CN101824410B - 一种简易的植物人工microRNA构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种简易的植物人工microRNA构建方法，该方法的步骤如下：(1)用于植物人工microRNA构建的植物天然miRNA前体克隆；(2)用于植物人工microRNA构建的人工miRNA序列预测；(3)用于植物人工microRNA构建的引物设计合成；根据miRNA前体序列和人工miRNA序列设计具有如下特征的引物对：Primer F：sequenceA-sequence1-artificial miRNA sequence-sequnce2；Primer R：sequenceB-sequence3-artificial miRNA*RC sequence-sequnce4；(4)用于植物人工microRNA构建的PCR扩增体系。本发明有益的效果是：可用于植物miRNA构建，本发明具有的技术优势是操作简便快捷，省去了原来需要4次PCR才能完成的构建过程。

Description

一种简易的植物人工microRNA构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要是一种简易的植物人工microRNA构建方法。

背景技术

microRNA是真核生物体内的一种小分子，它能够调控与其互补的靶基因表达下调，它是由其前体pre-miRNA经Dicer酶切割产生。目前人们利用miRNA产生的原理和特点开展了人工miRNA沉默目的靶基因的研究，就是将pre-miRNA内产生天然miRNA的区域替换成其他序列(人工miRNA序列)，该序列经Dicer酶切割后就能产生出人工miRNA并发挥与天然miRNA相似的功能，沉默与人工miRNA互补的目的靶基因，从而有助于研究靶基因功能。在该技术中，根据靶基因序列设计出人工microRNA序列后，要通过4次PCR将植物本身的miRNA前体骨架中的miRNA和miRNA^*序列替换成人工miRNA和miRNA^*序列(如图1)，最后连入植物表达载体，完成植物人工microRNA的载体构建，上述过程费时费力。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种简易的植物人工microRNA构建方法，通过1次PCR即可完成构建，极大简化了植物人工microRNA载体的构建过程。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：本发明提供一种简易的植物人工microRNA构建方法，根据miRNA前体骨架序列和预测获得的人工miRNA序列设计1对引物(图2)，通过1次PCR即可完成植物人工miRNA载体构建。

一种简易的植物人工microRNA构建方法，包括：

1)用于植物人工microRNA构建的植物天然miRNA前体克隆

在目前的植物人工miRNA研究中，人们已经利用miR156、miR172、miR390和miR528前体进行了人工miRNA的构建工作。理论上每一种miRNA前体都能作为构建人工miRNA的骨架。

本方法中，首先要根据实验需要确定利用哪一个植物miRNA前体序列作为构建人工miRNA的骨架。选定miRNA前体后，在其茎环结构的上、下游100bp处设计上游引物Pf和下游引物Pu。以植物总DNA为模板，扩增miRNA前体。扩增体系如下：10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl₂10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM Pf和Pu各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1m，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化后，利用Promega T-vector进行PCR片段的TA克隆，条件如下：2×Promega ligase buffer 5ul，T-vector 1ul，PCR回收片段2ul，Promega T4-ligase 1ul，无菌水1ul，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、1mmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。序列测回后，通过DNAMAN 6.0软件进行核酸序列的比对分析，选择与已报道miRNA前体序列一致的克隆进行后续试验。

2)用于植物人工microRNA构建的人工miRNA序列预测

利用各种有效公用方法设计针对某一靶序列的人工miRNA序列；靶序列上与人工miRNA序列配对的相应序列即为miRNA^*序列。本方法中选用http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi？page＝Designer；project＝stdwmd网站的预测程序预测。首先将人工miRNA要沉默的靶基因序列以FASTA格式放入Target genes栏，genomes一栏选定植物基因组种类，Description一栏输入任务名称，Email-address一栏输入有效的电子邮箱，然后点击submit递交。1天后网站将会向电子邮箱发送针对靶基因的、预测的人工miRNA序列。将预测的人工miRNA序列与靶基因序列比对，靶基因序列上与人工miRNA序列互补的序列即是后续构建工作中的miRNA^*序列。

3)用于植物人工microRNA构建的引物设计合成

根据miRNA前体序列和人工miRNA序列设计具有如下特征的引物对(图2)：

Primer F：sequenceA-sequence1-artificial miRNA sequence-sequnce2

Primer R：sequenceB-sequence3-artificial miRNA^*RC sequence-sequnce4

该序列中，sequnce1为前体中miRNA区域外侧序列，长度为0-50nt；aritificial miRNAsequence为人工miRNA序列；sequence2为前体中miRNA区域内侧序列，长度为5-50nt；sequence3为前体中miRNA^*区域外侧序列的反向互补序列，长度为0-50nt；aritificial miRNA^*RC sequence为人工miRNA^*序列的反向互补序列；sequence4为前体中miRNA^*区域内侧序列的反向互补序列，长度为5-50nt；sequence A和B为用于酶切连接的核酸内切酶识别序列或者是用于拓扑连接的重组序列；根据实验需要sequnceA和B也可没有。根据不同miRNA前体的结构不同，miRNA和miRNA^*的位置可能有交换，在这种情况下，则上述特点描述中将miRNA与miRNA^*相互交换即可。在引物末端还可以添加数个起保护作用的碱基。

4)用于植物人工microRNA构建的PCR扩增体系及反应条件

以5ng含有miRNA前体序列的质粒为模板，在如下条件下进行扩增反应：10×PCR扩增缓冲液5μl，15mM MgCl₂10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primer F和primer R各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化后，利用Promega T-vector进行PCR片段的TA克隆，条件如下：2×Promega ligase buffer 5ul，T-vector 1ul，PCR回收片段2ul，Promega T4-ligase 1ul，无菌水1ul，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、1mmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。序列测回后，通过DNAMAN 6.0软件进行测回序列与人工miRNA序列、测回序列与人工miRNA^*序列、测回序列与miRNA前体序列的核酸比对分析，同时含有miRNA前体序列和人工miRNA序列、人工miRNA^*序列的测回序列即是构建好的植物人工miRNA序列(T-amiRNA)。

5)应用植物人工microRNA的后续工作

利用Promega质粒抽提试剂盒(Promega公司)抽提T-amiRNA质粒，用分别识别sequenceA和B的核酸内切酶A(Promega公司)和核酸内切酶B(Promega公司)进行酶切反应，反应条件如下：10×酶切缓冲液5ul，20ul T-amiRNA质粒，2ul核酸内切酶A(Promega公司)，2ul核酸内切酶B(Promega公司)，无菌水21ul，混匀后在核酸内切酶A和B所需最适温度酶切2h。反应完毕后，利用Qiagen凝胶回收试剂盒(Qiagen公司)回收酶切片段。将回收片段与同样酶切和回收的植物表达载体片断连接，连接反应如下：10×连接缓冲液(Promega)，2ul植物表达载体片段；6ul回收片段，1ul T4-连接酶(Promega)，混匀后放置4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取全部培养液涂布于含有50mmol/L卡那霉素的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后挑选3个长出的菌斑送上海Invitrogen公司测序。序列测回后，通过DNAMAN 6.0软件进行测回序列与T-amiRNA序列的比对分析，与T-amiRNA序列完全匹配的克隆即是含有植物人工miRNA表达载体的克隆，可以用于人工miRNA的沉默靶基因试验。

本发明有益的效果是：本发明的方法，可用于植物miRNA构建。与传统方法相比，本发明具有的技术优势是操作简便快捷，省去了原来需要4次PCR才能完成的构建过程。

附图说明

图1：传统构建人工miRNA的方法示意图

图2：本发明构建人工miRNA方法示意图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：沉默GFP的植物人工miRNA构建与应用

①植物天然miR528前体克隆

选定拟南芥miR528为前体骨架进行人工miRNA构建；因此根据其前体序列，在其茎环结构的上、下游100bp处设计上游引物Pf和下游引物Pu。

Pf：CCACCCTTCACCAATGGAT

Pu：TTTACAACGGCATACGCCC

以拟南芥总DNA为模板，扩增miR528前体。扩增体系如下：10×PCR buffer 5μl，15mMMgCl₂ 10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM Pf和Pu各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，总DNA 1ul，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1m，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化后，利用PromegaT-vector进行PCR片段的TA克隆，条件如下：2×Promega ligase buffer 5ul，T-vector 1ul，PCR回收片段2ul，Promega T4-ligase 1ul，无菌水1ul，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、1mmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。序列测回后，通过DNAMAN 6.0软件进行核酸序列的比对分析，选择与miR528前体序列一致的克隆进行后续试验。

②针对GFP的人工miRNA序列预测

采用http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi？page＝Designer；project＝stdwmd网站上的预测程序预测烟草16c体内GFP序列的潜在人工miRNA靶位点。首先打开网页，在Targetgenes栏输入GFP的FASTA序列格式，genomes一栏选定拟南芥基因组，Description一栏输入任务名称GFP，Email-address一栏输入有效的电子邮箱，然后点击submit递交。1天后网站向电子邮箱发送来针对GFP的、预测的人工miRNA序列。选定自由能最高的TTAAGGGTAAGTTTTCCGCAT为人工miRNA序列，将该序列与GFP序列比对，与人工miRNA序列互补的序列即是后续构建工作中的miRNA^*序列，为ATACGGAAAACTTACCCTTAA。

③构建人工miRNA的引物设计

根据拟南芥miR528前体序列和GFP人工miRNA序列设计构建人工miRNA的引物，在引物末端添加酶切位点以用于后续真核表达载体的克隆。引物如下：

Primer F中，依次斜体为技术方案中的sequenceA，是核酸内切酶BamHI的识别位点；下划线序列为技术方案中的sequence1，是miR528前体中miRNA外侧序列，长度为9nt；粗体序列为技术方案中的artificial miRNA sequence，是预测获得的针对GFP的人工miRNA序列；下划线序列是技术方案中的sequence2，是miR528前体中miRNA内侧序列，长度为16nt。Primer R中，依次斜体为技术方案中的sequenceB，是核酸内切酶SacI的识别位点；下划线序列为技术方案中的sequence3，是miR528前体中miRNA^*外侧序列，长度为9nt；粗体序列为技术方案中的artificial miRNA^*sequence，是预测获得的针对GFP的人工miRNA的互补序列；下划线序列是技术方案中的sequence4，是miR528前体中miRNA^*内侧序列，长度为16nt。

④构建针对GFP的人工miRNA

以5ng含有miR528前体序列的质粒为模板，在如下条件下进行扩增反应：10×PCR buffer5μl，15mM MgCl₂10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primer F和primer R各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化后，利用Promega T-vector进行PCR片段的TA克隆，条件如下：2×Promega ligase buffer 5ul，T-vector1ul，PCR回收片段2ul，Promega T4-ligase 1ul，无菌水1ul，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、1mmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。序列测回后，通过DNAMAN 6.0软件进行测回序列与GFP人工miRNA序列、测回序列与GFP人工miRNA^*序列、测回序列与miR528前体序列的核酸比对分析，同时含有miR528前体序列和GFP人工miRNA序列、GFP人工miRNA^*序列的测回序列即是构建好的针对GFP的植物人工miRNA载体(T-GFP amiRNA)

④应用GFP人工miRNA沉默烟草16c体内的GFP表达

将T-GFP amiRNA质粒中的人工miRNA片段经BamHI和SacI酶切后连入同样酶切的pBI121中，构建pBGami载体并转入农杆菌EHA105后，应用瞬时表达系统注射表达有GFP的烟草16c，3天后观测烟草叶片GFP荧光变化，并通过real-time PCR检测GFP表达情况，表达有GFP amiRNA的区域GFP荧光减弱，紫外光下变成叶片本底的红色，而对照不含有GFP amiRNA的区域，在紫外光下仍呈绿色。real-time PCR的结果也表明，GFP的表达在amiRNA存在的条件下下降70％。

实施效果：

利用本发明构建针对GFP的人工miRNA，仅用1个PCR反应即可，而用传统方法要需要4次PCR，因此极大地缩短了实验时间、节省了财力。同时，利用本发明构建的针对GFP的人工miRNA能够有效地沉默目的基因GFP的表达。

实施例2：沉默upf1基因的植物人工miRNA构建与应用

①植物天然miR319前体克隆

选定miR319前体序列为骨架进行人工miRNA构建；因此根据其前体序列，在其茎环结构的上、下游100bp处设计上游引物Pf和下游引物Pu。

Pf：ACCCTCACTATTCTCGTCTCCA

Pu：GATAAAGCACTGTTGATGACAAGC

以拟南芥总DNA为模板，扩增miR319前体。扩增体系如下：10×PCR buffer 5μl，15mMMgCl₂10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM Pf和Pu各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，总DNA 1ul，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1m，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化后，利用PromegaT-vector进行PCR片段的TA克隆，条件如下：2×Promega ligase buffer 5ul，T-vector 1ul，PCR回收片段2ul，Promega T4-ligase 1ul，无菌水1ul，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、1mmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。序列测回后，通过DNAMAN 6.0软件进行核酸序列的比对分析，选择与miR319前体序列一致的克隆进行后续试验。

②针对烟草upf1的人工miRNA序列预测

采用http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi？page＝Designer；project＝stdwmd网站上的预测程序预测烟草upf1序列的潜在人工miRNA靶位点。首先打开网页，在Target genes栏输入upf1的FASTA序列格式，genomes一栏选定拟南芥基因组，Description一栏输入任务名称upf1，Email-address一栏输入有效的电子邮箱，然后点击submit递交。1天后网站向电子邮箱发送来针对upf1的、预测的人工miRNA序列。选定自由能最高的TTTGAATTAAACTGATGGGCC为人工miRNA序列，将该序列与upf1序列比对，与人工miRNA序列互补的序列即是后续构建工作中的miRNA^*序列，为AGCCCATCAGTTTAATTCAAG。

③构建人工miRNA的引物设计

根据拟南芥miR319前体序列和upf1人工miRNA序列设计构建人工miRNA的引物，在引物末端添加酶切位点以用于后续真核表达载体的克隆。引物如下：

由于miR319前体骨架与miR528不同，因此Primer F中，斜体、下划线、粗体、下划线标示的碱基依次是技术方案中的sequenceA、sequence1(前体中miRNA^*区域外侧序列)、artificial miRNA^*sequence和sequence2(前体中miRNA^*区域内侧序列)；Primer R中，依次斜体、下划线、粗体、下划线标示的碱基依次是技术方案中的sequenceA、sequence3(前体中miRNA区域外侧序列)、artificial miRNA sequence和sequence4(前体中miRNA区域内侧序列)。

④构建针对upf1的人工miRNA

以5ng含有miR319前体序列的质粒为模板，在如下条件下进行扩增反应：10×PCR buffer5μl，15mM MgCl₂10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primer F和primer R各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，无菌水补足50μl。反应条件为95℃预变性3min；93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化后，利用Promega T-vector进行PCR片段的TA克隆，条件如下：2×Promega ligase buffer 5ul，T-vector1ul，PCR回收片段2ul，Promega T4-ligase 1ul，无菌水1ul，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取10ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1h后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、1mmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37℃培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。序列测回后，通过DNAMAN 6.0软件进行测回序列与upf1人工miRNA序列、测回序列与upf1人工miRNA^*序列、测回序列与miR319前体序列的核酸比对分析，同时含有miR319前体序列和upf1人工miRNA序列、upf1人工miRNA^*序列的测回序列即是构建好的针对upf1的植物人工miRNA载体(T-upf1 amiRNA)

④应用upf1人工miRNA沉默本氏烟体内的upf1基因表达

将T-upf1 amiRNA质粒中的人工miRNA片段经BamHI和SacI酶切后连入同样酶切的pBI121中，构建pBUami载体并转入农杆菌EHA105后，应用瞬时表达系统注射本氏烟叶片，3天后抽提注射区域的RNA，翻转后进行半定量RT-PCR检测，叶片内的upf1基因在其人工miRNA存在条件下表达量大幅下降。

实施效果：

利用本发明构建针对upf1基因的人工miRNA，仅用1个PCR反应即可，而用传统方法要需要4次PCR，因此极大地缩短了实验时间、节省了财力。同时，利用本发明构建的针对upf1的人工miRNA能够有效地沉默目的基因upf1的表达。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

一、upf1序列

<110>浙江省农业科学院

<120>一种简易的植物人工microRNA构建方法

<130>无

<140>

<141>

<160>1

<210>1

<211>1422

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>1

tctttcttct tggtttcatt tctgctaagg cagagagtgt cgttgttctc ctctgtaggg 60

aaccttgcct taatgttaat gcattgaagg atatgaactg ggacctaagc cagtggtgcc 120

cgctcattga tgacaggtgc tttttgcagt ggcttgttaa ggtcccctct gagcaagaac 180

agttgagggc acgccagatc aatgctcaac aaatcaacaa agtagaagaa ttgtggaaga 240

caaatccaga tgctaccttg gaagatcttg agaagcctgg tgtagatggt gagcctcagc 300

ccgttgcctt gaagtatgaa gatgcctgtc agtatcaaaa catatttgca ccattgatca 360

agctcgaagc tgactacgat aagatgatga aagagtctca gagtaaagac aatcttacta 420

ttcgatggga tattggtctc aacaagaaac gcgttgcgta ctttgtcttc cctaaggaag 480

ataatgagtt gcgtcttgta cctggtgatg agctaaggct gcgatattca ggggatgcag 540

cacatccagc ttggcaatcc gtggggcacg tggtaaaatt aactgctcaa gaggaggttg 600

cgctagaact tcgtgtcagc cagggggttc ctgtcgatgt gacccatggg cttagcgttg 660

actttgtttg gaaaagtacg agctttgatc ggatgcagag tgcgatgaaa acctttgcag 720

tggatgagac tagtgtcagt gggtatattt accatcacct gttaggtcat gaagttgaga 780

tgcagatggt ccgcaatgca cttcctcgcc gttttggtgc ccctggtctt ccagagctta 840

atgcatctca ggtttttgct gtaaaaagtg ttcttcaaaa gcccatcagt ttaattcaag 900

gtccacctgg aacgggaaaa actgtcacct ctgccgccat tgtgtatcat gtggccaaac 960

aaggccaagg acaggttttg gtctgtgccc ccagtaatgt tgctgtggac caattagcag 1020

agaagataag tgctactggt ctgaaggtgg tcaggctctg tgccaagtca agggaagctg 1080

tcagttctcc tgtcgagcat ttaacccttc actatcaggt tcgccatctt gacacatctg 1140

agaagagtga actgcacaag ttacagcaac tgaaggatga acaaggagag ctctccagca 1200

gtgatgagaa gaaatataaa gctttgaagc gggcaacaga gagggaaata gctcagagtg 1260

ctgatgtaat ttgttgcaca tgcgttggtg ctggagaccc tagattggct aacttcagat 1320

tccgccaggt gcttattgat gaatccactc aggctactga gcctgaatgt cttattcctt 1380

tggttcttgg cgcaaagcag gctgttcttg tcggtgatca tt                    1422

二、GFP序列

<110>浙江省农业科学院

<120>一种简易的植物人工microRNA构建方法

<130>无

<140>

<141>

<160>1

<210>1

<211>792

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>1

atgaagacta atctttttct ctttctcatc ttttcacttc tcctatcatt atcctcggcc 60

gaattcagta aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 120

ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 180

ggaaaactta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc atggccaaca 240

cttgtcacta ctttctctta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccaga tcatatgaag 300

cggcacgact tcttcaagag cgccatgcct gagggatacg tgcaggagag gaccatcttc 360

ttcaaggacg acgggaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaggg agacaccctc 420

gtcaacagga tcgagcttaa gggaatcgat ttcaaggagg acggaaacat cctcggccac 480

aagttggaat acaactacaa ctcccacaac gtatacatca tggccgacaa gcagaagaac 540

ggcatcaaag ccaacttcaa gacccgccac aacatcgaag acggcggcgt gcaactcgct 600

gatcattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 660

tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 720

cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact atacaaacat 780

gacgaactct aa                                                     792

Claims (1)

1.一种简易的植物人工microRNA构建方法，其特征是：该方法的步骤如下：

(1)用于植物人工microRNA构建的植物天然miRNA前体克隆；

(2)用于植物人工microRNA构建的人工miRNA序列预测；将预测的人工miRNA序列与靶基因序列比对，靶基因序列上与人工miRNA序列互补的序列即是后续构建工作中的miRNA^*序列；

(3)用于植物人工microRNA构建的引物设计合成；

根据miRNA前体序列和人工miRNA序列设计具有如下特征的引物对：

Primer F：sequenceA-sequence1-artificial miRNA sequence-sequnce2

Primer R：sequenceB-sequence3-artificial miRNA^*RC sequence-sequnce4

该序列中，sequnce1为前体中miRNA区域外侧序列，长度为9nt；aritificial miRNA sequence为人工miRNA序列；sequence2为前体中miRNA区域内侧序列，长度为16nt；sequence3为前体中miRNA^*区域外侧序列的反向互补序列，长度为9nt；aritificial miRNA^*RC sequence为人工miRNA^*序列的反向互补序列；sequence4为前体中miRNA^*区域内侧序列的反向互补序列，长度为16nt；sequence A和B为用于酶切连接的核酸内切酶识别序列或是用于拓扑连接的重组序列；

(4)用于植物人工microRNA构建的PCR扩增。

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