BR112014003679B1 - Domínio variável de imunoglobulina único, composição farmacêutica, formulação, ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, microorganismo transgênico, e, uso de uma composição farmacêutica - Google Patents

Domínio variável de imunoglobulina único, composição farmacêutica, formulação, ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, microorganismo transgênico, e, uso de uma composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

DOMÍNIO VARIÁVEL DE IMUNOGLOBULINA ÚNICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM DOMÍNIO VARIÁVEL DE IMUNOGLOBULINA ÚNICO OU DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, FORMULAÇÃO, DISPOSITIVO DE DISPENSAÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO OU RECOMBINANTE, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO. A presente invenção refere-se a proteínas e peptídeos modificados que têm baixa capacidade de ligar a anticorpos pré-existentes. Tais moléculas de proteína/peptídeo modificadas podem compreender adições, extensões ou marcas no terminal C e/ou certas substituições de aminoácidos. Tais moléculas modificadas (por exemplo, fusões e conjugadas) compreendem proteínas, peptídeos, moléculas de ligação de antígeno, anticorpos ou fragmentos de anticorpo tais como domínios variáveis únicos, por exemplo, domínios variáveis únicos de imunoglobulina humano (anticorpo), e também domínios variáveis únicos derivados de fontes de não humano tal como um lhama ou camelo, por exemplo, um VHH incluindo um nanocorpo ? (descrito, por exemplo, em WO 94/04678 e WO 95/04079 inter alia). A invenção adicionalmente refere-se a usos, formulações, composições compreendendo tais moléculas terminalmente C estendidas modificadas e/ou substituídas com aminoácido e também a métodos de produção e expressão dessas moléculas.

Description

[0001] A presente invenção fornece proteínas e peptídeos modificados que têm baixa capacidade de ligar a anticorpos pré-existentes. Tais moléculas de proteína/peptídeo modificadas podem compreender adições, extensões ou marcações no terminal C e/ou certas substituições de aminoácidos. Tais moléculas de proteína/peptídeo modificadas (incluindo fusões e seus conjugados) podem compreender moléculas de ligação de antígeno, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpo, e domínios variáveis únicos, por exemplo, domínios variáveis únicos de imunoglobulina humana (anticorpo), e também domínios variáveis únicos derivados de fontes de não humano tal como lhama ou camelo, por exemplo, uma VHH incluindo um Nanobody™ (por exemplo, descrito em WO 94/04678 e WO 95/04079 INTER ALIA). A invenção adicionalmente fornece usos, formulações, composições compreendendo tais moléculas terminalmente C estendidas modificadas e/ou substituídas com aminoácido e também a métodos de produção e expressão dessas moléculas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] Existem autoanticorpos de°Corrência natural em humanos que podem ligar em proteínas, por exemplo, em imunoglobulinas hospedeiras ou fragmentos de imunoglobulina, por exemplo, fator reumatoide (que ligam epítopos na região Fc de anticorpos), autoanticorpos anti-idiotipo (que ligam o anticorpo das regiões variável/CDR) e autoanticorpos antidobradiça (que ligam a região de dobradiça do domínio constante de Ig em fragmentos Fab).
[0003] Esses autoanticorpos podem ser parte de um repertório policlonal de autoanticorpos anti-imunoglobulina (Ig) com especificidade para epítopos por toda a molécula de Ig que estão presentes tanto em primatas humanos quanto em não humano. Além dos autoanticorpos anti-IgG que ligam epítopos no domínio de Fc intacto (isto é, os fatores reumatoides (RF)), a presença de autoanticorpos antiidiotípicos que ligam nas regiões de variáveis CDR de IgG, e anticorpos antidobradiça que reagem com epítopos crípticos nas regiões de dobradiça do terminal C de Fab ou fragmentos de F(‘Ab’)2 também foram observados. O papel funcional desses diferentes autoanticorpos anti-IgG continua incerto. O fator reumatoide e autoanticorpos antidobradiça foram ligados com certas condições patológicas, tais como autoimunidade e certas infecções, embora anticorpos antiidiotípicos possam conferir proteção a partir dos autoanticorpos em certas doenças autoimunes. Além disso, foi proposto um papel imunorregulatório para autoanticorpos anti-IgG, em que esses autoanticorpos controlam o estímulo de células B autorreativas e regulam respostas imunes a antígenos estrangeiros. Anticorpos antidobradiça são autoanticorpos anti-IgG que reagem com IgG clivado, mas, não intacto. Sua alta prevalescência na população humana normal implica exposição prévia a fragmentos de IgG, possivelmente em decorrência de clivagem de IgG por proteases bacterianas ou endógenas.
[0004] Bem como ligação em proteínas endógenas (presentes em sujeitos naive) autoanticorpos podem também ligar em proteínas ou peptídeos que são administrados em um indivíduo para tratamento. Anticorpos pré- existentes que ligam em moléculas tais como proteínas e peptídeos terapêuticos administrados em um indivíduo podem afetar sua eficácia e podem resultar em reações na administração, hipersensibilidade, resposta clínica alterada em pacientes tratados bem como biodisponibilidade alterada, sustentando, eliminando ou neutralizando a molécula. Entretanto, em alguns exemplos, existência desses anticorpos pode ser menos significativa durante tratamento com medicamento do que em outros exemplos.
[0005] Autoanticorpos de ligação de proteína terapêutica e anticorpos que são recém formados em resposta ao tratamento com medicamento (tal como administração de uma proteína ou peptídeo terapêutico) são coletivamente denominados anticorpos antimedicamento (ADAs). Quando ADAs são descritos em todo este documento, nos referimos aos ADAs pré- existentes, a menos que especificamente estabelecido de outra forma.
[0006] Anticorpos do domínio de VH e VL são derivados de sequências da estrutura totalmente humano e, embora previsões in silico descrevam uma incidência notavelmente baixa de peptídeos potencialmente imunogênicos, é possível que esses anticorpos do domínio possam ser imunogênicos em humanos, isto é, eles poderiam elicitar ADAs, e eles ligariam em ADAs pré-existentes dependendo de fatores tanto dependente da sequência quanto independente da sequência.
[0007] Similarmente, inúmeros dAbs simples derivados da cadeia pesada de camelídio (VHH) estão sob investigação na clínica e, embora não tenha sido reportada nenhuma hipersensibilidade ou outros eventos adversos imune-mediados, ligação em ADAs pré-existentes continua uma possibilidade.
[0008] Poderia ser assim vantajoso fornecer moléculas para terapia que compreendem proteínas, ou peptídeos, por exemplo, moléculas de ligação de antígeno, que têm baixa capacidade de ligar em ADAs pré-existentes quando administradas em um indivíduo, em particular um indivíduo humano. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] Demonstramos, conforme descrito aqui, que, em soros de alguns sujeitos humanos naive saudáveis, estão presentes autoanticorpos anti- VH pré-existentes que podem ligar tanto anticorpos do domínio de VH quanto moléculas VHH, bem como autoanticorpos anti-VL (por exemplo, V capa (Vk)) que podem ligar moléculas de VL. Os ADAs pré-existentes que ligam dAbs de VH são similares aos anticorpos antidobradiça em que eles ligam fragmentos de IgG, mas, não as mesmas sequências observadas no IgG intacto in situ.
[00010] Foi desenvolvido um imunoensaio específico conforme descrito aqui e validado para detectar anticorpos antimedicamento para o DOM1H-131-206 do dAb de VH (sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO 1) em humanos. Um painel de 60 amostras de soro de doador humano saudável foi classificado para reatividade de fundo no ensaio. Determinou-se que aproximadamente 45% das amostras de soro desses sujeitos tiveram anticorpos detectáveis, que foram capazes de ligar no DOM1H-131-206. Esta reatividade parece específicas para um neo epítopo, ou epítopos, dentro da sequência da estrutura do dAb de VH, uma vez que a resposta foi reativa cruzada com as estruturas de VH do dAbs ligando vários antígenos alvos, mas, não com IgG humano total. ADA pré-existente para dAbs de VL foi também observado nas amostras de soro de doadores humanos saudáveis mas, a um menor grau que VH.
[00011] Usando uma abordagem de mutagênese, determinamos se as modificações na estrutura de VH poderiam reduzir a ligação desses ADAs pré-existentes. Usando esta abordagem, mapeamos um epítopo na terminação C da estrutura do dAb da VH, e exemplificamos inúmeras abordagem que podem ser usadas para reduzir ou eliminar a ligação dos anticorpos pré- existentes em moléculas de VL, VH e VHH. Em particular, mostramos que modificações que alteram a conformação tridimensional da terminação C do dAb, em particular o resíduo de serina terminal C (isto é, na posição 113 de Kabat) em dAbs de VH e VHH, são importantes. Além do mais, conformação tridimensional da terminação C do dAb pode ser alterada pela adição de resíduos de aminoácido adicionais (extensão no terminal C) e/ou substituindo os resíduos de aminoácido presentes em uma ou mais das posições 14, 41, 108, 110 e 112 em dAbs de VH.
[00012] A presente invenção assim forneces moléculas modificadas que têm baixa capacidade de ligar em ADAs (pré-existentes) comparadas com a molécula não modificada e são adequadas para administração em um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano para terapia ou profilaxia. Baixa capacidade de ligar significa que a molécula liga com uma baixa afinidade ou baixa avidez em um ADA pré-existente. Tais moléculas compreendem proteínas, ou peptídeos, por exemplo, proteínas de ligação de antígeno, por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpo e domínios variáveis únicos, por exemplo, domínios variáveis únicos de imunoglobulina humano (anticorpo) (VH ou VL), e também domínios variáveis únicos derivados de fontes de não humano tal como lhama ou camelídio, por exemplo, uma VHH de camelídio incluindo um Nanobody™ (descrito, por exemplo, em WO 94/04678 e WO 95/04079 inter alia). As ditas moléculas compreendem uma ou mais modificações selecionadas de: (a) uma adição, extensão, deleção ou marcação do terminal C, e/ou (b) uma ou mais substituições da estrutura de aminoácido.
[00013] Adicionalmente, as moléculas modificadas aqui descritas e composições farmacêuticas compreendendo essas moléculas modificadas podem ter um melhor perfil de segurança e menos efeitos colaterais do que as moléculas não modificadas, por exemplo, dAb não modificada, que não compreendem uma extensão, adição, deleção ou marcação do terminal C e/ou outra modificação da estrutura, para diminuir a ligação em ADA pré-existente. Similarmente, administração das moléculas modificadas conforme descrito aqui, ou de composições farmacêuticas compreendendo essas moléculas modificadas (que têm baixa capacidade de ligar em ADA pré-existente), pode levar a imunogenicidade modificada e pode também resultar em maior eficácia e um melhor perfil de segurança e, por exemplo, pode ser vantajosamente usada para dosagem repetitiva em pacientes que poderiam desenvolver autoanticorpos para as moléculas não modificadas, por exemplo, dAbs.
[00014] Assim, em um primeiro aspecto da invenção, é provido: um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), que compreende uma ou mais modificações selecionadas de: (a) uma extensão no terminal C que compreende uma extensão de aminoácido de um aminoácido a 5 aminoácidos; ou (b) uma ou mais substituições da estrutura de aminoácido em que pelo menos uma substituição é uma substituição selecionada de: uma substituição de P14A, uma substituição de P41A e uma substituição de L108A.
[00015] Em uma modalidade, é fornecida uma extensão no terminal C de um a 4 aminoácidos. Em uma outra modalidade, a dita extensão no terminal C compreende um aminoácido que é alanina, e que tem baixa ligação em ADAs pré-existentes, comparado com o domínio variável de imunoglobulina único não modificado (dAb).
[00016] Em um outro aspecto, a extensão do terminal C pode ser uma extensão de 1-15 aminoácidos, por exemplo, 1 a 8 aminoácidos ou 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 aminoácidos. Em particular, uma extensão de 1 a 8 aminoácidos, ou 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 aminoácidos que compreende um resíduo de alanina, por exemplo, uma única extensão de alanina, ou uma extensão de AS, AST, ASTK, ASTKG, ASTKGP. Em particular, uma extensão de 1-5 aminoácidos é provida ou uma extensão de 1-4 aminoácidos. O domínio variável de imunoglobulina único modificado pode também compreender uma deleção de aminoácido. O domínio variável de imunoglobulina único (dAb) pode ser selecionado de um dAb de VH humano, ou VL humano ou uma VHH camelídio. A extensão no terminal C pode estar presente como uma fusão direta ou um conjugado com a terminação C do dAb.
[00017] Em um outro aspecto, a invenção fornece um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) em que (i) o dito dAb é uma VH humano ou uma VHH de camelídio e a dita extensão do terminal C compreende uma extensão de aminoácido selecionado de (a) A (b) AS, (c) AST (d) ASTK, (e) ASTKG (f) AAA ou (g) T; e em que (ii) o dito dAb é uma VL humano (tal como um V capa) e a dita extensão do terminal C compreende uma extensão de aminoácido selecionado de (a) AAA, (b) A (c) TV (d) T.
[00018] A invenção também fornece um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) que liga monovalentemente em um antígeno alvo, compreendendo: a) três regiões determinantes de complementariedade (CDR) específicas para o dito antígeno alvo; de maneira tal que o dito dAb liga o dito antígeno com uma KD na faixa de 5 micromolar a 1 picomolar b) quatro regiões de estrutura (FW); e c) uma sequência terminal do C que consiste na sequência VTVS(S)nX ou VEIKpRqX; e, opcionalmente, d) uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 14, 41, 108, 110, ou 112 comparadas com uma sequência da estrutura da linha germinal humano em que: n representa um número inteiro independentemente selecionado de 0 ou 1; p e q cada qual representa 0 ou 1, de maneira tal que, quando p representar 1, q pode ser 0 ou 1, e de maneira tal que, quando p representar 0, q também representa 0; X pode estar presente ou ausente e, se presente, representa uma extensão de aminoácido de 1 a 8 resíduos de aminoácidos; com a condição adicional que, se X estiver ausente; i) n é 0 e/ou a terminação do dAb em VTVS(S)n compreende uma ou mais das ditas substituições de aminoácidos; ii) p e/ou q é 0, e/ou a terminação do dAb em VEIKpRqX compreende uma ou mais das ditas substituições de aminoácidos.
[00019] KD refere-se à constante de dissociação de equilíbrio. Versados na técnica perceberão que quanto menor o valor numérico de KD, tanto mais forte a ligação.
[00020] Em uma modalidade deste aspecto, o dito dAb liga no dito antígeno com uma KD na faixa de cerca de 10 pM a cerca de 50 nM.
[00021] Em uma modalidade deste aspecto, o dito domínio variável de imunoglobulina único (dAb) tem uma menor afinidade de ligação e/ou avidez para um anticorpo de antimedicamento (ADA) do que um dAb equivalente, em que o dito dAb equivalente tem a mesma sequência do dito domínio variável de imunoglobulina único, exceto que X está ausente, n,p e q são 1 e não existe nenhuma substituição de aminoácido.
[00022] Em uma modalidade adicional, o dito domínio variável de imunoglobulina único é um em que a dita sequência do terminal C consiste na sequência VTVSSX.
[00023] Em uma outra modalidade, o dito domínio variável de imunoglobulina único é um em que a dita sequência do terminal C consiste na sequência VEIKRX.
[00024] Em uma modalidade adicional, o dito domínio variável de imunoglobulina único tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: uma substituição de P14A, uma substituição de P41A, uma substituição de L108A, uma substituição de T110A e uma substituição de S112A.
[00025] Em uma modalidade, X está presente e é uma extensão de 1 a 8 aminoácidos ou 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 aminoácidos, em particular uma extensão de 1 a 8 aminoácidos, ou 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 aminoácidos que compreende um resíduo de alanina, por exemplo, uma única extensão de alanina, ou uma extensão de AS, AST, ASTK, ASTKG, ASTKGP.
[00026] Em uma modalidade adicional, o dito dAb é um dAb de VH, ou VL ou uma VHH Camelídio.
[00027] Ainda em um aspecto adicional, a invenção também fornece uma sequência de aminoácidos que é qualquer uma das sequências do domínio variável de imunoglobulina único não modificado (dAb) conforme descrito aqui, (por exemplo, SEQ ID NOs 1-6, 10-13) que é então modificada para diminuir a ligação em ADAs conforme descrito aqui, por exemplo, uma sequência de domínio variável de imunoglobulina único não modificada descrita aqui, que é modificada de maneira tal que, X está presente e é uma extensão de 1 a 8 aminoácidos, em particular uma extensão de 1 a 8 aminoácidos que compreende um resíduo de alanina, por exemplo, uma única extensão de alanina, ou uma extensão de AS, AST, ASTK, ASTKG, ASTKGP e/ou o dito domínio variável de imunoglobulina único tem uma ou mais substituições de aminoácidos em que, as ditas uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas do grupo que consiste em uma substituição de P14A, uma substituição de P41A, uma substituição de L108A, uma substituição de T110A e uma substituição de S112A.
[00028] Em uma modalidade, a invenção fornece um domínio variável de imunoglobulina único que é uma VH humano ou uma VHH de camelídio e a dita extensão do terminal C compreende uma extensão de aminoácido selecionada de: (a) AS, (b) AST (c) ASTK, (d) ASTKG (e) AAA ou (f) T ou (g) ASTKGP, e/ou em que existe uma deleção de aminoácido da terminação do dAb em VTVS(S)n e a dita deleção é uma deleção -S.
[00029] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um domínio variável de imunoglobulina único que é uma VL humano, por exemplo, V capa, e em que a dita extensão do terminal C compreende uma extensão de aminoácido selecionada de: (a) AAA (b) A (c) TV e (d) T, e/ou em que existe uma deleção de aminoácido da terminação do dAb em VEIKR e a dita deleção é uma deleção -R.
[00030] Em uma modalidade alternativa dos aspectos anteriores da invenção, quando a sequência terminal do C para um dAb da VL é VEIKRAAA ou VEIKRT, são excluídos construtos de ligação de antígeno compreendendo dois dAbs separados por uma região Fc de cadeia única de um anticorpo, em que cada dAb é capaz de ligar em VEGF.
[00031] Em um aspecto, os dAbs modificados para diminuir a ligação em ADA conforme descrito aqui, (por exemplo, VH, VL tais como V capa e VHH) têm uma KD de ligação em ADA que é 150% ou mais (por exemplo, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650% ou mais) da KD de uma sequência de domínio variável de imunoglobulina único equivalente, mas não modificada (dAb). Também provido pela invenção é dAb modificado conforme descrito aqui, para ter baixa ligação em ADA e que tem baixa ligação em ADAs, determinado usando um ensaio de confirmação descrito no exemplo 2 e onde o dito dAb modificado tem um% de inibição média de sinal que é menor que 90%, por exemplo, menor que 80%, por exemplo, menor que 70%, por exemplo, menor que 60%, por exemplo, menor que 50%, por exemplo, menor que 40%, por exemplo, menor que 30%, por exemplo, menor que 20%, por exemplo, menor que 10%, em comparação com um dAb de controle que tem em torno de 98%-100% de inibição de sinal, o dito dAb de controle (não modificado) tem a mesma sequência ou similar a ela, mas, não é modificada para diminuir a ligação em ADA.
[00032] A presente invenção também fornece um domínio variável de imunoglobulina (dAb) único da invenção para uso em um método de terapia, por exemplo, para uso em um método de impedir efeitos colaterais. Este uso pode ser de benefício particular onde o dAb é um antagonista do alvo, por exemplo, um alvo selecionado de receptor de TNFα, TNF, receptor de TNF 1 (TNFR1), VEGF, IL-1R, IL-6R, IL-4, IL-5, IL-13, DC-SIGN, ASGPR, albumina, e TGFβR2. Em uma modalidade, o alvo é um receptor, ou em particular um receptor que é polimérico ou um receptor que dimeriza mediante ativação, por exemplo, o receptor de TNF. Em uma outra modalidade, o dAb modificado conforme descrito aqui, de maneira tal que ele tenha baixa ligação em ADAs, é para ser usado em um regime de tratamento que envolve dosagem repetida.
[00033] A invenção fornece um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) em que o alvo é TNFR1, e que é dAb selecionado de qualquer uma das sequências de aminoácidos seguintes identificadas como: (a) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 16); (b) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C e uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 17); (c) dAb de DOM1h-131-206 com uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 18); (d) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG (SEQ ID NO 19); e (e) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG e uma mutação da estrutura de aminoácido P14A (SEQ ID NO 20). A invenção também fornece um dAb (não modificado) que é selecionado de uma sequência que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas como: DOM1h-131-206 (SEQ ID NO 1), DOM1h-131-511 (SEQ ID NO 2), DOM1h-131-202 (SEQ ID NO 3) e que compreende adicionalmente qualquer uma incluindo, por exemplo, qualquer das modificações descritas aqui que diminui a ligação em ADAs, por exemplo, uma única extensão da terminação C de alanina.
[00034] Os dAbs da invenção incluem qualquer uma das sequências de aminoácidos do dAb descritas aqui, ou que são parte de moléculas, conforme descrito aqui (ou uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica a uma sequência de dAb como essa), por exemplo, qualquer um dos dAbs descritos em qualquer dos exemplos aqui e que, por exemplo, compreende qualquer das modificações descritas aqui para diminuir a ligação em ADAs, tal como uma extensão de alanina no terminal C. A invenção também compreende qualquer uma das moléculas descritas aqui (por exemplo, nos exemplos) compreendendo uma sequência de dAb da maneira descrita anteriormente, que compreende qualquer das modificações descritas aqui para diminuir a ligação em ADAs, tais moléculas podem ser, por exemplo, qualquer um dos dAbs de Vh-Vk dAb-Fc no exemplo 12, ou qualquer dos mAbdAbs descritos aqui, por exemplo, nos exemplos aqui.
[00035] Assim, a invenção fornece um dAb anti-IL13, por exemplo, um dAb com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas como: (a) DOM10h-53-567 (SEQ ID NO 13) ou (b) DT04-H-033 (SEQ ID NO 12); e cuja sequência de aminoácidos compreende adicionalmente qualquer das modificações descritas aqui, que diminuem a ligação em ADAs, por exemplo, uma única extensão da terminação C de alanina.
[00036] A invenção também fornece um anti-TNFR1dAb, por exemplo, um dAb com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como: DOM1h-574-208 (SEQ ID NO 10); e que compreende adicionalmente qualquer das modificações descritas aqui, que diminui a ligação em ADAs, por exemplo, uma única extensão da terminação C de alanina.
[00037] A invenção também fornece uma fusão anti-TNFR1dAb-VL, por exemplo, com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como: fusão de DOM1h-574-208-VL (SEQ ID NO 11); e que compreende adicionalmente qualquer das modificações descritas aqui, que diminuem a ligação em ADAs, por exemplo, uma extensão de alanina única (ou um tripla) presente na terminação C da molécula de fusão.
[00038] A invenção também fornece um mAbdAb que é um dAb anti- IL13mAb: IL-4 V capa, que compreende adicionalmente qualquer das modificações descritas aqui que diminuem a ligação em ADAs, por exemplo, o mAbdAb pode compreender uma sequência de cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como: molécula de cadeia pesada de mAb-VL ‘735 SEQ ID NO 30; e uma sequência de cadeia leve identificada como sequência de cadeia leve ‘735SEQ ID NO 31; e que compreende adicionalmente qualquer das modificações descritas aqui que diminui a ligação em ADAs, por exemplo, uma extensão de alanina única (ou um tripla).
[00039] A invenção também fornece um mAbdAb que é um dAb anti- IL13mAb: IL-4 V capa designado mAb-VL 15014 modificado para diminuir a ligação em ADAs conforme descrito aqui, em que o mAbdAb compreende (a) uma sequência cadeia pesada-ligante-V capa com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 32; e (b) uma sequência de cadeia leve, com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 33.
[00040] A invenção também fornece um mAbdAb que é um dAb anti- IL13mAb: IL-4 V capa designado mAb-VL 15019 modificado para diminuir a ligação em ADAs conforme descrito aqui, em que o mAbdAb compreende (a) uma sequência cadeia pesada-ligante-V capa, com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 34; e (b) uma sequência de cadeia leve com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 35.
[00041] A invenção também fornece um mAbdAb que é um dAb anti- IL13mAb: IL-4 V capa designado mAb-VL 15020 modificado para diminuir a ligação em ADAs conforme descrito aqui, em que o mAbdAb compreende (a) uma sequência cadeia pesada-ligante-V capa, com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 36; e (b) uma sequência de cadeia leve com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 37.
[00042] A invenção também fornece um mAbdAb que é um dAb anti- IL13mAb: IL-4 V capa designado mAb-VL 15021 modificado para diminuir a ligação em ADAs conforme descrito aqui, em que o mAbdAb compreende (a) uma sequência cadeia pesada-ligante-V capa, com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 38; e (b) uma sequência de cadeia leve com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica às sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 39.
[00043] A invenção também fornece uma sequência de VHH com qualquer um das modificações descritas aqui para diminuir a ligação em ADAs, por exemplo, uma VHH com uma sequência de aminoácidos que é 100%, 99,5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 7-9.
[00044] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos dAbs da invenção, por exemplo, qualquer um dos ácidos nucleicos descritos aqui, por exemplo, qualquer uma das sequências de ácido nucleico mostradas na figura 9 (SEQ ID NOs 21-23) ou figura 10 (SEQ ID NOs 24-29). Em uma modalidade, a invenção fornece um ácido nucleico (SEQ ID NO 22) que codifica o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C, um vetor compreendendo o ácido nucleico (SEQ ID NO 22) e ela também diz respeito uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira de E.coli, que expressa o ácido nucleico (SEQ ID NO 22), ou um vetor tal como o Pave011 (da Fujifilm Diosynth) que expressa SEQ ID NO 22. Também é fornecido um método de produzir o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C que compreende manter uma célula hospedeira, tal como E.col,i compreendendo um vetor tal como Pave011 (ou ácido nucleico) que codifica ácido nucleico (SEQ ID NO 22) em condições adequadas para expressão do dAb prolongado, produzindo, por meio disso, o polipeptídeo.
[00045] Os dAbs de invenção podem também estar presentes como fusões ou conjugados com outras moléculas.
[00046] Em outras modalidades da invenção descritas por toda esta descrição, em vez do uso de um “dAb” em uma fusão da invenção, contempla-se que versados na técnica podem usar um domínio que compreende os CDRs de um dAb que liga seu alvo e cuja estrutura compreende as modificações, conforme descrito aqui para diminuir a ligação em ADAs.
[00047] Também fornecidas são composições farmacêuticas compreendendo um dAb de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção, por exemplo, em combinação com um(s) carreador(s), excipiente(s) ou diluentes(s) farmacêutica ou fisiologicamente aceitável(s).
[00048] A invenção adicionalmente fornece os usos dos dAbs da invenção para terapia ou medicina, e usos para tratar ou impedir doenças ou distúrbios. Por exemplo, dAbs anti-TNFR1 com baixa ligação em ADA, por exemplo, o dAb de DOM1h-131-206 modificado conforme descrito aqui para diminuir a ligação em ADA (por exemplo, aquele com sequências de aminoácidos mostradas na figura 8a-8e: SEQ ID NOS 16-20).
[00049] Em um aspecto, a invenção fornece uso do dAb de DOM1h- 131-206 com uma extensão de alanina no terminal C (SEQ ID NO 16) para uso em terapia ou medicina ou como um medicamento, por exemplo, para tratar ou impedir uma doença ou distúrbio inflamatório ou uma doença ou distúrbio respiratório ou pulmonar, tais como lesão pulmonar aguda (ALI) e síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e complicações destes.
[00050] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam os dAbs da invenção com baixa ligação em ADA e vetores e células hospedeiras compreendendo esses ácidos nucleicos. Também fornecidos são métodos de produzir os dAbs da invenção compreendendo expressar os vetores e ácidos nucleicos codificantes em células hospedeiras, por exemplo, células hospedeiras microbianas tal como E.coli.
[00051] Em um aspecto adicional, a invenção fornece formulações compreendendo os dAbs da invenção com baixa ligação em ADA, por exemplo, formulações nebulizáveis para distribuição pulmonar. Também são fornecidos dispositivos nebulizadores ou inaladores compreendendo os dAbs da invenção, por exemplo, qualquer um dos dAbs anti-TNFR1, por exemplo, aqueles com sequências de aminoácidos mostradas na figura 8a-8e: SEQ ID NOS 16-20, por exemplo, o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de alanina no terminal C (SEQ ID NO 16).
[00052] Em um outro aspecto, a invenção fornece o dAb de DOM1h- 131-206 não modificado (SEQ ID NO1) ou o dAb de DOM1h-131-206 modificado de qualquer uma das maneiras descritas aqui para diminuir a ligação em ADA, por exemplo, o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 16), para tratar um distúrbio inflamatório de pele, por exemplo, psoríase.
[00053] Um outro aspecto da descrição é um método de tratar psoríase em um humano compreendendo as etapas de a) identificar um humano com psoríase; e b) administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo do domínio (por exemplo, o dAb de DOM1h-131-206 não modificado (SEQ ID NO1) ou o dAb de DOM1h-131-206 modificado de qualquer uma das maneiras descritas aqui para diminuir a ligação em ADA, por exemplo, o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 16) em uma placa psoriática no humano com psoríase; por meio do qual a psoríase é tratada.
[00054] Um outro aspecto da descrição é um anticorpo do domínio para uso no tratamento de psoríase, e também um regime de dosagem para uso de um anticorpo do domínio para uso no tratamento de psoríase. O anticorpo do domínio pode ser o dAb de DOM1h-131-206 não modificado (SEQ ID NO1) ou o dAb de DOM1h-131-206 modificado, de qualquer uma das maneiras descritas aqui para diminuir a ligação em ADA, por exemplo, o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 16).
[00055] Em um aspecto adicional, a invenção também fornece um ferramenta mAb (por exemplo, a ferramenta mAb descrito no exemplo 19 e com a sequência de aminoácidos dada na figura 6: SEQ ID NOs 14 e 15). A ferramenta mAb foi gerado usando tecnologia de anticorpo monoclonal de camundongo padrão, isto é, camundongos foram imunizados com DOM 1H- 131-206 (SEQ ID NO1), baços foram coletados e linhagens de celulares hibridoma foram geradas, os hibridomas que expressam anticorpo foram então clonados e o anticorpo resultante isolado e sequenciado usando técnicas padrões. A ferramenta mAb é um que liga no dAb da estrutura de VH e, por meio disso, diminui a ligação dos dAbs de VH em ADAs. Assim, a ferramenta mAb parece ligar em um epítopo similar na estrutura de VH no ADA anti-VH humano. Assim, a ferramenta mAb pode ser usado, por exemplo, para testar dAb modificado (VH, VHH) e para determinar quais modificações no dAb impedem ou diminuem a ligação do dAb na ferramenta mAb. Modificações nos dAbs de VH que impedem ligação na ferramenta mAb também impedirão ou diminuirão ligação dos dAbs de VH nos ADAs. Assim, a invenção fornece qualquer dAbs que são modificados (por exemplo, por qualquer das modificações descritas aqui) para impedir ou diminuir a ligação na ferramenta mAb. A invenção também fornece um método de usar um ferramenta mAb (por exemplo, a ferramenta mAb descrito no exemplo 19 e com a sequência de aminoácidos dada no exemplo 19 e também na figura 6: SEQ ID NOs 14 e 15) em um ensaio para testar dAbs, por exemplo, dAbs modificados (por exemplo, (VH, VHH), por exemplo, qualquer daqueles descritos aqui, por exemplo, dAbs de TNFR1 tais como aqueles descritos aqui) e para determinar aqueles com baixa ligação em ADAs, por exemplo. Em um aspecto, os dAbs (por exemplo, VH, VHH) são modificados para diminuir a ligação na ferramenta mAb conforme descrito aqui, e têm uma KD de ligação na ferramenta mAb que é 150% ou mais (por exemplo, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650% ou mais) da KD de uma sequência de dAb equivalente que não foi modificada. A invenção também fornece qualquer dAbs identificados por este ensaio de classificação.
[00056] Em um aspecto adicional, a invenção também propicia o uso da ferramenta mAb (por exemplo, a ferramenta mAb descrito no exemplo 19 e com a sequência de aminoácidos dada na figura 6: SEQ ID NOs 14 e 15) em um método de ensaio para quantificar quanto dAb (por exemplo, VH, VHH), está presente em um amostra de tecido ou amostra de plasma.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
[00057] Figura 1: mostra Frequência de anticorpos antimedicamento pré-existentes em soros de um painel de sujeitos humanos saudáveis.
[00058] Figura 2: mostra sequências de aminoácidos de dAbs anti- TNFR1 não modificados identificados como (a) DOM 1H-131-206 (SEQ ID NO 1) (não modificada) (b) DOM 1H-131-511 (SEQ ID NO 2) (não modificada) (c) DOM 1H-131-202 (não modificada) (SEQ ID NO 3; e sequências de VHH identificadas como (d) que tem um formato biespecífico, com um módulo de ligação de IL6R ligado por GGGGSGGGS para um módulo de ligação de albumina de soro humano descrito em WO2010100135 (SEQ ID NO 4), (e) tem um formato biespecífico, com módulo de ligação de TNF ligado em um módulo de ligação de albumina de soro, por sua vez, ligado em um módulo de ligação de TNF, usando GGGGSGGGS como ligante descrito em WO2010077422 (SEQ ID NO 5), (f) tem um formato monoespecífico bivalente compreendendo dois módulos idênticos ligados por um ligante Ala-Ala-Ala, cada módulo é um dAb que pode ligar no domínio A1 do fator de Von-Willebrand, mostrado em WO2009115614A2 (SEQ ID NO 6), (g) clone VHH2 (d) tem um formato biespecífico, com um módulo de ligação de IL6R ligado por GGGGSGGGS em um módulo de ligação de albumina de soro humano descrito em WO2010100135 com uma extensão de alanina (SEQ ID NO 7) (h) formato biespecífico, com módulo de ligação de TNF ligado em um módulo de ligação de albumina de soro, por sua vez, ligado em um módulo de ligação de TNF, usando GGGGSGGGS como ligante descrito em WO2010077422 com uma extensão de alanina (SEQ ID NO 8) (i) um formato monoespecífico bivalente compreendendo dois módulos idênticos ligados por um ligante Ala-Ala-Ala, cada módulo é um dAb que pode ligar no domínio A1 do fator de Von-Willebrand, mostrado em WO2009115614A2 com uma extensão de alanina (SEQ ID NO 9) (j) DOM 1H-574-208 (SEQ ID NO 10) (k) fusão de DOM 1H-574-208 - VL (SEQ ID NO 11) (l) DT04-H-033 (SEQ ID NO 12); (m) Dom10h-53-567 (SEQ ID NO 13).
[00059] Figura 3: mostra uma estrutura cristalina modelo de DOM1H- 131-206 com resíduos salientados que impactam na ligação em ADA quando mutados. Modelagem de resíduos superficiais foi realizada e os mutantes resultantes foram classificados no ensaio de ADA para ligação em ADAs pré- existentes (por exemplo, descrito no exemplo 2). Observou-se que resíduos indicados como 14 e o “termo C” têm um forte impacto na ligação em ADA quando mutados, observou-se que resíduos indicados como 112, 110, 108 e 41 têm um impacto moderado na ligação em ADA quando mutados e que resíduos indicados como 13, 11, 91, 43, 44, 83 e 84 têm um impacto fraco na ligação em ADA quando mutados.
[00060] Figura 4: mostra a anulação de ligação em ADAs causada pela adição de uma extensão de resíduo de aminoácido de alanina única em clones de VHH 2(d), 2(e) e 2(f).
[00061] Figura 5: mostra níveis de ligação em ADAs e dos dAbs de VH ou dAbs de VL ou moléculas compreendendo esses dAbs.
[00062] Figuras 6a e 6b: mostram a sequências de aminoácidos da ferramenta mAb (M2.3G10.1G06), a figura 6a mostra a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO 14); e a figura 6b mostra a sequência de cadeia pesada. Os CDRs são mostrados sublinhados na figura (SEQ ID NO 15).
[00063] Figura 7: mostra sinal de ensaio de competição (eixo x) na presença das amostras de soro dos sujeitos com uma faixa de sinal de ADA anti-VH pré-existente. Soro de uma faixa de doadores humanos com ada anti- VH pré-existente compete com mAb anti-VH M2.3G10.1G06 para ligar em DOM 1H-131-206 resultando em inibição do sinal de ensaio de competição.
[00064] Figura 8: mostra as sequências de aminoácidos de dAbs de TNFR1 modificados identificadas como: (a) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única (SEQ ID NO 16); (b) dAb de DOM1h- 131-206 com uma extensão de uma alanina única e uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 17); (c) dAb de DOM1h-131-206 com uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 18); (d) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG (SEQ ID NO 19); e (e) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG e uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 20).
[00065] Figura 9: mostra a sequência de ácidos nucleicos de dAbs de TNFR1 (a) dAb de DOM1h-131-206 (SEQ ID NO 21) (b) dAb de DOM1h- 131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 22) (c) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG (SEQ ID NO 23).
[00066] Figura 10: mostra a sequência de ácidos nucleicos que codificam (a) sequência de VHH com a sequência de aminoácidos mostrada na figura 2d (SEQ ID NO 24) (b) sequência de VHH com a sequência de aminoácidos mostrada na figura 2e (SEQ ID NO 25); (c) sequência de VHH com a sequência de aminoácidos mostrada na figura 2f (SEQ ID NO 26), (d) sequência de VHH que tem um formato biespecífico, com um módulo de ligação de IL6R ligado por GGGGSGGGS em um módulo de ligação de albumina de soro humano com uma extensão de uma alanina única (SEQ ID NO 27), (e) sequência de VHH com a sequência de aminoácidos mostrada em 2e adicionalmente compreendendo uma extensão de uma alanina única (SEQ ID NO 28), (f) sequência de VHH com a sequência de aminoácidos mostrada em 2f adicionalmente compreendendo uma extensão de uma alanina única (SEQ ID NO 29).
[00067] Figura 11: mostra sequências de aminoácidos de dAbs de mAb:VL (moléculas de dAb IL-13mAb: IL-4Vcapa): (a) molécula ‘735 de mAb-VL (dAb IL-13mAb: IL-4Vcapa) (SEQ ID NOs 30 e 31), (b) mAb-VL 150154 (SEQ ID NOs 32 e 33), (c) mAb-VL 15019 (SEQ ID NOs 34 e 35), (d)) mAb-VL 15020 (SEQ ID NOs 36 e 37), (e) mAb-VL 15021 (SEQ ID NOs 38 e 39).
[00068] Figura 12: mostra sequências de aminoácidos de (a) DMS30045: dAb de DOM15-26-597 N-( ligante VEPKSSDK) & dAb K-044- 085 do terminal C ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 40), (b) DMS30046: DMS1576 com dAb K-044-085 do terminal C ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 41), (c) DMS30047 (contém terminação C modificada): dAb de DOM15-26- 597 N-(ligante VEPKSSDK) & menos C dAb de K-044-085 do terminal C- termo R ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 42), (d) DMS30048 (contém terminação C modificada): dAb de DOM15-26-597 N-(ligante VEPKSSDK) & dAb de K-044-085 do terminal C +A ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 43), (e) DMS30049 (contém terminação C modificada): dAb de DOM15-26-597 N- (ligante VEPKSSDK) & dAb de K-044-085 do terminal C +AAA ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 44), (f) DMS30050 (contém terminação C modificada): dAb de DOM15-26-597 N-(ligante VEPKSSDK) & dAb de K- 044-085 do terminal C +T ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 45), (g) DMS30051 (contém terminação C modificada): DMS1576 com menos C dAb de K-044- 085 do terminal C-termo R ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 46), (h) DMS30052 (contém terminação C modificada): DMS1576 com dAb de K-044-085 do terminal C + A ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 47), (i) DMS30053 (contém terminação C modificada): DMS1576 com dAb de K-044-085 do terminal C +AAA ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 48), (j) DMS30054 (contém terminação C modificada): DMS1576 com dAb de K-044-085 do terminal C +T ((TGLDSP)x4) (SEQ ID NO 49).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00069] A invenção foi descrita nesta especificação, com referência às modalidades, de um modo que permite que uma especificação clara e concisa seja escrita. Pretende-se e deve-se perceber que modalidades podem ser variavelmente combinadas ou separadas sem fugir da invenção.
[00070] A menos que de outra forma definida, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente entendido pelos versados na técnica (por exemplo, em cultura celular, genética molecular, química de ácido nucleico, técnicas de hibridização de bioquímica). Técnicas padrões são usadas para métodos moleculares, e métodos químicos, genéticos e bioquímicos (vide no geral, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a Ed, John Wiley & Sons, Inc. que estão incorporados aqui pela referência).
[00071] Afinidade é a intensidade de ligação de uma molécula, por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno da invenção, para um outro, por exemplo, seu antígeno alvo, em um único sítio de ligação. A afinidade de ligação de uma proteína de ligação de antígeno em seu alvo pode ser determinada por métodos de equilíbrio padrões (por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)), ou cinética (por exemplo, análise BIACORETM).
[00072] O termo "epítopo" da maneira aqui usada refere-se àquela porção do antígeno que faz contato com um domínio de ligação particular da proteína de ligação de antígeno, por exemplo, dAb. Um epítopo pode ser linear ou conformacional/descontínuo. Um epítopo conformacional ou descontínuo compreende resíduos de aminoácido que são separados por outras sequências, isto é, não em uma sequência contínua na sequência primária do antígeno. Embora os resíduos possam ser de diferentes regiões da cadeia de peptídeo, eles estão em proximidade imediata na estrutura tridimensional do antígeno. No caso de antígenos multiméricos, um epítopo conformacional ou descontínuo pode incluir resíduos de diferentes cadeias de peptídeo. Resíduos particulares compreendidos em um epítopo podem ser determinados através de programas de modelagem de computador, ou por meio de estruturas tridimensionais obtidas através de métodos conhecidos na técnica, tal como cristalografia de raios X.
[00073] Um conjugado dAb refere-se a uma composição compreendendo um dAb no qual uma molécula adicional é quimicamente conjugada por meio de uma ligação covalente ou não covalente, preferivelmente uma ligação covalente. Tal ligação covalente poderia ser através de uma ligação de peptídeo ou outros meios, tal como por meio de uma cadeia lateral modificada. A ligação não covalente pode ser direta (por exemplo, interação eletrostática, interação hidrofóbica) ou indireta (por exemplo, através de ligação não covalente de parceiros de ligação complementar (por exemplo, biotina e avidina), em que um parceiro é ligado covalentemente no medicamento e o parceiro de ligação complementar é covalentemente ligado no dAbTM). Quando parceiros de ligação complementar são empregados, um dos parceiros de ligação pode ser covalentemente ligado no medicamento diretamente ou através de uma fração do ligante adequada, e o parceiro de ligação complementar pode ser covalentemente ligado no dAbTM diretamente ou através de uma fração do ligante adequada.
[00074] Da maneira aqui usada, uma fusão de dAb refere-se a uma proteína de fusão que compreende um dAb e um medicamento de polipeptídeo. O dAb e o medicamento de polipeptídeo estão presentes como partes discretas (frações) de uma única cadeia de polipeptídeo contínua.
[00075] Da maneira aqui usada "fragmento", quando usado com referência a um polipeptídeo, é um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é igual a parte, mas, nem toda a sequência de aminoácidos da totalidade de polipeptídeo de°Corrência natural. Fragmentos podem ser "independentes" ou compreendidos em um polipeptídeo grande do qual eles formam uma parte ou região como uma única região contínua em um único polipeptídeo grande.
[00076] Da maneira aqui usada, o termo mAbdAb refere-se a um anticorpo monoclonal ligado em um domínio de ligação adicional, em particular um único domínio variável tal como um anticorpo do domínio. Um mAbdAb tem pelo menos dois sítios de ligação de antígeno, pelo menos um dos quais é de um anticorpo do domínio, e pelo menos um é de um domínio VH/VL pareado. Tais mAbdAbs são descritos, por exemplo, em WO 2009/068649.
[00077] Da maneira aqui usada, “peptídeo” refere-se a cerca de dois a cerca de 50 aminoácidos que são unidos entre si por meio de ligações de peptídeos. Da maneira aqui usada, “polipeptídeo” ou “proteína” refere-se a pelo menos cerca de 50 aminoácidos que são unidos entre si por ligações de peptídeos. Polipeptídeos e proteínas no geral compreendem estrutura terciária e dobra nos domínios funcionais.
[00078] Da maneira aqui usada, os termos “região Fc de cadeia única de um anticorpo” referem-se a uma região Fc de cadeia pesada única de um IgG, tais como um IgG1, IgG2, IgG3, iGG4 ou IgG4PE, ou um anticorpo de IgA. Uma região Fc de cadeia pesada única pode compreender um ou mais dos domínios do anticorpo da região constante CH1, CH2 e CH3, por exemplo, todos os três domínios do anticorpo da região constante ou apenas os domínios CH2 e CH3. Além de compreender um ou mais dos domínios CH1, CH2 e CH3 do anticorpo da região constante, a região FC de cadeia pesada única de um anticorpo pode compreender adicionalmente uma região de dobradiça de um anticorpo (tal como uma região normalmente encontrada entre os domínios CH1 e CH2).
[00079] Da maneira aqui usada, “funcional” descreve um polipeptídeo ou peptídeo que tem atividade biológica, tal como atividade de ligação específica. Por exemplo, os termos “polipeptídeo funcional” incluem um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste que liga um antígeno alvo através de seu sítio de ligação de antígeno.
[00080] Da maneira aqui usada, “ligante alvo” refere-se a um ligante que é específica ou seletivamente ligado por um polipeptídeo ou peptídeo. Por exemplo, quando um polipeptídeo é um anticorpo, fragmento de ligação de antígeno deste, ou domínio variável único de imunoglobulina, o ligante alvo pode ser qualquer antígeno ou epítopo desejado. A ligação no antígeno alvo depende de o polipeptídeo ou peptídeo ser funcional.
[00081] Da maneira aqui usada, um anticorpo refere-se a IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE ou um fragmento (tal como um Fab, F(ab’)2, Fv, Fv, scFv ligados por dissulfetos, anticorpo multiespecífico de conformação fechada, scFv ligado por dissulfetos, diacorpo) quer derivados de qualquer espécie que produz naturalmente um anticorpo, ou criados por tecnologia de DNA recombinante; quer isolados do soro, células B, hibridomas, transfectomas, levedura ou bactérias.
[00082] A frase “domínio variável único de imunoglobulina” refere-se a um domínio variável de anticorpo (VH, VHH, VL) que liga especificamente um antígeno ou epítopo independentemente de outras regiões ou domínios V. Um domínio variável único de imunoglobulina pode estar presente em um formato (por exemplo, homo ou heteromultímero) com outras regiões variáveis ou domínios variáveis onde as outras regiões ou domínios não são exigidos para ligação de antígeno pelo domínio variável de imunoglobulina único (isto é, onde o domínio variável único de imunoglobulina liga antígeno independentemente dos domínios variáveis adicionais). Um “anticorpo do domínio” ou “dAb” é igual a um “domínio variável único de imunoglobulina” como termo usado aqui. Um “domínio variável de imunoglobulina único” é igual a um “domínio variável único de imunoglobulina” como o termo é usado aqui. Um “domínio variável de anticorpo único” é igual a um “domínio variável único de imunoglobulina” como o termo é usado aqui. Um domínio variável único de imunoglobulina é em uma modalidade um domínio variável de anticorpo humano, mas também inclui domínios variáveis únicos de anticorpo de outra espécie, tal como roedor (por exemplo, conforme descrito em WO 00/29004, cujos conteúdos estão incorporados aqui pela referência na sua íntegra), dAbs de tubarão-enfermeiro e VHH de camelídio. VHH de camelídio são polipeptídeos do domínio variável único de imunoglobulina que são derivados de espécie incluindo camelo, lhama, alpaca, dromedário, e guanaco, que produzem anticorpos de cadeia pesada naturalmente isentos de cadeias leves. O VHHpode ser humanizado. Também no escopo da presente invenção estão dAbs humano que foram modificados de maneira a não ser totalmente humanos, por exemplo, modificações que são feitas para reduzir agregação, incluindo mutação dos mesmos resíduos que são motivos de Camelídio.
[00083] Um domínio variável único de imunoglobulina não modificado (isto é, dAb não modificado), por exemplo, um dAb que liga um alvo, compreende três regiões determinantes de complementariedade (CDRs) em uma estrutura. Enquanto na genética de cadeias de imunoglobulina de°Corrência natural a região V termina no início de CDR3, com o restante de CDR3 sendo provido pelas regiões D e J (resultando em uma fusão de V-D-J), com o propósito da presente invenção, um dAb inclui todo o CDR3 e termina no resíduo 4 da estrutura na sua terminação C. Um dAb de VH termina nos resíduos LVTVSS na sua terminação C. Um dAb de VHH termina nos resíduos VTVSS na sua terminação C. Um dab de VL termina em VEIKR na sua terminação C.
[00084] Um “dAb modificado” é um dAb conforme descrito aqui, que adicionalmente tem uma modificação que altera a conformação tridimensional da terminação C do dAb. Um dAb modificado inclui um dAb que compreende adições, extensões ou marcações no terminal C e/ou certas substituições de aminoácidos da maneira descrita aqui.
[00085] A presente invenção também fornece um domínio variável de imunoglobulina único (ou uma moléculas compreendendo um dAb, por exemplo, um mAbdAb) da maneira descrita anteriormente que tem uma menor afinidade de ligação e/ou avidez (por exemplo, que tem uma KD de ligação em ADA que é 150% ou mais (por exemplo, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650% ou mais da KD de uma sequência equivalente) para um anticorpo antimedicamento que um dAb equivalente (ou molécula compreendendo o dAb) cujo dAb equivalente tem a mesma sequência, exceto que X está ausente, n,p e q são 1 e não existem mutações na estrutura. Isto significa que um dAb, por exemplo, DOM 1H- 131-206 (SEQ ID NO 1) quando então modificado de maneira tal que é prolongado para conter X, por exemplo, uma única extensão de alanina terminal C, ou é modificado para remover a serina do terminal C, ou é modificado por uma substituição na estrutura de um ou mais dos resíduos 14, 41, 108, 110 e/ou 112 (ou qualquer combinação de tais modificações) liga em um anticorpo de antimedicamento (ADA) com uma menor afinidade de ligação e/ou avidez do que DOM 1H-131-206 (SEQ ID NO 1) sem nenhuma modificação como essas. Isto pode ser determinado usando ressonância de Plasmon de superfície, por exemplo, em um Biacore TM usando técnicas padrões. Versados na técnica perceberão que quanto menor o valor de KD tanto mais forte a ligação.
[00086] Também é fornecido pela invenção um dAb modificado aqui descrito que tem baixa ligação em ADA e que tem baixa ligação em ADAs determinado usando um ensaio de confirmação descrito no exemplo 2, e onde o dito dAb modificado tem um% de inibição média de sinal que é menor que 90%, por exemplo, menor que 80%, por exemplo, menor que 70%, por exemplo, menor que 60%, por exemplo, menor que 50%, por exemplo, menor que 40%, por exemplo, menor que 30%, por exemplo, menor que 20%, por exemplo, menor que 10%, em comparação com um dAb de controle que tem em torno de 98%-100% de inibição de sinal, o dito dAb de controle (não modificado) tem a mesma sequência ou sequência similar, mas, não é modificado para diminuir a ligação em ADA.
[00087] Um ADA pré-existente é um ADA já presente no indivíduo no qual o medicamento deve ser administrado. Um ADA pré-existente pode estar presente em um indivíduo naive (isto é, um indivíduo no qual o medicamento nunca foi administrado antes).
[00088] Um “domínio” é uma estrutura de proteína dobrada que tem estrutura terciária independente do resto da proteína. No geral, domínios são responsáveis por propriedades funcionais discretas de proteínas, e em muitos casos podem ser adicionados, removidos ou transferidos para outras proteínas sem perda de função do restante da proteína e/ou do domínio. Um “domínio variável de anticorpo único” é um domínio de polipeptídeo dobrado compreendendo sequências característica de domínios variáveis de anticorpo. Ele, portanto, inclui domínios variáveis de anticorpo e completos domínios variáveis modificados, por exemplo, nos quais um ou mais laços foram substituídos por sequências que não são características de domínios variáveis de anticorpo, ou domínios variáveis de anticorpo que foram truncados ou compreendem extensões no terminal N ou C, bem como fragmentos de domínios variáveis dobrados que retêm pelo menos a atividade e especificidade de ligação do domínio de comprimento total.
[00089] Da maneira aqui usada, o termo “dose” refere-se à quantidade de fusão ou conjugado administrada em um indivíduo a um dado momento (dose unitária), ou em duas ou mais administrações com um intervalo de tempo definido. Por exemplo, dose pode referir-se à quantidade de fusão ou conjugado administrada em um indivíduo no curso de um dia (24 horas) (dose diária), dois dias, uma semana, duas semanas, três semanas ou um ou mais meses (por exemplo, por uma administração única, ou por duas ou mais administrações). O intervalo entre doses pode ser qualquer quantidade de tempo desejada. “Monovalente” significa ligação em um epítopo.
[00090] Os termos “meia-vida” referem-se ao tempo gasto para a concentração de soro ou plasma da fusão ou conjugado reduzir em 50%, in vivo, por exemplo, devido a degradação e/ou depuração ou sequestro por mecanismos naturais. As composições da invenção são estabilizadas in vivo e sua meia-vida aumentada por ligação em moléculas de albumina de soro, por exemplo, albumina de soro humano (HSA) que resistem a degradação e/ou depuração ou sequestro. Essas moléculas de albumina de soro são proteínas de°Corrência natural que por si mesmas têm uma meia-vida longa in vivo. A meia-vida de uma molécula é aumentada se sua atividade funcional persistir, in vivo, por um maior período que uma molécula similar que não é específica para a molécula aumentar a meia-vida.
[00091] Da maneira aqui usada, “tamanho hidrodinâmico” refere-se ao tamanho aparente de uma molécula (por exemplo, uma molécula da proteína, ligante) com base na difusão da molécula através de uma solução aquosa. A difusão ou movimento de uma proteína através da solução pode ser processada para derivar um tamanho aparente da proteína, onde o tamanho é dado pelo “raio de Stokes” ou “raio hidrodinâmico” da partícula da proteína. O “tamanho hidrodinâmico” de uma proteína depende tanto da massa quanto da forma (conformação), de maneira tal que duas proteínas com a mesma massa molecular podem ter diferentes tamanhos hidrodinâmicos com base na conformação geral da proteína.
[00092] Cálculos de “homologia” ou “identidade” ou “similaridade” entre duas sequências (os termos são usados indiferentemente aqui) são realizados da maneira a seguir. As sequências são alinhadas com propósitos de comparação ideal (por exemplo, intervalos podem ser introduzidas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácido ou ácido nucleico para alinhamento ideal e sequências não homólogas podem ser desconsideradas com propósitos de comparação). Em uma modalidade, o comprimento de uma sequência de referência alinhada com propósitos de comparação é pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 100% do comprimento da sequência de referência. Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos nas posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nesta posição (da maneira aqui usada, “homologia” de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente a “identidade de aminoácido ou ácido nucleico”). A porcentagem de identidade entre as duas sequências é função do número de posições idênticas compartilhado pelas sequências, levando em conta o número de intervalos, e o comprimento de cada intervalo, que precisa ser introduzido para alinhamento ideal das duas sequências. Alinhamentos e homologia, similaridade ou identidade da sequência de aminoácido e nucleotídeo, definidos aqui podem ser preparados e determinados usando o algoritmo sequências BLAST 2, usando parâmetros padrões (Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999).
[00093] A invenção fornece ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes que codificam as composições da invenção que são descritas aqui.
[00094] Ácidos nucleicos referidos aqui como “isolados” são ácidos nucleicos que foram separados de outro material (por exemplo, outros ácidos nucleicos tais como DNA, DNAc e/ou RNA genômicos) em seu ambiente original (por exemplo, em células ou em uma mistura de ácidos nucleicos tal como uma biblioteca). Um ácido nucleico isolado pode ser isolado como parte de um vetor (por exemplo, um plasmídeo).
[00095] Ácidos nucleicos referidos aqui como “recombinante” são ácidos nucleicos que foram produzidos por metodologia de DNA recombinante, incluindo métodos que baseiam na recombinação artificial, tal como clonagem em um vetor ou cromossomo usando, por exemplo, enzimas de restrição, recombinação homóloga, vírus e similares, e ácidos nucleicos preparados usando a reação em cadeia da polimerase (PCR).
[00096] A invenção também fornece uma célula hospedeira recombinante, por exemplo, mamífero ou microbiano, que compreende um (um ou mais) ácido nucleico ou construto de expressão recombinante compreendendo ácido(s) nucleico(s) que codifica(m) uma composição da invenção conforme descrito aqui, por exemplo, um dAb modificado para diminuir a ligação em ADAs. Foi também provido um método de preparar uma composição da invenção conforme descrito aqui, compreendendo manter uma célula hospedeira recombinante, por exemplo, mamífero ou microbiano da invenção em condições apropriadas para expressão do polipeptídeo de fusão. O método pode adicionalmente compreender a etapa de isolar ou recuperar a fusão, se desejado.
[00097] Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico (isto é, uma ou mais moléculas de ácido nucleico) que codifica uma molécula da invenção pode ser introduzida em uma célula hospedeira adequada para criar uma célula hospedeira recombinante usando qualquer método apropriado para a célula hospedeira selecionada (por exemplo, transformação, transfecção, eletroporação, infecção), de maneira tal que a(s) molécula(s) de ácido nucleico são operacionalmente ligada(s) em um ou mais elementos de controle de expressão (por exemplo, em um vetor, em um construto criados por processos na célula, integrados no genoma da célula hospedeira). A célula hospedeira recombinante resultante pode ser mantida em condições adequadas para expressão (por exemplo, na presença de um indutor, em um animal adequado, em meio de cultura adequado suplementado com sais apropriados, fatores de crescimento, antibióticos, suplementos nutricionais, etc.), por meio do que o peptídeo ou polipeptídeo codificado é produzido. Se desejado, o peptídeo ou polipeptídeo codificado pode ser isolado ou recuperado (por exemplo, do animal, da célula hospedeira, meio, leite). Este processo engloba expressão em uma célula hospedeira de um animal transgênico (vide, por exemplo, WO 92/03918, GenPharm International).
[00098] As moléculas da invenção descritas aqui, podem também ser produzidas em um sistema de expressão in vitro adequado, por exemplo, por síntese química ou por qualquer outro método adequado.
[00099] Conforme descrito e exemplificado aqui, moléculas da invenção, no geral ligam em seus ligantes alvos com alta afinidade.
[000100] As moléculas da invenção, por exemplo, dAbs modificados com baixa ligação em ADAs, podem ser expressas em espécie E. coli ou em Pichia (por exemplo, P. pastoris). Em uma modalidade, o dAb é secretado em espécie E. coli ou em Pichia (por exemplo, P. pastoris); ou em cultura celular de mamífero (por exemplo, células CHO, ou HEK 293). Embora as moléculas descritas aqui possam ser secretáveis quando expressas em espécie E. coli ou em Pichia ou células de mamífero elas podem ser produzidas usando qualquer método adequado, tais como métodos químicos sintéticos ou métodos de produção biológica que não empregam espécie E. coli ou Pichia. Em uma modalidade, ácido nucleico que codifica os dAbs da invenção, por exemplo, os dAbs de TNFR1 descritos aqui, podem ser clonados em um vetor de expressão adequado, por exemplo, Pave011 (de Fujifilm Diosynth) e então expressos em um vetor microbiano tal como E.coli.
[000101] Em uma modalidade da invenção, o dAb, por exemplo, o VH, VL ou VHH, pode ser modificado para impedir ligação em ADAs de maneira tal que a modificação compreenda uma marcação presente na terminação C. Esta marcação pode estar presente como uma fusão ou conjugada com a molécula. A marcação pode ser qualquer marcação conhecida na técnica, por exemplo, marcação de afinidade tal como marcação myc, marcação FLAG, marcação his, modificação química tal como PEG, ou domínios de proteína tal como o domínio de Fc de anticorpo. Em particular, a presente invenção fornece uma molécula da invenção prolongada com uma marcação, uma modificação química ou um domínio de proteína para uso em um método de reduzir efeitos colaterais, adicionalmente definidos aqui.
[000102] Em uma outra modalidade, a invenção também fornece uma molécula, por exemplo, dAb (tal como uma VH ou VL ou uma VHH) que compreende uma estrutura modificada que diminui a ligação em ADA pré- existente, por exemplo, um dAb (tal como uma VHH, VH ou VL) que compreende uma substituição de aminoácidos em qualquer uma das posições 14, 41, 108, 110, ou 112. Por exemplo, essas substituições podem ser uma ou mais modificações selecionadas de: P14A, P14K, P14Q, P14T, P41A, L108A, L108 Q, T110A e S112A.
[000103] Em um aspecto desta modalidade, o dAb (por exemplo, o VHH, VH ou VL) compreende uma ou mais modificações selecionadas de: P14A, P14K, P14Q, P14T, P41A, L108A, T110A e S112A; e pode adicionalmente compreender qualquer das extensões, adições, deleção ou marcações do terminal C descritas anteriormente. Em uma modalidade, o dAb (por exemplo, o VHH, VH ou VL) que compreende uma ou mais modificações selecionadas de: P14A, P14K, P14Q, P14T P41A, L108A, T110A e S112A também compreende uma extensão de aminoácido na terminação C do dAb que é selecionada de: (a) alanina, ou (b) uma sequência de aminoácidos que compreende ou que consiste em uma extensão selecionada de: AS, AST, ASTK, ASTKG, ou ASTKGP. Adicionalmente, as moléculas de dAb descritas aqui e composições farmacêuticas compreendendo essas moléculas podem ser usadas na prevenção ou redução de efeitos colaterais. A ligação de anticorpos antimedicamento por um dAb pode fazer com que dois dAbs sejam agrupados. Em algumas circunstâncias, isto pode levar a preocupações com problema de segurança. Por exemplo, se o alvo de um dAb for um receptor ou um alvo polimérico, a ligação de dois dAbs pode agrupar dois alvos entre si. Isto pode levar a impactos farmacológicos inesperados, por exemplo, agonismo sem ser antagonismo, por exemplo, por meio de dimerização do receptor. Assim, a presente invenção propicia o uso das moléculas da invenção em um método de impedir efeitos colaterais. Prevenção significa o uso das moléculas da invenção anula uma ligação de nível completo ou parcial de anticorpos antimedicamento pré- existentes comparado com a molécula equivalente que não foi modificada. A redução em ligação em ADAs leva a uma redução no nível de efeitos farmacológicos indesejáveis. Assim, as moléculas da invenção podem ter um melhor perfil de segurança e menos efeitos colaterais que as moléculas não modificadas, por exemplo, dAb não modificada, que não compreende uma extensão, adição, deleção ou marcação do terminal C e/ou outra modificação da estrutura, para diminuir a ligação em ADA pré-existente. Similarmente, administração das moléculas modificadas aqui descritas, ou de composições farmacêuticas compreendendo essas moléculas modificadas (que têm baixa capacidade de ligar em ADA pré-existente), pode levar a imunogenicidade modificada, isto é em virtude de que quando as moléculas não modificadas ligam em ADAs elas formam complexos imunes e atais complexos imunes gerariam então um resposta imune. Além do mais, administração das moléculas modificadas descrita aqui, ou de composições farmacêuticas compreendendo essas moléculas modificadas, pode também resultar em maior eficácia e um melhor perfil de segurança e, por exemplo, pode ser vantajosamente usado para repetir dosagem em pacientes que poderiam desenvolver autoanticorpos para as moléculas não modificadas. Além do mais, as moléculas de dAb da invenção podem ser administradas a uma população de paciente sem a necessidade de preclassificação para tituladores de ADA para remover sujeitos em risco de uma reação adversa. No contexto do uso das moléculas para a prevenção de efeitos colaterais, a presente invenção diz respeito também ao uso de um domínio variável de imunoglobulina único definido aqui, no qual X é substituído por Y, em que Y é selecionado do grupo que consiste em: uma marcação tal como uma marcação de afinidade, um marcação myc, um marcação FLAG ou um marcação his, uma modificação química tal como um grupo PEG, ou uma proteína, tal como a porção Fc de um anticorpo.
[000104] A presente invenção também fornece um método de impedir ou reduzir efeitos colaterais em regime de tratamento por administração das moléculas da invenção, ou moléculas da invenção nas quais X foi substituído por Y conforme definido anteriormente. É também fornecido um método de modificar uma molécula aqui descrita para reduzir sua ligação em ADAs e reduzir efeitos colaterais.
[000105] A invenção também fornece composições que compreendem as moléculas modificadas descritas aqui, por exemplo, composições compreendendo VHH, VH ou VL modificados. Tais composições podem compreender as moléculas modificadas presentes como uma fusão ou conjugadas com outras moléculas, por exemplo, outras proteínas, moléculas do anticorpo ou fragmentos de anticorpo. Por exemplo, um dAb pode estar presente como um dAb formatado (por exemplo, o dAb pode estar presente como uma fusão de dAb-fc ou conjugado descrito, por exemplo, em WO 2008/149148) ou ele pode estar presente como um mAbdAb (descrito em WO 2009/068649) ou o dAb estar presente como uma fusão ou conjugado com proteínas ou polipeptídeos de meia-vida prolongada, por exemplo, um dAb adicional, por exemplo, um dAb que liga em albumina de soro (AlbudAb™) ou, por exemplo, com polietilenogligol PEG ou moléculas terapêuticas ou ativas adicionais. Nesta modalidade a(s) molécula(s) terapêutica(s) quando presente(s) como uma fusão ou conjugadas com um dAb (por exemplo, uma VHH, VH ou VL) pode ser ligada tanto na extensão no terminal C do dAb quanto na terminação N do dAb. Em uma modalidade, uma ou mais moléculas terapêuticas estão presentes como uma fusão (ou conjugadas) na terminação N do dAb.
[000106] Em uma modalidade, os dAbs da invenção (e também moléculas compreendendo os dAbs tais como mAbdAbs que são também parte da invenção) que têm baixa capacidade de ligar ADAs ligam em um ligante alvo com alta afinidade, por exemplo, eles podem ter uma KD medida por ressonância de plasmon superficial usando BiacoreTM na região de 5 micromolar a cerca de 1 pM, por exemplo, cerca de 500 nM a cerca de 10 pM, por exemplo, cerca de 200 nM a cerca de 10 pM, por exemplo, 50 nM a cerca de 10 pM, por exemplo, cerca de 10 nm a cerca de 10 pM. Em uma modalidade, a molécula pode ter uma KD de cerca de 10 nM a cerca de 10-30 pM, por exemplo, ela pode ser um dAb de TNFR1 com baixa ligação em ADAs e que tem uma KD de cerca de 10-30 pM, por exemplo, cerca de 20 pM.
[000107] Em uma modalidade, os dAbs da invenção (e também moléculas compreendendo os dAbs tais como mAbdAbs que são também parte da invenção) que têm baixa capacidade de ligar ADAs podem ter níveis de expressão que são pelo menos 3%, por exemplo, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% daqueles mostrados por um dAb da mesma sequência ou sequência similar de aminoácidos que não é modificado, conforme descrito aqui para diminuir a ligação em ADAs. Em uma modalidade adicional, as moléculas da invenção (por exemplo, dAbs e moléculas compreendendo os dAbs tais como mAbdAbs) que têm baixa capacidade de ligar ADAs podem ter níveis de expressão de pelo menos 0,1 g/litro.
[000108] Em uma modalidade, os dAbs da invenção (e também moléculas compreendendo os dAbs tais como mAbdAbs que são também parte da invenção) que têm baixa capacidade de ligar ADAs têm uma KD de ligação em seu antígeno alvo que é cerca de 50 vezes maior (ou mais) (isto é, os dAbs são 50 vezes menos potentes), por exemplo, a cerca de 40 vezes maior, cerca de 30 vezes maior, cerca de 20 vezes maior, cerca de 10 vezes maior, cerca de 5 vezes maior, cerca de 4 vezes maior que a KD de um dAb da mesma sequência ou sequência similar de aminoácidos que não é modificado, conforme descrito aqui para diminuir a ligação em ADAs. Em uma modalidade, os dAbs da invenção (e também moléculas compreendendo os dAbs tais como mAbdAbs que são também parte da invenção) que têm baixa capacidade de ligar ADAs têm uma KD para seu antígeno alvo que é essencialmente a mesma (por exemplo, em torno de 2 vezes maior a 2 vezes menor) ou mais que 2 vezes menor que a KD de um dAb da mesma sequência ou sequência similar de aminoácidos que não é modificado conforme descrito aqui, para diminuir a ligação em ADAs.
[000109] A invenção adicionalmente fornece usos, formulações, composições compreendendo tais moléculas terminalmente C prolongadas e/ou modificadas e também a métodos de produção e expressão dessas moléculas.
[000110] Em uma modalidade, a invenção fornece um dAb (VH, VL ou VHH) que tem qualquer das modificações no terminal C, da maneira descrita anteriormente, e que liga em um alvo selecionado de: TNFα, TNFR1, VEGF, IL-1R, IL-6R, IL-4, IL-5, IL-13, DC-SIGN, ASGPR, albumina, e TGFβR2.
[000111] Em uma modalidade, a invenção fornece um dAb que é descrito ou descrito em qualquer um de: WO 2007/049017 (por exemplo, o dAb anti-TNFR1 designado 2H-131-511 ou um dAb que é pelo menos 80% idêntico a isto (por exemplo, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% idêntico), WO 2008/149144 (por exemplo, um dAb anti-TNFR1 selecionado de: 1h-131-201, 1h-131-202, 1h-131-203, 1h-131-204, 1h-131-205 ou um dAb que é pelo menos 80% idêntico a isto (por exemplo, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% idêntica) e WO 2008/149148 (cujos conteúdos estão explicitamente incorporados aqui pela referência), por exemplo, qualquer um dos dAbs anti-TNFR1 dele; e cujo dAb compreende adicionalmente pelo menos uma das modificações descritas aqui para reduzir afinidade de ligação e/ou avidez em ADAs, por exemplo, qualquer uma das modificações no terminal C da maneira descrita anteriormente e/ou qualquer uma das substituições e/ou deleções de aminoácidos descritas anteriormente.
[000112] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um dAb não modificado que é descrito ou descrito em qualquer um de WO 2007/049017, WO 2008/149144, e WO 2008/149148 (por exemplo, qualquer uma das sequências de dAb descritas anteriormente), e cujo dAb é então modificado para compreender uma ou mais modificações da estrutura, por exemplo, selecionadas de: P14A, P14K, P14Q, P14T P41A, L108A, T110A e S112A mutações da estrutura e que pode também ainda opcionalmente compreender qualquer das modificações no terminal C descritas aqui. Em um exemplo, o dAb não modificado pode ser qualquer uma das sequências de dAb anti- TNFR1 descritas ou descritas em qualquer um de WO 2007/049017, WO 2008/149144, e WO 2008/149148. Em uma modalidade, a sequência de dAb anti-TNFR1 não modificada pode ser uma que é pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) idêntica à sequência de dAb identificada tanto como DOM1h-131-206 (descrito em WO 2008/149148), DOM1h-131-511 (descrito em WO 2007/049017 e 2008/149144) quanto DOM1h-131-202 (descrito em WO 2008/149144).
[000113] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um dAb de VEGF que é descrito ou descrito em WO 2008/149147, por exemplo, o dAb designado 15-26-593 (sequência de aminoácidos mostrada na figura 5 de WO 2008/149147), (cujos conteúdos estão explicitamente incorporados aqui pela referência), e cujo dAb compreende adicionalmente qualquer uma das modificações descritas aqui para reduzir afinidade de ligação e/ou avidez em ADAs, por exemplo, qualquer uma das modificações no terminal C da maneira descrita anteriormente e/ou qualquer uma das substituições e/ou deleções de aminoácidos descritas anteriormente.
[000114] Sequências de aminoácidos do dAb não modificadas são da maneira a seguir: (a) DOM 1H-131-206 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWV RQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 1) (b) DOM 1H-131-511 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWV RQAPGKGLEWVSHIPPVGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 2) (c) DOM 1H-131-202 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWV RQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 3) (d) Clone de VHH 2(d): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWY RQAPGKGRELVAGIISGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSL RPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEV QLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVS SISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCT IGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO 4) (e) Clone de VHH 2(e): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWV RQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMN SLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVES GGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGS GSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSL SRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISR DNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 5) (f) Clone de VHH 2(f) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWF RQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMN SLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSAA AEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGR ELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTA VYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO 6)
[000115] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um dAb de VHH modificado selecionado das sequências seguintes: (g) Clone de VHH 2(d)+A: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWY RQAPGKGRELVAGIISGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSL RPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEV QLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVS SISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCT IGGSLSRSSQGTLVTVSSA (SEQ ID NO 7) (h) Clone de VHH 2(e)+A: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWV RQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMN SLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVES GGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGS GSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSL SRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISR DNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO 8) (i) Clone de VHH 2(f)+A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWF RQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMN SLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSAA AEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGR ELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTA VYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSA (SEQ ID NO 9).
[000116] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um dAb de DOM1h-131-206 modificado que liga em TNFR1 e que é selecionado das sequências de aminoácidos seguintes: (j) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWV RQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO 16) (k) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única e uma mutação da estrutura P14A: EVQLLESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWV RQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO 17) (l) dAb de DOM1h-131-206 com uma mutação da estrutura P14A: EVQLLESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWV RQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 18) (m) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWV RQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSSASTKG (SEQ ID NO 19) (n) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG e uma mutação da estrutura P14A EVQLLESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWV RQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSSASTKG (SEQ ID NO 20)
[000117] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam as moléculas descritas aqui, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam os dAbs anti-TNFR1 descritos anteriormente. Também são fornecidas células hospedeiras, por exemplo, células hospedeiras não embriônicas, por exemplo, células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, tal como E. coli, ou células hospedeiras de levedura ou células de mamífero que compreendem esses ácidos nucleicos.
[000118] A invenção adicionalmente fornece um dAb que tem baixa ligação em ADA em soros humano (por exemplo, não liga em ADA pré- existente em soros humano) e em que o epítopo no dAb no qual o ADA liga é mascarado (isto é, o epítopo não está mais disponível para ligar em ADA, por exemplo, ele foi coberto ou mascarado por uma outra molécula, impedindo assim a ligação, ou sua conformação estérica foi mudada, impedindo assim a ligação). O epítopo no dAb pode ser mascarado por qualquer das modificações descritas aqui para diminuir a ligação em ADA, por exemplo, adicionando uma entidade química na terminação C do dAb ou por substituições, ou deleções da estrutura conforme descrito aqui. A entidade química adicionada na terminação C do dAb pode ser uma extensão (por exemplo, uma extensão de aminoácido) ou uma marcação, ou ela pode ser uma modificação química tal como peguilação ou amidação. A modificação na terminação C pode ser uma que muda tanto direta quanto indiretamente a conformação do epítopo no dAb que liga nos ADAs, por meio disso reduzindo a capacidade do dAb de ligar em ADAs.
[000119] Versados na técnica perceberão que, mediante produção de uma molécula descrita aqui, por exemplo, um dAb, em particular dependendo da linhagem celular usada e da sequência de aminoácidos particular da molécula, por exemplo, dAb, modificações pós-translacionais podem ocorrer. Por exemplo, isto pode incluir a clivagem de certas sequências líderes, a adição de várias frações de açúcar em vários padrões de glicosilação e fosforilação, desamidação, oxidação, embaralhamento de ligação de dissulfeto, isomerização, aparamento de lisina do terminal C, e ciclização de glutamina do terminal N. A presente invenção engloba o uso de tais moléculas, por exemplo, dAbs, que foram submetidas a uma ou mais modificações pós-translacionais, ou passaram por elas. Assim, um dAb da invenção inclui um dAb que passou por uma modificação pós-translacional tal como descrito a seguir: glicosilação de anticorpos em posições conservadas em suas regiões constantes é conhecida por ter um profundo efeito na função de anticorpo, particularmente funcionamento efetor, vide, por exemplo, Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318. Variantes de glicosilação das proteínas de ligação de antígeno da invenção, em que uma ou mais fração de carboidrato é adicionada, substituída, deletada ou modificada, são contemplados. Introdução de um motivo de asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina cria um sítio potencial para anexação enzimática de frações de carboidrato e pode, portanto, ser usado para manipular a glicosilação de um anticorpo. Em Raju et al. (2001) Biochemistry 40: 88688876 a sialilação terminal de uma imunoadesina de TNFR-IgG foi aumentada através de um processo de regalactosilação e/ou resialilação usando beta-1, 4- galactosiltransferase e/ou alfa, 2,3 sialiltransferase. Acredita-se que aumentando a sialilação terminal aumente a meia-vida da imunoglobulina. Anticorpos, em comum com a maioria das glicoproteínas, são tipicamente produzidos como uma mistura de glicoformas. Esta mistura fica particularmente aparente quando anticorpos são produzidos em células eucarióticas, particularmente de mamífero. Uma variedade de métodos foram desenvolvidos para fabricar glicoformas definidas, vide Zhang et al. (2004) Science 303: 371: Sears et al. (2001) Science 291: 2344; Wacker et al. (2002) Science 298: 1790; Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727. Os anticorpos (por exemplo, do isotipo de IgG, por exemplo, IgG1) aqui descritos podem compreender um número definido (por exemplo, 7 ou menos, por exemplo, 5 ou menos, tal como dois ou um único) de glicoforma(s); desamidação é uma reação enzimática primeiramente convertendo asparagina (N) em ácido isoaspártico e ácido aspártico (D) a razão de aproximadamente 3:1. A um grau muito menor, desamidação pode ocorrer com resíduos de glutamina de uma maneira similar. Desamidação em um CDR resulta em uma mudança na carga da molécula, mas, tipicamente não resulta em uma mudança na ligação de antígeno, nem ela impacta em PK/PD; oxidação pode ocorrer durante produção e armazenamento (isto é, na presença de condições oxidantes) e resulta em uma modificação covalente de uma proteína, induzida tanto diretamente por espécie de oxigênio reativo quanto indiretamente por reação com subprodutos secundários de tensão oxidante. Oxidação acontece primeiramente com resíduos de metionina, mas, ocasionalmente pode ocorrer em triptofano e resíduos sem cisteína; embaralhamento de ligação de dissulfeto pode ocorrer durante a produção e condições básicas de armazenamento. Em certas circunstâncias, ligação de dissulfetos pode quebrar ou formar incorretamente, resultando em resíduos de cisteína não pareados (- SH). Esses sulfidrilas livres (não pareados) (-SH) podem promover embaralhamento; isomerização tipicamenteorre durante produção, purificação, e armazenamento (a pH ácido) e normalmente ocorre quando ácido aspártico é convertido em ácido isoaspártico através de um processo químico; glutamina do terminal N na cadeia pesada e/ou cadeia leve é provável de formar piroglutamato (pGlu). A maioria da formação de pGlu acontece no biorreator de produção, mas it ele ser formado não enzimaticamente, dependendo do pH e temperatura de processamento e condições de armazenamento. Formação de pGlu é considerada um dos principais caminhos de degradação para mAbs recombinantes; aparamento de lisina do terminal C é uma reação enzimática catalisada por carboxipeptidases, e é comumente observada em mAbs recombinantes. Variantes deste processo incluem remoção de lisina de uma ou ambas cadeias pesadas. Aparamento de lisina não parece impactar a bioatividade e não tem nenhum efeito na função efetora de mAb.
[000120] A invenção adicionalmente fornece um método para produzir uma molécula da presente invenção, compreendendo uma extensão de aminoácido presente como uma fusão direta, cujo método compreende manter uma célula hospedeira tal como aquela descrita anteriormente, que compreende um ácido nucleico recombinante e/ou construto que codifica uma fusão da invenção em condições adequadas para expressão do dito ácido nucleico recombinante, por meio do qual uma fusão é produzida.
[000121] A invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo as moléculas modificadas da invenção. A invenção adicionalmente fornece uma composição farmacêutica da invenção para uso na medicina, por exemplo, para uso no tratamento ou prevenção, por exemplo, de doença ou condição ou distúrbio e que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica da invenção. No geral, as moléculas da invenção serão utilizadas em forma purificada junto com carreadores farmacêutica ou fisiologicamente apropriados. Tipicamente, esses carreadores podem incluir soluções aquosas ou alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, qualquer um incluindo salina e/ou meio tamponado. Carreadores parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e lactado de Ringer. Adjuvantes fisiologicamente aceitáveis adequados, se necessário, para manter um complexo de polipeptídeo em suspensão, podem ser escolhidos de espessantes tais como carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina e alginatos. Carreadores intravenosos incluem fluido e reabastecedores de nutriente e reabastecedores de eletrólito, tais como aqueles com base em dextrose de Ringer. Conservantes e outros aditivos, tais como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes, podem também estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). Uma variedade de formulações adequadas pode ser usada, incluindo formulações de liberação prolongada.
[000122] A invenção também fornece um método para tratar (terapêutica ou profilaticamente) um paciente ou indivíduo com uma doença ou distúrbio, tais como aqueles descritos aqui, e que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica da invenção.
[000123] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outras moléculas ou frações, por exemplo, polipeptídeos, proteínas e/ou moléculas terapêuticas (por exemplo, outras proteínas (incluindo anticorpos), peptídeos, ou medicamentos de molécula pequena.
[000124] A invenção também fornece composições farmacêuticas da invenção compreendendo dAbs anti-TNFR1 de VH ou VL modificados descritos aqui, por exemplo, aqueles dAbs anti-TNFR1 de VH ou VL descritos aqui, ou domínios de VHH anti-TNFR1 modificados descritos aqui, para uso no tratamento de doenças ou distúrbios inflamatórios, por exemplo, psoríase, artrite, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal (por exemplo) doença de Crohn e colite ulcerativa; ou, por exemplo, doenças ou distúrbios respiratórios ou pulmonares, por exemplo, selecionados de: doença pulmonar obstrutiva crônica, bronquite crônica, bronquite obstrutiva crônica e enfisema, inflamação do pulmão, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, pneumonia, pneumonite por hipersensibilidade, infiltrado pulmonar com eosinofilia, doença pulmonar ambiental, pneumonia, bronquiectsia, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensão pulmonar primária, tromboembolismo pulmonar, distúrbios da pleura, distúrbios do mediastino, distúrbios do diafragma, hipoventilação, hiperventilação, apneia do sono, síndrome do desconforto respiratório agudo, mesotelioma, sarcoma, rejeição a enxerto, doença do hospedeiro versus enxerto, câncer do pulmão, rinite alérgica, alergia, asbestose, aspergiloma, aspergilose, bronquiectsia, bronquite crônica, enfisema, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, doença invasiva do pneumococo, influenza, micobactérias não tuberculosas, efusão pleural, pneumoconiose, pneumocitose, pneumonia, actinomicose pulmonar, proteinose alveolar pulmonar, antraz pulmonar, edema pulmonar, êmbolo pulmonar, inflamação pulmonar, histiocitose X pulmonar, hipertensão pulmonar, nocardiose pulmonar, tuberculose pulmonar, doença veno-oclusiva pulmonar, doença pulmonar reumatoide, sarcoidose, e granulomatose de Wegener e lesão pulmonar aguda (ALI) e também síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e complicações dos mesmos tal como lesão renal aguda.
[000125] A invenção também propicia o uso de uma composição farmacêutica da invenção compreendendo os dAbs anti-TNFR1 (VH, VL ou VHH) modificados descritos aqui, na fabricação de um medicamento para tratamento de qualquer uma das doenças ou distúrbios especificados descritos anteriormente. A invenção também propicia o uso de qualquer uma das composições descritas aqui para uso em terapia, diagnose ou profilaxia de qualquer das doenças ou distúrbios inflamatórios ou doenças ou distúrbios respiratórios ou pulmonares descritos anteriormente. A invenção também fornece uso profilático de qualquer uma das composições descritas aqui para impedir ou aliviar qualquer uma das doenças ou distúrbios inflamatórios ou doenças ou distúrbios respiratórios ou pulmonares descritos anteriormente.
[000126] As composições contendo os dAbs anti-TNFR1 descritos aqui, por exemplo, DOM 1H-131-206 com uma extensão de alanina no terminal C, podem ser administradas para tratamentos profilático e/ou terapêuticos e são administrados como uma "dose terapeuticamente efetiva". Quantidades necessárias para obter essa dosagem dependerão da gravidade da doença e do estado geral do sistema imune do próprio paciente, mas, no geral variam de 0,005 a 5,0 mg do dAb per quilograma de peso corpóreo, com doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo mais comumente usadas. Para aplicações profiláticas, podem ser usadas dosagens similares ou ligeiramente menores, para impedir, inibir ou atrasar início de ação da doença (por exemplo, para sustentar remissão ou quiescência, ou para impedir fase aguda). Versados na técnica poderão determinar o intervalo de dosagem apropriado para tratar, suprimir ou impedir a doença. Quando um dAb anti-TNFR1 descrito aqui é administrado para tratar, suprimir ou impedir uma doença inflamatória crônica, ele pode ser administrado até quatro vezes por dia, duas vezes semanalmente, uma vez semanalmente, uma vez a cada duas semanas, uma vez ao mês, ou uma vez a cada dois meses, a uma dose, por exemplo, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 100 mg/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 70 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 60 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 10 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 10 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg a cerca de 2.5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg. Em modalidades particulares, o dAb anti-TNFR1 pode ser administrado para tratar, suprimir ou impedir uma doença inflamatória crônica, uma vez a cada duas semanas ou uma vez ao mês a uma dose de cerca de 10 mg/kg a cerca de 10 mg/kg (por exemplo, cerca de 10 mg/kg, cerca de 100 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg).
[000127] Tratamento ou terapia realizado usando as composições descritas aqui é considerado “efetivo” se um ou mais sintomas ou sinais forem reduzidos ou aliviados (por exemplo, em pelo menos 10% ou pelo menos um ponto em uma escala de avaliação clínica), com relação a tais sintomas presentes antes do tratamento, ou com relação a tais sintomas em um indivíduo (modelo humano ou animal) não tratado com tal composição ou outro controle adequado. Sintomas variarão obviamente dependendo da natureza precisa da doença ou distúrbio alvejado, mas podem ser medidos pelos versados na técnica.
[000128] Similarmente, profilaxia realizada usando uma composição descrita aqui é “efetiva” se o início de ação ou gravidade de um ou mais sintomas ou sinais forem atrasados, reduzidos ou abolidos com relação a tais sintomas em um indivíduo similar (modelo humano ou animal) não tratado com a composição.
[000129] As moléculas da invenção podem ser adicionalmente formatadas para terem um grande tamanho hidrodinâmico para prolongar adicionalmente a meia-vida, por exemplo, por anexação de um grupo PEG, albumina de soro, transferrina, receptor de transferrina ou pelo menos a porção de ligação de transferrina dos mesmos, um região Fc do anticorpo, ou por conjugação com um domínio do anticorpo. Por exemplo, o dAb que liga albumina de soro pode ser formatado como um grande fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo (por exemplo, formatado como um Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2, IgG, scFv).
[000130] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição, de acordo com a invenção, que compreende um ligante específico duplo ou ligante multiespecífico que compreende um primeiro dAb que é modificado de acordo com a invenção, por exemplo, por uma extensão do terminal C e/ou por uma mutação da estrutura P14A e um segundo dAb que tem uma especificidade de ligação igual ou diferente do primeiro dAb e opcionalmente no caso de ligantes multiespecíficos, dAbs adicionais. O segundo dAb (ou dAbs adicionais) pode opcionalmente ligar um diferente alvo e pode também opcionalmente compreender uma extensão do terminal C e/ou uma mutação da estrutura P14A, de acordo com a invenção. Em um aspecto, a invenção diz respeito às moléculas e composições da invenção para distribuição por administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa, inalação, distribuição nasal, distribuição transmucosal, distribuição oral, distribuição para o trato GI de um paciente, distribuição retal ou distribuiçãoocular. Em um aspecto, a invenção propicia o uso das moléculas e composições da invenção na fabricação de um medicamento para distribuição por injeção subcutânea, inalação, distribuição intravenosa, distribuição nasal, distribuição transmucosal, distribuição oral, distribuição para o trato GI de um paciente, distribuição retal, distribuição transdérmica ouocular.
[000131] Em um aspecto, a invenção fornece um método para distribuição para um paciente por injeção subcutânea, distribuição pulmonar, distribuição intravenosa, distribuição nasal, distribuição transmucosal, distribuição oral, distribuição para o GI trato de um paciente, distribuição retal ou ocular, em que o método compreende administrar ao paciente uma quantidade farmaceuticamente efetiva de uma molécula da invenção.
[000132] Em um aspecto, a invenção fornece uma formulação oral, injetável, inalável, nebulizável compreendendo uma molécula da invenção.
[000133] A formulação pode ser na forma de um comprimido, pílula, cápsula, líquido ou xarope.
[000134] O termo "indivíduo" ou “indivíduo” é definido aqui para incluir animais tais como mamíferos, incluindo, mas, mas sem limitações, primatas (por exemplo, humanos), vacas, ovelha, cabras, cavalos, cães, gatos, coelhos, porquinhos-da-índia, ratos, camundongos ou outra espécie de bovino, ovino, equino, canino, felino, roedor ou murino.
[000135] A invenção também fornece um estojo para uso na administração de moléculas e composições, de acordo com a invenção, a um indivíduo (por exemplo, paciente humano), compreendendo uma molécula ou composição da invenção, um dispositivo de distribuição de medicamento e, opcionalmente, instruções para uso. a composição pode ser fornecida como uma formulação, tal como uma formulação liofilizada ou uma formulação de liberação lenta. Em certas modalidades, o dispositivo de distribuição de medicamento é selecionado do grupo que consiste em uma seringa, um inalador, um dispositivo de administração intranasal ouocular (por exemplo, um conta-gotas mister, de olho ou nariz), e um dispositivo de injeção sem agulha.
[000136] As moléculas e composições desta invenção podem ser liofilizadas para armazenamento e reconstituídas em um carreador adequado antes do uso. Qualquer método liofilização adequado (por exemplo, secagem por aspersão, secagem de torta) e/ou técnicas de reconstituição podem ser empregadas. Versados na técnica perceberão que liofilização e reconstituição podem levar a graus variados de perda de atividade do anticorpo e a que níveis de uso podem precisar ser ajustados para compensar. Em uma modalidade particular, a invenção fornece uma composição compreendendo uma composição liofilizada (congelada seca) descrita aqui. Preferivelmente, a composição liofilizada (congelada seca) perde não mais que cerca de 20%, ou não mais que cerca de 25%, ou não mais que cerca de 30%, ou não mais que cerca de 35%, ou não mais que cerca de 40%, ou não mais que cerca de 45%, ou não mais que cerca de 50% de sua atividade (por exemplo, atividade de ligação em albumina de soro) quando reidratada. Atividade é a quantidade de composição exigida para produzir o efeito da composição antes de ela ser liofilizada. A atividade da composição pode ser determinada usando qualquer método adequado antes da liofilização, e a atividade pode ser determinada usando o mesmo método depois da reidratação para determinar a quantidade de atividade perdida.
[000137] A invenção também diz respeito a formulações de liberação sustentada ou lenta compreendendo as moléculas da invenção, tais formulações de liberação sustentada podem compreender as moléculas da invenção em combinação, por exemplo, com ácido hialurônico, microesferas ou lipossomos e outros carreadores, excipientes e/ou diluentes farmacêutica ou farmacologicamente aceitáveis.
[000138] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula da invenção, e um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis.
[000139] Em uma modalidade, a invenção fornece os dAbs de TNFR1 modificados da presente invenção que têm baixa ligação em ADAs, por exemplo, tal como um dAb de DOM1h-131-206 modificado com uma modificação descrita aqui para diminuir a ligação em ADAs. Por exemplo, a invenção fornece o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 16), por exemplo, como uma composição farmacêutica, por exemplo, para uso para tratar uma doença ou distúrbio, por exemplo, para tratar uma doença ou distúrbio respiratório tais como COPD, ALI ou ARDS. O dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 16) (ou composição farmacêutica compreendendo o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C) quando usado para tratar uma doença ou distúrbio respiratório tal como COPD, ALI ou ARDS podem ser administrados em um indivíduo, por exemplo, em um indivíduo humano, por injeção (por exemplo, por injeção subcutânea, intravenosa ou intramuscular) ou eles alternativamente podem ser dados ao indivíduo, por exemplo, a um indivíduo humano, por administração pulmonar, por exemplo, por nebulização usando um nebulizador padrão ou por inalação, por exemplo, usando um dispositivo inalador padrão. A invenção adicionalmente diz respeito às formulações de liberação sustentada e/ou liofilizada compreendendo os dAbs de TNFR1 modificados da presente invenção com baixa ligação em ADA, tal como o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 16). Também fornecido é um dispositivo de distribuição, por exemplo, um dispositivo inalador ou um nebulizador que compreende os dAbs de TNFR1 modificados da presente invenção, tal como dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única no ácido nucleico da terminação C (SEQ ID NO 22).
[000140] Em um aspecto, a invenção fornece o dAb de DOM1h-131- 206 não modificado (SEQ ID NO 1) ou ao dAb de DOM1h-131-206 modificado, de qualquer uma das maneiras descritas aqui para diminuir a ligação em ADA, por exemplo, o dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 16), para tratar um distúrbio inflamatório de pele, por exemplo, psoríase e também qualquer um dos regimes de dosagem é fornecido conforme descrito a seguir, para uso de um anticorpo do domínio no tratamento de psoríase. O anticorpo do domínio usado para o tratamento de psoríase alveja seletivamente o mesmo domínio de TNFR1 humano como o ligante TNF-alfa humano natural para este receptor e é um antagonista de TNFR1 específico competitivo, mas, não de TNFR2, e impede a ligação de TNF-alfa em TNFR1 e a sinalização deste ligante através de TNFR1. Um anticorpo do domínio como esse pode compreender qualquer dAb anti-TNFR1 que foi modificado para diminuir a ligação em ADAs, da maneira descrita aqui. Em particular, o anticorpo do domínio pode ser um anticorpo do domínio humano tais como DOM1h-131- 206 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, o DOM1h- 131-206 com uma alanina no terminal C com as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO: 16, ou um dAb de DOM1h-131-206 (SEQ ID NO 1) que foi então modificado para diminuir a ligação em ADA descrito aqui (isto é, qualquer modificação para diminuir a ligação em ADAs) da maneira descrita aqui. O anticorpo do domínio pode ser provido em um frasco contendo, por exemplo, 100 mg ou, por exemplo, 40 mg de um liofilizado do anticorpo do domínio. O liofilizado pode compreender sacarose, glicina, di- idrogeno fosfato de sódio e polissorbato 80. Este liofilizado do anticorpo do domínio pode inicialmente ser reconstituído em 5 mL de água estéril e então diluído com água estéril, ou um outro diluente farmaceuticamente aceitável, para produzir composições farmacêuticas compreendendo 20 mg/mL, 5 mg/mL, e 1 mg/mL do anticorpo do domínio.
[000141] O anticorpo do domínio pode ser usado para tratar pacientes humanos identificados com psoríase. Em particular, o anticorpo do domínio pode ser usado para tratar pacientes humanos identificados com psoríase tipo placa estável branda, moderada ou grave, crônica, com uma ou duas áreas de placa. De acordo com o National Psoriasis Foundation, psoríase tipo placa branda afeta menos que 3% de uma área superficial do corpo do paciente humano, psoríase tipo placa moderada afeta entre 3% e 10% de uma área superficial do corpo do paciente humano e psoríase grave afeta mais que 10 porcento de uma área superficial do corpo do paciente humano. vide, por exemplo, Krajacic, 6 (5) Supplement 6, Biotechnology Healthcare, December 2009 and National Psoriasis Foundation, About Psoriasis: Statistics. Como um ponto de referência, um palmo do paciente humano poderia ser considerado aproximadamente 1% da área superficial do corpo do paciente. A gravidade de psoríase pode também ser determinada, como uma alternativa, de acordo com a Área de Psoríase e Índice de Gravidade através do uso do sistema de graduação descrito por Fredrikson que é baseado em quatro critérios: vermelhidão, espessura, escamação e o envolvimento da quantidade de área superficial. vide, por exemplo, Fredrickson, 157 Dermatologic 238 (1978). As placas psoriáticas a ser tratadas podem ter uma espessura infiltrada comparável de pelo menos 200 μm, avaliadas por medições sonográficas, quando o anticorpo do domínio é primeiramente administrado. Os pacientes humanos podem ser sujeitos machos ou fêmeas com psoríase tipo placa crônica com placa(s) estável(s) nas extremidades superiores, coxas ou tronco. Esses pacientes humanos podem ter cerca de 18 a cerca de 70 anos de idade. Pacientes humanos podem também ter de 14 a 26 anos de idade, bem como 14 ou mais anos de idade.
[000142] O anticorpo do domínio pode ser administrado aos pacientes humanos por injeção em uma placa psoriática. Em particular, 100 μL de uma composição farmacêutica compreendendo 20 mg/mL, 5 mg/mL, ou 1 mg/mL do anticorpo do domínio podem ser administrados por injeção em uma placa psoriática a uma profundidade que alveja a epiderme e derme superficial na placa.
[000143] O anticorpo do domínio pode ser administrado em um paciente humano com uma placa psoriática de acordo com um protocolo de tratamento no qual 100 μL de uma composição farmacêutica compreendendo 5 mg/mL do anticorpo do domínio são injetados em uma placa psoriática uma vez por semana durante um período de tratamento de 28 dias. Em um protocolo de tratamento como esse, o paciente será administrado com a composição farmacêutica quatro vezes e receberá 0,5 mg do anticorpo do domínio durante cada administração, de maneira tal que uma dose total de 2 mg do anticorpo do domínio será recebida durante o período de tratamento de 28 dias. Isto significa, por exemplo, que em um protocolo de tratamento de período curto de 28 dias, o paciente poderá receber a primeira injeção de 100 μL contendo 0,5 mg do anticorpo do domínio em dia um, a segunda injeção como essa no dia oito, o terceira injeção como essa no dia quinze, e o quarta injeção como essa no dia vinte e dois. Doses de anticorpo do domínio (por exemplo, injeção de 100 μL contendo 0,5 mg do anticorpo do domínio) neste protocolo de tratamento são administradas com base em mg por paciente.
[000144] O anticorpo do domínio pode também ser administrado em um paciente humano com uma placa psoriática, de acordo com um protocolo de tratamento, no qual 100 μL de uma composição farmacêutica compreendendo 20 mg/mL do anticorpo do domínio são injetados em uma placa psoriática uma vez por semana durante um período de tratamento de 28 dias. Em um protocolo de tratamento como esse, o paciente será administrado a composição farmacêutica quatro vezes e receberá 2 mg do anticorpo do domínio durante cada administração, de maneira tal que, uma dose total de 8 mg do anticorpo do domínio é recebida durante o período de tratamento de 28 dias. Isto significa, por exemplo, que em um protocolo de tratamento de período curto de 28 dias o paciente poderá receber que a primeira injeção de 100 μL contendo 2 mg do anticorpo do domínio no dia um, a segunda injeção como essa no dia oito, a terceira injeção como essa no dia quinze, e a quarta injeção como essa no dia vinte e dois. Doses de anticorpo do domínio (por exemplo, injeção de 100 μL contendo 2 mg do anticorpo do domínio) neste protocolo de tratamento são administradas com base em mg por paciente.
[000145] O anticorpo do domínio pode também ser administrado em um paciente humano com uma placa psoriática, de acordo com um protocolo de tratamento, no qual 100 μL de uma composição farmacêutica compreendendo 5 mg/mL do anticorpo do domínio são injetados em uma placa psoriática duas vezes por semana durante um período de tratamento de 28 dias. Em um protocolo de tratamento como esse, o paciente será administrado com a composição farmacêutica oito vezes e receberá 0,5 mg do anticorpo do domínio durante cada administração, de maneira tal que, uma dose total de 4 mg do anticorpo do domínio será recebida durante o período de tratamento de 28 dias. Isto significa, por exemplo, que em um protocolo de tratamento de período curto de 28 dias, o paciente poderá receber a primeira injeção de 100 μL contendo 0,5 mg do anticorpo do domínio no dia um, a segunda injeção como essa no dia quatro, a terceira injeção como essa no dia oito, a quarta injeção como essa no dia onze, a quinta injeção como essa no dia quinze, a sexta injeção como essa no dia dezoito, a sétima injeção como essa no dia vinte e dois e a oitava injeção como essa no dia vinte e cinco. Doses de anticorpo do domínio (por exemplo, injeção de 100 μL contendo 0,5 mg do anticorpo do domínio) neste protocolo de tratamento são administradas com base em mg por paciente.
[000146] O anticorpo do domínio pode também ser administrado em um paciente humano com uma placa psoriática, de acordo com um protocolo de tratamento, no qual 100 μL de uma composição farmacêutica compreendendo 1 mg/mL do anticorpo do domínio são injetados em uma placa psoriática uma vez por semana durante um período de tratamento de 28 dias. Em um protocolo de tratamento como esse, o paciente será administrado com a composição farmacêutica quatro vezes e receberá 0,1 mg do anticorpo do domínio durante cada administração, de maneira tal que, uma dose total de 0,4 mg do anticorpo do domínio será recebida durante o período de tratamento de 28 dias. Isto significa, por exemplo, que em um protocolo de tratamento de período curto de tempo 28 dias o paciente poderá receber a primeira injeção de 100 μL contendo 0,1 mg do anticorpo do domínio no dia um, a segunda injeção como essa no dia oito, a terceira injeção como essa no dia quinze, e a quarta injeção como essa no dia vinte e dois. Doses de anticorpo do domínio (por exemplo, injeção de 100 μL contendo 0,1 mg do anticorpo do domínio) neste protocolo de tratamento são administradas com base em mg por paciente.
[000147] WO 2008/149148 descreve métodos de testar, isolar e produzir o dAb de DOM1h-131-206 não modificado e tais métodos são aplicáveis aos dAbs de TNFR1 modificados da presente invenção com baixa ligação em ADAs, por exemplo, ao dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única na terminação C (SEQ ID NO 16), e esta descrição (incluindo métodos de testar, isolar e produzir) está incorporada aqui.
[000148] Nas modalidades adicionais 1-36 a seguir a invenção também fornece: 1. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) (por exemplo, VH, VL ou um VHH), por exemplo, que liga em um alvo que compreende uma ou mais modificações selecionadas de: (a) uma adição, extensão ou marcação do terminal C; (b) uma ou mais substituições da estrutura de aminoácido em que pelo menos uma substituição é uma substituição selecionada de: uma substituição de P14A, uma substituição de P41A e uma substituição de L108A; e que tem baixa ligação em ADAs pré-existentes comparadas com o domínio variável de imunoglobulina único não modificado (dAb). 2. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com 1. anteriormente, em que o dito dAb é selecionado de uma VH humano, ou dAb da VL ou uma VHH Camelídio. 3. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) de acordo com 1 ou 2, que compreende uma extensão no terminal C de pelo menos um aminoácido. 4. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) de acordo com 3, em que a dita extensão no terminal C compreende uma extensão de aminoácido de um aminoácido a cerca de 6 aminoácidos. 5. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) de acordo com 3 ou 4, em que a dita extensão no terminal C compreende um aminoácido que é alanina. 6. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) de acordo com 5, em que a dita extensão no terminal C consiste em um único aminoácido que é alanina. 7. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) de acordo com a reivindicação 5, em que a dita extensão do terminal C compreende uma extensão de aminoácido selecionado de: (a) AS, (b) AST (c) ASTK,(d) ASTKG, ou (e) ASTKGP. 8. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) de acordo com qualquer um de 1-2, em que o terminal C tem uma marcação selecionada de: marcação de afinidade, uma marcação myc, marcação FLAG, marcação his, modificação química tal como PEG, ou domínio de proteínas tal como o domínio de Fc de anticorpo. 9. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com 6, em que o dito dAb é um dAb de VH e que compreende adicionalmente uma substituição da estrutura P14A. 10. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com 7, em que o dito dAb é um dAb de VH e que compreende adicionalmente uma substituição da estrutura P14A. 11. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que liga em um alvo, em que o dito é selecionado de: TNFα, TNFR1, VEGF, IL-1R, IL-6R, IL-4, IL-5, IL-13, DC-SIGN, ASGPR, albumina, TGFβR2. 12. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com 11, que é selecionado de uma sequência de aminoácidos seguinte identificada como: (a) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única (SEQ ID NO 16) (b) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única e uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 17) (c) dAb de DOM1h-131-206 com uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 18) (d) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG (SEQ ID NO 19) (e) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG e uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 20). 13. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com 11 ou 12, em que o alvo é TNFR1 e o dAb não modificado é selecionado de uma sequência de aminoácidos que é 100%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica à sequência de aminoácidos identificada como: DOM1h-131- 206 (SEQ ID NO 1), DOM1h-131-511 (SEQ ID NO 2), DOM1h-131-202 (SEQ ID NO 3). 14. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dAb está presente como uma fusão ou conjugado com moléculas adicionais. 15. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com 14, em que o dAb está presente como uma fusão ou conjugado com uma ou mais moléculas adicionais selecionadas de: um dAb adicional, uma proteína ou polipeptídeo ou fragmento deste, por exemplo, que tem meia-vida que se estende ou é uma molécula terapêutica ou ativa adicional, uma molécula PEG, um anticorpo ou um fragmento destes, por exemplo, uma região Fc. 16. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com 15, em que o dAb está presente como uma molécula de mAbdAb. 17. Uma composição farmacêutica compreendendo um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com qualquer um dos anteriores em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis. 18. A composição farmacêutica de acordo com 17, que compreende adicionalmente agentes terapêuticos ou ativos. 19. Uma composição farmacêutica de acordo com 17 ou 18, que compreende um dAb anti-TNFR1. 20. Uma composição farmacêutica de acordo com 19, que compreende um dAb anti-TNFR1 de acordo com qualquer um de 12-13. 21. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, ou uma composição, de acordo com qualquer uma das 17-20, para uso na medicina. 22. Um método de tratamento ou prevenção de pelo menos uma doença ou distúrbio ou condição selecionadas de uma doença ou distúrbio inflamatório ou uma doença ou distúrbio respiratório ou pulmonar administrando a um indivíduo, uma quantidade terapêutica ou profilaticamente efetiva de uma composição, de acordo com qualquer um 19- 20 ou um dAb de acordo com 11-13. 23. O método de 22, em que a dita pelo menos uma doença ou distúrbio ou condição é selecionada de: psoríase, artrite, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal (por exemplo) doença de Crohn e colite ulcerativa ou, por exemplo, doenças ou distúrbios respiratórios ou pulmonares, por exemplo, selecionadas de: doença pulmonar obstrutiva crônica, bronquite crônica, bronquite obstrutiva crônica e enfisema, inflamação do pulmão, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, pneumonia, pneumonite por hipersensibilidade, infiltrado pulmonar com eosinofilia, doença pulmonar ambiental, pneumonia, bronquiectsia, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensão pulmonar primária, tromboembolismo pulmonar, distúrbios da pleura, distúrbios do mediastino, distúrbios do diafragma, hipoventilação, hiperventilação, apneia do sono, síndrome do desconforto respiratório agudo, mesotelioma, sarcoma, rejeição a enxerto, doença do hospedeiro versus enxerto, câncer do pulmão, rinite alérgica, alergia, asbestose, aspergiloma, aspergilose, bronquiectsia, bronquite crônica, enfisema, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, doença invasiva do pneumococo, influenza, micobactérias não tuberculosas, efusão pleural, pneumoconiose, pneumocitose, pneumonia, actinomicose pulmonar, proteinose alveolar pulmonar, antraz pulmonar, edema pulmonar, êmbolo pulmonar, inflamação pulmonar, histiocitose X pulmonar, hipertensão pulmonar, nocardiose pulmonar, tuberculose pulmonar, doença veno-oclusiva pulmonar, doença pulmonar reumatoide, sarcoidose, e granulomatose de Wegener e lesão pulmonar aguda (ALI), e síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e complicações destes. 24. O método de acordo com 23, em que a dita doença é ALI e o dito dAb é um dAb de acordo com a reivindicação 13, ou a dita composição farmacêutica compreende um dAb de acordo com a reivindicação 13. 25. O método de acordo com qualquer um de 22-24, em que a dita composição ou dAb é distribuída a um indivíduo por injeção subcutânea, intravenosa ou intramuscular. 26. O método de acordo com qualquer um de 22-24, em que a dita composição ou dAb é distribuída a um indivíduo por meio de distribuição parenteral, oral, retal, transmucosal, ocular, pulmonar ou do trato GI. 27. Uma formulação injetável, oral, inalável ou nebulizável que compreende uma composição ou um dAb de acordo com qualquer um de 1-20. 28. Uma formulação de liberação sustentada que compreende uma composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20. 29. Uma formulação liofilizada que compreende uma composição de acordo com qualquer um de 1-20. 30. Um dispositivo de distribuição compreendendo uma composição de acordo com qualquer um de 1-20. 31. Um dispositivo de distribuição compreendendo uma composição de acordo com qualquer um de 1-20, em que o dito dispositivo é um nebulizador ou um inalador. 32. Um ácido nucleico isolado ou recombinante que codifica um dAb, de acordo com qualquer uma das 1-16. 33. Um ácido nucleico isolado ou recombinante que codifica um dAb, de acordo com qualquer uma das 12-13. 34. Um vetor compreendendo um ácido nucleico de 32 ou 33. 35. Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 32 ou 33 ou o vetor de 34. 36. Um método de produzir um polipeptídeo compreendendo um dAb, de acordo com qualquer um de 1-16, em que o dito método compreende manter uma célula hospedeira de 35 em condições adequadas para expressão do dito ácido nucleico ou vetor, por meio do que um polipeptídeo é produzido. 37. Um dAb de acordo com 1-16, em que o dAb liga em ADA com uma KD que é 150% ou mais da KD do dAb não modificado (por exemplo, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650% ou mais).
[000149] A invenção também diz respeito às modalidades seguintes listadas como 1b-25b: 1b. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) que não liga (ou tem baixa ligação) em ADA humano pré-existente em soros humano, em que o epítopo no dAb no qual ADA liga é mascarado. 2b. Um dAb de acordo com 1b anteriormente, que tem uma KD de ligação em ADA que é 150% ou mais (por exemplo, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650% ou mais) da KD de uma sequência equivalente na qual o epítopo não é mascarado. 3b. Um dAb de acordo com 1 b- 2b, em que o epítopo é mascarado por: a. adição de uma entidade química na terminação C; e/ou b. uma ou mais substituição(s) da estrutura(s); e/ou c. uma ou mais deleções 4b. Um dAb de acordo com 3b em que a entidade química compreende, um ou mais aminoácido(s), uma marcação no terminal C, ou uma modificação química tal como peguilação ou amidação. 5b. O dAb de acordo com 3b ou 4b em que (a), (b) e/ou (c) tem um efeito conformacional direto no epítopo, um efeito de conformação indireto no epítopo, e/ou impede estericamente o epítopo. 6b. O dAb de acordo com qualquer um dos anteriores em que o dito epítopo; d. sobrepõe com resíduo Kabat 113 na terminação C; e/ou e. sobrepõe com resíduos Kabat 14, 41, 108, 110, 112 e 113; e/ou f. compreende os resíduos Kabat 14, 41, 108, 110, 112 e 113 expostos na superfície, e qualquer outro resíduo em 5 angstrons dessas posições; e/ou g. compreende estrutura 4, e os laços entre as fitas beta das estruturas 1 e 2. 7b. Um dAb de acordo com qualquer modalidade anterior 1b- 6b, que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições Kabat 14, 41, 108, 110, ou 112 comparado com uma sequência da estrutura da linha germinal humano. 8b. Um domínio variável de imunoglobulina único humanizado (dAb) que tem uma sequência de não humano em um ou mais dos resíduos seguintes: resíduos Kabat 14, 41, 108, 110 e/ou 112. 9b. Um dAb de acordo com 7b ou 8b em que os resíduos de aminoácido na dita uma ou mais posições são resíduos de alaninas. 10b. Um dAb de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 1b-9b, em que o dito mascaramento é obtido pela provisão de uma extensão de aminoácido na terminação C do dAb. 11b. Um dAb de acordo com 10b em que a dita extensão tem entre 1 e 8 aminoácidos. 12b. Um dAb de acordo com 10b ou 11b em que a dita extensão compreende um resíduo de alanina. 13b. Um dAb de acordo com 12b em que a dita extensão consiste em um único resíduo de alanina. 14b. Um dAb de acordo com 12b em que a dita extensão é selecionada do grupo que consiste em: AS, AST, ASTK, ASTKG, e ASTKGP. 15b. Um dAb de acordo com qualquer um de 1b-14b, em que o dito dAb é uma VH ou VL ou um dAb de VHH. 16b. Um dAb de acordo com qualquer um de 1b-15b, em que o alvo no qual o dAb liga é TNFα, TNFR1, VEGF, IL-1R, IL-6R, IL-4, IL-5, IL-13, DC-SIGN, ASGPR, albumina, e TGFβR2. 17b. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com 16b que é selecionado das sequências de aminoácidos seguintes identificadas como: (a) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única (SEQ ID NO 16); (b) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão de uma alanina única e uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 17) (c) dAb de DOM1h-131-206 com uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 18); (d) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG (SEQ ID NO 19); e (e) dAb de DOM1h-131-206 com uma extensão da terminação C de ASTKG e uma mutação da estrutura P14A (SEQ ID NO 20). 18b. Um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), de acordo com 16b ou 17b em que o alvo é TNFR1 e o dAb não modificado é selecionado de uma sequência que é 100%, 95%, 90%, 85% ou 80% idêntica à sequência de aminoácidos identificada como: DOM1h-131-206 (SEQ ID NO 1), DOM1h-131-511 (SEQ ID NO 2), DOM1h-131-202 (SEQ ID NO 3). 19b. Um método de mascarar um epítopo em um domínio variável de imunoglobulina único (dAb), cujo epítopo liga em ADA humano pré-existente em soros humano, compreendendo a etapa de modificar o epítopo. 20b. Um método de reduzir a ligação de um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) em ADA humano pré-existente em soros humano, compreendendo mascarar o epítopo no dAb no qual ADA liga. 21b. Um método de acordo com 19b ou 20b no qual o dito mascaramento causa uma redução na ligação em ADA de maneira tal que o dAb compreendendo o epítopo mascarado tem uma KD que é 150% ou mais da KD de um dAb, no qual o epítopo não é mascarado. 22b. Um método de acordo com qualquer um de 19b - 21b em que o epítopo é mascarado por: h. adição de uma entidade química na terminação C; e/ou um i.ou mais substituição da estrutura(s); e/ou j. uma ou mais deleções 23b. Um método de acordo com 22b em que a entidade química compreende um ou mais aminoácido(s), uma marcação no terminal C, ou uma modificação química tal como peguilação ou amidação. 24b. O método de acordo com 22b ou 23b em que (a), (b) e/ou (c) tem um efeito conformacional direto no epítopo, um efeito de conformação indireto no epítopo, e/ou impede estericamente o epítopo. 25b. Um método de acordo com qualquer um de 19b-24b anterior em que o dito epítopo; k. sobrepõe com resíduo Kabat 113 na terminação C; l. sobrepõe com resíduos Kabat 14, 41, 108, 110, 112 e 113; e/ou m. Compreende os resíduos Kabat 14, 41, 108, 110, 112 e 113 expostas na superfície, e qualquer outro resíduo em 5 angstroms desta superfície; e/ou n. compreende estrutura 4, e os laços entre as fitas beta das estruturas 1 e 2. Em modalidades adicionais 1c-15c a seguir a invenção fornece: 1c. Um domínio variável de imunoglobulina único de VHH humanizado que retém um ou mais resíduo(s) de linha germinal de camelo nos resíduos Kabat 14 e/ou 108. 2c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com 1c anterior, que tem uma KD de ligação em ADA humano em soro humano que é 150% ou mais (por exemplo, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650% ou mais) da KD de uma sequência equivalente na qual os resíduos 14 e/ou 108 foram humanizados. 3c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com 1c ou 2c no qual um ou mais aminoácidos do terminal C foram deletados. 4c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com 3c em que um aminoácido do terminal C foi deletado. 5c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com 1c ou 2c que compreende uma adição, extensão ou marcação do terminal C. 6c Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com 5c em que a dita adição, extensão ou marcação é selecionada do grupo que consiste em: uma ou mais extensão(s) de aminoácido(s), uma marcação no terminal C, ou uma modificação química tal como peguilação ou amidação. 7c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com 5c ou 6c no qual a dita extensão tem entre 1 e 8 aminoácidos. 8c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com 7c em que a dita extensão compreende um resíduo de alanina. 9c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com 8c em que a dita extensão consiste em um resíduo de alanina única. 10c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com 8c em que a dita extensão é selecionada do grupo que consiste em: AS, AST, ASTK, ASTKG, ASTKGP, ASTKA, ASTKAP e ASTKAPS. 11c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 1c-10c, que compreende adicionalmente resíduos de não humano em um ou mais dos resíduos seguintes: resíduos Kabat 41, 110 e/ou 112. 12c. Um domínio variável de imunoglobulina único, de acordo com qualquer um das modalidades anteriores em que o alvo no qual o dAb liga, é TNFα, TNFR1, VEGF, IL-1R, IL-6R, IL-4, IL-5, IL-13, DC-SIGN, ASGPR, albumina e TGFβR2. 13c. Um método de humanização de um domínio variável de imunoglobulina único de VHH de camelídio compreendendo reter um ou mais resíduo(s) de linha germinal de camelo nos resíduos Kabat: 14 e/ou 108. 14c. Um método de reduzir ligação de uma domínio variável de imunoglobulina único de VHH de camelídio (dAb) em ADA pré-existente, compreendendo reter um resíduo da linha germinal de camelo nos resíduos Kabat: 14 e/ou 108. 15c. Um método de acordo com 13c ou 14c, no qual a dita retenção causa uma redução na ligação em ADA de maneira tal que, o VHH compreendendo os resíduos de camelídio nas posições 14 e/ou 108 tem uma KD de ligação em ADA humano em soro humano, que é 150% ou mais da KD de uma VHH com uma sequência equivalente, na qual esses resíduos foram humanizados.
[000150] Note que o termo dAb da maneira aqui usada é uma marcação registrada.
EXEMPLOS: Exemplo 1: Frequência de sujeitos saudáveis com ADA pré-existente para o dAb designado DOM1H-131-206 Procedimento do ensaio de ADA DOM1H-131-206 (VH)
[000151] DOM1H-131-206 (SEQ ID NO 1) é biotinilada a uma razão de desafio molar de biotina de 8:1. Depois da marcação, DOM1H-131-206 (SEQ ID NO 1) biotinilada passa por uma troca de tampão e é armazenada em um tampão de formulação contendo de fosfato de sódio 14 mM, 8,4% de sacarose, 0,35% de glicina, 0,014% de polissorbato 80 a pH 7,4.
[000152] DOM1H-131-206 é rutênio rotulado a uma razão de desafio molar Sulfo-Tag de 5:1. Depois da marcação, DOM1H-131-206 marcada Sulfo-TAG passa por uma troca de tampão e é armazenada em um tampão de formulação contendo 14 mM de fosfato de sódio, 8,4% de sacarose, 0,35% de glicina, 0,014% de polissorbato 80 a pH 7,4.
[000153] O ensaio de anticorpo de antimedicamento (ADA) é um ensaio de ligação realizado na plataforma da tecnologia MSD ™ ECL (eletroquimioluminescência). A tecnologia MSD™ (disponível pela Meso scale Discovery, Matyland, USA) utiliza um quelato metálico de rutênio como o rótulo ECL junto com eletrodos de carbono colocados dentro dos poços de uma placa microtituladora que são revestidos com estreptavidina. O Sulfo-Tag™ ligado usado no ensaio produz um sinal de quimioluminescência que é disparado quando tensão é aplicada pelo instrumento (Meso Scale Discovery Sector™ Imager 6000). O sinal luminescência resultante é medido em unidades de ECL™. A intensidade do sinal é diretamente proporcional à quantidade de anticorpos detectados na amostra. Amostras de controle negativas (soro humano normal; NHS) e positivas (PC; anticorpo idiotípico camundongo anti- DOM1H-131-206 dopado em soro humano normal) (QCs) são corridas em cada placa de ensaio.
[000154] O sumário dos procedimentos de ensaio é descrito a seguir: 1. Uma placa de estreptavidina MSD™ é bloqueada com caseína de bloqueio 150 μL/poço em PBS (1%) à temperatura ambiente (RT) por 1-2 horas. O bloqueador é removido sem lavagem. 2. Depois de uma pré-incubação de 1 hora, uma mistura homogênea contendo 0,1 μg/mL de DOM1H-131-206 biotinilada (medicamento), 0,1 μg/mL de (“Sulfo-Tag” ™) DOM1H-131-206 rutenilada (medicamento), e 2% de amostra de soro em diluente do ensaio (1% de caseína em PBS) são transferidos para a placa de MSD ™ e incubada por 1 hora ± 5 minutos a RT. 3. A placa de MSD é então lavada 3 vezes com PBST. 4. 150 μL/poço de tampão de leitura são adicionados e a placa é lida.
[000155] Durante a validação deste imunoensaio específico, um painel de 60 amostras de soro de doador humano saudável foi classificado para reatividade de fundo no ensaio. Determinou-se que aproximadamente 45% das amostras de soro desses sujeitos tiveram autoanticorpos VH-reativos detectáveis, basicamente do isotipo de IgG, que foram capazes de ligar DOM1H-131-206 (resultados mostrados na figura 1).
[000156] DOM1H-131-206 não rotulada livre compete para ligação em ADA neste ensaio, resultando em menor intensidade de sinal (alto% de inibição de sinal) Este ‘ensaio de confirmação’ foi usado para determinar se versões modificadas de DOM1H-131-206 e outras moléculas baseadas no anticorpo podem competir com DOM1H-131-206 para ligação em ADA.
Exemplo 2: Substituições de aminoácido na estrutura de VH de DOMlh- 131-206
[000157] DOM1H-131-206 não rotulada livre compete para ligação em ADA e resulta em menor intensidade de sinal no ensaio de ADA de DOM1H- 131-206 descrito anteriormente. Este ‘ensaio de confirmação’ foi, portanto, usado para determinar se materiais de teste, por exemplo, DOM1H-131-206, versões modificadas de DOM1H-131-206, ou outras moléculas baseadas no anticorpo (‘material de teste’), podem também inibir ligação em ADA para DOM1H-131-206.
[000158] Para investigar se a ligação em ADA na estrutura de VH poderia ser reduzida, inúmeras substituições de aminoácidos e outras modificações foram feitas na estrutura de DOM1h-131-206 por técnicas padrões de mutagênese direcionada ao sítio.
[000159] Moléculas com substituições (materiais de teste) foram ensaiadas usando o método seguinte (ensaio de confirmação):
[000160] Procedimento de ensaio de confirmação de DOM1H-131-206 (que pode ser usado para classificar dAbs de VH para ligação em ADA): 1. 10 μg/mL de DOM1H-131-206 ou outro material de teste tais como dAbs modificados são pré-incubados por 1 hora ± 5 minutos a RT com 4% de soro humano positivo de ADA em diluente do ensaio (1% de caseína em PBS). 2. Uma placa de estreptavidina de MSD™ é bloqueada com 150 μL/poço de caseína de bloqueio em PBS (1%) à temperatura ambiente (RT) por 1-2 horas. O bloqueador é removido sem lavagem. 3. Em uma placa de ensaio microtituladora, a amostra contendo soro humano positivo de amostra de ADA e 10 μg/mL de material de teste tais como dAbs modificados são adicionados a uma mistura homogênea de DOM1H-131-206 biotinilada (SEQ ID NO 1) (medicamento) e DOM1H-131-206 (SEQ ID NO 1) rutenilada (“Sulfo-Tag” ™) (medicamento) em diluente do ensaio (1% de caseína em PBS), de maneira tal que as concentrações finais fossem 2% de soro humano positivo de ADA, 0,1 μg/mL de DOM1H-131-206 biotinilada (SEQ ID NO 1) (medicamento) e 0,1 μg/mL de DOM1H-131-206 rutenilada (“Sulfo-Tag” ™) (SEQ ID NO 1) (medicamento) e incubadas por 1 hora ± 5 minutos a RT. 4. Depois da incubação de 1 hora, as amostras do ensaio são transferidas pra a placa de MSD bloqueada, e a placa é incubada por 1 hora ± 5 minutos no escuro a RT. 5. A placa de MSD™ é então lavada 3 vezes com PBST. 6. 150 μL/poço de tampão de leitura são adicionados e a placa é lida.
[000161] Para cada experimento com um diferente clone parental (resultados mostrados na tabela 1), amostras de soro humano de 10 sujeitos positivos de ADA foram testadas no ensaio de confirmação anterior (no exemplo 2): Resultados são mostrados na tabela 1b tanto quanto como o% de inibição média de sinal (total) quanto também como o% de sujeitos com ligação em ADA. Quanto menor o% de inibição de sinal tanto menos o composto modificado foi capaz de ligar em ADAs. Um corte de cerca de 40,5% no% de inibição de sinal foi feito para mostrar ligação negligível em ADA.
[000162] Usando o ensaio de confirmação, determinou-se que substituições de aminoácidos nas posições seguintes reduziram significativamente a ligação em ADA pré-existente na DOM1H-131-206 retendo ao mesmo tempo potência para ligação de antígeno isto é, ligação em TNFR1 conforme determinado usando um procedimento de ensaio de afinidade de TNFR1 mostrado no exemplo 5c (resultados mostrados na tabela 1): P14A, P41A, L108Q.
Exemplo 3: Extensões de aminoácido na estrutura de VH de DOM1H-131- 206
[000163] Para determinar se modificação da terminação C da estrutura de VH poderia reduzir a ligação em ADA, inúmeras modificações no terminal C foram feitas nas estruturas, por técnicas padrões de mutagênese direcionada ao sítio. Moléculas com substituições (materiais de teste) foram ensaiadas usando o ‘ensaio de confirmação’ descrito previamente no exemplo 2) e os resultados são mostrados a seguir na tabela 1.
[000164] Extensão da DOM1H-131-206 da terminação C ou outras moléculas testadas, também reduziram significativamente ligação em ADA pré-existente (Tabela 1, Tabela 2). Os resultados mostrados na tabela 2 foram também obtidos usando o ‘ensaio de confirmação’ descrito previamente no exemplo 2. Isto é exemplificado pelas extensões A, AS, AST, ASTK, ASTKG, ASTKGP, AAA, e todas as extensões maiores testadas. Clones de VHH que não foram humanizados têm no geral menores níveis de ligação em ADAs. Tabela 1: Avaliação de ligação de ADA em mutantes de DOM1H-131-206
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% de inibição = ligação em ADA (% de inibição de sinal quando a dada proteína é competida no ensaio de ligação de ADA (ensaio de confirmação)). Tabela 2: Avaliação de ligação em ADA de moléculas VHH e anticorpos do domínio de VH com extensões no terminal C
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% de inibição = ligação em ADA (% de inibição de sinal quando a dada proteína é competida no ensaio de ligação de ADA).
[000165] A sequência da marcação FLAG pode ser observada em Nature Biotechnology 1988, Vol 16, pp1204-1210.
[000166] Note que (média) 40% de inibição de sinal (ou menos que 40% de inibição de sinal) são tomados para mostrar ligação negligível em ADA.
Exemplo 4: Combinação de substituições de aminoácido e extensão no terminal C da estrutura de VH de DOM1H-131-206
[000167] Para determinar se uma combinação de substituições de aminoácidos e modificação da terminação C da estrutura de VH poderia reduzir a ligação em ADA, inúmeras modificações no terminal C e/ou substituições de aminoácidos foram feitas para estruturas, por técnicas padrões de mutagênese direcionada ao sítio. Moléculas com substituições foram ensaiadas usando o ‘ensaio de confirmação’ descrito previamente no exemplo 2. Os resultados são mostrados a seguir na tabela 3:
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Exemplo 5 a e 5b: Afinidade de extensão do terminal C de DOM1H-131-206
[000168] Estudos adicionais foram realizados para determinar se modificações em DOM1H-131-206 que reduzem ligação em ADA pré- existente resultou em qualquer mudança na afinidade deste dAb para seu alvo, TNFR1 humano.
Exemplo 5 a: Avaliação de ligação de TNFR1 de mutantes de DOM1H-131- 206 por ELISA
[000169] A capacidade de variantes modificadas de DOM 1H-131-206 (dAbs testes) de ligar em TNFR1 humano foi determinada por ELISA. Observou-se que mutação da estrutura e modificações no terminal C que foram mostradas para diminuir a ligação em ADA pré-existente, no geral teve ligação comparável com TNFR1 comparado com o dAb de DOM1H-131-206 parental. A exceção foi DOM1H-131-206 com uma extensão no terminal C de ASTKGP, que teve EC50 aproximadamente 5 vezes mais baixo para ligação de TNFR1 comparado com o dAb de DOM1h-131-206 parental. Protocolo de ensaio de ligação de ELISA TNFR1: 1. TNFR1-Fc humano recombinante (R&D Systems) é adicionado nas placas ELISA de 96 poços a uma concentração final de 0,1 μg/mL em tampão de carbonato-bicarbonato pH 9,4 (Pierce). 2. Depois de incubação por toda a noite a 4°C, TNFR1:Fc em excesso é removido por lavagem três vezes com tampão de lavagem (tampão de lavagem - 0,1% de Tween-20/PBS) e três vezes com PBS. 3. As placas são bloqueadas com 1% de BSA em PBS por 1 hora à temperatura ambiente. Bloqueio é removido por lavagem mencionada e então amostras de dAb teste diluídas em diluente do ensaio (BSA 0,1% + 0,05% de Tween-20/PBS) são adicionadas na placa e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente. 4. Depois da lavagem mencionada, um Ig de coelho anti- humano policlonal (Vh específico) a uma diluição de 1:1.000 em diluente do ensaio é adicionado e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. 5. Depois da lavagem mencionada, um anticorpo conjugado camundongo anti-coelho HRP é adicionado a uma diluição de 1:10.000 em diluente do ensaio e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. 6. Depois da lavagem mencionada, 100 uL de substrato SureBlue TMB são adicionados a cada poço. Uma vez que cor azul suficiente foi descrita, a reação enzimática é interrompida com 100 μL de HCl 1 M e a placa é lida a 450 nm. 7. Curvas de resposta a dose para cada dAb teste são preparadas colocando em gráfico concentração contra valores de absorbância. Os valores EC50 para ligação de dAb em TNFR1 são determinados usando Graphpad Prism. Tabela 4a: Avaliação de ligação em TNFR1 para mutantes de DOM1H-131- 206
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Tabela 4b: Avaliação de ligação em TNFR1 para mutantes de DOM1H-131-206
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Tabela 4c: Avaliação de ligação em TNFR1 para mutantes de DOM1H-131-206
Figure img0007
Exemplo 4b: Procedimento de ensaio de afinidade de TNFR1 usando Biacore™
[000170] Afinidade de um dAb de DOM1H-131-206 modificado com uma extensão A do terminal C foi determinada por ressonância de Plasmon de superfície usando um Biacore™ T100. Anti-IgG de anticorpo humano foi imobilizado em um chipe CM4, e TNFR1:Fc humano foi capturado nesta superfície a um nível de aproximadamente 60 unidades relativas. Materiais de teste diluídos em tampão a concentrações finais de 25 nM a 0,024 nM (em um faixa de diluição 4 vezes) foram injetados sobre o TNFR1:Fc. Curvas de ligação geradas foram referenciadas duplamente usando uma curva de material de teste de 0 nM, e dados ajustados a um 1 modelo de ligação:1 para gerar dados cinéticos. Ligação de material de teste para TNFR1 de macaco cinomolgo foi determinado da mesma maneira. Dados cinéticos de ligação são mostrados a seguir na tabela 4d.
[000171] Em conclusão, as cinéticas de ligação de TNFR1dAbs modificados (isto é, com adição de um terminal C A) e não modificados foram similares. Tabela 4d:
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(não foi calculado nenhum erro para dados anteriores)
Exemplo 6: Farmacocinética de extensão no terminal C de DOM1H-131-206
[000172] Estudos adicionais foram realizados para determinar se modificações em DOM1H-131-206 que reduzem ligação em ADA pré- existente resultaram em qualquer mudança na farmacocinética deste dAb. Procedimento de farmacocinética
[000173] A exposição sistêmica de DOM 1H-131-206 e DOM 1H-131- 206 com uma extensão de alanina no terminal C foi determinada em macacos cinomolgos. Grupos separados de 5 macacos cinomolgos foram dosados com materiais de teste por uma infusão intravenosa por 30 minutos. Amostras de plasma foram coletadas até 48 horas após a dosagem e os níveis dos dois materiais de teste determinados por imunoensaio. Resumidamente, anticorpo biotinilado específicos para o material de teste foi adicionado em uma placa microtituladora de 96 poços revestida com estreptavidina, após o que as amostras de plasma de macaco foram adicionadas. TNFR1:Fc humano rotulado com digoxiginina foi adicionado, após o que um anticorpo anti- digoxiginina conjugado com peroxidase de rábano silvestre foi adicionado. Finalmente, substrato de TMB (disponível pelos sistemas R+D) foi adicionado e a quantidade de material de teste determinada por retrocálculo de sinal colorimétrico de uma curva padrão do material de teste.
[000174] Não foi observada nenhuma mudança notável nos parâmetros de exposição sistêmica média de sexo (>2 vezes) quando DOM-1H131-206 foi comparada com DOM-1H131-206 +A em macacos cinomolgos depois de infusão intravenosa. Concluímos que modificações em DOM1H-131-206 pela adição de uma extensão no terminal C (+A) não afeta a farmacocinética do dAb (mostrado na tabela 5). Tabela 5: Farmacocinética de mutantes de DOM1H-131-206 depois de uma dose intravenosa única em macacos cinomolgos
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Exemplo 7a: Expressão de variantes de DOM1H-131-206
[000175] Para determinar se modificações na estrutura de VH que diminuem a ligação em ADA pré-existente têm um impacto na expressão do dAb anti-TNFR1, o rendimento de um painel de variantes modificadas de dAbs DOM1H 131-206 anti-TNFR1 foi comparado com o clone parental depois de crescimento em vasos de fermentação de 1 litro. Os dAbs testes incorporados uma extensão no terminal C (+A ou +ASTKG), com ou sem uma substituição da estrutura (P14A). Os dAbs testes foram expressos na mesma cepa de E. Coli, usando o mesmo vetor de expressão microbiano (pave011 (Avecia)) como a DOM1H 131-206 não modificada (SEQ ID NO 1). A nível de expressão em pequeno escala (1L), o rendimento total para os dAbs com A extensões do terminal C +A ou +ASTKG foi similar ao clone parental não modificado. O rendimento para dAbs com a substituição de P14A e extensão no terminal C (+A ou +ASTKG) foi reduzido comparado com o clone parental não modificado (Tabela 6a).
Procedimento da expressão
[000176] Um estágio de ‘expansão da semente’ foi completado inoculando um frasco de agitação de 100 mL com um frasco de células de E. Coli que expressam o construto de dAb em um vetor de expressão microbiano.
[000177] Depois de aproximadamente 10 horas de crescimento o frasco de semente é usado para inocular um fermentador de 1L. O processo de produção é constituído de três estágios, lote, lote alimentado e indução. A fase de lote inicial dura aproximadamente 13 horas, em cujo tempo a cultura é crescida exponencialmente a 37 °C (reduzida para 30 °C para as últimas 4 horas) até que a fonte de carbono primária, glicerol, fosse esgotada. No momento da depleção de glicerol,°Corre uma dopagem em oxigênio dissolvido (DO) e a alimentação do nutriente se inicia (estágio de lote alimentado). Em torno de 5 horas depois do início da alimentação do nutriente (a um OD600 de 75) a cultura é induzida com IPTG (estágio de indução) e durante esta fase do processo, o produto é produzido e liberado no meio. O lote é interrompido aproximadamente 48 horas depois da indução e a quantidade do dAb no sobrenadante foi quantificada por HPLC. Tabela 6a: Expressão de tituladores de variantes de DOM1H-131-206
Figure img0010
Conclusões deste experimento foram da maneira a seguir: 1) DOM1H-131-206 +A, DOM1H-131-206 +ASTKG e mutantes tipo selvagem exibiram expressão de dAb muito boa. A maior titulação foi cerca de 3.000 mg/L. 2) Mutantes de DOM1H-131-206 P14 +A, e DOM1H-131-206 p14 +ASTKG não expressam dAb no processo. 3) Em geral, DOM1H-131-206 +A e DOM1H-131- 206+ASTKG foram comparável com tipo selvagem em termos do nível de expressão de dAb.
Exemplo 7b: Estabilidade de DOM1H-131-206 com uma alanina no terminal C
[000178] A estabilidade da extensão de alanina no terminal C de DOM 1H-131-206 +A foi determinada em soro humano, homogenato de pulmão ou homogenato fígado medidos usando um imunoensaio validado para DOM 1H-131-206 (descrito a seguir) que detecta DOM 1H-131-206, mas, é reativo cruzado muito fracamente com DOM 1H-131-206+A. Isto é devido ao fato de que o M2.3G10.1G06 do anticorpo de detecção liga fortemente em DOM 1H- 131-206, mas fracamente em DOM 1H-131-206 +A. O formato do ensaio usa TNFR1:Fc humano como um reagente de captura e, portanto, é considerado específico para dAb funcional intacto.
[000179] Observou-se que plasma dopado com 2 μg/mL de DOM 1H- 131-206 +A deu uma leitura de ~6,4 ng/mL neste ensaio, enquanto tampão dopado com 2 μg/mL de GSK2862277 deu uma leitura de 11,3 ng/mL. Assim, reatividade cruzada de DOM 1H-131-206 +A no ensaio de DOM 1H- 131-206 foi estimada entre 0,25-0,5%.
[000180] Para estudar conversão, sangue total humano, homogenato de pulmão humano (10 mg proteína/mL), ou homogenato de fígado humano (10 mg proteína/mL) foram dopados com 1μg/mL tanto de DOM 1H-131-206, DOM 1H-131-206 +A quanto de tampão (nenhum medicamento adicionado). Após incubação tanto por 0,3 hora, 6 horas quanto 24 horas, plasma/sobrenadante foi coletado por centrifugação e amostras congeladas antes do ensaio para DOM 1H-131-206 usando o imunoensaio validado (faixa de trabalho de 0,1 a 10 ng/mL).
[000181] No decurso de 24 horas não houve nenhuma evidência de conversão significativa de DOM 1H-131-206 +A em DOM 1H-131-206 em qualquer matriz, que poderia ter sido evidenciada por sinal de aumento no imunoensaio (devido a formação de DOM 1H-131-206). Isto sugere que a alanina adicional no terminal C não é propensa a clivagem proteolítica rápida. Protocolo para imunoensaio validado de DOM 11H-131-206
[000182] mAb anti-VH biotinilado (M2.3G10.1G06) é diluído em tampão de ensaio (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, BSA 0,1%, Tween 20 0,1%, pH 7,5) e 100 μL foram adicionados a uma concentração final de 10 ng/mL em cada poço de uma placa revestida com neutravidina (Pierce). A placa é vedada e incubada por 1 hora a 37°C.
[000183] A placa microtituladora é lavada 5 vezes com 300 μL de tampão de lavagem (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,1%, pH 7,5) usando um lavador de placa.
[000184] 100 μL por poço de padrões, e amostras diluídas em matriz são adicionados e a placa vedada e incubada com agitação constante por aproximadamente 2 horas a 37°C.
[000185] A placa microtituladora é lavada 5 vezes com 300 μL de tampão de lavagem.
[000186] 100 μL por poço de hTNFR1:Fc rotulado com digoxigenina (1:40.000) são adicionados e a placa vedada e incubada com agitação constante por aproximadamente 2 horas a 37°C.
[000187] A placa microtituladora é lavada 5 vezes com 300 μL de tampão de lavagem.
[000188] 100 μL por poço de anticorpo camundongo anti-digoxigenina rotulado com HRP (Abcam)(1:20.000) são adicionados e a solução, vedada com fita de vedação asséptica, e a placa vedada e incubada com agitação constante por aproximadamente 2 horas a 37°C.
[000189] A placa microtituladora é lavada 5 vezes com 300 μL de tampão de lavagem.
[000190] 100 μL por poço de substrato de TMB (Thermo) são adicionados e a placa é incubada com agitação constante por aproximadamente 5 minutos à temperatura ambiente.
[000191] 100 μL por poço de substrato de solução de parada TMB (Sigma) são adicionados, e a absorbância a 450 nm para cada poço é lida usando uma leitora de placa. A curva padrão é ajustada a um algoritmo logístico parâmetro de 1/x quatro ponderado usando SMS2000 e as amostras desconhecidas são interpoladas a partir da curva.
Exemplo 7c: Capacidade de DOM1H-131-206 com uma extensão de alanina no terminal C (+A) para inibir transdução de sinal de TNFR1:
[000192] Sinais de TNFα através do caminho NFKB e resultados na secreção de várias citocinas incluindo IL-8. Em células não estimuladas, IL-8 RNAm é rapidamente degradado. Entretanto, na presença de TNFα, ativação do caminho NFKB leva à estabilização de IL-8 RNAm. Esta estabilização resulta em um aumento em RNAm e contribui para a indução de secreção de IL-8. Consequentemente, neste ensaio a indução de IL-8 secretado é para determinar se a adição de uma extensão no terminal C afeta a capacidade de DOM1H-131-206 ou DOM1H-131-206+A (isto é, uma extensão de alanina no terminal C) para inibir transdução de sinal de TNFR1. Estes estudos foram realizados em linhagens celulares humano e macaco cinomolgo, e também em sangue total humano e macaco cinomolgo. Comparação de valores IC50 indica que extensão da terminação C de DOM1H-131-206 que diminui a ligação em ADA pré-existente não impacta negativamente a capacidade de DOM1H-131- 206 para inibir transdução de sinal por meio de TNFR1 em células tanto humano quanto de macaco cinomolgo (Tabela 6b).
Protocolo para determinar inibição de IL-8 induzida por TNFα em fibroblastos de pulmão humano
[000193] A capacidade de DOM1H-131-206 ou DOM1H-131-206+A para impedir ligação de TNFα humano em TNFR1 humano e para inibir secreção de IL-8 foi determinada usando células MRC-5 do fibroblasto de pulmão humano (ATCC). Células MRC-5 foram incubadas com as amostras testes por uma hora após o que TNFα (220 pg/mL) foi adicionado. Após incubação a 37°C e 5% de CO2 por 24 horas os sobrenadantes foram colhidos e armazenados a -20°C até que o ensaio MSD™ para IL-8 fosse realizado de acordo com o protocolo do fabricante para amostras de cultura de tecido. Os sobrenadantes foram diluídos 1 em 12 no fornecedor Calibrator Diluent antes do ensaio. Ajuste da curva foi conduzido em GraphPad Prism a fim de determinar o IC50.
Protocolo para determinar inibição de IL-8 induzida por TNFα em células A549
[000194] Células A549 foram semeadas nas placas de 96 poços a uma densidade de 2 x 104 células/poço e incubadas por toda a noite a 37°C e 5% de CO2 para permitir aderência. As células foram então incubadas por uma hora na presença de DOM1H-131-206 ou DOM1H-131-206+A a várias concentrações na faixa de 0,01 nM-1.000 nM. Cada concentração foi testada em poços duplicados. Após incubação a 37°C e 5% de CO2 por 24 horas, os sobrenadantes foram colhidos e armazenados a -20°C até que o ensaio MSD™ para IL-8 fosse realizado, de acordo com o protocolo do fabricante para amostras de cultura de tecido. Os sobrenadantes foram diluídos 1 em 5 no fornecedor Calibrator Diluent antes do ensaio. Ajustes da curva e valores IC50 foram calculados usando XLFit.
Protocolo para determinar inibição de IL-8 induzida por TNFα em células CYNOM-K1
[000195] Células CYNOM-K1 foram incubadas por uma hora na presença de DOM1H-131-206 ou DOM1H-131-206+A a várias concentrações começando a 100 nM. Isto foi seguido por estímulo com TNFα a uma concentração final de 1 ng/mL. Após incubação a 37°C e 5% de CO2 por 24 horas, os sobrenadantes foram colhidos e armazenados a -20°C até que o ensaio MSD™ para IL-8 fosse realizado, de acordo com o protocolo do fabricante para amostras de cultura de tecido. Os sobrenadantes foram diluídos 1 em 12 no fornecedor Calibrator Diluent antes do ensaio. Ajuste da curva foi conduzido em GraphPad Prism a fim de determinar o IC50.
Protocolo para determinar inibição de IL-8 induzida por TNFα em sangue total humano
[000196] Sangue de doadores voluntários saudáveis (com consentimento apropriado de conformidade com o UK Human Tissue Act) foi coletado em heparina de sódio. Meio do ensaio foi preparado adicionando 1% de BSA em meio RPMI-1640 (sem vermelho de fenol). DOM1H-131-206 ou DOM1H- 131-206+A e dAb simulado com VH foram diluídos em placas de 96 poços em meio de ensaio, de maneira tal que, a concentração final depois de adição de sangue poderia ser 800 nM, e diluída serialmente 1 em 2 até 0,01 nM. 130 μL de sangue foram adicionados por poço e as placas foram incubadas por uma hora (37°C, 5% de CO2) para permitir ligação em TNFR1. Amostras de sangue foram então estimuladas com 10 μL de TNFα diluídos em meio de ensaio de maneira tal que a concentração final fosse 10 ng/mL. Cada condição foi testada em duplicata. Após mais 24 horas de incubação (37°C, 5% de CO2), 110 μL de PBS foram adicionados por poço para aumentar o volume das amostras, que foram então agitadas em um agitador de placa por 10 minutos a 500 rpm e centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos. O plasma foi transferido para uma nova placa e armazenado a -80°C até que o ensaio IL-8 MSD™ fosse realizado, de acordo com o protocolo do fabricante para amostras de soro e plasma. Ajustes da curva e valores IC50 foram calculados usando XLFit.
Protocolo para determinar inibição de IL-8 induzida por LPS em sangue total de macaco cinomolgo
[000197] 12 mL de sangue de 4 macacos cinomolgos foram coletados em heparina de sódio. Meio do ensaio foi preparado adicionando 1% de BSA em meio RPMI-1640 (sem vermelho de fenol). DOM1H-131-206 ou DOM1H-131-206+A e dAb simulado com VH foram diluídos em placas de 96 poços em meio de ensaio a 15X concentração final. Cada concentração foi testada em triplicata. 130 μL de sangue foram adicionados por poço e as placas foram incubadas por uma hora (37°C, 5% de CO2) antes de estímulo com 10 μL de LPS diluídos em meio de ensaio de maneira tal que a concentração final fossa 94 ng/mL. As placas foram então incubadas por mais 24 horas (37°C, 5% de CO2). Após a incubação, 110 μL de PBS foram adicionados por poço para aumentar o volume das amostras, que foram então agitadas em um agitador de placa por 10 minutos a 500 rpm e centrifugadas a 2.000 rpm por 5 minutos. O plasma foi transferido para uma nova placa e armazenado a -80°C até que a IL-8 fosse medida usando o ensaio MSD™ para IL-8 humano realizado de acordo com o protocolo do fabricante para amostras de soro e plasma. O plasma não foi diluído no ensaio. Ajustes da curva e valores IC50 foram calculados usando XLFit.
[000198] Tabela 6b: Sumário da potência de DOM1H-131-206 comparada com DOM1H-131-206 +A em ensaios baseados em célula humano e macaco:
Figure img0011
Exemplo 7d: Uso de Anticorpo do domínio de DOM1h-131-206 para tratamento de psoríase
[000199] Nestes estudos, o anticorpo do domínio de DOM1h-131-206 (com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1) foi utilizado, bem como ortólogos roedores deste anticorpo do domínio. Dados obtidos com essas moléculas foram usados para selecionar o protocolo de doses e tratamentos descrito aqui, para ser usado para tratamento de psoríase e placas psoriáticas, em pacientes humanos a ser administrados tanto com molécula fixa de DOM1h-131-206 (com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1), ou ADA DOM1h-131-206 com uma alanina terminal (com as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO: 16), quanto uma molécula fixa de DOM1h131206 ADA compreendendo qualquer ADA fixo (isto é, qualquer modificação para diminuir a ligação de um dAb em ADAs) como é descrito aqui.
[000200] Por exemplo, derivados farmacocinéticos de estudos in vivo com macacos cinomolgos mostraram o que anticorpo do domínio de DOM1h- 131-206 (com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1) tem uma depuração de plasma de 2,4 mL/min/kg, que aproxima da taxa de filtração glomerular (GFR) em macacos e dá uma meia-vida de eliminação de aproximadamente 3 horas. O volume de distribuição para este anticorpo do domínio foi 0,26 L/kg que iguala aproximadamente ao volume extravascular e sugere distribuição fora do compartimento central/plasma. Quando o anticorpo do domínio de DOM1h-131-206 foi administrado em um compartimento extravascular (por exemplo, quando inalado nos pulmões) existe somente uma pequena mudança na meia-vida de eliminação observada, que reflete cinética que limita a taxa de absorção.
[000201] Além disso, após a dosagem intradérmica de um dAb anti- TNFR1 ortólogo de roedor (“Dom1 m-15-12”) em camundongos, um atraso de absorção ainda maior foi observado. Isto pode ter sido devido a uma maior diferença entre a GFR e depuração da taxa de absorção após a dosagem por meio da via intradérmica. A taxa de eliminação terminal observada em plasma de camundongo foi aproximadamente 40 minutos que foi maior que aquela após a distribuição intravenosa (aproximadamente 20 minutos). A menor taxa de eliminação (Ke) vista em plasma após distribuição intradérmica foi corroborada pelo PK de tecido dérmico que mostrou um taxa de eliminação terminal de 5-7 horas (Ke 0,1-0,14 h-1), embora a fração da dose acionada a taxa de eliminação aparentemente prolongada tenha sido estimada pequena (0,5%). Taxa de absorção dérmica (Ka) no plasma foi definida a partir de um estudo de rato com dosagem intradérmica de um dAb ortólogo de roedor e foi relativamente rápida (Ka=4,11 h-1) resultando em um Tmax observada a aproximadamente 1 hora após a dose. Estimou-se que 10% do anticorpo do domínio tenham ficado retidos no compartimento dérmico em rato com uma taxa de eliminação suposta da pele similar ao camundongo. Assim, parece que após injeção intradérmica, o anticorpo do domínio de DOM1h-131-206 distribui em tecidos vascularizados na pele (por exemplo, na derme) onde é rapidamente extraído no plasma e é eliminado por meio de filtração renal. A fase de distribuição e absorção inicial através dos tecidos da pele é refletida no tempo de atraso de absorção antes de exposições de plasma ficar mensurável. Dado às diferenças anatômicas entre a pele de roedor e humano, espera-se que a taxa de absorção em humanos seja maior que, por sua vez, levaria a exposição de plasma menor/incomensurável do anticorpo do domínio de DOM1h-131-206. Isto significa que previsões de exposição de plasma humano são baseadas em observações dos estudos de roedor e, portanto, servem como uma estimativa conservadora de exposição de plasma em humanos.
[000202] O anticorpo do domínio de DOM1h-131-206 (com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1) foi também dosado para voluntários saudáveis por meio de infusão intravenosa (duração de até 3 horas) até 2 mg/kg e em uma experiência em andamento por meio de inalação em voluntários saudáveis. Parâmetros farmacocinéticos derivados foram no geral em concordância muito boa com dados pré-clínicos em macacos cinomolgos. Após administração intravenosa, depuração foi entre 0,6-1,5 mL/min/kg (GFR em humano aproximadamente 1,8 mL/min/kg) com uma meia-vida resultante de eliminação de 5 horas. Volume de distribuição, aproximadamente 0,3 L/kg, foi similar ao volume extravascular. Distribuição rápida do anticorpo do domínio de DOM1h-131-206 no compartimento extravascular foi confirmada por meio de uma medição de lavagem bronquioalveolar (fluido do revestimento epitelial do pulmão) após administração IV. Níveis de fluido extravascular no pulmão foram aproximadamente 4-14% de níveis de plasma medidos a 5 horas a partir do início da dosagem após uma infusão de 3 horas.
[000203] Previsões de eficácia em humanos foram estimadas com base na exposição observada e prevista, estimadas no compartimento dérmico e dados da linhagem celular in vitro humano. Faixas IC50 (8-40 ng/mL) nesses sistemas in vitro (complexidade e tipo de célula variados) foram usadas como níveis de pico visados no compartimento dérmico e facilitaram seleção das doses de anticorpo do domínio e protocolos de tratamento para o tratamento de psoríase, e placas psoriáticas, em pacientes humanos descritos aqui. Por exemplo, a dose de partida de 0,5 mg foi escolhida para obter uma exposição de plasma, considerando uma pior das hipóteses de exposição sistêmica, menor que aquela obtida no estudo intravenoso de FTIH onde agonismo foi observado em sujeitos positivos de ADA. Nesta dose de partida inicial espera- se que a sinalização mediada por TNFR1 seja inibida em uma zona discreta em torno do sítio de injeção (área superficial < 2 cm2) a um nível de > 90% imediatamente depois da dosagem. Inibição de TNFR1 com o tempo depende da quantidade de medicamento distribuída, retida e então eliminada do compartimento dérmico. Considerando um mínimo (10% de retenção dérmica e Ke 0,1-0,14 h-1 como em rato), esperou-se que níveis fossem mantidos > IC50 (em uma zona de injeção/teste) por um mínimo de 3 dias após uma injeção intradérmica de 0,5 mg do anticorpo do domínio de DOM1h-131-206.
[000204] Para seleção de doses de anticorpo do domínio e protocolos de tratamento, foram feias previsões de exposição de plasma humano após a dosagem intradérmica do anticorpo do domínio de DOM1h-131-206. Essas previsões consideraram a máxima exposição possível que poderia ser obtida para uma injeção intradérmica. Dados de tempo-concentração de plasma humano real de anticorpo do domínio de DOM1h-131-206 intravenosamente administrado foram usados em um modelo PK dérmico humano com uma taxa de absorção fixa (ajustada na escala a partir da absorção dérmica de roedor) e uma biodisponibilidade de 100%. O perfil de tempo-concentração de plasma humano para a(s)s dose(s) máxima(s) de domínio e os protocolos de tratamento descritos aqui (2 mg semanalmente + 0,5 mg duas vezes por semana) foi então examinado. Isto revelou que as concentrações plasmáticas de pico previstas atingem Tmax rapidamente em 30 minutos após a dose, e os níveis caem rapidamente para níveis abaixo do limite mais baixo atual de ensaio de plasma de quantificação (0,1 ng/mL) em 24 horas. Não foi esperado nenhum acúmulo na dosagem repetida em plasma mesmo usando esta previsão de exposição máxima possível. Entretanto, esta previsão representa a mais alta exposição possível de plasma e é possível que exposições possam ser significativamente menor que a prevista e, mesmo assim baixa, esta exposição de plasma pode não ser mensurável. Usando níveis de inibição alvo (com base em ensaios baseados em célula in vitro) previu-se que a níveis de IC90 (imediatamente após a dose) ou IC50 (pico) na pele nenhum protocolo de tratamento descrito aqui será na faixa de 30-80 ng/mL ou 8-40 n/mL respectivamente.
[000205] Com base na informação mencionada, as exposições de plasma previstas (Cmax e AUC) para a dose primeira, dose diária máxima e dose cumulativa, durante 28 dias, são mostradas a seguir na tabela 6b junto com as margens de segurança com relação a segurança pré-clínica. Tabela 6b:
Figure img0012
[000206] No dia 14 estudo de toxicologia de boas práticas de laboratório de cinomolgos de dose repetida em macacos machos (20 mg/kg/dia) com base em exposições médias de macho (dias 1,4 e 14) (Cmax e AUC(0-24h) de 48.5 ug/mL e 249 ug^h/mL respectivamente).
[000207] Finalmente, a informação apresentada anteriormente a partir dos estudos in vitro, estudos in vivo e as análises relacionadas foi usada para selecionar as doses de anticorpo do domínio e protocolos de tratamento usados no tratamento de psoríase em pacientes humanos.
[000208] A administração dos anticorpos do domínio, de acordo com um protocolo de tratamento, da maneira descrita aqui é usada no tratamento de psoríase. A eficácia do anticorpo do domínio para tratar psoríase, tal como em um protocolo de tratamento particular, pode ser confirmada tanto por medição de placas com sonografia e/quanto avaliações clínicas.
[000209] Sonografia, medições a base de ultrassom de alta frequência podem ser realizadas usando um sonógrafo de alta frequência de 20 MHz (DUB USB, Taberna pro Medicum, Lueneburg). Varreduras A em série podem ser compostas e apresentadas em um monitor como uma seção da pele. Uma resolução lateral de aproximadamente 200 μm e uma resolução axial de 80 μm são possíveis e preferidas. Dependendo dos padrões de eco, componentes da epiderme, derme e subcutâneo são apresentadas e é possível medição exata de espessura de pele. O infiltrado psoriático inflamatório no sítio da placa psoriática é visto como uma banda brilhante de eco claramente definível abaixo do eco de entrada. A espessura da banda psoriática brilhante do eco pode ser determinada e documentada antes da administração de um anticorpo do domínio e depois da administração de um anticorpo do domínio. Esta espessura pode ser medida em μm. Uma diminuição na espessura da banda psoriática ecolucente depois da administração de um anticorpo do domínio demonstra que a administração de um anticorpo do domínio, tal como de acordo com um protocolo de tratamento descrito aqui, foi eficaz no tratamento de psoríase, e uma placa psoriática, em um paciente humano. Vide, por exemplo, Bangha et al., 9 Skin Pharmacol. 298 (1996).
[000210] Avaliação clínica pode ser realizada usando uma classificação de 5 pontos determinada por comparação na clínica de uma placa psoriática tratada na qual um anticorpo do domínio foi injetado com pelo menos uma placa não tratada próxima à placa psoriática tratada. De acordo com esta comparação, as pontuações de avaliação clínica seguintes são designadas (pontuações de avaliação clínica são 0 por definição antes da primeira administração de um anticorpo do domínio): -1 = piorada 0 = não mudada (nenhum efeito) 1 = leve melhora 2 = melhora claramente, mas, não completamente curada 3 = completamente curada.
[000211] Assim, nesta base, uma classificação de avaliação clínica aumentada depois da administração de um anticorpo do domínio, de acordo com um protocolo de tratamento da maneira descrita aqui, indica eficácia no tratamento de psoríase, e uma placa psoriática, em um paciente humano.
Exemplo 8: Extensões de alanina única para clones de VHH.
[000212] Ligação de ADA em VHH foi observada usando o ensaio de confirmação usado no exemplo 2 (para DOM1H-131-206). A fim de confirmar que inibição de ligação similar em ADA poderia ser obtida modificando sequências de VHH, três clones de VHH com sequências de aminoácidos mostrados na figura 2 (d), (e) e (f) foram testados:
[000213] Clone VHH2(d) tem um formato biespecífico, com um módulo de ligação de IL6R ligado por GGGGSGGGS em um módulo de ligação de albumina de soro humano descrito em WO2010100135. (A sequência de aminoácidos é mostrada na figura 2 d: SEQ ID NO 4).
[000214] Clone VHH2(e) tem um formato biespecífico, com módulo de ligação de TNF ligado em um módulo de ligação de albumina de soro, por sua vez, ligado em um módulo de ligação de TNF, usando GGGGSGGGS como ligante descrito em WO2010077422. (A sequência de aminoácidos é mostrada na figura 2 e: SEQ ID NO 5).
[000215] Clone VHH2(f) tem um formato monoespecífico bivalente compreendendo dois módulos idênticos ligados por um ligante Ala-Ala-Ala, cada módulo é um dAb que pode ligar no domínio A1 do fator de Von- Willebrand, mostrado em WO2009115614A2. (A sequência de aminoácidos é mostrada na figura 2 f: SEQ ID NO 6).
[000216] Todos os três clones mencionados foram modificados pela adição de uma alanina no terminal C no resíduo de serina final, e os clones modificados e não modificados foram comparados usando o ensaio do exemplo 2. Como pode-se ver a seguir na tabela 7 e figura 4, os resultados mostram que extensão no terminal C por um resíduo de aminoácido de alanina única diminui a ligação em ADA.
Figure img0013
Exemplo 9: Frequência de sujeitos saudáveis com ADA pré-existente em uma faixa de moléculas a base dAb da VH e VL Procedimento do ensaio de ADA
[000217] Similarmente ao procedimento descrito no exemplo 1 para DOM1H-131-206, moléculas de teste (DOM 1H-131-206 (SEQ ID NO 1), DOM 1H-131-206 + extensão de alanina no terminal C (SEQ ID NO 16), mAb-VH (SEQ ID NO), uma sequência Peptídeo-VL, VH-VL (SEQ ID NO 11), a molécula ‘735 (SEQ ID NO 30 e 31), foram biotiniladas, passaram por uma troca de tampão e foram armazenadas em tampão de formulação. Estas moléculas de teste foram também rotuladas com rutênio e então passaram por uma troca de tampão e foram armazenadas em tampão de formulação.
[000218] O anticorpo de antimedicamento (ADA) para cada molécula é um ensaio de ligação realizado na plataforma da tecnologia MSD ™ ECL (eletroquimioluminescência) descrito anteriormente.
[000219] O sumário de procedimento de ensaio usado neste experimento é descrito a seguir: 1. Uma placa de estreptavidina de MSD™ é bloqueada com 150 μL/poço de caseína de bloqueio em PBS (1%) à temperatura ambiente (RT) por 1-2 horas. O bloqueador é removido sem lavagem. 2. Depois de uma pré-incubação de 1 hora, uma mistura homogênea contendo 0,1 μg/mL de molécula de teste biotinilada, 0,1 μg/mL de molécula de teste rutenilada (“Sulfo-Tag” ™), e 2% de amostra de soro em diluente do ensaio (1% de caseína em PBS) é transferida para a placa de MSD ™ e incubada por 1 hora ± 5 minutos a RT. 3. A placa de MSD é então lavada 3 vezes com PBST. 4. 150 μL/poço de tampão de leitura são adicionados e a placa é lida.
[000220] As concentrações e tempos de incubação anteriores foram usadas para moléculas de DOM1H-131-206.
[000221] Versados na técnica perceberão que as concentrações e tempos de incubações precisas serão otimizados, por exemplo, a DOM1H-131-206 (e versões modificadas) pode ter concentrações ligeiramente diferente e tempos de incubações comparados com, por exemplo, uma DOM10H-53-567 ou uma sequência de Peptídeo-VL.
[000222] Um painel de 100 amostras de soro de doador humano saudável foi classificado para reatividade no ensaio. Anticorpos pré-existentes (ADA) contra o estrutura de cadeia leve variável (VL) foram também detectados em amostras de soro humano normal, embora a magnitude e frequência mais baixas do que o que foi previamente observado contra domínios VH e VHH (vide Figura 4). Os resultados são mostrados na figura 5 onde o eixo Y mostra níveis de ligação em ADA s e dAbs de VH teve a mais alta incidência de ligação em ADA.
[000223] Conclusões foram: resultados mostrados na figura 5 mostram o nível de ligação de ADAs pré-existentes em DOM 1H-131-206 e o efeito de adicionar uma extensão do terminal C na ligação da DOM 1H -131-206 modificada em ADAs. Pode-se também observar a partir da figura 5 que ligação de ADAs pré-existentes em um dAb de VH foi também observada quando é fundido em um mAb (mAb-VH). Figura 5 também mostra que existem ligação de ADAs pré-existentes em dAbs V capa (Vk) (VL) e exemplos mostrados incluem fusões de peptídeo:VL, VH-VL e uma fusão de mAb-VL Exemplo 10: Extensões de aminoácido na estrutura VL
[000224] Uma vez que anticorpos pré-existentes contra a estrutura VL (Vk) foram também detectados em amostras de soro humano normal, embora a um nível no geral mais baixo que foi observado na estrutura de VH (vide Figura 5), foi determinado se modificações da região terminal C de dAbs Vk poderiam reduzir ligação em ADA pré-existente, como foi demonstrado para moléculas contendo VH.
[000225] Com base em um mAb:ligante: molécula de VL (dAb designado ‘735 - esta molécula é “mAbdAb” - é um IL-13mAb:ligante:IL-4 (cromossomo Capa)), um painel de teste mAb:ligante: moléculas de VL foi gerado por mutagênese direcionada ao sítio padrão, e que conteve a mesma sequência dAb da VL, mas tem várias modificações no terminal C para o dAb da VL. Estes materiais de teste designados ‘15014’, ‘15019’, ‘15020’ e ‘15021’ foram modificados por engenharia par ater uma extensão no terminal C (+AAA, +T ou +TV), ou para ter um deleção (-R) no terminal C (mostrado a seguir na tabela 8).
[000226] Materiais de teste foram ensaiados usando um ‘ensaio de confirmação’ descrito a seguir, similar ao descrito previamente para dAbs de VH. Teste do composto foi realizado avaliando a capacidade de compostos individuais de competir com compostos específicos do ensaio rotulados para ligar em anticorpos pré-existentes. Qualquer redução potencial em sinal de ensaio foi reportado como% de inibição. Porcentagem de níveis de inibição maior que o ponto de corte confirmatório previamente determinado para este ensaio particular sugere que o teste composto compete com o composto específico do ensaio para ligar em anticorpos anti-Vk, e assim pode compartilhar epítopo(s) com o composto específico do ensaio. Procedimento do ensaio da confirmação de ADA ‘735 usado para medir a frequência de ADA pré-existente em V capa: 1. Em um placa de ensaio microtituladora, 2% de amostra de soro positivo de ADA em diluente do ensaio (1% de caseína em PBS) são incubados por 1 hora ± 5 minutos a RT com um concentração final de 10 μg/mL ‘735 ou outro material de teste tal como dAbs modificados. 2. Depois de pré-incubação por 1 hora, uma mistura homogênea contendo 0,05 μg/mL de ‘735 biotinilado e 0,05 μg/mL de ‘735 rutenilada (“Sulfo-Tag” ™), em diluente do ensaio (1% de caseína em PBS) é adicionada na placa de ensaio e incubada por toda a noite a RT. 3. Depois da incubação, a placa de MSD é então lavada 3 vezes com PBST, as amostras do ensaio são transferidas para a placa de MSD, e a placa é incubada por 1 hora ± 5 minutos no escuro a RT. 4. A placa de MSD™ é então lavada 3 vezes com PBST 5. 150 μL/poço de tampão de leitura são adicionados e a placa é lida.
[000227] Os resultados dessas classificações do composto estão apresentados na tabela 8. Todas as modificações no terminal C testadas (+AAA, +T, +TV e -R) mostraram menor inibição na ensaio de confirmação de‘735. Isto sugere que modificações no terminal C para dAbs de VL provocam ablação da ligação de anticorpos pré-existentes (ADAs) de uma maneira similar ao dAbs de VH. Tabela 8: Avaliação de ligação em ADA de mutantes ‘735 de mAb:VL
Figure img0014
Exemplo 11: Extensões de aminoácido na estrutura de VH de DOM10H-53- 567 (dAb anti-IL-13)
[000228] Uma vez que modificações no terminal C para o dAb anti- TNFR1 de VH DOM 1H-131-206 diminuiu a ligação em ADA pré-existente, foi determinado se modificação do terminação C poderia reduzir ligação em ADA para uma diferente molécula de VH. Modificações no terminal C foram feitas na estrutura de VH de DOM10H-53-567 por técnicas padrões de mutagênese direcionada ao sítio. Moléculas com substituições (materiais de teste) foram ensaiadas usando o ‘ensaio de confirmação’ descrito previamente.
[000229] Extensões da terminação C de DOM10H-53-567 também reduziram significativamente a ligação em ADA pré-existente (resultados mostrados a seguir na tabela 9). Isto é exemplificado pelas extensões A, AS, AST, ASTK, ASTKG e ASTKG. Essas modificações não impactam negativamente a capacidade de clones de DOM10H-53-567 ligarem e inibirem seus IL-13 do antígeno alvo conforme confirmado pela atividade de dAb de IL-13 ensaio descrito a seguir e resultados mostrados na tabela 9b. Tabela 9a: Avaliação de ligação em ADA de DOM10H-53-567 mutantes
Figure img0015
Protocolo de ensaio da atividade de dAb de IL-13:
[000230] Um bioensaio foi usado para medir a capacidade de variantes de moléculas de DOM10H-53-567 de inibir produção de fosfatase alcalina estimulada por IL-13 humano recombinante em células in vitro HEKBlue- STAT6. Células HEK-STAT6 (Invivogen) (que expressam fosfatase alcalina embriônica secretada (SEAP) sob o controle de um promotor dependente de STAT6) foram plaqueadas em placas de 96 poços. IL-13 humano a 3 ng/mL de concentração e uma série de diluição de moléculas de DOM1-H-53-567 foram pré-equilibradas por 1 hora à temperatura ambiente e então adicionadas nas células por 24 horas a 37 °C. Após incubação, concentrações de sobrenadante de SEAP produzido pelas células em decorrência de estímulo de IL-13, foram determinadas por adição de Quanti-Blue (Invivogen) e obtendo uma densidade leitura ótica a 640 nm. Valores IC50 foram calculados a partir das curvas de resposta a dose usando Graphpad Prism.
[000231] Tabela 9b: Avaliação de atividade para mutantes de DOM10H-53-567
Figure img0016
[000232] Extensões da terminação C de DOM10H-53-567 que diminuem ligação em ADA pré-existente não impactam negativamente a capacidade de DOM10H-53-567 dAbs de ligar e inibir seu antígeno alvo (humano IL-13).
Exemplo 12a: Clonagem de moléculas anti-VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb com terminação C modificada
[000233] Os dAbs de Vh-Vk dAb-Fc com modificações feitas na terminação C da porção dAb Vk: DMS30047-30054 foram modificados por engenharia gerando as sequências variantes de dAb Vk por PCR e então por ré-clonagem em DMS30045 (SEQ ID NO 40) e DMS30046 (SEQ ID NO 41), respectivamente para gerar os vetores de expressão de mamífero modificados. A partir de DMS30045: (i) o resíduo de arginina do terminal C foi removido para gerar DMS30047 (DMS30037 -R), (ii) uma alanina no terminal C foi adicionada para gerar DMS30048 (que é DMS30037 + A) (SEQ ID NO 43), (iii) três alaninas no terminal C foram adicionadas para gerar DMS30049 (DMS30037 + AAA) (SEQ ID NO 44), e uma treonina no terminal C foi adicionada para gerar DMS30050 (DMS30037 + T) (SEQ ID NO 45). A partir de DMS30046 (SEQ ID NO 41): (i) o resíduo de arginina do terminal C foi removido para gerar DMS30051 (DMS30038 -R) (SEQ ID NO 46), (ii) uma alanina no terminal C foi adicionada para gerar DMS30052 ((DMS30038 + A) (SEQ ID NO 47), (iii) três alaninas no terminal C foram adicionados para gerar DMS30053 (DMS30038 + AAA) (SEQ ID NO 48), e uma treonina no terminal C foi adicionada para gerar DMS30054 (DMS30038 + T) (SEQ ID NO 43).
[000234] Descrições das moléculas mencionadas são da maneira a seguir:
[000235] DMS30045: dAb de DOM15-26-597 N-(ligante VEPKSSDK) & dAb de K-044-085 do terminal C ((TGLDSP)x4), DMS30046: DMS1576 com dAb de K-044-085 do terminal C ((TGLDSP)x4), DMS30047 (contém terminação C modificada): dAb de DOM15-26-597 N-(ligante VEPKSSDK) & menos C dAb de K-044-085 do terminal C-termo R ((TGLDSP)x4), DMS30048 (contém terminação C modificada): dAb de DOM15-26-597 N- (ligante VEPKSSDK) & dAb de K-044-085 do terminal C + A ((TGLDSP)x4), DMS30049 (contém terminação C modificada): dAb de DOM15-26-597 N-(ligante VEPKSSDK) & dAb de K-044-085 do terminal C +AAA ((TGLDSP)x4), DMS30050 (contém terminação C modificada): dAb de DOM15-26-597 N-(ligante VEPKSSDK) & dAb de K-044-085 do terminal C +T ((TGLDSP)x4), DMS30051 (contém terminação C modificada): DMS1576 com menos C dAb de K-044-085 do terminal C- termo R ((TGLDSP)x4), DMS30052 (contém terminação C modificada): DMS1576 com dAb de K-044-085 do terminal C + A ((TGLDSP)x4), DMS30053 (contém terminação C modificada): DMS1576 com dAb de K- 044-085 do terminal C +AAA ((TGLDSP)x4), DMS30054 (contém terminação C modificada): DMS1576 com dAb de K-044-085 do terminal C +T ((TGLDSP)x4) (sequências de aminoácidos das moléculas são mostradas na figura 12 e SEQ ID NO 40-49).
Exemplo 12B: Modificações na região do terminal C das moléculas tipo halteres da VEGF Vk dAb, DMS30037 e DMS30038 têm baixa ligação em anticorpos pré-existentes
[000236] Procedimento de ensaio de confirmação de ADA V capa usado para medir a frequência de ADA pré-existente em V capa: 1. Em uma placa de ensaio microtituladora, 10% de amostra de soro positivo de ADA em diluente do ensaio (1% de caseína em PBS) são incubados por 1 hora ± 5 minutos a RT com uma concentração final de 10 μg/mL do material de teste, tais como dAbs modificados. 2. Depois da pré-incubação por 1 hora, o soro positivo de ADA/material de teste é adicionado em uma placa de ensaio com uma mistura homogênea contendo dAb V capa biotinilado (não modificado) e dAb ‘V capa rutenilada (“Sulfo-Tag” ™) (não modificado) para um concentração final de cerca de 0,025 μg/mL de dAb biotinilado, cerca de 0,0125 μg/mL de dAb rutenilado (“Sulfo-Tag” ™), e 5% de soro positivo de ADA em diluente do ensaio (1% de caseína em PBS). A placa é incubada por 1 hora ± 5 minutos a RT. 3. Uma placa de estreptavidina de MSD™ é bloqueada com 150 μL/poço de caseína de bloqueio em PBS (1%) à temperatura ambiente (RT) por 1-2 horas. O bloqueador é removido sem lavagem. 4. Depois da pré-incubação por 1 hora, a mistura homogênea é adicionada em uma placa de ensaio de estreptavidina de MSD™ e incubada por 1 hora ± 5 minutos a RT. 5. Depois da incubação de 1 hora, a placa de MSD é então lavada 3 vezes com PBST, as amostras do ensaio são transferidas para a placa de MSD, e a placa é incubada por 1 hora ± 5 minutos no escuro a RT. 6. A placa de MSD™ é então lavada 3 vezes com PBST 7. 150 μL/poço tampão de leitura são adicionados e a placa é lida.
[000237] Versados na técnica perceberão que as concentrações e tempos de incubações precisas nos ensaios de confirmação serão otimizados, por exemplo, a 1H-131-206 (e versões modificadas) pode ter concentrações e tempos de incubações ligeiramente diferentes comparadas com uma DOM10H-53-567.
[000238] Os resultados dessas classificações do composto estão apresentados na tabela 9B a seguir. Todas as modificações no terminal C testadas no dAb V capas (+T, +A, +AAA e -R) mostraram menor inibição no ensaio de confirmação‘697 anterior. Isto sugere que modificações no terminal C nesses dAb V capas reduzem a ligação de anticorpos pré-existentes (ADAs) de uma maneira similar ao DAbs Vh. Tabela 9b: Avaliação de ligação em ADA de DMS3007 e mutantes de DMS3008
Figure img0017
Exemplo 13: Expressão de moléculas anti-VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb com terminação C modificada (DMS30047-30054)
[000239] Plasmídeos de expressão que codificam as moléculas anti- VEGF dAb-Fc-dAb relevantes descritas anteriormente no exemplo 12a foram transientemente transfectados para células HEK293 6E e expressos na escala de 500 mL para produzir as moléculas de fragmento do anticorpo usando o método descrito a seguir neste exemplo. Níveis de expressão de >30 mg/L de sobrenadante foram rotineiramente obtidos.
[000240] As sequências de dAb foram clonadas na terminação N ou C de um Fc genérico do isotipo do IgG1 humano em um vetor de expressão de mamífero. Os dAbs foram ligados no Fc usando uma sequência ligante: o ligante do terminal N foi tanto AAAS, quanto TVAAPS e o ligante do terminal C foi tanto ((GS(TVAAPSGS)x3), quanto domínio de albumina 3.
Exemplo 14: Purificação moléculas anti-VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb- com terminação C modificada
[000241] As moléculas de dAb-Fc-dAb tiveram afinidade purificada a partir dos sobrenadantes, conforme descrito para o exemplo anterior.
Exemplo 15: Análise molecular por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) de moléculas anti-VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb com terminação C modificada
[000242] A integridade molecular, homogeneidade e% de pureza das moléculas anti-VEGF dAb-Fc-dAb que foram purificadas foram então analisadas por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho analítica (SEC). As proteínas foram assim confirmadas ter >95% de proteína alvo pura e por SDS-PAGE e SEC antes da análise adicional em ensaios de biologia.
Exemplo 16: Ligação de moléculas anti-VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb com terminação C modificada no VEGF em Biacore.
[000243] A afinidade de ligação de certas moléculas anti-VEGF dAb- Fc-dAb, (com pequenas modificações no terminal C), para VEGF165 foi determinada por ressonância dePlasmon de superfície (SPR) usando um Biacore T100. Proteína A foi imobilizada em um chipe C1 por acoplamento de amina primária e esta superfície foi então usada para capturar os construtos anti-VEGF. VEGF165 recombinante humano (originada ‘em casa" a partir da transfecção transiente de células HEK293) foi usado como o analito a 32 nM a 0,03125 nM em uma série de diluição de 4 vezes. Todas as curvas de ligação foram referenciadas duplamente com uma injeção de tampão (isto é, 0 nM) e os dados foram estabelecidos a modelo 1:1 inerente ao T100. Regeneração foi realizada usando NaOH 50 mM. O corrida foi realizada a 37 °C, usando HBS-EP como o tampão de corrida. Os dados obtidos são mostrados nas tabelas 10A, 10B & 10C. A partir dos dados na tabela 10A, o comportamento de DMS30037 e diversas variantes modificadas na terminação C: DMS30037+A (DMS30048), DMS30037+AAA (DMS30049), e DMS30037+T (DMS30050) (vide exemplo 12a para detalhes adicionais dessas moléculas) parece comparável em Biacore e as modificações no terminal C não parecem reduzir potência sobre o parental.
[000244] Um conjunto de dados adicionais é mostrado na tabela 10B onde o desempenho tanto de DMS30037 quanto DMS30038 foi comparado com variantes modificadas na terminação C: DMS30037-R, (rotulada como +R (DMS30047), DMS30037+T (DMS30050) e DMS30038-R, (rotulada como +R (DMS30051) e Bevacizumab (Avastin) no Biacore. Neste conjunto de dados novamente o comportamento de todas as moléculas parece comparável em Biacore e as modificações no terminal C não parece reduzir potência sobre o parental. Dados significativos não poderiam ser capturados sem ser para ver a curva para Avastin. Um conjunto de dados adicionais é exibido na tabela 10C onde as moléculas DMS30037 e DMS30038 foram comparadas com variantes modificadas na terminação C: DMS30037-R, (DMS30047), DMS30037+T (DMS30050), DMS30038-R, (DMS30051) e DMS30038+T (DMS30054) e Bevacizumab (Avastin). Novamente o comportamento de todas as moléculas de dAb-Fc-dAb parece comparável em Biacore e as modificações no terminal C não parecem reduzir a potência sobre o parental. Neste conjunto de dados, vide a tabela 10C, os dados Bevacizumab (Avastin) não poderiam ser devidamente medidos devido à taxa de dissociação ser muito apertada. Tabela 10A: Ligação da molécula anti-VEGF dAb-Fc-dAb: DMS30037 com modificações no terminal C par VEGF165 e comparação com DMS30037.
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Tabela 10B: Ligação das moléculas anti-VEGF dAb-Fc-dAb: DMS30037 e DMS30038 com modificações no terminal C para VEGF165 e comparação com dAb-Fc-dAb parental e Bevacizumab (Avastin).
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Tabela 10C: Ligação das moléculas anti-VEGF dAb-Fc-dAb: DMS30037 e DMS30038 com modificações no terminal C para VEGF165 e comparação com dAb-Fc-dAb parental e Bevacizumab (Avastin).
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Exemplo 17: Ensaio de ligação do receptor VEGF R2 de moléculas anti- VEGF Vh/Vk de dAb-Fc-dAb com terminação C modificada
[000245] As potências de moléculas anti-VEGF_Vh/Vk dAb-Fc-dAb baseadas em DMS30037 e DMS30038, mas com modificações no terminal C, foram comparadas tanto com o molécula tipo selvagem quanto Bevacizumab (Avastin), no ensaio de ligação do receptor 2 de VEGF, (R2), usando o método modificado, isto é, sem nenhuma pré-incubação, descrito a seguir neste exemplo. Os dados são mostrados na tabela 11A, todas as moléculas de dAb-Fc-dAb testadas: DMS30037, DMS30037+T (DMS30050), DMS30037- R (DMS30047), DMS30038, DMS30038-R (DMS30051), pareceram ser de potência comparável e consideravelmente mais potente do que Bevacizumab (Avastin), Tabela 11A. Houve pouca variação na inibição de porcentagem máxima obtida pelas moléculas no ensaio, com todas as moléculas obtendo >93-98% de inibição máxima (dados não mostrados).
[000246] Dados adicionais foi gerados comparando os dAb-Fc-dAbs: DMS30038, DMS30038+T, (DMS30050) e DMS30038-R, (DMS30051) com Bevacizumab (Avastin), no mesmo formato do ensaio, os dados foram exibidos na tabela 11B. A partir dos dados, DMS30038 e suas variantes do terminal C, (Tabela 11B), têm potências similares julgadas por valores EC50 no ensaio RBA e parecem ser consideravelmente mais potentes do que Bevacizumab (Avastin) por estes critérios. Houve pouca variação na inibição de porcentagem máxima obtida pelas moléculas no ensaio com todas as moléculas obtendo >94% de inibição máxima, (dados não mostrados).
[000247] Ensaio de ligação do receptor de VEGF R2: As potências foram analisadas no ensaio de ligação do receptor de VEGF em comparação a aquele de Bevacizumab (Avastin). Este ensaio mede a ligação de VEGF165 tanto em VEGF R1 quanto VEGF R2 e a capacidade de as moléculas de teste bloquearem esta interação. Uma placa de 96 poços ligada no padrão MSD (L11XA-3) foi revestida com 0,25 μg/mL de VEGF R1 (R&D Systems 321- FL) ou VEGF R2 (R&D 357-KD) em tampão de bicarbonato (50 μL/poço), coberta com um selador de placa e incubada por toda a noite a 4 °C. No dia seguinte a placa de MSD foi lavada 3x 300 μL/poço com tampão de lavagem Tris e manchada sobre uma almofada de tecido para remover excesso de tampão de lavagem dos poços. A placa de MSD foi então bloqueada com 3% de BSA em PBS (250 μL/poço) e incubada agitando (750 RPM) à temperatura ambiente por 1 hora. A placa de MSD foi lavada novamente antes da adição de uma concentração 2x de molécula anti-VEGF (25 μL/poço) e incubada com agitação (750 RPM) à temperatura ambiente por 10 minutos antes da adição de uma concentração 2x de rhVEGF, 25 μL/poço, R&D Systems (293-VE/CF, produzido em células de inseto usando Baculovírus) ou uma fonte GSK ‘em casa' de VEGF (produzido das células HEK293 de mamífero, dados posteriores não mostrados exceto Tabela 3A). As moléculas anti-VEGF e as VEGF foram preparadas usando BSA 0,1% em PBS. O ensaio inicial foi realizado com uma etapa na qual a molécula anti- VEGF foi pré-incubada com VEGF. As pré-incubações foram preparadas adicionando um volume igual de uma concentração 2x de molécula anti- VEGF em um volume igual de uma concentração 2x de VEGF (R&D, 293- VE/CF) por 30 minutos à temperatura ambiente. A concentração final de VEGF usada foi 10 ng/mL. Nenhum controle VEGF e VEGF sozinhas foi também incluído. A placa de MSD foi incubada com agitação (750 RPM) à temperatura ambiente por 2 horas após o que, ela foi lavada novamente antes da adição do reagente de detecção (50 μL/poço, anticorpo biotinilado de VEGF de cabra anti-humano - R&D Systems BAF293) a 0,25 μg/mL em 1% de BSA em PBS e incubada com agitação (750 RPM) à temperatura ambiente por 1 hora. A placa de MSD foi lavada novamente antes da adição do estreptavidina sulfo-TAG (50 μL/poço, MSD R32AD-1) a 2 μg/mL em 1% de BSA em PBS e incubada com agitação (750 RPM) à temperatura ambiente por 30 minutos. Antes da medição da eletroquimioluminescência em um MSD Sector Imager 6000, a placa de MSD foi lavada e 150 μL/poço de Tampão de leitura T 2x (MSD R92TC-1) foram adicionados. Ajuste da curva e cálculos EC50 foram realizados usando GraphPad Prism. A capacidade das moléculas anti-VEGF e Bevacizumab de teste (Avastin) para inibir ligação de VEGF em VEGFR1 e VEGFR2 foi determinada da maneira descrita.
[000248] Método modificado: Um segundo ensaio foi realizado por meio do qual o agente anti-VEGF e o VEGF não foram pré-incubados antes da adição no placa de MSD revestidas com o receptor de VEGF. Este ensaio foi realizado e somente usado VEGF originado de R&D Systems, (293- VE/CF). A capacidade de as moléculas anti-VEGF e Bevacizumab (Avastin) inibirem a ligação de VEGF em VEGFR1 e VEGFR2 foi determinada da maneira descrita anteriormente, mas sem a etapa de pré-incubação. Tabela 11A: valores EC50 de anti-VEGF dAb-Fc-dAbs com modificações no terminal C comparado com Bevacizumab (Avastin) no ensaio de ligação do receptor de VEGFR2:
[000249] Ajuste da curva e cálculos de EC50 foram realizados usando GraphPad Prism.
Figure img0021
Tabela 11B: valores DE EC50 de anti-VEGF dAb-Fc-dAbs com modificações no terminal C comparado com Bevacizumab (Avastin) em ensaio de ligação do receptor DE VEGFR2:
[000250] Ajuste da curva e cálculos de EC50 foram realizados usando GraphPad Prism.
Figure img0022
Exemplo 18 - Ensaio de proliferação da célula endotelial da veia umbilical humano (HUVEC): Inibição com moléculas anti-VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb contendo modificações no terminal C:
[000251] As capacidades de moléculas de dAb-Fc-dAb baseadas em DMS30037 e DMS30038 mas com modificações no terminal C: DMS30037- R (DMS30047) & DMS30037+T (DMS30050), DMS30038-R (DMS30051) & DMS30038+T (DMS30054) suprimirem proliferação das células endoteliais da veia umbilical humano foram comparadas com Bevacizumab (Avastin) usando o método descrito a seguir com os seguinte desvios: (i) em vez de deixar os poços externos livres de células, toda a placa de 96 poços foi usada; e (ii) os dados foram analisados usando GraphPad Prism usando um ajuste de curva Sigmodial, inclinação variável cf uma regressão não linear (inclinação variável). Os compostos testes foram independentemente avaliados em placas individuais contra a molécula comparadora, Bevacizumab (Avastin); o ensaio foi realizado em pelo menos três°Casiões separadas, com um conjunto de dados total por molécula de Bevacizumab (Avastin): 15; DMS30037: 7; DMS30038: 8; DMS30037-R (DMS30047): 3; DMS30037+T (DMS30050): 4; DMS30038-R (DMS30051): 4 & DMS30038+T (DMS30054): 4, (dados não mostrados). O foco foi mediante análise tanto do grau de inibição máxima quanto dos valores relativos de EC50 no ensaio gerado por certas moléculas comparado com aquele de Bevacizumab (Avastin).
[000252] Os dados foram analisadas usando GraphPad Prism usando um ajuste de curva Sigmodial, inclinação variável cf uma regressão não linear (inclinação variável). Ajustes de curvas individuais foram feitos para cada molécula e a cada dia. Devido a algum ajuste fraco, decidiu-se introduzir restrições para a curva onde um patamar não foi observado na concentração mínima. Uma placa foi excluída da análise devido ao fraco ajuste de curva, apesar das restrições. Esta restrição poderia ser igual à média dos pontos na concentração mais baixa. Dados foram manualmente selecionados, quer o mínimo tenha sido ou não restringido, e o ajuste de curva e parâmetros foram automaticamente atualizados baseados nesta seleção de critérios. Estimativas da curva máxima e o erro padrão foram analisados usando uma análise modelo misto pesado de variância, usando 1/ (padrão erro)2, [SE]2, como uma pesagem. A análise ajustada para variabilidade entre placas e dias usando termos de efeitos aleatórios. A partir desta análise, as médias previstas foram estimadas e comparações foram feitas novamente para Avastin (controle) (vide Tabela 12A). A mesma análise foi então realizada na escala log10 para o IC50, e os resultados transformados de volta. A partir disso, estimativas da média geométrica foram geradas e comparações foram feitas novamente com Avastin na forma de uma razão para Avastin (controle) isto é, um razão de 0,5 indicaria uma queda de 50% de Avastin (vide Tabela 12B).
[000253] Ensaio de proliferação da célula endotelial do cordão umbilical humano (HUVEC):
[000254] Moléculas Anti-VEGF foram ensaiadas quanto a sua capacidade de suprimir proliferação de células endoteliais da veia umbilical humano comparadas com aquelas de Bevacizumab (Avastin). Este ensaio mede a extensão de proliferação de célula endotelial induzida por uma concentração definida de VEGF165 e a capacidade de os antagonistas de VEGF bloquearem este efeito. HUVECs foram semeadas a 5.000 células por poço em de 96 poços placas revestidas com gelatina, deixando os poços externos livre de células, e incubados por diversas horas para permitir aderência. Moléculas testes foram ensaiadas a concentrações equimolares (max 3,33x10-08M) com uma diluição em série de 2 vezes, cada qual em triplicata. O VEGF165 foi preparado em meio basal para obter concentração final de 75 ng/mL. Meio foi removido manualmente das monocamadas de célula e 50 μL de meio basal foram adicionados para impedir que células se separem pela secagem. 25 μL de meio contendo VEGF165 e 25 μL de meio basal ou meio contendo anticorpo teste foram adicionados conforme apropriado. Células foram incubadas para 72 horas, após cujo tempo o número total de células foi determinado usando Titulador de Célula Glo. Tratamento de HUVECs com VEGF165 resultou no aumento esperado no número total de células depois 72 horas, quando comparado com células não tratadas com VEGF165 (dados não mostrados). Este aumento mediado por VEGF é interpretado como representando os efeitos cumulativos de VEGF tanto em proliferação de HUVEC quanto em prevenção de morte da célula HUVEC. Os compostos testes foram independentemente avaliados em placas individuais contra a molécula comparadora, Bevacizumab (Avastin). Tabela 12A: Média geométrica prevista de inibição de porcentagem máxima de anti-VEGF dAb-Fc-dAbs Terminal Cmente modificadas com 95% de intervalos de confidência (CI) comparado com parental e Bevacizumab (Avastin) no ensaio de HUVEC:
Figure img0023
[000255] A partir desta análise, parece que moléculas DMS30037, DMS30037+T e DMS30037-R levam a maior inibição máxima no ensaio de HUVEC e elas superaram o grupo Avastin, o intervalo de confidência não sobrepõe a referência zero, e assim os dados foram estatisticamente significativos daqueles de Avastin, dados não mostrados (vide Tabela 12A). Tabela 12B: Média geométrica de IC50 para anti-VEGF dAb-Fc-dAbs Terminal Cmente modificadas com 95% de intervalos de confidência (CI) comparada com parental e Bevacizumab (Avastin) no ensaio HUVEC:
Figure img0024
[000256] Uma análise similar da média geométrica doa valores de IC50 com 95% de intervalos de confidência, (CI), mostraram que quase todas as moléculas de dAb-Fc-dAb DMS30037, DMS30037+T, DMS30038, DMS30038+T e DMS30038-R tiveram valores IC50 estatisticamente significativamente menores do que Avastin, dados não mostrados (vide Tabela 18B). O conjunto de dados de DMS30037-R foi altamente variável com um baixo número n (3).
[000257] Os dados gerais sugerem que as modificações no terminal C de ambas dAb-Fc-dAbs: DMS30037 & DMS30038 tiveram valores de IC50 e níveis de inibição máxima muito similares no ensaio de HUVEC para moléculas do parental e pareceram mais potentes do que Bevacizumab (Avastin), tanto em termos de porcentagem de inibição máxima quanto IC50 menor, ( vide Tabelas 12A e 12B).
Exemplo 19 (Ferramenta mAb): O uso de um mAb anti-VH para definir o epítopo para ligação em ADA anti-VH pré-existente:
[000258] Um anticorpo monoclonal (mAb anti-VH M2.3G10.1G06) liga na estrutura de VH de DOM1H-131-206 e determinou-se que este mAb tem ligação muito baixa em DOM1H-131-206 +A; portanto este anticorpo parece ligar um epítopo similar ao ADA anti-VH pré-existente humano.
[000259] Sequências de CDR de mAb anti-VH M2.3G10.1G06: As sequências de CDR do mAb anti-VH M2.3G10.1G06 foram amplificadas e sequenciadas a partir da linhagem celular de hibridoma. As sequências de cadeia pesada e leve para mAb M2.3G10.1G06 são mostradas em [as sequências de aminoácidos são mostradas na figura 6a e 6b]. Sequências foram clonadas em um vetor de expressão de mAb de IgG1 humano e transfectadas nas células de mamífero para expressar o mAb identificado. O anticorpo resultante foi purificado da célula sobrenadante e testado quanto a sua capacidade de ligar o dAb da estrutura de VH.
[000260] Especificidade de mAb anti-VH M2.3G10.1G06: A especificidade de mAb M2.3G10.1G06 para ligar no dAb da estrutura de VH (com ou sem uma modificação que anula a ligação em ADA pré-existente) foi determinada medindo a ligação de mAb M2.3G10.1G06 em um ensaio de ligação de TNFR1:dAb realizado na plataforma de MSD ™ (vide o exemplo 1 para detalhes de plataforma de MSD ™). O ensaio de ligação de TNFR1:dAb é detalhado a seguir. Demonstrou-se que mAb anti-VH M2.3G10.1G06 rutenilado tem uma baixa ligação na estrutura de VH por até 85% quando a terminação C é modificada por extensão com alanina (1 a 15% de ligação residual) (resultados mostrados na tabela 13).
[000261 ] Competição entre ADA anti-VH pré-existente e mAb M2.3G10.1G06:
[000262] Para confirmar que mAb anti-VH M2.3G10.1G06 liga o mesmo epítopo como ADA anti-VH de soro pré-existentes, uma ensaio de competição foi realizado. Determinou-se que soro de uma faixa de doadores humanos com ADA anti-VH pré-existente podem competir com mAb anti-VH M2.3G10.1G06 para ligar em DOM1H-131-206 (dados mostrados na figura 7). Concluímos que ADA anti-VH e mAb anti-VH M2.3G10.1G06 pré-existente humano compartilham um epítopo de sobreposição na estrutura de VH.
[000263] Modificações nos dAbs de VH que rompem o epítopo para ligação em ADA pré-existente podem ser previstas com base na ligação de mAb anti-VH M2.3G10.1G06. A ligação de mAb anti-VH M2.3G10.1G06 pode portanto ser usada para ensaio para modificações que levam a menor ligação em ADA pré-existente.
[000264] Métodos usados: Protocolo de ensaio de ligação de TNFR1:dAb 1. TNFR1:Fc é capturado em um placa MSD de alta ligação por toda a noite a 4 °C. A placa de MSD é então lavada 3 vezes com tampão de lavagem MSD/TRIS. 2. A placa é bloqueada com 3% de BSA em PBS por 1,5 horas à temperatura ambiente. A placa de MSD é então lavada 3 vezes com MSD/TRIS tampão de lavagem. 3. A série de diluições do dAb teste (DOM 1H-131-206 (SEQ ID NO 1) ou DOM 1H-131-206 com uma extensão de alanina no terminal C (SEQ ID NO 16)) é adicionada por 2 horas a RT. A placa de MSD é então lavada 3 vezes com tampão de lavagem MSD/TRIS. 4. mAb M2.3G10.1G06 rutinilado a uma concentração final de 1 μg/mL é adicionado por 1 hora à temperatura ambiente. A placa de MSD é então lavada 3 vezes com tampão de lavagem MSD/TRIS. 5. 150 μL/poço de tampão de leitura são adicionados e a placa é lida. Protocolo de competição de ensaio para ADA anti-VH e mAb M2.3G10.1G06 pré-existente 1. 0,2 μg/mL molécula de teste biotinilada (dAb) que foi DOM 1H-131-206 (SEQ ID NO 1) e 20% de amostra de soro em diluente do ensaio (1% de caseína em PBS) são incubados em uma placa de ensaio de base redonda por 1 hora ± 5 minutos a RT. 2. MAb anti-VH M2.3G10.1G06 rutinilado a uma concentração final de 0,5 μg/mL é adicionado por 1 hora à temperatura ambiente. 3. Uma placa de estreptavidina de MSD™ é bloqueada com 150 μL/poço caseína de bloqueio em PBS (1%) à temperatura ambiente (RT) por 1-2 horas. 4. Amostras são transferidas para a placa de estreptavidina de MSD™ e incubadas à temperatura ambiente (RT) por 1-2 horas. 5. A placa de MSD é então lavada 3 vezes com PBST. 6. 150 μL/poço tampão de leitura são adicionados e a placa é lida. Tabela 13: Ligação diferencial de mAb anti-VH em DOM1H-131-206 ou DOM1H-131-206 modificadas com uma extensão no terminal C
Figure img0025
[000265] Este mAb liga a estrutura dos dAbs de VH, por exemplo, DOM 1H-131-206 (SEQ ID NO 1), mas a ligação é altamente reduzida em dAbs com uma modificação no terminal C +A, por exemplo, DOM 1H-131- 206 com uma extensão de alanina no terminal C (SEQ ID NO 16). Sequências da cadeia H & L foram determinadas a partir do hibridoma depositado em Biocat. Houve somente uma sequência LC, mas, duas sequências HC: uma sequência funcional e uma não funcional (vide a seguir) incluindo códons de parada e alterações de quadro de leitura.
[000266] Expressão do mAb e confirmação de ligação contra as duas moléculas mencionadas com base na sequência funcional prevista a seguir nos permitirão confirmar que temos de corrigir sequência de mAb para o preenchimento. O modo que os construtos de pTT5 foram montados significa que somente a sequência em não itálico é do hibridoma, a em itálico é quimérica do vetor de pTT no qual ela foi clonada (isto não é exigido para o ensaio de ligação). Cadeia leve DIVMTQSQKFMSPTVGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKL LIYSASNRYTGVPD RFTGSGSGTDFTLTINNMQSEDLADYFCQQYGSYPLTFGGGTKLEIKÃ TVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Cadeia pesada EVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTLTESYMHWVKQSHGKSLE WIGVISPYNGGTSY NQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCTRRGIYYDPSW FAYWGQGTLVTVS AAKTTPPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Região variável em tipo normal. CDRs sublinhados/negrito Sequência quimérica para Fc em itálicos. Fc é IgG1 humano. Sequências para a Ferramenta mAb são mostrados na figura 6 (SEQ ID NOs 14 e 15).

Claims (29)

1. Domínio variável de imunoglobulina único, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 18.
2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único (dAb) como definido na reivindicação 1, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.
3. Formulação injetável, oral, inalável, nebulizável, de liberação prolongada ou liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 1.
4. Domínio variável de imunoglobulina único, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 18.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 4, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.
6. Formulação injetável, oral, inalável, nebulizável, de liberação prolongada ou liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 4.
7. Domínio variável de imunoglobulina único, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 7.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 7, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.
9. Formulação injetável, oral, inalável, nebulizável, de liberação prolongada ou liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 7.
10. Domínio variável de imunoglobulina único, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 7.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 10, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.
12. Formulação injetável, oral, inalável, nebulizável, de liberação prolongada ou liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 10.
13. Domínio variável de imunoglobulina único, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 8.
14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 13, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.
15. Formulação injetável, oral, inalável, nebulizável, de liberação prolongada ou liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 13.
16. Domínio variável de imunoglobulina único, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 8.
17. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 16, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.
18. Formulação injetável, oral, inalável, nebulizável, de liberação prolongada ou liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 16.
19. Domínio variável de imunoglobulina único, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 9.
20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 19, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.
21. Formulação injetável, oral, inalável, nebulizável, de liberação prolongada ou liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 19.
22. Domínio variável de imunoglobulina único, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 9.
23. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 22, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.
24. Formulação injetável, oral, inalável, nebulizável, de liberação prolongada ou liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de imunoglobulina único como definido na reivindicação 22.
25. Ácido nucleico isolado ou recombinante, caracterizado pelo fato de que codifica a sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos das reivindicações 1, 7, 13 ou 19.
26. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico como definido na reivindicação 25.
27. Microorganismo transgênico, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 25, ou vetor como definido na reivindicação 26.
28. Uso de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 e 23, caracterizado pelo fato de que é para manufatura de um medicamento para tratamento ou prevenção de pelo menos uma doença ou distúrbio.
29. Uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio são selecionados dentre lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, artrite reumatóide ou doença de Von Willebrand.
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