CN101870973B - 提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列，它是SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，本发明提供一段核苷酸序列，将它连接到基因编码区的下游后再进行常规的外源基因在植物体内的表达过程，可提高外源基因表达水平1倍以上。本发明有益的效果是：利用分子生物学实验技术将本发明序列连到外源基因编码区终止密码子的下游，以融合片段作为一个整体进行常规的植物表达载体构建后进行外源基因在植物体内的表达，即可提高外源基因在植物体内的表达水平。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，主要是一种提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列。
背景技术
近来越来越多的研究表明，基因的3’UTR可通过影响mRNA的稳定性调节基因表达。已经有实验证实，在mRNA3’UTR中存在降解相关元件，在影响mRNA稳定上起重要作用。除此之外，3’UTR可以多种方式调控基因表达，如mRNA前体的加工过程及有效的poly(A)聚合依赖于3’UTR中的加尾信号，而poly(A)尾巴与mRNA的稳定与翻译密切相关；另外3’UTR序列中包含的一些元件、序列可以调节mRNA的稳定性。富含AU区(AU-rich region，ARE)是在3’UTR中发现得较早的一个元件，通常被认为是一个导致mRNA稳定性下降的元件，并且3’UTR中ARE越多越不稳定。与此相反，转铁蛋白受体基因和铁蛋白基因的3’UTR中含有IRE元件，在缺乏铁离子的时候可以阻止mRNA降解。这些元件可能通过与其结合的RNA结合蛋白影响mRNA的稳定性和正常的翻译。鉴于3’UTR具有调节基因表达的特点，我们就可以利用其特点来增加基因的稳定性，进而提高基因表达。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列，本发明的序列能够增加基因的转录产物提高基因表达。
本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列，它是SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，atttcttttt cttgtcaact ttattgcatt cattcatgataataattgtc ttagt。本发明提供一段核苷酸序列，将它连接到基因编码区的下游后再进行常规的外源基因在植物体内的表达过程，可提高外源基因表达水平1倍以上。
1)序列的获得
以拟南芥总DNA为模板，用P1(ATTTCTTTTTCTTGTCAACT)和P2(ACTAAGACAATTATTATCATGAA)引物进行PCR反应。扩增体系如下：10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs 2μl，10mM Pf和Pu各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1m，35个循环；72℃延伸10min。目的PCR产物大小约65bp，PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化后，利用Promega T-vector进行PCR片段的TA克隆，条件如下：2×Promega ligasebuffer 5ul，T-vector 1ul，PCR回收片段2ul，Promega T4-ligase 1ul，无菌水1ul，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、1mmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。含有插入序列的克隆命名为T-1。
2)序列的应用方法
利用分子生物学实验技术将获得序列连到外源基因编码区终止密码子的下游，以融合片段作为一个整体进行常规的植物表达载体构建后进行外源基因在植物体内的表达，即可提高外源基因在植物体内的表达水平。
本发明有益的效果是：本发明的序列，可提高外源基因在植物体内的表达水平。
附图说明
图1：本发明序列连接到GFP的末端后提高GFP在烟草叶片内的表达水平示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
实施例：应用本发明提高GFP在烟草叶片内的表达水平
①序列的克隆
以拟南芥总DNA为模板，用P1(ATTTCTTTTTCTTGTCAACT)和P2(ACTAAGACAATTATTATCATGAA)引物进行PCR反应。扩增体系如下：10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs 2μl，10mM Pf和Pu各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl(购自大连Takara公司)，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1m，35个循环；72℃延伸10min。目的PCR产物大小约65bp，PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒(德国Qiagen公司)纯化后，利用Promega T-vector(美国Promega公司)进行PCR片段的TA克隆，条件如下：2×Promega ligase buffer 5ul，T-vector 1ul，PCR回收片段2ul，Promega T4-ligase 1ul(美国Promega公司)，无菌水1ul，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、1mmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。含有插入序列的克隆命名为T-1。
②序列与GFP的融合
根据测得的序列，设计引物P3(ACAAACATGACGAACTCTAAATTTCTTTTTCTTGTCAACT)和P4(GAGCTCACTAAGACAATTATTATCATGA，下划线为SacI识别位点)，以T-1载体为模板进行PCR反应。扩增体系如下：10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs 2μl，10mM Pf和Pu各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl(购自大连Takara公司)，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1m，35个循环；72℃延伸10min。目的PCR产物大小约65bp，PCR产物(产物1)经Qiagen凝胶纯化试剂盒(德国Qiagen公司)纯化。根据pBinGFP中的GFP序列和本发明序列设计引物P5(GAATTCATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTT，下划线为BamHI识别位点)和P6(GTTGACAAGAAAAAGAAATTTAGAGTTCGTCATGTTTGT)，以pBinGFP质粒为模板扩增GFP序列。扩增体系如下：10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs 2μl，10mM Pf和Pu各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl(大连Takara公司)，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1m，35个循环；72℃延伸10min。目的PCR产物大小约750bp，PCR产物(产物2)经Qiagen凝胶纯化试剂盒(德国Qiagen公司)纯化。将产物1和产物2稀释100倍后混合，以此为模板，用P4和P5为引物进行PCR反应。扩增体系如下：10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs 2μl，10mM Pf和Pu各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl(大连Takara公司)，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1m，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化后，利用Promega T-vector(美国Promega公司)进行PCR片段的TA克隆，条件如下：2×Promega ligase buffer 5ul，T-vector 1ul，PCR回收片段2ul，Promega T4-ligase 1ul(美国Promega公司)，无菌水1ul，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、1mmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。测序正确的克隆命名为T-GFP-1。
③融合GFP在烟草叶片内的表达
将T-GFP-1中的融合片断经BamHI和SacI酶切后连入同样酶切的pCV1300中，构建pCVGFP-1载体；同时，利用同样的方法构建只含有GFP序列、不含有本发明核苷酸序列的pCVGFP载体。将两个载体分别转入农杆菌EHA105后，应用瞬时表达系统注射本氏烟草叶片，3天后观测烟草叶片GFP荧光变化，并通过real-time PCR检测GFP表达情况，结果如图2所示。在表达有pCVGFP-1的区域，GFP荧光明显较强，而在表达有pCVGFP的区域，GFP荧光相对较弱(图1a)。real-time PCR的结果也表明，pCVGFP-1区域的GFP表达水平要高出pCVGFP区域的GFP表达水平1倍以上(图1b)。
实施效果：
利用本发明序列，可提高实验中GFP基因在植物体内的表达水平。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
序列列表
SEQUENCE LISTING
一、核苷酸序列
<110>浙江省农业科学院
<120>提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列
<130>无
<140>
<141>
<160>1
<210>l
<211>55
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>1
atttcttttt cttgtcaact ttattgcatt cattcatgat aataattgtc ttagt 55
二、P1序列
<110>浙江省农业科学院
<120>提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列
<130>无
<140>
<141>
<160>l
<210>2
<21l>20
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>1
atttcttttt cttgtcaact 20
三、P2序列
<110>浙江省农业科学院
<120>提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列
<130>无
<140>
<141>
<160>1
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>1
actaagacaa ttattatcat gaa 23
四、P3序列
<110>浙江省农业科学院
<120>提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列
<130>无
<140>
<141>
<160>1
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>1
acaaacatga cgaactctaa atttcttttt cttgtcaact 40
五、P4序列
<110>浙江省农业科学院
<120>提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列
<130>无
<140>
<141>
<160>1
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>1
gagctcacta agacaattat tatcatga 28
Claims (1)
1.一种提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列，其特征是：它是SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
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