BR112021014442A2 - Composições de regulação gênica e métodos para imunoterapia aprimorada - Google Patents

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Jason Merkin
Noah Jacob Tubo
James Martin Kaberna Ii
Solomon Martin Shenker
Kerem Jonatan Tuncel
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Abstract

composições de regulação gênica e métodos para imunoterapia. a presente invenção refere-se a métodos e composições relacionadas à modificação de tregs para aumentar a eficácia terapêutica. em algumas modalidades, são fornecidas tregs modificadas para reduzir a expressão de um ou mais genes alvo endógenos ou para reduzir uma ou mais funções de uma proteína endógena para aumentar as funções imunossupressoras das células imunes. em algumas modalidades, são fornecidas tregs modificadas adicionalmente pela introdução de transgenes que conferem especificidade ao antígeno, como receptores de células t exógenos (tcrs) ou receptores de antígeno quiméricos (cars). também são fornecidos métodos de tratamento de doenças autoimunes descritos neste documento usando as tregs modificadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- SIÇÕES DE REGULAÇÃO GÊNICA E MÉTODOS PARA IMUNOTE- RAPIA APRIMORADA".
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A divulgação se refere a métodos, composições e compo- nentes para editar uma sequência de ácido nucleico alvo ou modular a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo e suas aplicações em conexão com imunoterapia, incluindo o uso com células T regula- doras (opcionalmente células T reguladoras receptoras manipuladas) no tratamento de doenças autoimunes.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] Respostas inadequadas ou exageradas do sistema imuno- lógico causam vários sintomas para os organismos afetados, incluindo distúrbios autoimunes. A transferência de células adotivas utilizando células T geneticamente modificadas, em particular as células CAR-T, entrou em testes clínicos como um terapêutico para malignidades sóli- das e hematológicas. E a transferência de células adotivas tem o po- tencial de utilidade em doenças diferentes do câncer, como doenças autoimunes. No entanto, os fatores que limitam a eficácia das células imunes geneticamente modificadas incluem (1) proliferação celular, por exemplo, proliferação limitada de células T após a transferência adotiva; (2) sobrevida das células, por exemplo, indução da apoptose das células T; e (3) função das células, por exemplo, inibição da fun- ção das células T por fatores inibidores e exaustão das células imunes durante os processos de fabricação e/ou após a transferência. Há es- paço considerável para crescimento na utilização de células T adoti- vas, particularmente no tratamento de doenças autoimunes, e existe uma necessidade de melhorar a eficácia da transferência adotiva de células imunes modificadas no tratamento de doenças autoimunes.
SUMÁRIO
[0003] Um aspecto da invenção divulgado neste documento se refere a uma célula T reguladora (Treg) que compreende um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos compreendendo TNFRSFA4, em que a expressão e/ou função reduzida do um ou mais genes endóge- nos aumenta a função imunossupressora de Treg. Um aspecto da in- venção divulgado neste documento se refere a uma Treg modificada em que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endóge- nos compreendendo TNFRSF4 foi reduzida por um sistema de regula- ção de genes, e em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aumenta uma função imunossupressora de Treg.
[0004] Um aspecto da invenção divulgado neste documento se refere a uma Treg que compreende um sistema de regulação de ge- nes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos compreendendo PRDM1, em que a expressão e/ou função reduzida do um ou mais genes endógenos aumenta a função imunossupressora de Treg. Um aspecto da invenção divulgado neste documento se refere a uma Treg modificada em que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos compreendendo PRDM1 foi reduzida por um sistema de regulação de genes, e em que a ex- pressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos au- menta uma função imunossupressora de Treg.
[0005] Um aspecto da invenção divulgado neste documento se refere a uma Treg modificada compreendendo um sistema de regula- ção de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSFA4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP, em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aumenta uma função imunossupressora de Treg. Um aspecto da invenção divulgado neste documento se refere a uma Treg modificada em que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSFA4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP foi reduzida por um sistema de regulação de gene, e em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endó- genos aumenta uma função imunossupressora de Treg.
[0006] Em certas modalidades, o sistema de regulação de genes compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma proteína en- zimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzi- mática. Em uma modalidade, o sistema de regulação de genes com- preende uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir de um SIRNA, um shRNA, um microRNA (miR), um antagomiR ou um RNA antisense. Em uma modalidade, o sistema de regulação de genes compreende uma proteína enzimática e em que a proteína enzimática foi manipulada para se ligar especificamente a uma sequência alvo em um ou mais dos genes endógenos. Em algumas modalidades, a prote- ína é uma nuclease com efetores do tipo ativador transcricional (TA- LEN), uma nuclease de dedo de zinco ou uma meganuclease.
[0007] Em uma modalidade, o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico guia e uma proteína en- zimática, em que a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNA guia (gRNA) e a proteína enzimática é uma proteína Cas ou um ortólogo Cas. Em uma modalidade, a proteína Cas é uma proteína Cas9. Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas de tipo selvagem que compreende dois domínios enzimaticamente ati- vos e capaz de induzir quebras de DNA de fita dupla. Em modalida- des, a proteína Cas é uma mutante de Cas nickase compreendendo um domínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples. Em uma modalidade, a proteína Cas é uma proteína Cas desativada (dCas) e está associada a uma proteína heteróloga capaz de modular a expressão de um ou mais genes alvo endógenos. Em algumas modalidades, a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em proteína 1 de interação com MAX (MXI1), domínio de caixa associada a Krúppel (KRAB), proteína 2 de ligação a metil-CpG (MECP2) e quatro domínios mSin3 concatenados (SID4X).
[0008] Em modalidades, o sistema regulador de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais genes alvo endógenos.
[0009] Em modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSFA4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo menos 2, 3,4, 5,6 ou mais genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
[0010] Em uma modalidade, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de ge- nes alvo endógenos, em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é TNFRSF4 e em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é selecionado a partir de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP. Em uma modalidade, um da pluralidade de genes alvo é TNFRSF4 e em que pelo menos 2, 3,4,5, 6 ou mais da pluralidade de genes alvo são selecionados de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
[0011] Em uma modalidade, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de ge-
nes alvo endógenos, em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é PRDM1 e em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é selecionado a partir de TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP. Em uma modalidade, um da plurali- dade de genes alvo é PRDM1 e em que pelo menos 2, 3, 4, 5,6 ou mais da pluralidade de genes alvo são selecionados de TNFRSFA, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
[0012] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma pluralidade de moléculas de gRNA. Em outras modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na Treg por transfecção, transdução, eletroporação ou interrupção física da membrana celular por um dispositivo microfluídico. Em algumas moda- lidades, o sistema de regulação de genes é introduzido como um poli- nucleotídeo que codifica um ou mais componentes do sistema, uma proteína ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
[0013] Em certas modalidades, a função imunossupressora é se- lecionada dentre proliferação de Treg, viabilidade de Treg, estabilidade de Treg, expressão ou secreção aumentada de uma citocina imunos- supressora, opcionalmente em que a citocina imunossupressora é IL- 10, coexpressão aumentada de Foxp3 e Helios e/ou resistência à exa- ustão. Em uma modalidade, a Treg modificada compreende ainda um receptor imune manipulado exibido na superfície da célula. Em algu- mas modalidades, o receptor imune manipulado é um receptor de an- tígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação ao an- tígeno, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização in- tracelular.
[0014] Em certas modalidades, o receptor imune manipulado é um receptor de células T manipulado (TCR). Em uma modalidade, o re- ceptor imune manipulado se liga especificamente a um antígeno ex- presso em uma célula alvo.
[0015] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refere- se a uma Treg modificada compreendendo expressão e/ou função redu- zida de um ou mais genes endógenos em relação à expressão e/ou fun- ção de um ou mais genes endógenos em uma Treg não modificada, em que um ou mais genes endógenos compreendem TNFRSF4 e em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aumenta uma função imunossupressora da Treg.
[0016] Um aspecto da invenção divulgado neste documento se refere a uma Treg modificada compreendendo expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos em relação à expressão e/ou função de um ou mais genes endógenos em uma Treg não modi- ficada, em que um ou mais genes endógenos compreendem PRDM1 e em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endó- genos aumenta uma função imunossupressora da Treg.
[0017] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a uma Treg modificada compreendendo expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos em relação à expressão e/ou função de um ou mais genes endógenos em uma Treg não modi- ficada, em que um ou mais genes endógenos são selecionados do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP e em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aumenta uma fun- ção imunossupressora da Treg.
[0018] Em algumas modalidades, a Treg modificada compreende ainda um receptor imune manipulado exibido na superfície celular. Em algumas modalidades, o receptor imune manipulado é um CAR ou TCR manipulado. Em uma modalidade, o receptor imune manipulado se liga especificamente a um antígeno expresso em uma célula alvo.
[0019] Em uma modalidade, a Treg modificada compreende ainda expressão reduzida de TNFRSF4. Em uma modalidade, a Treg modifi-
cada compreende expressão e/ou função reduzida de TNFRSF4 e ex- pressão e/ou função reduzida de pelo menos um gene alvo selecionado de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK1I6 e ADNP. Em uma modalidade, a Treg modificada compreende expres- são reduzida e/ou função de TNFRSF4 e expressão reduzida e/ou função de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais genes alvo selecionados do grupo que consiste em PRDM1, REEP3, MRPL32 , FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
[0020] Em uma modalidade, a Treg modificada compreende ainda expressão reduzida de PRDM1. Em uma modalidade, a Treg modifi- cada compreende expressão e/ou função reduzida de PRDM1 e ex- pressão e/ou função reduzida de pelo menos um gene alvo seleciona- do de TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP. Em uma modalidade, a Treg modificada compreende expressão reduzida e/ou função de PRDM1 e expressão reduzida e/ou função de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais genes alvo selecionados do grupo que consiste em TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
[0021] Em modalidades, o sistema de regulação de genes com- preende uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir de um SIRNA e um shRNA. Em certas modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz ainda de reduzir a expressão de um ou mais genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSFA4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK1I6 e ADNP. Em uma modalidade, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de genes alvo endógenos e compreende uma pluralidade de siRNAs ou shRNAs, em que pelo menos um gene alvo endógeno é selecionado a partir do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
[0022] Em certas modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo menos 2, 3,4, 5,6 ou mais genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP. Em uma modalidade, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma plurali- dade de genes alvo endógenos e compreende uma pluralidade de SIiRNAs ou shrnaS, em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é TNFRSF4 e em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é selecionado a partir de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP?2. Em certas modalidades, pelo menos um da pluralidade de genes alvo é TNFRSF4 e pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais da pluralidade de genes alvo são selecionados de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK1I6 e ADNP. Em outra modalidade, o sistema de regulação de genes é ca- paz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de genes alvo endógenos e compreende uma pluralidade de siRNAs ou shR- NAs, em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é PRDM1 e em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é selecionado a partir de TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP2. Em uma modalidade, pelo menos um da pluralidade de genes alvo é PRDM1 e em que pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais da pluralidade de genes alvo são selecionados de TNFRSFA4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
[0023] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a uma composição compreendendo uma Treg modificada divul- gada neste documento. Em uma modalidade, a composição compre- ende pelo menos 1 x 10º, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 10º, ou 1 x 10ºº Tregs modificadas. Em certas modalidades, a composição é adequada para administração a um indivíduo em necessidade desta.
Em algumas modalidades, a composição compreende Tregs autólogas derivadas do indivíduo em necessidade. Em uma modalidade, a com- posição compreende Tregs alogênicas derivadas de um indivíduo do- ador.
[0024] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expres- são de um ou mais genes alvo endógenos em uma célula, em que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma pro- teína enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteí- na enzimática, e em que um ou mais genes alvo endógenos compre- endem TNFRSF4. Em algumas modalidades, o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico de RNA guia (gRNA) e uma endonu- clease Cas.
[0025] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expres- são de um ou mais genes alvo endógenos em uma célula, em que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma pro- teína enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteí- na enzimática, e em que um ou mais genes alvo endógenos compre- endem PRDM1. Em algumas modalidades, o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico de RNA guia (gRNA) e uma endonu- clease Cas.
[0026] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expres- são e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos em uma célula, em que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma proteína enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática, e em que um ou mais genes alvo endógenos são selecionados do grupo que consiste em REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP2. Em algumas moda-
lidades, o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico de RNA guia (gRNA) e uma endonuclease Cas.
[0027] Qualquer proteína Cas, incluindo aquelas fornecidas neste documento, pode ser usada. Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9. Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas de tipo selvagem que compreende dois domínios enzi- maticamente ativos e capaz de induzir quebras de DNA de fita dupla. Em modalidades, a proteína Cas é uma mutante de Cas nickase com- preendendo um domínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples. Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas desativada (dCas) e está associada a uma proteína heteróloga capaz de modular a expressão de um ou mais ge- nes alvo endógenos.
[0028] Em uma modalidade, a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em proteína 1 de interação com MAX (MXI1), domínio de caixa associada a Krúppel (KRAB) e quatro domí- nios mSin3 concatenados (SID4X).
[0029] Em uma modalidade, o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico e em que a molécula de ácido nucleico é um siRNA, um shRNA, um microRNA (miR), um antagomiR ou um RNA antisen- se.
[0030] Em algumas modalidades, o sistema compreende uma pro- teína compreendendo um domínio de ligação ao DNA e um domínio enzimático e é selecionado a partir de uma nuclease de dedo de zinco e uma nuclease com efetores do tipo ativador transcricional (TALEN).
[0031] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um kit que compreende um sistema de regulação de genes aqui divulgado.
[0032] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a uma molécula de ácido nucleico de gRNA que compreende uma sequência de ácido nucleico de domínio de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo em um gene alvo endógeno, em que o gene alvo endógeno é TNFRSFA4. Um aspecto da invenção di- vulgado neste documento refere-se a uma molécula de ácido nucleico de gRNA compreendendo uma sequência de ácido nucleico de domí- nio de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo em um gene alvo endógeno, em que o gene alvo endógeno é PRDM1. Um aspecto da invenção divulgado neste documento refere-se a uma mo- lécula de ácido nucleico de gRNA que compreende uma sequência de ácido nucleico de domínio de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo em um gene alvo endógeno, em que o gene alvo endógeno é selecionado de REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP?2.
[0033] Em algumas modalidades, a sequência alvo compreende uma sequência PAM. Em certas modalidades, o gRNA é uma molécu- la de gRNA modular. Em uma modalidade, o gRNA é uma molécula de gRNA dupla. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento possui 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a molécula de gRNA compre- ende uma modificação na ou próxima a extremidade 5' (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 5') e/ou uma modificação na ou próxima a extremidade 3' (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 3').
[0034] Em algumas modalidades, o gRNA modificado exibe maior estabilidade em relação às nucleases quando introduzido em uma cé- lula T. Em algumas modalidades, o gRNA modificado exibe uma res- posta imune inata reduzida quando introduzido em uma célula T.
[0035] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a uma molécula polinucleotídica que codifica uma molécula de gRNA aqui divulgada. Um aspecto da invenção divulgado neste docu-
mento refere-se a uma molécula polinucleotídica que codifica uma plu- ralidade de moléculas de gRNA aqui divulgadas.
[0036] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a uma composição compreendendo uma ou mais moléculas de gRNA divulgadas neste documento ou um polinucleotídeo divulgado neste documento. Um aspecto da invenção divulgado neste documen- to refere-se a um kit compreendendo uma molécula de gRNA aqui di- vulgada ou um polinucleotídeo aqui divulgado.
[0037] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de produção de uma Treg modificada que compre- ende: a obtenção de uma Treg de um indivíduo; introdução de um sis- tema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, e em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem TNFRSFA4; e cultivo da Treg de modo que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos seja reduzida em comparação a uma Treg que não foi modificada.
[0038] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de produção de uma Treg modificada que compre- ende: a obtenção de uma Treg de um indivíduo; introdução de um sis- tema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, e em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem PRDM1; e cultivo da Treg de modo que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos seja reduzida em comparação a uma Treg que não foi modificada.
[0039] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de produção de uma Treg modificada compreen- dendo: a introdução de um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expres-
são e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem TNFRSF4. Um aspecto da invenção divulgado neste documento refere-se a um método de pro- dução de uma Treg modificada compreendendo: a introdução de um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regula- ção de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endóge- nos compreendem PRDM1.
[0040] Em modalidades, o sistema de regulação de genes é qual- quer sistema divulgado neste documento. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a introdução de uma sequência polinucleo- tídica que codifica um receptor imune manipulado selecionado a partir de um CAR e um TCR. Em algumas modalidades, o sistema de regu- lação de genes e/ou o polinucleotídeo que codifica o receptor imune manipulado são introduzidos na Treg por transfecção, transdução, ele- troporação ou ruptura física da membrana celular por um dispositivo microfluídico. Em uma modalidade, o sistema de regulação de genes é introduzido como uma sequência polinucleotídica que codifica um ou mais componentes do sistema, tal como uma proteína ou como um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
[0041] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de produção de uma Treg modificada que compre- ende: obtenção de uma população de Tregs; expansão da população de Tregs; e introdução um sistema de regulação de genes na popula- ção de Tregs, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos compreendendo TNFRSF4. Em modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de Tregs antes da expansão. Em uma modalidade, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de Tregs após a expansão.
[0042] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de produção de uma Treg modificada que compre- ende: obtenção de uma população de Tregs; expansão da população de Tregs; e introdução um sistema de regulação de genes na popula- ção de Tregs, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos compreendendo PRDM1. Em uma modalidade, o sistema de regula- ção de genes é introduzido na população de Tregs antes da expansão. Em modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de Tregs após a expansão.
[0043] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade deste, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma Treg modificada divulgada neste do- cumento ou de uma composição divulgada neste documento.
[0044] Em modalidades, a doença ou distúrbio é um distúrbio au- toimune. Em modalidades, o distúrbio autoimune é hepatite autoimune, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn, colite, colite ul- cerativa, diabetes tipo 1, alopecia areata, vasculite, artrite temporal, lúpus, doença celíaca, síndrome de Sjogren, polimialgia reumática, esclerose múltipla, artrite, artrite reumatoide, doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) ou psoríase. Em certas modalidades, o distúrbio autoimune é uma doença inflamatória intestinal (IBD), por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa. Em certas modalidades, o dis- túrbio autoimune é lúpus eritematoso sistêmico. Em certas modalida- des, o distúrbio autoimune é uma resposta autoimune associada a um transplante de órgão sólido, por exemplo, GVHD. Em certas modalida- des, as Tregs modificadas são autólogas para o indivíduo. Em uma modalidade, as Tregs modificadas são alogênicas para o indivíduo.
[0045] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe-
re-se a um método para aumentar uma ou mais funções imunossu- pressoras de uma Treg compreendendo: a introdução de um sistema de regulação de gene na Treg, em que o sistema de regulação de ge- ne é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, e em que um ou mais genes alvo endógenos com- preendem TNFRSFA; e cultivo da Treg de modo que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos seja reduzida em com- paração com uma Treg que não foi modificada, em que a Treg modifi- cada demonstra uma ou mais funções imunossupressoras aumenta- das em comparação à Treg que não foi modificada.
[0046] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método para aumentar uma ou mais funções imunossu- pressoras de uma Treg compreendendo: a introdução de um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais ge- nes alvo endógenos, e em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem PRDM1; e cultivo da Treg de modo que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos seja reduzida em comparação com uma Treg que não foi modificada, em que a Treg modificada demonstra uma ou mais funções imunossupressoras au- mentadas em comparação à Treg que não foi modificada.
[0047] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de potencialização de uma ou mais funções imu- nossupressoras de uma Treg compreendendo: a introdução de um sis- tema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem TNFRSFA4.
[0048] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de potencialização de uma ou mais funções imu-
nossupressoras de uma Treg compreendendo: a introdução de um sis- tema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem PRDM1.
[0049] Em modalidades, as uma ou mais funções imunossupres- soras são selecionadas dentre proliferação de Treg, viabilidade de Treg, estabilidade de Treg, expressão ou secreção aumentada de uma citocina imunossupressora, opcionalmente em que a citocina imunos- supressora é IL-10, coexpressão aumentada de Foxp3 e Helios e/ou resistência à exaustão.
[0050] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de potencialização de uma ou mais funções imu- nossupressoras de uma Treg compreendendo: a introdução de um sis- tema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endógenos compreen- dem TNFRSF4 e em que a introdução do sistema de regulação de genes não aumenta a estabilidade da Treg. A estabilidade da Treg pode ser avaliada, por exemplo, medindo a metilação de Foxp3 TSDR.
[0051] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de potencialização de uma ou mais funções imu- nossupressoras de uma Treg compreendendo: a introdução de um sis- tema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem PRDM1 e em que a introdução do sistema de regulação de genes aumenta a estabilidade da Treg. A estabilidade da Treg pode ser avaliada, por exemplo, medindo a metilação de Foxp3 TSDR.
[0052] Assim, por exemplo, a introdução do sistema de regulação de genes pode aumentar a porcentagem de Foxp3 TSDR desmetilado em pelo menos 10%, em pelo menos 15%, em pelo menos 20% ou em pelo menos 25%. A introdução do sistema de regulação de genes po- de aumentar a porcentagem de Foxp3 TSDR desmetilado em 10-50% 10-30%, 15-50%, 15-30% 20-50%, 20-30%, 25-50% ou 25-30%.
[0053] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade deste, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma Treg modificada divulgada neste do- cumento ou da composição divulgada neste documento. Em modali- dades, a doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em: hepatite autoimune, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn, colite, colite ulcerativa, diabetes tipo 1, alopecia areata, vasculi- te, artrite temporal, lúpus, doença celíaca, síndrome de Sjogren, poli- mialgia reumática, esclerose múltipla, artrite, artrite reumatoide, doen- ça do enxerto contra hospedeiro (GVHD) e psoríase. Em certas moda- lidades, o distúrbio autoimune é uma doença inflamatória intestinal (IBD), por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa. Em certas modalidades, o distúrbio autoimune é lúpus eritematoso sistêmico.
[0054] Um aspecto da invenção divulgado neste documento refe- re-se a um método de tratamento de uma resposta autoimune associ- ada a um transplante de órgão sólido, por exemplo, GVHD, em um in- divíduo em necessidade deste, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma Treg modificada divulgada neste do- cumento ou da composição divulgada neste documento.
[0055] Em alguns aspectos, a Treg modificada é uma Treg resi- dente em tecido. Em alguns aspectos, a Treg é uma Treg residente em tecido.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0056] A Fig. 1 resume os alvos seletivos para Treg identificados por meio de triagem genômica funcional de CRISPR/Cas9 in vitro.
[0057] A Fig. 2A e a Fig. 2B ilustram a edição dos genes Foxp3 e CDA45 em células Treg humanas usando métodos descritos neste do- cumento.
[0058] A Fig. 32A e a Fig. 3B demonstram capacidade proliferativa melhorada de células Treg com PRDM1 e TNFRSF editado em um sistema de cultura in vitro.
[0059] A Fig. 4A e a Fig. 4B demonstram o aumento da proporção de células Foxp3*Helios* em células Treg com PRDM1 editado em um sistema de cultura in vitro.
[0060] A Fig. 5 demonstra que a desmetilação de Foxp3 da região desmetilada específica de Treg (TSDR), uma medida de estabilidade de Treg, é mantida em células Treg com TNFRSFA4 editado e é au- mentada em células Treg com PRDM1 editado.
[0061] A Fig. 68A e a Fig. 68B demonstram o aumento da produção da interleucina-10 citocina imunossupressora em células Treg com PRDM1 e TNFRSF editado em um sistema de cultura in vitro.
[0062] A Fig. TA e a Fig. 7B demonstram que as células Treg com PRDM1 editado persistem sob condições inflamatórias.
[0063] A Fig. 8 demonstra que as capacidades supressivas das Tregs com PRDM1 e TNFRSF4 editado são comparáveis àquelas das Tregs com controle editado.
[0064] A Fig. 9A demonstra que o tratamento de camundongos com Tregs com PRDM1 e TNFRSF4 editados exibem sobrevida au- mentada em relação a camundongos tratados com Tregs com controle editado em um modelo de GvHD.
[0065] A Fig. 9B demonstra capacidade proliferativa reduzida de células T CD8+ efetoras como consequência do tratamento com Treg.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0066] A presente divulgação fornece métodos e composições re-
lacionados à modificação de células T reguladoras (Treg) para aumen- tar sua eficácia terapêutica no contexto de imunoterapia para doenças autoimunes. Em algumas modalidades, as Tregs são modificadas pe- los métodos da presente divulgação para reduzir a expressão de um ou mais genes alvo endógenos ou reduzir uma ou mais funções de uma proteína endógena, de modo que uma ou mais funções imunos- supressoras das células imunes sejam potencializadas. Em algumas modalidades, as Tregs são ainda modificadas pela introdução de transgenes que conferem especificidade ao antígeno, como a introdu- ção de construtos de expressão do receptor de células T (TOR) ou re- ceptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, a pre- sente divulgação fornece composições e métodos para modificar Tregs, tal como composições de sistemas de regulação de genes. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de tra- tamento de um distúrbio autoimune, compreendendo a administração das Tregs modificadas descritas neste documento a um indivíduo em necessidade destas. |. Definições
[0067] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindica- ções anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem refe- rências plurais a menos que o contexto indique claramente de outra forma.
[0068] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "e/ou" é usado nesta divulgação para significar "e" ou "ou", a menos que indi- cado de outra forma.
[0069] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que o contexto requeira o contrário, a palavra "compreender" ou variações, tais como "compreende" ou "compreendendo" será entendida como implicando na inclusão de um elemento citado ou número inteiro ou grupos de elementos ou números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números intei- ros.
[0070] Conforme utilizado neste pedido, os termos "cerca de" e "aproximadamente" são usados como equivalentes. Quaisquer nume- rais usados neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente des- tinam-se a abranger quaisquer flutuações normais apreciadas por al- guém com habilidade comum na técnica relevante. Em algumas moda- lidades, o termo "aproximadamente" ou "cerca de" refere-se a uma fai- xa de valores que se enquadra dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em qualquer direção (maior que ou menor que) do valor declarado de referência, salvo especificação em contrário ou salvo evidência a partir do contexto (exceto onde tal número exceder 100% de um valor possível).
[0071] "Diminuir" ou "reduzir" refere-se a uma diminuição ou redu- ção em um valor específico de pelo menos 5%, por exemplo, uma di- minuição de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou 100% em comparação com um valor de referência. Uma di- minuição ou redução em um valor específico também pode ser repre- sentada como um fold change no valor em comparação com um valor de referência, por exemplo, uma diminuição de pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 vezes ou mais em comparação com um valor de referência.
[0072] "Aumento" refere-se a um aumento em um valor específico de pelo menos 5%, por exemplo, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com um valor de referência. Um aumento em um va-
lor específico também pode ser representado como um fold change no valor comparado a um valor de referência, por exemplo, um aumento de pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 vezes ou mais em comparação com o nível de um valor de referência.
[0073] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são utili- zados neste documento de forma intercambiável e referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos quimi- camente ou bioquimicamente modificados ou derivatizados e polipep- tídeos com estruturas principais de peptídeo modificadas.
[0074] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico", usados nes- te documento de forma intercambiável, referem-se a uma forma poli- mérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam ribonucleotí- deos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, esse termo inclui, mas não se limita a, DNA ou RNA de fita simples, dupla ou múltiplas, DNA genô- mico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero compreendendo purina e bases de pirimidina ou outras bases nucleotídicas derivadas, não naturais quimicamente ou bioquimicamente modificadas. "Oligo- nucleotídeo" geralmente se refere a polinucleotídeos entre cerca de 5 e cerca de 100 nucleotídeos de DNA de fita simples ou dupla. No en- tanto, para os fins desta divulgação, não há limite superior para o comprimento de um oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos também são conhecidos como "oligômeros" ou "oligos" e podem ser isolados de genes ou sintetizados quimicamente por métodos conhecidos na técnica. Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" devem ser en- tendidos como incluindo, conforme aplicável à modalidade sendo des- crita, polinucleotídeos de fita simples (tais como sense ou antisense) e de fita dupla.
[0075] "Fragmento" refere-se a uma porção de uma molécula poli-
peptídica ou polinucleotídica contendo menos do que toda a sequência polipeptídica ou polinucleotídica. Em algumas modalidades, um frag- mento de um polipeptídeo ou polinucleotídeo compreende pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de todo o comprimento do polipeptídeo ou polinucleotí- deo de referência. Em algumas modalidades, um fragmento de polinu- cleotídeo ou polipeptídeo pode conter 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos.
[0076] O termo "identidade de sequência" refere-se à porcentagem de bases ou aminoácidos entre duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas que são iguais e na mesma posição relativa. Como tal, uma sequência polinucleotídica ou polipeptídica possui uma certa por- centagem de identidade de sequência em comparação com outra se- quência polinucleotídica ou polipeptídica. Para comparação de se- quências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. O termo "sequência de referência" refere-se a uma molécula à qual uma sequência de teste é comparada.
[0077] "Complementar" refere-se à capacidade de emparelhamen- to, através do empilhamento de bases e ligação específica de hidrogê- nio, entre duas sequências que compreendem bases naturais ou não naturais ou análogos destas. por exemplo, se uma base em uma posi- ção de um ácido nucleico é capaz de ligação de hidrogênio com uma base na posição correspondente de um alvo, então as bases são con- sideradas complementares uma à outra nessa posição. Os ácidos nu- cleicos podem compreender bases universais ou espaçadores abási- cos inertes que não fornecem contribuição positiva ou negativa para a ligação de hidrogênio. Os emparelhamentos de bases podem incluir tanto o emparelhamento de base Watson-Crick canônico quanto não-
Watson-Crick (por exemplo, emparelhamento de base Wobble e em- parelhamento de base Hoogsteen). Entende-se que, para emparelha- mentos de bases complementares, bases do tipo adenosina (A) são complementares às bases do tipo timidina (T) ou bases do tipo uracila (U), que as bases do tipo citosina (C) são complementares às bases do tipo guanosina (L), e que as bases universais, tais como, 3-nitropirrolo ou o-nitroindole pode hibridar e são consideradas complementares a qual- quer A, C, U, ou T. Nichols et a/., Nature, 1994;369:492-493 and Loa- kes et al., Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-4043. A inosina (|) tam- bém foi considerada na técnica como uma base universal e é conside- rada complementar a qualquer A, C, U ou T. Ver Watkins and Santa Lucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33 (19): 6258-6267.
[0078] Como referido neste documento, uma "sequência de ácido nucleico complementar" é uma sequência de ácido nucleico que com- preende uma sequência de nucleotídeos que permite a ligação não covalente a outro ácido nucleico de uma maneira antiparalela específi- ca de sequência (ou seja, um ácido nucleico especificamente liga-se a um ácido nucleico complementar) sob condições apropriadas in vitro e/ou in vivo de temperatura e resistência de solução iônica.
[0079] Os métodos de alinhamento de sequência para compara- ção e determinação da porcentagem de identidade de sequência e porcentagem de complementaridade são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser condu- zido, por exemplo, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela busca pelo método de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, por implementações computadorizadas desses al- goritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madi- son, WI), por alinhamento manual e inspeção visual (consulte por exemplo, Brent et a/., (2003) Current Protocols in Molecular Biology), pelo uso de algoritmos conhecidos na técnica, incluindo os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et a/., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; e Altschul et a/., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. O programa para a realização de análises por BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information.
[0080] Aqui, o termo "hibridizar" refere-se ao emparelhamento en- tre bases nucleotídicas complementares (por exemplo, adenina (A) forma um par de bases com timina (T) em uma molécula de DNA e uracila (U) em uma molécula de RNA e guanina (G) forma um par de bases com citosina (C) nas moléculas de DNA e RNA) para formar uma molécula de ácido nucleico de fita dupla. (Ver, por exemplo, Wahl e Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, AR (1987) Me- thods Enzymol. 152: 507). Além disso, também é conhecido na técnica que, para hibridação entre duas moléculas de RNA (por exemplo, dsRNA), pares de bases de guanina (G) com uracila (U). por exemplo, o emparelhamento de bases G/U é parcialmente responsável pela de- generescência (isto é, redundância) do código genético no contexto do emparelhamento de bases anticódon de tRNA com códons no mRNA. No contexto desta divulgação, uma guanina (G) de um segmento de ligação a proteínas (dsRNA duplex) de uma molécula de RNA guia é considerada complementar a uma uracila (U) e vice-versa. Como tal, quando um par de bases G/U pode ser feito em uma determinada po- sição nucleotídica, um segmento de ligação a proteínas (ASRNA du- plex) de uma molécula de RNA guia, a posição não é considerada não complementar e sim como sendo complementar. É compreendido na técnica que a sequência do polinucleotídeos não precisa de ser 100% complementar a do seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável. Além disso, um polinucleotídeo pode hibridar sobre um ou mais segmentos, de tal modo que os segmentos intervenientes ou ad- jacentes não estejam envolvidos no evento de hibridação (por exem- plo, uma estrutura de hairpin ou estrutura de loop). Um polinucleotídeo pode compreender pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, ou 100% de complementari- dade de sequência com uma região alvo dentro da sequência de ácido nucleico alvo à qual eles são direcionados.
[0081] O termo "modificado" refere-se a uma substância ou com- posto (por exemplo, uma célula, uma sequência polinucleotídica e/ou uma sequência polipeptídica) que foi alterada ou alterou em compara- ção com a substância ou composto não modificado correspondente.
[0082] O termo "ocorrência natural" tal como utilizado neste docu- mento aplicado a um ácido nucleico, um polipeptídeo, uma célula ou um organismo, refere-se a um ácido nucleico, polipeptídeo, célula ou organismo que é encontrado na natureza. por exemplo, uma sequên- cia de polipeptídeo ou polinucleotídeo, que está presente em um orga- nismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo homem em laboratório, ocorre naturalmente.
[0083] "Isolado" refere-se a um material que é livre em graus vari- ados de componentes que normalmente o acompanham como encon- trado em seu estado nativo.
[0084] Um "cassete de expressão" ou "construto de expressão" refere-se a uma sequência de polinucleotídeos de DNA operacional- mente ligada a um promotor. "Operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da sua maneira pretendida. por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma se- quência polinucleotídica se o promotor afeta a transcrição ou a ex- pressão da sequência polinucleotídica.
[0085] O termo "vetor recombinante", conforme utilizado neste do- cumento, refere-se a uma molécula de polinucleotídeo capaz de trans- ferir ou transportar outro polinucleotídeo inserido no vetor. O polinucle- otídeo inserido pode ser uma cassete de expressão. Em algumas mo- dalidades, um vetor recombinante pode ser um vetor viral ou um vetor não viral (por exemplo, um plasmídeo).
[0086] O termo "amostra" refere-se a uma composição biológica (por exemplo, uma célula ou uma porção de um tecido) que é subme- tida a análise e/ou modificação genética. Em algumas modalidades, uma amostra é uma "amostra primária", na medida em que é obtida diretamente de um indivíduo; em algumas modalidades, uma "amos- tra" é o resultado do processamento de uma amostra primária, por exemplo, para remover certos componentes e/ou isolar ou purificar certos componentes de interesse.
[0087] O termo "indivíduo" inclui animais, como, por exemplo, mamíferos. Em algumas modalidades, o mamífero é um primata. Em algumas modalidades, o mamífero é um humano. Em algumas moda- lidades, os indivíduos são animais de pecuário, tais como gado, ove- Ilhas, cabras, vacas, suínos e similares; ou animais domesticados, tais como cães e gatos. Em algumas modalidades (por exemplo, particu- larmente em contextos de pesquisa) os indivíduos são roedores (por exemplo, camundongos, ratos, hamsters), coelhos, primatas ou suí- nos, tais como porcos endocruzados e semelhantes. Os termos "indi- víduo" e "paciente" são usados de forma intercambiável neste docu- mento.
[0088] "Administração" se refere neste documento a introduzir um agente ou composição em um indivíduo.
[0089] "Tratamento", conforme usado neste documento, refere-se a distribuir um agente ou composição a um indivíduo para afetar um resultado fisiológico.
[0090] Conforme usado neste documento, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade mínima de um agente ou composição necessária para resultar em um efeito fisiológico específico. A quanti- dade eficaz de um agente específico pode ser representada em uma variedade de maneiras com base na natureza do agente, tal como massa/volume, número de células/volume, partículas/volume (massa do agente)/(massa do indivíduo), número de células/(massa do indiví- duo) ou partículas/(massa do indivíduo). A quantidade eficaz de um determinado agente também pode ser expressa como a metade da concentração máxima efetiva (ECso), que se refere à concentração de um agente que resulta na magnitude de uma resposta fisiológica es- pecífica que é a mediana entre um nível de referência e um nível má- ximo de resposta.
[0091] "População" de células refere-se a qualquer número de cé- lulas maior que 1, mas é preferencialmente pelo menos 1x10º células, pelo menos 1x10º células, pelo menos 1x10º células, pelo menos 1x106 células, pelo menos 1x107 células, pelo menos 1x108 células, pelo menos 1x10º células, pelo menos 1x10*º células. Uma população de células pode se referir a uma população in vitro (por exemplo, uma população de células em cultura) ou a uma população in vivo (por exemplo, uma população de células que residem em um tecido especí- fico).
[0092] Métodos gerais em bioquímica molecular e celular podem ser encontrados em textos padrão, tais como Molecular Cloning: A La- boratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al., John Wiley et al. & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Aca- demic Press 1995); Immunology Methods Manual (1. Lefkovits ed.,
Academic Press 1997); e Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedu- res in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), as divulgações destas sendo incorporadas neste documento por referên- cia. II. Células T reguladoras modificadas
[0093] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece células T reguladoras modificadas (Tregs). Neste documento, o termo "Tregs modificadas" abrange células Treg compreendendo uma ou mais modificações genômicas resultando na expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes alvo endógenos, bem como Tregs compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos. Neste documento, uma "Treg não modificada" ou "Treg controle" refere-se a uma célula ou população de células em que os genomas não foram modificados e que não compreende um sistema de regulação de ge- nes ou que compreende um sistema de regulação de genes controle (por exemplo, um controle de vetor vazio, um gRNA não direcionado, um siRNA embaralhado etc.). Em algumas modalidades, a Treg ou a Treg modificada pode ser uma Treg residente em tecido.
[0094] Em algumas modalidades, a Treg modificada é uma célula animal ou é derivada de uma célula animal, incluindo animais inverte- brados e animais vertebrados (por exemplo, peixe, anfíbio, réptil, pás- saro ou mamífero). Em algumas modalidades, a Treg modificada é uma célula de mamífero ou é derivada de uma célula de mamífero (por exemplo, um porco, uma vaca, uma cabra, uma ovelha, um roedor, um primata não humano, um humano etc.). Em algumas modalidades, a Treg modificada é uma célula de roedor ou é derivada de uma célula de roedor (por exemplo, um rato ou um camundongo). Em algumas modalidades, a Treg modificada é uma célula humana ou é derivada de uma célula humana.
[0095] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compre- endem uma ou mais modificações (por exemplo, inserções, deleções ou mutações de um ou mais ácidos nucleicos) na sequência de DNA genômico de um gene alvo endógeno, resultando na expressão e/ou função reduzida do gene endógeno. Em tais modalidades, as Tregs modificadas compreendem um "gene alvo endógeno modificado". Em algumas modalidades, as modificações na sequência de DNA genômi- co reduzem ou inibem a transcrição de mMRNA, reduzindo assim o nível de expressão do transcrito de mMRNA codificado e da proteína. Em al- gumas modalidades, as modificações na sequência de DNA genômico reduzem ou inibem a tradução de mRNA, reduzindo assim o nível de expressão da proteína codificada. Em algumas modalidades, as muta- ções na sequência de DNA genômico codificam uma proteína endóge- na modificada com função reduzida ou alterada em comparação com a versão não modificada (isto é, do tipo selvagem) da proteína endógena (por exemplo, uma mutante dominante negativa, descrito infra).
[0096] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compre- endem uma ou mais modificações genômicas em um local genômico que não seja um gene alvo endógeno que resultam na expressão e/ou função reduzida do gene alvo endógeno ou que resultam na expressão de uma versão modificada de uma proteína endógena. por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência polinucleotídica que codifica um sistema de regulação de genes é inserida em um ou mais locais no genoma, reduzindo assim a expressão e/ou função de um gene alvo endógeno mediante a expressão do sistema de regulação de genes. Em algumas modalidades, uma sequência polinucleotídica que codifi- ca uma versão modificada de uma proteína endógena é inserida em um ou mais locais no genoma, em que a função da versão modificada da proteína é reduzida em comparação com a versão não modificada ou do tipo selvagem da proteína (por exemplo, uma mutante dominan-
te negativa, descrito infra).
[0097] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento compreendem um ou mais genes alvo endógenos modificados, em que uma ou mais modificações resultam em uma ex- pressão e/ou função reduzida de um produto gênico (ou seja, um transcrito de MRNA ou uma proteína) codificado pelo gene alvo endó- geno comparado a uma Treg não modificada. por exemplo, em algu- mas modalidades, uma Treg modificada demonstra expressão reduzi- da de um transcrito de MRNA e/ou expressão reduzida de uma proteí- na. Em algumas modalidades, a expressão do produto gênico em uma Treg modificada é reduzida em pelo menos 5% em comparação à ex- pressão do produto gênico em uma Treg não modificada. Em algumas modalidades, a expressão do produto gênico em uma Treg modificada é reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação à expressão do produto gênico em uma Treg não modificada. Em algumas modalidades, as Tregs modifi- cadas descritas neste documento demonstram expressão reduzida e/ou função de produtos gênicos codificados por uma pluralidade (por exemplo, dois ou mais) de genes alvo endógenos em comparação à expressão dos produtos gênicos em uma Treg não modificada. por exemplo, em algumas modalidades, uma Treg modificada demonstra expressão e/ou função reduzida de produtos gênicos de 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10 ou mais genes alvo endógenos em comparação à expressão dos produtos gênicos em uma Treg não modificada.
[0098] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece uma Treg modificada em que um ou mais genes alvo endógenos, ou uma porção deles, são deletados (ou seja, "nocauteados") de modo que a Treg modificada não expresse o transcrito ou proteína de MRNA. Em algumas modalidades, uma Treg modificada compreende a deleção de uma pluralidade de genes alvo endógenos ou porções destes. Em algumas modalidades, uma Treg modificada compreende a deleção de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes alvo endógenos.
[0099] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento compreendem um ou mais genes alvo endógenos modificados, em que uma ou mais modificações na sequência de DNA alvo resultam na expressão de uma proteína com função reduzida ou alterada (por exemplo, uma "proteína endógena modificada") em com- paração à função da proteína correspondente expressa em uma Treg não modificada (por exemplo, uma "proteína endógena não modifica- da"). Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descrita neste documento compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes alvos endógenos modificados que codificam 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais proteínas endógenas modificadas. Em algumas modalidades, a proteí- na endógena modificada demonstra uma afinidade de ligação reduzida ou alterada para com outra proteína expressa pela Treg modificada ou expressa por outra célula; capacidade de sinalização reduzida ou alte- rada; atividade enzimática reduzida ou alterada; atividade de ligação ao DNA reduzida ou alterada; ou capacidade reduzida ou alterada de funcionar como uma proteína de andaime.
[00100] Em algumas modalidades, o gene alvo endógeno modifica- do compreende uma ou mais mutações negativas dominantes. Con- forme utilizado neste documento, uma "mutação dominante negativa" refere-se a uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais nu- cleotídeos de um gene alvo, de modo que a proteína codificada atue de maneira antagônica à proteína codificada pelo gene alvo não modi- ficado. A mutação é dominante negativa porque o fenótipo negativo confere dominância gênica sobre o fenótipo positivo do gene não mo- dificado correspondente. Um gene compreendendo uma ou mais mu- tações dominantes negativas e a proteína codificada por elas é referi- do como "mutantes dominantes negativos", por exemplo, genes domi-
nantes negativos e proteínas dominantes negativas. Em algumas mo- dalidades, a proteína mutante dominante negativa é codificada por um transgene exógeno inserido em um ou mais locais no genoma da Treg.
[00101] São conhecidos vários mecanismos para a negatividade dominante. Tipicamente, o produto gênico de um mutante dominante negativo retém algumas funções do produto gênico não modificado, mas carece de uma ou mais outras funções cruciais do produto gênico não modificado. Isso faz com que o mutante dominante negativo anta- gonize o produto gênico não modificado. por exemplo, como uma mo- dalidade ilustrativa, um mutante dominante negativo de um fator de transcrição pode não ter um domínio de ativação funcional, mas reter um domínio de ligação ao DNA funcional. Neste exemplo, o fator de transcrição dominante negativo não ativa a transcrição do DNA, como faz o fator de transcrição não modificado, mas o fator de transcrição dominante negativo pode inibir indiretamente a expressão gênica, im- pedindo o fator de transcrição não modificado de ligar ao sítio de liga- ção do fator de transcrição. Como outra modalidade ilustrativa, são conhecidas mutações dominantes negativas de proteínas que funcio- nam como dímeros. Mutantes dominantes negativos de tais proteínas diméricas podem reter a capacidade de dimerizar com proteína não modificada, mas não podem funcionar de outra maneira. Os monôme- ros dominantes negativos, por dimerização com monômeros não modi- ficados para formar heterodímeros, impedem a formação de homodií- meros funcionais dos monômeros não modificados.
[00102] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compre- endem um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expres- são ou função de um ou mais genes alvo endógenos. O sistema de regulação de genes pode reduzir a expressão e/ou função das modifi- cações dos genes alvo endógenos por uma variedade de mecanismos, incluindo a modificação da sequência de DNA genômico do gene alvo endógeno (por exemplo, por inserção, deleção ou mutação de um ou mais ácidos nucleicos na sequência de DNA genômico); regulando a transcrição do gene alvo endógeno (por exemplo, inibição ou repres- são da transcrição de mMRNA); e/ou regulando a tradução do gene alvo endógeno (por exemplo, por degradação do mRNA).
[00103] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento compreendem um sistema regulador de genes (por exemplo, um sistema de regulação de genes à base de ácido nucleico, um sistema regulador de genes à base de proteína ou um sistema re- gulador de genes à base de ácido nucleico/combinação de proteína. Em tais modalidades, o sistema de regulação de genes compreendido na Treg modificada é capaz de modificar um ou mais genes alvo en- dógenos. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento compreendem um sistema de regulação de genes que compreende: (a) uma ou mais moléculas de ácido nucleico capazes de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codi- ficado por um ou mais genes alvo endógenos; (b) um ou mais polinucleotídeos que codificam uma molé- cula de ácido nucleico que é capaz de reduzir a expressão ou modifi- car a função de um produto gênico codificado por um ou mais genes alvo endógenos; (c) uma ou mais proteínas de ácido nucleico capazes de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codi- ficado por um ou mais genes endógenos alvo; (d) um ou mais polinucleotídeos que codificam uma prote- ína que é capaz de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codificado por um ou mais genes alvo endógenos; (e) um ou mais RNAs guias (gRNAs) capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(f|) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(g) um ou mais polipeptídeos modificadores sítio-dirigidos, capazes de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(h) um ou mais polinucleotídeos que codificam um poli- peptídeo modificador sítio-dirigido, capaz de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(i). um ou mais DNAs guia (gDNAs) capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(])) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gDNAs capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(K) um ou mais polipeptídeos modificadores sítio-dirigidos, capazes de interagir com um gDNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(1) um ou mais polinucleotídeos que codificam um poli- peptídeo modificador sítio-dirigido, capaz de interagir com um gDNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(m) um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma se- quência de mRNA codificada por um gene endógeno;
(n) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequência de mMRNA codifica- da por um gene endógeno;
(o) um ou mais polipeptídeos modificadores sítio-dirigidos, capazes de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de MRNA codificada por um gene endógeno;
(p) um ou mais polinucleotídeos que codificam um poli- peptídeo modificador sítio-dirigido, capaz de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de mRNA alvo codificado por um gene endó- geno; ou (q) qualquer combinação dos citados acima.
[00104] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam o sistema de regulação de genes são inseridos no genoma da Treg. Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam o sistema de regulação de genes são expressos de modo epissomal e não são inseridos no genoma da Treg.
[00105] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes alvo endógenos e compreendem ainda um ou mais transgenes exógenos inseridos em um ou mais loci genômicos (por exemplo, um "knock-in" genético). Em algumas modalidades, um ou mais transgenes exógenos codificam tags detectáveis, sistemas de switch de segurança, receptores de switch quiméricos e/ou receptores específicos de antígeno manipulados.
[00106] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento compreendem ainda um transgene exógeno que co- difica uma tag detectável. Exemplos de tags detectáveis incluem, entre outros, tags FLAG, tags poli-histidina (por exemplo, 6xHis), tags SNAP, tags Halo, tags cMyc, tags glutationa-S-transferase, avidina, enzimas, proteínas fluorescentes, proteínas luminescentes, quimiolu- minescentes proteínas, proteínas bioluminescentes e proteínas fosfo- rescentes. Em algumas modalidades, a proteína fluorescente é seleci- onada do grupo que consiste em proteínas azuis/UV (como BFP, TagBFP, mTagBFP2, Azurita, EBFP2, mKalama1, Sirius, Sapphire e T-Sapphire); proteínas ciano (como CFP, eCFP, Cerúleo, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, Midoriishi-cCyan monomérico, TagCFP e mMTFP1); proteínas verdes (como: GFP, eGFP, meGFP (mutação A2Z08K), Emerald, Superfolder GFP, Azami Green Monomérico,
TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover e mNeonGreen); proteínas ama- relas (como YFP, eYFP, Citrino, Venus, SYFP2 e TagYFP); proteínas alaranjadas (como Kusabira-Orange monomérica, MKOK, mKO2, mO- range e mOrange2); proteínas vermelhas (como RFP, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby e mRuby2); proteínas distantes do espectro vermelho (como mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune e NIirFP); proteí- nas próximas ao espectro infravermelho (como TagRFP657, IFP1.4 e iRFP); proteínas de grande deslocamento de Stokes (como mKeima Red, LSS-mKate1, LSS-mKate2 e mBeRFP); proteínas fotoativáveis (como PA-GFP, PAmCherry1 e PATagRFP); proteínas fotoconversí- veis (como Kaede (verde), Kaede (vermelho), KikKGR1 (verde), KIkKGR1 (vermelho), PS-CFP2, PS-CFP2, mEos2 (verde), mEos2 (vermelho), mEos3.2 (verde), mEos3.2 (vermelho), PSmOrange e PSmOrange); e proteínas fotoconversíveis (como Dronpa). Em algumas modalidades, a tag detectável pode ser selecionada de AmCyan, AsRed, DsRed2, DsRed Express, E2-Crimson, HcRed, ZsGreen, ZsYellow, mCherry, mStrawberry, mOrange, mBanana, mPlum, mRasberry, tdTomato, DsRed Monomer e/ou ACGFP, todas disponibilizadas por Clontech.
[00107] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento compreendem ainda um transgene exógeno que co- difica um sistema de switch de segurança. Os sistemas de switch de segurança (também referidos na técnica como sistemas de genes sui- cidas) compreendem transgenes exógenos que codificam a uma ou mais proteínas que permitem a eliminação de uma Treg modificada após a célula ter sido administrada a um indivíduo. Exemplos de sis- temas de switch de segurança são conhecidos na técnica. por exem- plo, os sistemas de switch de segurança incluem genes que codificam para as proteínas que convertem pró-drogas não tóxicas em compos- tos tóxicos, como o sistema Herpes simplex timidina quinase (Hsv-tk) e o sistema ganciclovir (GCV) (Hsv-tk/GCV). O Hsv-tk converte o GCV não tóxico em um composto citotóxico que leva à apoptose celular. Como tal, a administração de GCV a um indivíduo que foi tratado com Tregs modificadas compreendendo um transgene que codifica a prote- ína de Hsv-tk pode eliminar seletivamente as Tregs modificadas, pou- pando as Tregs endógenas. (Ver, por exemplo, Bonini et a/., Science, 1997, 276 (5319): 1719-1724; Ciceri et al., Blood, 2007, 109 (11): 1828-1836; Bondanza et a/., Blood 2006, 107 (5): 1828-1836).
[00108] Os sistemas adicionais de switch de segurança incluem ge- nes que codificam para marcadores de superfície celular, permitindo a eliminação de Tregs modificadas pela administração de um anticorpo monoclonal específico para o marcador de superfície celular através de ADCC. Em algumas modalidades, o marcador da superfície celular é CD20 e as Tregs modificadas podem ser eliminadas pela adminis- tração de um anticorpo monoclonal anti-CD20, como o Rituximab (ver, por exemplo, Introna et al., Hum Gene Ther, 2000, 11 (4). ): 611-620; Serafini et al., Hum Gene Ther, 2004, 14, 63-76; van Meerten et al, Gene Ther, 2006, 13, 789-797). Sistemas similares usando EGF-R e Cetuximabe ou Panitumumabe são descritos na Publicação Internaci- onal PCT n.º WO 2018006880. Sistemas de switch de segurança adi- cionais incluem transgenes que codificam moléculas pró-apoptóticas compreendendo um ou mais sítios de ligação para um indutor químico de dimerização (CID), permitindo a eliminação de células efetoras imunes modificadas pela administração de um CID que induz a oligo- merização das moléculas pró-apoptóticas e ativação da via da apopto- se. Em algumas modalidades, a molécula pró-apoptótica é Fas (tam- bém conhecida como CD95) (Thomis et a/., Blood, 2001, 97 (5), 1249- 1257). Em algumas modalidades, a molécula pró-apoptótica é a cas- pase-9 (Straathof et al., Blood, 2005, 105 (11), 4247-4254).
[00109] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento compreendem ainda um transgene exógeno que co- difica um receptor de switch quimérico. Receptores de switch quiméri- cos são receptores de superfície celular manipulados que compreen- dem um domínio extracelular de um receptor endógeno da superfície celular e um domínio de sinalização intracelular heterólogo, de modo que o reconhecimento de ligantes pelo domínio extracelular resulta na ativação de uma cascata de sinalização diferente daquela ativada pela forma de tipo selvagem do receptor da superfície celular. Em algumas modalidades, o receptor de switch quimérico compreende o domínio extracelular de um receptor inibidor da superfície celular fundido com um domínio intracelular que leva à transmissão de um sinal de ativa- ção em vez do sinal inibitório normalmente transduzido pelo receptor inibidor da superfície celular. Em modalidades particulares, os domí- nios extracelulares derivados de receptores de superfície celular co- nhecidos por inibir a ativação da Treg podem ser fundidos à ativação de domínios intracelulares. O engajamento do ligante correspondente ativará então as cascatas de sinalização que aumentam, em vez de inibir, a ativação da célula efetora imune.
[00110] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento compreendem ainda um receptor específico do antí- geno manipulado que reconhece uma proteína alvo expressa por uma célula alvo, aqui referida como "células modificadas com receptor ma- nipulado" ou "células RE modificadas". O termo "receptor de antígeno manipulado" refere-se a um receptor específico de antígeno que não ocorre naturalmente, como um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T recombinante (TOR). Em algumas modali- dades, o receptor de antígeno manipulado é um CAR compreendendo um domínio de ligação ao antígeno extracelular fundido através de domínios de dobradiça e de transmembrana a um domínio citoplasmá- tico que compreende um domínio de sinalização. Em algumas modali-
dades, o domínio extracelular do CAR se liga a um antígeno expresso por uma célula alvo de maneira independente de MHC, levando à ati- vação e proliferação da célula RE. Em algumas modalidades, o domí- nio extracelular de um CAR reconhece uma tag fundida com um anti- corpo ou fragmento de ligação ao antígeno desta. Em tais modalida- des, a especificidade de antígeno do CAR é dependente da especifici- dade de antígeno do anticorpo marcado, de modo que um único cons- truto de CAR possa ser usado para atingir vários antígenos diferentes, substituindo um anticorpo por outro (Ver, por exemplo, Patentes US n.º
9.233.125 e 9.624.279; Publicações de Pedido de Patente US n.º 20150238631 e 20180104354). Em algumas modalidades, o domínio extracelular de um CAR pode compreender um fragmento de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo. Os domínios de ligação ao an- tígeno que são úteis na presente divulgação incluem, por exemplo, scFvs; anticorpos; regiões de ligação ao antígeno de anticorpos; regi- ões variáveis das cadeias pesada/leve; e anticorpos de cadeia única.
[00111] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intrace- lular de um CAR pode ser derivado da cadeia zeta do complexo TOR (como domínios de sinalização de CD38), FeyRIIl, FeeRI ou o domínio de ativação de linfócitos T. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um CAR compreende ainda um domínio co- estimulatório, por exemplo, um domínio 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 ou CD70. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um CAR compreende dois domínios co-estimulatórios, por exemplo, quaisquer dois dos domínios 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 ou CD70. Es- truturas de CAR exemplares e domínios de sinalização intracelular são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, WO 2009/091826; US 2013 0287748; WO 2015/142675; WO 2014/055657; e WO 2015/090229, incorporados neste documento por referência).
[00112] CARs específicos para antígenos relevantes para doenças autoimunes (por exemplo, GVHD, colite e esclerose múltipla) são dis- cutidos, por exemplo, em Zhang et al., Frontiers in Immunology 9: 1-8 (2018); Int'l Publ. n.º WO2017218850A1; e McDonald et al., JCI 2016; 126 (4): 1413-1424, cada um dos quais é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.
[00113] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno manipu- lado é um TCR manipulado. Os TOCORs manipulados compreendem ca- deias de TORa e/ou TCRB que foram isoladas e clonadas a partir de populações de células T que reconhecem um antígeno alvo específico. por exemplo, os genes TCRa e/ou TCRB (isto é, TRAC e TRBC) po- dem ser clonados a partir de populações de células T isoladas de indi- víduos com determinadas doenças ou populações de células T que foram isoladas de camundongos humanizados imunizados com tipos de células. Os TORs manipulados reconhecem o antígeno através dos mesmos mecanismos que os seus homólogos endógenos (por exem- plo, pelo reconhecimento de seu antígeno cognato apresentado no contexto das principais proteínas do complexo principal de histocom- patibilidade -MHC-, expressas na superfície da célula alvo). Esse en- gajamento antigênico estimula as vias endógenas de transdução de sinal, levando à ativação e proliferação das células manipuladas pelo TCR. A. Funções imunossupressoras
[00114] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento demonstram um aumento em uma ou mais funções imunossupressoras, incluindo a geração, manutenção e/ou intensifica- ção de uma função imunossupressora. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento demonstram uma ou mais das seguintes características em comparação à uma Treg não modificada: proliferação aumentada, viabilidade celular aumentada ou prolongada, estabilidade melhorada, função imunossupressora melho-
rada ou produção aumentada de fatores de imunidade imunossupres- sores (por exemplo, citocinas anti-inflamatórias).
[00115] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento demonstram um aumento na proliferação celular em comparação à uma Treg não modificada. Nessas modalidades, o re- sultado é um aumento no número de Tregs modificadas presentes em comparação à Tregs não modificadas após um determinado período de tempo. por exemplo, em algumas modalidades, as Tregs modifica- das demonstram taxas aumentadas de proliferação em comparação às Tregs não modificadas, em que as Tregs modificadas se dividem a uma taxa mais rápida do que as Tregs não modificadas. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas demonstram um aumento de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8,9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes na taxa de proliferação em comparação à uma Treg não modificada. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas demonstram períodos prolongados de proliferação em comparação à Tregs não modificadas, em que as Tregs modificadas e as Tregs não modificadas se dividem em taxas semelhantes, mas em que as Tregs modificadas mantêm o estado proliferativo por um período de tempo mais longo. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas mantêm um estado proliferativo 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes maior do que uma célula imune não modificada.
[00116] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento demonstram viabilidade celular aumentada ou pro- longada em comparação à uma Treg não modificada. Em tais modali- dades, o resultado é um aumento no número de Tregs modificadas ou presentes em comparação à Tregs não modificadas após um determi- nado período de tempo. Em algumas modalidades, as Tregs modifica-
das mantêm descritas neste documento permanecem viáveis e persis- tem por um período de tempo 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes maior do que uma célula imune não modificada.
[00117] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento demonstram resistência aumentada à exaustão de Treg em comparação à uma Treg não modificada. Em algumas moda- lidades, um aumento de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes na produção de citocinas a partir das células efetoras imunes modificadas em comparação à produção de citocinas da população controle das células imunes é indicativo de um aumento de resistência à exaustão de células T. Em algumas modali- dades, a resistência à exaustão de células T é demonstrada pelo au- mento da proliferação das células efetoras imunes modificadas em comparação à proliferação observada da população controle das célu- las imunes. Em algumas modalidades, um aumento de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes na prolife- ração das células efetoras imunes modificadas em comparação à proli- feração da população controle de células imunes é indicativo de um aumento da resistência à exaustão de células T.
[00118] Em algumas modalidades, a exaustão das Tregs modifica- das em comparação às populações controle das células imunes é me- dida durante o processo de fabricação in vitro ou ex vivo.
[00119] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento demonstram um aumento da expressão ou produção de fatores imunes anti-inflamatórios em comparação à uma Treg não modificada. Exemplos de fatores imunes anti-inflamatórios ou imunos-
supressores incluem citocinas anti-inflamatórias ou imunossupresso- ras, como IL-10. Em modalidades, as Tregs modificadas descritas nes- te documento demonstram uma estabilidade melhorada. Em modali- dades, a estabilidade pode ser avaliada, por exemplo, medindo a meti- lação de Foxp3 TSDR. Em modalidades, as Tregs modificadas descri- tas neste documento demonstram uma função imunossupressora me- lhorada. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento não têm impacto nas citocinas pró-inflamatórias, in- cluindo IL-17A e IFNy.
[00120] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento demonstram expressão aumentada de Foxp3 e/ou Helios em comparação à uma Treg não modificada. Em algumas mo- dalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento demons- tram uma coexpressão aumentada de Foxp3 e Helios em comparação à uma Treg não modificada.
[00121] Os ensaios para medir a função imunossupressora são co- nhecidos na técnica. A expressão do receptor da superfície celular po- de ser determinada por citometria de fluxo, imuno-histoquímica, imuno- fluorescência, Western blot e/ou qPCR. A expressão e produção de citocinas e quimiocinas podem ser medidas por citometria de fluxo, imuno-histoquímica, imunofluorescência, Western blot, ELISA e/ou qPCR. A capacidade de resposta ou sensibilidade a estímulos extrace- lulares (por exemplo, citocinas, ligantes inibidores ou antígeno) pode ser medida avaliando a proliferação e/ou a ativação celular de cami- nhos de sinalização a jusante (por exemplo, fosforilação de intermediá- rios de sinalização a jusante) em resposta aos estímulos. B. Regulação de vias e genes endógenos
[00122] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento demonstram uma expressão ou função reduzida de um ou mais genes alvo endógenos. Em algumas modalidades, um ou mais genes alvo endógenos estão presentes em vias relacionadas ao aumento da função imunossupressora. Em tais modalidades, a ex- pressão ou função reduzida de um ou mais genes alvo endógenos aprimora uma ou mais funções imunossupressoras da célula imune.
[00123] Vias exemplares adequadas para a regulação pelos méto- dos descritos neste documento incluem, por exemplo, proliferação de Treg, viabilidade de Treg, estabilidade de Treg e/ou vias de atividade imunossupressora de Treg. Em algumas modalidades, a expressão de um gene alvo endógeno em uma via específica é reduzida nas Tregs modificadas. Em algumas modalidades, a expressão de uma plurali- dade (por exemplo, duas ou mais) de genes alvo endógenos em uma via específica são reduzidos nas Tregs modificadas. por exemplo, a expressão de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes alvo endógenos em uma via específica pode ser reduzida. Em algumas modalidades, a expressão de um gene alvo endógeno em uma via e a expressão de um gene alvo endógeno em outra via são reduzidas nas células Tregs modificadas. Em algumas modalidades, a expressão de uma plurali- dade de genes alvo endógenos em uma via e a expressão de uma plu- ralidade de genes alvo endógenos em outra via são reduzidas nas cé- lulas Tregs modificadas. por exemplo, a expressão de 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10 ou mais genes alvo endógenos em uma via pode ser reduzida e a expressão de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes alvo endóge- nos em outra via específica podem ser reduzidas.
[00124] Em algumas modalidades, a expressão de uma pluralidade de genes alvo endógenos em uma pluralidade de vias é reduzida. por exemplo, um gene endógeno de cada uma de várias vias (por exem- plo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vias) pode ser reduzido. Em as- pectos adicionais, uma pluralidade de genes endógenos (por exemplo, 2,3,4,5,6,7,8,9, 10 ou mais genes) de cada uma de uma pluralida- de de vias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vias) pode ser reduzida.
[00125] Genes endógenos alvo exemplares são mostrados abaixo na Tabela 1.
[00126] Em algumas modalidades, a expressão de TNFRSF4 é re- duzida. TNFRSF4 também é conhecido como "membro da superfamí- lia 4 do fator de necrose tumoral", "antígeno ACT35", "receptor TNFRSFA4L", "CD134", "OX40" e "receptor de glicoproteína 1 ativada por transcrição de TAX". TNFRSF4 é um receptor para TNFSF4 (tam- bém conhecido como OX40L e GP34). Uma isoforma solúvel de TNFRSF4 humano também foi relatada (Taylor L et al., (2001) J Immunol Methods 255: 67-72).
[00127] Em algumas modalidades, a expressão de PRDM1 é redu- zida. PRDM1 também é conhecido como "proteína dedo de zinco 1 do domínio PR", "BLIMP1", "PRDI-BF1" e "fator de ligação do domínio regulatório positivo | do gene beta-interferon". PRDM1 é um fator de transcrição.
[00128] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um ou mais dentre TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 ou ADNP. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um gene seleciona- do da Tabela 1. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas com- preendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos dois genes selecionados da Tabela 1 (por exemplo, pelo menos dois genes sele- cionados de TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP). Embora métodos exemplares para modificar a expressão de TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, e ADNP descritos neste do- cumento, a expressão desses genes alvo endógenos também pode ser modificada por métodos conhecidos na técnica.
[00129] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão reduzida de TNFRSF4. Em algumas modali- dades, as células efetoras modificadas compreendem expressão redu- zida de PRDM1.
[00130] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão reduzida de TNFRSF4 e um ou mais dentre PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA , LZTS1, CDK16 e ADNP. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compreendem expressão reduzida de um gene selecionado da Tabela 1 e expressão reduzida de TNFRSF4. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão reduzida de PRDM1 e um ou mais dentre TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA , LZTS1, CDK16 e ADNP. Em algumas modalidades, as Tregs modifi- cadas compreendem expressão reduzida de um gene selecionado da Tabela 1 e expressão reduzida de PRDM1. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compreendem expressão reduzida de TNFRSF4 e expressão reduzida de dois genes selecionados da Tabela 1. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compreendem expressão reduzida de PRDM1 e expressão reduzida de dois genes selecionados da Tabela 1. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compre- endem expressão reduzida de uma pluralidade de genes selecionados da Tabela 1 e expressão reduzida de TNFRSF4. Em algumas modali- dades, as Tregs modificadas compreendem expressão reduzida de uma pluralidade de genes selecionados da Tabela 1 e expressão re- duzida de PRDM1. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compreendem expressão reduzida de dois genes selecionados da Ta- bela 1 e expressão reduzida de TNFRSF4. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas compreendem expressão reduzida de dois ge- nes selecionados da Tabela 1 e expressão reduzida de PRDM1. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas podem compreender ex-
pressão reduzida de três ou mais dentre PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA , LZTS1, CDK16 e ADNP e expressão reduzida de TNFRSF4. Em algumas modalidades, as Tregs modificadas podem compreender expressão reduzida de três ou mais dentre TNFRSFA, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA , LZTS1, CDK16 e ADNP e expressão reduzida de PRDM1.
[00131] Em algumas modalidades, a expressão de TNFRSF4 é re- duzida por um sistema de regulação de genes descrito neste docu- mento. Em algumas modalidades, a expressão de PRDM1 é reduzida por um sistema de regulação de genes descrito neste documento. Tabela 1: Genes Endógenos Exemplares Símbolo do Ref. UniProt | Ref. UniProt Nome do gene Gene Humano Murino Proteína dedo de zinco 1 do domínio PRDM1 075626 Q60636
PR Superfamília de receptor do fator de TNFRSF4 P43489 P47741 necrose tumoral, membro 4 Proteína ribossomal L32 39S, mito- MRPL32 Q9BYC8 Q9DCI9 condrial KLC3 Cadeia leve 3 de cinesina Q6P597 Q91W40 Proteína Alfa de Ligação 4 do Com- C4BPA PO04003 PO8607 ponente do Complemento Supressor 1 de tumor putativo com LZTS1 Q9Y250 P60853 zíper de leucina CDK16 Quinase 16 Dependente de Ciclina Q00536 Q04735 Homeobox de neuroprotetor depen- ADNP Q9H2P0 0972103 dente de atividade Ill. Sistemas de regulação de genes
[00132] Neste documento, o termo "sistema de regulação de genes" refere-se a uma proteína, ácido nucleico ou combinação destes que é capaz de modificar uma sequência de DNA alvo endógeno quando in-
troduzida em uma célula, regulando assim a expressão ou função do produto gênico codificado. Numerosos sistemas de edição de genes adequados para uso nos métodos da presente divulgação são conhe- cidos na técnica, incluindo, entre outros, ShRNAs, siRNAs, sistemas de nuclease de dedos de zinco, sistemas de TALEN e sistemas de CRISPR/Cas.
[00133] Conforme usado neste documento, "regular", quando usado em referência ao efeito de um sistema regulador de genes em um ge- ne alvo endógeno engloba qualquer alteração na sequência do gene alvo endógeno, qualquer alteração no estado epigenético do gene alvo endógeno, e/ou qualquer alteração na expressão ou função da proteí- na codificada pelo gene alvo endógeno.
[00134] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes pode mediar uma mudança na sequência do gene alvo endógeno, por exemplo, introduzindo uma ou mais mutações na sequência alvo endógena, tal como por inserção ou deleção de um ou mais ácidos nucleicos na sequência alvo endógena. Mecanismos exemplares que podem mediar alterações da sequência alvo endógena incluem, mas não estão limitados a junção de extremidade não homóloga (NHEJ) (por exemplo, clássica ou alternativa), junção de extremidade mediada por micro-homologia (MMEJ), reparo direcionado por homologia (por exemplo, mediada por modelo de doador endógeno), SDSA (anela- mento de fita dependente da síntese), anelamento de fita simples ou invasão de fita simples.
[00135] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes pode mediar uma mudança no estado epigenético da sequência alvo endógena. por exemplo, em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes pode mediar modificações covalentes do DNA do gene alvo endógeno (por exemplo, metilação e hidroximetilação de citosina) ou de proteínas histonas associadas (por exemplo, acetilação de lisina, metilação de lisina e arginina, fosforilação de serina e treoni- na e ubiquitinação e SUMOilação de lisina).
[00136] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes pode mediar uma mudança na expressão da proteína codificada pelo gene alvo endógeno. Em tais modalidades, o sistema de regula- ção de genes pode regular a expressão da proteína codificada por modificações da sequência de DNA alvo endógena ou agindo no pro- duto de mRNA codificado pela sequência de DNA. Em algumas moda- lidades, o sistema de regulação de genes pode resultar na expressão de uma proteína endógena modificada. Em tais modalidades, as modi- ficações na sequência de DNA endógena mediada pelo sistema de regulação de genes resultam na expressão de uma proteína endógena demonstrando uma função reduzida em comparação com a proteína endógena correspondente em uma Treg não modificada. Em tais mo- dalidades, o nível de expressão da proteína endógena modificada po- de ser aumentado, diminuído ou pode ser o mesmo ou substancial- mente semelhante ao nível de expressão da proteína endógena cor- respondente em uma célula imune não modificada. A. Sistemas de regulação de genes baseados em ácido nucleico
[00137] Conforme utilizado neste documento, um sistema de regu- lação de genes baseado em ácido nucleico é um sistema que compre- ende uma ou mais moléculas de ácido nucleico capazes de regular a expressão de um gene alvo endógeno sem a necessidade de uma pro- teína exógena. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de inter- ferência de RNA ou molécula de RNA antisense que é complementar a uma sequência de ácido nucleico alvo.
[00138] Uma "molécula de RNA antisense" refere-se a uma molécu- la de RNA, independentemente do comprimento, que é complementar a um transcrito de MRNA. Moléculas de RNA antisense se referem a moléculas de RNA de fita simples que podem ser introduzidas em uma célula, tecido ou indivíduo e resultam em diminuição da expressão de um produto gênico alvo endógeno por meio de mecanismos que não dependem de vias endógenas de silenciamento de genes, mas sim na degradação do transcrito de mMRNA alvo mediado por RNaseH. Em algumas modalidades, um ácido nucleico antisense compreende uma estrutura principal modificada, por exemplo, fosforotioato, fosforoditioa- to ou outros conhecidos na técnica ou pode compreender ligações in- ternucleosídicas não naturais. Em algumas modalidades, um ácido nu- cleico antisense pode compreender ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
[00139] "“Molécula de interferência de RNA", conforme utilizado nes- te documento, refere-se a um polinucleotídeo de RNA que medeia a expressão diminuída de um produto de gene alvo endógeno pela de- gradação de um mMRNA alvo através de vias de silenciamento de ge- nes endógenos (por exemplo, Dicer e complexo de silenciamento in- duzido por RNA (RISC)). Agentes de interferência de RNA exemplifica- tivos incluem micro RNAs (também referidos neste documento como "MIRNAs"), RNAs de hairpin curto (ShRNAs), pequenos RNAs interfe- rentes (siRNAs), aptâmeros de RNA e morfolinos.
[00140] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico compreende um ou mais miRNAs. mMIiRNAs referem-se a pequenas moléculas de RNA não codificantes de ocorrência natural com cerca de 21 a 25 nucleotídeos de compri- mento. Os miRNAs são pelo menos parcialmente complementares a uma ou mais moléculas de mRNA alvo. Os miRNAs podem regular negativamente (por exemplo, diminuir) a expressão de um produto de gene alvo endógeno por meio de repressão translacional, clivagem do MRNA e/ou desadenilação.
[00141] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge-
nes baseado em ácido nucleico compreende um ou mais sShRNAs. Os ShRNAs são moléculas de RNA de fita simples com cerca de 50-70 nucleotídeos de comprimento que formam estruturas de haste-alça e resultam na degradação de sequências complementares de mRNA. Os shRNAs podem ser clonados em plasmídeos ou em vetores virais recombinantes não replicantes a serem introduzidos intracelularmente e resultar na integração da sequência que codifica o ShRNA no geno- ma. Como tal, um ShRNA pode fornecer uma repressão estável e con- sistente da tradução e expressão de genes alvo endógenos.
[00142] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico compreende um ou mais siRNAs. SIRNAs referem-se a moléculas de RNA de fita dupla tipicamente com cerca de 21-23 nucleotídeos de comprimento. O siRNA se associa a um complexo multiproteico denominado complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), durante o qual a fita sense do "passageiro" é clivada enzimaticamente. A fita "guia" antisense contida no RISC ati- vado, em seguida, guia o RISC para o MRNA correspondente por cau- sa da homologia da sequência e a mesma nuclease corta o MRNA al- vo, resultando em silenciamento de gene específico. Idealmente, um SIRNA tem 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeos de comprimento e tem uma saliência de 2 bases na sua extremidade 3'. Os siRNAs po- dem ser introduzidos em uma célula individual e/ou sistema de cultura e resultar na degradação das sequências alvo de mMRNA. siRNAs e ShRNAs são descritos adicionalmente em Fire et a/., Nature, 391: 19, 1998 e Patentes US nº. 7.732.417; 8.202.846; e 8.383.599.
[00143] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes à base de ácido nucleico compreende um ou mais morfolinos. "Morfolino", como utilizado neste documento, refere-se a um oligômero de ácido nucleico modificado, em que as bases padrão de ácido nu- cleico estão ligadas aos anéis de morfolina e estão ligadas através de ligações de fosforodiamidato. Semelhante ao siRNA e shRNA, os mor- folinos se ligam a sequências complementares de mRNA. No entanto, os morfolinos funcionam através da inibição estérica da tradução de mMRNA e da alteração do splicing de MRNA, em vez de direcionar se- quências complementares de mRNA para degradação.
[00144] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes à base de ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nu- cleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um aptâmero de RNA ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90% idêntica a um RNA codificado por uma sequência de DNA de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em al- gumas modalidades, o sistema de regulação de genes à base de ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um aptâmero de RNA ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a um RNA codificado por uma sequência de DNA de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes à base de ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um aptâmero de RNA ou um morfoli- no) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 100% idêntica a um RNA codificado por uma sequência de DNA de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1.
[00145] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de siRNA ou uma molécula de shRNA selecionada dentre as conhecidas na téc- nica, como os construtos de siRNA e shRNA disponíveis de fornecedo- res comerciais, como Sigma Aldrich, Dharmacon, ThermoFisher e si- milar.
[00146] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge-
nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico (por exemplo, dois ou mais siRNAs, dois ou mais sShRNAs, dois ou mais aptâmeros de RNA, ou dois ou mais morfolinos), em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de RNA codifi- cada por uma sequência de DNA de um gene alvo selecionado da Ta- bela 1. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico (por exemplo, dois ou mais siRNAs, dois ou mais sShRNAs, dois ou mais aptâmeros de RNA, ou dois ou mais morfolinos), em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA de um gene alvo sele- cionado da Tabela 1. Em algumas modalidades, o sistema de regula- ção de genes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico (por exemplo, dois ou mais siRNAs, dois ou mais ShRNAs, dois ou mais aptâmeros de RNA, ou dois ou mais morfolinos), em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA de um gene alvo selecio- nado da Tabela 1.
B. Sistemas de regulação de genes baseados em proteínas
[00147] Em algumas modalidades, um sistema de regulação de ge- nes baseado em proteína é um sistema que compreende uma ou mais proteínas capazes de regular a expressão de um gene alvo endógeno de uma maneira específica de sequência, sem a necessidade de uma molécula guia de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em proteína compreende uma proteí- na que compreende um ou mais domínios de ligação dedo de zinco e um domínio enzimático. Em algumas modalidades, o sistema de regu-
lação de genes baseado em proteína compreende uma proteína que compreende um domínio de nuclease efetora do tipo ativador transcri- cional (TALEN) e um domínio enzimático. Tais modalidades são referi- das neste documento como "TALENSs".
1. Sistemas de dedos de zinco
[00148] Os sistemas baseados em dedo de zinco compreendem uma proteína de fusão compreendendo dois domínios de proteína: um domínio de ligação ao DNA dedo de zinco e um domínio enzimático. Um "domínio de ligação ao DNA dedo de zinco", "proteína dedo de zinco" ou "ZFP" é uma proteína ou um domínio dentro de uma proteína maior que se liga ao DNA de uma maneira específica de sequência através de um ou mais dedos de zinco, que são regiões da sequência de aminoácidos dentro do domínio de ligação cuja estrutura é estabili- zada através da coordenação de um fon de zinco. O domínio de dedo de zinco, ao se ligar a uma sequência de DNA alvo, direciona a ativi- dade do domínio enzimático para a proximidade da sequência e, por- tanto, induz a modificação do gene alvo endógeno na proximidade da sequência alvo. Um domínio de dedo de zinco pode ser manipulado para se ligar a praticamente qualquer sequência desejada. Conse- quentemente, após a identificação de um locus genético alvo contendo uma sequência de DNA alvo na qual a clivagem ou recombinação é desejada (por exemplo, um locus alvo em um gene alvo referenciado na Tabela 1), um ou mais domínios de ligação de dedos de zinco po- dem ser manipulados para se ligar a uma ou mais sequências de DNA alvo no locus genético alvo. A expressão de uma proteína de fusão compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco e um domí- nio enzimático em uma célula afeta a modificação no locus genético alvo.
[00149] Em algumas modalidades, um domínio de ligação de dedo de zinco compreende um ou mais dedos de zinco. Miller et a/. (1985)
EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Febuary:56- 65; Pat. U.S. n.º 6.453.242. Normalmente, um único domínio de dedo de zinco tem cerca de 30 aminoácidos de comprimento. Um dedo de zinco individual se liga a uma sequência de três nucleotídeos (isto é, tripleto) (ou uma sequência de quatro nucleotídeos que pode se so- brepor, por um nucleotídeo, ao sítio de ligação de quatro nucleotídeos de um dedo de zinco adjacente). Portanto, o comprimento de uma se- quência na qual um domínio de ligação de dedo de zinco é manipulado para se ligar (por exemplo, uma sequência alvo) determinará o número de dedos de zinco em um domínio de ligação de dedo de zinco mani- pulado. por exemplo, para ZFPs em que os motivos dos dedos não se ligam a subsítios sobrepostos, uma sequência alvo de seis nucleotí- deos é ligada por um domínio de ligação com dois dedos; uma se- quência alvo de nove nucleotídeos é ligada por um domínio de ligação de três dedos etc. Os sítios de ligação para dedos individuais de zinco (por exemplo, subsítios) em um sítio alvo não precisam ser contíguos, mas podem ser separados por um ou vários nucleotídeos, dependen- do do comprimento e da natureza das sequências de aminoácidos en- tre os dedos de zinco (por exemplo, os ligantes com dedos) em um domínio de ligação com vários dedos. Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao DNA de ZFNs individuais compreendem entre três e seis repetições individuais de dedo de zinco e podem reconhe- cer cada um entre 9 e 18 pares de bases.
[00150] Os domínios de ligação ao dedo de zinco podem ser mani- pulados para se ligar a uma sequência de escolha. Ver, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416. Um domínio de ligação de dedo de zinco manipulado pode ter uma nova especificida-
de de ligação, em comparação à uma proteína dedo de zinco de ocor- rência natural. Métodos de manipulação incluem, mas não estão limi- tados ao design racional e vários tipos de seleção.
[00151] A seleção de uma sequência de DNA alvo para ligação por um domínio de dedo de zinco pode ser realizada, por exemplo, de acordo com os métodos divulgados na Pat. U.S. n.º 6.453.242. Ficará claro para os versados na técnica que a inspeção visual simples de uma sequência nucleotídica também pode ser usada para a seleção de uma sequência de DNA alvo. Por conseguinte, quaisquer meios para a seleção da sequência de DNA alvo podem ser utilizados nos métodos descritos neste documento. Um sítio alvo geralmente tem um comprimento de pelo menos 9 nucleotídeos e, consequentemente, é ligado por um domínio de ligação de dedo de zinco compreendendo pelo menos três dedos de zinco. No entanto, a ligação de, por exem- plo, um domínio de ligação de 4 dedos a um sítio alvo de 12 nucleotí- deos, um domínio de ligação de 5 dedos a um sítio alvo de 15 nucleo- tídeos ou um domínio de ligação de 6 dedos a um sítio alvo de 18 nu- cleotídeos é também é possível. Como será aparente, a ligação de domínios de ligação maiores (por exemplo, 7, 8, 9 dedos e mais) a sí- tio alvo mais longos também é possível.
[00152] Em algumas modalidades, os domínios de ligação de dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecio- nado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os domínios de ligação de dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os domínios de liga- ção de dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modali- dades, o sistema de dedo de zinco é selecionado dentre aqueles co- nhecidos na técnica, como aqueles disponíveis de fornecedores co- merciais, como Sigma Aldrich.
[00153] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação de dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90% idêntica a uma se- quência de DNA alvo de um gene alvo selecionado da Tabela 1. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco, em que pelo menos um dos do- mínios de ligação de dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado da Tabela
1. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes com- preende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreen- dendo um domínio de ligação de dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação de dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado da Tabela 1.
[00154] A porção do domínio enzimático das proteínas de fusão de- dos de zinco pode ser obtida de qualquer endo- ou exonuclease. As endonucleases exemplificativas a partir das quais um domínio enzimá- tico pode ser derivado, incluem, mas não estão limitadas a endonu- cleases de restrição e endonucleases de homing. Ver, por exemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; e Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. As enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, Nuclease 51; nuclease de feijão-mungo; DNase | pancreática; nuclease microcócica; endonu- clease de levedura HO; ver também Linn et a/. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais dessas enzimas (ou seus fragmentos funcionais) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem.
[00155] —Endonucleases de restrição exemplares (enzimas de restri- ção) adequadas para uso como domínio enzimático das ZFPs descri- tas neste documento estão presentes em muitas espécies e são capa- zes de ligação específica de sequências ao DNA (em um sítio de re- conhecimento) e clivagem de DNA no sítio de ligação ou próximo a ele. Determinadas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) cliva o DNA em sítios removidos do sítio de reconhecimento e têm domínios de ligação e de clivagem separáveis. por exemplo, a enzima Fokl do Tipo IIS catalisa a clivagem de fita dupla do DNA em 9 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento em uma fita e em 13 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento na outra. Ver, por exemplo, Pat. U.S. n.º
5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; assim como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31.978-31.982. As- sim, em uma modalidade, as proteínas de fusão compreendem o do- mínio enzimático de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco.
[00156] Uma enzima de restrição Tipo IIS exemplificativa, cujo do- mínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fokl. Esta en- zima particular é ativa como um dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. Assim, para a clivagem de DNA de fita dupla direcionada usando fusões de dedo de zinco-Fokl, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um domínio en- zimático de Fokl, podem ser usadas para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma única molécula polipeptídica contendo um domínio de ligação de dedo de zinco e dois domínios enzimáticos de Fokl também podem ser utilizados. ZFPs exemplares compreendendo domínios enzimáticos de Fokl são descri- tas na Patente US n.º 9.782.437.
2. Sistemas TALEN
[00157] Os sistemas baseados em TALEN compreendem uma pro- teína que compreende um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL e um domínio enzimático. Eles são feitos pela fusão de um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL a um domínio de clivagem de DNA (uma nuclease que corta as fitas de DNA). A enzima de restrição Fokl des- crita acima é um domínio enzimático exemplar adequado para uso em sistemas de regulação de genes baseados em TALEN.
[00158] Os efetores TAL são proteínas secretadas pela bactéria Xanthomonas através do sistema de secreção tipo Ill quando infectam plantas. O domínio de ligação ao DNA contém uma sequência repetida e altamente conservada de 33 a 34 aminoácidos com o 12º e 13º ami- noácidos divergentes. Essas duas posições, referidas como Di-resíduo Variável de Repetição (Repeat Variable Diresidue - RVD), são alta- mente variáveis e fortemente correlacionadas com o reconhecimento específico de nucleotídeos. Portanto, os domínios efetores de TAL po- dem ser manipulados para ligar sequências de DNA alvo específicas selecionando uma combinação de segmentos de repetição contendo os RVDs apropriados. A especificidade do ácido nucleico para combi- nações de RVD é a seguinte: o HD tem como alvo a citosina, o NI tem como alvo a adenina, o NG tem como alvo a timina e o NN tem como alvo a guanina (embora, em algumas modalidades, o NN também pos- sa se ligar à adenina com menor especificidade).
[00159] Em algumas modalidades, os domínios de ligação do efetor de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%
idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do efetor de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma se- quência de DNA alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do efe- tor de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é 100% idênti- ca a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado daque- les listados na Tabela 1.
[00160] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão de efetor de TAL, cada uma compreendendo um domínio de ligação de efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios de ligação de efetor de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado da Tabela
1. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes com- preende duas ou mais proteínas de fusão de efetor de TAL, cada uma compreendendo um domínio de ligação de efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios de ligação de efetor de TAL se liga a uma se- quência de DNA alvo que é de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecio- nado da Tabela 1. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes compreende duas ou mais proteínas de fusão de efetor de TAL, cada uma compreendendo um domínio de ligação de efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios de ligação de efetor de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado da Tabela 1.
[00161] Os métodos e composições para a montagem das repeti- ções dos efetores de TAL são conhecidos na técnica. Ver, por exem- plo, Cermak et al, Nucleic Acids Research, 39:12, 2011, e82. Os plas-
mídeos para construtos das repetições de efetores de TAL estão dis- poníveis comercialmente na Addgene. C. Combinação de sistemas de regulação de genes baseados em proteínas/ácidos nucleicos
[00162] A combinação de sistemas de regulação de genes compre- ende um polipeptídeo modificador sítio-dirigido e uma molécula guia de ácido nucleico. Neste documento, um "polipeptídeo modificador sí- tio-dirigido" refere-se a um polipeptídeo que se liga a uma molécula guia de ácido nucleico, que é direcionado a uma sequência alvo de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de DNA ou RNA alvo en- dógeno) pela molécula guia de ácido nucleico à qual está ligado e mo- difica a sequência alvo de ácido nucleico (por exemplo, por clivagem, mutação ou metilação da sequência alvo de ácido nucleico).
[00163] Um polipeptídeo modificador sítio-dirigido compreende duas porções, uma porção que liga ao guia de ácido nucleico e uma porção de atividade. Em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador sítio-dirigido compreende uma porção de atividade que exibe atividade enzimática sítio-dirigida (por exemplo, metilação do DNA, clivagem de DNA ou RNA, acetilação da histona, metilação da histona etc.), em que o sítio da atividade enzimática é determinado pelo ácido nucleico guia. Em alguns casos, um polipeptídeo modificador sítio-dirigido com- preende uma porção de atividade que possui atividade enzimática que modifica a sequência de ácido nucleico alvo endógeno (por exemplo, atividade de nuclease, atividade de metiltransferase, atividade de desmetilase, atividade de reparo do DNA, atividade de dano ao DNA, atividade de desaminação, atividade de dismutase, atividade de alqui- lação, atividade de depurinação, atividade de oxidação, atividade de formação de dímero de pirimidina, atividade de integrase, atividade de transposase, atividade de recombinase, atividade de polimerase, ativi- dade de ligase, atividade de helicase, atividade de fotolase ou ativida-
de de glicosilase). Em outros casos, um polipeptídeo modificador sítio- dirigido compreende uma porção de atividade que possui atividade enzi- mática que modifica um polipeptídeo (por exemplo, uma histona) associ- ado à sequência de ácido nucleico alvo endógeno (por exemplo, ativida- de metiltransferase, atividade desmetilase, atividade acetiltransferase, atividade desacetilase, atividade de quinase, atividade de fosfatase, ativi- dade de ubiquitina ligase, atividade de desubiquitinação, atividade de adenilação, atividade de desadenilação, atividade de SUMOilação, ativi- dade de deSUMOilação, atividade de ribosilação, atividade de desibo- silação, atividade de miristoilação ou atividade de desiristoilação). Em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador sítio-dirigido com- preende uma porção de atividade que modula a transcrição de uma sequência de DNA alvo (por exemplo, para aumentar ou diminuir a transcrição). Em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador sítio-dirigido compreende uma porção de atividade que modula a ex- pressão ou tradução de uma sequência de RNA alvo (por exemplo, para aumentar ou diminuir a transcrição).
[00164] O guia de ácido nucleico compreende duas porções: uma primeira porção que é complementar e capaz de se ligar a uma se- quência nucleica endógena alvo (referida neste documento como um "segmento de ligação a ácidos nucleicos") e uma segunda porção que é capaz de interagir com o polipeptídeo modificador sítio-dirigido (refe- rido neste documento como um "segmento de ligação a proteínas"). Em algumas modalidades, o segmento de ligação ao ácido nucleico e o segmento de ligação à proteína de um guia de ácido nucleico estão compreendidos dentro de uma única molécula de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o segmento de ligação ao ácido nucleico e o segmento de ligação à proteína de um guia de ácido nucleico estão compreendidos dentro de moléculas de polinucleotídeo separadas, de modo que o guia de ácido nucleico compreende duas moléculas de polinucleotídeo que se associam para formar o guia funcional.
[00165] O guia de ácido nucleico medeia a especificidade alvo dos sistemas de regulação de genes combinados de ácido nucleico/pro- teína, hibridando especificamente com uma sequência alvo de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico al- vo é uma sequência de RNA, tal como uma sequência de RNA com- preendida dentro de um transcrito de MRNA de um gene alvo. Em al- gumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo é uma se- quência de DNA compreendida dentro da sequência de DNA de um gene alvo. A referência feita neste documento a um gene alvo abrange a sequência de DNA completa para esse gene particular que compre- ende uma pluralidade de loci genéticos alvo (isto é, partes de uma se- quência de gene alvo específica (por exemplo, um éxon ou um Ífn- tron)). Dentro de cada loci genético alvo, há expansões mais curtas de sequências de DNA referidas neste documento como "sequências de DNA alvo" que podem ser modificadas pelos sistemas de regulação de genes descritos neste documento. Além disso, cada loci genético alvo compreende um "sítio de modificação alvo", que se refere à localiza- ção precisa da modificação induzida pelo sistema regulador de genes (por exemplo, a localização de uma inserção, uma deleção ou muta- ção, a localização de um DNA ou a localização de uma modificação epigenética).
[00166] Os sistemas de regulação de genes descritos neste docu- mento podem compreender um único guia de ácido nucleico ou podem compreender uma pluralidade de guias de ácido nucleico (por exem- plo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais guias de ácido nucleico).
[00167] Em algumas modalidades, os sistemas reguladores combi- nados de proteína/ácido nucleico compreendem polipeptídeos modifi- cadores sítio-dirigidos derivados de proteínas Argonaute (Ago) (por exemplo, Ago de T. thermophiles ou TtAgo). Em tais modalidades, o polipeptídeo modificador sítio-dirigido é uma endonuclease de DNA de T. thermophiles Ago e o guia de ácido nucleico é um DNA guia (gDNA) (Veja, Swarts et al., Nature 507 (2014), 258-261). Em algumas modali- dades, a presente divulgação fornece um polinucleotídeo que codifica um gDNA. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica o gDNA é compreendido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante. Em algumas modalidades, a pre- sente divulgação fornece um polinucleotídeo que codifica um polipep- tídeo modificador sítio-dirigido de TtAgo ou uma variante deste. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador sítio-dirigido de TtAgo está compreendido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante.
[00168] Em algumas modalidades, os sistemas de edição de genes descritos neste documento são sistemas de nuclease CRISPR (Repe- tições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaça- das)/Cas (Associado a CRISPR). Em algumas modalidades, o sistema CRISPR/Cas é um sistema de Classe 2. Os sistemas CRISPR/Cas de Classe 2 são divididos em três tipos: sistemas Tipo Il, Tipo V e Tipo VI. Em algumas modalidades, o sistema CRISPR/Cas é um sistema de Classe 2 Tipo Il, utiizando a proteína Cas9. Em tais modalidades, o polipeptídeo modificador sítio-dirigido é uma endonuclease de DNA de Cas9 (ou sua variante) e a molécula guia de ácido nucleico é um RNA guia (gRNA). Em algumas modalidades, o sistema CRISPR/Cas é um sistema de Classe 2 Tipo V, utilizando as proteínas Cas12 (por exem- plo, Cas12a (também conhecida como Cpf1), Cas12b (também conhe- cida como C2c1), Cas12c (também conhecida como C2c3), Cas12d (também conhecida como CasY) e Cas12e (também conhecida como CasX)). Em tais modalidades, o polipeptídeo modificador sítio-dirigido é uma endonuclease de DNA de Cas12 (ou sua variante) e a molécula guia de ácido nucleico é um gRNA. Em algumas modalidades, o sis-
tema CRISPR/Cas é um sistema de Classe 2 e Tipo VI, utilizando as proteínas Cas13 (por exemplo, Cas13a (também conhecida como C2c2), Cas13b e Cas13c). (Ver Pyzocha et al., ACS Chemical Biology, 13 (2), 347-356). Em tais modalidades, o polipeptídeo modificador sí- tio-dirigido é uma riboendonuclease de RNA de Cas13 e a molécula guia de ácido nucleico é um gRNA.
[00169] Um polipeptídeo de Cas refere-se a um polipeptídeo que pode interagir com uma molécula de gRNA e, em conjunto com a mo- lécula de gRNA, hospedar ou localizar um DNA ou sequência de RNA alvo. Os polipeptídeos de Cas incluem proteínas Cas que ocorrem na- turalmente e proteínas Cas manipuladas, alteradas ou modificadas, que diferem por um ou mais resíduos de aminoácidos de uma sequên- cia de Cas que ocorre naturalmente.
[00170] Um RNA guia (gRNA) compreende dois segmentos, um segmento de ligação ao DNA e um segmento de ligação à proteína. Em algumas modalidades, o segmento de ligação às proteínas de um gRNA é compreendido em uma molécula de RNA e o segmento de ligação ao DNA é compreendido em outra molécula de RNA separada. Tais modalidades são referidas neste documento como "gRNAs de molécula dupla" ou "gRNA de duas moléculas" ou "gRNAs duplos." Em algumas modalidades, o gRNA é uma molécula de RNA única e é refe- rido neste documento como um "RNA guia único" ou um "sgRNA." O termo "RNA guia" ou "gRNA!" é inclusivo, referindo-se a RNAs guia de duas moléculas e sgaRNAs.
[00171] O segmento de ligação às proteínas de um gRNA compre- ende, em parte, duas expansões complementares de nucleotídeos que hibridam entre si para formar um duplex de RNA de fita dupla ((SRNA duplex), que facilita a ligação à proteína Cas. O segmento de ligação ao ácido nucleico (ou "sequência de ligação ao ácido nucleico") de um gRNA compreende uma sequência de nucleotídeos que é complemen-
tar e capaz de se ligar à uma sequência alvo específica do ácido nu- cleico.
O segmento de ligação à proteína do gRNA interage com um polipeptídeo de Cas e a interação da molécula de gRNA e do polipep- tídeo modificador sítio-dirigido resulta na ligação de Cas à sequência endógena de ácido nucleico e produz uma ou mais modificações den- tro ou ao redor da sequência alvo de ácido nucleico.
A localização pre- cisa do sítio de modificação alvo que é determinada por (i) comple- mentaridade de emparelhamento de bases entre o gRNA e a sequên- cia alvo de ácido nucleico; e (ii) a localização de um motivo curto, refe- rido como motivo adjacente do protoespaçador (PAM), na sequência de DNA alvo (referido como sequência de flanco do protoespaçador (PFS) nas sequências de RNA alvo). A sequência PAM/PFS é neces- sária para a ligação de Cas à sequência de ácido nucleico alvo.
Uma variedade de sequências de PAM/PFS é conhecida na técnica e é adequada para uso com uma endonuclease Cas específica (por exemplo, uma endonuclease Cas9) (ver, por exemplo, Nat Methods. 2013 Nov; 10(11): 1116-1121 e Sci Rep. 2014; 4: 5405). Em algumas modalidades, a sequência PAM está localizada dentro de 50 pares de bases do sítio de modificação alvo em uma sequência de DNA alvo.
Em algumas modalidades, a sequência PAM está localizada dentro de pares de bases do sítio de modificação alvo em uma sequência de DNA alvo.
As sequências de DNA que podem ser direcionadas por es- te método são limitadas apenas pela distância relativa da sequência PAM ao sítio de modificação alvo e pela presença de uma sequência exclusiva de 20 pares de bases para mediar a ligação de Cas mediada por gRNA específica da sequência.
Em algumas modalidades, a se- quência PFS está localizada na extremidade 3' da sequência de RNA alvo.
Em algumas modalidades, o sítio de modificação alvo está locali- zado no terminal 5' do locus alvo.
Em algumas modalidades, o sítio de modificação alvo está localizado na extremidade 3' do locus alvo.
Em algumas modalidades, o sítio de modificação alvo está localizado den- tro de um íntron ou um éxon do locus alvo.
[00172] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polinucleotídeo que codifica um gRNA. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica o gRNA é compreendido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polinucleotí- deo que codifica um polipeptídeo modificador sítio-dirigido. Em algu- mas modalidades, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo mo- dificador sítio-dirigido está compreendido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante.
1. Proteínas Cas
[00173] Em algumas modalidades, o polipeptídeo modificador sítio- dirigido é uma proteína Cas. Qualquer proteína Cas, incluindo aquelas fornecidas neste documento, pode ser usada. Moléculas Cas de várias espécies podem ser usadas nos métodos e composições descritos neste documento, incluindo moléculas Cas derivadas de S. pyogenes, S. aureus, N. meningitidis, S. thermophiles, Acidovorax avenae, Acti- nobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobaci- Ilus suis, Actinomyces sp., Cycliphilusdenitrificans, Aminomonas pau- civorans, Bacillus cereus, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacte- roides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterospoxus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfringens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, Gammaproteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputomm, Helicobacter ca- nadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae, llyobacter polytropus, Kingella kingae, Lactobacillus crispatus, Listeria ivanovii,
Listeria monocytogenes, Listeriaceae bacterium, Methylocystis sp., Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacillifor- mis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitroso- monas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutens, Ralstonia syzygii, Rhodopseu- domonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomo- nas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus aureus, Staphylo- coccus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., ou Verminephrobacter eiseniae.
[00174] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, a endonu- clease Cas é selecionada a partir do grupo que consiste em C2C1, C2C3, Cpfi (também referida como Cas12a), Cas12b, Casí2c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CasliB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conheci- da como Csnl e Csx12), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, e Csfa4.
[00175] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma endorri- bonuclease, como uma proteína Cas13. Em algumas modalidades, a proteína Cas13 é uma proteína Cas13a (Abudayyeh et a/l., Nature 550 (2017), 280-284), Cas13b (Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019- 1027), Cas13c (Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027) ou Cas13d (Zhang et a/l., Cell 175 (2018), 212-223).
[00176] Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é qualquer pro- teína Cas9, incluindo qualquer uma das proteínas Cas9 especifica- mente fornecidas neste documento. Em algumas modalidades, a pro- teína Cas é uma proteína Cas9 de tipo selvagem ou de ocorrência na-
tural ou um ortólogo de Cas9. A Cas9 do tipo selvagem é uma enzima de vários domínios que usa um domínio de nuclease HNH para clivar a fita alvo do DNA e um domínio semelhante ao RuvC para clivar a fita não alvo.
A ligação de WT Cas9 ao DNA com base na especificidade do gRNA resulta em quebras de DNA de fita dupla que podem ser re- paradas por junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou reparo direcionado por homologia (HDR). Moléculas de Cas9 de ocorrência natural exemplares são descritas em Chylinski et al, RNA Biology 2013 10:5, 727-737 e ortólogos de Cas9 adicionais são descritos na Publicação Internacional POT n.º WO 2015/071474. Essas moléculas de Cas9 incluem moléculas de Cas9 de uma família bacteriana do clu- ster 1, família bacteriana do cluster 2, família bacteriana do cluster 3, família bacteriana do cluster 4, família bacteriana do cluster 5, família bacteriana do cluster 6, família bacteriana do cluster 7, família bacteri- ana do cluster 8, família bacteriana do cluster 9, família bacteriana do cluster 10, família bacteriana do cluster 11, família bacteriana do clus- ter 12, família bacteriana do cluster 13, família bacteriana do cluster 14, família bacteriana do cluster 15, família bacteriana do cluster 16, família bacteriana do cluster 17, família bacteriana do cluster 18, famí- lia bacteriana do cluster 19, família bacteriana do cluster 20, família bacteriana do cluster 21, família bacteriana do cluster 22, família bac- teriana do cluster 23, família bacteriana do cluster 24, família bacteria- na do cluster 25, família bacteriana do cluster 26, família bacteriana do cluster 27, família bacteriana do cluster 28, família bacteriana do clus- ter 29, família bacteriana do cluster 30, família bacteriana do cluster 31, família bacteriana do cluster 32, família bacteriana do cluster 33, família bacteriana do cluster 34, família bacteriana do cluster 35, famí- lia bacteriana do cluster 36, família bacteriana do cluster 37, família bacteriana do cluster 38, família bacteriana do cluster 39, família bac- teriana do cluster 40, família bacteriana do cluster 41, família bacteria-
na do cluster 42, família bacteriana do cluster 43, família bacteriana do cluster 44, família bacteriana do cluster 45, família bacteriana do clus- ter 46, família bacteriana do cluster 47, família bacteriana do cluster 48, família bacteriana do cluster 49, família bacteriana do cluster 50, família bacteriana do cluster 51, família bacteriana do cluster 52, famí- lia bacteriana do cluster 53, família bacteriana do cluster 54, família bacteriana do cluster 55, família bacteriana do cluster 56, família bac- teriana do cluster 57, família bacteriana do cluster 58, família bacteria- na do cluster 59, família bacteriana do cluster 60, família bacteriana do cluster, 61 família bacteriana do cluster 62, família bacteriana do clus- ter 63, família bacteriana do cluster 64, família bacteriana do cluster 65, família bacteriana do cluster 66, família bacteriana do cluster 67, família bacteriana do cluster 68, família bacteriana do cluster 69, famí- lia bacteriana do cluster 70, família bacteriana do cluster 71, família bacteriana do cluster 72, família bacteriana do cluster 73, família bac- teriana do cluster 74, família bacteriana do cluster 75, família bacteria- na do cluster 76, família bacteriana do cluster 77 ou família bacteriana do cluster 78.
[00177] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de Cas9 de ocor- rência natural é selecionado a partir do grupo que consiste em SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, Sa- Cas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9 e NmeCas9. Em algumas modalida- des, a proteína Cas9 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma se- quência de aminoácidos Cas9 descrita em Chylinski et a/., RNA Bio- logy 2013 10: 5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6).
[00178] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de Cas compre- ende uma ou mais das seguintes atividades: (a) uma atividade de nickase, isto é, a capacidade de cli-
var uma única fita, por exemplo, a fita não complementar ou a fita complementar de uma molécula de ácido nucleico; (b) uma atividade de nuclease de fita dupla, isto é, a ca- pacidade de clivar ambas as fitas de um ácido nucleico de fita dupla e criar uma quebra de fita dupla, que em uma modalidade é a presença de duas atividades de nickase; (c) uma atividade de endonuclease; (d) uma atividade de exonuclease; e/ou (e) uma atividade de helicase, isto é, a capacidade de de- senrolar a estrutura helicoidal de um ácido nucleico de fita dupla.
[00179] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de Cas é fundido com proteínas heterólogas que recrutam proteínas sinalizadoras de dano ao DNA, exonucleases ou fosfatases para aumentar ainda mais a probabilidade ou a taxa de reparo da sequência alvo por um ou outro mecanismo de reparo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de WT Cas é co-expresso com um modelo de reparo de ácido nucleico para facilitar a incorporação de uma sequência de ácido nucleico exó- gena por reparo direcionado por homologia.
[00180] Em algumas modalidades, diferentes proteínas Cas (ou se- ja, proteínas Cas9 de várias espécies) podem ser vantajosas para uso nos vários métodos fornecidos, a fim de capitalizar várias característi- cas enzimáticas das diferentes proteínas Cas (por exemplo, para dife- rentes preferências de sequência PAM; para maior ou atividade enzi- mática reduzida; para um nível aumentado ou diminuído de toxicidade celular; para alterar o equilíbrio entre NHEJ, reparo direcionado à ho- mologia, quebras de fita simples, quebras de fita dupla, etc.).
[00181] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. pyogenes e reconhece o motivo da sequência PAM NGG, NAG, NGA (Mali et a/, Science 2013; 339 (6121): 823- 826). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. thermophiles e reconhece o motivo da sequência PAM NGGNG e/ou NNAGAAW (W = A ou T) (ver, por exemplo, Horvath et al, Science, 2010; 327 (5962): 167-170 e Deveau et al., J. Bacteriol 2008; 190 (4): 1390-1400). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. mutans e reconhece o motivo da sequência PAM NGG e/ou NAAR (R = A ou G) (ver, por exemplo, De- veau et al., J. BACTERIOL 2008; 190 (4): 1390-1400). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. au- reus e reconhece o motivo de sequência PAM NNGRR (R = A ou G). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 deri- vada de S. aureus e reconhece o motivo da sequência PAM N GRRT (R= A ou G). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteí- na Cas9 derivada de S. aureus e reconhece o motivo N de sequência PAM GRRV (R = A ou G). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de N. meningitidis e reconhece o motivo da sequência PAM N GATT ou N GCTT (R= A ou G, V= A, Gou C) (Veja, por exemplo, Hou et ah, PNAS 2013, 1-6). Nas modalidades mencionadas acima, N pode ser qualquer resíduo de nucleotídeo, por exemplo, qualquer um de A, G, C ou T. Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas13a derivada de Leptotrichia shahii e reconhece o motivo de sequência PFS de um único 3' A, U ou C.
[00182] Em algumas modalidades, é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas. Em algumas modalidades, o polinucle- otídeo codifica uma proteína Cas que é pelo menos 90% idêntica a uma proteína Cas descrita na Publicação Internacional PCT n.º WO 2015/07 1474 ou Chylinski et a/., RNA Biology 2013 10: 5, 727-737. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína Cas que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma prote- ína Cas descrita na Publicação InternacionaliPcCT nº WO 2015/07 1474 ou Chylinski et a/., RNA Biology 2013 10: 5, 727-737. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína Cas que é 100% idêntica a uma proteína Cas descrita na Publicação Inter- nacional PCT n.º WO 2015/071474 ou Chylinski et al., RNA Biology 2013 10: 5, 727-737.
2. Mutantes de Cas
[00183] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de Cas são manipulados para alterar uma ou mais propriedades do polipeptídeo de Cas. por exemplo, em algumas modalidades, o polipeptídeo de Cas compreende propriedades enzimáticas alteradas, por exemplo, ativi- dade alterada de nuclease (em comparação à uma molécula de Cas de ocorrência natural ou outra referência) ou atividade alterada de he- licase. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de Cas modificado pode ter uma alteração que altera seu tamanho, por exemplo, uma de- leção da sequência de aminoácidos que reduz seu tamanho sem efeito significativo em outra propriedade do polipeptídeo de Cas. Em algu- mas modalidades, um polipeptídeo de Cas manipulado compreende uma alteração que afeta o reconhecimento de PAM. por exemplo, um polipeptídeo de Cas manipulado pode ser alterado para reconhecer uma sequência PAM diferente da sequência PAM reconhecida pela proteína Cas do tipo selvagem correspondente.
[00184] Os polipeptídeos de Cas com propriedades desejadas po- dem ser feitos de várias maneiras, incluindo alteração de um polipeptí- deo de Cas que ocorre naturalmente ou polipeptídeo de Cas precur- sor, para fornecer um polipeptídeo de Cas mutante ou alterado com uma propriedade desejada. por exemplo, uma ou mais mutações po- dem ser introduzidas na sequência de um polipeptídeo de Cas paren- tal (por exemplo, um polipeptídeo de Cas que ocorre naturalmente ou manipulado). Tais mutações e diferenças podem compreender substi- tuições (por exemplo, substituições conservadoras ou substituições de aminoácidos não essenciais); inserções; ou deleções. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de Cas mutante compreende uma ou mais mutações (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 mutações) em relação a um polipeptídeo de Cas parental.
[00185] Em uma modalidade, um polipeptídeo de Cas mutante compreende uma propriedade de clivagem que difere de um polipeptí- deo de Cas que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, a Cas é uma mutante de Cas desativada (dCas). Em tais modalidades, o po- lipeptídeo de Cas não compreende nenhuma atividade enzimática in- trínseca e é incapaz de mediar a clivagem de ácido nucleico alvo. Em tais modalidades, a dCas pode ser fundida com uma proteína heteró- loga que é capaz de modificar o ácido nucleico alvo de uma maneira não baseada em clivagem. por exemplo, em algumas modalidades, uma proteína dCas é fundida aos domínios ativador ou repressor da transcrição (por exemplo, a caixa associada a Kruppel (KRAB ou SKD); o domínio de interação Mad mSIN3 (SID ou SID4X); o domínio repressor ERF (ERD); a proteína 1 de interação com MAX (MXI1); pro- teína 2 de ligação ao metil-CpG (MECP2) etc.). Em alguns casos, a proteína de fusão dCas é direcionada pelo ggRNA para um sítio espe- cífico (isto é, sequência) no ácido nucleico alvo e exerce regulação es- pecífica do locus, como o bloqueio da ligação da RNA polimerase a um promotor (que inibe seletivamente a função ativadora da transcri- ção) e/ou modificar o status da cromatina local (por exemplo, quando é usada uma sequência de fusão que modifica o DNA alvo ou modifica um polipeptídeo associado ao DNA alvo). Em alguns casos, as mu- danças são transitórias (por exemplo, repressão ou ativação de trans- crição). Em alguns casos, as mudanças são hereditárias (por exemplo, quando são feitas modificações epigenéticas ao DNA alvo ou às prote- ínas associadas ao DNA alvo, por exemplo, histonas nucleossômicas).
[00186] Em algumas modalidades, a dCas é uma mutante de dCas13 (Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676). Essas mutantes de dCas13 podem então ser fundidas com enzimas que modificam o RNA, incluindo adenosina desaminases (por exemplo, ADAR1 e ADAR?2). As adenosina-desaminases convertem adenina em inosina, que a maquinaria de tradução trata como guanina, criando assim uma alteração funcional de ASG na sequência de RNA. Em algumas mo- dalidades, a dCas é uma mutante de dCas9.
[00187] Em algumas modalidades, a mutante Cas9 é uma mutante de Cas9 nickase. As mutantes de Cas9 nickase compreendem apenas um domínio cataliticamente ativo (o domínio HNH ou o domínio RuvC). As mutantes de Cas9 nickase retêm a ligação do DNA com base na especificidade do gRNA, mas são capazes de cortar apenas uma fita de DNA, resultando em uma quebra de fita única (por exemplo, um "nick"). Em algumas modalidades, dois mutantes de Cas9 nickase complementares (por exemplo, uma mutante de Cas9 nickase com um domínio RuvC inativado e uma mutante de Cas9 nickase com um do- mínio HNH inativado) são expressos na mesma célula com dois gRNAs correspondentes a duas respectivas sequências alvo; uma se- quência alvo na fita de DNA sense e uma na fita de DNA antisense. Esse sistema de dupla nickase resulta em quebras na fita dupla esca- lonadas e pode aumentar a especificidade do alvo, pois é improvável que dois cortes fora do alvo sejam gerados perto o suficiente para ge- rar uma quebra na fita dupla. Em algumas modalidades, uma mutante de Cas9 nickase é co-expressa com um modelo de reparo de ácido nucleico para facilitar a incorporação de uma sequência de ácido nu- cleico exógena por reparo direcionado por homologia.
[00188] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de Cas descri- tos neste documento podem ser manipulados para alterar a especifici- dade de PAM/PFS do polipeptídeo de Cas. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de Cas mutante tem uma especificidade de PAM/PFS que é diferente da especificidade de PAM/PFS do polipeptídeo de Cas parental. por exemplo, uma proteína Cas de ocorrência natural pode ser modificada para alterar a sequência de PAM/PFS que o polipeptí- deo de Cas mutante reconhece para diminuir os sítios fora do alvo, melhorar a especificidade ou eliminar um requisito de reconhecimento de PAM/PFS. Em algumas modalidades, uma proteína Cas pode ser modificada para aumentar o comprimento da sequência de reconheci- mento de PAM/PFS. Em algumas modalidades, o comprimento da se- quência de reconhecimento de PAM tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8,9, 10 ou 15 aminoácidos de comprimento. Polipeptídeos de Cas que reco- nhecem diferentes sequências de PAM/PFS e/ou têm atividade fora do alvo reduzida podem ser gerados usando evolução direcionada. Méto- dos e sistemas exemplares que podem ser utilizados para evolução direcionada de polipeptídeos Cas são descritos, por exemplo, em Es- velt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503.
[00189] “Exemplos de Cas mutantes são descritos na Publicação Internacional PCT n.º WO 2015/161276 e Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676, que são incorporados neste documento por referên- cia na sua totalidade.
3. gRNAs
[00190] A presente divulgação fornece RNAs guia (gRNAs) que di- recionam um polipeptídeo modificador sítio-dirigido para uma sequên- cia de ácido nucleico alvo específica. Un gRNA compreende um seg- mento de direcionamento de ácido nucleico e um segmento de ligação à proteína. O segmento de ácido nucleico direcionado a um gRNA compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência na sequência de ácido nucleico alvo. Como tal, o seg- mento de direcionamento de ácido nucleico de um gRNA interage com um ácido nucleico alvo de uma maneira específica de sequência via hibridização (ou seja, emparelhamento de base), e a sequência de nu- cleotídeos do segmento de direcionamento de ácido nucleico determi-
na a localização dentro do ácido nucléico alvo ao qual o gRNA se liga- rá. O segmento de ácido nucleico direcionado a um gRNA pode ser modificado (por exemplo, por engenharia genética) para hibridizar com qualquer sequência desejada dentro de uma sequência de ácido nu- cleico alvo.
[00191] O segmento de ligação à proteína de um RNA guia interage com um polipeptídeo modificador dirigido ao local (por exemplo, uma proteína Cas) para formar um complexo. O RNA guia o polipeptídeo ligado a uma sequência de nucleotídeos específica dentro do ácido nucleico alvo através do segmento de direcionamento ao ácido nuclei- co descrito acima. O segmento de ligação à proteína de um gRNA guia compreende duas expansões de nucleotídeos que são complementa- res entre si e que formam um duplex de RNA de fita dupla.
[00192] Em algumas modalidades, um gRNA compreende duas mo- léculas de RNA separadas. Em tais modalidades, cada uma das duas moléculas de RNA compreende um trecho de nucleotídeos que são complementares entre si, de modo que os nucleotídeos complementa- res das duas moléculas de RNA hibridizam para formar o duplex de RNA de fita dupla do segmento de ligação à proteína. Em algumas modalidades, um gRNA compreende uma única molécula de RNA (S9RNA).
[00193] A especificidade de um gRNA para um loci alvo é mediada pela sequência do segmento de ligação ao ácido nucleico, que com- preende cerca de 20 nucleotídeos que são complementares a uma se- quência de ácido nucleico alvo dentro do locus alvo. Em algumas mo- dalidades, a sequência de ácido nucleico alvo correspondente tem aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento. Em algumas mo- dalidades, os segmentos de ligação de ácido nucleico das sequências de gRNA da presente divulgação são pelo menos 90% complementa- res a uma sequência de ácido nucleico alvo dentro de um locus alvo.
Em algumas modalidades, os segmentos de ligação de ácido nucleico das sequências de gRNA da presente divulgação são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementares a uma sequência de ácido nucleico alvo dentro de um locus alvo. Em algumas modalida- des, os segmentos de ligação de ácido nucleico das sequências de gRNA da presente divulgação são 100% complementares a uma se- quência de ácido nucleico alvo dentro de um locus alvo.
[00194] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo é uma sequência alvo de RNA. Em algumas modalidades, a se- quência de ácido nucleico alvo é uma sequência alvo de DNA. Em al- gumas modalidades, os segmentos de ligação de ácido nucleico das sequências de gRNA se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modali- dades, os segmentos de ligação de ácido nucleico das sequências de gRNA se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os segmentos de ligação de ácido nucleico das sequên- cias de grRNA se ligam a uma sequência de DNA alvo que é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1.
[00195] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, cada uma com- preendendo um segmento de ligação de DNA, em que pelo menos um dos segmentos de ligação de ácido nucleico se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo selecionado da Tabela 1. Em algumas modali- dades, o sistema de regulação de genes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, cada uma compreendendo um segmento de liga-
ção de ácido nucleico, em que pelo menos um dos segmentos de liga- ção de ácido nucleico se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a um alvo Sequência de DNA de um gene alvo selecionado da Tabela 1. Em algumas modali- dades, o sistema de regulação de genes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, cada uma compreendendo um segmento de liga- ção de ácido nucleico, em que pelo menos um dos segmentos de liga- ção de ácido nucleico se liga a uma sequência de DNA alvo que é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene alvo seleci- onado da Tabela 1.
[00196] Em algumas modalidades, os segmentos de ligação de áci- do nucleico das sequências de gRNA descritas neste documento são manipulados para minimizar a ligação fora do alvo usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, localizador Cas-OFF) para identi- ficar sequências alvo que são exclusivas para um locus alvo específico ou gene alvo.
[00197] Em algumas modalidades, os gRNAs descritos neste do- cumento podem compreender um ou mais nucleosídeos ou nucleotí- deos modificados que introduzem estabilidade em relação às nuclea- ses. Em tais modalidades, esses gRNAs modificados podem desenca- dear uma resposta de imunidade inata reduzida em comparação com um gRNA não modificado. O termo "resposta imune inata" inclui uma resposta celular a ácidos nucleicos exógenos, incluindo ácidos nuclei- cos de fita simples, geralmente de origem viral ou bacteriana, que en- volvem a indução da expressão e liberação de citocinas, particular- mente os interferons, e a morte celular.
[00198] Em algumas modalidades, os gRNAs descritos neste do- cumento são modificados na extremidade 5' ou próximos a ela (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 5'). Em algumas modalidades, a extremidade 5' de um gRNA é modificada pela inclusão de uma estrutura de tampa de mRNA eucariótica ou de um análogo de tampa (por exemplo, um análogo de tampa G(5')ppp(5')G, um análogo de tampa m7G(5')ppp(5')G ou um análogo anti tampa re- versa 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA)). Em algumas modalidades, um gRNA transcrito in vitro é modificado por tratamento com uma fos- fatase (por exemplo, fosfatase alcalina intestinal de bezerro) para re- mover o grupo trifosfato 5. Em algumas modalidades, um gRNA com- preende uma modificação na extremidade 3' ou próximo a ela (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 3'). por exemplo, em algumas modalidades, a extremidade 3' de um gRNA é modificada pela adição de um ou mais (por exemplo, 25-200) resí- duos de adenina (A).
[00199] Em algumas modalidades, nucleosídeos modificados e nu- cleotídeos modificados podem estar presentes em um gRNA, mas também podem estar presentes em outros sistemas de regulação de genes, por exemplo, sistemas baseados em mRNA, RNAi ou siRNA. Em algumas modalidades, nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem incluir um ou mais de: (a) alteração, por exemplo, substituição, de um ou ambos os oxigênios de fosfato não-ligados e/ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato de ligação na ligação da estrutura principal de fosfodiéster; (b) alteração, por exemplo, substituição, de um constituin- te do açúcar ribose, por exemplo, da hidroxila 2' no açúcar ribose; (c) substituição em massa da fração fosfato por ligantes peptídicos "defosfo"; (d) modificação ou substituição de uma nucleobase de ocorrência natural; (e) substituição ou modificação da cadeia principal da ri- bose-fosfato; (f)' modificação da extremidade 3' ou da extremidade 5'
do oligonucleotídeo, por exemplo, remoção, modificação ou substitui- ção de um grupo fosfato terminal ou conjugação de uma fração; e (9) modificação do açúcar.
[00200] Em algumas modalidades, as modificações listadas acima podem ser combinadas para fornecer nucleosídeos e nucleotídeos modificados que podem ter duas, três, quatro ou mais modificações. por exemplo, em algumas modalidades, um nucleosídeo ou nucleotí- deo modificado pode ter um açúcar modificado e uma nucleobase mo- dificada. Em algumas modalidades, toda base de um gRNA é modifi- cada. Em algumas modalidades, cada um dos grupos fosfato de uma molécula de gRNA é substituído por grupos fosforotioato.
[00201] Em algumas modalidades, uma ferramenta de software po- de ser usada para otimizar a escolha do gRNA na sequência alvo de um usuário, por exemplo, para minimizar a atividade total fora do alvo em todo o genoma. A atividade fora do alvo pode ser diferente da cli- vagem. por exemplo, para cada escolha possível de gRNA usando S. pyogenes Cas9, as ferramentas de software podem identificar todas as possíveis sequências fora do alvo (precedendo os NAM ou NGG PAMs) no genoma que contêm até um determinado número (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) de pares de bases incompatí- veis. A eficiência da clivagem em cada sequência fora do alvo pode ser prevista, por exemplo, usando um esquema de ponderação deri- vado experimentalmente. Cada possível gRNA pode ser classificado de acordo com sua clivagem total prevista fora do alvo; os gRNAs mais bem classificados representam aqueles com maior probabilidade de apresentar maior clivagem no alvo e menos fora do alvo. Outras funções, por exemplo, design automatizado de reagente para constru- ção do vetor de gRNA, desenho de primer para o ensaio Surveyor no alvo e projeto de primer para detecção de alto rendimento e quantifica- ção da clivagem fora do alvo via sequenciamento de próxima geração,
também podem ser incluídos na ferramenta. IV. Métodos de produção de células T reguladoras modificadas
[00202] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para a produção de Tregs modificadas. Em algumas modali- dades, os métodos compreendem a introdução de um sistema de re- gulação de genes em uma população de Tregs, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou a função de um ou mais genes alvo endógenos.
[00203] Os componentes dos sistemas de regulação de genes des- critos neste documento, por exemplo, um sistema baseado em ácido nucleico ou ácido nucleico/proteína pode ser introduzido nas células alvo em uma variedade de formas, usando uma variedade de métodos e formulações de distribuição. Em algumas modalidades, um polinu- cleotídeo que codifica um ou mais componentes do sistema é distribui- ção por um vetor recombinante (por exemplo, um vetor viral ou plas- mídeo). Em algumas modalidades, onde o sistema compreende mais do que um único componente, um vetor pode compreender uma plura- lidade de polinucleotídeos, cada um codificando um componente do sistema. Em algumas modalidades, onde o sistema compreende mais de um único componente, pode ser usada uma pluralidade de vetores, em que cada vetor compreende um polinucleotídeo que codifica um componente específico do sistema. Em algumas modalidades, um ve- tor também pode compreender uma sequência que codifica um peptí- deo de sinal (por exemplo, para localização nuclear, localização nucle- olar, localização mitocondrial), fundida ao polinucleotídeo que codifica o um ou mais componentes do sistema. por exemplo, um vetor pode compreender uma sequência de localização nuclear (por exemplo, de SVA40) fundida ao polinucleotídeo que codifica o um ou mais compo- nentes do sistema. Em algumas modalidades, a introdução do sistema de regulação de genes na célula ocorre in vitro. Em algumas modali-
dades, a introdução do sistema de regulação de genes na célula ocor- re in vivo. Em algumas modalidades, a introdução do sistema de regu- lação de genes na célula ocorre ex vivo.
[00204] Em algumas modalidades, o vetor recombinante compre- endendo um polinucleotídeo que codifica um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descrito neste documento é um vetor viral. Os vetores virais adequados incluem, mas não estão limita- dos a, vetores virais baseados no vírus vaccinia; poliovírus; adenovírus (ver, por exemplo, Li et a/., Invest Opthalmol Vis Sci 35: 2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6: 515 524, 1999; Li e Davidson, PNAS 92: 7700 7704, 1995; Sakamoto et al, H Gene Ther 5: 1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adeno-associado (ver, por exemplo, Patente US. nº 7.078.387; Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et a/, PNAS 94: 6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Op- thalmol Vis Sci 38: 2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4: 683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10: 641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5: 591 594, 1996; Srivastava em WO 93/09239, Sa- mulski et al., J. Vir. (1989) 63: 3822-3828; Mendelson et al,, Virol. (1988) 166: 154-165; e Flotte et al, PNAS (1993) 90: 10613-10617); SVAO; vírus do herpes simplex; vírus da imunodeficiência humana (ver, por exemplo, Miyoshi et a/., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J. Virol 73: 7812 7816, 1999); um vetor retroviral (por exemplo, ví- rus da leucemia murina, vírus da necrose do baço e vetores derivados de retrovírus, como o vírus Rous Sarcoma, Harvey Sarcoma, vírus de leucose aviária, um lentivírus, vírus de imunodeficiência humana, vírus mieloproliferativo de sarcoma e vírus de tumor mamário); e similar.
[00205] Em algumas modalidades, o vetor recombinante compre- endendo um polinucleotídeo que codifica um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descrito neste documento é um plasmídeo. Numerosos vetores de expressão de plasmídeo adequa- dos são conhecidos dos versados na técnica, e muitos estão comerci- almente disponíveis. Os vetores que se seguem são fornecidos a título de exemplo; para as células hospedeiras eucarióticas: pXKT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG e pSVLSV40 (Pharmacia). No entan- to, qualquer outro vetor de plasmídeo pode ser utilizado desde que seja compatível com a célula hospedeira. Dependendo do tipo de célula e sis- tema de regulação de genes utilizado, qualquer um de vários elementos de controle de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos de potencializador de transcrição, terminadores de transcrição, etc., pode ser usado no vetor de expres- são (ver por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
[00206] Em algumas modalidades, uma sequência polinucleotídica que codifica um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descrito neste documento está operacionalmente ligada a um elemento de controle, por exemplo, um elemento de controle transcri- cional, como um promotor. O elemento de controle da transcrição pode ser funcional em uma célula eucariótica (por exemplo, uma célula de mamífero) ou uma célula procariótica (por exemplo, bacteriana ou cé- lula de Archaea). Em algumas modalidades, uma sequência polinucle- otídica que codifica um ou mais componentes de um sistema de regu- lação de genes descrito neste documento está operacionalmente liga- da a múltiplos elementos de controle que permitem a expressão do polinucleotídeo nas células procarióticas e eucarióticas. Dependendo do tipo de célula e sistema de regulação de genes utilizado, qualquer um de vários elementos de controle de transcrição e tradução adequa- dos, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos de po- tencializador de transcrição, terminadores de transcrição, etc., pode ser usado no vetor de expressão (ver por exemplo, Bitter et al. (1987)
Methods in Enzymology, 153:516-544).
[00207] Exemplos não limitantes de promotores eucarióticos ade- quados (promotores funcionais em uma célula eucariótica) incluem aqueles de citomegalovírus (CMV) precoce, timidina quinase do vírus de herpes simples (HSV), SV40 precoce e tardia, repetições terminais longas (LTRs) do retrovírus, e metalotioneína-l de camundongo. A se- leção do vetor e promotor adequado é bem dentro do nível dos versa- dos na técnica. O vetor de expressão também pode conter um sítio de ligação de ribossomo para a iniciação da tradução e um terminador de transcrição. O vetor de expressão também pode incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão. O vetor de expressão tam- bém pode incluir sequências nucleotídicas que codificam tags de pro- teínas (por exemplo, tag 6xHis, tag de hemaglutinina, proteína fluores- cente verde, etc.) que são fundidos ao polipeptídeo modificador sítio- dirigido, resultando assim em um polipeptídeo quimérico.
[00208] Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeos que codifica um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descritos neste documento está operacionalmente ligada a um promotor induzível. Em algumas modalidades, a sequência de polinu- cleotídeos que codificam um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descritos neste documento estão operacionalmen- te ligados a um promotor constitutivo.
[00209] Os métodos de introdução de polinucleotídeos e vetores recombinantes em uma célula hospedeira são conhecidos na técnica, e qualquer método conhecido pode ser usado para introduzir compo- nentes de um sistema de regulação de genes em uma célula. Os mé- todos adequados incluem, por exemplo, infecção viral ou bacteriófago, transfecção, conjugação, fusão de protoplastos, lipofecção, eletropora- ção, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polieti- lenoimina (PEI), transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossomas, tecnologia de pistola de partículas, precipita- ção de fosfato de cálcio, micro injeção direta, distribuição de ácido nu- cleico mediada por nanopartículas (ver, por exemplo, Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012, setembro 13, pii: S0169-409X (12) 00283- 9), métodos de distribuição de microfluídicos (ver, por exemplo, Publi- cação Internacional PCT Nº WO 2013/059343) e semelhantes. Em al- gumas modalidades, a distribuição por eletroporação compreende mis- turar as células com os componentes de um sistema de regulação de genes em um cartucho, câmara ou cubeta e aplicar um ou mais impul- sos elétricos de duração e amplitude definidas. Em algumas modalida- des, as células são misturadas com componentes de um sistema de regulação de genes em um vaso conectado a um dispositivo (por exemplo, uma bomba) que alimenta a mistura em um cartucho, câma- ra ou cubeta em que um ou mais impulsos elétricos de duração defini- da e amplitude são aplicados, após o que as células são distribuídas a um segundo vaso.
[00210] Em algumas modalidades, um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes ou sequência de polinucleotídeos que codificam um ou mais componentes de um sistema de regulação des- crito neste documento são introduzidos em um veículo de distribuição não viral, como um transposon, uma nanopartícula (por exemplo, uma nanopartícula lipídica), um lipossomo, um exossomo, uma bactéria atenuada ou uma partícula semelhante a vírus. Em algumas modali- dades, o veículo é uma bactéria atenuada (por exemplo, manipulada naturalmente ou artificialmente para ser invasiva, mas atenuada para evitar patogênese, incluindo Listeria monocytogenes, certas cepas de Salmonella , Bifidobacterium longum, e Escherichia coli modificada), bactérias com tropismo nutricional e específico do tecido para direcio- nar células específicas e bactérias que possuem proteínas de superfí- cie modificadas para alterar a especificidade da célula alvo. Em algu-
mas modalidades, o veículo é um bacteriófago geneticamente modifi- cado (por exemplo, fagos manipulados com grande capacidade de empacotamento, menos imunogenicidade, contendo sequências de manutenção de plasmídeo de mamífero e tendo ligantes de direciona- mento incorporados). Em algumas modalidades, o veículo é uma par- tícula semelhante a vírus de mamífero. por exemplo, partículas virais modificadas podem ser geradas (por exemplo, pela purificação das partículas "vazias" seguidas pela montagem ex vivo do vírus com a carga desejada). O veículo também pode ser manipulado para incor- porar ligantes de direcionamento para alterar a especificidade do teci- do alvo. Em algumas modalidades, o veículo é um lipossoma biológi- co. por exemplo, o lipossoma biológico é uma partícula fosfolipídica derivada de células humanas (por exemplo, hemácias-fantasma, que são glóbulos vermelhos quebrados em estruturas esféricas derivadas do indivíduo e em que o direcionamento do tecido pode ser alcançado pela ligação de vários tecidos ou células ligantes específicas), exos- somos secretores ou nanovescículas ligadas à membrana (30-100 nm) de origem endocítica (por exemplo, podem ser produzidas a partir de vários tipos de células e, portanto, podem ser absorvidas pelas células sem a necessidade de direcionar ligantes).
[00211] Em algumas modalidades, os métodos de Tregs modifica- das descritos neste documento compreendem a obtenção de uma po- pulação de Tregs a partir de uma amostra. Em algumas modalidades, uma amostra compreende uma amostra de tecido, uma amostra de fluido, uma amostra de célula, uma amostra de proteína ou uma amos- tra de DNA ou RNA. Em algumas modalidades, uma amostra de tecido pode ser derivada de qualquer tipo de tecido no corpo, incluindo, mas não se limitando a intestino, pele, pulmão, fígado, baço, nódulos linfá- ticos e meios de cultura de células de tecido adiposo compreendendo uma ou mais populações de células, soluções tamponadas compreen-
dendo uma ou mais populações de células e semelhantes.
[00212] Em algumas modalidades, a amostra é processada para enriquecer ou isolar um determinado tipo de célula, como uma Treg, do restante da amostra.
[00213] Em algumas modalidades, as Tregs isoladas são expandi- das em cultura para produzir uma população expandida de Tregs. Um ou mais fatores de ativação ou de crescimento podem ser adicionados ao sistema de cultura durante o processo de expansão. por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais citocinas (como TGF-B e/ou IL-2) podem ser adicionadas ao sistema de cultura para aumentar ou promover a proliferação e expansão celular. Em algumas modalidades, um ou mais anticorpos ativadores, como um anticorpo anti-CD3, po- dem ser adicionados ao sistema de cultura para aumentar ou promo- ver a proliferação e expansão celular. Em algumas modalidades, as Tregs podem ser co-cultivadas com células alimentadoras durante o processo de expansão. Em algumas modalidades, os métodos forne- cidos neste documento compreendem uma ou mais fases de expan- são. Os métodos para expansão ex vivo de células imunes são conhe- cidos na técnica, por exemplo, conforme descrito nos Publicadores de Pedidos de Patente US. 20180282694 e 20170152478 e Patentes US.
8.383.099 e 8.034.334.
[00214] Em qualquer ponto durante o processo de cultura e expan- são, os sistemas de regulação de genes descritos neste documento podem ser introduzidos nas Tregs para produzir uma população de Tregs modificadas. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de Tregs imediatamente após o enriquecimento de uma amostra. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de Tregs antes, du- rante ou após o um ou mais processos de expansão. Em algumas mo- dalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na popula-
ção de Tregs imediatamente após o enriquecimento de uma amostra ou colheita de um indivíduo e antes de qualquer ciclo de expansão. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introdu- zido na população de Tregs após a expansão.
[00215] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas produzi- das pelos métodos descritos neste documento podem ser usadas ime- diatamente. Alternativamente, as células podem ser congeladas em temperaturas de nitrogênio líquido e armazenadas por longos períodos de tempo, sendo descongeladas e passíveis de reutilização. Nesses casos, as células geralmente serão congeladas em dimetilsulfóxido a 10% (DMSO), 50% de soro, 40% de meio tamponado ou alguma outra solução comumente usada na técnica para preservar as células em temperaturas tão baixas e descongeladas de uma maneira como vul- garmente conhecido na técnica para descongelar células cultivadas congeladas.
[00216] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas podem ser cultivadas in vitro sob várias condições de cultura. As células podem ser expandidas em cultura, isto é, cultivadas em condições que pro- movam sua proliferação. O meio de cultura pode ser líquido ou semis- sólido, por exemplo, contendo ágar, metilcelulose, etc. A população de células pode ser suspensa em um meio nutriente apropriado, tal como DMEM modificado de Iscove ou RPMI 1640, normalmente suplemen- tado com soro fetal de bezerro (cerca de 5-10%), L-glutamina, um tiol, particularmente 2-mercaptoetanol e antibióticos, por exemplo, penicili- na e estreptomicina. A cultura pode conter fatores de crescimento aos quais as células T reguladoras respondem. Fatores de crescimento, conforme definidos neste documento, são moléculas capazes de pro- mover a sobrevida, crescimento e/ou diferenciação de células, seja em cultura ou no tecido intacto, por meio de efeitos específicos em um re- ceptor transmembrana. Os fatores de crescimento incluem polipeptí-
deos e fatores não polipeptídicos.
A. Produção de células T reguladoras modificadas usando siste- mas CRISPR/Cas
[00217] Em algumas modalidades, um método de produção de uma Treg modificada envolve o contato de uma sequência de DNA alvo com um complexo compreendendo um gRNA e um polipeptídeo Cas. Conforme discutido acima, um gRNA e o polipeptídeo Cas formam um complexo, em que o domínio de ligação ao DNA do gRNA direciona o complexo para uma sequência de DNA alvo e em que a proteína Cas (ou proteína heteróloga fundida a uma proteína Cas enzimaticamente inativa) modifica a sequência de DNA alvo. Em algumas modalidades, este complexo é formado intracelularmente após a introdução do gRNA e da proteína Cas (ou polinucleotídeos que codificam o gRNA e as proteínas Cas) a uma célula. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico que codifica a proteína Cas é um ácido nucleico do DNA e é in- troduzido na célula por transdução. Em algumas modalidades, os componentes Cas9 e gRNA de um sistema de edição de genes CRISPR/Cas são codificados por uma única molécula de polinucleotí- deo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a prote- ína Cas e o componente de gRNA são compreendidos em um vetor viral e introduzidos na célula por transdução viral. Em algumas modali- dades, os componentes Cas9 e gRNA de um sistema de edição de genes CRISPR/Cas são codificados por diferentes moléculas de poli- nucleotídeo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a proteína Cas é compreendido em um primeiro vetor viral e o polinu- cleotídeo que codifica o gRNA é compreendido em um segundo vetor viral. Em alguns aspectos desta modalidade, o primeiro vetor viral é introduzido em uma célula antes do segundo vetor viral. Em alguns aspectos desta modalidade, o segundo vetor viral é introduzido em uma célula antes do primeiro vetor viral. Em tais modalidades, a inte-
gração dos vetores resulta na expressão sustentada dos componentes Cas9 e gRNA. No entanto, a expressão sustentada de Cas9 pode le- var ao aumento de mutações fora do alvo e ao corte em alguns tipos de células. Portanto, em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico de mRNA que codifica a proteína Cas pode ser introdu- zida na população de células por transfecção. Em tais modalidades, a expressão de Cas9 diminuirá ao longo do tempo e pode reduzir o nú- mero de mutações fora do alvo ou sítios de corte.
[00218] Em algumas modalidades, este complexo é formado em um sistema livre de células, misturando as moléculas de gRNA e as prote- ínas Cas e incubando por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos. Este complexo pré-formado, compreenden- do o gRNA e a proteína Cas e referido neste documento como uma ribonucleoproteína CRISPR (CRISPR-RNP) pode então ser introduzi- do em uma célula para modificar uma sequência de DNA alvo. B. Produção de células T reguladoras modificadas usando siste- mas sShRNA
[00219] Em algumas modalidades, um método de produção de uma Treg modificada que introduz na célula um ou mais polinucleotídeos de DNA que codificam uma ou mais moléculas de SshRNA com sequência complementar ao transcrito de MRNA de um gene alvo. A Treg pode ser modificada para produzir o ShRNA através da introdução de se- quências específicas de DNA no núcleo da célula por meio de uma pequena cassete gênica. Ambos os retrovírus e lentivírus podem ser usados para introduzir DNAs que codificam shRNA em Tregs. O DNA introduzido pode tornar-se parte do próprio DNA da célula ou persistir no núcleo e instrui a maquinaria celular a produzir SNRRNAs. Os shR- NAs podem ser processados pela atividade do cortador mediado por Dicer ou AGO?2 dentro da célula para induzir o knockdown do gene mediado por RNAi.
V. Composições e Kits
[00220] O termo "composição", conforme usado neste documento, refere-se a uma formulação de um sistema regulador de genes ou uma Treg modificada descrita neste documento que é capaz de ser admi- nistrada ou distribuída a um indivíduo ou célula. Tipicamente, as for- mulações incluem todas as composições fisiologicamente aceitáveis, incluindo derivados e/ou pró-drogas, solvatos, estereoisômeros, race- matos ou tautômeros deste, com quaisquer carreadores, diluentes e/ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Uma "composição tera- pêutica" ou "composição farmacêutica" (usada de forma intercambiável neste documento) é uma composição de um sistema de regulação de genes ou de uma Treg modificada capaz de ser administrada a um in- divíduo para o tratamento de uma doença ou distúrbio específico ou contatada com uma célula para modificação de um ou mais genes alvo endógenos.
[00221] A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada neste documento para se referir àqueles compostos, materiais, com- posições e/ou formas de dosagem que estão, dentro do escopo do bom julgamento médico, adequados para uso em contato com os teci- dos de seres humanos e animais sem excesso de toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma razão de benefício/risco aceitável.
[00222] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece kits para a realização de um método descrito neste documento. Em algumas modalidades, um kit pode incluir: (a) uma ou mais moléculas de ácido nucleico capazes de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codi- ficado por um ou mais genes alvo endógenos; (b) um ou mais polinucleotídeos que codificam uma molé- cula de ácido nucleico que é capaz de reduzir a expressão ou modifi-
car a função de um produto gênico codificado por um ou mais genes alvo endógenos;
(c) uma ou mais proteínas de ácido nucleico capazes de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codi- ficado por um ou mais genes endógenos alvo;
(d) um ou mais polinucleotídeos que codificam uma prote- ína de modificação que é capaz de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codificado por um ou mais genes alvo endógenos;
(e) um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma se- quência de DNA alvo em um gene endógeno;
(f) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(9) um ou mais polipeptídeos modificadores sítio-dirigidos, capazes de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(h) um ou mais polinucleotídeos que codificam um poli- peptídeo modificador sítio-dirigido, capaz de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(i) um ou mais DNAs guia (gDNAs) capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
()) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gDNAs capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(k) um ou mais polipeptídeos modificadores sítio-dirigidos, capazes de interagir com um gDNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno;
(1) um ou mais polinucleotídeos que codificam um poli- peptídeo modificador sítio-dirigido, capaz de interagir com um gDNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno; (m) um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma se- quência de mRNA codificada por um gene endógeno; (n) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequência de mMRNA codifica- da por um gene endógeno; (o) um ou mais polipeptídeos modificadores sítio-dirigidos, capazes de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de MRNA codificada por um gene endógeno; (p) um ou mais polinucleotídeos que codificam um poli- peptídeo de modificação sítio-dirigido, capaz de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de mMRNA alvo por um gene endó- geno; (a) uma Treg modificada descrita neste documento; ou qualquer combinação dos citados acima.
[00223] Em algumas modalidades, o kit compreende um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes (ou um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais componentes) e um rea- gente para reconstituir e/ou diluir os componentes. Em algumas moda- lidades, um kit compreendendo um ou mais componentes de um sis- tema de regulação de genes (ou um ou mais polinucleotídeos que co- dificam um ou mais componentes) e compreende ainda um ou mais reagentes adicionais, onde esses reagentes adicionais podem ser se- lecionados a partir de: um tampão para introduzir o sistema de regula- ção de genes numa célula; um tampão de lavagem; um reagente con- trole; um vetor de expressão controle ou polinucleotídeo de RNA; um reagente para a produção in vitro do sistema de regulação de genes a partir do DNA e semelhantes. Os componentes de um kit podem estar em recipientes separados ou podem ser combinados em um único re- cipiente.
[00224] Além dos componentes mencionados acima, em algumas modalidades um kit compreende ainda instruções para o uso dos componentes do kit para praticar os métodos da presente divulgação. As instruções para a prática de métodos são gravadas em uma mídia de gravação adequada. por exemplo, as instruções podem ser impres- sas em um substrato, como papel ou plástico, etc. Como tal, as instru- ções podem estar presentes nos kits como uma bula ou na rotulagem do recipiente do kit ou seus componentes (ou seja, associadas à em- balagem ou embalagem interna) etc. Em outras modalidades, as ins- truções estão presentes como um arquivo de dados de armazenamen- to eletrônico presente num meio de armazenamento legível por com- putador adequado, por exemplo, CD-ROM, disquete, unidade flash, etc. Em outras modalidades, as instruções de verdade não estão pre- sentes no kit, mas meios para obtenção das instruções a partir de uma fonte remota, por exemplo, através da internet, são fornecidos. Um exemplo desta modalidade é um Kkit que inclui um endereço web onde as instruções podem ser visualizadas e/ou a partir do qual as instru- ções podem ser baixadas. Como com as instruções, este meio para obtenção das instruções é gravado em um substrato adequado. VI. Métodos Terapêuticos e Aplicações
[00225] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas e os sis- temas de regulação de genes descritos neste documento podem ser utilizados em uma variedade de aplicações terapêuticas. por exemplo, em algumas modalidades, as Tregs modificadas e/ou sistemas regula- dores de genes descritos neste documento podem ser administrados a um indivíduo para fins como terapia gênica, por exemplo, para tratar uma doença, para uso como um agente terapêutico de doença autoi- mune ou para pesquisa biológica.
[00226] Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um recém- nascido, um jovem ou um adulto. De particular interesse são indiví-
duos mamíferos. As espécies de mamíferos que podem ser tratadas com os presentes métodos incluem caninos e felinos; equinos; bovi- nos; ovinos; etc. e primatas, particularmente humanos. Modelos ani- mais, particularmente mamíferos pequenos (por exemplo , camundon- gos, ratos, porquinhos-da-índia, hamsters, coelhos, etc.) podem ser usados para investigações experimentais.
[00227] A administração das Tregs modificadas descritas neste do- cumento, populações e composições destas podem ocorrer por inje- ção, irrigação, inalação, consumo, eletro-osmose, hemodiálise, iontofo- rese e outros métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalida- des, a via de administração é local ou sistêmica. Em algumas modali- dades, a via de administração é intra-arterial, intracraniana, intradérmi- ca, intraduodenal, intramamária, intrameníngea, intraperitoneal, intra- tecal, intratumoral, intravenosa, intravítrea, oftálmica, parenteral, espi- nhal, subcutânea, ureteral, uretral, vaginal ou intrauterina.
[00228] Em algumas modalidades, a via de administração é por in- fusão (por exemplo, contínua ou em bolus). Exemplos de métodos pa- ra administração local, isto é, distribuição ao sítio da lesão ou doença, incluem através de um reservatório Ommaya, por exemplo , para dis- tribuição intratecal (ver , por exemplo, as Patentes US N.º 5.222.982 e
5.385.582, incorporadas neste documento por referência); por injeção em bolus, por exemplo, por uma seringa, por exemplo , em uma junta; por infusão contínua, por exemplo , por canulação, como por convec- ção (ver , por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US. Nº 2007- 0254842, incorporada neste documento por referência); ou implantan- do um dispositivo no qual as células foram fixadas reversivelmente (ver, por exemplo , as Publicações de Pedido de Patente US. N.º 2008-0081064 e 2009-0196903, incorporadas neste documento por referência). Em algumas modalidades, a via de administração é por administração tópica ou injeção direta. Em algumas modalidades, as
Tregs modificadas descritas neste documento podem ser fornecidas ao indivíduo isoladamente ou com um substrato ou matriz adequado, por exemplo, para apoiar seu crescimento e/ou organização no tecido para o qual estão sendo transplantados.
[00229] Em algumas modalidades, pelo menos 1 x 10º células são administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, pelo menos x 10º células, 1 x 10º células, 5 x 10º células, 1 x 10º células, 5 x 105 células, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5x 106, 1 x 107, 1x 10%, 5x 108, 1 x 10º, 5x 10º, 1 x 107%, 5x 10%, 1x 10, 5x107, 1x102, 5x 10º? ou mais células são administradas para um assunto. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10'? células são administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º? células são administradas a um indiví- duo. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10"? células são administradas a um indivíduo. Em algumas modalida- des, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10? células são adminis- tradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 10" e cerca de 1 x 10"? células são administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10 célu- las são administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10º células são administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1x 10º células são administradas a um indivíduo. Em algumas modali- dades, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10º células são adminis- tradas a um indivíduo. O número de administrações de tratamento a um indivíduo pode variar. Em algumas modalidades, a introdução das Tregs modificadas no indivíduo pode ser um evento único. Em algu- mas modalidades, tal tratamento pode exigir uma série contínua de tratamentos repetidos. Em algumas modalidades, múltiplas adminis- trações das Tregs modificadas podem ser necessárias antes que um efeito seja observado. Os protocolos exatos dependem da doença ou condição, do estágio da doença e dos parâmetros do indivíduo a ser tratado.
[00230] Em algumas modalidades, os sistemas de regulação de genes descritos neste documento são empregados para modificar DNA ou RNA celular in vivo, como para terapia genética ou para pes- quisa biológica. Em tais modalidades, um sistema de regulação de ge- nes pode ser administrado diretamente ao indivíduo, como pelos mé- todos descritos supra. Em algumas modalidades, os sistemas de regu- lação de genes descritos neste documento são empregados para a modificação ex vivo ou in vitro de uma população de Tregs. Em tais modalidades, os sistemas reguladores de genes descritos neste do- cumento são administrados a uma amostra compreendendo Tregs.
[00231] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento são administradas a um indivíduo. Em algumas mo- dalidades, as Tregs modificadas descritas administradas a um indiví- duo são Tregs autólogas. O termo "autólogo", neste contexto, refere- se a células que foram derivadas do mesmo indivíduo ao qual são ad- ministradas. por exemplo, as Tregs podem ser obtidas de um indiví- duo, modificadas ex vivo de acordo com os métodos descritos neste documento e depois administradas ao mesmo indivíduo, a fim de tratar uma doença. Em tais modalidades, as células administradas ao indiví- duo são Tregs autólogas. Em algumas modalidades, as Tregs modifi- cadas, ou composições das mesmas, administrados a um indivíduo são Tregs alogênicas. O termo "alogênico", neste contexto, refere-se a células que foram derivadas de um indivíduo e são administradas a outro indivíduo. por exemplo, as Tregs podem ser obtidas de um pri- meiro indivíduo, modificadas ex vivo de acordo com os métodos des- critos neste documento e depois administradas a um segundo indiví- duo, a fim de tratar uma doença. Em tais modalidades, as células ad-
ministradas ao indivíduo são Tregs alogênicas.
[00232] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas descritas neste documento são administradas a um indivíduo a fim de tratar uma doença. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a distri- buição de uma quantidade eficaz de uma população de células (por exemplo, uma população de Tregs modificadas) ou composição destas a um indivíduo em necessidade desta. Em algumas modalidades, o tratamento refere-se ao tratamento de uma doença em um mamífero, por exemplo, em um humano, incluindo (a) inibição da doença, ou se- ja, interrompendo o desenvolvimento da doença ou impedindo a pro- gressão da doença; (b) alívio da doença, ou seja, causar regressão do estado da doença ou aliviar um ou mais sintomas da doença; e (c) cu- ra da doença, ou seja, remissão de um ou mais sintomas da doença. Em algumas modalidades, o tratamento pode referir-se a uma redução a curto prazo (por exemplo, temporária e/ou aguda) e/ou a longo prazo (por exemplo, sustentada) em um ou mais sintomas da doença. Em algumas modalidades, o tratamento resulta em uma melhoria ou cor- reção dos sintomas da doença. A melhora é uma melhora observável ou mensurável, ou pode ser uma melhora no sentimento geral de bem- estar do indivíduo.
[00233] A quantidade eficaz de uma Treg modificada administrada a um indivíduo em particular dependerá de uma variedade de fatores, vários dos quais diferirão de paciente para paciente, incluindo o distúr- bio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; atividade do(s) agente(s) específico(s) empregado(s); a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o momento da administração, via de administração; a duração do tratamento; drogas usadas em combina- ção; o julgamento do médico prescritor; e fatores semelhantes conhe- cidos nas técnicas médicas.
[00234] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de Tregs modificados será de pelo menos 1 x103 células, por exemplo 5 x 103 células, 1 x 10º células, 5 x 10º células, 1 x 10º células, 5 x 10º células, 1x 1086, 2x 1086, 3 x 106, 4 x 106, 5x 106, 1 x 107, 1x 108, 5x 108, 1 x 10º, 5 x 10%, 1 x 10%, 5 x 10%, 1 x 1071, 5x 107, 1 x 1072, 5 x 1072, ou mais células.
[00235] Em algumas modalidades, as Tregs modificadas e os sis- temas de regulação de genes descritos neste documento podem ser usados no tratamento de um distúrbio autoimune. A menos que indi- cado o contrário, os termos "distúrbio" e "doença" são usados de forma permutável neste documento. O termo "distúrbio autoimune", conforme aqui utilizado, é uma doença ou distúrbio decorrente de e dirigido con- tra os próprios tecidos ou órgãos de um indivíduo ou um co-segregado ou manifestação dos mesmos ou condição resultante dos mesmos. As doenças autoimunes são causadas principalmente pela desregulação das respostas imunes adaptativas e são formados autoanticorpos ou células T autorreativas contraestruturas próprias.
[00236] Os distúrbios autoimunes de exemplo incluem hepatite au- toimune, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn, colite, colite ulcerativa, diabetes tipo 1, alopecia areata, vasculite, artrite tem- poral, lúpus, doença celíaca, síndrome de Sjogren, polimialgia reumá- tica, esclerose múltipla, artrite, artrite reumatoide, doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) e psoríase. Incorporação a Título de Referência
[00237] Todas as referências, artigos, publicações, patentes, publi- cações de patentes e pedidos de patente citados neste documento são incorporados por referência na sua totalidade para todas as finalida- des. Entretanto, a menção de qualquer referência, artigo, publicação, patente, publicação de patente e pedido de patente mencionado no presente documento não é, e não deve ser tomado como, um reco- nhecimento ou qualquer forma de sugestão de que os mesmos consti-
tuam técnica anterior válida ou façam parte do conhecimento geral comum em qualquer país do mundo.
Exemplos Exemplo 1: Materiais e Métodos
[00238] Os experimentos aqui descritos utilizam o sistema CRISPR/Cas9 para modular a expressão de genes alvo endógenos em células T reguladoras (Treg) para seu uso clínico como imunotera- pia para o tratamento de doenças autoimunes.
|. Materiais
[00239] gRNAs: Salvo indicação em contrário, todas as experiên- cias utilizam gRNAs de molécula única (sgRNAs). As moléculas de gRNA duplo foram usadas conforme indicado e foram formadas por duplexação de tracr»RNA 200 uM (IDT Cat nº 1072534) com 200 uM de crRNA específico do alvo (IDT) em tampão duplex livre de nuclease (IDT Cat nº 11-01-03-01) para 5 min a 95 ºC, para formar 100 uM de tracrRNA: crRNA duplex, onde o tracrRNA e o crRNA estão presentes na razão de 1:1.
[00240] Cas9:Casg9 foi expresso nas células alvo por introdução de MRNA de Cas9 ou de uma proteína Cas9. Salvo indicação em contrá- rio, o MRNA que codifica Cas9 que compreende uma sequência de localização nuclear (MRNA de Cas9-NLS) derivada de S. pyogenes (Trilink L-7206) ou proteína Cas9 derivada de S. pyogenes (IDT Cat nº 1074182) foi usado nas seguintes experiências.
[00241] — RNPs: as ribonucleoproteínas de gRNA-Cas9 (RNP's) foram formadas pela combinação de 1,2 ul de truRRNA 100 UM: duplex de crRNA com 1 uL de proteína Cas9 20 uM e 0,8 uL de PBS. As mistu- ras foram incubadas a TA durante 20 minutos para formar os comple- xos RNP.
[00242] —Construtos de expressão lentiviral: Uma biblioteca de
56.408 sgRNAs, cada um direcionado a um único gene no genoma humano, foi clonada em um vetor de expressão contendo o promotor U6 humano. No total, 5.137 genes foram direcionados por esta biblio- teca de gRNAs. Os plasmídeos compreendiam ainda um promotor EF1L que dirige a expressão de RFP, uma sequência T2A e uma cas- sete de resistência à puromicina.
[00243] Lentivífus que codificam a biblioteca de saRNA descrita acima foram gerados como segue. Resumidamente, 578 x 10º das cé- lulas LentiX-293T foram plaqueadas em um CellSTACK de 10 cama- das 24 horas antes da transfecção. OptiMEM sem soro, TransIT-293 e plasmídeos auxiliares (116 ug VSVG e 231 ug PAX2-Gag-Pol) foram combinados com 462 ug de plasmídeos que expressam sgRNA descri- tos acima e incubados por 5 minutos. Essa mistura foi adicionada às células LentiX-293T com meios frescos. Os meios foram substituídos 18 horas após a transfecção e os sobrenadantes virais foram coleta- dos 48 horas após a transfecção. Os sobrenadantes foram tratados com nuclease Benzonase? e passados através de um filtro de 0,45 um para isolar as partículas virais. As partículas virais foram então concentradas por Filtragem de Fluxo Tangencial (TFF), divididas em alíquotas, tituladas e armazenadas a -80 ºC.
1. Métodos
[00244] Isolamento de células Treg humanas: Células Treg de san- gue periférico e efetoras CD4+ T (Teff) foram isoladas de leucopacks frescos ou sangue total de doadores de sangue voluntários saudáveis de uma maneira gradual. Primeiro, as células mononucleares do san- gue periférico (PBMCs) foram obtidas por centrifugação em gradiente de Ficoll. Em seguida, as células T CD4 + foram isoladas por meio de seleção imunomagnética negativa usando EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit (StemCell Technologies, Cat % 17952). Para enriquecimento de Tregs, células T CD4+ isoladas foram ainda marcadas com um anti- corpo monoclonal contra CD25-PE seguido por seleção positiva usando
EasySep Human PE Positive Selection Kit (StemCell Technologies, Cat t 18561). As células CD4+CD25+ enriquecidas foram subsequentemente marcadas com anticorpos monoclonais específicos para CD4 e CD127 antes da seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) para obter uma população pura de Tregs. Tregs foram classificadas com base nos seguintes parâmetros: CD4+CD25"'8"CD 127”,
[00245] “Expansão de células Treg humanas ex vivo: Tregs isoladas foram semeadas a 2 x 10º células/mlL em meio de expansão de células T X-VIVO 15 (Lonza, Cat tt 04-418Q) suplementado com soro humano inativado AB (10%) e IL- humano 2 (60 ng/ml ou 300 unidades/ml). No dia O e no dia 10 de cultura, grânulos de expansão Treg anti- CD3/CD28 ou ativadores de células T CD3/CD28/CD2 humanos Immunocult (tetraméricos) foram adicionados à cultura a uma razão célula:esfera de 1:4 ou 1:1, respectivamente, ou de forma 1X no caso dos ativadores. IL-2 humana adicional foi suplementada à cultura a cada 2-3 dias.
[00246] Transdução lentiviral de células Treg: Após 10 dias de ex- pansão, Treg foram reativadas usando esferas expansoras anti- CD3/CD28 Treg por 18 horas antes de serem semeadas em 5 x 10º células por poço em uma placa de 6 poços, em volume de 1,5 mL de meio X-VIVO 15, 6 ng/mL de IL-2 humana. Após a mesma expansão, os Teff foram reativados usando ativadores de células T CD3/CD28/CD2 Humano Immunocult por 18 horas antes de serem semeados a 5 x 10º células por poço em uma placa de 6 poços em volume de 1,5 mL de X- VIVO 15 meio, 10 ng/mL de IL-2 humana. Lentivirus expressando bi- blioteca de sgRNA foi adicionado separadamente a ambos os tipos de células em um MOI capaz de infectar 80% de todas as células. Foram adicionados 20 uL de Retronectina (1 mg/mL) a cada poço. Os meios X-VIVO 15 foram adicionados a um volume final de 2,0 mL por poço. As placas foram centrifugadas a 600 x g durante 1,5 horas a tempera-
tura ambiente. Após 18 horas (dia 2), as células foram lavadas e se- meadas a 1 x10º células/mL em X-VIVO 15. Para culturas de Treg, 60 ng/mL IL2 foi adicionado e para culturas Teff, 10 ng/mL IL2 e ativado- res de células T foram adicionados.
[00247] —Eletroporação de células T: Onde indicado, gRNAs e/ou Cas9 foram introduzidos nas células Treg por eletroporação. por exemplo, onde as células Treg foram transduzidas com um lentivírus expressando sgRNAs específicos, o MRNA Cas9 pode ser eletropora- do nas células após a transdução. Alternativamente, duplexes duplos de gRNA podem ser complexados com uma proteína Cas9 para for- mar um RNP, que pode, então, ser eletroporado em células Treg. O protocolo de eletroporação para Cas9 mRNA ou RNPs é o seguinte.
[00248] Três dias após a reativação das células Treg e Teff (dia 13 de expansão), as células Treg e Teff transduzidas com lentivírus ex- pressando sgRNAs específicos foram colhidas e ressuspensas em tampão de nucleofecção (18% suplemento 1, 82% tampão P3 da célu- la primária Amaxa P3 4D-Nuclefector X kit S (Cat tt V4XP-3032)) a uma concentração de 100 x10º células/mL. 4 ug (4 ul de 1 mg / mL) de S. pyogenes Cas9-NLS mRNA foram adicionados à mistura de cé- lulas por 20 ul de solução de células e 24 ul da mistura de célu- las/mRNA foram, então, adicionados a cada poço de reação. As célu- las foram eletroporadas seguindo o programa "célula T, Humano, Stim" (EO-115). Após eletroporação, 80 uL de meio X-VIVO 15 quente foram adicionados a cada poço e as células foram reunidas em um balão de cultura a uma densidade de 2 x 10º células/ml em meios X-VIVO 15 contendo |IL-2 (Treg: 60 ng/mL; Teff 10 ng/mL). No dia 4 após a reati- vação, as células foram lavadas, contadas e utilizadas para ensaios funcionais, conforme descrito abaixo. A eficiência de edição de genes alvo foi determinada por análise FACS de proteínas de superfície ou intracelulares (por exemplo, CD45, Foxp3) e/ou análise TIDE/NGS do local de corte genômico.
[00249] A edição de um gene é avaliada por sequenciamento de próxima geração. Para este método, o DNA genômico (gDNA) foi iso- lado das células T editadas usando o Mini Kit de DNA de Cultura de Sangue e Células da Qiagen (Cat nº: 13323), seguindo o protocolo re- comendado pelo fabricante e quantificado. Após o isolamento do gDNA, foi realizada a POR para amplificar a região do DNA genômico editado usando primers de PCR específicos para locus contendo ove- rhangs necessárias para a adição de adaptadores de sequenciamento Illumina Next Generation. O produto de PCR resultante foi executado em um gel de agarose a 1% para garantir a amplificação específica e adequada do locus genômico antes da limpeza da PCR ser realizada de acordo com o protocolo recomendado pelo fornecedor, usando o Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (Cat nº: T1030S). O produto de PCR purificado foi então quantificado e uma segunda PCR foi realizada pa- ra parear os adaptadores de sequenciamento lllumina e sequências de indexação específicas da amostra necessárias para a multiplexação. Depois disso, o produto de PCR foi executado em um gel de agarose a 1% para avaliar o tamanho antes de ser purificado usando os grânulos AMPure XP (produzidas internamente). O produto de PCR purificado foi então quantificado via qQPCR usando o Kit de Quantificação de Bi- blioteca Kapa Illumina (Cat nº: KK4923) e Padrões de DNA de Quanti- ficação de Biblioteca Kapa Illumina (Cat nº: KK4903). O produto quan- tificado foi então carregado no sistema Illumina NextSegq 500 usando o cartucho de reagente de saída média Illumina NextSeq 500/550 v2 (Cat nº: FC-404-2003). A análise dos dados de sequenciação produzi- dos foi realizada para avaliar inserções e deleções (indels) no sítio de corte antecipado no DNA do conjunto de células T editado.
[00250] Imunofenotipagem e análise de TSDR de células Treg edi- tadas: Quatro dias após a edição das células Treg, as células foram marcadas com reagente CellTrace Violet para rastrear a divisão celular e estimuladas com esferas expansoras Treg anti-CD3/CD28 na pre- sença de IL-2 humana (500 unidades/ml). Após quatro dias de estimu- lação, as células foram reestimuladas com eBioscience Cell Stimula- tion Cocktail (mais inibidores de transporte de proteína) (eBioscience, Cat ft: 00-4975-03) durante 5 horas. A coloração da superfície celular foi realizada com os seguintes anticorpos: anti-CD4 (SK3), -CD25 (MA- 251), -TNFRSF4 (Ber-ACT35) e CD45 (HI30). A coloração foi realizada durante 20 minutos a 4 ºC na presença de reagente FcBlock humano (BD Biosciences, Cat tt 564219). Para detectar proteínas intracelula- res, após a coloração da superfície, as células foram fixadas e perme- abilizadas usando eBioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Cat %: 00-5523-00) e coradas com os seguin- tes anticorpos: anti-Foxp3 (259D/C7), Helios (22F6) e I1L-10 (JES3- 9D7). O LSRFortessa (BD Biosciences) foi utilizado para a coleta de dados e a análise foi realizada por meio do software FlowJo (TreeS- tar). Para a análise de TSDR, o DNA genômico foi isolado de Tregs editados, conforme descrito anteriormente, usando o Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini (Cat ft: 13323) seguindo o protocolo reco- mendado pelo fornecedor. A conversão bissulfito e a pirossequencia- mento do DNA genômico foram realizadas por EpigenDx (ensaio ID ADS783-FS2) para quantificar o estado de metilação da região do ge- ne FOXP3.
[00251] Supressão in vitro de células efetoras T alogênicas por Tregs editadas: A função supressora de Tregs foi determinada usando uma versão modificada de um método desenvolvido por Collison et al. ("Ensaios de supressão de Treg in vitro," Methods Mol Biol. 707:21-37 (2011)). Tregs congeladas editadas por saRNA e células T efetoras alogênicas não editadas (doravante referidas como células T respon- dentes) foram descongeladas e repousadas durante a noite em meio de expansão de células T X-VIVO 15 (Lonza, Cat % 04-418Q) suple- mentado com 10% de homem humano inativado soros e 600 unida- des/ml de IL-2. Células T respondedoras e Tregs foram lavadas em PBS contendo 0,1% de BSA e então incubadas no mesmo tampão contendo 10 uM de CellTrace Violet ou 4 uM de CFSE, respectivamen- te, por 10 minutos em temperatura ambiente. As células T responde- doras marcadas foram ressuspensas em meio de expansão de células T e semeadas a 50.000 células (50 ul) por poço em uma placa de fun- do em U de 96 poços. Em uma placa separada, Tregs marcadas, res- suspensas em meio de expansão de células T, foram semeadas a
50.000 células (50 ul) por poço, diluídas em série e, em seguida, mis- turadas com células T respondedoras em proporções entre 1:2 a 1:32. Finalmente, 100 ul de 0,5 ul/ml de ativadores de células T Human CD3/CD28 ImmunoCult'y" foram adicionados a cada poço. Os poços sem Tregs ou tetrâmeros CD3/28 serviram como controles positivo e negativo, respectivamente. Após 4 dias de incubação a 37 ºC, as célu- las foram coradas com anticorpos para CD4, CD3, Foxp3 e Helios (descrito acima). Os dados foram adquiridos em um analisador de cé- lulas BD LSRFortessa X-20 (BD Biosciences), e a proliferação de célu- las T respondedoras foi analisada usando FlowJo (TreeStar Inc.). À supressão de Tregs foi determinada como: supressão (%): 100 - [100 x (% de células em proliferação com Tregs)/(% de células em prolife- ração sem Tregs).
[00252] Avaliação da função de Tregs editadas in vivo: A capaci- dade de Tregs humanas editadas por CRISPR para reduzir respostas autoimunes foi avaliada no modelo de camundongo NSG-PBMC hu- mano xenogênico de Doença de Enxerto versus Hospedeiro (GvHD). Um modelo previamente descrito por Cuende et al. foi adaptado ("Os anticorpos monoclonais contra os complexos GARP/TGF-8B1 inibem a atividade imunossupressora das células T reguladoras humanas in vi-
vo", Sci Transl Med. 7(284):284ra56 (2015)) a ser modulado pela transferência de Tregs humanas. Camundongos fêmeas NCG (8 a 12 semanas de idade) foram injetados por via intravenosa com 20 x106 células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs). Qua- torze dias depois, os camundongos foram randomizados por peso cor- poral em quatro grupos de cinco animais por grupo, e três grupos fo- ram dosados por via intravenosa com 2 x10º Tregs humanas editadas. Um grupo serviu como controle não tratado e não recebeu tratamento com Treg. Antes do tratamento, as Tregs humanas foram editadas por eletroporação com complexos de gRNA/Cas9 RNP compreendendo (1) um gRNA controle direcionado ao gene OR1IA1 (SEQ ID NO: 1 GCTGACCAGTAACTCCCAGG); (2) um único gRNA direcionado ao gene PRDM1 (SEQ ID NO: 2 TIGGACAGATCTATTCCAGA;); e (3) um único gRNA direcionado ao gene TNFRSF4 (SEQ ID NO: 3 GGATG- TGCGTGGGGGCTCGG). A eficiência de edição do complexo gRNA/ Cas9 direcionado aos genes PRDM1 e TNFRSF4 foi avaliada por se- quenciamento de próxima geração e determinada como sendo 99% e 83%, respectivamente. Peso corporal e pontuação GvHD (a soma das pontuações dadas para perda de peso, atividade, postura, textura do pelo e integridade da pele) foram medidos três vezes por semana após a transferência de Tregs. A citometria de fluxo também foi realizada em amostras de sangue periférico obtidas quinze dias após a transfe- rência de Treg para rastrear a proliferação e ativação das células T CD8+. Os resultados são discutidos no Exemplo 4.
Exemplo 2: Identificação de alvos para imunomodulação de células Treg por meio de Triagens genômicas funcionais de CRISPR/Cas9 in vitro
[00253] Experimentos foram realizados para identificar alvos que modulam a aptidão de Tregs durante a expansão in vitro. Foi realizada uma triagem CRISPR agrupada em todo o genoma, na qual um con-
junto de saRNAs, cada um dos quais tem como alvo um único gene, foi introduzido em uma população de células Treg humanas ou células Teff correspondentes do doador, de modo que cada célula da popula- ção compreendesse uma única sgRNA direcionada a um único gene. Para determinar o efeito de um determinado gene em Tregs (ou célu- las Teff) durante a expansão ex vivo, a frequência de cada sgaRNA na população de Treg (ou células Teff) foi determinada no início do expe- rimento e comparada com a frequência do mesmo sgRNA em um pon- to de tempo posterior no experimento. A frequência de saRNAs direci- onados a genes que regulam positivamente a expansão de Treg (ou cé- lulas Teff) in vitro (por exemplo, genes que regulam positivamente a proli- feração ou viabilidade de células Treg (ou Teff) deve aumentar ao longo do tempo, enquanto a frequência de saRNAs direcionados a genes que regulam negativamente a expansão de Treg (ou células Teff) in vitro (por exemplo, genes que regulam negativamente a proliferação ou viabilida- de de células Treg (ou Teff)) deve diminuir ao longo do tempo.
[00254] A distribuição e/ou frequência de cada sgRNA nas alíquotas tomadas em vários pontos de tempo durante a expansão in vitro foi analisada e comparada a distribuição e/ou frequência de cada saRNA na população Treg (ou células Teff) editada inicial. As análises estatís- ticas foram realizadas para cada sgRNA individual para identificar SgRNAs que foram significativamente enriquecidos em populações de Treg (ou células Teff) após a expansão in vitro e para atribuir uma pon- tuação de enriquecimento a cada um dos guias. Para cada sgRNA in- dividual em nossa biblioteca de triagem, uma pontuação de enriqueci- mento foi calculada tomando a razão das contagens de guia observa- das no desfecho da triagem e dividindo pelo número de leituras obser- vadas para esse guia no início da triagem. Para calcular uma pontua- ção de enriquecimento em nível de gene, uma pontuação de enrique- cimento agregado foi calculada como a pontuação de enriquecimento
SgRNA mediana. Para calcular a significância estatística do enriqueci- mento em nível de gene, um p-valor nominal foi calculado para cada guia como o percentil para enriquecimento desse guia em relação a todos os outros guias na biblioteca. Esses p-valores foram combinados usando o método de combinação de p-valor de logit (Mudholkar 1977), gerando um p-valor de nível de gene agregado para o enriquecimento do alvo. Os p-valores no nível do gene foram corrigidos para testes múltiplos usando o procedimento de Benjamini-Hochberg. Para identi- ficar genes alvo que têm um efeito consistente e reproduzível no acú- mulo de células Treg (ou Teff) in vitro em vários saRNAs, foi definido um corte de taxa de descoberta falsa (FDR) igual ou inferior a 0,2. Os resultados destes experimentos são mostrados abaixo na Tabela 2 e Fig. 1. Os genes na Tabela 2 são os genes com as 10 maiores pontu- ações de enriquecimento em nível de gene; PRDM1 e TNFRSF4 fo- ram os dois genes que passaram nos critérios de FDR. Tabela 2: Genes-alvo identificados por pontuações de percentil [Nome do Ao — Teniguesimento — FD Exemplo 3: Validação de alvos para imunomodulação de células treg
[00255] —Alvos com um corte de FDR igual a menos de 0,2 foram selecionados para avaliação posterior em um formato de guia único para determinar se a edição de um gene alvo em células Treg alterou a estabilidade e/ ou função dessas células. A avaliação de alvos exemplificativos é descrita neste documento, no entanto, esses méto- dos podem ser usados para avaliar qualquer um dos alvos em poten- cial descritos acima.
[00256] Imunofenotipagem de células Treg humanas editadas: As células Treg humanas foram isoladas e expandidas ex vivo como des- crito acima e editadas por eletroporação usando RNAs guia complexa- dos com Cas9 em um formato RNP para genes alvo individuais. Como mostrado na Fig. 2, alta eficiência de edição de genes alvo pode ser alcançada usando os métodos descritos. A consequência da edição de genes alvo individuais identificados por meio de nossa triagem genô- mica funcional CRISPR/Cas9 in vitro em células Treg humanas foi de- terminada por citometria de fluxo para quantificar por célula, quaisquer alterações na capacidade proliferativa e na frequência e magnitude de fatores de transcrição específicos e citocinas conhecidas por serem importantes para a estabilidade e função das Tregs.
[00257] As células Treg editadas foram reestimuladas com esferas expansoras anti-CD3/CD28 Treg e a capacidade proliferativa, a ex- pressão do fator de transcrição e a produção de citocinas foram avalia- das no dia 4. Como mostrado na Fig. 3, as Tregs editadas por PRDM1 e TNFRSFA4 demonstraram uma diminuição de 40% e 30%, respectiva- mente, na intensidade média de fluorescência (MFI) da coloração de TV em comparação com o controle, células Treg editadas por CD45. Uma redução na coloração de CTV ocorre durante cada rodada de di- visão celular, portanto, a redução na coloração de CTV observada em células Treg editadas é indicativa de aumento da proliferação de célu- las Treg editadas por PRDM1 e TNFRSFA4.
[00258] O fator de transcrição Helios em células Treg é conhecido por ser essencial para a estabilidade das células Treg (Kim HJ, Barnitz RA, Kreslavsky T, et al. A atividade inibitória estável das células T re- guladoras requer o fator de transcrição Helios. Science. 2015;350 (6258):334-9.). Além disso, a ligação de Helios com o fator de transcri- ção determinante da linhagem Treg, Foxp3, está fortemente associada à expressão de genes de assinatura Treg centrais (Kwon HK, Chen HM, Mathis D, Benoist C. Diferentes complexos moleculares que me- deiam a indução transcricional e repressão por FoxP3. Nat Immunol. 2017;18(11):1238-1248). Assim, a co-expressão de Helios e Foxp3 em células Treg foi associada a estabilidade melhorada e função imunos- supressora aumentada. Como mostrado na Fig. 4, a edição de PRDM1 em células Treg levou a um aumento de 2,6 vezes na proporção de células Treg que coexpressam Foxp3 e Helios, demonstrando que a edição de PRDM1 leva a alterações fenotípicas em células Treg que se associaram com estabilidade melhorada e função imunossupresso- ra das células Treg.
[00259] Além disso, vários estudos mostraram que a desmetilação de uma região conservada dentro do locus Foxp3 denominada região desmetilada específica de Treg (TSDR) é necessária para manter a expressão de Foxp3 na progênie de células Treg em divisão (Zheng et al. "Role of conserved non-coding DNA elements in the Foxp3 gene in regulatory T-cell fate", Nature 463:808-12 (2010); Polansky JK, et al. "DNA methylation controls Foxp3 gene expression," Eur. J. Immunol. 38: 1654-1663 (2008). Como mostrado na Fig. 5, a edição de TNFRSF4 não afetou o status de metilação de TSDR em células Treg, e a edição de PRDM1 aumentou a desmetilação de TSDR (em 27% em comparação com células Treg controle editadas por CD45). Esses dados indicam que a edição de PRDM1 direciona o acúmulo de célu- las Treg estáveis.
[00260] A produção de citocinas imunossupressoras, como a IL-10,
pelas células Tregs é o principal mecanismo pelo qual as células Tregs são capazes de mediar sua função supressora. Na verdade, as células Treg que são incapazes de produzir IL-10 são incapazes de prevenir a inflamação mediada por células T efetoras (Asseman C, Mauze S, Leach MW, Coffman RL, Powrie F. Um papel essencial para a inter- leucina 10 na função de T regulador células que inibem a inflamação intestinal. J Exp Med. 1999;190(7):995-1004). Como mostrado na Fig. 6, a edição de TNFRSF4 em células Treg levou a um aumento de 40% na capacidade das células Treg de produzir IL-10 em comparação com as células Treg controle editadas por CD45. A edição do PRDM1 levou a um aumento de 10% na produção de IL-10 nas células Treg. Expe- rimentos semelhantes demonstraram que a edição de TNFRSF4 não afetou as citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-17A e IFNy.
Citocinas inflamatórias, como IL-6, podem desestabilizar Tregs e en- fraquecer sua função supressora (Yang et al., "Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs", Immu- nity 29:44-56 (2008)). Em camundongos, a desestabilização de Tregs por IL-6 é acelerada na ausência de PRDM1 (Garg et al., "Blimp1 Pre- vents Methylation of Foxp3 and Loss of Regulatory T Cell Identity at Sites of Inflammation", Cell Reports 26:1854-1868 (2019)). Para de- terminar se IL-6 conduz a desestabilização de Tregs humanos defici- entes em PRDM1, Tregs editados de PRDM1 e controle foram cultiva- dos na presença ou ausência de 50 ng/ml de IL-6. Os resultados, mos- trados nas Fig. 7A e B, demonstram que, em contraste com as Tregs de camundongo, as Tregs humanas editadas com PRDM1 mantêm a estabilidade, conforme indicado por sua alta expressão de Helios, mesmo na presença de grandes quantidades de IL-6.
[00261] A função supressora das Tregs é dependente de vários processos metabólicos, alguns dos quais são regulados negativamen- te à medida que as Tregs sofrem proliferação in vitro (Thornton AM, et al., "CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production", J Exp Med. 188:287-96 (1998); Kuniyasu Y, et al., "Naturally anergic and suppres- sive CD25(+) CDA4(+) T cells as a functionally and phenotypically dis- tinct immunoregulatory T cell subpopulation," Int Immunol. 12:1145-55 (2000)). Dado que a edição de PRDM1 e TNFRSF4 levou ao aumento da proliferação de Tregs, a capacidade de tais Tregs para suprimir a proliferação de células T efetoras foi avaliada. Em um sistema de co- cultura in-vitro (ver Métodos) em que Tregs são cultivadas por 4 dias junto com células T efetoras marcadas em proporções entre 1:2 a 1:32, ambas as Tregs editadas por PRDM1 e TNFRSFA4 foram capa- zes de suprimem a proliferação de células T efetoras, e sua função supressora era comparável àquela das Tregs editadas por controle (Fig. 8).
[00262] Tomados em conjunto, esses dados demonstram que, a edição de células Treg com sequências guia individuais para genes identificados por meio de nossa triagem genômica funcional CRISPR/ Cas9 leva a alterações distintas na capacidade proliferativa e na fre- quência e magnitude de fatores de transcrição específicos e citocinas conhecidas por serem importante para a estabilidade e função de Treg. EXEMPLO 4: VALIDAÇÃO DE ALVOS PARA IMUNOMODULAÇÃO
DE CÉLULAS TREG
[00263] Os dados na Figura 9A mostram que camundongos trata- dos com Treg humanas submetidas a GvHD aumentaram a sobrevida em comparação a camundongos não tratados. O tempo para todos os cinco camundongos não tratados caírem abaixo de seu peso corporal inicial foi de 25 dias, contra 32 dias para os camundongos tratados com Treg editadas controle. O grupo tratado com TNFRSF4-/- Treg teve um camundongo para manter o peso acima da medição inicial até o dia 58 pós-transferência de Treg (72 dias após a transferência de PBMC). A Figura 9B mostra dados de citometria de fluxo em sangue periférico de camundongos no dia quinze pós-transferência de Treg.
À intensidade de coloração Ki67 demonstrou ser um marcador substituto para quantificar a capacidade proliferativa das células (Miller et al. ("Ki67 is a Graded Rather than a Binary Marker of Proliferation versus Quiescence", Cell Rep. 24 (5):1105-1112.e5 (2018)). A intensidade da coloração Ki67 foi reduzida em células CD8 humanas em todos os grupos para os quais as Tregs foram transferidas, demonstrando que as Tregs foram capazes de suprimir a inflamação.
Além disso, os ca- mundongos tratados com Tregs editadas com TNFRSF4 foram encon- trados para serem ainda mais reduzidos na intensidade de coloração Ki67 dentro de sua população de células T CD8+, demonstrando que a perda de TNFRSF4 leva a Tregs mais potentes in vivo (Figura 9B).

Claims (134)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula T reguladora modificada (Treg) caracterizada pe- lo fato de que compreende um sistema regulador de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos compreendendo TNFRSFA, em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aumenta uma função imunossupressora de Treg.
2. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que o sistema regulador de genes compreen- de (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma proteína enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática.
3. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 2, ca- racterizada pelo fato de que o sistema regulador de genes compreen- de uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir de um siRNA, um shRNA, um microRNA (miR), um antagomiR ou um RNA antisen- se.
4. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 2, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes com- preende uma proteína enzimática e em que a proteína enzimática foi manipulada para se ligar especificamente a uma sequência alvo em um ou mais dos genes endógenos.
5. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 4, ca- racterizada pelo fato de que a proteína é uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco ou uma meganuclease.
6. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 2, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes com- preende uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática, em que a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNA guia (gRNA) e a proteína enzimática é uma proteína Cas ou um ortólogo
Cas.
7. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9.
8. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas de tipo selvagem compreendendo dois domínios enzimaticamente ativos e capaz de induzir quebras de DNA de fita dupla.
9. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é um mutante da Cas nickase que compreende um domínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples.
10. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas desa- tivada (dCas) e está associada a uma proteína heteróloga capaz de modular a expressão de um ou mais genes alvo endógenos.
11. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 10, ca- racterizada pelo fato de que a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em proteína que interage com MAX 1 (MXI1), domínio de caixa associada a Krúppel (KRAB), proteína de ligação 2 de metil-CpG (MECP2) e quatro domínios mSin3 concatena- dos (SID4X).
12. Treg modificada caracterizada pelo fato de que com- preende um sistema regulador de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos compreendendo PRDM1, em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aumenta uma função imunossupressora de Treg.
13. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 12, ca- racterizada pelo fato de que o sistema regulador de genes compreen- de (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma proteína enzimática; ou
(iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática.
14. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 13, ca- racterizada pelo fato de que o sistema regulador de genes compreen- de uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir de um siRNA, um shRNA, um microRNA (miR), um antagomiR ou um RNA antisen- se.
15. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 13, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes com- preende uma proteína enzimática e em que a proteína enzimática foi manipulada para se ligar especificamente a uma sequência alvo em um ou mais dos genes endógenos.
16. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 15, ca- racterizada pelo fato de que a proteína é uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco ou uma meganuclease.
17. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 13, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes com- preende uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática, em que a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNA guia (gRNA) e a proteína enzimática é uma proteína Cas ou um ortólogo Cas.
18. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 17, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9.
19. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 17, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas de tipo selvagem compreendendo dois domínios enzimaticamente ativos e capaz de induzir quebras de DNA de fita dupla.
20. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 17, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é um mutante da Cas nickase que compreende um domínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples.
21. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 17, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas desa- tivada (dCas) e está associada a uma proteína heteróloga capaz de modular a expressão de um ou mais genes alvo endógenos.
22. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 21, ca- racterizada pelo fato de que a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em proteína que interage com MAX 1 (MXI1), domínio de caixa associada a Krúppel (KRAB), proteína de ligação 2 de metil-CpG (MECP2) e quatro domínios mSin3 concatena- dos (SID4X).
23. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que o sistema regula- dor de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo me- nos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais genes alvo endógenos.
24. Treg modificada caracterizada pelo fato de que com- preende um sistema regulador de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, e ADNP, em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aumenta uma função imunossupressora de Treg.
25. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizada pelo fato de que o sistema regulador de genes compreen- de (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma proteína enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática.
26. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizada pelo fato de que o sistema regulador de genes compreen- de uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir de um siRNA, um shRNA, um microRNA (miR), um antagomiR ou um RNA antisen-
se.
27. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes com- preende uma proteína enzimática e em que a proteína enzimática foi manipulada para se ligar especificamente a uma sequência alvo em um ou mais dos genes endógenos.
28. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 27, ca- racterizada pelo fato de que a proteína é uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco ou uma meganuclease.
29. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes com- preende uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática, em que a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNA guia (gRNA) e a proteína enzimática é uma proteína Cas ou um ortólogo Cas.
30. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 29, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9.
31. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 29, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas de tipo selvagem compreendendo dois domínios enzimaticamente ativos e capaz de induzir quebras de DNA de fita dupla.
32. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 29, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é um mutante da Cas nickase que compreende um domínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples.
33. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 29, ca- racterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas desa- tivada (dCas) e está associada a uma proteína heteróloga capaz de modular a expressão de um ou mais genes alvo endógenos.
34. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 33, ca- racterizada pelo fato de que a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em proteína que interage com MAX 1 (MXI1), domínio de caixa associada a Krúppel (KRAB), proteína de ligação 2 de metil-CpG (MECP2) ou quatro domínios mSin3 concate- nados (SID4X).
35. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 24 a 34, caracterizada pelo fato de que o sistema regula- dor de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma plu- ralidade de genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP..
36. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
37. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de genes alvo endógenos, em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é TNFRSF4 e em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é selecionado de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
38. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 37, ca- racterizada pelo fato de que um da pluralidade de genes alvo é TNFRSF4 e em que pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais da pluralidade de genes alvo são selecionados de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
39. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 12, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de genes alvo endógenos, em que pelo menos um dentre a pluralidade de genes alvo é PRDM1 e em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é selecionado de TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
40. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 39, ca- racterizada pelo fato de que um dentre a pluralidade de genes alvo é PRDM1 e em que pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais da pluralidade de genes alvo são selecionados a partir de TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
41. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 37 a 40, caracterizada pelo fato de que o sistema de re- gulação de genes compreende uma pluralidade de moléculas de gRNA.
42. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 41, caracterizada pelo fato de que o sistema regula- dor de genes é introduzido na Treg por transfecção, transdução, ele- troporação ou ruptura física da membrana celular por um dispositivo de microfluídicos.
43. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 42, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é intro- duzido como um polinucleotídeo que codifica um ou mais componen- tes do sistema, uma proteína ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
44. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 43, caracterizada pelo fato de que a função imunos- supressora é selecionada de proliferação de Treg, viabilidade de Treg, estabilidade de Treg, expressão aumentada ou secreção de uma cito-
cina imunossupressora, opcionalmente em que a citocina imunossu- pressora é IL-10, aumentada co-expressão de Foxp3 e Helios e/ou re- sistência à exaustão.
45. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 44, ca- racterizada pelo fato de que a estabilidade de Treg é avaliada durante a cultura in vitro com IL-6.
46. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 45, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um receptor imune manipulado exibido na superfície celular.
47. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 46, ca- racterizada pelo fato de que o receptor imune modificado é um recep- tor de antígeno quimérico (CAR) que compreende um domínio de liga- ção ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinali- zação intracelular.
48. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 47, ca- racterizada pelo fato de que o receptor imune modificado é um recep- tor de células T modificado (TCR).
49. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 46 a 48, caracterizada pelo fato de que o receptor imune modificado se liga especificamente a um antígeno expresso em uma célula alvo.
50. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 49, caracterizada pelo fato de que o Treg é uma Treg humano.
51. Treg modificada caracterizado pelo fato de que a ex- pressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos em relação à expressão e/ou função de um ou mais genes endógenos em uma Treg não modificada, em que um ou mais genes endógenos compreendem TNFRSF4 e em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aumenta uma função imunossupres-
sora da Treg.
52. Treg modificada caracterizada pelo fato de que com- preende a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes en- dógenos em relação à expressão e/ou função de um ou mais genes endógenos em uma Treg não modificada, em que um ou mais genes endógenos compreendem PRDM1 e em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aumenta uma função imu- nossupressora da Treg.
53. Treg modificada caracterizada pelo fato de que com- preende a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes en- dógenos em relação à expressão e/ou função de um ou mais genes endógenos em uma Treg não modificada, em que um ou mais genes endógenos são selecionados do grupo que consiste em TNFRSFA, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP e em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais ge- nes endógenos aumenta uma função imunossupressora da Treg.
54. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 51 a 53, caracterizada pelo fato de que compreende ain- da um receptor imune manipulado exibido na superfície celular.
55. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 54, ca- racterizada pelo fato de que o receptor imune manipulado é um CAR ou um TCR manipulado.
56. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracterizada pelo fato de que o receptor imune modificado se liga especificamente a um antígeno expresso em uma célula alvo.
57. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 53 a 56, caracterizada pelo fato de que compreende ain- da a expressão reduzida de TNFRSFA4.
58. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 57, ca- racterizada pelo fato de que compreende a expressão e/ou função reduzida de TNFRSF4 e a expressão e/ou função reduzida de pelo menos um gene alvo selecionado de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
59. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 58, ca- racterizada pelo fato de que compreende a expressão e/ou função reduzida de TNFRSF4 e a expressão e/ou função reduzida de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais genes alvo selecionados do grupo que consiste em PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
60. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 53 a 56, caracterizada pelo fato de que compreende ain- da a expressão reduzida de PRDM1.
61. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 60, ca- racterizada pelo fato de que compreende a expressão e/ou função reduzida de PRDM1 e a expressão e/ou função reduzida de pelo me- nos um gene alvo selecionado de TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
62. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 61, ca- racterizada pelo fato de que compreende a expressão e/ou função reduzida de PRDM1 e a expressão e/ou função reduzida de pelo me- nos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais genes alvo selecionados do grupo que consis- te em TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
63. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 13, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir de um siRNA e um shRNA.
64. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 63, ca- racterizada pelo fato de que o sistema regulador de genes é ainda capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
65. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 63, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de genes alvo endógenos e compreende uma pluralidade de siRNAs ou shRNAs, em que pelo menos um gene alvo endógeno é selecionado a partir do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
66. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 65, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais genes alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em TNFRSF4, PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
67. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 63, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de genes alvo endógenos e compreende uma pluralidade de siRNAs ou shRNAs, em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é TNFRSF4 e pelo menos um da pluralidade de genes alvo é selecionado de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP?2.
68. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 67, ca- racterizada pelo fato de que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é TNFRSF4 e pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais da pluralidade de genes alvo são selecionados de PRDM1, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
69. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 63, ca- racterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de uma pluralidade de genes alvo endógenos, em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é PRDM1 e em que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é sele- cionado de TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP?2.
70. Treg modificada, de acordo com a reivindicação 69, ca- racterizada pelo fato de que pelo menos um da pluralidade de genes alvo é PRDM1 e pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mais da pluralidade de genes alvo são selecionados de TNFRSF4, REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 e ADNP.
71. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 51 a 70, caracterizada pelo fato de que a Treg é uma Teg humana.
72. Composição caracterizada pelo fato de que compreen- deTregs modificadas, como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 71.
73. Composição, de acordo com a reivindicação 72, carac- terizada pelo fato de que a composição compreende pelo menos 1 x 10%, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 10º, ou 1 x 10%º Tregs modifi- cadas.
74. Composição, de acordo com a reivindicação 72 ou 73, caracterizada pelo fato de que é adequada para administração a um indivíduo em necessidade.
75. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 72 a 74, caracterizada pelo fato de que compreende Tregs autólogos derivados do indivíduo em necessidade.
76. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 72 a 74, caracterizada pelo fato de que compreende Tregs alogênicos derivadas de um indivíduo doador.
77. Sistema de regulação de genes capaz de reduzir a ex- pressão de um ou mais genes alvo endógenos em uma célula, carac-
terizado pelo fato de que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma proteína enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática, e em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem TNFRSFA4.
78. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 77, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico guia RNA (gRNA) e uma endonu- clease Cas.
79. Sistema de regulação de genes capaz de reduzir a ex- pressão de um ou mais genes alvo endógenos em uma célula, carac- terizado pelo fato de que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma proteína enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática, e em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem PRDM1.
80. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 79, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico guia RNA (gRNA) e uma endonu- clease Cas.
81. Sistema regulador de genes capaz de reduzir a expres- são e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos em uma célula, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende (i) uma molécu- la de ácido nucleico; (ii) uma proteína enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico e uma proteína enzimática, e em que um ou mais genes alvo endógenos são selecionados do grupo que consiste em REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16 E ADNP?2.
82. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 81, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico guia RNA (gRNA) e uma endonu- clease Cas.
83. Sistema de regulação de genes, de acordo com qual-
quer uma das reivindicações 78 a 82, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9.
84. Sistema de regulação de genes, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 78 a 82, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas de tipo selvagem que compreende dois domínios enzimaticamente ativos e capaz de induzir quebras de DNA de fita dupla.
85. Sistema de regulação de genes, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 78 a 82, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é um mutante de Cas nickase compreendendo um do- mínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples.
86. Sistema de regulação de genes, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 78 a 82, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas desativada (dCas) e está associa- da a uma proteína heteróloga capaz de modular a expressão de um ou mais genes alvo endógenos.
87; Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 86, caracterizado pelo fato de que a proteína heteróloga é selecionada do grupo que consiste no domínio de interação 1 da MAX (MXI1), domínio de caixa associada a Krúppel (KRAB) e quatro domí- nios mSin3 concatenados (SID4X).
88. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 77, 79 ou 81, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico e em que a molécula de ácido nucleico é um siRNA, um shRNA, um microRNA (miR), um anta- gomiR ou um RNA antisense.
89. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 77, 79 ou 81, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma proteína compreendendo um domínio de ligação ao
DNA e um domínio enzimático e é selecionado a partir de uma nu- clease de dedo de zinco e uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN).
90. Kit caracterizado pelo fato de que compreende o sis- tema regulador de genes, como definido em qualquer uma das reivin- dicações 77 a 89.
91. Molécula de ácido nucleico de gRNA caracterizada pe- lo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de domí- nio de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo em um gene alvo endógeno, em que o gene alvo endógeno é TNFRSFA4.
92. Molécula de ácido nucleico de gRNA caracterizado pe- lo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de domí- nio de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo em um gene alvo endógeno, em que o gene alvo endógeno é PRDM1.
93. Molécula de ácido nucleico de gRNA caracterizado pe- lo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de domí- nio de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo em um gene alvo endógeno, em que o gene alvo endógeno é selecionado de REEP3, MRPL32, FSCN3, KLC3, C4BPA, LZTS1, CDK16, EADNP?2.
94. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 93, caracterizada pelo fato de que a sequência alvo compreende uma sequência PAM.
95. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 94, caracterizada pelo fato de que o gRNA é uma molécula de gRNA modular.
96. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 94, caracterizada pelo fato de que o gRNA é uma molécula de gRNA dupla.
97. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 96, caracterizada pelo fato de que o domínio de direcionamento tem 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou mais nucleotídeos de comprimento.
98. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 97, caracterizada pelo fato de compreender uma modificação na extremidade 5' ou próxima a ela (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 5') e / ou uma modifi- cação em ou próximo da extremidade 3' (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 3').
99. Molécula de gRNA, de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo fato de que o gRNA modificado exibe maior estabi- lidade em relação às nucleases quando introduzido em uma célula T.
100. Molécula de gRNA, de acordo com a reivindicação 98 ou 99, caracterizada pelo fato de que o gRNA modificado exibe uma resposta imune inata reduzida quando introduzida em uma célula T.
101. Molécula de polinucleotídeo caracterizada pelo fato de que codifica a molécula de gRNA, como definida em qualquer uma das reivindicações 91 a 100.
102. Molécula de polinucleotídeo caracterizada pelo fato de que codifica uma pluralidade de moléculas de gRNA selecionada, como definidas em qualquer uma das reivindicações 91 a 100.
103. Composição caracterizada pelo fato de que compre- ende uma ou mais moléculas de gRNA, como definidas em qualquer uma das reivindicações 91 a 100, ou o polinucleotídeo, conforme a rei- vindicação 101 ou 102.
104. Kit caracterizado pelo fato de que compreende a mo- lécula de gRNA, como definida em qualquer uma das reivindicações 91 a 100, ou o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 101 ou
102.
105. Método de produção de uma Treg modificada caracte-
rizado pelo fato de que compreende: obter uma Treg de um indivíduo; introduzir um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, e em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem TNFRSF4; e cultivar a Treg de modo que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos seja reduzida em comparação com uma Treg que não foi modificada.
106. Método de produção de uma Treg modificada caracte- rizado pelo fato de que compreende: obter uma Treg de um indivíduo; introduzir um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, e em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem PRDM1; e cultivar a Treg de modo que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos seja reduzida em comparação com uma Treg que não foi modificada.
107. Método de produção de uma Treg modificada caracte- rizado pelo fato de que compreende: introduzir um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem TNFRSFA4.
108. Método de produção de uma Treg modificada caracte- rizado pelo fato de que compreende: introduzir um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem PRDM1.
109. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 105 a 108, caracterizado pelo fato de que o sistema de regula- ção de genes é um selecionado conforme as reivindicações 74 a 86.
110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 105 a 108, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a introdução de uma sequência polinucleotídica que codifica um receptor imunológico manipulado selecionado de um CAR e um TCR.
111. Método, de acordo com a reivindicação 110, caracte- rizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes e/ou o poli- nucleotídeo que codifica o receptor imune manipulado são introduzidos na Treg por transfecção, transdução, eletroporação ou interrupção físi- ca da membrana celular por um dispositivo microfluídico.
112. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 107 a 111, caracterizado pelo fato de que o sistema de regula- ção de genes é introduzido como uma sequência polinucleotídica que codifica um ou mais componentes do sistema, como uma proteína ou como um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
113. Método de produção de uma Treg modificada caracte- rizado pelo fato de que compreende: obter uma população de Tregs; expandir a população de Tregs; e introduzir um sistema regulador de genes na população de Tregs, em que o sistema regulador de genes é capaz de reduzir a ex- pressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos compreen- dendo TNFRSFA4.
114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracte- rizado pelo fato de que o sistema regulador de genes é introduzido na população de Tregs antes da expansão.
115. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracte-
rizado pelo fato de que o sistema regulador de genes é introduzido na população de Tregs após a expansão.
116. Método de produção de uma Treg modificada caracte- rizado pelo fato de que compreende: obter uma população de Tregs; expandir a população de Tregs; e introduzir um sistema regulador de genes na população de Tregs, em que o sistema regulador de genes é capaz de reduzir a ex- pressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos compreen- dendo PRDM1.
117. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracte- rizado pelo fato de que o sistema regulador de genes é introduzido na população de Tregs antes da expansão.
118. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracte- rizado pelo fato de que o sistema regulador de genes é introduzido na população de Tregs após a expansão.
119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 105 a 118, caracterizado pelo fato de que o Treg é uma Treg humano.
120. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade caracterizado pelo fato de que compre- ende a administração de uma quantidade eficaz de Tregs modificadas, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 71, ou a com- posição, como definida em qualquer uma das reivindicações 72 a 76.
121. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracte- rizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é um distúrbio autoimu- ne.
122. Método, de acordo com a reivindicação 121, caracte- rizado pelo fato de que o distúrbio autoimune é hepatite autoimune, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn, colite, colite ul-
cerativa, diabetes tipo 1, alopecia areata, vasculite, artrite temporal, lúpus, doença celíaca, síndrome de Sjogren, polimialgia reumática, esclerose múltipla, artrite, artrite reumatoide, doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) e psoríase.
123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 120 a 122, caracterizado pelo fato de que os Tregs modificadas são autólogos ao indivíduo.
124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 120 a 122, caracterizado pelo fato de que os Tregs modificadas são alogênicos ao indivíduo.
125. Método para aumentar uma ou mais funções imunos- supressoras de uma Treg caracterizado pelo fato de que compreen- de: introduzir um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, e em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem TNFRSF4; e cultivar a Treg de modo que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos seja reduzida em comparação com uma Treg que não foi modificada, em que o Treg modificada demonstra uma ou mais funções imunossupressoras aumentadas em comparação com a Treg que não foi modificada.
126. Método para aumentar uma ou mais funções imunos- supressoras de uma Treg caracterizado pelo fato de que compreen- de: introduzir um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, e em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem PRDM1; e cultivar a Treg de modo que a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos seja reduzida em comparação com uma Treg que não foi modificada, em que o Treg modificada demonstra uma ou mais funções imunossupressoras aumentadas em comparação com a Treg que não foi modificada.
127. Método para aumentar uma ou mais funções imunos- supressoras de uma Treg caracterizado pelo fato de que compreen- de: introduzir um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem TNFRSFA4.
128. Método para aumentar uma ou mais funções imunos- supressoras de uma Treg caracterizado pelo fato de que compreen- de: introduzir um sistema de regulação de genes na Treg, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes alvo endógenos, em que um ou mais genes alvo endógenos compreendem PRDM1.
129. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 125 a 128, caracterizada pelo fato de que uma ou mais funções imunossupressoras são selecionadas de proliferação de Treg, viabili- dade de Treg, estabilidade de Treg, expressão aumentada ou secre- ção de uma citocina imunossupressora, opcionalmente em que a cito- cina imunossupressora é IL-10, aumentada co-expressão de Foxp3 e Helios e/ou resistência à exaustão.
130. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracte- rizado pelo fato de que a estabilidade de Treg é avaliada durante a cultura in vitro com IL-6.
131. Método de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade caracterizado pelo fato de que compre- ende a administração de uma quantidade eficaz de Treg modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 71, ou a com- posição, como definida em qualquer uma das reivindicações 72 a 76.
132. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracte- rizado pelo fato de que a doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em: hepatite autoimune, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn, colite, colite ulcerativa, diabetes tipo 1, alope- cia areata, vasculite, artrite temporal, lúpus, doença celíaca, síndrome de Sjogren, polimialgia reumática, esclerose múltipla, artrite, artrite reumatoide, doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) e psoríase.
133. Treg modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, caracterizada pelo fato de que a Treg modifica- da é uma Treg residente em tecido.
134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 105 a 132, caracterizado pelo fato de que Treg é um Treg resi- dente em tecido.
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