在包含两个靶特异性结合结构域的CAR中，所述结合结构域通过多肽接头、Fc铰链区或膜铰链区在单条多肽链上彼此共价连接。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是免疫球蛋白(例如，小鼠或人)的共价连接以形成VH::VL异二聚体的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或通过肽编码接头或间隔子连接，所述肽编码接头或间隔子将VH的N末端与VL的C末端连接，或将VH的C末端与VL的N末端连接。术语“接头”和“间隔子”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，抗原结合结构域(例如，Tn-MUC1结合结构域)包含具有从N末端到C末端VH-接头-VL的构型的scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域(例如，Tn-MUC1结合结构域、PSMA结合结构域)包含具有从N末端到C末端VL-接头-VH的构型的scFv。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适当构型。
接头通常富含甘氨酸以具有柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以具有溶解性。接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。接头的非限制性例子公开于Shen等人,Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO 2014/087010，将其内容通过引用以其整体并入本文。各种接头序列是本领域已知的，包括但不限于甘氨酸丝氨酸(GS)接头，如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n表示至少1的整数。示例性接头序列可以包含氨基酸序列，包括但不限于GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG、GSSSG、GGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS等。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适的接头序列。在一个实施方案中，本发明的抗原结合结构域(例如，Tn-MUC1结合结构域、PSMA结合结构域)包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL通过具有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(其可以由包含核苷酸序列ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggt ggcggcggatct的核酸序列编码)的接头序列隔开。
尽管去除了恒定区并引入了接头，但scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包含VH和VL编码序列的核酸表达，如Huston等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)所描述。还参见，美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公开号20050196754和20050196754。已经描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(参见例如，Zhao等人,Hybridoma(Larchmt),27(6):455-51(2008)；Peter等人,J.Cachexia Sarcopenia Muscle(Aug.12,2012)；Shieh等人,J.Imunol.,183(4):2277-85(2009)；Giomarelli等人,Thromb.Haemost.,97(6):955-63(2007)；Fife等人,J.Clin.Invst.,116(8):2252-61(2006)；Brocks等人,Immunotechnology,3(3):173-84(1997)；Moosmayer等人,Ther.Immunol.,2(10):31-40(1995))。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见例如，Peter等人,J.Biol.Chem.,25278(38):36740-7(2003)；Xie等人,Nat.Biotech.,15(8):768-71(1997)；Ledbetter等人,Crit.Rev.Immunol.,I(5-6):427-55(1997)；Ho等人,BioChim.Biophys.Acta.,1638(3):257-66(2003))。
如本文所用，“Fab”是指与抗原结合但为单价且不具有Fc部分的抗体结构的片段，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个Fab片段和一个Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不与抗原结合的Fc区)。
在一些情形下，抗原结合结构域可以衍生自最终将使用CAR的相同物种。例如，为了在人类中使用，CAR的抗原结合结构域可以包含如本文其他地方所述的人抗体或其片段。
因此，例如通过本文所述的方法获得的免疫细胞可以被工程化以表达靶向以下癌症相关抗原(肿瘤抗原)中的一种的CAR：CD19；CD20；CD22(唾液酸凝集素2)；CD37；CD 123；CD22；CD30；CD 171；CS-1(也称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；CD133；表皮生长因子受体(EGFR)；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；人表皮生长因子受体(HER1)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAca-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-l lRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白(Testisin)或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC 1)；GalNAca1-O-Ser/Thr(Tn)MUC 1(TnMUC1)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)组成的癌基因融合蛋白和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1(Abl)(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1(TEM1/CD248)；相关的肿瘤内皮标记物7(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，D成员(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；多唾液酸；胎盘特异性蛋白1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白(uroplakin)2(UPK2)；酪氨酸蛋白激酶Met(c-Met)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替读码框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-la)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGEl)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤抗原p53(p53)；p53突变体；prostein；存活素(surviving)；端粒末端转移酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)；成对的盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样蛋白(BORIS或印迹位点的调节剂的同系物)、被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对的盒蛋白Pax-5(PAX5)；顶体蛋白原结合蛋白sp32(OY-TES l)；淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；高级糖化终产物的受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓间质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；NKG2D；KRAS；GDNF家族受体α-4(GFRa4)；IL13Ra2；Fc受体样蛋白5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。在一些实施方案中，将免疫细胞工程化以表达靶向CD19、CD20、CD22、BCMA、CD37、间皮素、PSMA、PSCA、Tn-MUC1、EGFR、EGFRvIII、c-Met、HER1、HER2、CD33、CD133、GD2、GPC2、GPC3、NKG2D、KRAS或WT1的CAR。
2.跨膜结构域
关于跨膜结构域，可以将CAR设计成包含将CAR的抗原结合结构域与细胞内结构域连接的跨膜结构域。主题CAR的跨膜结构域是能够跨越细胞(例如，免疫细胞或其前体)的质膜的区域。跨膜结构域用于插入细胞膜，例如真核细胞膜。在一些实施方案中，跨膜结构域介于CAR的抗原结合结构域与细胞内结构域之间。
在一个实施方案中，跨膜结构域天然地与所述CAR中的一个或多个结构域缔合。在一些情形下，可以通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，例如I型跨膜蛋白。在来源是合成的情况下，跨膜结构域可以是任何促进所述CAR插入到细胞膜中的人工序列，例如人工疏水性序列。本发明中特别使用的跨膜区的例子包括但不限于衍生自以下的跨膜结构域(即，至少包含以下的一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD2，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD7，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134(OX-40)，CD137(4-1BB)，CD154(CD40L)，CD278(ICOS)，CD357(GITR)，Toll样受体1(TLR1)，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8和TLR9。在一些实施方案中，所述跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在某些示例性实施方案中，在合成跨膜结构域的每个末端会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
本文所述的跨膜结构域可以与本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何共刺激信号传导结构域、本文所述的任何细胞内信号传导结构域或本文所述的可以包含在受试者CAR中的任何其他结构域组合。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域进一步包含铰链区。本发明的主题CAR还可以包含铰链区。CAR的铰链区是位于抗原结合结构域与跨膜结构域之间的亲水性区域。在一些实施方案中，此结构域促进CAR的适当蛋白质折叠。铰链区是CAR的任选组分。铰链区可以包括选自抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工铰链序列或其组合的结构域。铰链区的例子包括但不限于CD8a铰链、由可以小到三个甘氨酸(Gly)的多肽制成的人工铰链、以及IgG(如人IgG4)的CH1和CH3结构域。
在一些实施方案中，本公开文本的主题CAR包含将抗原结合结构域与跨膜结构域连接的铰链区，所述跨膜结构域进而与细胞内结构域连接。在示例性实施方案中，所述铰链区能够支持抗原结合结构域识别且结合靶细胞上的靶抗原(参见例如，Hudecek等人,Cancer Immunol.Res.,3(2):125-135(2015))。在一些实施方案中，铰链区是柔性结构域，因此允许所述抗原结合结构域具有用于最佳地识别细胞(如肿瘤细胞)上的靶抗原的特定结构和密度的结构。铰链区的柔性允许铰链区采用许多不同的构象。
在一些实施方案中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。在一些实施方案中，铰链区是衍生自受体的铰链区多肽(例如，CD8源性铰链区)。
铰链区的长度可以为从约4个氨基酸至约50个氨基酸，例如，从约4个氨基酸至约10个氨基酸、从约10个氨基酸至约15个氨基酸、从约15个氨基酸至约20个氨基酸、从约20个氨基酸至约25个氨基酸、从约25个氨基酸至约30个氨基酸、从约30个氨基酸至约40个氨基酸或从约40个氨基酸至约50个氨基酸。
可以容易地选择合适的铰链区，并且合适的铰链区可以具有任何合适的长度数，如从约1个氨基酸(例如，Gly)至约20个氨基酸、从约2个氨基酸至约15个氨基酸、从约3个氨基酸至约12个氨基酸，包括约4个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约9个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸或约7个氨基酸至约8个氨基酸，并且可以是约1、约2、约3、约4、约5、约6或约7个氨基酸。
例如，铰链区包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:47)和(GGGS)n(SEQ ID NO:48)，其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser两者均是相对非结构化的，因此可以充当组分之间的中性系链。可以使用甘氨酸聚合物；因为甘氨酸接近的空间甚至比丙氨酸显著更大，并且比侧链较长的残基受到的限制小得多(参见例如，Scheraga,Rev.Computational.Chem.(1992)2:73-142)。示例性铰链区可以包含包括但不限于以下的氨基酸序列：GGSG(SEQ ID NO:29)、GGSGG(SEQ ID NO:30)、GSGSG(SEQ ID NO:31)、GSGGG(SEQ ID NO:32)、GGGSG(SEQ IDNO:33)、GSSSG(SEQ ID NO:34)等。
在一些实施方案中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。免疫球蛋白铰链区氨基酸序列是本领域已知的；参见例如，Tan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87(1):162-166(1990)；和Huck等人,Nucleic Acids Res.,14(4):1779-1789(1986)。作为非限制性例子，免疫球蛋白铰链区可以包含以下氨基酸序列中的一种：DKTHT(SEQ ID NO:35)；CPPC(SEQID NO:36)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO:37)(参见例如，Glaser等人,J.Biol.Chem.(2005)280:41494-41503)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:38)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO:39)；KCCVDCP(SEQ ID NO:40)；KYGPPCP(SEQ ID NO:41)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:42)(人IgG1铰链)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:43)(人IgG2铰链)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:44)(人IgG3铰链)；SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO:45)(人IgG4铰链)；等。
所述铰链区可以包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列。在一个实施方案中，与野生型(天然存在的)铰链区相比，所述铰链区可以包含一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。例如，人IgG1铰链的His229可以用Tyr取代使得所述铰链区包含序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO:46)；参见例如，Yan等人,J.Biol.Chem.(2012)287:5891-5897。在一个实施方案中，铰链区可以包含衍生自人CD8的氨基酸序列或其变体。
在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，主题CAR包含CD8α跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:24中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。
在另一个实施方案中，主题CAR包含CD8α铰链结构域和CD8α跨膜结构域。在一个实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:26中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。
在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，主题CAR包含CD28跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的核酸序列编码。
跨膜结构域和/或铰链结构域的可容许的变化对于本领域技术人员来将是已知的，同时保留其预期功能。例如，在一些实施方案中，跨膜结构域或铰链结构域包含与SEQID NO:23、25和/或27中所示的任何氨基酸序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，跨膜结构域或铰链结构域由这样的核酸序列编码，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:24、26和/或28中所示的任何核苷酸序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列同一性的核苷酸序列。
跨膜结构域可以与任何铰链结构域组合和/或可以包含一个或多个本文所述的跨膜结构域。
本文所述的跨膜结构域，如T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD2，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD7，CD8，CD9，CD 16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134(OX-40)，CD137(4-1BB)，CD154(CD40L)，CD278(ICOS)，CD357(GITR)，Toll样受体1(TLR1)，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8和TLR9的跨膜区可以与本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何共刺激信号传导结构域或细胞内结构域或胞质结构域或本文所述的可以包含在CAR中的任何其他结构域组合。
在一个实施方案中，所述跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在示例性实施方案中，在合成跨膜结构域的每个末端会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
在一些实施方案中，主题CAR可以在CAR的细胞外结构域与跨膜结构域之间或在CAR的细胞内结构域与跨膜结构域之间进一步包含间隔子结构域。如本文所用，术语“间隔子结构域”通常意指任何寡肽或多肽，其功能是将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或细胞内结构域。间隔子结构域可以包含长达约300个氨基酸，例如约10至约100个氨基酸或约25至约50个氨基酸。在一些实施方案中，所述间隔子结构域可以是短寡肽接头或多肽接头，例如长度在约2与约10个氨基酸之间。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体在主题CAR的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间提供了特别合适的接头。
因此，本公开文本的主题CAR可以包含本文所述的跨膜结构域、铰链结构域或间隔子结构域中的任一个。
3.细胞内结构域
本发明的主题CAR还包含细胞内结构域。CAR的细胞内结构域负责其中表达CAR的细胞(例如，免疫细胞)的至少一种效应子功能的激活。细胞内结构域转导效应子功能信号并指导细胞(例如，免疫细胞)执行其专门功能，例如伤害和/或破坏靶细胞。
CAR的细胞内结构域或其他胞质结构域负责激活其中表达CAR的细胞。用于本发明的细胞内结构域的例子包括但不限于表面受体的胞质部分、共刺激分子和协同作用以启动T细胞中的信号转导的任何分子、以及这些元件的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
在某些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域。在某些实施方案中，细胞内结构域包含细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域和细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB和CD3ζ。在某些实施方案中，共刺激信号传导结构域包含4-1BB。在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ。
在一个实施方案中，CAR的细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域包含一个或多个共刺激分子的任何部分(如来自TNFR超家族中的蛋白质、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS(CD278)、NKG2C、B7-H3(CD276)的至少一个信号传导结构域)；和衍生自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞内结构域、其任何衍生物或变体、其具有相同功能能力的任何合成序列、以及它们的任何组合。
细胞内信号传导结构域的例子包括但不限于T细胞受体复合物的ζ链或其任何类似物(例如，η链、FcsRIγ和β链、MB 1(Iga)链、B29(Ig)链等)、人CD3ζ链、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和参与T细胞转导的其他分子(如CD2、CD5和CD28)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、带有胞质受体的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)及其组合。
细胞内结构域的其他例子包括来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，所述一种或多种分子或受体包括但不限于TCR，CD3ζ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD86，共同FcRγ，FcRβ(FcεRib)，CD79a，CD79b，FcγR11a，DAP10，DAP12，T细胞受体(TCR)，CD8，CD27，CD28，4-1BB(CD137)，OX9，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，KIR家族蛋白，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，与CD83、CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1Id、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD lib、ITGAX、CD11c、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD 162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9特异性结合的配体，本文所述的其他共刺激分子，其任何衍生物、变体或片段，具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，以及它们的任何组合。
细胞内结构域的其他例子包括但不限于几种类型的各种其他免疫信号传导受体的细胞内信号传导结构域，所述免疫信号传导受体包括但不限于第一、第二和第三代T细胞信号传导蛋白，包括CD3、B7家族共刺激受体和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族受体(参见例如，Park和Brentjens,J.Clin.Oncol.,33(6):651-653(2015))。另外，细胞内信号传导结构域可以包括NK和NKT细胞使用的信号传导结构域(参见例如，Hermanson和Kaufman,Front.Immunol.,6:195(2015))，如NKp30(B7-H6)(参见例如，Zhang等人,J.Immunol.,189(5):2290-2299(2012))和DAP 12(参见例如，Topfer等人,J.Immunol.,194(7):3201-3212(2015))、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10和CD3z的信号传导结构域。
适用于本发明的主题CAR的细胞内信号传导结构域包括任何所希望的信号传导结构域，其响应于CAR的激活(即，被抗原和二聚化试剂激活)而提供独特和可检测的信号(例如，细胞产生的一种或多种细胞因子的增加；靶基因转录的改变；蛋白质活性的改变；细胞行为的改变例如细胞死亡；细胞增殖；细胞分化；细胞存活；细胞信号传导反应的调节；等)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)如下文所述的ITAM基序。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含DAP10/CD28型信号传导链。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域不与膜结合的CAR附接，而是在细胞质内扩散。
适用于本发明的主题CAR的细胞内信号传导结构域包括包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的细胞内信号传导多肽。在一些实施方案中，ITAM基序在细胞内信号传导结构域中重复两次，其中ITAM基序的第一和第二例子彼此间隔6至8个氨基酸。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内信号传导结构域包含3个ITAM基序。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的人免疫球蛋白受体的信号传导结构域，所述人免疫球蛋白受体诸如但不限于FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(参见例如，Gillis等人,Front.Immunol.,5:254(2014))。
合适的细胞内信号传导结构域可以是衍生自含有ITAM基序的多肽的含ITAM基序的部分。例如，合适的细胞内信号传导结构域可以是来自任何含ITAM基序的蛋白质的含ITAM基序的结构域。因此，合适的细胞内信号传导结构域不需要包含其从中衍生的整个蛋白质的整个序列。合适的含ITAM基序多肽的例子包括但不限于：DAP12、FCER1G(Fcε受体Iγ链)、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD3Z(CD3ζ)和CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域衍生自DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX激活蛋白12；KAR相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤激活受体相关蛋白；杀伤激活受体相关蛋白等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域衍生自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceR1γ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白E受体，高亲和力γ链；等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-δ；T3D；CD3抗原，δ亚基；CD3δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3复合物)；OKT3，δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3链(也称为CD3G；T细胞受体T3γ链；CD3-GAMMA；T3G，γ多肽(TiT3复合物)等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域衍生自CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；Ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白；等)。在一个实施方案中，适用于本发明的主题CAR的细胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一个实施方案中，适用于本发明的主题CAR的细胞内信号传导结构域包括ZAP70多肽。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的胞质信号传导结构域。在一个实施方案中，CAR中的细胞内信号传导结构域包括人CD3ζ的胞质信号传导结构域。
虽然通常可以采用完整的细胞内信号传导结构域，但是在多种情况下不需要使用整条链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这样的截短部分可以用于代替整条链，只要它转导效应子功能信号即可。细胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
本文所述的细胞内信号传导结构域可以与本文所述的任何共刺激信号传导结构域、本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何跨膜结构域或本文所述的可包含在CAR中的任何其他结构域组合。
此外，适用于主题CAR的变体细胞内信号传导结构域是本领域已知的。YMFM基序在ICOS中发现并且是招募PI3K的p85和p50alpha亚基两者从而增强AKT信号传导的SH2结合基序。参见例如，Simpson等人(2010)Curr.Opin.Immunol.,22:326-332。在一个实施方案中，可以产生CD28细胞内结构域变体以包含YMFM基序。
在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的4-1BB共刺激结构域，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:2或3中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的CD28共刺激结构域，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:5中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的CD28(YMFM)共刺激结构域，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的ICOS共刺激结构域，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的ICOS(YMNM)共刺激结构域，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:12中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列的CD2共刺激结构域，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:14中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的CD27共刺激结构域，所述氨基酸序列可以由包含SEQ ID NO:16中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的OX40共刺激结构域，所述氨基酸序列可以由包含SEQID NO:18中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。
在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:21中所示的氨基酸序列的CD3ζ细胞内信号传导结构域，所述氨基酸序列可以分别由包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中所示的核苷酸序列的核酸序列编码。
细胞内结构域的可容许的变化对于本领域技术人员来将是已知的，同时保留其比活性。例如，在一些实施方案中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:19或21中所示的任何氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，细胞内结构域由这样的核酸序列编码，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:20或22中所示的任何核苷酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含ICOS共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含CD28共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含CD28 YMFM变体共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含CD27共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含OX40共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一个示例性实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一个示例性实施方案中，主题CAR的细胞内结构域包含CD2共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。
表1展示了本文所述的CAR的结构域的示例性序列。
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B.T细胞受体
在一些实施方案中，经修饰的未刺激的免疫细胞或经修饰的刺激的免疫细胞(例如，经修饰的未刺激的或刺激的T细胞)表达外源T细胞受体(TCR)。包含对任何抗原(例如，实体瘤抗原)具有亲和力的TCR的任何经修饰的细胞都是可设想的，并且本领域技术人员根据本文的公开文本可以容易地理解和制备。
在一些实施方案中，靶细胞已经被改变以含有特异性T细胞受体(TCR)基因(例如，TRAC和TRBC基因)。TCR或其抗原结合部分包括识别靶多肽(如肿瘤的抗原、病毒或自身免疫性蛋白)的肽表位或T细胞表位的那些。在一些实施方案中，TCR对肿瘤相关抗原具有结合特异性。在一些情形下，示例性肿瘤相关抗原包括NY-ESO-1(LAGE2、LAGE2B或癌症/睾丸抗原1)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)和H3.3K27M。
TCR是一种二硫键连接的异二聚体蛋白，其由参与T细胞响应于抗原而激活的六种不同的膜结合链组成。存在α/βTCR和γ/δTCR。α/βTCR包含TCRα链和TCRβ链。表达包含TCRα链和TCRβ链的TCR的T细胞通常称为α/βT细胞。γ/δTCR包含TCRγ链和TCRδ链。表达包含TCRγ链和TCRδ链的TCR的T细胞通常称为γ/δT细胞。本公开文本的TCR是包含TCRα链和TCRβ链的TCR。TCRα链和TCRβ链各自由两个细胞外结构域可变区和恒定区组成。TCRα链可变区和TCRβ链可变区是TCR对靶抗原的亲和力所需的。每个可变区包含三个高变区或互补决定区(CDR)，它们提供与靶抗原的结合。TCRα链的恒定区和TCRβ链的恒定区靠近细胞膜。TCR进一步包含跨膜区和短胞质尾。CD3分子与TCR异二聚体组装在一起。CD3分子包含酪氨酸磷酸化的特征序列基序，称为免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。近端信号传导事件是通过CD3分子介导的，因此，TCR-CD3复合物相互作用在介导细胞识别事件中起着重要作用。
TCR的刺激是由抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体分子(MHC)触发的，所述抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原肽，并且与TCR相互作用以诱导一系列细胞内信号传导级联。TCR的接合启动正和负信号传导级联，这导致细胞增殖、细胞因子产生和/或激活诱导的细胞死亡。
本发明的TCR可以是野生型TCR、高亲和力TCR和/或嵌合TCR。高亲和力TCR可能是对野生型TCR的修饰的结果，与野生型TCR相比，所述修饰赋予对靶抗原更高的亲和力。高亲和力TCR可以是亲和力成熟的TCR。修饰TCR和/或TCR的亲和力成熟的方法是本领域技术人员已知的。用于工程化和表达TCR的技术包括但不限于TCR异二聚体的产生，其包括连接各个亚基的天然二硫桥(Garboczi,等人,(1996),Nature 384(6605):134-41；Garboczi,等人,(1996),J Immunol 157(12):5403-10；Chang等人,(1994),PNAS USA 91:1 1408-11412；Davodeau等人,(1993),J.Biol.Chem.268(21):15455-15460；Golden等人,(1997),J.Imm.Meth.206:163-169；美国专利号6,080,840)。
在一些实施方案中，外源TCR是完整TCR或其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈ab形式或gd形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合，如与MHC-肽复合物结合。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变a链和可变b链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与所述肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有高变环或CDR，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见例如，Jores等人,PNAS,87:9138(1990)；Chothia等人,EMBO J.,7:3745(1988)；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55(2003))。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上的三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经加工肽部分的相互作用最重要。在一些情境下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情境下，β链的CDR1可以与肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别贡献最大或者是主要负责的CDR。在一些实施方案中，b链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb,Clinical Microbiology Reviews,8:41 1-426(1995))。
在一些实施方案中，TCR含有可变α结构域(Va)和/或可变β结构域(Vp)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR的α链和/或β链还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health andDisease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33(1997))。
在一些实施方案中，所述α链恒定结构域由TRAC基因(IMGT命名法)编码或是其变体。在一些实施方案中，所述β链恒定区由TRBC1或TRBC2基因(IMGT命名法)编码或是其变体。在一些实施方案中，所述恒定结构域与细胞膜相邻。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。
确定或鉴定TCR的各种结构域或区域在熟练技术人员的水平内。在一些方面中，TCR的残基是已知的或者可以根据国际免疫遗传学信息系统(InternationalImmunogenetics Information System，IMGT)编号系统鉴定(参见例如www.imgt.org；还参见Lefranc等人,Developmental and Comparative Immunology,2:55-77(2003)；以及TheTCell Factsbook第2版,Lefranc and LeFranc Academic Press 2001)。使用此系统，TCRVa链和/或nb链内的CDR1序列对应于残基编号27-38(包括端值)之间存在的氨基酸，TCR Va链和/或nb链内的CDR2序列对应于残基编号56-65(包括端值)之间存在的氨基酸，并且TCRVa链和/或nb链内的CDR3序列对应于残基编号105-117(包括端值)之间存在的氨基酸。
在一些实施方案中，TCR可以是如通过一个或多个二硫键连接的两条链a和b(或任选地g和d)的异二聚体。在一些实施方案中，TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接所述TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在a链和b链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。在一些实施方案中，恒定和可变结构域中的每一个含有由半胱氨酸残基形成的二硫键。
在一些实施方案中，用于如所述工程化细胞的TCR是从一个或多个已知的TCR序列(如na、b链的序列)产生的TCR，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是容易获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，T细胞可以是经培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，可以根据TCR序列的知识合成产生所述TCR或其抗原结合部分。在一些实施方案中，从患者鉴定、分离靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见例如，肿瘤抗原(参见例如，Parkhurst等人,Clin Cancer Res.,15:169-180(2009)和Cohen等人,J.Immunol.,175:5799-5808(2005))。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等人,Nat.Med.,14:1390-1395(2008)和Li,Nat.Biotechnol.,23:349-354(2005))。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已修饰或工程化的TCR或其抗原结合部分。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性(如对特定MHC-肽复合物具有较高亲和力)的TCR。在一些实施方案中，通过包括但不限于以下的展示方法实现定向进化：酵母展示(Holler等人,Nat.Immunol.,4:55-62(2003)；Holler等人,PNAS USA,97:5387-92(2000))、噬菌体展示(Li等人,Nat.Biotechnol.,23:349-54(2005))或T细胞展示(Chervin等人,J.Immunol.Methods,339:175-84(2008))。在一些实施方案中，展示途径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生经诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基发生突变，并且选择具有所希望改变的特性(如对所希望的靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在如所述的一些实施方案中，所述TCR可以含有引入的一个或多个二硫键。在一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸(例如在a链和b链的恒定结构域中)被另一种残基(如丝氨酸或丙氨酸)取代。在一些实施方案中，可以通过将α链和β链上(如在a链和b链的恒定结构域中)的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于WO 2006/000830和WO 2006/037960中。在一些实施方案中，可以在α链的残基Thr48和β链的残基Ser57处、在α链的残基Thr45和β链的残基Ser77处、在α链的残基Tyr10和β链的残基Serl7处、在α链的残基Thr45和β链的残基Asp59处、和/或在α链的残基Serl5和β链的残基Glul5处引入半胱氨酸。在一些实施方案中，重组TCR中非天然半胱氨酸残基的存在(例如产生一个或多个非天然二硫键)可以有利于在引入它的细胞中产生所需重组TCR，而不是表达含有天然TCR链的错配TCR对。
在一些实施方案中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些方面中，所述TCR的每条链(例如α或β)可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和C末端处的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR(例如经由胞质尾)与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子如CD3及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3Y、CD36、CD3s和链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCR a链可变区序列的序列与对应于TCR a链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCR b链可变区序列的序列与对应于TCR b链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚体ab TCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。在一些实施方案中，dTCR含有TCR a链，所述TCR a链含有可变a结构域、恒定a结构域和附接至恒定a结构域C末端的第一二聚化基序；以及TCR b链，所述TCR b链包含可变b结构域、恒定b结构域和附接至恒定b结构域C末端的第一二聚化基序，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCR a链与TCR b链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR，其是含有能够与MHC-肽复合物结合的α链和β链的单氨基酸链。
通常，scTCR可以使用本领域技术人员已知的方法产生，参见例如，WO 1996/13593、WO 1996/18105、WO 1999/18129、WO 2004/033685、WO 2006/037960、WO 2011/044186；美国专利号7,569,664；和Schlueter等人J.Mol.Biol.,256:859(1996)。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以是Ca或CP跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可以来自非TCR来源，例如来自CD3z、CD28或B7.1的跨膜区。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于细胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR含有CD3z信号传导结构域。在一些实施方案中，TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已发生改变。在一些实施方案中，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。
在一些实施方案中，TCR包含对靶细胞上的靶抗原的亲和力。靶抗原可以包括与靶细胞缔合的任何类型的蛋白质或其表位。例如，TCR可以包括对靶细胞上的靶抗原的亲和力，所述亲和力指示靶细胞的特定疾病状态。在一些实施方案中，靶抗原由MHC处理和呈递。
在一些实施方案中，TCR由核酸构建体编码，所述核酸构建体从N末端到C末端依次编码第一异源TCR亚基链(其中所述TCR亚基链包含所述TCR亚基链的可变区和恒定区)和第二异源TCR亚基链的可变区和可变区。所述构建体进一步编码在所述第一异源TCR亚基链的可变区之前的第一自切割肽，以及在第一异源TCR亚基链与第二TCR亚基之间的第二自切割肽。在一些实施方案中，第一异源TCR亚基链是TCRα链，并且所述第二异源TCR亚基链是TCRβ链。在一些实施方案中，第一异源TCR亚基链是TCRβ链，并且所述第二异源TCR亚基链是TCRα链。
自切割肽的例子包括但不限于自切割病毒2A肽，例如猪捷申病毒-1(P2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A)肽、马鼻炎A病毒(E2A)肽或口蹄疫病毒(F2A)肽。自切割2A肽允许表达来自单个构建体的多个基因产物。(参见例如，Chng等人"Cleavage efficient 2Apeptides for high level monoclonal antibody expression in CHO cells,"MAbs,7(2):403-412(2015))。在一些实施方案中，第一和第二自切割肽是相同的。在一些实施方案中，第一和第二自切割肽是不同的。
C.另外的抗原结合多肽
在一些实施方案中，所述经修饰的未刺激的免疫细胞或经修饰的刺激的免疫细胞(例如，经修饰的未刺激的或刺激的T细胞)表达抗原结合结构域、细胞表面受体配体或与肿瘤抗原结合的多肽。在一些情形下，抗原结合结构域包含这样的抗体，所述抗体识别细胞表面蛋白或在肿瘤细胞上表达的受体。在一些情形下，抗原结合结构域包含识别肿瘤抗原的抗体。在一些情形下，抗原结合结构域包含全长抗体或其抗原结合片段、Fab、F(ab)2、单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、三抗体、微型抗体、V-NAR或VhH。
在一些实施方案中，经修饰的未刺激的免疫细胞或经修饰的刺激的免疫细胞(例如，经修饰的未刺激的或刺激的T细胞)表达细胞表面受体配体。在一些情形下，配体与在肿瘤细胞上表达的细胞表面受体结合。在一些情况下，配体包含与细胞表面受体结合的野生型蛋白或其变体。在一些情形下，配体包含与所述细胞表面受体结合的全长蛋白或其功能片段。在一些情况下，与全长形式的蛋白质相比，功能片段包含约90％、约80％、约70％、约60％、约50％或约40％的长度，但是保留与细胞表面受体的结合。在一些情况下，配体是与细胞表面受体结合的从头工程化的蛋白质。示例性配体包括但不限于表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或Wnt3A。
在一些实施方案中，经修饰的未刺激的免疫细胞或经修饰的刺激的免疫细胞(例如，经修饰的未刺激的或刺激的T细胞)表达与肿瘤抗原结合的多肽。在一些情形下，肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。示例性肿瘤抗原包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD33/IL3Ra、ROR1、间皮素、c-Met、PSMA、PSCA、叶酸受体α、叶酸受体β、EGFRvIII、GPC2、Tn-MUC1、GDNF家族受体α-4(GFRa4)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)和IL13Ra2。在一些情形下，肿瘤抗原包括CD19、CD20、CD22、BCMA、CD37、间皮素、PSMA、PSCA、Tn-MUC1、EGFR、EGFRvIII、c-Met、HER1、HER2、CD33、CD133、GD2、GPC2、GPC3、NKG2D、KRAS或WT1。在一些情形下，多肽是肿瘤抗原的配体，例如与肿瘤抗原结合的全长蛋白、其功能片段或与肿瘤抗原结合的从头工程化的配体。在一些情形下，多肽是与肿瘤抗原结合的抗体。
IV.组合物
本发明的组合物可以包含如本文所述的经修饰的未刺激的免疫细胞或如本文所述的经修饰的刺激的免疫细胞，任选地与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂组合。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地被配制用于肠胃外施用(例如，静脉内施用)。
V.使用方法
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的经修饰的未刺激的免疫细胞群体，或本文所述的经修饰的刺激的免疫细胞群体。在一些情形下，所述疾病是癌症，任选地是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些情形下，经修饰的未刺激的免疫细胞或经修饰的刺激的免疫细胞各自表达抗原结合结构域，所述抗原结合结构域对由癌症表达的抗原具有特异性。
在一些实施方案中，癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括但不限于膀胱癌、骨癌、脑癌(例如，神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或胃癌。在一些情形下，实体瘤是脑癌(例如，神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在一些情形下，实体瘤是转移性癌症。在一些情况下，实体瘤是复发性或难治性实体瘤。
在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤是B细胞恶性肿瘤或T细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤是淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。示例性血液恶性肿瘤包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、华氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些情形下，血液恶性肿瘤是转移性血液恶性肿瘤。在一些情况下，血液恶性肿瘤是复发性或难治性血液恶性肿瘤。
在一些实施方案中，治疗疾病的方法进一步包括向所述受试者施用另外的治疗剂或另外的疗法。
在一些情况下，本文公开的另外的治疗剂包括化学治疗剂、免疫治疗剂、靶向疗法、放射疗法或其组合。说明性的另外的治疗剂包括但不限于烷基化剂，如六甲蜜胺、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、洛莫司汀、美法仑、奥沙利铂、替莫唑胺或噻替帕；抗代谢物，如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤或培美曲塞；蒽环类药物，如柔红霉素、阿霉素、表柔比星或伊达比星；拓扑异构酶I抑制剂，如拓扑替康或伊立替康(CPT-11)；拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷或米托蒽醌；有丝分裂抑制剂，如多西他赛、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、长春碱、长春新碱或长春瑞滨；或皮质类固醇，如泼尼松、甲基泼尼松龙或地塞米松。
在一些情况下，另外的治疗剂包括一线疗法。如本文所用，“一线疗法”包括用于患有癌症的受试者的主要治疗。在一些情形下，癌症是原发性癌症。在其他情形下，癌症是转移性或复发性癌症。在一些情况下，一线疗法包括化学疗法。在其他情况下，一线治疗包括放射疗法。技术人员将容易理解，不同的一线治疗可以适用于不同类型的癌症。
在一些情况下，另外的治疗剂包括免疫检查点抑制剂。在一些情形下，免疫检查点抑制剂包括针对以下的抑制剂，如抗体或其片段(例如，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、RNAi分子或小分子：PD-1、PD-L1、CTLA4、PD-L2、LAG3、B7-H3、KIR、CD137、PS、TFM3、CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、OX40、GITR、ICOS、BTLA(CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGHT、DR3、CD226、CD2或SLAM。
示例性检查点抑制剂包括派姆单抗、纳武单抗、曲美木单抗或伊匹单抗。
在一些实施方案中，另外的疗法包括放射疗法。
在一些实施方案中，另外的疗法包括手术。
VI.试剂盒和制品
在一些实施方案中，本文所述的试剂盒或制品包含一个或多个经修饰的未刺激的免疫细胞(例如，经修饰的未刺激的T细胞)群体或一个或多个经修饰的刺激的免疫细胞(例如，经修饰的刺激的T细胞)群体。在一些情形下，本文所述的试剂盒或制品进一步包含载体、包装或容器，其被分隔以容纳一个或多个容器如小瓶、管等，所述一个或多个容器中的每一个包含有待在本文所述的方法中使用的单独要素之一。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由各种材料(如玻璃或塑料)形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的例子包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子以及适合于所选配制品以及预期施用方式和治疗的任何包装材料。
试剂盒通常包含列出内容物和/或使用说明的标签、以及包含使用说明的包装说明书。通常还将包括一组指令。
VII.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本公开文本的实践或测试，但本文描述了合适的方法和材料。
除非上下文明确指示其他含义，否则如本文所用的单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文所用，使用术语“约”指某一数值包括用于测定所述数值的装置或方法的误差的标准偏差。当在数字指定(例如温度、时间、量和浓度，包括范围)之前使用时，术语“约”指示可以变化(+)或(-)15％、10％、5％、3％、2％或1％的近似值。
除非另有指示，本公开文本将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见例如，Green和Sambrook编辑(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版；丛书Ausubel等人编辑(2015)Current Protocols in Molecular Biology；丛书Methods in Enzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；MacPherson等人(2015)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press atOxford University Press)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical Approach；McPherson等人(2006)PCR:The Basics(Garland Science)；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Greenfield编辑(2014)Antibodies,A LaboratoryManual；Freshney(2010)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第6版；Gait编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic AcidHybridization；Herdewijn编辑(2005)Oligonucleotide Synthesis:Methods andApplications；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription and Translation；Buzdin andLukyanov编辑(2007)Nucleic Acids Hybridization:Modern Applications；ImmobilizedCells and Enzymes(IRL Press(1986))；Grandi编辑(2007)In Vitro Transcription andTranslation Protocols,第2版；Guisan编辑(2006)Immobilization of Enzymes andCells；erbal(1988)A Practical Guide to Molecular Cloning,第2版；Miller和Calos编辑,(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring HarborLaboratory)；Makrides编辑(2003)Gene Transfer and Expression in MammalianCells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Academic Press,London)；Lundblad和Macdonald编辑(2010)Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology,第4版；以及Herzenberg等人编辑(1996)Weir'sHandbook of Experimental Immunology,第5版。
“同种异体的”是指衍生自相同物种的不同动物的任何物质。
如本文所用，术语“抗体”是指这样的组装体(例如，完整抗体分子、免疫粘附素或其变体)，其对目的抗原(例如肿瘤相关抗原)具有显著已知的特异性免疫反应活性。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，其间具有或不具有链间共价连接。脊椎动物系统中的基础免疫球蛋白结构已被相对充分地理解。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原确定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和从抗体片段形成的多特异性抗体。
例如嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括抗体变体。如本文所用，术语“抗体变体”包括抗体的合成和工程化形式，所述抗体被改变使得它们不是天然存在的，例如包含至少两个重链部分但不是两个完整重链的抗体(如结构域缺失的抗体或微型抗体)；多特异性形式的抗体(例如，双特异性、三特异性等)，其被改变以结合两种或更多种不同抗原或结合单一抗原上的不同表位；与scFv分子连接的重链分子等。另外，术语“抗体变体”包括多价形式的抗体(例如，三价、四价等)，结合相同抗原的三个、四个或更多个拷贝的抗体。
如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的激活，或两者。本领域技术人员将理解，任何大分子(包括几乎所有的蛋白质或肽)都可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码作为本文所用的术语的“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。容易地看出，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所希望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。容易地看出，抗原可以合成产生，或者可以衍生自生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
如本文所用，术语“自体的”意在指代源自同一个体的任何材料，之后可以将所述材料重新引入所述个体中。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指经工程化以在免疫效应细胞或其前体细胞上表达并特异性结合抗原的人工T细胞受体。CAR可用于过继细胞疗法和过继细胞转移。在一些实施方案中，过继细胞转移(或疗法)包括从患者取出T细胞，并且修饰T细胞以表达对特定抗原具有特异性的受体。在一些实施方案中，CAR对选定的靶标(例如PSMA或MUC1)具有特异性。CAR还可以包含细胞内激活结构域、跨膜结构域和包含抗原结合区的细胞外结构域。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括所有本领域已知的那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“切割”是指共价键的断裂，如在核酸分子的骨架中或肽键的水解中。裂解可以通过多种方法来引发，所述多种方法包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割两者都是可能的。双链切割可能是两个不同的单链切割事件的结果。DNA裂解可导致产生平头末端或交错末端。
如本文所用，“同源”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个序列中的两者中的亚基位置都被相同的单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，则所述分子在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中的位置的一半(例如，在长度上的聚合物十个亚基中的五个位置)是同源的，则这两个序列50％同源；如果90％位置(例如，10分之9)匹配或同源，则这两个序列90％同源。
术语“非同源末端连接”或NHEJ是指其中在不需要同源模板核酸的情况下直接连接DNA链的切割的末端或有切口的末端的过程。NHEJ的修复可以导致在修复位点处的一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代或其组合。
术语“同源定向修复”或HDR是指其中通过插入同源模板或供体核酸来修复DNA链的切割的末端或有切口末端的过程。当发生这种情况时，将原始DNA序列用同源模板DNA替换。同源模板核酸可以由基因组中其他地方(姐妹染色单体、同源染色体、或者相同或不同染色体上的重复区域)的同源序列提供。可以引入外源模板核酸以在靶位点处获得特定的HDR诱导的序列变化。这允许在切割位点引入特定的突变或转基因。外源模板可以是单链DNA(ssDNA)模板或双链DNA(dsDNA)模板，编码由HDR引入的转基因或突变。在一些情况下，ssDNA或dsDNA模板包括两个同源区域，例如5’末端和3’末端，其侧接含有待插入靶切割或插入位点的异源序列的区域。
如本文所用，术语“上游”是指在基因组中的特定位点或基因座(例如，由基因组编辑系统催化的切割位点)的5’处发现的核酸序列。如本文所用，术语“下游”是指在基因组中特定位点或基因座的3’处发现的核酸序列。
如本文可互换使用的“有效量”或“治疗有效量”是指如本文所述的化合物、配制品、材料、药剂或组合物在有需要的受试者中有效地实现所希望的生理、治疗或预防结局的量。此类结果可以包括但不限于当施用于哺乳动物时引起与在不存在本发明的组合物的情况下检测到的免疫应答相比的可检测水平的免疫应答的量。可以通过多种本领域承认的方法轻松评估免疫应答。本领域技术人员将理解，本文施用的组合物的量是变化的，并且可以基于许多因素(如正在治疗的疾病或病症、正在治疗的哺乳动物的年龄和健康以及身体状况、疾病的严重程度、正在施用的特定化合物等)容易地确定。根据待治疗受试者的健康和身体状况、待治疗受试者的分类组、组合物的配制、受试者医疗状况的评估和其他相关因素，有效量可以在受试者之间有所不同。
“编码”是指多核苷酸(如基因，cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生了蛋白质，则该基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，通常在序列列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)两者均可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统，或者生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。
如本文所用的术语“表位”被定义为在抗原上可以引发免疫应答、诱导B和/或T细胞应答的小化学分子。抗原可以具有一个或多个表位。大多数抗原具有许多表位；即，它们是多价的。通常，表位的大小粗略地为约10个氨基酸和/或糖。在某些示例性实施方案中，所述表位为约4-18个氨基酸、约5-16个氨基酸、约6-14个氨基酸、约7-12个氨基酸、约10-12个氨基酸或约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解，通常分子的整体三维结构(而不是特定的线性序列)是抗原特异性的主要标准，并且因此将一个表位与另一个表位区分开。基于本公开文本，本发明中使用的肽可以是表位。
如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。
如本文所用的术语“扩增”是指数量的增加，如T细胞数量的增加。在一个实施方案中，离体扩增的T细胞的数量相对于最初存在于培养物中的数量增加。在另一个实施方案中，离体扩增的T细胞的数量相对于培养物中的其他细胞类型增加。如本文所用，术语“离体”是指已经从活生物体(例如，人)中取出并且在生物体外部(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
如本文所用的术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用的“同一性”是指两个聚合物分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，如两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中的每个分子中的一个位置被精氨酸占据，则它们在该位置是相同的。两个氨基酸序列在比对中在相同位置处具有相同残基的同一性或程度通常以百分比表示。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或相同位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中的位置的一半(例如，在长度上的聚合物十个氨基酸中的五个位置)相同，则两个序列50％相同；如果90％的位置(例如10分之9)匹配或相同，则两个氨基酸序列90％相同。
“分离的”意指从其天然状态改变或脱离。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，而是从其天然状态的共存物质中部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。
如本文所用的术语“敲低”是指一个或多个基因的基因表达的降低。
如本文所用的术语“敲除”是指一个或多个基因的基因表达的消融。
如本文所用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
如本文所用的术语“经修饰的”意指本发明的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可以通过多种方式进行修饰，包括化学、结构和功能上的修饰。细胞可以通过引入核酸来修饰。
如本文所用的术语“调节”意指与不存在治疗或化合物的情况下受试者的反应水平相比和/或与在其他方面相同但是未治疗的受试者的反应水平相比，介导受试者的反应水平的可检测的增加或减少。所述术语涵盖干扰和/或影响天然信号或反应，从而介导受试者(例如人)中的有益治疗反应。
在本发明的上下文中，使用以下常用的核酸碱基的缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，“U”指尿苷。
除非另有规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，至编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以含有一个或多个内含子的程度。
如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有如下常识，即核酸是多核苷酸，多核苷酸可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段(即，使用普通克隆技术和聚合酶链式反应等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)和通过合成手段。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体的短链以及在本领域中通常称为蛋白质的有许多类型的长链。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
术语“特异性”是指特异性结合(例如，与……免疫反应)给定靶抗原(例如，人靶抗原)的能力。嵌合抗原受体可以是单特异性的并且含有特异性结合靶标的一个或多个结合位点，或者嵌合抗原受体可以是多特异性的并且含有特异性结合相同或不同靶标的两个或更多个结合位点。在某些实施方案中，嵌合抗原受体对相同靶标的两个不同(例如，非重叠)部分具有特异性。在某些实施方案中，嵌合抗原受体对多于一种靶标具有特异性。
如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”意指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体或其结合片段(例如，scFv)。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗体也可以与来自一个或多个物种的该抗原结合。但是，这种跨物种反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一个例子中，与抗原特异性结合的抗体也可以与抗原的不同等位基因形式结合。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在一些情形下，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specificallybinding)”可以用于指代抗体、蛋白质、嵌合抗原受体或肽与第二化学物质的相互作用，以意味着所述相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，嵌合抗原受体识别并结合至特定蛋白质结构，而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和所述抗体的反应中，含有表位A(或游离的未标记的A)的分子的存在将减少与所述抗体结合的标记的A的量。
如本文所用的术语，术语“未刺激的”是指免疫细胞(例如，T细胞)尚未通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合被刺激或诱导的状态。未刺激的T细胞也可以称为“休眠”或“幼稚”T细胞，并且尚未通过本领域手段的方法被刺激。未刺激的细胞表达可以将细胞与群体中的其他细胞(例如，刺激的T细胞)进行区分的标记物，所述标记物包括但不限于CD45RA和CD62L。
如本文所用，“休眠”是指处于可逆状态的细胞，优选T细胞，在所述可逆状态中，所述细胞不分裂，但是保留重新进入细胞增殖的能力。休眠T细胞的特征在于小的细胞大小、增殖能力低和基础代谢程序低。可以刺激休眠细胞分裂和增殖。休眠细胞是基本上不增殖的细胞群体。可以通过多种手段来测量休眠，所述手段包括但不限于细胞增殖测定，如BrdU测定、EdU测定、MTT细胞增殖测定、XTT细胞增殖测定、WST-1细胞增殖测定和标记物(如Ki67)和增殖细胞核抗原(PCNA)的测量。
术语“刺激”意指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合从而介导信号转导事件(诸如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导)而诱导的初级应答。刺激可以介导某些分子表达的改变，如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组、克隆扩增和分化为不同的亚群。
如本文所用的术语“刺激分子”意指T细胞上与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性地结合的分子。
如本文所用，“刺激配体”意指当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上时可以与T细胞上的同源结合配偶体(本文称为“刺激分子”)特异性地结合，从而介导T细胞的初级应答(包括但不限于激活、启动免疫应答、增殖等)的配体。刺激配体在本领域中是熟知的，并且尤其涵盖负载有肽、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。
如本文所用，关于培养未刺激的免疫细胞(例如，经修饰的未刺激的免疫细胞)的术语“非扩增条件”是指不刺激免疫细胞的培养条件。在一些实施方案中，培养基不包含将在未刺激的免疫细胞中诱导刺激应答的刺激分子或刺激配体。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换地使用。如本文所用，受试者可以是哺乳动物，如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)。在某些实施方案中，如本文所用，术语“受试者”是指脊椎动物，如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、野生动物、未驯服的动物、农场动物、运动动物和宠物。可以引发免疫应答的任何活生物体都可能是受试者或患者。在某些示例性实施方案中，受试者是人。
“靶位点”或“靶序列”是指如下基因组核酸序列，其定义结合分子可在足以发生结合的条件下所特异性地结合的核酸的一部分。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指膜蛋白的复合物，其响应于抗原的呈递而参与T细胞的激活。TCR负责识别与主要组织相容性复合体分子结合的抗原。TCR由alpha(a)链和beta(β)链的异二聚体构成，尽管在一些细胞中，TCR由gamma和delta(γ/δ)链组成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，它们在结构上类似但具有不同的解剖学位置和功能。每条链由两个细胞外结构域(可变结构域和恒定结构域)组成。在一些实施方案中，TCR可以在任何包含TCR的细胞上被修饰，所述细胞包括例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。
如本文所用的术语“治疗”意指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态获得治疗效果。
如本文所用，术语“疗法”是指可以用于预防、管理、治疗和/或改善疾病或与其相关的症状的任何方案、方法和/或药剂(例如，CAR-T)。在一些实施方案中，术语“多个疗法”和“疗法”是指本领域技术人员(如医务人员)已知的可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病或与其相关的症状的生物疗法(例如，过继细胞疗法)、支持疗法(例如，淋巴细胞耗竭疗法(lymphodepleting therapy))和/或其他疗法。
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指借之将外源核酸转移至或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指由一种或多种疗法(包括但不限于针对实体瘤的治疗的CAR-T疗法)的施用引起的疾病或与其相关的症状的进展、严重程度、频率和/或持续时间的降低或改善。如本文所用，术语“治疗”还可以指代改变被治疗受试者的病程。治疗的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓和一种或多种症状、减少疾病的直接或间接病理后果、降低疾病进展的速度、改善或减缓疾病状态以及缓解或改善预后。
“载体”是包含分离的核酸并且可以用于将所述分离的核酸递送到细胞内部的物质组合物。多种载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物缔和的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的例子包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆病毒载体、慢病毒载体等。
如本文所用，关于Cas核酸内切酶的术语“基于”是指与目的参考或靶Cas核酸内切酶相比，具有约60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Cas分子。
如本文所用，术语“多种完全培养基”和“完全培养基”是指针对免疫细胞生长(例如，T细胞生长)进行优化的细胞培养基。在一些情形下，完全培养基包含蛋白质、无机盐、微量元素、维生素、氨基酸、脂质、碳水化合物、细胞因子和/或生长因子，其中每种组分的比率已针对细胞生长进行了优化。示例性蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白和胰岛素。示例性碳水化合物包括葡萄糖。示例性无机盐包括钠、钾和钙离子。示例性微量元素包括锌、铜、硒和三羧酸。示例性氨基酸包括必需氨基酸，如L-谷氨酰胺(例如丙氨酰-l-谷氨酰胺或甘氨酰-l-谷氨酰胺)；或非必需氨基酸(NEAA)，如甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和/或L-丝氨酸。在一些实施方案中，完全培养基还包含碳酸氢钠(NaHCO3)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、酚红、抗生素和/或β-巯基乙醇中的一种或多种。在一些情形下，完全培养基是无血清培养基。在一些情形下，完全培养基是无异种培养基。
如本文所用，术语“化学成分确定的培养基”是指其中所有组分的组成和浓度是已知的细胞培养基。它与完全培养基的不同之处在于，完全培养基可以含有其中组成和/或浓度是未知的组分，例如，动物来源的组分。
在一些情形下，“无外源物质”培养基不含有任何动物来源的(非人)组分。在一些情形下，无外源物质培养基含有一种或多种人来源的组分，如人血清、生长因子和胰岛素。
在一些实施方案中，“无血清”培养基不含血清或血浆，但是可以含有源自血清或血浆的组分。在一些情形下，“无血清”培养基含有动物来源的组分，如牛血清白蛋白(BSA)。
在一些实施方案中，“基础”培养基包含用于靶细胞生长的基础必需物。在一些情形下，基础培养基含有无机盐、碳源和水。在一些情形下，将补充剂、细胞因子和/或蛋白质(如白蛋白(例如，HSA))添加到基础培养基中。如本文所用，补充剂包括微量元素、维生素、氨基酸、脂质、碳水化合物、细胞因子、生长因子或其组合。
范围：贯穿本公开文本，本发明的各方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明的范围的僵硬限制。因此，应当认为范围的描述具体地公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，对范围(如从1至6)的描述应该被认为已经具体地公开了子范围(如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等)以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
实施例
这些实施例仅仅出于说明性目的提供，并且不限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1-用于制备经修饰的未刺激的T细胞的通用无载体制造方法
基于图2中所示的方法制备经修饰的未刺激的T细胞。
简言之，从新鲜的白细胞单采术样品处理未刺激的T细胞。从白细胞单采术中选择T细胞是由CliniMACS Prodigy根据制造商的方案进行的，并且使用CD4和CD8微珠对CD4+和CD8+T细胞进行阳性选择。然后将富集的CD4+和CD8+T细胞重悬于电穿孔缓冲液中。
将Cas9核酸内切酶、gRNA和靶向TCRα恒定(TRAC)基因座的HDR模板进行孵育，随后通过使用4D Nucleofector(Lonza)或ATx或GTx电穿孔剂(MaxCyte)转染到未刺激的T细胞群体中。Cas9核酸内切酶、gRNA和HDR模板的比率为1:1:1。
随后将转染的T细胞培养约72小时，然后收获并且在-80℃下冷冻。
实施例2-使用CRISPR/Cas9与靶向TRAC的gRNA破坏未刺激的T细胞中的内源TCR表达
进行CRISPR/Cas9基因编辑以靶向未刺激的T细胞中的TCRα恒定(TRAC)基因座。
测试了两种CRISPR/Cas9核糖核酸蛋白(RNP)系统：Truecut.v2 Cas9(ThermoFisher Scientific)和SpyFi Cas9(Aldevron)。将在未使用RNP的情况下进行模拟电穿孔的T细胞用作阳性对照。用RNP复合物电穿孔72小时后，通过流式细胞术分析细胞的CD3ε和TCRα/β表达。
图3A和图3B示出了与未用RNP电穿孔的阳性对照细胞相比，在使用Truecut或SpyFi CRISPR/Cas9 RNP的细胞中表达内源TCR的细胞百分比显著降低。
引入供体DNA模板以测试在破坏的TRAC基因座中HDR介导的插入。设计具有侧接5’同源臂和3’同源臂的EcoRI限制性位点的单链DNA(ssDNA)超聚寡核苷酸和经化学修饰的ssDNA供体(图4)。同源臂被设计为在TRAC基因座的CRISPR/Cas9切割位点的上游和下游具有同源性。经由电穿孔将ssDNA供体引入细胞。测试有或没有HDR介导的插入，并且将引物设计为插入的上游和下游(包括同源臂)的基因组序列，并且经由聚合酶链式反应(PCR)扩增插入位点。
然后将PCR产物与EcoRI一起孵育，并且将所得的DNA片段使用琼脂糖电泳分离并且可视化。
图5展示了EcoRI消化的结果。通过CRISPR/Cas9编辑和EcoRI消化的泳道中较低的分子量条带表明了供体DNA的成功插入。
实施例3-将编码NY-ESO-1TCR的供体DNA插入TRAC基因座中的敲入策略
图6展示了HDR介导的将对NY-ESO-1具有特异性的工程化TCR插入TRAC基因座中的策略。
设计了含有完整TCRα和TCRβ(仅VJ区)链的供体DNA。在CRISPR切割TRAC外显子1位点后，有效载荷两侧的同源臂允许外源TCR的插入。
翻译后去除自切割肽(T2A和P2A)，从而产生NY-ESO-1TCR的全长TCRα和TCRβ链的组成型表达。
实施例4-将编码靶蛋白的供体DNA插入T细胞基因组中的特定基因座中
设计了编码绿色荧光蛋白的DNA供体(GFP HDR盒)，并且将其插入T细胞基因组内的特定靶向区域中。如上文所述，GFP基因侧接5’同源臂和3’同源臂。图7显示了取决于每个反应中使用的DNA供体的量而检测到不同百分比的GFP+T细胞。
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虽然已经说明并描述了某些实施方案，但是应理解，在不脱离如所附权利要求中限定的本技术的更广泛方面的情况下，可以根据本领域的普通技术在其中进行改变和修改。
本文说明性描述的实施方案可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下进行合适的实践。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩展地且无限制地解读。另外，本文采用的术语和表达已经被用作具有描述性而没有限制性的术语，并且在使用此类术语和表达时并非意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，而是认为可以在所要求保护的技术的范围内进行各种修改。另外，短语“基本上由……组成”将被理解为包括那些具体列举的元素和那些不实质影响所要求保护的技术的基本和新颖特征的那些另外元素。短语“由......组成”不包括任何未指定的元素。
本公开文本不受限于本申请中描述的特定实施方案。如本领域技术人员所清楚地，可以在不脱离其精神和范围的情况下进行许多修改和变化。本领域技术人员从前面的描述中将清楚除了本文列举的那些方法和组合物外的在本公开文本的范围内的功能上等效的方法和组合物。此类修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本公开文本仅由所附权利要求的权项以及此类权利要求所提到的等同物的全部范围来限制。应当理解，本公开文本不限于特定的方法、试剂、化合物或组合物，其当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅是用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在具有限制性。
另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员应认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合，不包括端点。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述相同的范围并使相同的范围能够分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围都可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。
将本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文件均通过引用并入本文，如同具体且单独地指示将每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文件通过引用以其整体并入一样。在通过引用并入的文本中包含的定义与本公开文本中的定义相抵触的程度上，将其排除。
其他实施方案陈述于以下权利要求中。

Claims (48)

1.一种制备经修饰的未刺激的免疫细胞群体的无载体方法，所述无载体方法包括：
(a)通过转染方法将(i)基因编辑核酸酶、(ii)指导RNA和(iii)包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的同源定向修复(HDR)模板递送到从生物样品获得的未刺激的免疫细胞群体中；以及
(b)将所述群体在非扩增条件下培养约72小时或更短时间，
其中所述基因编辑核酸酶和所述指导RNA形成复合物以在至少一个未刺激的免疫细胞内的靶位点处产生双链断裂，并且
其中所述HDR模板促进所述靶位点处的HDR以在所述群体内产生至少一个经修饰的未刺激的免疫细胞。
2.一种制备经修饰的未刺激的免疫细胞群体的无载体方法，所述无载体方法包括：
(a)从生物样品获得富集的未刺激的免疫细胞群体；
(b)通过转染方法将(i)基因编辑核酸酶、(ii)指导RNA和(iii)包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的同源定向修复(HDR)模板递送到所述富集的群体中；以及
(c)将所述群体在非扩增条件下培养；
其中所述基因编辑核酸酶和所述指导RNA形成复合物以在所述群体内的多个未刺激的免疫细胞内的靶位点处产生双链断裂，并且
其中所述HDR模板促进所述靶位点处的HDR产生多个经修饰的未刺激的免疫细胞，并且
其中所述群体内约10％或更高的未刺激的免疫细胞被修饰。
3.一种产生经修饰的未刺激的免疫细胞群体的无载体方法，所述无载体方法包括：
(a)通过以下方式在约10％或更高的未刺激的免疫细胞群体中诱导同源定向修复(HDR)：
(i)使所述未刺激的免疫细胞群体与基因编辑核酸酶和包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的同源定向修复(HDR)模板接触；并且
(ii)通过转染方法将所述基因编辑核酸酶和所述HDR模板递送到所述未刺激的免疫细胞中；以及
(b)将所述未刺激的免疫细胞在非扩增条件下培养约72小时或更短时间，从而产生所述经修饰的未刺激的免疫细胞群体。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括：
(a)使所述未刺激的免疫细胞群体与指导RNA接触，并且通过转染方法将所述指导RNA递送到所述未刺激的免疫细胞中，以及任选地
(b)其中所述基因编辑核酸酶和任选地所述指导RNA在一个或多个未刺激的免疫细胞的基因组内的靶位点处产生双链断裂。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述HDR模板在约10％或更高的所述未刺激的免疫细胞群体中促进所述靶位点处的HDR。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述未刺激的免疫细胞群体：
(a)从生物样品获得；和/或
(b)包含CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合的富集的群体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述未刺激的免疫细胞群体包含约500万个细胞、1000万个细胞、2000万个细胞、5000万个细胞、1亿个细胞、5亿个细胞、10亿个细胞、20亿个细胞、30亿个细胞、40亿个细胞、50亿个细胞或更多。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述转染方法：
(a)提供了从约10％至约99％、从约12％至约99％、从约13％至约99％、从约15％至约99％、从约20％至约99％、从30％至约99％、从约40％至约99％、从约50％至约99％、从约60％至约99％、从约70％至约99％、从约10％至约80％、从约12％至约80％、从约13％至约80％、从约15％至约80％、从约20％至约80％、从约30％至约80％、从约40％至约80％、从约50％至约80％、从约20％至约70％或从约30％至约60％的效率；和/或
(b)提供了约10％、12％、13％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的效率。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法提供了以下的细胞活力：
(a)从约10％至约99％、从约12％至约99％、从约13％至约99％、从约15％至约99％、从约20％至约99％、从30％至约99％、从约40％至约99％、从约50％至约99％、从约60％至约99％、从约70％至约99％、从约10％至约80％、从约12％至约80％、从约13％至约80％、从约15％至约80％、从约20％至约80％、从约30％至约80％、从约40％至约80％、从约50％至约80％、从约20％至约70％或从约30％至约60％；和/或
(b)约10％、约12％、约13％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中：
(a)将约1pM至约10mM的所述HDR模板递送到所述未刺激的免疫细胞中；和/或
(b)将约1pM至约10mM的所述基因编辑核酸酶递送到所述未刺激的免疫细胞中；和/或
(c)将约1pM至约10mM的所述指导RNA递送到所述未刺激的免疫细胞中。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中：
(a)所述基因编辑核酸酶与指导RNA的比率为约10:1、约5:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:5或约1:10；和/或
(b)所述HDR模板与在所述基因编辑核酸酶与所述指导RNA之间形成的复合物的比率为约5:1、约2:1、约1:1、约1:2或约1:5；和/或
(c)所述HDR模板与所述基因编辑核酸酶的比率为约5:1、约2:1、1:1、约1:2或约1:5。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述复合物是核糖核酸蛋白(RNP)复合物。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述未刺激的免疫细胞群体：
(a)包含未刺激的T细胞、未刺激的自然杀伤(NK)细胞、未刺激的自然杀伤T(NKT)细胞或其组合；和/或
(b)包含含有CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞或其组合的未刺激的T细胞；和/或
(c)包含CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合的富集的群体。
14.根据权利要求2或13所述的方法，其中所述富集的群体包含约90％、约95％、约99％或约100％的CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在产生所述未刺激的免疫细胞群体之前，将所述生物样品与多个CD4和/或CD8标记的微珠、任选地磁化的微珠一起孵育的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述步骤进一步包括：
(a)将所述生物样品与包含白蛋白、任选地人血清白蛋白(HSA)的溶液一起孵育；和/或
(b)用于富集所述群体中的未刺激的细胞的细胞选择过程；和/或
(c)将所述富集的未刺激的细胞在包含基础培养基、HSA、细胞因子、补充剂或其组合的细胞培养基中孵育。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中将所述经修饰的未刺激的免疫细胞：
(a)在非扩增条件下培养约48小时或更短时间、约36小时或更短时间、约24小时或更短时间、或约18小时或更短时间；和/或
(b)在非扩增条件下培养约18小时、约24小时、约36小时、约48小时或约72小时；和/或
(c)进一步重悬于低温保存溶液中并且低温冷冻。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述转染方法包括：
(a)电穿孔；或
(b)细胞挤压方法。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述抗原结合多肽：
(a)包含抗原结合结构域；
(b)包含嵌合抗原受体(CAR)；
(c)包含细胞表面受体配体；或
(d)包含T细胞受体(TCR)；和/或
(e)与肿瘤抗原结合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中：
(a)所述抗原结合结构域包含全长抗体或其抗原结合片段、Fab、F(ab)2、单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、三抗体、微型抗体、V-NAR或VhH；和/或
(b)所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且任选地其中所述CAR包含铰链区。
21.根据权利要求20所述的方法，其中：
(a)所述跨膜结构域选自人工疏水性序列，I型跨膜蛋白的跨膜结构域，T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，OX40(CD134)，4-1BB(CD137)，ICOS(CD278)，CD154和衍生自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的跨膜结构域；和/或
(b)所述细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域和细胞内信号传导结构域；和/或
(c)所述细胞内结构域包含选自TNFR超家族中的蛋白质CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS(CD278)、NKG2C、B7-H3(CD276)的蛋白质的共刺激结构域和衍生自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞内结构域或其变体中的一个或多个。
22.根据权利要求21所述的方法，其中：
(a)所述共刺激结构域包含4-1BB(CD137)共刺激结构域；和/或
(b)所述细胞内信号传导结构域包含选自以下的细胞内结构域或其变体：人CD3ζ链(CD3ζ)的胞质信号传导结构域、FcγRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、带有胞质受体的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d；和/或
(c)所述细胞内信号传导结构域包含4-1BB共刺激结构域和人CD3ζ链(CD3ζ)胞质信号传导结构域。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述胞质信号传导结构域包含人CD3ζ链(CD3ζ)。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述肿瘤抗原：
(a)与血液恶性肿瘤相关；和/或
(b)选自CD19、CD20、CD22和CD33/IL3Ra；和/或
(c)与实体瘤相关；和/或
(d)选自ROR1、间皮素、c-Met、PSMA、PSCA、叶酸受体α、叶酸受体β、EGFRvIII、GPC2、TnMUC1、GDNF家族受体α-4(GFRa4)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)和IL13Ra2。
25.根据权利要求19所述的方法，其中所述TCR：
(a)包含TCRα链和TCRβ链；和/或
(b)选自野生型TCR、高亲和力TCR和嵌合TCR。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述HDR模板：
(a)进一步包含所述多核苷酸上游的5’同源臂；和/或
(b)进一步包含所述多核苷酸下游的3’同源臂；和/或
(c)是双链DNA模板；和/或
(d)是双链DNA模板，其中所述HDR模板的长度为从约2千碱基对(kb)至约5kb、从约2.3kb至约5kb、从约3kb至约5kb、从约3kb至约4kb、从约2kb至约4kb、从约2.3kb至约4kb、从约2kb至约3kb、从约2.3kb至约3kb或从约4kb至约5kb；和/或
(e)通过电穿孔递送。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述5’同源臂：
(a)与所述多核苷酸相邻；和/或
(b)与所述靶位点的5’端的基因组区同源；和/或
(c)长度为从约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸；和/或
(d)长度为约50、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述3’同源臂：
(a)与所述多核苷酸相邻；和/或
(b)与所述靶位点的3’端的基因组区同源；和/或
(c)长度为从约50个核苷酸至约500个核苷酸、从约50个核苷酸至约400个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约50个核苷酸至约200个核苷酸、从约50个核苷酸至约150个核苷酸、从约100个核苷酸至约500个核苷酸、从约100个核苷酸至约400个核苷酸、从约100个核苷酸至约300个核苷酸、从约100个核苷酸至约200个核苷酸、从约200个核苷酸至约500个核苷酸、从约200个核苷酸至约400个核苷酸、从约200个核苷酸至约300个核苷酸、从约300个核苷酸至约500个核苷酸或从约300个核苷酸至约400个核苷酸；和/或
(d)长度为约50、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述靶位点位于TRAC基因座，以及任选地所述TRAC基因座的外显子1中。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述基因编辑核酸酶包含：
(a)Cas核酸酶；和/或
(b)锌指核酸酶；和/或
(c)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述Cas核酸酶：
(a)是Cas9，任选地SpCas9或SaCas9；和/或
(b)在递送到所述未刺激的免疫细胞中之前与所述指导RNA组装成复合物；和/或
(c)在递送到所述未刺激的免疫细胞中之后与所述指导RNA组装成复合物。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将一种或多种另外的指导RNA递送到所述未刺激的免疫细胞中。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述生物样品：
(a)是血液样品；和/或
(b)是血液样品，其中所述血液样品为全血样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品或单采术样品；和/或
(c)是血液样品，其中所述血液样品是低温保存的单采术样品；和/或
(d)是血液样品，其中所述血液样品是新鲜的单采术样品。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
(a)刺激所述经修饰的未刺激的免疫细胞以产生经修饰的刺激的免疫细胞群体，以及任选地
(b)扩增所述经修饰的刺激的免疫细胞群体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中将所述经修饰的刺激的免疫细胞群体在扩增条件下培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天或更长时间。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞、造血干细胞或其组合。
37.一种通过根据权利要求1-33中任一项所述的方法产生的经修饰的未刺激的免疫细胞群体。
38.一种通过根据权利要求1-36中任一项所述的方法产生的经修饰的刺激的免疫细胞群体。
39.一种组合物，所述组合物包含通过根据权利要求1-33中任一项所述的方法产生的经修饰的未刺激的免疫细胞群体、或通过根据权利要求1-36中任一项所述的方法产生的经修饰的刺激的免疫细胞群体；任选地包含药学上可接受的赋形剂。
40.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述经修饰的未刺激的免疫细胞群体；或向所述受试者施用根据权利要求1-38中任一项所述的经修饰的刺激的免疫细胞群体或根据权利要求39所述的组合物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域对由所述癌症表达的抗原具有特异性。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述生物样品对于所述受试者而言是自体的。
46.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述生物样品对于所述受试者而言是同种异体的。
47.根据权利要求40-46中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
48.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求37所述的经修饰的未刺激的免疫细胞群体或根据权利要求38所述的经修饰的刺激的免疫细胞群体。
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