KR20210125509A - 개선된 면역요법을 위한 유전자-조절 조성물 및 방법 - Google Patents

개선된 면역요법을 위한 유전자-조절 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20210125509A
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존 조
제이슨 머킨
노아 제이콥 투보
2세 제임스 마틴 케버나
솔로몬 마틴 쉔커
케렘 조나단 툰켈
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케이에스큐 세러퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 치료 효능을 증가시키기 위한 Treg의 변형에 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시키도록, 또는 면역 세포의 면역억제 기능을 향상시키기 위해서 내인성 단백질의 하나 이상의 기능을 감소시키도록 변형된 Treg가 제공된다. 일부 실시형태에서, 항원 특이성을 부여하는 트랜스진, 예컨대, 외인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)의 도입에 의해서 추가로 변형된 Treg가 제공된다. 본 명세서에 기재된 상기 Treg를 사용하여 자가면역 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.

Description

개선된 면역요법을 위한 유전자-조절 조성물 및 방법
본 개시내용은 표적 핵산 서열을 편집하거나, 표적 핵산 서열의 발현을 조절하기 위한 방법, 조성물 및 성분, 및 자가면역 질환의 치료에서, 조절 T-세포(선택적으로 수용체 조작된 조절인자 T 세포)와 함께 사용하는 것을 포함하는, 면역요법과 관련하여 이를 응용하는 것에 관한 것이다.
면역계의 부적절하거나 과장된 반응은 자가면역 장애를 비롯한, 영향을 받은 유기체에 다양한 증상을 유발한다. 유전자 변형된 T 세포, 특히 CAR-T 세포를 사용하는 입양 세포 전달(adoptive cell transfer)은 고형 악성종양 및 혈액 악성종양을 위한 치료제로서 임상 시험에 진입하였다. 그리고, 승인된 입양 세포 전달은 암 이외의 장애, 예컨대, 자가면역 장애에서 유용성에 대한 가능성을 갖는다. 그러나, 유전자 변형된 면역 세포의 효능을 제한하는 요소는 (1) 세포 증식, 예를 들어, 입양 전달 후 T 세포의 제한된 증식; (2) 세포 생존, 예를 들어, T 세포 아포토시스의 유도; 및 (3) 세포 기능, 예를 들어, 제조 과정 및/또는 전달 후 면역 세포의 소진 및 저해 인자에 의한 T 세포 기능의 저해를 포함한다. 특히 자가면역 장애의 치료에서 입양 T 세포의 이용에 있어 상당한 성장 여지가 있으며, 자가면역 장애 치료에서 변형된 면역 세포의 입양 전달의 효능을 개선할 필요가 있다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은, TNFRSF4를 포함하는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 조절 T 세포(regulatory T cell: Treg)에 관한 것이며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능은 Treg의 면역억제 기능을 향상시킨다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 변형된 Treg에 관한 것이며, 여기서 TNFRSF4를 포함하는 하나 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능은 유전자-조절 시스템에 의해서 감소되었고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능은 Treg의 면역억제 기능을 향상시킨다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은, PRDM1을 포함하는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 Treg에 관한 것이며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능은 Treg의 면역억제 기능을 향상시킨다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 변형된 Treg에 관한 것이며, 여기서 PRDM1을 포함하는 하나 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능은 유전자-조절 시스템에 의해서 감소되었고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능은 Treg의 면역억제 기능을 향상시킨다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은, TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 Treg에 관한 것이며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능은 Treg의 면역억제 기능을 향상시킨다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은, 변형된 Treg에 관한 것이며, 여기서 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능은 유전자-조절 시스템에 의해서 감소되었고, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능은 Treg의 면역억제 기능을 향상시킨다.
특정 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함한다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA로부터 선택된 핵산 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 효소 단백질을 포함하고, 상기 효소 단백질은 내인성 유전자 중 하나 이상 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하도록 조작되어 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(Transcription activator-like effector nuclease: TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제이다.
실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하고, 상기 핵산 분자는 가이드 RNA(gRNA) 분자이며, 상기 효소 단백질은 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크(break)를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제 돌연변이체이다. 실시형태에서, Cas 단백질은 비활성화된 Cas 단백질(deactivated Cas protein: dCas)이고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합된다. 실시형태에서, 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MAX-interacting protein 1: MXI1), 크루펠-연관 박스(
Figure pct00001
-associated box: KRAB) 도메인, 메틸-CpG 결합 단백질 2(methyl-CpG binding 단백질 2: MECP2) 및 4개의 이어진(concatenated) mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서 유전자-조절 시스템은 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4이고, 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택된다. 실시형태에서, 복수의 표적 유전자 중 하나는 TNFRSF4이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과는 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1이고, 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 복수의 표적 유전자 중 하나는 PRDM1이고, 복수의 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과는 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자 조절 시스템은 복수의 gRNA 분자를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 형질주입, 형질도입, 전기천공 또는 마이크로유체 디바이스(microfluidics device)에 의한 세포막의 물리적 파괴에 의해서 Treg에 도입된다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 시스템의 1종 이상의 성분, 단백질 또는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 도입된다.
특정 실시형태에서, 면역억제 기능은 Treg 증식, Treg 생존력, Treg 안정성, 면역억제 사이토카인의 발현 또는 분비 증가(선택적으로 상기 면역억제 사이토카인은 IL-10임), Foxp3 및 Helios의 공발현 증가 및/또는 소진에 대한 저항성으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 세포 표면 상에서 제시되는 조작된 면역 수용체를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 조작된 면역 수용체는 항원-결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
특정 실시형태에서, 조작된 면역 수용체는 조작된 T 세포 수용체(TCR)이다. 실시형태에서, 조작된 면역 수용체는 표적 세포 상에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 비변형된 Treg 내의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능에 비해서 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 Treg에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 내인성 유전자는 TNFRSF4를 포함하고, 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 Treg의 면역억제 기능을 향상시킨다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 비변형된 Treg 내의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능에 비해서 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 Treg에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 내인성 유전자는 PRDM1을 포함하고, 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 Treg의 면역억제 기능을 향상시킨다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 비변형된 Treg 내의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능에 비해서 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 Treg에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 내인성 유전자는 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택되고, 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 Treg의 면역억제 기능을 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 세포 표면 상에서 제시되는 조작된 면역 수용체를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 조작된 면역 수용체는 CAR 또는 조작된 TCR이다. 일 실시형태에서, 조작된 면역 수용체는 표적 세포 상에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합한다.
일 실시형태에서, 변형된 Treg는 TNFRSF4의 감소된 발현을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 변형된 Treg는 TNFRSF4의 감소된 발현 및/또는 기능 및 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 실시형태에서, 변형된 Treg는 TNFRSF4의 감소된 발현 및/또는 기능 및 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일 실시형태에서, 변형된 Treg는 PRDM1의 감소된 발현을 더 포함한다. 실시형태에서, 변형된 Treg는 PRDM1의 감소된 발현 및/또는 기능 및 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 실시형태에서, 변형된 Treg는 PRDM1의 감소된 발현 및/또는 기능 및 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 siRNA 및 shRNA로부터 선택된 핵산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 더 감소시킬 수 있다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 복수의 siRNA 또는 shRNA를 포함하되, 적어도 1종의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 복수의 siRNA 또는 shRNA를 포함하되, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP2로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4이고, 복수의 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과는 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 복수의 siRNA 또는 shRNA를 포함하되, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP2로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1이고, 복수의 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과는 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택된다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 본 명세서에 개시된 변형된 Treg를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 실시형태에서, 조성물은 적어도 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109 또는 1×1010개의 변형된 Treg를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 조성물은 이를 필요로 하는 대상체로부터 유래된 자가유래 Treg를 포함한다. 실시형태에서, 조성물은 공여자 대상체로부터 유래된 동종이계 Treg를 포함한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템에 관한 것이며, 여기서 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함한다. 실시형태에서, 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템에 관한 것이며, 여기서 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템에 관한 것이며, 여기서 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본 명세서에 제공된 것을 포함하는 임의의 Cas 단백질이 사용될 수 있다. 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크(break)를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질이다. 특정 실시형태에서, Cas 단백질은 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제 돌연변이체이다. 일부 실시형태에서, 상기 Cas 단백질은 비활성화된 Cas 단백질(deactivated Cas protein: dCas)이고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합된다.
실시형태에서, 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MXI1), 크루펠-연관 박스(KRAB) 도메인 및 4개의 이어진 mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, 시스템은 핵산 분자를 포함하고, 상기 핵산 분자는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA이다.
일부 실시형태에서, 시스템은 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함하고, 아연 핑거 뉴클레아제 및 전사-활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(transcription-activator-like effector nuclease: TALEN)로부터 선택된다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 본 명세서에 개시된 유전자-조절 시스템을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 내인성 표적 유전자 내의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인 핵산 서열을 포함하는 gRNA 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4이다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 내인성 표적 유전자 내의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인 핵산 서열을 포함하는 gRNA 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 내인성 표적 유전자는 PRDM1이다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 내인성 표적 유전자 내의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인 핵산 서열을 포함하는 gRNA 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 내인성 표적 유전자는 REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP2로부터 선택된다.
실시형태에서, 표적 서열은 PAM 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, gRNA는 모듈식(modular) gRNA 분자이다. 실시형태에서, gRNA는 이중 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 길이이다. 실시형태에서, gRNA 분자는 이의 5' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 이의 5' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형 및/또는 이의 3' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 이의 3' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 T 세포 내에 도입될 때 뉴클레아제에 대한 증가된 안정성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 T 세포 내에 도입될 때 감소된 선천 면역 반응을 나타낸다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 본 명세서에 개시된 gRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 본 명세서에 개시된 복수의 gRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 관한 것이다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 본 명세서에 개시된 1종 이상의 gRNA 분자 또는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 본 명세서에 개시된 gRNA 분자 또는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 변형된 Treg의 생산 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계로서, 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함하는, 상기 도입하는 단계; 및 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 Treg에 비해서 감소되도록 상기 Treg를 배양하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 변형된 Treg의 생산 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계로서, 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 및 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 Treg에 비해서 감소되도록 상기 Treg를 배양하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 변형된 Treg의 생산 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함한다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 변형된 Treg의 생산 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함한다.
실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 본 명세서에 개시된 임의의 시스템이다. 실시형태에서, 방법은 CAR 및 TCR로부터 선택된 조작된 면역 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템 및/또는 상기 조작된 면역 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 형질주입, 형질도입, 전기천공, 또는 마이크로유체 디바이스에 의한 세포막의 물리적 파괴에 의해서 Treg에 도입된다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 단백질로서 또는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 도입된다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 변형된 Treg의 생산 방법에 관한 것이며, 이 방법은, Treg의 집단을 얻는 단계; Treg의 집단을 확장시키는 단계; 및 유전자-조절 시스템을 Treg의 집단에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4를 포함하는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 상기 확장 이전에 Treg의 집단에 도입된다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 상기 확장 이후에 Treg의 집단에 도입된다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 변형된 Treg의 생산 방법에 관한 것이며, 이 방법은, Treg의 집단을 얻는 단계; Treg의 집단을 확장시키는 단계; 및 유전자-조절 시스템을 Treg의 집단에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 PRDM1을 포함하는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 상기 확장 이전에 Treg의 집단에 도입된다. 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 상기 확장 이후에 Treg의 집단에 도입된다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 개시된 Treg 또는 본 명세서에 개시된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 질환 또는 장애는 자가면역 장애이다. 실시형태에서, 자가면역 장애는 자가면역 간염, 염증성 잘 질환(IBD), 크론병, 대장염, 궤양성 대장염, 1형 당뇨병, 원형 탈모증, 혈관염, 측두성 관절염, 루푸스, 셀리악병(celiac disease), 쇼그렌 증후군(Sjogrens syndrome), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatica), 다발성 경화증, 관절염, 류마티스성 관절염, 이식편대숙주병(graft versus host disease: GVHD) 또는 건선이다. 특정 실시형태에서, 자가면역 장애는 염증성 장 질환(IBD), 예를 들어, 크론병 또는 궤양성 대장염이다. 특정 실시형태에서, 자가면역 장애는 전신 홍반성 루푸스이다. 특정 실시형태에서, 자가면역 장애는 실질 기관 이식과 연관된 자가면역 반응, 예를 들어, GVHD이다. 특정 실시형태에서, 변형된 Treg는 대상체에 대해서 자가유래이다. 실시형태에서, 변형된 Treg는 대상체에 대해서 동종이계이다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계로서, 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함하는, 도입하는 단계; 및 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 Treg에 비해서 감소되도록 Treg를 배양하는 단계를 포함하되, 변형된 Treg는 변형되지 않은 Treg에 비해서 하나 이상의 향상된 면역억제 기능을 나타낸다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계로서, 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함하는, 도입하는 단계; 및 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 Treg에 비해서 감소되도록 Treg를 배양하는 단계를 포함하되, 변형된 Treg는 변형되지 않은 Treg에 비해서 하나 이상의 향상된 면역억제 기능을 나타낸다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 면역억제 기능은 Treg 증식, Treg 생존력, Treg 안정성, 면역억제 사이토카인의 발현 또는 분비 증가(선택적으로 상기 면역억제 사이토카인은 IL-10임), Foxp3 및 Helios의 공발현 증가 및/또는 소진에 대한 저항성으로부터 선택된다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함하고, 유전자-조절 시스템의 도입은 Treg의 안정성을 감소시키지 않는다. Treg의 안정성은 예를 들어, Foxp3 TSDR의 메틸화를 측정함으로써 평가될 수 있다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 유전자-조절 시스템을 Treg에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함하고, 유전자-조절 시스템의 도입은 Treg의 안정성을 증가시킨다. Treg의 안정성은 예를 들어, Foxp3 TSDR의 메틸화를 측정함으로써 평가될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 유전자-조절 시스템의 도입은 Foxp3 TSDR의 탈메틸화의 백분율을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20% 또는 적어도 25%만큼 증가시킬 수 있다. 유전자-조절 시스템의 도입은 Foxp3 TSDR의 탈메틸화의 백분율을 10 내지 50% 10 내지 30%, 15 내지 50%, 15 내지 30%, 20 내지 50%, 20 내지 30%, 25 내지 50% 또는 25 내지 30%만큼 증가시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 개시된 Treg 또는 본 명세서에 개시된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 자가면역 질환은 자가면역 간염, 염증성 잘 질환(IBD), 크론병, 대장염, 궤양성 대장염, 1형 당뇨병, 원형 탈모증, 혈관염, 측두성 관절염, 루푸스, 셀리악병, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 경화증, 관절염, 류마티스성 관절염, 이식편대숙주병(GVHD) 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 자가면역 장애는 염증성 장 질환(IBD), 예를 들어, 크론병 또는 궤양성 대장염이다. 특정 실시형태에서, 자가면역 장애는 전신 홍반성 루푸스이다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 일 양상은 치료를 필요로 하는 대상체에서 실질 기관 이식와 연관된 자가면역 반응, GVHD를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 개시된 Treg 또는 본 명세서에 개시된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 변형된 Treg는 조직-상주 Treg이다. 일부 양상에서, Treg는 조직-상주 Treg이다.
도 1은 시험관내 CRISPR/Cas9 기능성 게놈 스크리닝을 통해서 식별된 Treg-선택성 표적을 요약한 도면.
도 2A 및 도 2B는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 인간 Treg 세포에서 Foxp3 및 CD45 유전자의 편집을 도시한 도면.
도 3A 및 도 3B는 시험관내 배양 시스템에서 PRDM1- 및 TNFRSF-편집된 Treg 세포의 개선된 증식 능력을 입증한 도면.
도 4A 및 도 4B는 시험관내 배양 시스템에서 PRDM1-편집된 Treg 세포에서 Foxp3+Helios+ 세포의 비율 증가를 입증한 도면.
도 5는 Treg 안정성의 척도인 Foxp3 Treg-특이적 탈메틸화 영역(TSDR) 탈메틸화가 TNFRSF4-편집된 Treg 세포에서 유지되고, PRDM1-편집된 T reg 세포에서 증가됨을 입증한 도면.
도 6A 및 도 6B는 시험관내 배양 시스템에서 PRDM1- 및 TNFRSF-편집된 Treg 세포에서 면역억제 사이토카인 인터류킨-10의 생산 증가를 입증한 도면.
도 7A 및 도 7B는 PRDM1-편집된 Treg 세포가 면역 조건 하에서 유지됨을 입증한 도면.
도 8는 PRDM1- 및 TNFRSF4-편집된 Treg의 억제 능력이 대조군-편집된 Treg와 대등한 것을 입증한 도면.
도 9A는 PRDM1- 및 TNFRSF4-편집된 Treg로의 마우스의 치료가 GvHD 모델에서 대조군-편집된 Treg로 치료된 마우스보다 향상된 생존을 나타냄을 입증한 도면.
도 9B는 Treg 치료의 결과로서 CD8+ 효과기 T 세포의 감소된 증식 능력을 입증한 도면.
본 개시내용은 자가면역 질환을 위한 면역요법의 맥락에서 치료 효능을 증가시키기 위한 T 조절 세포(Treg)의 변형에 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, Treg는 면역 세포의 하나 이상의 면역억제 기능이 향상되도록 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시키도록, 또는 내인성 단백질의 하나 이상의 기능을 감소시키도록 본 발명의 방법에 의해서 변형된다. 일부 실시형태에서, Treg는 항원 특이성을 부여하는 트랜스진의 도입, 예컨대, T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 작제물의 도입에 의해서 추가로 변형된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 Treg를 변형시키기 위한 조성물 및 방법, 예컨대, 유전자-조절 시스템의 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 자가면역 장애의 치료 방법을 제공하며 이 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기재된 변형된 Treg를 투여하는 단계를 포함한다.
I. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 그 문맥이 달리 명백하게 제시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는"은 달리 제시되지 않는 한 "및" 또는 "또는"을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서 전체에서, 그 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다", 또는 변형, 예컨대, "포함한다" 또는 "포함하는"은, 언급된 요소 또는 정수 또는 요소의 군 또는 정수들의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소의 군 또는 정수들을 제외하지 않는다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 동의어로서 사용된다. 약/및 대략과 함께 또는 이러한 용어 없이 본 출원에서 사용되는 임의의 수치는 당업자에 의해서 인식되는 임의의 일반적인 변동을 포함하는 의미이다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 제시되지 않는 한 또는 그 문맥으로부터 명백하지 않는 한 언급된 참조값의 양 방향의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만(더 크거나 또는 더 작음)에 포함되는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수가 가능한 값의 100% 를 초과할 경우 제외).
"감소시킨다" 또는 "저감시킨다"는 참조값과 비교할 때 특정값에서의 적어도 5%, 예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 감소 또는 저감을 지칭한다. 특정값의 감소 또는 저감은 또한 참조값과 비교하여 값의 배수 변화로서, 예를 들어, 참조값과 비교할 때 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 또는 그 초과의 감소로서 표현될 수 있다.
"증가시킨다"는 참조값과 비교할 때 특정값에서의 적어도 5%, 예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 초과의 증가를 지칭한다. 특정값의 증가는 또한 참조값과 비교하여 값의 배수 변화로서, 예를 들어, 참조값과 비교할 때 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 또는 그 초과의 증가로서 표현될 수 있다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭하는데, 이것은 암호화된 및 비암호화된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산 및 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어에는 단일-, 이중-, 또는 복수 가닥 DNA 또는 RNA, 유전체 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린과 피리미딘 염기 또는 다른 천연의, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 단일- 또는 이중-가닥 DNA의 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 그러나, 본 개시내용의 목적을 위해서, 올리고뉴클레오타이드의 길이에 대한 상한은 존재하지 않는다. 올리고뉴클레오타이드는 "올리고머" 또는 "올리고"라고도 공지되며, 유전자로부터 또는 당업계에 공지된 방법에 의해서 화학적으로 합성될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 기재될 실시형태에 적용 가능한 경우, 단일-가닥(예컨대, 센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"단편"은 전체 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열보다 작은 것을 함유하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 분자의 일부를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 단편은 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 단편은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
용어 "서열 동일성"은 동일한 그리고 동일한 상대적인 위치의 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 간의 염기 또는 아미노산의 백분율을 지칭한다. 따라서 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 또 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 비교하여 서열 동일성의 특정 백분율을 갖는다. 서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열이, 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 기능한다. 용어 "참조 서열"은 시험 서열이 비교되는 분자를 지칭한다.
"상보적"은 염기 적층 및 특이적 수소 결합을 통해서 자연 또는 비자연 발생 염기 또는 이의 유사체를 포함하는 2개의 서열 간의 짝지움에 대한 능력을 지칭한다. 예를 들어, 핵산의 하나의 위치에서의 염기가 표적의 상응하는 위치에서의 염기와 수소 결합할 수 있으면, 그 염기는 그 위치에서 서로에 상보적이라고 간주된다. 핵산은 수소 결합에 대한 긍정적인 기여도 제공하지 않고 부정적인 기여도 제공하지 않는 범용(universal) 염기, 또는 불활성 무염기(abasic) 스페이서를 포함할 수 있다. 염기 짝지움은 정규 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 짝지움 및 비-왓슨-크릭 염기 짝지움(예를 들어, 워블(Wobble) 염기 짝지움 및 후그스틴(Hoogsteen) 염기 짝지움)을 포함할 수 있다. 상보적 염기 짝지움의 경우, 아데노신-유형 염기(A)가 티미딘-유형 염기(T) 또는 우라실-유형 염기(U)에 상보적이고, 사이토신-유형 염기(C)가 구아노신-유형 염기(G)에 상보적이라고 이해되며, 범용 염기, 예컨대, 3-나이트로피롤 또는 5-나이트로인돌이 임의의 A, C, U 또는 T에 혼성화할 수 있고, 상보적이라고 고려된다(Nichols et al., Nature, 1994;369:492-493 및 Loakes et al., Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-4043). 이노신(I)은 또한 당업계에서 범용 염기인 것으로 간주되었고, 임의의 A, C, U 또는 T에 상보적이라고 간주된다(문헌[Watkins and SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33 (19): 6258-6267] 참고).
본 명세서에서 지칭되는 바와 같이, "상보적 핵산 서열"은 적절한 시험관내 및/또는 생체내 온도 조건 및 용액 이온 강도 하에서 서열-특이적인 역평행 방식으로 또 다른 핵산에 비-공유적으로 결합할 수 있게 하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 핵산 서열(즉, 핵산은 상보성 핵산에 특이적으로 결합함)이다.
서열 동일성 백분율 및 상보성 백분율의 비교 및 결정을 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어, 문헌[Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해서, 문헌[Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 탐색에 의해서, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재))의 컴퓨터 구현에 의해서, 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, 문헌[Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology])에 의해서, 각각 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 비롯한 당업계에 공지된 알고리즘의 사용에 의해서 수행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해서 공개적으로 입수 가능하다.
본 명세서에서, 용어 "혼성화하다"는 상보적 뉴클레오타이드 염기들 간에 짝을 지워서(예를 들어, 아데닌(A)은 DNA 분자에서는 티민(T)과, RNA 분자에서는 우라실(U)과 염기쌍을 형성하고, 구아닌(G)은 DNA 및 RNA 분자 둘 다에서 사이토신(C)과 염기상을 형성함) 이중-가닥 핵산 분자를 형성하는 것을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Wahl and Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참고). 또한, 2개의 RNA 분자(예를 들어, dsRNA) 간의 혼성화를 위해서, 구아닌(G) 염기가 우라실(U)과 짝지워지는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, G/U 염기 짝지움은 부분적으로 mRNA 내의 코돈과 tRNA 항-코돈 염기 짝지움의 관점에서 유전자 암호의 축퇴(즉, 과잉)의 원인이다. 본 개시내용의 맥락에서, 가이드 RNA 분자의 단백질-결합 분절(dsRNA 듀플렉스)의 구아닌(G)은 우라실(U)에 상보적인 것으로 간주되고, 그 반대로 마찬가지이다. 이와 같이, G/U 염기-쌍이 주어진 뉴클레오타이드 위치에서 가이드 RNA 분자의 단백질 결합 분절(dsRNA 듀플렉스)를 제조할 수 있는 경우, 그 위치는 비상보적인 것으로 간주되지 않고, 대신 상보적인 것으로 간주된다. 폴리뉴클레오타이드의 서열은 특이적으로 혼성화 가능한 표적 핵산의 서열에 100% 상보적일 필요는 없다고 이해된다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 분절 상에 혼성화되어 개재 또는 인접한 분절이 혼성화 사건(예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조)에 연관되지 않도록 할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 표적화되는 표적 핵산 서열 내의 표적 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 서열 상보성을 포함할 수 있다.
용어 "변형된"은 상응하는 비변형된 물질 또는 화합물과 비교할 때 변경되거나 변화된 물질 또는 화합물(예를 들어, 세포, 폴리뉴클레오타이드 서열, 및/또는 폴리펩타이드 서열)을 지칭한다.
핵산, 폴리펩타이드, 세포 또는 유기체에 적용될 때 본 명세서에 사용된 용어 "자연 발생"은 자연에서 발견되는 핵산, 폴리펩타이드, 세포 또는 유기체를 지칭한다. 예를 들면, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연 발생적이다.
"단리된"은 네이티브 상태로 발견될 때 일반적으로 동반되는 성분으로부터 존재하지 않거나 다양한 정도로 존재하는 물질을 지칭한다.
"발현 카세트" 또는 "발현 작제물"은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "작동 가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 성분이 의도된 방식으로 기능하는 것을 허용하는 관계로 존재한다는 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는, 프로모터가 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치면 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
용어 "재조합 벡터"는 벡터에 삽입된 또 다른 폴리뉴클레오타이드를 전달 또는 수송할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 분자를 지칭한다. 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 발현 카세트일 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드)일 수 있다.
용어 "샘플"은 분석 및/또는 유전자 변형에 적용되는 생물학적 조성물(예를 들어, 세포 또는 조직의 일부)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 대상체로부터 직접 획득된다는 점에서 "일차 샘플"이고; 일부 실시형태에서, "샘플"은 예를 들어, 특정 성분을 제거하고/하거나 특정 관심대상 성분을 단리 또는 정제시키기 위한 일차 샘플의 처리 결과이다.
용어 "대상체"는 동물, 예컨대, 예를 들어, 포유동물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 영장류이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가축, 예컨대, 소, 양, 염소, 소, 돼지 등; 또는 개와 고양이와 같은 길들여진 동물이다. 일부 실시형태에서 (예를 들어, 특히 연구 맥락에서) 대상체는 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류 또는 돼지, 예컨대, 근친 돼지 등이다. 용어 "대상체"및 "환자"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
"투여"는 본 명세서에서 작용제 또는 조성물을 대상체에게 도입하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "치료하는"은 생리학적 결과에 영향을 주기 위해 작용제 또는 조성물을 대상체에게 전달하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "유효량"은 특정 생리학적 효과를 초래하는데 필요한 최소량의 작용제 또는 조성물을 지칭한다. 특정 작용제의 유효량은 작용제의 본성, 예를 들어, 질량/부피, 세포/부피 수, 입자/부피, (작용제의 질량)(대상체의 질량), 세포 수/(대상체 질량) 또는 입자/(대상체의 질량)으로 표현될 수 있다. 특정 작용제의 유효량은 또한 절반-최대 유효 농도(half-maximal effective concentration)(EC50)로 표현될 수 있으며, 이는 참조 수준과 최대 반응 수준 사이의 절반인 특정 생리학적 반응의 크기를 초래하는 작용제의 농도를 지칭한다.
세포의 "집단"은 1개를 초과하지만, 바람직하게는 적어도 1×103개 세포, 적어도 1×104개 세포, 적어도 1×105개 세포, 적어도 1×106개 세포, 적어도 1×107개 세포, 적어도 1×108개 세포, 적어도 1×109개 세포, 적어도 1×1010개 세포 또는 그 초과의 세포의 임의의 수의 세포를 지칭한다. 세포의 집단은 시험관내 집단(예를 들어, 배양물 중의 세포의 집단) 또는 생체내 집단(예를 들어, 특정 조직에 존재하는 세포의 집단)을 지칭할 수 있다.
분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]와 같은 표준 교과서에서 찾아볼 수 있고, 이들의 본 개시내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
II. 변형된 조절 T 세포
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 T 조절 세포(Treg)를 제공한다. 본 명세서에서, 용어 "변형된 Treg"는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래하는 하나 이상의 변형을 포함하는 Treg뿐만 아니라 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 Treg를 포함한다. 본 명세서에서, "비변형된 Treg" 또는 "대조군 Treg"는, 게놈이 변형되지 않았고, 유전자-조절 시스템을 포함하지 않거나 대조군 유전자-조절 시스템(예를 들어, 빈 벡터 대조군, 비-표적화 gRNA, 스크램블드(scrambled) siRNA 등)을 포함하는 세포 또는 세포의 집단을 지칭한다. 일부 실시형태에서, Treg 또는 변형된 Treg는 조직-상주 Treg일 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 동물 세포이거나 또는 무척추 동물 및 척추 동물(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유동물)을 비롯한 동물 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 포유동물 세포이거나 또는 포유동물세포(예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류 비-인간 영장류, 인간 등)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 설치류 세포이거나 또는 설치류 세포(예를 들어, 래트 또는 마우스)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 인간 세포이거나 또는 인간 세포로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 내인성 표적 유전자의 게놈 DNA 서열 내에 하나 이상의 변형(예를 들어, 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 돌연변이)을 포함하여 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 Treg는 "변형된 내인성 표적 유전자"를 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA 서열에서의 변형은 mRNA 전사를 감소 또는 저해하여, 암호화된 mRNA 전사체 및 단백질의 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA 서열에서의 변형은 mRNA 번역을 감소 또는 저해하여, 암호화된 단백질의 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA 서열에서의 변형은 내인성 단백질의 비변형된(즉, 야생형) 버전(예를 들어, 하기에 기재된 음성-우세(dominant-negative) 돌연변이체)에 비해서 감소된 또는 변경된 기능을 갖는 변형된 내인성 단백질을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래하거나 또는 내인성 단백질의 변형된 버전의 발현을 초래하는 내인성 표적 유전자 이외의 게놈 위치에 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 게놈 내의 하나 이상의 위치에 삽입되어, 유전자-조절 시스템의 발현 시 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 내인성 단백질의 변형된 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 게놈의 하나 이상의 위치에 삽입되며, 여기서 단백질의 변형된 버전의 기능은 단백질의 비변형된 또는 야생형 버전(예를 들어, 하기에 기재된 음성-우세 돌연변이체)에 비해서 감소된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 하나 이상의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함하며, 여기서 하나 이상의 변형은 비변형된 Treg에 비해서 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물(즉, mRNA 전사체 또는 단백질)의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 단백질의 mRNA 전사체 및/또는 감소된 발현의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg 내의 유전자 생성물의 발현은 비변형된 Treg 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 적어도 5% 감소된다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg 내의 유전자 생성물의 발현은 비변형된 Treg 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 비변형된 Treg 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 복수(예를 들어, 2개 이상)의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 감소된 발현 및/또는 기능을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 비변형된 Treg 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자로부터의 유전자 생성물의 감소된 발현 및/또는 기능을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 Treg를 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자, 또는 이의 일부는 변형된 Treg가 mRNA 전사체 또는 단백질을 발현하지 않도록 삭제된다(즉, "넉아웃된다"). 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 복수의 내인성 표적 유전자 또는 이의 부분의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 하나 이상의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함하며, 여기서 표적 DNA 서열 내의 하나 이상의 변형은 비변형된 Treg에서 발현되는 상응하는 단백질(예를 들어, "비변형된 내인성 단백질")의 기능에 비해서 감소된 또는 변경된 기능을 갖는 단백질(예를 들어, "변형된 내인성 단백질")의 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 변형된 내인성 단백질을 암호화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 내인성 단백질은, 변형된 Treg에 의해서 발현되거나 또는 또 다른 세포에 의해서 발현되는 또 다른 단백질에 대해서 감소된 또는 변경된 결합 친화도를 나타내거나; 감소된 또는 변경된 신호전달 능력을 나타내거나; 감소된 또는 변경된 효소 활성도를 나타내거나; 감소된 또는 변경된 DNA-결합 활성도를 나타내거나; 또는 스캐폴드 단백질로서 기능하는 감소된 또는 변경된 능력을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 변형된 내인성 표적 유전자는 하나 이상의 음성 우세 돌연변이(dominant negative mutation)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "음성-우세 돌연변이"는 암호화된 단백질이 비변형된 표적 유전자에 의해서 암호화된 단백질에 길항적으로 작용하도록 하는 표적 유전자의 1종 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는, 음성 표현형이 상응하는 비변형된 유전자의 양성 표현형보다 유전자 우세하기 때문에 음성-우세이다. 하나 이상의 음성-우세 돌연변이를 포함하는 유전자 및 이에 의해서 암호화된 단백질은 "음성-우세 돌연변이체", 예를 들어, 음성-우세 유전자 및 음성-우세 단백질로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, 음성 우세 돌연변이체 단백질은 Treg의 게놈 내의 하나 이상의 위치에 삽입된 외인성 트랜스진에 의해서 암호화된다.
음성 우세에 대한 다양한 기전이 공지되어 있다. 전형적으로, 음성 우세 돌연변이체의 유전자 생성물은 비변형된 유전자 생성물의 일부 기능을 보유하지만, 비변형된 유전자 생성물의 하나 이상의 중요한 다른 기능이 결핍되어 있다. 이는 음성-우세 돌연변이체가 비변형된 유전자 생성물을 길항작용하도록 한다. 예를 들어, 예시적인 실시형태로서, 전사 인자의 음성-우세 돌연변이체는 기능성 활성화 도메인이 결핍될 수 있지만 기능성 DNA 결합 도메인을 유지할 수 있다. 이러한 예에서, 음성-우세 전사 인자는 비변형된 전사 인자로서 DNA의 전사를 활성화시킬 수 없지만, 음성-우세 전사 인자는 비변형된 전사 인자가 전사 인자 결합 부위에 결합하는 것을 예방함으로써 유전자 발현을 간접적으로 저해할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태로서, 이량체로서 기능하는 단백질의 음성-우세 돌연변이가 공지되어 있다. 이러한 이량체 단백질의 음성-우세 돌연변이체는 비변형된 단백질과 이량체화하는 능력을 보유할 수 있지만, 달리 기능할 수 없다. 음성-우세 단량체는, 비변형된 단량체와 이량체화하여 이종이량체를 형성함으로써, 비변형된 단량체의 기능성 동종이량체의 형성을 방지한다.
일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함한다. 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 유전자의 게놈 DNA 서열을 변형시킴으로써(예를 들어, 게놈 DNA 서열 내의 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 돌연변이에 의해서); 내인성 표적 유전자의 전사를 조절(예를 들어, mRNA 전사의 저해 또는 억제)함으로써; 그리고/또는 내인성 표적 유전자의 번역(예를 들어, mRNA 분해에 의해서)을 조절함으로써 다양한 기전에 의해서 내인성 표적 유전자 변형의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 유전자-조절 시스템(예를 들어, 핵산-기반 유전자-조절 시스템, 단백질-기반 유전자-조절 시스템 또는 조합 단백질/핵산-기반 유전자-조절 시스템)을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 Treg에 포함된 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자를 변경시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 하기를 포함하는 유전자-조절 시스템을 포함한다:
(a) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 핵산 분자;
(b) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 핵산 분자를 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
(c) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 단백질;
(d) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
(e) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 RNA(gRNA);
(f) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(g) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(h) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(i) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 DNA(gDNA);
(j) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 하나 이상의 gDNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(k) gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(l) gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(m) 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA;
(n) 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(o) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(p) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(q) 이들의 임의의 조합물.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드가 Treg의 게놈 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드는 에피솜에 의해서(episomally) 발현되고, Treg의 게놈에 삽입되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, 1종 이상의 게놈 유전자좌에 삽입된 하나 이상의 외인성 트랜스진을 추가로 포함한다(예를 들어, 유전자 "넉인"). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 트랜스진은 검출 가능한 표지, 안정성-스위치 시스템, 키메라 스위치 수용체 및/또는 조작된 항원-특이적 수용체를 암호화한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 검출 가능한 태그를 암호화하는 외인성 트랜스진을 추가로 포함한다. 검출 가능한 태그는 FLAG 태그, 폴리-히스티딘 태그(예를 들어, 6xHis), SNAP 태그, Halo 태그, cMyc 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그, 아비딘, 효소, 형광 단백질, 발광 단백질, 화학발광 단백질, 생물발광 단백질 및 인광 단백질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서 형광 단백질은 청색/UV 단백질(예컨대, BFP, TagBFP, mTagBFP2, Azurite, EBFP2, mKalama1, Sirius, 사파이어 및 T-사파이어); 시안 단백질(예컨대, CFP, eCFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, 단량체 Midoriishi-Cyan, TagCFP 및 mTFP1); 녹색 단백질(예컨대: GFP, eGFP, meGFP(A208K 돌연변이), Emerald, Superfolder GFP, Monomeric Azami Green, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover 및 mNeonGreen); 황색 단백질(예컨대, YFP, eYFP, Citrine, Venus, SYFP2, 및 TagYFP); 주황색 단백질(예컨대, Monomeric Kusabira-Orange, mKOκ, mKO2, mOrange 및 mOrange2); 적색 단백질(예컨대, RFP, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby 및 mRuby2); 원적(far-red) 단백질(예컨대, mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune 및 NirFP); 근적(near-infrared) 단백질(예컨대, TagRFP657, IFP1.4 및 iRFP); 긴 스트로크 이동 단백질(long stokes shift protein)(예컨대, mKeima Red, LSS-mKate1, LSS-mKate2 및 mBeRFP); 광활성화 가능한(photoactivatible) 단백질(예컨대, PA-GFP, PAmCherry1 및 PATagRFP); 광전환 가능한(photoconvertible) 단백질(예컨대, Kaede(녹색), Kaede(적색), KikGR1(녹색), KikGR1(적색), PS-CFP2, PS-CFP2, mEos2(녹색), mEos2(적색), mEos3.2(녹색), mEos3.2(적색), PSmOrange 및 PSmOrange); 및 광스위치 가능한(photoswitchable) 단백질(예컨대, Dronpa)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 태그는 AmCyan, AsRed, DsRed2, DsRed Express, E2-Crimson, HcRed, ZsGreen, ZsYellow, mCherry, mStrawberry, mOrange, mBanana, mPlum, mRasberry, tdTomato, DsRed Monomer 및/또는 AcGFP로부터 선택될 수 있고, 이들 모두는 클론테크사(Clontech)로부터 입수 가능하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 안전성-스위치 시스템을 암호화하는 외인성 트랜스진을 추가로 포함한다. 안전성-스위치 시스템(당업계에서 자살 유전자 시스템이라고 지칭됨)은 세포가 대상체에 투여된 후 변형된 Treg의 제거를 가능하게 하는 1종 이상의 단백질을 암호화하는 외인성 트랜스진을 포함한다. 안전성-스위치 시스템의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 안전성-스위치 시스템은 비독성 전구약물을 독성 화합물로 전환시키는 단백질, 예컨대, 단순 포진 티미딘 키나제(Hsv-tk) 및 간시클로비어(GCV) 시스템을 암호화하는 유전자(Hsv-tk/GCV)를 포함한다. Hsv-tk는 비독성 GCV를 세포독성 화합물로 전환시키는데, 이것은 세포 아포토시스를 일으킨다. 이와 같이, GCV를, Hsv-tk 단백질을 암호화하는 트랜스진을 포함하는 변형된 Treg로 치료된 대상체에 투여하는 것은 내인성 Treg를 절약하게 하면서 변형된 Treg를 선택적으로 제거할 수 있다(예를 들어, 문헌[Bonini et al., Science, 1997, 276(5319):1719-1724; Ciceri et al., Blood, 2007, 109(11):1828-1836; Bondanza et al., Blood 2006, 107(5):1828-1836] 참고).
추가의 안전성-스위치 시스템은 ADCC를 통해서 세포-표면 마커에 특이적인 단클론성 항체의 투여에 의해서 변형된 Treg의 제거를 가능하게 하는 세포-표면 마커를 암호화하는 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 마커는 CD20이고, 변형된 Treg는 항-CD20 단클론성 항체, 예컨대, 리툭시맙의 투여에 의해서 제거될 수 있다(예를 들어, 문헌[Introna et al., Hum Gene Ther, 2000, 11(4):611-620; Serafini et al., Hum Gene Ther, 2004, 14, 63-76; van Meerten et al., Gene Ther, 2006, 13, 789-797] 참고). EGF-R 및 세툭시맙 또는 페니투무맙을 사용한 유사한 시스템은 PCT 공개 제WO 2018006880호에 기재되어 있다. 추가적인 안전성-스위치 시스템은 이량체화의 화학 유도기(chemical inducer of dimerization: CID)에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 프로-아포토시스(pro-apoptotic) 분자를 암호화하는 트랜스진을 포함하는데, 이것은 프로-아포토시스 분자의 올리고머화 및 아포토시스 경로의 활성화를 유도하는 CID의 투여에 의해서 변형된 Treg의 제거를 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 프로-아포토시스 분자는 Fas(CD95라고도 공지됨)이다(Thomis et al., Blood, 2001, 97(5), 1249-1257). 일부 실시형태에서, 프로-아포토시스 분자는 카파제-9이다(Straathof et al., Blood, 2005, 105(11), 4247-4254).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 키메라 스위치 수용체를 암호화하는 외인성 트랜스진을 추가로 포함한다. 키메라 스위치 수용체는 내인성 세포-표면 수용체로부터의 세포외 도메인 및 이종 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 조작된 세포-표면 수용체여서, 세포외 도메인에 의한 리간드 인식은 세포-표면 수용체의 야생형 형태에 의해서 활성화되는 것보다 상이한 신호전달 캐스케이드 활성화를 초래한다. 일부 실시형태에서, 키메라 스위치 수용체는 저해성 세포-표면 수용체에 의해서 일반적으로 전달되는 저해성 신호가 아닌 활성화 신호의 전달로 이어지는 세포내 도메인에 융합된 저해성 세포-표면 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, Treg 활성화를 저해한다고 공지된 세포-표면 수용체로부터 유래된 세포외 도메인은 활성화 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 이어서, 상응하는 리간드의 맞물림이 면역 효과기 세포의 활성화를 저해하기 보다는 증가시키는 신호전달 캐스케이드를 활성화시킬 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 본 명세서에서 "변형된 수용체-조작된 세포" 또는 "변형된 RE-세포"로서 지칭되는, 표적 세포에 의해서 발현되는 단백질 표적을 인식하는 조작된 항원-특이적 수용체를 추가로 포함한다. 용어 "조작된 항원 수용체"는 비자연 발생 항원-특이적 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 힌지 및 막관통 도메인을 통해서 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인에 융합된 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 실시형태에서, CAR 세포외 도메인은 MHC-독립적인 방식으로 표적 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하고, 이것은 RE 세포의 활성화 및 증식으로 이어진다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 융합된 태그를 인식한다. 이러한 실시형태에서, CAR의 항원-특이성은 표지된 항체의 항원-특이성에 좌우되어, 또 다른 항체를 하나의 항체로 대체함으로써 단일 CAR 작제물을 사용하여 다수의 상이한 항원을 표적화할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제9,233,125호 및 제9,624,279호; 미국 특허 출원 공개 제20150238631호 및 제20180104354호 참고). 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 유용한 항원 결합 도메인은 예를 들어, scFv; 항체; 항체의 항원 결합 영역; 중쇄/경쇄의 가변 영역; 및 단일 쇄 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 TCR 복합체 제타 쇄(예컨대, CD3ζ 신호전달 도메인), FcγRIII, FcεRI 또는 T-림프구 활성화 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공자극성 도메인, 예를 들어, 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공자극성 도메인, 예를 들어, 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인 중 임의의 2개를 추가로 포함한다. 예시적인 CAR 구조 및 세포내 신호전달 도메인은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2009/091826호; 미국 특허 제20130287748호; 국제 공개 제WO2015/142675호; 국제 공개 제WO 2014/055657호; 및 국제 공개 제WO 2015/090229호 참고).
자가면역질환(예를 들어, GVHD, 대장염 및 다발성 경화증)과 관련된 항원에 특이적인 CAR은 예를 들어, 문헌[Zhang et al., Frontiers in Immunology 9:1-8 (2018)]; 국제 공개 제WO2017218850A1호; 및 문헌[McDonald et al., JCI 2016;126(4):1413-1424]에 논의되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 조작된 TCR이다. 조작된 TCR은 특정 표적 항원을 인식하는 T 세포 집단으로부터 단리 및 클로닝된 TCRα 및/또는 TCRβ 쇄를 포함한다. 예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ 유전자(즉, TRAC 및 TRBC)는 세포 유형으로 면역화된 인간화된 마우스로부터 단리된 특정 질환 또는 T 세포 집단을 갖는 개체로부터 단리된 T 세포 집단으로부터 클로닝될 수 있다. 조작된 TCR은 (예를 들어, 표적 세포의 표면 상에서 발현되는 주 조직적합성 복합체(MHC) 단백질의 맥락에서 제시된 동족 항원의 인식에 의해서) 내인성 반대부분과 동일한 기전을 통해서 항원을 인지한다. 이러한 항원 맞물림은 내인성 신호전달 경로를 자극하여, TCR-조작된 세포의 활성화 및 증식으로 이어진다.
A. 면역억제 기능
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 면역억제 기능의 생성, 유지 및/또는 향상을 포함하는, 하나 이상의 면역억제 기능의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 하기 특징 중 하나 이상을 나타낸다: 증식 증가, 세포 생존력 증가 또는 연장, 안정성 개선, 면역억제 기능 개선 또는 면역억제 면역 인자(예를 들어, 항염증 사이토카인)의 생산 증가.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 세포 증식 증가를 나타낸다. 이들 실시형태에서, 이러한 결과는 주어진 시간 기간 후에 비변형된 Treg에 비해서 존재하는 변형된 Treg의 수를 증가시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 증가된 증식 속도를 나타내고, 여기서 변형된 Treg는 비변형된 Treg보다 더 신속한 속도로 분화된다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 증식 속도에서 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과의 배수 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 연장된 증식 기간을 나타내는데, 여기서 변형된 Treg 및 비변형된 Treg는 유사한 속도로 분화하지만, 변형된 Treg는 더 긴 시간 기간 동안 증식성 상태를 유지한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 비변형된 면역 세포보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 더 긴 시간 동안 증식성 상태를 유지한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 증가된 또는 연장된 세포 생존을 나타낸다. 이러한 실시형태에서, 이러한 결과는 주어진 시간 기간 후에 비변형된 Treg에 비해서 존재하는 변형된 Treg의 수를 증가시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 비변형된 면역 세포보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 더 긴 시간 동안 생존을 유지하고, 지속된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 Treg 소진에 대한 저항성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단으로부터의 사이토카인 생산과 비교하여, 변형된 면역 효과기 세포로부터의 사이토카인 생산에서의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 증가는 T 세포 소모에 대한 증가된 저항성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, T 세포 소진에 대한 저항성은, 대조군 면역 세포 집단으로부터 관찰된 증식과 비교하여, 변형된 면역 효과기 세포의 증가된 증식에 의해서 입증된다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단의 증식과 비교하여, 변형된 면역 효과기 세포의 증식에서의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 증가는 T 세포 소모에 대한 증가된 저항성을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단과 비교된 변형된 Treg의 소진은 시험관내 또는 생체외 제조 과정 동안 측정된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 전염증성 면역 인자의 증가된 발현 또는 생산을 나타낸다. 항염증 또는 면역억제 면역 인자의 예는 항염증 또는 면역억제 사이토카인, 예컨대, IL-10을 포함한다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 안정성 개선을 나타낸다. 실시형태에서, 안정성은 예를 들어, Foxp3 TSDR의 메틸화에 의해서 평가될 수 있다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 면역억제 기능 개선을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg은 IL-17A 및 IFNγ를 포함하는 전염증성 사이토카인에 효과를 갖지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 Foxp3 및/또는 Helios의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 비변형된 Treg에 비해서 Foxp3 및 Helios의 증가된 공발현을 나타낸다.
면역억제 기능을 측정하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 세포-표면 수용체 발현은 유세포 분석법, 면역조직화학, 면역형광, 웨스턴 블롯 및/또는 qPCR에 의해서 결정될 수 있다. 사이토카인 및 케모카인 발현 및 생산은 유세포 분석법, 면역조직화학, 면역형광, 웨스턴 블롯, ELISA, 및/또는 qPCR에 의해서 측정될 수 있다. 세포외자극(예를 들어, 사이토카인, 저해성 리간드 또는 항원)에 대한 반응 또는 민감성은 자극에 반응한 하류 신호전달 경로(예를 들어, 하류 신호전달 중간체의 포스포릴화)의 세포 증식 및/또는 활성화를 검정함으로써 측정될 수 있다.
B. 내인성 경로 및 유전자의 조절
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 또는 기능의 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 면역억제 기능 증가와 관련된 경로에 존재한다. 이러한 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 또는 기능은 면역 세포의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시킨다.
본 명세서에 기재된 방법에 의한 조절에 적합한 예시적인 경로는 예를 들어, Treg 증식, Treg 생존력, Treg 안정성 및/또는 Treg 면역억제 활성 경로를 포함한다. 일부 실시형태에서, 특정 경로에서의 내인성 표적 유전자의 발현은 변형된 Treg에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 특정 경로에서의 복수의(예를 들어, 2개 이상의) 내인성 표적 유전자의 발현은 변형된 Treg에서 감소된다. 예를 들어, 특정 경로에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현이 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나의 경로에서의 내인성 표적 유전자의 발현 및 또 다른 경로에서의 내인성 표적 유전자의 발현은 변형된 Treg에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 하나의 경로에서의 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및 또 다른 경로에서의 복수의 내인성 표적 유전자의 발현은 변형된 Treg에서 감소된다. 예를 들어, 하나의 경로에서의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현이 감소될 수 있고, 또 다른 특정 경로에서의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현이 감소될 수 있다.
일부 실시형태에서, 복수의 경로에서의 복수의 내인성 표적 유전자의 발현이 감소된다. 예를 들어, 복수의 경로(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 경로) 각각으로부터의 하나의 내인성 유전자가 감소될 수 있다. 추가 양상에서, 복수의 경로(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 경로) 각각으로부터의 복수의 내인성 유전자(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 유전자)가 감소될 수 있다.
예시적인 내인성 표적 유전자를 하기 표 1에 제시한다.
일부 실시형태에서, TNFRSF4의 발현이 감소된다. TNFRSF4는 "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 4", "ACT35 항원", "TNFRSF4L 수용체", "CD134", "OX40", 및 "TAX 전사-활성화 당단백질 1 수용체"라고도 공지되어 있다. TNFRSF4는 TNFSF4(OX40L 및 GP34라고도 공지됨)에 대한 수용체이다. 인간 TNFRSF4의 가용성 아이소폼이 또한 보고되어 있다(문헌[Taylor L et al., (2001) J Immunol Methods 255: 67-72]).
일부 실시형태에서, PRDM1의 발현이 감소된다. PRDM1은 "PR 도메인 아연 핑거 단백질1", "BLIMP1", "PRDI-BF1", 및 "베타-인터페론 유전자 양성 조절 도메인 I-결합 인자"라고도 공지되어 있다. PRDM1은 전사 인자이다.
일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 또는 ADNP 중 1종 이상의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 표 1로부터 선택된 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 표 1(예를 들어, TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택된 적어도 2종의 유전자)로부터 선택된 적어도 2종의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP의 발현을 변형시키는 예시적인 방법이 본 명세서에 기재되어 있지만, 이들 내인성 표적 유전자의 발현은 당업계에 공지된 방법에 의해서 또한 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 TNFRSF4의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 PRDM1의 감소된 발현을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 TNFRSF4 및 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP 중 1종 이상의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 표 1로부터 선택된 유전자의 감소된 발현 및 TNFRSF4의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 PRDM1 및 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP 중 1종 이상의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 표 1로부터 선택된 유전자의 감소된 발현 및 PRDM1의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 TNFRSF4의 감소된 발현 및 표 1로부터 선택된 2종의 유전자의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 PRDM1의 감소된 발현 및 표 1로부터 선택된 2종의 유전자의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 표 1로부터 선택된 복수의 유전자의 감소된 발현 및 TNFRSF4의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 표 1로부터 선택된 복수의 유전자의 감소된 발현 및 PRDM1의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 표 1로부터 선택된 2종의 유전자의 감소된 발현 및 TNFRSF4의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 표 1로부터 선택된 2종의 유전자의 감소된 발현 및 PRDM1의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP 중 3종 이상의 감소된 발현 및 TNFRSF4의 감소된 발현을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 NFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP 중 3종 이상의 감소된 발현 및 PRDM1의 감소된 발현을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, TNFRSF4의 발현은 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템에 의해서 감소된다. 일부 실시형태에서, PRDM1의 발현은 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템에 의해서 감소된다.
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III. 유전자-조절 시스템
본 명세서에서, 용어 "유전자-조절 시스템"은 세포에 도입될 때 내인성 표적 DNA 서열을 변형시켜서 암호화된 유전자 생성물의 발현 또는 기능을 조절할 수 있는 단백질, 핵산 또는 이들의 조합물을 지칭한다. shRNA, siRNA, 아연-핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템 및 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 개시내용의 방법에 사용하기에 적합한 다수의 유전자 편집 시스템이 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "조절한다"는, 내인성 표적 유전자에 대한 유전자-조절 시스템의 효과와 관련하여 사용되는 경우, 내인성 표적 유전자의 서열에서의 임의의 변화, 내인성 표적 유전자의 후성적 상태에서의 변화 및/또는 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 발현 또는 기능에서의 임의의 변화를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 예를 들어, 내인성 표적 서열 내의 하나 이상의 돌연변이의 도입에 의해서, 예컨대, 내인성 표적 서열 내의 하나 이상의 핵산의 삽입 또는 결실에 의해서, 내인성 표적 유전자의 서열에서의 변화를 매개할 수 있다. 내인성 표적 서열의 변경을 매개할 수 있는 예시적인 기전은 비-상동성 말단 연결(non-homologous end joining: NHEJ)(예를 들어, 통상적이거나 대안적임), 마이크로상동성-매개된 말단 연결(microhomology-mediated end joining: MMEJ), 상동성-유도된 수선(homology-directed repair)(예를 들어, 내인성 공여자 주형 매개된), SDSA(합성 의존성 가닥 어닐링), 단일 가닥 어닐링 또는 단일 가닥 침범을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 서열의 후성적 상태에서의 변화를 매개할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 유전자 DNA의 공유 변형(예를 들어, 사이토신 메틸화 및 하이드록시메틸화) 또는 연관된 히스톤 단백질의 공유 변형(예를 들어, 라이신 아세틸화, 라이신 및 아르기닌 메틸화, 세린 및 트레오닌 포스포릴화 및 라이신 유비퀴틴화 및 수모화(sumoylation))을 매개할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 발현의 변화를 매개할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 DNA 서열의 변형에 의해서, 또는 DNA 서열에 의해서 암호화된 mRNA 생성물에 작용함으로써 암호화된 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 변형된 내인성 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 유전자-조절 시스템에 의해서 매개된 내인성 DNA 서열에 대한 변형은 내인성 단백질의 발현을 초래하는데, 이는 비변형된 Treg에서 상응하는 내인성 단백질과 비교할 때 감소된 기능을 입증한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 내인성 단백질의 발현 수준은 증가되거나 감소될 수 있고, 비변형된 면역 세포에서 상응하는 내인성 단백질의 발현 수준과 동일하거나 실질적으로 유사할 수 있다.
A. 핵산-기반 유전자-조절 시스템
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 외인성 단백질에 대한 요건 없이 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 1종 이상의 핵산 분자를 포함하는 시스템이다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표적 핵산 서열에 상보적인 RNA 간섭 분자 또는 안티센스 RNA 분자를 포함한다.
"안티센스 RNA 분자"는 mRNA 전사체와 상보적인, 길이에 무관한 RNA 분자를 지칭한다. 안티센스 RNA 분자는 세포, 조직 또는 대상체에 도입되어 내인성 유전자 침묵 경로에 좌우되지 않지만, 그 보다는 표적 mRNA 전사체의 RNaseH-매개된 분해에 좌우되는 기전을 통해서 내인성 표적 유전자 생성물의 발현을 감소시킬 수 있는 단일 가닥 RNA 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 핵산은 변형된 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 또는 당업계에 공지된 다른 것을 포함하거나, 또는 비-자연 인터뉴클레오사이드 링키지를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안티센스 핵산은 잠금 핵산(LNA)을 포함할 수 있다.
"RNA 간섭 분자"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 내인성 유전자 침묵 경로(예를 들어, Dicer 및 RNA-유도된 침묵 복합체(RNA-induced silencing 복합체: RISC))를 통한 표적 mRNA의 분해에 의해서 내인성 표적 유전자 생성물의 발현 감소를 매개하는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예시적인 RNA 간섭제는 마이크로 RNA(본 명세서에서 "miRNA"라고도 지칭됨), 짧은 헤어-핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), RNA 압타머 및 몰폴리노를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 miRNA를 포함한다. miRNA는 약 21 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 자연 발생, 작은 비-암호 RNA 분자를 지칭한다. miRNA는 1종 이상의 표적 mRNA 분자에 적어도 부분적으로 상보적이다. miRNA는 번역 억압, mRNA의 절단 및/또는 탈아데닐화를 통해서 내인성 표적 유전자 생성물의 발현을 하향조절(예를 들어, 감소)할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 shRNA를 포함한다. shRNA는 줄기-루프 구조를 형성하고, 상보적 mRNA 서열의 분해를 유발하는 약 50 내지 70개 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 RNA 분자이다. shRNA는 플라스미드 또는 비-복제 재조합 바이러스 벡터에서 클로닝되어 세포내로 도입되어, 게놈 내의 shRNA-암호화 서열의 통합을 초래할 수 있다. 이와 같이, shRNA는 내인성 표적 유전자 번역 및 발현의 안정적이고 일관된 억제를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 siRNA를 포함한다. siRNA는 전형적으로 약 21 내지 23개 뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 RNA 분자를 지칭한다. siRNA는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)라고 불리는 멀티 단백질 복합체와 회합하고, 그 동안 "패신저" 센스 가닥이 효소에 의해서 절단된다. 이어서 서열 상동성으로 인해서, 활성화된 RISC에 함유된 안티센스 "가이드" 가닥이 RISC를 상응하는 mRNA로 안내하고, 동일한 뉴클레아제가 표적 mRNA를 절단하여, 특이적 유전자 침묵을 초래한다. 최적으로, siRNA는 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오타이드 길이이고, 3' 단부에 2 염기 오버행을 갖는다. siRNA는 개별 세포 및/또는 배양 시스템에 도입되어, 표적 mRNA 서열의 분해를 초래할 수 있다. siRNA 및 shRNA는 문헌[Fire et al., Nature, 391:19, 1998] 및 미국 특허 제7,732,417호; 제8,202,846호; 및 제8,383,599호에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 하나 이상의 몰폴리노를 포함한다. "몰폴리노"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 변형된 핵산 올리고머를 지칭하며, 여기서 표준 핵산 염기가 몰폴리노 고리에 결합되어 있고, 포스포로다이아미데이트 링키지를 통해서 연결된다. siRNA 및 shRNA에 유사하게, 몰폴리노는 상보적 mRNA 서열에 결합한다. 그러나, 몰폴리노는 분해를 위해서 상보성 mRNA 서열을 표적화하기 보다는 mRNA 번역 및 mRNA 스플라이싱의 변경을 통해서 기능한다.
일부 실시형태에서 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA와 적어도 90% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA와 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 당업계에 공지된 것으로부터 선택된 siRNA 분자 또는 shRNA 분자, 예컨대, 상업 공급원, 예컨대, 시그마 알드리치사(Sigma Aldrich), 다마콘사(Dharmacon), 써모피셔사(ThermoFisher) 등으로부터 입수 가능한 siRNA 및 shRNA 작제물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자(예를 들어, 2개 이상의 siRNA, 2개 이상의 shRNA, 2개 이상의 RNA 압타머, 또는 2개 이상의 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자(예를 들어, 2개 이상의 siRNA, 2개 이상의 shRNA, 2개 이상의 RNA 압타머, 또는 2개 이상의 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자(예를 들어, 2개 이상의 siRNA, 2개 이상의 shRNA, 2개 이상의 RNA 압타머, 또는 2개 이상의 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
B. 단백질-기반 유전자-조절 시스템
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 핵산 가이드 분자에 대한 요건 없이 서열 특이적 방식으로 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 1종 이상의 단백질을 포함하는 시스템이다. 일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 하나 이상의 아연-핑거 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 이러한 실시형태를 본 명세서에서 "TALEN"로 지칭한다.
1. 아연 핑거 시스템
아연 핑거-기반 시스템은 2개의 단백질 도메인: 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. "아연 핑거 DNA 결합 도메인", "아연 핑거 단백질", 또는 "ZFP"는 하나 이상의 아연 핑거를 통해서 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인인데, 이것은 구조가 아연 이온의 배위를 통해서 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 표적 DNA 서열에 대한 결합에 의해서, 아연 핑거 도메인은 그 서열 부근에서 효소 도메인의 활성도를 지시하고, 따라서 표적 서열 부근에서 내인성 표적 유전자의 변형을 유도한다. 아연 핑거 도메인은 사실상 임의의 목적하는 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 절단 또는 재조합이 바람직한 표적 DNA 서열을 함유하는 표적 유전자 유전자좌(예를 들어, 표 1에 언급된 표적 유전자에서의 표적 유전자좌)를 식별한 후, 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인은 표적 유전자 유전자좌에서 하나 이상의 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 세포에서 아연 핑거 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 융합 단백질의 발현은, 표적 유전자 유전자좌에서 변형을 달성한다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 1종 이상의 아연 핑거를 포함한다(Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Febuary:56-65; 미국 특허 제6,453,242호). 전형적으로, 단일 아연 핑거 도메인은 약 30개 아미노산 길이이다. 개별 아연 핑거는 3개-뉴클레오타이드(즉, 삼중) 서열(또는 1개 뉴클레오타이드에 의해서, 인접한 아연 핑거의 4개-뉴클레오타이드 결합 부위와 중첩할 수 있는 4개-뉴클레오타이드 서열)에 결합한다. 따라서 결합하도록 아연 핑거 결합 도메인이 조작된 서열(예를 들어, 표적 서열)의 길이는 조작된 아연 핑거 결합 도메인에서 아연 핑거의 수를 결정할 것이다. 예를 들어, 핑거 모티프가 중첩 하위부위에 결합하지 않은 ZFP의 경우, 6개-뉴클레오타이드 표적 서열이 2개-핑거 결합 도메인에 의해서 결합되고; 9개-뉴클레오타이드 표적 서열이 3개-핑거 결합 도메인에 의해서 결합되고, 그 등등이다. 표적 부위 내의 개별 아연 핑거에 대한 결합 부위(즉, 하위부위)는 인접할 필요는 없지만, 멀티-핑거 결합 도메인 내의 아연 핑거 사이(즉, 인터-핑거 링커)의 아미노산 서열의 길이 및 본성에 따라서, 하나 또는 몇몇 뉴클레오타이드에 의해서 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개별 ZFN의 DNA-결합 도메인은 3 내지 6개의 개별 아연 핑거 반복부를 포함하고, 이것은 각각 9 내지 18개 염기쌍을 인식할 수 있다.
아연 핑거 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있다(예를 들어, 문헌[Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416] 참고). 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연 발생 아연 핑거 단백질에 비해서 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
아연 핑거 도메인에 의한 결합을 위한 표적 DNA 서열의 선택은 예를 들어, 미국 특허 제6,453,242호에 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 간단한 육안 검사를 표적 DNA 서열의 선택에 또한 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법에서 표적 DNA 서열 선택을 위한 임의의 수단이 사용될 수 있다. 표적 부위는 일반적으로 길이가 적어도 9개 뉴클레오타이드이고, 따라서 적어도 3개의 아연 핑거를 포함하는 아연 핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 그러나, 예를 들어, 4개-핑거 결합 도메인의 12개-뉴클레오타이드 표적 부위에 대한 결합, 5개-핑거 결합 도메인의 15개-뉴클레오타이드 표적 부위에 대한 결합, 또는 6개-핑거 결합 도메인의 18개-뉴클레오타이드 표적 부위에 대한 결합이 또한 가능하다. 보다 큰 결합 도메인(예컨대, 7개-, 8개-, 9개-핑거 및 그 초과)의 보다 긴 표적 부위에 대한 결합이 또한 가능하다는 것이 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 시스템은 당업계에 공지된 것, 예컨대, 상업적인 공급원, 예컨대, 시그마 알드리치사로부터 입수 가능한 것으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
아연 핑거 융합 단백질의 효소 도메인 부분은 엔도- 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 효소 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, Mass.; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388] 참고). DNA를 절단하는 추가적인 효소가 공지되어 있다(예를 들어, 51 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNaseI; 마이크로코쿠스 뉴클레아제(micrococcal nuclease); 효모 HO 엔도뉴클레아제(또한 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참고). 이들 효소(또는 이의 기능성 단편) 중 1종 이상은 절단 도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 ZFP의 효소 도메인으로서 사용하기에 적합한 예시적인 제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 다수의 종에서 존재하고, DNA에(인식 부위에서) 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 부위에서 또는 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, 타입 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리 가능한 절단 도메인 및 결합 도메인을 갖는다. 예를 들어, 타입 IIS 효소 FokI은 하나의 가닥 상의 인식 부위로부터의 9개 뉴클레오타이드에서 그리고 나머지 상의 인식 부위로부터의 13개 뉴클레오타이드에서, DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다(예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호뿐만 아니라 문헌[Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31, 978-31, 982] 참고). 따라서, 일 실시형태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 타입 IIS 제한 효소로부터의 효소 도메인 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한, 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다(문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575] 참고). 따라서, 아연 핑거-FokI 융합체를 사용한 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해서, 각각 FokI 효소 도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매 활성 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 효소 도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자를 또한 사용할 수 있다. FokI 효소 도메인을 포함하는 예시적인 ZFP가 미국 특허 제9,782,437호에 기재되어 있다.
2. TALEN 시스템
TALEN-기반 시스템은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 이것은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인(DNA 가닥을 절단하는 뉴클레아제)에 융합시킴으로써 제조된다. 위에서 기재된 FokI 제한 효소는 TALEN-기반 유전자-조절 시스템에 사용하기에 적합한 예시적인 효소 도메인이다.
TAL 효과기는 식물을 감염시키는 타입 III 분비 시스템을 통해서 잔토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해서 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 분기하는 제12 및 제13 아미노산을 갖는 반복되고 고도로 보존된 33 내지 34 아미노산 서열을 함유한다. 반복 가변 이잔기(Repeat Variable Diresidue: RVD)라고 지칭되는 이러한 2개의 위치는 고도로 가변성이고, 특이적 뉴클레오타이드 인식과 강하게 상관관계가 있다. 따라서, TAL 효과기 도메인은 적절한 RVD를 함유하는 반복 분절의 조합물을 선택함으로써 특이적 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. RVD 조합물에 대한 핵산 특이성은 하기와 같다: HD는 사이토신을 표적으로 하고, NI 표적은 아데닌을 표적으로 하고, NG는 티민을 표적으로 하고, NN은 구아닌을 표적으로 한다(하지만, 일부 실시형태에서, NN은 더 낮은 특이성으로 아데닌에 결합할 수 있다).
일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
TAL-효과기 반복부를 조립하기 위한 방법 및 조성물은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Cermak et al, Nucleic Acids Research, 39:12, 2011, e82] 참고). TAL-효과기 반복부의 작제를 위한 플라스미드는 애드젠사(Addgene)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
C. 조합 핵산/단백질-기반 유전자-조절 시스템
조합 유전자-조절 시스템은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드 및 핵산 가이드 분자를 포함한다. 본 명세서에서, "부위-지향된 변형 폴리펩타이드"는 핵산 가이드 분자에 결합하고, 결합되는 핵산 가이드 분자에 의해서 표적 핵산 서열(예를 들어, 내인성 표적 DNA 또는 RNA 서열)에 표적화되고, (예를 들어, 표적 핵산 서열의 절단, 돌연변이 또는 메틸화) 표적 핵산 서열을 변형시키는 폴리펩타이드를 지칭한다.
부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 2개의 부분, 즉, 핵산 가이드에 결합하는 부분 및 활성 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 부위-지향 효소 활성(예를 들어, DNA 메틸화, DNA 또는 RNA 절단, 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화 등)을 나타내는 활성 부분을 포함하며, 여기서 효소 활성 부위는 가이드 핵산에 의해서 결정된다. 일부 경우에, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 내인성 표적 핵산 서열을 변형시키는 효소 활성(예를 들어, 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아민화 활성, 디스무타제(dismutase) 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화(depurination) 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 포톨리아제(photolyase) 활성 또는 글리코실라제 활성)을 갖는 활성 부분을 포함한다. 다른 경우에, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 내인성 표적 핵산 서열과 회합되는 폴리펩타이드(예를 들어, 히스톤)를 변형시키는 효소 활성(예를 들어, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성도, 탈아데닐화 활성, 수모화 활성, 탈수모화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화 활성)을 갖는 활성 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 표적 DNA 서열의 전사를 조절(예를 들어, 전사를 증가시키거나 감소시킴)하는 활성 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 표적 RNA 서열의 발현 또는 번역을 조절(예를 들어, 전사를 증가시키거나 감소시킴)하는 활성 부분을 포함한다.
핵산 가이드는 2개의 부분, 즉, 내인성 표적 핵산 서열과 상보적이고, 이와 결합할 수 있는 제1 부분(본 명세서에서 "핵산-결합 분절"이라고 지칭), 및 부위-지향된 변형 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있는 제2 부분(본 명세서에서 "단백질-결합 분절"이라고 지칭)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 가이드의 핵산-결합 분절 및 단백질-결합 분절은 단일 폴리뉴클레오타이드 분자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 핵산 가이드의 핵산-결합 분절 및 단백질-결합 분절은 각각 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자 내에 포함되어, 핵산 가이드는 서로와 회합되어 기능성 가이드를 형성하는 2개의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.
핵산 가이드는 표적 핵산 서열과 특이적으로 혼성화함으로써 조합된 단백질/핵산 유전자-조절 시스템의 표적 특이성을 매개한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 RNA 서열, 예컨대, 표적 유전자의 mRNA 전사체 내에 포함된 RNA 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 표적 유전자의 DNA 서열 내에 포함된 DNA 서열이다. 본 명세서에서 표적 유전자에 대한 언급은 복수의 표적 유전자 유전자좌(즉, 특정 표적 유전자 서열의 부분(예를 들어, 엑손 또는 인트론))를 포함하는 특정 유전자에 대한 전장 DNA 서열을 포함한다. 각각의 표적 유전자 유전자좌 내에는 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템에 의해서 변형될 수 있는 본 명세서에서 "표적 DNA 서열"이라고 지칭되는 DNA 서열의 더 짧은 스트레치가 존재한다. 추가로, 각각의 표적 유전자 유전자좌는 "표적 변형 부위"를 포함하는데, 이것은 유전자-조절 시스템에 의해서 유도된 변형의 정확한 위치(예를 들어, 삽입, 결실 또는 돌연변이의 위치, DNA 브레이크의 위치 또는 후성적 변형의 위치)를 지칭한다.
본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 단일 핵산 가이드를 포함할 수 있거나 또는 복수의 핵산 가이드(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 핵산 가이드)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조합된 단백질/핵산 유전자-조절 시스템은 알고너트(Argonaute)(Ago) 단백질(예를 들어, 티. 써모필레스(T. thermophiles) Ago 또는 TtAgo)로부터 유래된 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 티. 써모필레스 Ago DNA 엔도뉴클레아제이고, 핵산 가이드는 가이드 DNA(gDNA)이다(문헌[Swarts et al., Nature 507 (2014), 258-261] 참고). 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 gDNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, gDNA-암호화 핵산은 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 TtAgo 부위-지향된 변형 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, TtAgo 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 내에 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 편집 시스템은 CRISPR(짧은 회문 구조 반복 서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))/Cas(CRISPR 연관된) 뉴클레아제 시스템이다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 클래스 2 시스템이다. 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템은 3개의 유형으로 나뉜다: 타입 II, 타입 V 및 타입 VI 시스템. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 단백질을 사용하는 클래스 2 타입 II 시스템이다. 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas9 DNA 엔도뉴클레아제(또는 이의 변이체)이고, 핵산 가이드 분자는 가이드 RNA(gRNA)이다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas12 단백질(예를 들어, Cas12a(Cpf1이라고도 공지됨), Cas12b(C2c1이라고도 공지됨), Cas12c(C2c3이라고도 공지됨), Cas12d(CasY라고도 공지됨), 및 Cas12e(CasX라고도 공지됨))를 사용하는 클래스 2 타입 V 시스템이다. 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas12 DNA 엔도뉴클레아제(또는 이의 변이체)이고, 핵산 가이드 분자는 gRNA이다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas13 단백질(예를 들어, Cas13a(C2c2라고도 공지됨), Cas13b 및 Cas13c)을 사용하는 클래스 2 및 타입 VI 시스템이다(문헌[Pyzocha et al., ACS Chemical Biology, 13(2), 347-356] 참고). 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas13 RNA 리보엔도뉴클레아제이고, 핵산 가이드 분자는 gRNA이다.
Cas 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용할 수 있거나 gRNA 분자와 협력하여, 표적 DNA 또는 표적 RNA 서열에 귀소 또는 국지화할 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. Cas 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas 단백질 및 자연 발생 Cas 서열로부터 1개 이상의 아미노산 잔기가 다른 조작된, 변경된 또는 달리 변형된 Cas 단백질을 포함한다.
가이드 RNA(gRNA)는 2개의 분절, DNA-결합 분절 및 단백질-결합 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 단백질-결합 분절은 하나의 RNA 분자에 포함되고, DNA-결합 분절은 또 다른 별개의 RNA 분자에 포함된다. 이러한 실시형태를 본 명세서에서 "이중-분자 gRNA" 또는 "2-분자 gRNA" 또는 "이중 gRNA"로 지칭한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 단일 RNA 분자이고, 본 명세서에서 "단일-가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로 지칭된다. 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 2-분자 가이드 RNA 및 sgRNA로 지칭되는 것 둘 다를 포함한다.
gRNA의 단백질-결합 분절은 서로에 혼성화하여 이중 가닥 RNA 듀플렉스(dsRNA 듀플렉스)를 형성하는 뉴클레오타이드의 2개의 상보적인 스트레치를 부분적으로 포함하며, 이것은 Cas 단백질에 대한 결합을 용이하게 한다. gRNA의 핵산-결합 분절(또는 "핵산-결합 서열")은 특이적 표적 핵산 서열에 상보적이고, 이와 결합할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. gRNA의 단백질-결합 분절은 Cas 폴리펩타이드와 상호작용하고, gRNA 분자와 부위-지향된 변형 폴리펩타이드의 상호작용은 내인성 핵산 서열에 대한 Cas 결합을 야기하여, 표적 핵산 서열 내에 또는 그 주변에 하나 이상의 변형을 생성시킨다. 표적 변형 부위의 정확한 위치는 (i) gRNA와 표적 핵산 서열 간의 염기-짝지움 상보성; 및 (ii) 표적 DNA 서열 내의 프로토스페이서 인접한 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)로서 지칭되는, 짧은 모티프의 위치(표적 RNA 서열 내의 프로토스페이서 측접 서열(protospacer flanking sequence: PFS)로서 지칭됨)에 의해서 결정된다. PAM/PFS 서열은 표적 핵산 서열에 대한 Cas 결합에 필요하다. 다양한 PAM/PFS 서열은 당업계에 공지되어 있고, 특정 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제)와의 사용에 적합하다(예를 들어, 문헌[Nat Methods. 2013 Nov; 10(11): 1116-1121 및 Sci Rep. 2014; 4: 5405] 참고). 일부 실시형태에서, PAM 서열은 표적 DNA 서열 내의 표적 변형 부위의 50개 염기쌍 내에 위치된다. 일부 실시형태에서, PAM 서열은 표적 DNA 서열 내의 표적 변형 부위의 10개 염기쌍 내에 위치된다. 이러한 방법에 의해서 표적화될 수 있는 DNA 서열은 표적 변형 부위에 대한 PAM 서열의 상대적인 거리 및 서열-특이적, gRNA-매개된 Cas 결합을 매개하는 고유한 20개 염기쌍 서열의 존재에 의해서만 제한된다. 일부 실시형태에서, PFS 서열은 표적 RNA 서열의 3' 단부에 위치된다. 일부 실시형태에서, 표적 변형 부위는 표적 유전자좌의 5' 말단에 위치된다. 일부 실시형태에서, 표적 변형 부위는 표적 유전자좌의 3' 단부에 위치된다. 일부 실시형태에서, 표적 변형 부위는 표적 유전자좌의 인트론 또는 엑손 내에 위치된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, gRNA-암호화 핵산은 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 내에 포함된다.
1. Cas 단백질
일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas 단백질이다. 본 명세서에 제공된 것을 포함하는 임의의 Cas 단백질이 사용될 수 있다. 다양한 종의 Cas 분자가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있고, 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에스. 아우레우스(S. aureus), 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis), 에스. 써모필레스(S. thermophiles), 아시도보락스 아베내(Acidovorax avenae), 악티노바실루스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실루스 수시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 악티노바실루스 수이스(Actinobacillus suis), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 시클리필루스데니트리피칸스(Cycliphilusdenitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(아미노monas paucivorans), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 스미티이(Bacillus smithii), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 블라스토피렐룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp.), 브레비바실루스 라테로스폭수스(Brevibacillus laterospoxus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 악콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루코티(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 쉬배(Dinoroseobacter shibae), 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(Gamma proteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 종(Methylocystis sp.) 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬커스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카, 네이세리아 메닌기티디스, 네이세리아 종(Neisseria sp.) 네이세리아 와드워티(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기(Ralstonia syzygii), 로도슈모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 종(Rhodovulum sp.), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핑고모나스 종(Sphingomonas sp.), 스포로락토바실러스 비니애(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 서브돌리그라눌룸 종(Subdoligranulum sp.), 티스텔라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 종(Treponema sp.) 또는 베르미네프로박터 에이세니아(Verminephrobacter eiseniae)로부터 유래된 Cas 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 C2C1, C2C3, Cpf1(Cas12a라고도 지칭됨), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csnl 및 Csx12라고도 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3 및 Csf4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 엔도리보뉴클레아제, 예컨대, Cas13 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas13 단백질은 Cas13a(Abudayyeh et al., Nature 550 (2017), 280-284), Cas13b(Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027), Cas13c(Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027) 또는 Cas13d(Zhang et al., Cell 175 (2018), 212-223) 단백질이다.
일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 본 명세서에 구체적으로 제공된 Cas9 단백질 중 임의의 것을 포함하는 임의의 Cas9 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 야생형 또는 자연 발생 Cas9 단백질 또는 Cas9 오쏘로그이다. 야생형 Cas9는 HNH 뉴클레아제 도메인을 사용하여 DNA의 표적 가닥을 절단하고, RuvC-유사 도메인을 사용하여 비-표적 가닥을 절단하는 멀티-도메인 효소이다. gRNA 특이성에 기초한 DNA에 대한 WT Cas9의 결합은 비-상동 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성-유도된 수선(HDR)에 의해서 수선될 수 있는 이중 가닥 DNA 브레이크를 초래한다. 예시적인 자연 발생 Cas9 분자는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재되어 있고, 추가적인 Cas9 오쏘로그는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호에 기재되어 있다. 이러한 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아 패밀리, 클러스터 2 박테리아 패밀리, 클러스터 3 박테리아 패밀리, 클러스터 4 박테리아 패밀리, 클러스터 5 박테리아 패밀리, 클러스터 6 박테리아 패밀리, 클러스터 7 박테리아 패밀리, 클러스터 8 박테리아 패밀리, 클러스터 9 박테리아 패밀리, 클러스터 10 박테리아 패밀리, 클러스터 11 박테리아 패밀리, 클러스터 12 박테리아 패밀리, 클러스터 13 박테리아 패밀리, 클러스터 14 박테리아 패밀리, 클러스터 15 박테리아 패밀리, 클러스터 16 박테리아 패밀리, 클러스터 17 박테리아 패밀리, 클러스터 18 박테리아 패밀리, 클러스터 19 박테리아 패밀리, 클러스터 20 박테리아 패밀리, 클러스터 21 박테리아 패밀리, 클러스터 22 박테리아 패밀리, 클러스터 23 박테리아 패밀리, 클러스터 24 박테리아 패밀리, 클러스터 25 박테리아 패밀리, 클러스터 26 박테리아 패밀리, 클러스터 27 박테리아 패밀리, 클러스터 28 박테리아 패밀리, 클러스터 29 박테리아 패밀리, 클러스터 30 박테리아 패밀리, 클러스터 31 박테리아 패밀리, 클러스터 32 박테리아 패밀리, 클러스터 33 박테리아 패밀리, 클러스터 34 박테리아 패밀리, 클러스터 35 박테리아 패밀리, 클러스터 36 박테리아 패밀리, 클러스터 37 박테리아 패밀리, 클러스터 38 박테리아 패밀리, 클러스터 39 박테리아 패밀리, 클러스터 40 박테리아 패밀리, 클러스터 41 박테리아 패밀리, 클러스터 42 박테리아 패밀리, 클러스터 43 박테리아 패밀리, 클러스터 44 박테리아 패밀리, 클러스터 45 박테리아 패밀리, 클러스터 46 박테리아 패밀리, 클러스터 47 박테리아 패밀리, 클러스터 48 박테리아 패밀리, 클러스터 49 박테리아 패밀리, 클러스터 50 박테리아 패밀리, 클러스터 51 박테리아 패밀리, 클러스터 52 박테리아 패밀리, 클러스터 53 박테리아 패밀리, 클러스터 54 박테리아 패밀리, 클러스터 55 박테리아 패밀리, 클러스터 56 박테리아 패밀리, 클러스터 57 박테리아 패밀리, 클러스터 58 박테리아 패밀리, 클러스터 59 박테리아 패밀리, 클러스터 60 박테리아 패밀리, 클러스터 61 박테리아 패밀리, 클러스터 62 박테리아 패밀리, 클러스터 63 박테리아 패밀리, 클러스터 64 박테리아 패밀리, 클러스터 65 박테리아 패밀리, 클러스터 66 박테리아 패밀리, 클러스터 67 박테리아 패밀리, 클러스터 68 박테리아 패밀리, 클러스터 69 박테리아 패밀리, 클러스터 70 박테리아 패밀리, 클러스터 71 박테리아 패밀리, 클러스터 72 박테리아 패밀리, 클러스터 73 박테리아 패밀리, 클러스터 74 박테리아 패밀리, 클러스터 75 박테리아 패밀리, 클러스터 76 박테리아 패밀리, 클러스터 77 박테리아 패밀리, 또는 클러스터 78 박테리아 패밀리의 Cas9 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 자연 발생 Cas9 폴리펩타이드는 SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9 및 NmeCas9로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6]에 기재된 Cas9 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 하기 활성 중 하나 이상을 포함한다:
(a) 닉카제 활성, 즉, 핵산 분자의 단일 가닥, 예를 들어, 비-상보적 가닥 또는 상보적 가닥을 절단하는 능력;
(b) 이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 두 가닥을 절단하고, 이중 가닥 브레이크를 생성하는 능력(이것은 실시형태에서 2개의 닉카제 활성의 존재임);
(c) 엔도뉴클레아제 활성;
(d) 엑소뉴클레아제 활성; 및/또는
(e) 헬리카제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력.
일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 DNA-손상 신호전달 단백질, 엑소뉴클레아제 또는 포스파타제를 동원하여 하나의 수선 기전 또는 또 다른 것에 의한 표적 서열의 수선 가능성 또는 속도를 추가로 증가시키는 이종 단백질에 융합된다. 일부 실시형태에서, WT Cas 폴리펩타이드는 핵산 수선 주형과 공동 발현되어 상동성-유도된 수선에 의해서 외인성 핵산 서열의 혼입을 용이하게 한다.
일부 실시형태에서, 상이한 Cas 단백질(즉, 다양한 종으로부터의 Cas9 단백질)은 상이한 Cas 단백질의 다양한 효소 특징을 활용하기 위해서(예를 들어, 상이한 PAM 서열 선호도를 위해서; 증가된 또는 감소된 효소 활성도를 위해서; 세포 독성의 증가된 또는 감소된 수준을 위해서; NHEJ, 상동성-유도된 수선, 단일 가닥 브레이크, 이중 가닥 브레이크 등 간의 균형을 변화시키기 위해서) 다양한 제공된 방법에서 사용하는 것이 이로울 수 있다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 피오게네스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NGG, NAG, NGA를 인식한다(Mali et al, Science 2013; 339(6121): 823-826). 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 써모필레스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NGGNG 및/또는 NNAGAAW(W = A 또는 T임)를 인식한다(예를 들어, 문헌[Horvath et al, Science, 2010; 327(5962): 167-170 및 Deveau et al, J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400] 참고). 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 뮤탄스(S. mutans)로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NGG 및/또는 NAAR(R = A 또는 G임)를 인식한다(예를 들어, 문헌[Deveau et al, J BACTERIOL 2008; 190(4): 1390-1400] 참고). 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 아우레우스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NNGRR(R = A 또는 G임)을 인식한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 아우레우스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 N GRRT(R = A 또는 G임)을 인식한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 아우레우스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 N GRRV(R = A 또는 G임)을 인식한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 엔. 메닌기티디스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 N GATT 또는 N GCTT(R = A 또는 G, V = A, G 또는 C임)를 인식한다(예를 들어, 문헌[Hou et ah, PNAS 2013, 1-6] 참고). 상기에 언급된 실시형태에서, N은 임의의 뉴클레오타이드 잔기, 예를 들어, A, G, C 또는 T 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 렙토트리치아 사히(Leptotrichia shahii)로부터 유래된 Cas13a 단백질이고, 단일 3' A, U 또는 C의 PFS 서열 모티프를 인식한다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재된 Cas 단백질과 적어도 90% 동일한 Cas 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재된 Cas 단백질과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 Cas 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재된 Cas 단백질과 적어도 100% 동일한 Cas 단백질을 암호화한다.
2. Cas 돌연변이체
일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 Cas 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성을 변경시키도록 조작된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 변경된 효소 특성, 예를 들어, 변경된 뉴클레아제 활성(자연 발생 또는 다른 참조 Cas 분자와 비교할 때) 또는 변경된 헬리카제 활성를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 Cas 폴리펩타이드는 크기를 변경시키는 변경, 예를 들어, Cas 폴리펩타이드의 또 다른 특성에 상당한 효과를 갖지 않으면서 크기를 감소시키는 아미노산 서열의 결실을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 Cas 폴리펩타이드는 PAM 인식에 영향을 미치는 변경을 포함한다. 예를 들어, 조작된 Cas 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 Cas 단백질에 의해서 인식된 PAM 서열 이외의 PAM 서열을 인식하도록 변경될 수 있다.
목적하는 특성을 갖는 Cas 폴리펩타이드는 목적하는 특성을 갖는 돌연변이체 또는 변경된 Cas 폴리펩타이드를 제공하기 위해서, 자연 발생 Cas 폴리펩타이드 또는 모 Cas 폴리펩타이드의 변경을 비롯한, 다수의 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이는 모 Cas 폴리펩타이드(예를 들어, 자연 발생 또는 조작된 Cas 폴리펩타이드)의 서열 내에 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 및 차이는 치환(예를 들어, 보존적 치환 또는 비필수 아미노산의 치환); 삽입; 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드는 모 Cas 폴리펩타이드에 비해서 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50개의 돌연변이)를 포함한다.
실시형태에서, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas 폴리펩타이드와 상이한 절단 특성을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas는 비활성화된 Cas(dCas) 돌연변이체이다. 이러한 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 어떠한 고유한 효소 활성도 포함하지 않고, 표적 핵산 절단을 매개할 수 없다. 이러한 실시형태에서, dCas는 비-절단성 기반 방식으로 표적 핵산을 변형시킬 수 있는 이종 단백질과 융합될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, dCas 단백질은 전사 활성화제 또는 전사 리프레서 도메인(예를 들어, 크루펠 연관 박스(KRAB 또는 SKD); Mad mSIN3 상호작용 도메인(SID 또는 SID4X); ERF 리프레서 도메인(ERD); MAX-상호작용 단백질 1(MXI1); 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2); 등)에 융합된다. 일부 이러한 경우에, dCas 융합 단백질은 gRNA에 의해서, 표적 핵산 내의 특이적 위치(즉, 서열)에 표적화되고, 유전자좌-특이적 조절을 발휘하고, 예컨대, 프로모터에 대한 RNA 중합효소 결합을 차단(이것은 전사 활성화제 기능을 선택적으로 저해함)하고/하거나 국지적 크로마틴 상태를 변형시킨다(예를 들어, 융합 서열이 사용되는 경우 표적 DNA를 변형시키거나 또는 표적 DNA와 회합된 폴리펩타이드를 변형시킴). 일부 경우에, 변화는 일시적이다(예를 들어, 전사 억제 또는 활성화). 일부 경우에, 변화는 유전성이다(예를 들어, 후성적 변형이 표적 DNA 또는 표적 DNA와 회합된 단백질, 예를 들어, 뉴클레오솜 히스톤에 일어난 경우).
일부 실시형태에서, dCas는 dCas13 돌연변이체이다(Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676). 이어서, 이들 dCas13 돌연변이체는 아데노신 데아미나제(예를 들어, ADAR1 및 ADAR2)를 비롯한, RNA를 변형시키는 효소에 융합될 수 있다. 아데노신 데아미나제는 아데닌을 이노신으로 전환시키는데, 여기서 번역 머시너리가 유사한 구아닌을 처리함으로써, RNA 서열에서 기능성 A → G를 생성시킨다. 일부 실시형태에서, dCas는 dCas9 돌연변이체이다.
일부 실시형태에서, 돌연변이체 Cas9는 Cas9 닉카제 돌연변이체이다. Cas9 닉카제 돌연변이체는 단지 하나의 촉매 활성 도메인(HNH 도메인 또는 RuvC 도메인)을 포함한다. Cas9 닉카제 돌연변이체는 gRNA 특이성에 기초한 DNA 결합을 보유하지만, DNA의 단지 하나의 가닥을 절단하여 단일 가닥 브레이크(예를 들어, "닉(nick)")를 생성한다. 일부 실시형태에서, 2개의 상보성 Cas9 닉카제 돌연변이체(예를 들어, 불활성화된 RuvC 도메인을 갖는 하나의 Cas9 닉카제 돌연변이체, 및 불활성화된 HNH 도메인을 갖는 하나의 Cas9 닉카제 돌연변이체)는 2개의 각각의 표적 서열에 상응하는 2개의 gRNA를 갖는 동일한 세포에서 발현되는데; 하나의 표적 서열은 센스 DNA 가닥 상에서, 그리고 하나는 안티센스 DNA 가닥 상에서 발현된다. 이러한 이중-닉카제 시스템은 스태거드(staggered) 이중 가닥 브레이크를 생성시키고, 표적 특이성을 증가시킬 수 있는데, 그 이유는 2개의 표적외 닉이 이중 가닥 브레이크를 생성시키기에 충분히 가깝게 생성될 것 같지 않기 때문이다. 일부 실시형태에서, Cas9 닉카제 돌연변이체는 핵산 수선 주형과 공동 발현되어 상동성-유도된 수선에 의해서 외인성 핵산 서열의 혼입을 용이하게 한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 Cas 폴리펩타이드는 Cas 폴리펩타이드의 PAM/PFS 특이성을 변경시키도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드는 모 Cas 폴리펩타이드의 PAM/PFS 특이성과 상이한 PAM/PFS 특이성을 갖는다. 예를 들어, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드가 표적 부위를 감소시키거나 특이성을 개선시키거나 PAM/PFS 인식 요건을 제거하도록 인식하는 PAM/PFS 서열을 변경하도록 자연 발생 Cas 단백질을 변형시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 PAM/PFS 인식 서열의 길이를 증가시키도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, PAM 인식 서열의 길이는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개 아미노산 길이이다. 상이한 PAM/PFS 서열을 인식하고/하거나 감소된 표적외 활성을 갖는 Cas 폴리펩타이드는 유도 분화(directed evolution)를 사용하여 생성될 수 있다. Cas 폴리펩타이드의 유도 분화를 위해서 사용될 수 있는 예시적인 방법 및 시스템은 예를 들어, 문헌[Esvelt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503]에 기재되어 있다.
예시적인 Cas 돌연변이체는 국제 PCT 공개 제WO 2015/161276호 및 문헌[Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676]에 기재되어 있고, 이들은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
3. gRNA
본 개시내용은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 특정 표적 핵산 서열에 안내하는 가이드 RNA(gRNA)를 제공한다. gRNA는 핵산-표적화 분절 및 단백질-결합 분절을 포함한다. gRNA의 핵산-표적화 분절은 표적 핵산 서열 내의 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이와 같이, gRNA의 핵산-표적화 분절은 혼성화(즉, 염기 짝지움)를 통해서 서열-특이적 방식으로 표적 핵산과 상호작용하고, 핵산-표적화 분절의 뉴클레오타이드 서열은 gRNA가 결합할 표적 핵산 내의 위치를 결정한다. gRNA의 핵산-표적화 분절은 표적 핵산 서열 내의 임의의 목적하는 서열에 혼성화하도록 (예를 들어, 유전자 조작에 의해서) 변형될 수 있다.
가이드 RNA의 단백질-결합 분절은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드(예를 들어, Cas 단백질)과 상호작용하여 복합체를 형성한다. 가이드 RNA는 결합된 폴리펩타이드를 상기에 기재된 핵산-표적화 분절을 통해서 표적 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드 서열에 안내한다. 가이드 RNA의 단백질-결합 분절은 서로에 상보적이고, 이중 가닥 RNA 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오타이드의 2개의 스트레치를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 2개의 별개의 RNA 분자를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 2개의 RNA 분자 각각은, 2개의 RNA 분자의 상보적 뉴클레오타이드가 혼성화하여 단백질-결합 분절의 이중 가닥 RNA 듀플렉스를 형성하도록 서로와 상보적인 뉴클레오타이드의 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 단일 RNA 분자(sgRNA)를 포함한다.
표적 유전자좌에 대한 gRNA의 특이성은 핵산-결합 분절의 서열에 의해서 매개되는데, 이것은 표적 유전자좌 내의 표적 핵산 서열과 상보적인 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상응하는 표적 핵산 서열은 대략 20개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 표적 유전자좌 내의 표적 핵산 서열과 적어도 90% 상보적이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 표적 유전자좌 내의 표적 핵산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상보적이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 표적 유전자좌 내의 표적 핵산 서열과 100% 상보적이다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 RNA 표적 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 DNA 표적 서열이다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 표 1에 열거된 것으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 DNA-결합 분절을 포함하는 2개 이상의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 핵산-결합 분절 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 핵산-결합 분절을 포함하는 2개 이상의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 핵산-결합 분절 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 핵산-결합 분절을 포함하는 2개 이상의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 핵산-결합 분절 중 적어도 하나는 표 1로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 당업계에 공지된 알고리즘(예를 들어, Cas-OFF 파인더)을 사용하여 표적외 결합을 최소화하여 특정 표적 유전자좌 또는 표적 유전자에 고유한 표적 서열을 식별하도록 설계된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 뉴클레아제에 대해서 안정성을 도입하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 이들 변형된 gRNA는 비-변형된 gRNA와 비교할 때 감소된 선천 면역 반응을 도출할 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은 일반적으로 바이러스 또는 박테리아 기원의 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론 및 세포 사멸의 유도를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 5' 단부에서 또는 그 근처에서(예를 들어, 5' 단부의 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드) 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 5' 단부는 진핵 생물 mRNA 캡 구조 또는 캡 유사체(예를 들어, G(5')ppp(5')G 캡 유사체, m7G(5')ppp(5')G 캡 유사체 또는 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G 안티 리버스 캡 유사체(anti reverse cap analog: ARCA))의 포함에 의해서 변형된다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사된 gRNA는 5' 트라이포스페이트기를 제거하기 위해 포스파타제(예를 들어, 송아지 장 알칼리성 포스파타제)로 처리함으로써 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 이의 3' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 이의 3' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부는 하나 이상의(예를 들어, 25 내지 200개의) 아데닌(A) 잔기의 첨가에 의해서 변형된다.
일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 gRNA에 존재할 수 있지만, 또한 다른 유전자-조절 시스템, 예를 들어, mRNA, RNAi 또는 siRNA-기반 시스템에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(a) 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 포스포다이에스터 골격 링키지 내의 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체;
(b) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체;
(c) 포스페이트 모이어티의 "탈포스포(dephospho)" 링커로의 대량 대체;
(d) 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체;
(e) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형;
(f) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체 또는 모이어티의 접합; 및
(g) 당의 변형.
일부 실시형태에서, 상기에 열거된 변형을 조합하여 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 변형을 가질 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA의 모든 염기는 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자의 포스페이트기 각각은 포스포로티오에이트기로 대체된다.
일부 실시형태에서, 소프트웨어 툴을 사용하여 사용자의 표적 서열 내의 gRNA의 선택을 최적화하여, 예를 들어, 게놈 전체의 총 표적외 활성을 최소화할 수 있다. 표적외 활성은 절단 이외의 것일 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9를 사용하여 각각의 가능한 gRNA를 선택하는 경우, 소프트웨어 툴은 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10) 이하의 미스매칭된 염기쌍을 함유하는 게놈에 걸쳐서 모든 잠재적인 표적외 서열(상기 NAG 또는 NGG PAM)을 식별할 수 있다. 각각의 표적외 서열에서의 절단 효율은 예를 들어, 실험 유래된 가중식을 사용하여 예측될 수 있다. 이어서 각각의 가능한 gRNA를 이의 총 예측된 표적외 절단에 따라서 순위매길 수 있고; 상위 순위의 gRNA는 가장 큰 표적내 및 가장 적은 표적외 절단을 가질 가능성이 있는 것을 나타낸다. 다른 기능, 예를 들어, gRNA 벡터 작제를 위한 자동화 시약 설계, 표적내 서베이어(Surveyor) 검정을 위한 프라이머 설계 및 고속대량 검출(high-throughput detection)을 위한 프라이머 설계 및 차세대 서열결정을 통한 표적외 절단의 정량이 또한 툴에 포함될 수 있다.
IV. 변형된 조절 T 세포의 생산 방법
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 Treg의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 유전자-조절 시스템을 Treg의 집단에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 성분, 예를 들어, 핵산-, 단백질- 또는 핵산/단백질-기반 시스템은 다양한 전달 방법 및 제형을 사용하여 다양한 형태로 표적 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 플라스미드)에 의해서 전달된다. 일부 실시형태에서, 시스템이 단일 성분보다 많은 성분을 포함하는 경우, 벡터는 각각 시스템의 성분을 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템이 단일 성분보다 많은 성분을 포함하는 경우, 복수의 벡터가 사용될 수 있으며, 각각의 벡터는 시스템의 특정 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 또한 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 융합된 신호 펩타이드를 암호화하는 서열(예를 들어, 핵 국지화, 핵 국지화, 미토콘드리아 국지화)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 융합된 핵 국지화 서열(예를 들어, SV40으로부터)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 시험관내에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 생체내에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 생체외에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 바이러스 벡터이다. 적합한 바이러스 벡터는 백시나 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스(예를 들어, 문헌[Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참고); 아데노-연관 바이러스(예를 들어, 미국 특허 제7,078,387호; 문헌[Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996]; WO 93/09239, 문헌[Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617)]의 스리바스타바(Srivastava); SV40; 단순 포진 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(예를 들어, 문헌[Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999] 참고)에 기반한 바이러스 벡터; 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스 및 레트로바이러스, 예컨대, 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus), 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수 증식 육종 바이러스 및 유선 종양 바이러스로부터 유래된 벡터) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 플라스미드이다. 다수의 적합한 플라스미드 발현 벡터가 당업자에게 공지되어 있으며, 다수가 상업적으로 이용 가능하다. 하기 벡터가 예로서 제공된다; 진핵 생물 숙주 세포: pXT1, pSG5(스트라타젠사(Stratagene)), pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVLSV40(파마시아사(Pharmacia)). 그러나, 임의의 다른 플라스미드 벡터가 숙주 세포와 상용성인 한 사용될 수 있다. 이용된 세포 유형 및 유전자-조절 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소가 발현 벡터에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544)] 참고).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 제어 요소, 예를 들어, 프로모터와 같은 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 전사 제어 요소는 진핵 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 또는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 또는 고신 세포)에서 기능적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 다에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 다중 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 이용된 세포 유형 및 유전자-조절 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소가 발현 벡터에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544)] 참고).
적합한 진핵생물 프로모터(진핵세포에서 기능성인 프로모터)의 비제한적인 예는 극초기 사이토메갈로바이러스(CMV), 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부(LTR) 및 마우스 메탈로티오네인-l을 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 내에 있다. 발현 벡터는 또한 번역 개시 및 전사 종결자를 위한 리보솜 결합 부위를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 부위-지향된 변형 폴리펩타이드에 융합되어 키메라 폴리펩타이드를 생성하는 단백질 태그(예를 들어, 6xHis 태그, 헤마글루티닌 태그, 녹색 형광 단백질 등)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
폴리뉴클레오타이드 및 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 유전자-조절 시스템의 성분을 세포 내로 도입하기 위해 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어, 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질주입, 접합, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 인산 칼슘 침전, 폴리에틸렌 이민(PEI)매개된 형질주입, DEAE-덱스트란 매개된 형질주입, 리포솜 매개된 형질주입, 입자 총 기술, 인산 칼슘 침전, 직접 미세 주사, 나노입자-매개된 핵산 전달(예를 들어, 문헌[Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9) 참고), 미세 유체 전달 방법(예를 들어, 국제 PCT 공개 제WO 2013/059343호) 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전기천공을 통한 전달은 세포를 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 유전자-조절 시스템의 성분과 혼합하고, 정의된 지속 시간 및 진폭의 하나 이상의 전기 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳에 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 유전자-조절 시스템의 성분과 혼합되며, 여기서 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기 자극이 적용되고, 그 후 세포가 제2 용기로 전달된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분 또는 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 비바이러스 전달 비히클, 예를 들어, 트랜스포손, 나노입자(예를 들어, 지질 나노 입자), 리포솜, 엑소좀, 약독화된 박테리아 또는 바이러스 유사 입자로 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 비히클은 약독화 박테리아(예를 들어, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 특정 살모넬라 균주, 비피도박 테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 변형 대장균을 포함하는 병원체를 예방하기 위해 침습적이지만 약화되도록 자연적으로 또는 인공적으로 조작됨), 특이적 세포를 표적으로 하기 위한 영양 및 조직-특이적 성향을 갖는 박테리아, 표적 세포 특이성을 변경하기 위해 변형된 표면 단백질을 갖는 박테리아이다. 일부 실시형태에서, 비히클은 유전적으로 변형된 박테리오파지(예를 들어, 큰 패키징 능력, 낮은 면역원성을 갖고 포유동물 플라스미드 유지 서열을 함유하고, 표적화된 리간드를 포함하는 조작된 파지)이다. 일부 실시형태에서, 비히클은 포유동물 바이러스-유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자가 생성될 수 있다(예를 들어, "빈" 입자의 정제에 이어 원하는 카고와 바이러스의 생체외 조립에 의해). 비히클은 또한 표적 조직 특이성을 변경시키기 위해 표적화 리간드를 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비히클은 생물학적 리포솜이다. 예를 들어, 생물학적 리포좀은 인간 세포(예를 들어, 적혈구 고스트, 이것은 대상체로부터 유래된 구형 구조로 분해되는 적혈구이며, 여기서 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포-특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음)로부터 유래된 인지질계 입자, 세포 내 기원의 분비 엑소좀 또는 대상체 유래된 막-결합 나노소포(30 내지 100nm)(예를 들어, 다양한 세포 유형으로부터 생성될 수 있고 따라서 리간드를 표적화할 필요 없이 세포에 의해 흡수될 수 있음)이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg의 방법은 샘플로부터 Treg의 집단을 얻는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 조직 샘플, 유체 샘플, 세포 샘플, 단백질 샘플 또는 DNA 또는 RNA 샘플을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 세포의 1종 이상의 집단을 포함하는 장, 피부, 폐, 간, 비장, 림프절 및 지방 조직 세포 배양 매질, 세포의 1종 이상의 집단을 포함하는 완충 용액 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 신체 내의 임의의 조직 유형으로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 샘플의 잔여부로부터 특정 세포 유형, 예컨대, Treg를 농축하거나 단리하기 위해서 가공된다.
일부 실시형태에서, 단리된 Treg는 배양물에서 확장되어 Treg의 확장된 집단을 생산한다. 1종 이상의 활성화 또는 성장 인자가 확장 공정 동안 배양 시스템에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1종 이상의 사이토카인(예컨대, TGF-β 및/또는 IL-2)이 배양 시스템에 첨가되어 세포 증식 및 확장을 향상시키거나 촉진시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 활성화 항체, 예컨대, 항-CD3 항체가 배양 시스템에 첨가되어 세포 증식 및 확장을 향상시키거나 촉진시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Treg는 확장 과정 동안 피더 세포와 공배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상의 확장 단계를 포함한다. 면역 세포의 생체외 확장 방법은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20180282694호 및 제20170152478호 및 미국 특허 제8,383,099호 및 제8,034,334호에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
배양 및 확장 공정 동안 임의의 시점에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 Treg에 도입되어 변형된 Treg 집단을 생산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 샘플로부터의 농축 직후에 Treg의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 하나 이상의 확장 과정 전에, 확장 과정 중에 또는 확장 과정 후에 Treg의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 샘플로부터의 농축 또는 대상체로부터의 수거 직후에 그리고 임의의 확장 라운드 전에 Treg의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 상기 확장 이후에 Treg의 집단에 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 생산된 변형된 Treg는 즉시 사용될 수 있다. 대안적으로 세포는 액체 질소 온도에서 동결되고, 오랜 시간 기간 동안 저장될 수 있고, 해동되어 재사용될 수 있다. 이러한 경우, 세포는 일반적으로 10% 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 50% 혈청, 40% 완충 배지, 또는 이러한 동결 온도에서 세포를 보존하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 방식으로 일부 다른 용액에서 냉동될 것이고, 냉동 배양된 세포를 해동시키기 위해 당업계에 통상적으로 공지된 바와 같이 해동된다.
일부 실시형태에서, 변형된 Treg는 다양한 배양 조건 하에서 시험관내에서 배양될 수 있다. 세포는 배양물에서 확장되고, 즉, 증식을 촉진시키는 조건 하에서 성장될 수 있다. 배양 배지는 예를 들어, 아가, 메틸셀룰로스 등을 함유하는 액체 또는 반고체일 수 있다. 세포 집단은 적절한 영양 배지, 예컨대, 소 태아 혈청(약 5 내지 10%), L-글루타민, 티올, 특히 2-머캅토에탄올 및 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙타비딘이 보충된 이스코브 변형(Iscove's modified) DMEM 또는 RPMI 1640에 현탁될 수 있다. 배양물은 조절 T 세포가 응답성인 성장 인자를 함유할 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 성장 인자는 막관통 수용체의 특이적 효과를 통해서, 온전한 조직 내에서 또는 배양물에서 세포의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진시킬 수 있는 분자이다. 성장 인자는 폴리펩타이드 인자 및 비폴리펩타이드 인자를 포함한다.
A. CRISPR/Cas 시스템을 사용한 변형된 조절 T 세포의 생산
일부 실시형태에서, 변형된 Treg를 생산하는 방법은 표적 DNA 서열을 gRNA 및 Cas 폴리펩타이드를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기에 논의된 바와 같이, gRNA 및 Cas 폴리펩타이드는 복합체를 형성하는데, 여기서 gRNA의 DNA-결합 도메인은 복합체를 표적 DNA 서열에 표적화하고, Cas 단백질(또는 효소적으로 불활성인 Cas 단백질에 융합된 이종 단백질)은 표적 DNA 서열을 변형시킨다. 일부 실시형태에서, 이 복합체는 gRNA 및 Cas 단백질(또는 gRNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)을 세포에 도입한 후 세포 내로 형성된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 DNA 핵산이고, 형질도입에 의해 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템의 Cas9 및 gRNA 성분은 단일 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질 및 gRNA 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 포함되고, 바이러스 형질도입에 의해 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템의 Cas9 및 gRNA 성분은 상이한 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 제1 바이러스 벡터에 포함되고 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 제2 바이러스 벡터에 포함된다. 이 실시형태의 일부 양상에서, 제1 바이러스 벡터는 제2 바이러스 벡터 전에 세포에 도입된다. 이 실시형태의 일부 양상에서, 제2 바이러스 벡터는 제1 바이러스 벡터 전에 세포에 도입된다. 이러한 실시형태에서, 벡터의 통합은 Cas9 및 gRNA 성분의 지속적인 발현을 초래한다. 그러나, Cas9의 지속적인 발현은 표적외 돌연변이 증가 및 일부 세포 유형에서의 절단을 야기할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 mRNA 핵산 서열이 형질감염에 의해 세포 집단에 도입될 수 있다. 이러한 실시형태에서, Cas9의 발현은 시간에 따라 감소할 것이고, 표적외 돌연변이 또는 절단 부위의 수를 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 이 복합체는 gRNA 분자 및 Cas 단백질을 함께 혼합하고, 복합체 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시킴으로써 무세포 시스템에서 형성된다. 이어서 gRNA 및 Cas 단백질을 포함하고, 본 명세서에서 CRISPR-리보핵단백질(CRISPR-RNP)로 지칭되는 이러한 미리 형성된 복합체는 표적 DNA 서열을 변형시키기 위해 세포에 도입될 수 있다.
B. shRNA 시스템을 사용한 변형된 조절 T 세포의 생산
일부 실시형태에서, 표적 유전자의 mRNA 전사체에 상보적인 서열을 갖는 하나 이상의 shRNA 분자를 암호화하는 하나 이상의 DNA 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 변형된 Treg를 생산하는 방법이 제공된다. Treg는 작은 유전자 카세트를 통해 세포핵에 특이적 DNA 서열을 도입함으로써 shRNA를 생성하도록 변형될 수 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 둘 다는 shRNA-암호화 DNA를 Treg에 도입하는데 사용될 수 있다. 도입된 DNA는 세포 자신의 DNA의 일부가 되거나 핵에서 지속될 수 있으며, 세포 머시너리에 shRNA를 생산하도록 지시한다. shRNA는 RNAi-매개된 유전자 넉다운을 유도하도록 세포 내부의 다이서 또는 AGO2-매개 슬라이서 활성에 의해 처리될 수 있다.
V. 조성물 및 키트
용어 "조성물"은 대상체 또는 세포에 투여 또는 전달될 수 있는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 유전자-조절 시스템 또는 본 명세서에 기재된 변형된 Treg의 제형을 지칭한다. 전형적으로, 제형은 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 그의 유도체 및/또는 전구 약물, 용매화물, 입체이성질체, 라세미체 또는 호변이성질체를 포함하는 모든 생리학적으로 허용되는 조성물을 포함한다. "치료용 조성물"또는 "약제학적 조성물"(본 명세서에서 상호 교환적으로 사용됨)은 특정 질환 또는 장애의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있거나 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 변형을 위해서 세포와 접촉될 수 있는 유전자-조절 시스템 또는 변형된 Treg의 조성물이다.
구 "약제학적으로 허용 가능한"은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/유해비에 상응하면서, 본 명세서에서 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 인간의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 하기를 포함할 수 있다:
(a) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 핵산 분자;
(b) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 핵산 분자를 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
(c) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 단백질;
(d) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 변형 단백질을 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
(e) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA;
(f) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(g) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(h) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(i) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 DNA(gDNA);
(j) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 하나 이상의 gDNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(k) gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(l) gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(m) 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA;
(n) 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(o) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(p) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드; 또는
(q) 본 명세서에 기재된 변형된 Treg; 또는
(r) 이들의 임의의 조합물.
일부 실시형태에서, 키트는 유전자-조절 시스템 중 1종 이상의 성분(또는 1종 이상의 성분을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드) 및 성분을 재구성 및/또는 희석시키기 위한 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 유전자-조절 시스템 중 1종 이상의 성분(또는 1종 이상의 성분을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드)을 포함하고, 1종 이상의 추가 시약을 추가로 포함하며, 여기서 이러한 추가 시약은 세포에 유전자-조절 시스템을 도입하기 위한 완충제; 세척 완충제; 대조군 시약; 대조군 발현 벡터 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드; DNA로부터 유전자-조절 시스템의 시험관내 생산을 위한 시약 등으로부터 선택될 수 있다. 키트의 성분은 별개의 용기에 존재할 수 있거나 단일 용기에 조합될 수 있다.
상기에 언급된 성분에 더하여, 일부 실시형태에서 키트는 본 개시내용의 방법을 실시하기 위해서 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 방법을 실시하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기판 상에 인쇄될 수 있다. 이와 같이 설명서는 키트에 패키지 삽입물로서 또는 키트의 용기 또는 이의 성분의 라벨링으로서 존재할 수 있다(즉, 포장 또는 하위 포장과 관련됨). 다른 실시형태에서, 설명서는 예를 들어, 컴퓨터 판독 가능 매체와 같은 적절한 컴퓨터 판독 가능 저장 매체, CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브 등 상에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 다른 실시형태에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, 예를 들어, 인터넷을 통해서 원격 소스로부터 설명서를 얻는 수단이 제공된다. 이 실시형태의 예는 설명서를 볼 수 있고/있거나 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻기 위한 이러한 수단은 적절한 기판에 기록된다.
VI. 치료 방법 및 응용
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg 및 유전자-조절 시스템은 다양한 치료 응용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg 및/또는 유전자-조절 시스템은 유전자 요법과 같은 목적을 위해, 예를 들어, 질환을 치료하기 위해서, 자가면역 질환 치료제로서 사용하기 위해서 또는 생물학적 연구를 위해서 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 신생아, 청소년 또는 성인일 수 있다. 포유동물 대상체가 특히 중요하다. 본 방법으로 치료될 수 있는 포유동물 종은 개 및 고양이; 말; 소; 양 등 및 영장류, 특히 인간을 포함한다. 동물 모델, 특히 작은 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 토끼 등)이 실험 조사에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 변형된 Treg, 이의 집단 및 이의 조성물의 투여는 주사, 관개, 흡입, 소비, 전기 삼투, 혈액 투석, 이온 삼투 및 기타 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 국소적이거나 전신적이다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 동맥내, 두개내, 피부내, 십이지장내, 유방내, 수막내, 복강내, 척수강내, 종양내, 정맥내, 유리체내, 안내, 비경구, 척추, 피하, 요관, 요도, 질 또는 자궁내이다.
일부 실시형태에서, 투여 경로는 주입에 의한 것이다(예를 들어, 연속적 또는 볼러스(bolus)). 국소 투여 방법, 즉, 부상 또는 질환 부위로의 전달의 예는, 예를 들어, 옴마야(Ommaya) 저장소를 통한 것, 예를 들어, 척수강내 전달을 위한 것(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제5,222,982호 및 제5,385,582호 참고); 볼러스 주사에 의한 것, 예를 들어, 주사기에 의한 것, 예를 들어, 관절 내로; 연속 주입에 의한 것, 예를 들어, 대류(convection)과 같은 것을 사용한 배관 삽입에 의한 것(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 출원 공개 제2007-0254842호 참고); 또는 세포가 가역적으로 부착된 장치를 이식하는 것에 의한 것(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 출원 공개 제2008-0081064호 및 제2009-0196903호 참고)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 국소 투여 또는 직접 주사에 의한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 대상체에게 단독으로 또는 적합한 기질 또는 매트릭스와 함께 제공되어, 예를 들어, 이식될 조직에서 성장 및/또는 조직을 지원할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 1×103개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 적어도 5×103개 세포, 1×104개 세포, 5×104개 세포, 1×105개 세포, 5×105개 세포, 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 1×107, 1×108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 5×1012 또는 그 초과의 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×108 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×109 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×1010 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×1011 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×1011개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×1010개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×109개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×108개 세포가 대상체에게 투여된다. 대상체에 대한 치료의 투여 횟수는 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 Treg를 대상체 내로 도입하는 것은 일회성 사건일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 치료는 진행 중인 일련의 반복 치료를 요구할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과가 관찰되기 전에 변형된 Treg의 다중 투여가 필요할 수 있다. 정확한 프로토콜은 질환 또는 병태, 질환의 단계 및 치료될 개별 대상체의 파라미터에 따라 달라진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 유전자 치료 또는 생물학적 연구와 같이 생체내에서 세포 DNA 또는 RNA를 변형시키기 위해 사용된다. 이러한 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 상기에 기재된 방법에서와 같이 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 Treg 집단의 생체외 또는 시험관내 변형에 사용된다. 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 Treg를 포함하는 샘플에 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 자가유래 Treg이다. 이와 관련하여 용어 "자가유래"는 이들이 투여된 동일한 대상체로부터 유래된 세포를 지칭한다. 예를 들어, Treg는 대상체로부터 얻어지고, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생체외에서 변형된 후, 질환을 치료하기 위해 동일한 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 세포는 자가유래 Treg이다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 변형된 Treg 또는 이의 조성물은 동종이계 Treg이다. 이와 관련하여 용어 "동종이계"는 한 대상체로부터 유래되고 다른 대상체에게 투여된 세포를 지칭한다. 예를 들어, Treg는 제1 대상체로부터 얻어지고, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생체외에서 변형된 후, 질환을 치료하기 위해 제2 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 세포는 동종이계 Treg이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg는 질환을 치료하기 위해서 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료는 유효량의 세포의 집단(예를 들어, 변형된 Treg의 집단) 또는 이들의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료는 (a) 질환의 저해, 즉, 질환 발달의 정지 또는 질환 진행의 예방; (b) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환 상태의 퇴행을 유발하거나 질환의 하나 이상의 증상을 완화시키는 것; 및 (c) 질환 치료, 즉, 하나 이상의 질환 증상의 완화를 포함하는, 포유동물, 예를 들어, 인간에서 질환의 치료를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료는 하나 이상의 질환 증상에서의 단기(예를 들어, 일시적 및/또는 급성) 및/또는 장기(예를 들어, 지속) 감소를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 질환 증상의 개선 또는 향상을 초래한다. 개선은 관찰 가능하거나 측정 가능한 개선이거나, 또는 대상체의 전반적인 건강 느낌의 개선일 수 있다.
특정 대상체에게 투여되는 변형된 Treg의 유효량은 다양한 인자에 좌우될 것이며, 그 중 몇몇은 치료될 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 작용제(들)의 활성; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시기, 투여 경로; 치료 기간; 조합하여 사용되는 약물; 처방 의사의 판단; 의학 분야에 공지된 유사한 인자를 포함하여 환자마다 상이할 것이다.
일부 실시형태에서, 변형된 Treg의 유효량은 적어도 1×103개 세포, 예를 들어, 5×103개 세포, 1×104개 세포, 5×104개 세포, 1×105개 세포, 5×105개 세포, 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 1×107, 1×108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 5×1012 또는 그 초과의 세포일 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 Treg 및 유전자-조절 시스템은 자가면역 장애의 치료에 사용될 수 있다. 달리 제시되지 않는 한, 용어 "장애" 및 "질환"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "자가면역 장애"는 개체 자신의 조직 또는 기관으로부터 발생하고 그리고 이에 대해서 지향되는 질환 또는 장애 또는 이의 공동 분리 또는 증상발현 또는 이로부터 생성된 병태이다. 자가변역 질환은 주로 적응 면역 반응의 조절장애에 의해서 유발되고, 자가항체 또는 자가구조에 대한 자가반응성(autoreactive) T 세포 형성된다.
예시적인 자가면역 장애는 자가면역 간염, 염증성 잘 질환(IBD), 크론병, 대장염, 궤양성 대장염, 1형 당뇨병, 원형 탈모증, 혈관염, 측두성 관절염, 루푸스, 셀리악병, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 경화증, 관절염, 류마티스성 관절염, 이식편대숙주병(GVHD) 및 건선을 포함한다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공개 및 특허 출원은 이들의 전문이 모든 목적을 위해서 참조에 의해서 본 명세서에 포함된다. 그러나, 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공개 및 특허 출원에 대한 언급은 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 전 세계 모든 국가의 일반적인 지식의 공통의 일부를 구성한다는 인정 또는 어떠한 형태의 제안도 아니며, 그렇게 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 물질 및 방법
본 명세서에 기재된 실험은 자가면역 질환의 치료를 위한 면역요법으로서의 임상 사용을 위해서 조절 T 세포(Treg)에서 내인성 표적 유전자의 발현을 조절하기 위해서 CRISPR/Cas9 시스템을 사용한다.
I. 물질
gRNA: 달리 제시되지 않는 한, 모든 실험은 단일-분자 gRNA(sgRNA)를 사용한다. 이중 gRNA 분자를 제시된 바와 같이 사용하였고, 200μM tracrRNA(IDT 카탈로그 번호 1072534)를 뉴클레아제 무함유 듀플렉스 완충제(IDT 카탈로그 번호11-01-03-01) 중에서 5분 동안 95℃에서 200μM의 표적-특이적 crRNA(IDT)와 듀플렉싱(duplexing)시켜서 100μM의 tracrRNA:crRNA 듀플렉스를 형성함으로써 이중 gRNA 분자를 형성하였으며, 여기서 tracrRNA 및 crRNA는 1:1비로 존재한다.
Cas9: Cas9를 Cas9 mRNA 또는 Cas9 단백질의 도입에 의해서 표적 세포에 발현시켰다. 달리 제시되지 않는 한, 에스. 피오게네스(Trilink L-7206)로부터 유래된 핵 국지화 서열을 포함하는 Cas9-암호화 mRNA(Cas9-NLS mRNA) 또는 에스. 피오게네스(IDT 카탈로그 번호 1074182)로부터 유래된 Cas9 단백질을 하기 실험에서 사용하였다.
RNP: 1.2㎕의 100μM의 tracrRNA:crRNA 듀플렉스를 1㎕의 20μM의 Cas9 단백질 및 0.8㎕의 PBS와 조합함으로써 gRNA-Cas9 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성하였다. 혼합물을 RT에서 20분 동안 인큐베이션시켜 RNP 복합체를 형성하였다.
렌티바이러스 발현 작제물: 각각 인간 게놈에서 단일 유전자를 표적으로 하는 56,408개의 sgRNA의 라이브러리를 인간 U6 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 총, 5,137개의 유전자를 gRNA에 의해서 표적화되었다. 플라스미드는 RFP, T2A 서열 및 퓨로마이신 내성 카세트의 발현을 유도하는 EF1L 프로모터를 추가로 포함하였다.
상기에 기재된 sgRNA 라이브러리를 암호화하는 렌티바이러스를 하기와 같이 생성시켰다. 간략하면, 578×106개의 LentiX-293T 세포를 형질주입 24시간 전에 10층 CellTACK에 플레이팅하였다. 무혈청 OptiMEM, TransIT-293 및 헬퍼 플라스미드(116㎍의 VSVG 및 231㎍의 PAX2-Gag-Pol)를 상기에 기재된 sgRNA-발현 플라스미드 462㎍과 배합하고, 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이 혼합물을 새로운 배지와 함께 LentiX-293T 세포에 첨가하였다. 배지를 형질주입 18시간 후에 교체하고, 바이러스 상청액을 형질주입 후 48시간에 수집하였다. 상청액을 Benzonase(등록상표) 뉴클레아제로 처리하고, 0.45μm 필터에 통과시켜 바이러스 입자를 단리시켰다. 이어서 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration: TFF)에 의해서 농축시키고, 분취하고, 역가하고, -80℃에서 저장하였다.
II. 방법
인간 Treg 세포 단리: 말초 혈액 Treg 및 CD4+ T 효과기(Teff) 세포를 새로운 류코팩(leukopack) 또는 건강한 지원자 혈액 공여자로부터의 전혈로부터 단계식으로 단리시켰다. 먼저, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll 구배 원심분리에 의해서 얻었다. 다음으로, EasySep 인간 CD4+ T 세포 단리 키트(스템셀 테크놀로지즈사(StemCell Technologies), 카탈로그 번호 17952)를 사용한 음성 면역자성 선택을 통해서 CD4+ T 세포를 단리시켰다. Treg이 농축을 위해서, 단리된 CD4+ T 세포를 CD25-PE에 대한 단클론성 항체로 추가로 표지하고, 그 다음 EasySep 인간 PE 양성 선택 키트(스템셀 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 18561)를 사용하여 양성 선택하였다. 그 다음 농축된 CD4+CD25+ 세포를 형광 활성화 세포 분류(FACS) 이전에 CD4 및 CD127에 대해서 선택적인 단클론성 항체로 표지하여 Treg의 순수한 집단을 얻었다. Treg를 하기 파라미터에 기반하여 분류하였다: CD4+CD25highCD127dim.
생체외에서 인간 Treg 세포 확장: 단리된 Treg를 인간 불활성화된 AB(10%) 및 인간 IL-2(60ng/㎖ 또는 300단위/㎖)가 보충된 X-VIVO 15 T 세포 확장 배지(론자사, 카탈로그 번호 04-418Q)에 2×106개 세포/㎖로 플레이팅하였다. 0일 및 10일 배양 후, 항-CD3/CD28 Treg 확장인자 비드 또는 Immunocult Human CD3/CD28/CD2 T-세포 활성화제(사량체)를 각각 1:4 또는 1:1 세포:비드 비 또는 각각의 활성화제의 경우 1× 방식으로 배양물에 첨가하였다. 추가의 인간 IL-2를 2 내지 3일마다 배양물에 보충하였다.
Treg 세포의 렌티바이러스 형질도입: 10일 확장 후, Treg를 항-CD3/CD28 Treg 확장제 비드를 사용하여 18시간 동안 재활성화시키고, 그 다음 6웰 플레이트에 웰당 5×106개 세포로 1.5㎖ 부피의 X-VIVO 15 배지, 6ng/㎖ 인간 IL-2에 시딩하였다. 동일한 확장 후, Teff를 Immunocult Human CD3/CD28/CD2 T-세포 활성화제를 사용하여 18시간 동안 재활성화시키고, 6웰 플레이트에 웰당 5×106개 세포로 1.5㎖ 부피의 X-VIVO 15 배지, 10ng/㎖ 인간 IL-2에 시딩하였다. 렌티바이러스 발현 sgRNA 라이브러리를 모든 세포의 80%를 감염시킬 수 있는 MOI에서 두 세포 유형에 별개로 첨가하였다. 20㎕의 레트로넥틴(Retronectin)(1mg/㎖)을 각각의 웰에 첨가하였다. XVIVO 15 배지를 웰당 2.0㎖의 최종 부피에 첨가하였다. 플레이트를 600xg로 1.5시간 동안 실온에서 회전시켰다. 18시간(2일) 후, 세포를 세척하고, 1×106개 세포/㎖로 X-VIVO 15에 시딩하였다. Treg 배양물에, 60ng/㎖의 IL2를 첨가하고, Teff 배양물에 10ng/㎖의 IL2 및 T-세포 활성화제를 첨가하였다.
T 세포의 전기천공: 제시된 경우, gRNAs 및/또는 Cas9를 전기천공에 의해서 Treg 세포에 도입하였다. 예를 들어, Treg 세포가 특정 sgRNA를 발현하는 렌티바이러스로 형질 도입된 경우, Cas9 mRNA는 형질도입 후 세포로 전기천공될 수 있다. 대안으로, 이중 gRNA 듀플렉스는 Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 RNP를 형성한 다음 Treg 세포로 전기천공될 수 있다. Cas9 mRNA 또는 RNP에 대한 전기천공 프로토콜은 다음과 같다.
Treg 및 Teff 세포 재활성화 3일 후(발현 13일차), 특이적 sgRNA를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 Treg 및 Teff 세포를 수거하고, 뉴클레오펙션 완충제(18% 보충물 1, Amaxa P3 일차 세포 4D-Nuclefector X 키트 S로부터의 82% P3 완충제(카탈로그 번호 V4XP-3032))에 100×106개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 4㎍(4㎕의 1mg/㎖)의 에스. 피오게네스 Cas9-NLS mRNA를 20㎕의 세포 용액당 세포 혼합물에 첨가하고, 이어서 24㎕의 세포/mRNA 혼합물을 각각의 반응 웰에 첨가하였다. "T 세포, 인간, 자극" 프로그램(EO-115)에 따라서 세포를 전기천공하였다. 전기천공 후, 80㎕의 따뜻한 X-VIVO 15 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 배양 플라스크에 IL-2를 함유하는 X-VIVO 15 배지(Treg: 60ng/㎖; Teff 10ng/㎖) 중에서 2×106개 세포/㎖의 밀도로 풀링(pooling)시켰다. 재활성화 4일 후, 세포를 세척하고, 계수하고, 하기에 기재된 바와 같이 기능성 검정을 위해서 사용하였다. 표적 유전자의 편집 효율을 표면 또는 세포내 단백질(예를 들어, CD45, Foxp3) 및/또는 게놈 절단-부위의 TIDE/NGS 분석에 의해서 결정하였다.
차세대 서열결정에 의해서 유전자의 편집을 평가하였다. 이러한 방법을 위해서, 공급업체 권고 프로토콜에 따라 Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit(카탈로그 번호: 13323)를 사용하여 편집된 T 세포로부터 게놈 DNA(gDNA)를 단리시키고, 정량하였다. gDNA 단리 후, PCR을 수행하여, 일루미나 차세대 서열결정 어댑터의 첨가를 위해서 필요한 오버행을 함유하는 유전자좌 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 편집된 DNA의 영역을 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 전개시켜, Monarch PCR & DNA Cleanup Kit(카탈로그 번호: T1030S)를 사용하여 공급업체 권고된 프로토콜에 따라서 PCR 세척을 수행하기 전에 일어난 게놈 유전자좌의 특이적이고 적절한 증폭을 보장한다. 이어서, 정제된 PCR 생성물을 정량하고, 제2 PCR을 수행하여 일루미나 서열결정 어댑터를 어닐링하고, 멀티플렉싱에 필요한 특이적 인덱싱 서열을 샘플링하였다. 그후, PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 전개시켜 크기를 평가하고, 그 후 AMPure XP 비드(내부에서 제조)를 사용하여 정제시켰다. 이어서, 정제된 PCR 생성물을 Kapa Illumina Library Quantification Kit(카탈로그 번호: KK4923) 및 Kapa Illumina Library Quantification DNA Standards(카탈로그 번호: KK4903)를 사용하여 qPCR을 통해서 정량하였다. 이어서, 정량화 생성물을 Illumina NextSeq 500/550 Mid Output Reagent Cartridge v2(카탈로그 번호: FC-404-2003)를 사용하여 Illumina NextSeq 500 시스템 상에 로딩하였다. 생성된 서열결정 데이터의 분석을 수행하여 편집된 T 세포 풀의 DNA에서 예상된 절단 부위에서 삽입 및 결실(인델)을 평가하였다.
편집된 Treg 세포의 면역표현형결정 및 TSDR 분석 : Treg 세포의 편집 4일 후, 세포를 CellTrace Violet 시약으로 표지하여 세포 분열을 추적하였고, 인간 IL-2(500단위/㎖)의 존재 하에서 항-CD3/CD28 Treg 확장제 비드로 자극하였다. 자극 4일 후, 세포를 이바이오사이언스사 Cell Stimulation Cocktail(및 단백질 전송 저해제)(이바이오사이언스사, 카탈로그 번호: 00-4975-03)로 5시간 동안 재자극하였다. 세포 표면 염색을 다음 항체로 수행하였다: 항-CD4(SK3), -CD25(MA-251), -TNFRSF4(Ber-ACT35) 및 CD45(HI30). 염색을 인간 FcBlock 시약(비디 바이오사이언시스사(BD Biosciences), 카탈로그 번호 564219)의 존재 하에서 20분 동안 4℃에서 수행하였다. 세포내 단백질을 검출하기 위해서, 표면 염색 후, 세포를 고정시키고, 이바이오사이언스사 Foxp3/전사 인자 염색 완충제 세트(이바이오사이언스사, 카탈로그 번호: 00-5523-00)를 사용하여 침투시키고, 다음 항체로 염색하였다: 항-Foxp3 (259D/C7), Helios(22F6) 및 IL-10(JES3-9D7). LSRFortessa(비디 바이오사이언시스사)를 데이터 수집을 위해서 사용하였고, FlowJo 소프트웨어(TreeStar)를 사용하여 분석을 수행하였다. TSDR 분석을 위해서, 공급업체 권고 프로토콜에 따라 Qiagen Blood 및 Cell Culture DNA Mini Kit(카탈로그 번호: 13323)를 사용하여 상기에 깆된 바와 같은 편집된 Treg로부터 게놈 DNA를 단리시켰다. 게놈 DNA의 바이설파이트 전환 및 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 EpigenDx(검정 ID ADS783-FS2)에 의해서 수행하여 FOXP3 유전자 영역의 메틸화 상태를 정량하였다.
편집된 Treg에 의한 동종이계 T 효과기 세포의 시험관내 억제 : Treg의 억제 기능을 문헌[Collison et al. ("In vitro Treg suppression assays", Methods Mol Biol. 707:21-37 (2011)]에서 개발된 방법의 변형 버전을 사용하여 결정하였다. 동결된 sgRNA-편집된 Treg 및 비편집된 동종이계 효과기 T 세포(이하 T 응답자 세포라고 지칭함)를 해동시키고, 10% 불활성화된 남성 인간 혈장 및 600단위/㎖ IL-2가 보충된 X-VIVO 15 T 세포 확장 배지(론자사, 카탈로그 번호 04-418Q)에서 밤새 넣어두었다. T 응답자 세포 및 Treg를 0.1% BSA를 함유하는 PBS에서 세척하고, 이어서 10μM CellTrace Violet 또는 4μM CFSE를 각각 함유하는 동일한 완충액 중에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 표지된 T 응답자 세포를 T 세포 확장 배지에 재현탁시키고, 96웰 U-바닥 플레이트에서 웰당 50,000개 세포(50㎕)로 시딩하였다. 별개의 플레이트 상에서, T 세포 확장 배지에 재현탁된 표지된 Treg를 웰당 50,000개 세포(50㎕)로 시딩하고, 연속 희석시키고, 이어서 T 응답자 세포와 1:2 내지 1:32의 비로 혼합하였다. 마지막으로, 100㎕의 0.5㎕/㎖ ImmunoCult™ Human CD3/CD28 T 세포 활성화제를 각각의 웰에 첨가하였다. Treg 또는 CD3/28 사량체가 없는 웰을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 제공하였다. 37℃에서의 인큐베이션 4일 후, 세포를 CD4, CD3, Foxp3 및 Helios(상기에 기재됨)에 대한 항체로 염색하였다. BD LSRFortessa X-20 세포 분석기(비디 바이오사이언시스사)에서 데이터를 획득하고, T 응답자 세포의 증식을 FlowJo(트리스타사(TreeStar Inc.))를 사용하여 분석하였다. Treg 억제를 다음과 같이 결정하였다: 억제 (%):100 - [100× (Treg를 갖는 증식 세포 %)/(Treg를 갖지 않는 증식 세포 %).
생체내에서 편집된 Treg 기능의 평가: 자가면역 반응을 감소시키는 CRISPR 편집된 인간 Treg의 능력을 이식편대숙주병(GvHD)의 NSG-인간 PBMC 이종 마우스 모델에서 평가하였다. Cuende 등에 의해서 이미 기재된 모델("Monoclonal antibodies against GARP/TGF-β1 complexes inhibit the immunosuppressive activity of human regulatory T cells in vivo," Sci Transl Med. 7(284):284ra56 (2015))을 인간 Treg의 전달에 의해서 조절되도록 개작하였다. 암컷 NCG 마우스(8 내지 12주령)에게 20×106개의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 정맥내 주사하였다. 14일 후, 마우스를 군당 5마리 동물의 4개의 군으로 무작위화하고, 3개의 군에 2×106개의 편집된 인간 Treg를 정맥내 투여하였다. 1개의 군을 미처리군으로 제공하였고, Treg 처리를 제공하지 않았다. 처리 전, 인간 Treg를 (1) OR1A1 유전자를 표적으로 하는 대조군 gRNA(서열번호 1 GCTGACCAGTAACTCCCAGG); (2) PRDM1 유전자를 표적으로 하는 단일 gRNA(서열번호 2 TTGGACAGATCTATTCCAGA); 및 (3) TNFRSF4 유전자를 표적으로 하는 단일 gRNA(서열번호 3 GGATGTGCGTGGGGGCTCGG)를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집하였다. PRDM1 및 TNFRSF4 유전자를 표적으로 하는 gRNA/Cas9 복합체의 편집 효율을 차세대 서열결정에 의해서 평가하였고, 각각 99% 및 83%인 것으로 결정되었다. 체중 및 GvHD 점수(중량, 활동성, 자세, 털 질감, 피부 무결성에 대해 주어진 점수의 합)를 Treg 전달 후 주당 3회 측정하였다. CD8+ T 효과기 세포 증식 및 활성화를 추적하기 위해 Treg 전달 15일 후에 얻은 말초 혈액 샘플에 대해서도 유세포 분석법을 수행하였다. 결과를 실시예 4에서 논의한다.
실시예 2: 시험관내 CRISPR/Cas9 기능성 게놈 스크리닝을 통한 Treg 세포의 면역조절을 위한 표적의 식별
시험관내 확장 동안 Treg의 적합성을 조절하는 표적을 확인하기 위해 실험을 수행하였다. 풀링된 전체 게놈(genome-wide) CRISPR 스크린을 수행하였는데, 여기서 각각이 단일 유전자를 표적화하는 sgRNA 풀을 인간 Treg 세포 또는 공여자-매칭된 Teff 세포의 집단에 도입하여, 집단 내의 각각의 세포는 단일 유전자를 표적화하는 단일 sgRNA를 포함하였다. 생체외 확장 동안 Treg(또는 Teff 세포)에 대한 특정 유전자의 효과를 결정하기 위해서, Treg(또는 Teff 세포)의 집단에서 각각의 sgRNA의 빈도를 실험 시작 시에 결정하고, 실험에서 추후 시간 지점에서 동일한 sgRNA의 빈도와 비교하였다. 시험관내에서 Treg(또는 Teff 세포) 확장을 양으로 조절하는 유전자(예를 들어, Treg(또는 Teff 세포) 증식 또는 생존력을 양으로 조절하는 유전자)를 표적화하는 sgRNA의 빈도는 시간이 따라 증가할 것으로 예상되는 반면, 시험관내에서 Treg(또는 Teff 세포) 확장을 음으로 조절하는 유전자(예를 들어, T 세포 증식 또는 생존력을 음으로 조절하는 유전자)를 표적화하는 sgRNA의 빈도는 시간에 따라 감소할 것으로 예상된다.
시험관내 확장 동안 다양한 시간 지점에서 취한 분취물에서 각각의 sgRNA의 분포 및/또는 빈도를 분석하고, 초기 편집된 Treg(또는 Teff 세포) 집단에서 각각의 sgRNA의 분포 및/또는 빈도와 비교하였다. 각각의 개별 sgRNA에 대해서 통계학적 분석을 수행하여 시험관내 확장 후 Treg(또는 Teff 세포) 집단에서 상당히 농축된 sgRNA를 식별하고, 가이드 각각에 대해서 농축 점수를 배정하였다. 본 출원인의 스크리닝 라이브러리의 각각의 개별 sgRNA에 대해, 스크린 끝점에서 관찰된 가이드 수치의 비율을 화면 시작부에서 그 가이드에 대해 관찰된 판독수로 나누어 농축 점수를 계산하였다. 유전자-수준 농축 점수를 계산하기 위해서, 응집 농축 점수를 중위 sgRNA 농축 점수로서 계산하였다. 유전자 수준 농축 점수의 통계적 유의성을 계산하기 위해서, 라이브러리의 다른 모든 가이드에 대한 그 가이드의 농축에 대한 백분위수로 각각의 가이드에 대한 명목 p-값을 계산하였다. 이러한 p-값을 로짓 p- 값 조합 방법(Mudholkar 1977)을 사용하여 조합하여 표적 농축을 위한 집계 유전자 수준 p-값을 생성하였다. 유전자 수준 p-값을 벤자미니-호크버그(Benjamini-Hochberg) 절차를 사용하여 다중-시험을 위해서 수정하였다. 다수의 sgRNA에 걸쳐 시험관내 Treg(또는 Teff 세포) 축적에 일관되고 재현 가능한 효과가 있는 표적 유전자를 확인하기 위해서, 0.2 이하의 FDR(false-discovery-rate) 컷오프를 설정하였다. 이러한 실험의 결과를 하기 표 2 및 도 1에 제시한다. 표 2의 유전자는 상위 10개 유전자-수준 농축 점수를 갖는 유전자이고, PRDM1 및 TNFRSF4는 FDR 기준을 통과한 두 유전자였다.
Figure pct00003
실시예 3: treg 세포의 면역조절에 대한 표적의 검증
0.2 이하의 FDR 컷오프를 갖는 표적을 단일-가이드 포맷으로의 추가 평가를 위해서 선택하여 Treg 세포에서의 표적 유전자의 편집이 이들 세포의 안정성 및/또는 기능을 변경하였는지를 결정하였다. 예시적인 표적의 평가가 본 명세서에 기술되어 있지만, 이들 방법은 상기에 기재된 임의의 잠재적인 표적을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
편집된 인간 Treg 세포의 면역표현형결정 : 인간 Treg 세포를 단리시키고, 상기에 기재된 바와 같이 생체외에서 확장시키고, 개별 표적 유전자를 위한 RNP 포맷으로 Cas9와 복합체를 형성한 가이드 RNA를 사용한 전기천공에 의해서 편집하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 높은 수율의 표적 유전자의 편집이 기재된 방법을 사용하여 달성될 수 있었다. 인간 Treg 세포에서 시험관내 CRISPR/Cas9 기능성 유전체학 스크린을 통해 식별된 개별 표적 유전자의 편집 결과를 유세포 분석법에 의해 결정하여 세포당 기준으로, 증식 능력의 임의의 변경 및 Treg 안정성 및 기능에 중요한 것으로 알려진 특정 전사 인자 및 사이토카인의 빈도 및 규모를 결정하였다.
편집된 Treg 세포를 항-CD3/CD28 Treg 확장제 비드로 재자극하고, 증식 능력, 전사 인자 발현 및 사이토카인 생성을 4일에 평가하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, PRDM1- 및 TNFRSF4-편집된 Treg는 대조군, CD45-편집된 Treg 세포에 비해서 CTV 염색의 평균 형광 강도(MFI)에서 각각 40% 및 30% 감소를 나타내었다. CTV 염색의 감소는 각각의 라운드의 세포 분열 동안 발생하기 때문에, 편집된 Treg 세포에서 관찰된 CTV 염색의 감소는 PRDM1- 및 TNFRSF4-편집 Treg 세포의 증식 증가를 나타낸다.
Treg 세포에서 전사 인자 Helios는 Treg 세포의 안정성에 필수적인 것으로 공지되어 있다(문헌[Kim HJ, Barnitz RA, Kreslavsky T, et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 2015;350(6258):334-9]). 또한 Helios와 Treg 계통-결정 전사 인자인 Foxp3의 결합은 핵심 Treg 시그니처 유전자의 발현과 강하게 연관되어 있다(문헌[Kwon HK, Chen HM, Mathis D, Benoist C. Different molecular complexes that mediate transcriptional induction and repression by FoxP3.　Nat Immunol. 2017;18(11):1238-1248]). 따라서, Treg 세포에서 Helios 및 Foxp3의 공동 발현은 개선된 안정성 및 증가된 면역억제 기능과 연관되어 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, Treg 세포에서 PRDM1의 편집은 Foxp3 및 Helios를 공동 발현하는 Treg 세포의 비율을 2.6배 증가시켰는데, 이는 PRDM1의 편집이 개선된 안정성 및 Treg 세포의 면역억제 기능과 연관된 Treg 세포에서 표현형의 변경으로 이어진다는 것을 입증한다.
또한, 몇몇 연구는 Treg-특이적 탈메틸화 영역(TSDR)으로 명명된 Foxp3 유전자좌 내의 보존된 영역의 탈메틸화가 분열 중인 Treg 세포의 자손에서 Foxp3의 발현을 유지하는 데 필요함을 나타내었다(문헌[Zheng et al. "Role of conserved non-coding DNA elements in the Foxp3 gene in regulatory T-cell fate," Nature 463:808-12 (2010); Polansky JK, et al., "DNA methylation controls Foxp3 gene expression," Eur. J. Immunol. 38: 1654-1663 (2008)]). 도 5에 나타낸 바와 같이, TNFRSF4의 편집은 Treg 세포의 TSDR 메틸화 상태에 영향을 미치지 않았고, PRDM1의 편집은 TSDR의 탈메틸화를 증가시켰다(CD45-편집된 대조군 T reg 세포에 비해 27% 증가). 이러한 데이터는 PRDM1의 편집이 안정적인 Treg 세포의 축적을 유도한다는 것을 나타낸다.
Treg 세포에 의한 IL-10과 같은 면역억제 사이토카인의 생산은 Treg 세포가 억제 기능을 매개할 수 있는 주요 기전이다. 실제로 IL-10을 생산할 수 없는 Treg 세포는 효과기 T 세포-매개 염증을 예방할 수 없다(문헌[Asseman C, Mauze S, Leach MW, Coffman RL, Powrie F. An essential role for interleukin 10 in the function of regulatory T cells that inhibit intestinal inflammation. J Exp Med. 1999;190(7):995-1004]). 도 6에 나타낸 바와 같이, Treg 세포에서 TNFRSF4의 편집은 CD45-편집된 대조군 Treg 세포에 비해 Treg 세포의 IL-10 생산 능력을 40% 증가시켰다. PRDM1의 편집은 Treg 세포에서 IL-10 생산을 10% 증가시켰다. 유사한 실험은 TNFRSF4의 편집이 IL-17A 및 IFNγ를 포함한 전염증성 사이토카인에 영향을 미치지 않음을 입증하였다.
IL-6과 같은 염증 사이토카인은 Treg를 불안정하게 하고, 억제 기능을 약화시킬 수 있다(문헌[Yang et al., "Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs," Immunity 29:44-56 (2008)]). 마우스에서, IL-6에 의한 Treg의 불안정화는 PRDM1의 부재 하에서 가속화된다(문헌[Garg et al., "Blimp1 Prevents Methylation of Foxp3 and Loss of Regulatory T Cell Identity at Sites of Inflammation," Cell Reports 26: 1854-1868 (2019)]). IL-6이 PRDM1-결핍 인간 Treg의 불안정화를 유도하는지 여부를 결정하기 위해서, PRDM1- 및 대조군-편집된 Treg를 50ng/㎖의 IL-6의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 도 7A 및 도 7B에 제시된 결과는 마우스 Treg와 달리 PRDM1-편집된 인간 Treg가 많은 양의 IL-6의 존재 하에서도 Helios의 높은 발현으로 제시되는 바와 같은 안정성을 유지한다는 것을 나타낸다.
Treg의 억제 기능은 다양한 대사 과정에 의존하며, 이들 중 일부는 Treg가 시험관 내에서 증식할 때 하향조절된다(문헌[Thornton AM, et al., "CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production," J Exp Med. 188:287-96 (1998); Kuniyasu Y, et al., "Naturally anergic and suppressive CD25(+) CD4(+) T cells as a functionally and phenotypically distinct immunoregulatory T cell subpopulation," Int Immunol. 12:1145-55 (2000)]). PRDM1 및 TNFRSF4의 편집이 Treg의 증식 증가로 이어졌다는 것을 고려하여, 효과기 T 세포 증식을 억제하는 이러한 Treg의 능력을 평가하였다. Treg가 1:2 내지 1:32의 비율로 표지된 효과기 T 세포와 함께 4일 동안 배양되는 시험관 내 공동 배양 시스템(방법 참조)에서, PRDM1- 및 TNFRSF4-편집된 Treg 둘 다는 효과기 T 세포의 증식을 억제할 수 있었고, 이러한 억제 기능은 대조군-편집된 Treg의 기능과 대등하였다(도 8).
종합하면, 이들 데이터는 CRISPR/Cas9 기능성 게놈 스크린을 통해 식별된 유전자에 대한 개별 가이드 서열을 갖는 Treg 세포의 편집이 증식 능력 및 Treg의 안정성 및 기능에 중요하다고 알려진 특정 전사 인자 및 사이토카인의 빈도 및 규모에서 뚜렷한 변화를 초래함을 입증한다.
실시예 4: TREG 세포의 면역조절에 대한 표적의 검증
도 9A의 데이터는 GvHD를 겪는 인간 Treg-처리된 마우스가 미처리 마우스에 비해 향상된 생존을 가짐을 나타낸다. 5마리의 미처리 마우스 모두가 초기 체중보다 낮아지는 데 걸리는 시간은 25일이었고, 대조군-편집된 Treg 처리 마우스의 경우 32일이었다. TNFRSF4-/-Treg 처리군은 Treg 전달 58일 후(PBMC 전달 후 72일)까지 초기 측정치를 초과하는 체중을 유지하는 마우스를 가졌다. 도 9B는 Treg 전달 후 15일에 마우스의 말초 혈액에 대한 유세포 분석법 데이터를 나타낸다. Ki67 염색 강도는 세포의 증식 능력을 정량화하기 위한 대리 마커인 것으로 입증되어 있다(문헌[Miller et al. ("Ki67 is a Graded Rather than a Binary Marker of Proliferation versus Quiescence," Cell Rep. 24(5):1105-1112.e5 (2018)]). Treg가 전달된 모든 군의 인간 CD8 세포에서 Ki67 염색 강도가 감소하였는데, 이는 Treg가 염증을 억제할 수 있음을 입증하였다. 또한, TNFRSF4-편집된 Treg로 처리된 마우스는 CD8+ T 세포 집단 내에서 Ki67 염색 강도가 추가로 감소된 것을 발견하였는데, 이는 TNFRSF4의 손실이 생체내에서 더 강력한 Treg로 이어진다는 것을 입증한다(도 9B).
SEQUENCE LISTING <110> KSQ Therapeutics, Inc. <120> GENE-REGULATING COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED IMMUNOTHERAPY <130> WO/2020/160489 <140> PCT/US2020/16240 <141> 2020-01-31 <150> US 62/800,121 <151> 2019-02-01 <150> US 62/916,988 <151> 2019-10-18 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OR1A1 gRNA <400> 1 gctgaccagt aactcccagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRDM1 gRNA <400> 2 ttggacagat ctattccaga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF4 gRNA <400> 3 ggatgtgcgt gggggctcgg 20

Claims (134)

  1. 변형된(modified) 조절 T 세포(regulatory T cell)(Treg)로서, TNFRSF4를 포함하는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하되,
    상기 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 Treg의 면역억제 기능을 향상시키는, 변형된 Treg.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하는, 변형된 Treg.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA로부터 선택된 핵산 분자를 포함하는, 변형된 Treg.
  4. 제2항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 효소 단백질을 포함하되, 상기 효소 단백질은 상기 내인성 유전자 중 하나 이상 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하도록 조작되어 있는, 변형된 Treg.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단백질은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(Transcription activator-like effector nuclease: TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제인, 변형된 Treg.
  6. 제2항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하되, 상기 핵산 분자는 가이드 RNA(gRNA) 분자이며, 상기 효소 단백질은 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그인, 변형된 Treg.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 변형된 Treg.
  8. 제6항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크(break)를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질인, 변형된 Treg.
  9. 제6항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제 돌연변이체인, 변형된 Treg.
  10. 제6항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 비활성화된 Cas 단백질(deactivated Cas protein: dCas)이고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합되는, 변형된 Treg.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MAX-interacting protein 1: MXI1), 크루펠-연관 박스(
    Figure pct00004
    -associated box: KRAB) 도메인, 메틸-CpG 결합 단백질 2(methyl-CpG binding protein 2: MECP2) 및 4개의 이어진(concatenated) mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  12. 변형된 Treg로서, PRDM1을 포함하는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하되,
    상기 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 Treg의 면역억제 기능을 향상시키는, 변형된 Treg.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하는, 변형된 Treg.
  14. 제13항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA로부터 선택된 핵산 분자를 포함하는, 변형된 Treg.
  15. 제13항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 효소 단백질을 포함하되, 상기 효소 단백질은 상기 내인성 유전자 중 하나 이상 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하도록 조작되어 있는, 변형된 Treg.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단백질은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제인, 변형된 Treg.
  17. 제13항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하되, 상기 핵산 분자는 가이드 RNA(gRNA) 분자이며, 상기 효소 단백질은 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그인, 변형된 Treg.
  18. 제17항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 변형된 Treg.
  19. 제17항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질인, 변형된 Treg.
  20. 제17항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제 돌연변이체인, 변형된 Treg.
  21. 제17항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 비활성화된 Cas 단백질(dCas)이고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합되는, 변형된 Treg.
  22. 제21항에 있어서, 상기 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MXI1), 크루펠-연관 박스(KRAB) 도메인, 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2) 및 4개의 이어진 mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 Treg.
  24. 변형된 Treg로서, TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하되,
    상기 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 Treg의 면역억제 기능을 향상시키는, 변형된 Treg.
  25. 제24항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하는, 변형된 Treg.
  26. 제24항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA로부터 선택된 핵산 분자를 포함하는, 변형된 Treg.
  27. 제24항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 효소 단백질을 포함하되, 상기 효소 단백질은 상기 내인성 유전자 중 하나 이상 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하도록 조작되어 있는, 변형된 Treg.
  28. 제27항에 있어서, 상기 단백질은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제인, 변형된 Treg.
  29. 제24항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하되, 상기 핵산 분자는 가이드 RNA(gRNA) 분자이며, 상기 효소 단백질은 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그인, 변형된 Treg.
  30. 제29항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 변형된 Treg.
  31. 제29항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질인, 변형된 Treg.
  32. 제29항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제 돌연변이체인, 변형된 Treg.
  33. 제29항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 비활성화된 Cas 단백질(dCas)이고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합되는, 변형된 Treg.
  34. 제33항에 있어서, 상기 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MXI1), 크루펠-연관 박스(KRAB) 도메인, 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2) 또는 4개의 이어진 mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 Treg.
  36. 제35항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 Treg.
  37. 제1항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  38. 제37항에 있어서, 상기 복수의 표적 유전자 중 하나는 TNFRSF4이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과는 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  39. 제12항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  40. 제39항에 있어서, 상기 복수의 표적 유전자 중 하나는 PRDM1이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과는 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자-조절 시스템은 복수의 gRNA 분자를 포함하는, 변형된 Treg.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 형질주입, 형질도입, 전기천공, 또는 마이크로유체 디바이스(microfluidics device)에 의한 세포막의 물리적 파괴에 의해서 상기 Treg에 도입되는, 변형된 Treg.
  43. 제42항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 시스템의 1종 이상의 성분, 단백질 또는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 도입되는, 변형된 Treg.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제 기능은 Treg 증식, Treg 생존력, Treg 안정성, 면역억제 사이토카인의 발현 또는 분비 증가(선택적으로 상기 면역억제 사이토카인은 IL-10임), Foxp3 및 Helios의 공발현 증가 및/또는 소진에 대한 저항성으로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  45. 제44항에 있어서, Treg 안정성은 IL-6과의 시험관내 배양 동안 평가되는, 변형된 Treg.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 표면 상에서 제시되는 조작된 면역 수용체를 더 포함하는, 변형된 Treg.
  47. 제46항에 있어서, 상기 조작된 면역 수용체는 항원-결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)인, 변형된 Treg.
  48. 제47항에 있어서, 상기 조작된 면역 수용체는 조작된 T 세포 수용체(TCR)인, 변형된 Treg.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 수용체는 표적 세포 상에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는, 변형된 Treg.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Treg는 인간 Treg인, 변형된 Treg.
  51. 변형된 Treg로서, 비변형된 Treg 내의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능에 비해서 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되, 상기 하나 이상의 내인성 유전자는 TNFRSF4를 포함하고, 상기 하나 이상의 내인성 유전자의 상기 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 Treg의 면역억제 기능을 향상시키는, 변형된 Treg.
  52. 변형된 Treg로서, 비변형된 Treg 내의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능에 비해서 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되, 상기 하나 이상의 내인성 유전자는 PRDM1을 포함하고, 상기 하나 이상의 내인성 유전자의 상기 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 Treg의 면역억제 기능을 향상시키는, 변형된 Treg.
  53. 변형된 Treg로서, 비변형된 Treg 내의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능에 비해서 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되, 상기 하나 이상의 내인성 유전자는 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 내인성 유전자의 상기 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 Treg의 면역억제 기능을 향상시키는, 변형된 Treg.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 표면 상에서 제시되는 조작된 면역 수용체를 더 포함하는, 변형된 Treg.
  55. 제54항에 있어서, 상기 조작된 면역 수용체는 CAR 또는 조작된 TCR인, 변형된 Treg.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 조작된 면역 수용체는 표적 세포 상에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는, 변형된 Treg.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, TNFRSF4의 감소된 발현을 더 포함하는, 변형된 Treg.
  58. 제57항에 있어서, TNFRSF4의 감소된 발현 및/또는 기능 및 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 Treg.
  59. 제58항에 있어서, TNFRSF4의 감소된 발현 및/또는 기능 및 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 Treg.
  60. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, PRDM1의 감소된 발현을 더 포함하는, 변형된 Treg.
  61. 제60항에 있어서, PRDM1의 감소된 발현 및/또는 기능 및 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 Treg.
  62. 제61항에 있어서, PRDM1의 감소된 발현 및/또는 기능 및 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 Treg.
  63. 제1항 또는 제13항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 siRNA 및 shRNA로부터 선택된 핵산을 포함하는, 변형된 Treg.
  64. 제63항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 더 감소시킬 수 있는, 변형된 Treg.
  65. 제63항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 복수의 siRNA 또는 shRNA를 포함하되, 적어도 1종의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  66. 제65항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 Treg.
  67. 제63항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 복수의 siRNA 또는 shRNA를 포함하되, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP2로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  68. 제67항에 있어서, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과는 PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  69. 제63항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 복수의 siRNA 또는 shRNA를 포함하되, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP2로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  70. 제69항에 있어서, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나는 PRDM1이고, 상기 복수의 표적 유전자 중 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 초과는 TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 및 ADNP로부터 선택되는, 변형된 Treg.
  71. 제51항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Treg는 인간 Treg인, 변형된 Treg.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항의 변형된 Treg를 포함하는, 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109 또는 1×1010개의 변형된 Treg를 포함하는, 조성물.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 투여를 필요로 하는 대상체에게 투여하기에 적합한, 조성물.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 필요로 하는 대상체로부터 유래된 자가유래 Treg를 포함하는, 조성물.
  76. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 공여자 대상체로부터 유래된 동종이계 Treg를 포함하는, 조성물.
  77. 유전자-조절 시스템으로서, 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있되, 상기 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  78. 제77항에 있어서, 상기 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  79. 유전자-조절 시스템으로서, 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있되, 상기 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  80. 제79항에 있어서, 상기 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  81. 유전자-조절 시스템으로서, 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있되, 상기 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소 단백질; 또는 (iii) 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  82. 제81항에 있어서, 상기 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 유전자-조절 시스템.
  84. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질인, 유전자-조절 시스템.
  85. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제 돌연변이체인, 유전자-조절 시스템.
  86. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 비활성화된 Cas 단백질(dCas)이고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합되는, 유전자-조절 시스템.
  87. 제86항에 있어서, 상기 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MXI1), 크루펠-연관 박스(KRAB) 도메인 및 4개의 이어진 mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  88. 제77항, 제79항 및 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 핵산 분자를 포함하고, 상기 핵산 분자는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA인, 유전자-조절 시스템.
  89. 제77항, 제79항 및 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함하고, 아연 핑거 뉴클레아제 및 전사-활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(transcription-activator-like 효과기 nuclease: TALEN)로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  90. 제77항 내지 제89항 중 어느 한 항의 유전자-조절 시스템을 포함하는, 키트.
  91. gRNA 핵산 분자로서, 내인성 표적 유전자 내의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인 핵산 서열을 포함하되, 상기 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4인, gRNA 핵산 분자.
  92. gRNA 핵산 분자로서, 내인성 표적 유전자 내의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인 핵산 서열을 포함하되, 상기 내인성 표적 유전자는 PRDM1인, gRNA 핵산 분자.
  93. gRNA 핵산 분자로서, 내인성 표적 유전자 내의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인 핵산 서열을 포함하되, 상기 내인성 표적 유전자는 REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, 및 ADNP2로부터 선택되는, gRNA 핵산 분자.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 서열은 PAM 서열을 포함하는, gRNA 분자.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 모듈식(modular) gRNA 분자인, gRNA 분자.
  96. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 이중 gRNA 분자인, gRNA 분자.
  97. 제91항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 길이인, gRNA 분자.
  98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 5' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형 및/또는 3' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 3' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형을 포함하는, gRNA 분자.
  99. 제98항에 있어서, 상기 변형된 gRNA는 T 세포 내에 도입될 때 뉴클레아제에 대한 증가된 안정성을 나타내는, gRNA 분자.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 변형된 gRNA는 T 세포 내에 도입될 때 감소된 선천 면역 반응을 나타내는, gRNA 분자.
  101. 제91항 내지 제100항 중 어느 한 항의 gRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  102. 제91항 내지 제100항 중 어느 한 항으로부터 선택된 복수의 gRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  103. 제91항 내지 제100항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 gRNA 분자 또는 제101항 또는 제102항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  104. 제91항 내지 제100항 중 어느 한 항의 gRNA 분자 또는 제101항 또는 제102항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
  105. 변형된 Treg의 생산 방법으로서,
    대상체로부터 Treg를 얻는 단계;
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg에 도입하는 단계로서, 상기 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함하는, 상기 도입하는 단계; 및
    상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 Treg에 비해서 감소되도록 상기 Treg를 배양하는 단계
    를 포함하는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  106. 변형된 Treg의 생산 방법으로서,
    대상체로부터 Treg를 얻는 단계;
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg에 도입하는 단계로서, 상기 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 및
    상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 Treg에 비해서 감소되도록 상기 Treg를 배양하는 단계
    를 포함하는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  107. 변형된 Treg의 생산 방법으로서,
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg에 도입하는 단계를 포함하되, 상기 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함하는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  108. 변형된 Treg의 생산 방법으로서,
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg에 도입하는 단계를 포함하되, 상기 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함하는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  109. 제105항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 제74항 내지 제86항 중 어느 한 항으로부터 선택되는 것인, 변형된 Treg의 생산 방법.
  110. 제105항 또는 제108항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 및 TCR로부터 선택된 조작된 면역 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계를 더 포함하는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템 및/또는 상기 조작된 면역 수용체를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 형질주입, 형질도입, 전기천공, 또는 마이크로유체 디바이스에 의한 세포막의 물리적 파괴에 의해서 상기 Treg에 도입되는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  112. 제107항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 단백질로서 또는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 도입되는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  113. 변형된 Treg의 생산 방법으로서,
    Treg의 집단을 얻는 단계;
    상기 Treg의 집단을 확장시키는 단계; 및
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg의 집단에 도입하는 단계
    를 포함하되, 상기 유전자-조절 시스템은 TNFRSF4를 포함하는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 확장 이전에 상기 Treg의 집단에 도입되는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  115. 제113항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 확장 이후에 상기 Treg의 집단에 도입되는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  116. 변형된 Treg의 생산 방법으로서,
    Treg의 집단을 얻는 단계;
    상기 Treg의 집단을 확장시키는 단계; 및
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg의 집단에 도입하는 단계
    를 포함하되, 상기 유전자-조절 시스템은 PRDM1을 포함하는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 Treg의 생산 방법
  117. 제113항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 확장 이전에 상기 Treg의 집단에 도입되는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  118. 제113항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 확장 이후에 상기 Treg의 집단에 도입되는, 변형된 Treg의 생산 방법.
  119. 제105항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Treg는 인간 Treg인, 변형된 Treg의 생산 방법.
  120. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항의 변형된 Treg 또는 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료하는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 자가면역 장애인, 치료하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 자가면역 장애는 자가면역 간염, 염증성 잘 질환(IBD), 크론병, 대장염, 궤양성 대장염, 1형 당뇨병, 원형 탈모증, 혈관염, 측두성 관절염, 루푸스, 셀리악병(celiac disease), 쇼그렌 증후군(Sjogrens syndrome), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatica), 다발성 경화증, 관절염, 류마티스성 관절염, 이식편대숙주병(graft versus host disease: GVHD) 및 건선인, 치료하는 방법.
  123. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 Treg는 상기 대상체에 대해서 자가유래인, 치료하는 방법.
  124. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 Treg는 상기 대상체에 대해서 동종이계(allogeneic)인, 치료하는 방법.
  125. Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법으로서,
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg에 도입하는 단계로서, 상기 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함하는, 상기 도입하는 단계; 및
    상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 Treg에 비해서 감소되도록 상기 Treg를 배양하는 단계
    를 포함하되, 상기 변형된 Treg는 변형되지 않은 Treg에 비해서 하나 이상의 향상된 면역억제 기능을 나타내는, Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법.
  126. Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법으로서,
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg에 도입하는 단계로서, 상기 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 및
    상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 Treg에 비해서 감소되도록 상기 Treg를 배양하는 단계
    를 포함하되, 상기 변형된 Treg는 변형되지 않은 Treg에 비해서 하나 이상의 향상된 면역억제 기능을 나타내는, Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법.
  127. Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법으로서,
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg에 도입하는 단계를 포함하되, 상기 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 TNFRSF4를 포함하는, Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법.
  128. Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법으로서,
    유전자-조절 시스템을 상기 Treg에 도입하는 단계를 포함하되, 상기 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 PRDM1을 포함하는, Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법.
  129. 제125항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역억제 기능은 Treg 증식, Treg 생존력, Treg 안정성, 면역억제 사이토카인의 발현 또는 분비 증가(선택적으로 상기 면역억제 사이토카인은 IL-10임), Foxp3 및 Helios의 공발현 증가 및/또는 소진에 대한 저항성으로부터 선택되는, Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법.
  130. 제129항에 있어서, Treg 안정성은 IL-6과의 시험관내 배양 동안 평가되는, Treg의 하나 이상의 면역억제 기능을 향상시키는 방법.
  131. 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항의 변형된 Treg 또는 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  132. 제131항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 자가면역 간염, 염증성 잘 질환(IBD), 크론병, 대장염, 궤양성 대장염, 1형 당뇨병, 원형 탈모증, 혈관염, 측두성 관절염, 루푸스, 셀리악병, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 경화증, 관절염, 류마티스성 관절염, 이식편대숙주병(GVHD) 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  133. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 Treg는 조직-상주(tissue-resident) Treg인, 변형된 Treg.
  134. 제105항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Treg는 조직-상주 Treg인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022226163A1 (en) * 2021-02-23 2023-09-28 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for expanding regulatory t cells
WO2022198055A1 (en) * 2021-03-19 2022-09-22 KSQ Therapeutics, Inc. Uses of antagonist, non-depleting ox40 antibodies
WO2023141531A2 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Orthobio Therapeutics, Inc. Transmembrane receptor gene editing
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Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100136030A1 (en) * 2007-02-27 2010-06-03 Lamhamedi-Cherradi Salah-Eddine Antagonist ox40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases
US10968426B2 (en) * 2015-05-08 2021-04-06 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
KR20240000616A (ko) * 2016-04-15 2024-01-02 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 유전자이식 t 세포 및 키메라 항원 수용체 t 세포 조성물 및 관련 방법
MA46770A (fr) * 2016-11-09 2019-09-18 Agenus Inc Anticorps anti-ox40, anticorps anti-gitr, et leurs procédés d'utilisation
US20200085758A1 (en) * 2016-12-16 2020-03-19 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
EP3641789A4 (en) * 2017-06-22 2021-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System REGULATORY IMMUNE CELL PRODUCTION PROCESSES AND THEIR USES
WO2019217423A1 (en) * 2018-05-07 2019-11-14 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modifying regulatory t cells
WO2019237391A1 (zh) * 2018-06-16 2019-12-19 深圳市博奥康生物科技有限公司 CRISPR/Cas9 靶向敲除人 TXGP1 基因及其特异性 gRNA

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