ES2904553T3 - Fragmentos de anticuerpo modificados con bisagra y procedimientos de preparación - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un fragmento de anticuerpo aislado, en la que el fragmento de anticuerpo es un Fab del isotipo IgG1 que comprende una región bisagra truncada que termina con el residuo D221 (numeración EU).

Description

DESCRIPCIÓN

Fragmentos de anticuerpo modificados con bisagra y procedimientos de preparación

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab y F(ab')²) que tienen reactividad reducida o nula hacia anticuerpos antibisagra (AHA) preexistentes y composiciones que comprenden dichos fragmentos de anticuerpo, así como procedimientos de preparación y uso de dichos fragmentos de anticuerpo y composiciones.

Antecedentes

Los anticuerpos se componen de dos regiones Fab que están conectadas por una región bisagra flexible a Fc. Aunque el Fab media en el reconocimiento y la unión del antígeno, dos funciones importantes de la Fc son mediar en la función efectora por acoplamiento con los receptores Fcy (1) y conferir una semivida sérica prolongada por unión al receptor de rescate, FcRn (2). En particular, la farmacocinética lenta de IgG contribuye al éxito de los anticuerpos como opciones terapéuticas ya que permite una dosificación menos frecuente en comparación con otras opciones bioterapéuticas. En consecuencia, la mayoría de los anticuerpos terapéuticos aprobados tienen un formato de IgG de longitud completa. El documento WO 2014/138449 divulga anticuerpos que comprenden regiones Fc en tándem a las que se enlazan restos de unión tales como scFv y/o Fab. A diferencia de la IgG, la semivida sérica de un fragmento Fab aislado es corta (3) y dicha propiedad se requiere para indicaciones cuando se desea una semivida plasmática corta como con las tres moléculas Fab aprobadas por la FDA (4). Una molécula Fab terapéutica dirigida contra el receptor de superficie plaquetaria GPIIb/IIIa (abciximab, REOPRO®) se produce comercialmente por escisión proteolítica con papaína (5), que es el procedimiento original de producción de Fab (6). Con los avances en clonación molecular, la expresión recombinante de fragmentos de anticuerpo se ha vuelto una vía atractiva para generar moléculas Fab como se ejemplifica por la segunda opción terapéutica de Fab aprobada, anti-VEGF (ranibizumab, Lucentis®* (7) y el Fab recientemente aprobado contra dabigatran (idarucizumab, Praxbind®1 (33). Las moléculas Fab son ventajosas, por ejemplo, cuando se desea una actividad sistémica transitoria que no persista después de la dosificación o cuando la administración y la actividad se localizan en un compartimento periférico tal como el ojo.

Se han implicado muchas proteasas contra la región bisagra de anticuerpo como el mecanismo por el que los patógenos y las células tumorales intentan evadir la respuesta inmunitaria del huésped (13). Sin embargo, los neoepítopos C terminales resultantes se reconocen finalmente por el sistema inmunitario y se generan anticuerpos antibisagra (AHA). Dichos autoanticuerpos contra la región bisagra superior del Fab y la región bisagra inferior del F(ab')² se han mostrado en varios estudios (17-21). Estos valores de AHA preexistentes varían de un donante a otro (20) y pueden representar una exposición pasada y actual a dichos neoepítopos. En determinados casos, AHA puede actuar como Fc sustituto y restablecer la función efectora de los anticuerpos inactivados proteolíticamente (22). Como una razón para usar una molécula Fab o F(ab')² como formato terapéutico es eliminar la función efectora, no sería deseable que se restableciera la función efectora por el AHA preexistente y arriesgar cualquier problema de seguridad potencial. En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de obtener moléculas Fab y F(ab')² novedosas que tengan reactividad reducida o nula con AHA preexistente en suero humano para, entre otros, proporcionar potencialmente un perfil de seguridad superior en un entorno terapéutico minimizando respuestas inmunitarias después del tratamiento farmacológico.

Sumario

La presente divulgación se refiere a fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab y F(ab')²) que tienen reactividad reducida o nula hacia anticuerpos antibisagra (AHA) preexistentes y composiciones que comprenden dichos fragmentos de anticuerpo, así como procedimientos de preparación y uso de dichos fragmentos de anticuerpo y composiciones. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a un fragmento de anticuerpo aislado y composiciones que comprenden el mismo, en la que el fragmento de anticuerpo tiene reactividad reducida o nula hacia anticuerpos antibisagra preexistentes. En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo aislado de la presente divulgación presenta unión reducida y/o nula a FcYRIIIa y/o C1q. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo es un Fab, Fab' o F(ab')².

En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a fragmentos de anticuerpo y composiciones que comprenden los mismos, en los que el fragmento de anticuerpo es un Fab. En determinados modos de realización, la presente divulgación se dirige a moléculas Fab en las que el Fab termina con el residuo D²²¹. En determinados modos de realización, el Fab termina con aminoácidos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en CDKTHT (SEQ ID NO: 14), CDKTHL (SEQ ID NO: 15), CDKTH (SEQ ID NO: 16), CDKT (SEQ ID NO: 17), CDK y CD. En determinados modos de realización, el Fab termina con aminoácidos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en KYGPP (SEC ID NO: 18), KYGP (SEC ID NO: 19), KYG, KY y K. En determinados modos de realización, el Fab comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n O: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y modificaciones conservadoras de la misma.

En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a un fragmento de anticuerpo y composiciones que comprenden el mismo, en el que el fragmento de anticuerpo es un F(ab')². En determinados modos de realización, la presente divulgación se dirige a moléculas F(ab')², en las que F(ab')² comprende una deleción C terminal de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos. En determinados modos de realización de la presente divulgación, F(ab')² comprende una deleción en la posición EU231. En determinados modos de realización de la presente divulgación, F(ab')² comprende una deleción en las posiciones EU231-232. En determinados modos de realización de la presente divulgación, F(ab')² comprende una deleción en las posiciones EU231-233. En determinados modos de realización de la presente divulgación, F(ab')² comprende una deleción en la posición EU231-234. En determinados modos de realización, F(ab')² comprende una deleción en la posición EU230-234.

En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a un ácido nucleico aislado y composiciones que comprenden el mismo, en el que el ácido nucleico codifica un fragmento de anticuerpo que tiene reactividad reducida o nula con AHA. En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a un procedimiento de producción de un fragmento de anticuerpo que comprende cultivar dicha célula huésped de modo que se produce el fragmento de anticuerpo. En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a una formulación farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo que tiene reactividad reducida o nula con AHA y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene reactividad reducida o nula con AHA para su uso como medicamento. En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene reactividad reducida o nula con AHA para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene reactividad reducida o nula con AHA para su uso en la inhibición o activación de una vía y/o mecanismo molecular. En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere al uso de un fragmento de anticuerpo que tiene reactividad reducida o nula con AHA en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere al uso de un fragmento de anticuerpo que tiene reactividad reducida o nula con AHA en la fabricación de un medicamento para inhibir o activar una vía y/o mecanismo molecular.

En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a procedimientos de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de un fragmento de anticuerpo que tiene reactividad reducida o nula con AHA. En determinados modos de realización, la presente divulgación se refiere a procedimientos de inhibición o activación de una vía y/o mecanismo molecular en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de un fragmento de anticuerpo que tiene una reactividad reducida o nula con AHA para inhibir o activar una vía y/o mecanismo molecular.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1D muestran la unión de anticuerpos humanos preexistentes al Fab de IgG1, IgG2 e IgG4 humanas. (1A) Estructura cristalina de rayos X de la región Fab (PDB: 1HZH) incluyendo la bisagra superior; cadena ligera (101), cadena pesada (102), disulfuro intercatenario (103) y bisagra superior (104). En la molécula Fab aislada, la bisagra superior es una región no estructurada saliente sin papel estructural ni funcional. Los residuos de la bisagra superior se muestran en magenta para indicar la mutación T225F (105) que perturba la unión a AHA preexistente. La numeración de los residuos es de acuerdo con la nomenclatura de numeración EU. La figura 1A divulga SEQ ID NO 14-15, respectivamente, en orden de aparición. (1B) Se incubó suero humano combinado con Fab de IgG1 humana con diferentes extremos y longitudes de bisagra superior. Unión de anticuerpos preexistentes detectada por ELISA anti-Fc. Truncar el extremo C de Fab en D221 (D) y la variante C terminal T225F (DKTHF (SEQ ID NO: 20)) redujo en gran medida la unión de anticuerpos preexistentes a casi el fondo. Se observó una fuerte respuesta hacia T223 como residuo C terminal (DKT), coincidiendo con el sitio de escisión de la elastasa neutrófila humana. El valor medio de los puntos de datos individuales se representa por la línea horizontal. La figura 1B divulga SEQ ID NO 20-21 y 27, respectivamente, en orden de aparición. (1C) Se incubaron tres Fab diferentes con suero humano combinado y se detectó la unión de anticuerpos preexistentes por ELISA. Se observó una señal significativa para diferentes Fab con el extremo C de DKTHT (SEQ ID NO: 21). Se detectó una unión reducida de anticuerpos preexistentes al extremo C de D²²¹ y T²²⁵F en diferentes Fab. Fab-1 incluye el dominio variable de anticuerpo usado en (B) y todos los demás experimentos de unión de AHA en todo el ejemplo 1. La figura 1C divulga SEQ ID NO 21,20, 21,20, 21 y 20, respectivamente, en orden de aparición. (1D) Se incubó suero humano combinado con Fab de IgG2 humana y Fab de IgG4 con diferente longitud de bisagra superior y se detectó la unión de anticuerpos por ELISA. No se pueden detectar anticuerpos preexistentes para la bisagra superior de IgG2 e IgG4 humanas. La figura 1D divulga SEQ ID NO: 18.

Las figuras 2A-2C muestran la escisión de la quimera IgG1-2 por IdeS. (2A) Modelo de la región F(ab')² del anticuerpo cAC10 modelado con MOE; cadena ligera (201), cadena pesada (202), disulfuro intercatenario (203) y bisagra inferior (204). La posición P1 de IdeS es G236. La numeración de los residuos es de acuerdo con la nomenclatura de numeración EU. La figura 2A divulga SEQ ID NO: 30. (2B) Alineación de la bisagra inferior de IgG1 y la quimera IgG1-2. Los residuos en cian son residuos de isotipo IgG2 introducidos en la bisagra inferior de IgG2. La figura 2B divulga SEQ ID NO 31 y 59, respectivamente, en orden de aparición. (2C) Eficacia de escisión de IgG1 humana y la quimera IgG1-2. Se incubaron 1 mg/ml de IgG1 e IgG1-2 durante 24 horas a 37 °C con diferentes cantidades de IdeS como se indica. La escisión se analizó por electroforesis capilar. Mientras que IgG1 se escindió eficazmente en F(ab')² en una proporción IdeS:IgG de 1:500, IgG1-2 requiere concentraciones de IdeS 50 veces mayores para una escisión completa.

Las figuras 3A-3E muestran la escisión de IgG1 humana con variantes en la posición P1 y P2 por IdeS. (3A) Electroforesis capilar de anticuerpos con variantes en la posición P1 y P2 que se digirieron 24 horas a 37 °C con una proporción 1:10 de IdeS:IgG a 1 mg/ml. Los residuos P1 y P2 se designan con un código de 1 letra. Leucina y glicina (L235G236) son los aminoácidos naturales en estas posiciones. Todas las variantes de anticuerpo se pueden escindir completamente en fragmentos F(ab')². (3B) Se evaluó la eficacia de escisión de las variantes por la cantidad de F(ab')² producida a diferentes proporciones IdeS:IgG. Mientras que la variante VG se escinde de forma comparable a la secuencia natural (LG), otras variantes requieren un incremento en las cantidades de IdeS para una digestión completa. (3C) Se evaluó la eficacia de escisión de las variantes por la cantidad de F(ab')² producida en una proporción IdeS:IgG de 1:10. (3D) Diagramas esquemáticos de las estrategias de expresión, purificación y cribado para las variantes de IgG1 humana. La figura 3D divulga SEQ ID NO 31-34, respectivamente, en orden de aparición. (3E) Eficacia de escisión de las 76 variantes de IgG1 humana con IdeS. La figura 3E divulga SEQ ID NO: 31.

Las figuras 4A-4B muestran la reactividad de las variantes P1 y P2 hacia AHA preexistente. (4A) IdeS se retira eficazmente durante la purificación y no se puede detectar en las variantes de F(ab')² purificadas por SDS-PAGE seguida de tinción de Coomassie (panel superior) o análisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-IdeS (panel inferior). (4B) Se incubó suero humano combinado con Fab de IgG1 humana con el extremo C de T225 y F(ab')² generado por escisión de IdeS de anticuerpos con variantes en las posiciones P1 y P2. Se detectó la unión de anticuerpos preexistentes por ELISA. El F(ab')² mostró una señal que fue aproximadamente 1,7 veces mayor en comparación con el Fab. Las variantes de bisagra redujeron la reactividad hasta niveles comparables a Fab pero no eliminaron la reactividad por completo.

Las figuras 5A-5F muestran la reactividad de variantes truncadas hacia la respuesta de AHA preexistente. (5A) Escisión con IdeS de anticuerpos con deleciones en los sitios P3, P4 y P5 de IdeS. Mientras que la deleción del residuo P3 de IdeS (L234) en la bisagra inferior afectó gravemente a la eficacia de escisión, la deleción de las posiciones P4 (E233) o P5 (P232) no afectó a la escisión con IdeS en comparación con la natural (WT). (5B) La deleción de las posiciones P4 y P5 no fue suficiente para evitar la unión de AHA preexistente. (5C) Escisión con IdeS de anticuerpos con deleciones de los sitios P4 a P6 (AP456) y P4 a P7 (AP4567) de IdeS. Mientras que la eficacia de escisión de la variante AP4567 se redujo ligeramente en comparación con la secuencia de bisagra inferior natural (WT), AP456 mostró una eficacia de escisión comparable a la natural en una proporción IdeS:IgG de 1:200. (5D) Se incubó suero humano combinado con F(ab')² producido por digestión con IdeS y se detectó la unión de anticuerpos por ELISA. No se reconocieron las deleciones en la bisagra inferior AP456 y Ap4567 por AHA preexistente. (5E) IdeS escindió la variante de bisagra AP456 con alta especificidad. Después de la digestión de IgG natural (WT) y con bisagra con AP456, se analizó F(ab')² reducido por espectrometría de masas. Solo se observó una única especie de cadena pesada correspondiente a la masa molecular esperada. (5F) Diagrama esquemático que representa las deleciones generadas en la región bisagra inferior. La figura 5F divulga SEQ ID NO 35, 31, 36-40, 31 y 41-42, respectivamente, en orden de aparición.

Las figuras 6A-6B muestran la alineación de los residuos aminoacídicos (6A) y la numeración EU de los residuos aminoacídicos (6B) dentro de las regiones bisagra superior, central e inferior de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en ser humano, macaco cangrejero y macaco de la India. La figura 6A divulga SEQ ID NO 43-54, respectivamente, en orden de aparición. La figura 6B divulga SEQ ID NO 43, 46, 55 y 52, respectivamente, en orden de aparición.

La figura 7 muestra los niveles de expresión de Fab con truncamientos o mutaciones de bisagra superior en E. coli. La figura divulga SEQ ID NO 14-15, respectivamente, en orden de aparición.

La figura 8 muestra la eficacia de la escisión de la variante AP456 y AP4567 producida en una proporción IdeS:IgG de 1:500 o 1:10. La figura divulga SEQ ID NO 56-58, respectivamente, en orden de aparición.

Las figuras 9A-9D muestran la reactividad de variantes de deleción con residuos P1 y P2 modificados con AHA preexistente. (9A) Se evaluó la eficacia de escisión de las variantes por la cantidad de F(ab')² producida en una proporción IdeS:IgG de 1:100. La figura 9A divulga SEQ ID NO: 31. (9B) Se evaluó la eficacia de escisión de las variantes por la cantidad de F(ab')² producida en una proporción IdeS:IgG de 1:100. La figura 9B divulga SEQ ID NO: 31. (9C) Se evaluó la eficacia de escisión de las variantes por la cantidad de F(ab')² producida en una proporción IdeS:IgG de 1:500. La figura 9C divulga SEQ ID NO: 31. (9D) Detección del AHA preexistente unido a las variantes por ELISA anti-Fc. La figura 9D divulga SEQ ID NO: 56.

Las figuras 10A-10B muestran la reactividad de las variantes AP456 y AP4567 con residuos P1 y P2 modificados para AHA preexistente. (10A) Se evaluó la eficacia de escisión de las variantes por la cantidad de F(ab')² producida en una proporción IdeS:IgG de 1:10 y 1:200. La figura 10A divulga SEQ ID NO 56-57, respectivamente, en orden de aparición. (10B) Detección de AHA preexistente unido a las variantes por ELISA anti-Fc. La figura 10B divulga SEQ ID NO: 56.

La figura 11 muestra las curvas de valoración de las moléculas F(ab')² y Fab en el ELISA de AHA. Las diluciones correspondientes de la DO 450 nm (1,15) en el medio de las curvas de valoración de F(ab')² fueron 70 y 14 para F(ab')² y Fab, respectivamente. Por tanto, F(ab')² tiene una reactividad con AHA cinco veces mayor que Fab IgG1. Se recubrieron F(ab')², AP456 de F(ab')², Fab T²²⁵, T²²⁵L de Fab y D²²¹ de Fab en los pocillos. Se añadieron diluciones en serie de suero humano combinado a los pocillos y los pocillos de control no se recubrieron. Se obtuvieron resultados similares en otros 4 experimentos. Los datos mostrados aquí y en la figura 1B y la figura 5D se obtuvieron del mismo experimento. La figura divulga SEQ ID NO 21 y 20, respectivamente, en orden de aparición.

Descripción detallada

I. Definiciones

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')², diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo es una molécula Fab. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo es una molécula F(ab')².

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con disulfuro. Del extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (C^h1 , C^h2 y C^h3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Receptor de Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase, por ejemplo, M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se vayan a identificar en el futuro, se engloban por el término "FcR" en el presente documento.

El término "receptor de Fc" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y la regulación de la homeostasis de inmunoglobulinas. Son conocidos procedimientos de medición de la unión a FcRn (véanse, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton et al.).

Se pueden someter a ensayo la unión a FcRn humano in vivo y la semivida sérica de polipéptidos de unión de alta afinidad a FcRn humano, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se administran los polipéptidos con una región Fc variante. El documento WO 2000/042072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o reducida a FcR. Véase también, por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001).

"Funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

La "región bisagra" se define en general como que se expande desde 216-238 (numeración EU) o 226-251 (numeración de Kabat) de IgG1 humana. La bisagra se puede dividir además en tres regiones distintas, la bisagra superior, media (por ejemplo, central) e inferior. Véase, por ejemplo, Brezski y Georgiou, Curr. Opin. Immunol. 40, 62-69 (2016). En determinados modos de realización, la región bisagra de un anticuerpo IgG1 humano se define en general como sigue:

La bisagra superior comprende aminoácidos que tienen la secuencia EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 22). En determinados modos de realización, la bisagra superior comprende los aminoácidos en las posiciones 216-225 (numeración EU) o 226-238 (numeración de Kabat).

La bisagra media (por ejemplo, central) comprende los aminoácidos que tienen la secuencia CPPC (SEQ ID NO: 23). En determinados modos de realización, la bisagra central comprende los aminoácidos en las posiciones 226­ 229 (numeración EU) o 239-242 (numeración de Kabat).

La bisagra inferior comprende aminoácidos que tienen la secuencia PAPELLGGP (SEQ ID NO: 24). En determinados modos de realización, la bisagra inferior comprende los aminoácidos en las posiciones 230-238 (numeración EU) o 243-251 (numeración de Kabat).

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG¹, IgG², IgG3, IgG4, IgA¹ e IgA². Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y |J, respectivamente.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un anticuerpo o un fragmento se puede purificar a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza del anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, b La s T-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa a LiGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, o puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el trascurso de análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En determinados modos de realización, los fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo divulgado en el presente documento, o una formulación farmacéutica que comprende un agente, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211,1131,I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de micromoléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" quiere decir dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se determina por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede querer decir dentro de 3 o más de 3 desviaciones estándar, según la práctica en la técnica. De forma alternativa, "aproximadamente" puede querer decir un intervalo de hasta un 20 %, preferentemente hasta un 10 %, más preferentemente hasta un 5 % y más preferentemente todavía hasta un 1 % de un valor dado. De forma alternativa, en particular con respecto a sistemas o procesos biológicos, el término puede querer decir dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces, y más preferentemente dentro de 2 veces, de un valor.

II. Composiciones y procedimientos

En determinados modos de realización, la presente divulgación se basa, en parte, en procedimientos de genomanipulación de fragmentos de anticuerpo para evadir los anticuerpos antibisagra (AHA) preexistentes. En determinados modos de realización, se proporcionan fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab y F(ab')²) que tienen reactividad reducida o nula hacia A hA y procedimientos de preparación de estos fragmentos de anticuerpo. En determinados modos de realización, los fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación pueden proporcionar una seguridad superior en un entorno terapéutico minimizando la respuesta inmunitaria después de los tratamientos farmacológicos.

A. Fragmentos de anticuerpo ejemplares

En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')²) y composiciones que comprenden los mismos, que tienen reactividad reducida o nula hacia AHA. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un fragmento de anticuerpo divulgado en el presente documento muestra una reactividad con AHA que se reduce en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 % con respecto a un fragmento de anticuerpo de referencia, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo con una región bisagra natural. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo de referencia es un fragmento de anticuerpo IgG1 que tiene una región bisagra natural.

En determinados modos de realización, los fragmentos de anticuerpo aislados de la presente divulgación, y las composiciones que comprenden los mismos, presentan unión reducida y/o nula a FcYRIIIa y/o C1q. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación presenta unión a FcYRIIIa y/o C1q que se reduce en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 % con respecto a un fragmento de anticuerpo de referencia, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo con una región bisagra natural. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo de referencia es un fragmento de anticuerpo IgG1 que tiene una región bisagra natural.

En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo empleado en el contexto de los procedimientos descritos en el presente documento comprende una región bisagra natural o una región bisagra modificada. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación puede ser un fragmento Fab que comprende una región bisagra natural o una región bisagra modificada. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo de la presente divulgación es un F(ab')² que comprende una región bisagra natural o una región bisagra modificada.

Una región bisagra natural es una región bisagra normalmente asociada con el dominio C^h1 de una molécula de anticuerpo. En determinados modos de realización, la región bisagra natural de un fragmento de anticuerpo divulgado actualmente puede ser del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el fragmento Fab puede ser del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, el fragmento Fab, es del isotipo IgG2 que comprende una región bisagra natural. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, el fragmento Fab, es del isotipo IgG4 que comprende una región bisagra natural.

Una región bisagra modificada es cualquier bisagra que difiera en longitud y/o composición de la región bisagra natural. Dichas bisagras pueden incluir regiones bisagra de otras especies, tales como regiones bisagra humanas, de ratón, rata, conejo, cerdo, hámster, camello, llama o cabra. Otras regiones bisagra modificadas pueden comprender una región bisagra completa derivada de un anticuerpo de una clase o subclase diferente de la del dominio C^h1. Por tanto, por ejemplo, un dominio C^h1 de clase y1 se puede unir a una región bisagra de clase y4.

De forma alternativa, la región bisagra modificada puede comprender parte de una bisagra natural o una unidad de repetición en la que cada unidad en la repetición se deriva de una región bisagra natural.

En determinados modos de realización, la región bisagra natural se altera sustituyendo, delecionando y/o añadiendo uno o más residuos aminoacídicos para generar una región bisagra modificada. En determinados modos de realización, el fragmento Fab es del isotipo IgG1 que comprende una región bisagra modificada. En determinados modos de realización, el fragmento Fab es del isotipo IgG2 que comprende una región bisagra modificada. En determinados modos de realización, el fragmento Fab es del isotipo IgG4 que comprende una región bisagra modificada.

En determinados modos de realización, una región bisagra modificada comprende la sustitución, deleción y/o adición de uno o más aminoácidos dentro de la región bisagra superior. Por ejemplo, y no a modo de limitación, una región bisagra modificada de la materia objeto divulgada puede tener una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones en las posiciones aminoacídicas EU216-225. De forma alternativa o adicionalmente, una región bisagra modificada comprende la sustitución, deleción y/o adición de uno o más aminoácidos dentro de la región bisagra inferior. En determinados modos de realización, una región bisagra modificada de la materia objeto divulgada puede tener una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones en las posiciones aminoacídicas EU230-238. De forma alternativa o adicionalmente, una región bisagra modificada puede comprender la adición de uno o más aminoácidos C terminales con respecto a la posición aminoacídica EU238. En determinados modos de realización, una región bisagra modificada comprende la sustitución, deleción y/o adición de uno o más aminoácidos dentro de la región bisagra media, por ejemplo, central. Por ejemplo, y no a modo de limitación, una región bisagra modificada de la materia objeto divulgada puede tener una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones en las posiciones aminoacídicas EU226-229.

En determinados modos de realización, la modificación o alteración es una sustitución de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más o seis o más residuos aminoacídicos. En determinados modos de realización, la sustitución se puede generar dentro de la región bisagra superior, región bisagra media y/o región bisagra inferior. En determinados modos de realización, el residuo aminoacídico en la posición 225 se puede sustituir. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el residuo aminoacídico en la posición 225 se puede cambiar a cualquier aminoácido excepto treonina (T). En determinados modos de realización, el aminoácido en la posición 225, por ejemplo, treonina, se puede cambiar a una leucina (L), por ejemplo, T225L, de acuerdo con la numeración EU. En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación es un fragmento Fab que comprende la sustitución T225L.

En determinados modos de realización, la región bisagra superior de un fragmento de anticuerpo IgG1 se puede sustituir con uno o más residuos aminoacídicos presentes dentro de la región bisagra superior de un anticuerpo IgG2 y/o IgG4 porque, por ejemplo, las regiones bisagra superior de los anticuerpos IgG2 e IgG4 presentan reactividad reducida o nula hacia AHA (véase, por ejemplo, la figura 1). Por ejemplo, y no a modo de limitación, la región bisagra superior de un fragmento de anticuerpo IgG1 se puede sustituir con uno o más residuos aminoacídicos presentes dentro de la región bisagra natural de un anticuerpo IgG2 y/o IgG4 (véase la figura 6). En determinados modos de realización, una región bisagra modificada de un fragmento de anticuerpo IgG1 mantiene una cisteína en la posición aminoacídica EU220 (por ejemplo, en comparación con la región bisagra natural de un anticuerpo IgG1). En determinados modos de realización, una región bisagra modificada de un fragmento de anticuerpo IgG1 no mantiene una cisteína en la posición aminoacídica EU220, por ejemplo, en un fragmento de anticuerpo IgG donde la región bisagra superior del fragmento de anticuerpo IgG1 se reemplaza con la región bisagra superior (por ejemplo, toda la región bisagra superior) de IgG4. En determinados modos de realización, la región bisagra superior de un fragmento de anticuerpo IgG1 se puede sustituir con uno o más residuos aminoacídicos presentes dentro de la región bisagra superior de un anticuerpo IgG2, IgG3 y/o IgG4, donde el residuo aminoacídico en la posición 131 del anticuerpo IgG1 se cambia de una serina (S) a una cisteína (C), es decir, S131C.

En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación, por ejemplo, un Fab, F(ab')² o Fab', puede comprender una sustitución en las posiciones aminoacídicas EU235-236. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el aminoácido en la posición 236, por ejemplo, glicina (G), se puede cambiar a una alanina (A), por ejemplo, G236A. En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un F(ab')², puede comprender una sustitución en la posición 235, de acuerdo con la numeración EU. En determinados modos de realización, el aminoácido en la posición 235, por ejemplo, leucina (L), se puede cambiar a una valina (V), por ejemplo, L235V, cambiar a una isoleucina (I), por ejemplo, L235I, o cambiar a una metionina (M) por ejemplo, L235M.

En determinados modos de realización, la modificación o alteración es una deleción de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más o seis o más residuos aminoacídicos. En determinados modos de realización, la una o más deleciones se pueden generar dentro de la región bisagra superior, región bisagra media y/o región bisagra inferior. En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación, por ejemplo, un Fab, F(ab')² o Fab', comprende una región bisagra modificada que tiene una o más deleciones de uno o más aminoácidos en las posiciones EU230-238. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo comprende una deleción en la posición EU231. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo comprende una deleción en las posiciones EU231 y EU232. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo comprende deleciones en las posiciones EU231, EU232 y EU233. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo comprende deleciones en las posiciones EU231, EU232, EU233 y EU234. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo comprende deleciones en las posiciones EU230, EU231, EU232, EU233 y EU234.

En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación comprende una deleción C terminal de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más o seis o más aminoácidos. En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo de la presente comprende la deleción de uno o más aminoácidos en la región bisagra superior, por ejemplo, para generar un truncamiento C terminal. En determinados modos de realización, se pueden delecionar uno o más aminoácidos en las posiciones EU222-225 para obtener un truncamiento C terminal. En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo divulgado en el presente documento, por ejemplo, un fragmento Fab, comprende un truncamiento C terminal. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el extremo C terminal de un fragmento de anticuerpo divulgado en el presente documento, por ejemplo, un fragmento Fab, termina en el residuo aminoacídico D221 (de acuerdo con la numeración EU). En determinados modos de realización, el extremo C de un fragmento de anticuerpo divulgado en el presente documento, por ejemplo, un fragmento Fab, termina en el residuo aminoacídico K222 (de acuerdo con la numeración EU).

En determinados modos de realización, el extremo C de la cadena pesada de un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab, divulgado en el presente documento, termina con aminoácidos que tienen una secuencia seleccionada de CDKTHT (SEQ ID NO: 14), CDKTHF (SEQ ID NO: 15), CDKTH (SEQ ID NO: 16), CDKT (SEQ ID NO: 17), CDK y CD. En determinados modos de realización, el extremo C de la cadena pesada del fragmento Fab termina en la secuencia de aminoácidos CDKTHX (SEQ ID NO: 25), en la que X es cualquier aminoácido excepto T. En determinados modos de realización, un fragmento Fab comprende una región constante de la cadena pesada seleccionada de "CDKTHT", (SEQ ID NO: 14) "CDKTHL", (SEQ ID NO: 15) "CDKTH", (SEQ ID NO: 16) "CDKT", (SEQ ID NO: 17) "CDK" o "CD", como se divulga en la tabla 1 En determinados modos de realización, la materia objeto divulgada actualmente proporciona fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, el fragmento Fab, que comprenden una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5 o 6. En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación comprende una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5. En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación comprende una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

En determinados modos de realización, como alternativa al truncamiento y/o mutación en el extremo C, para evitar respuestas de AHA preexistente, se pueden usar los fragmentos Fab de IgG2 o IgG4. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 7 u 8. En determinados modos de realización, un fragmento Fab de IgG2 o IgG4 puede comprender una deleción C terminal de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más aminoácidos. En determinados modos de realización, un Fab de la presente divulgación es un fragmento Fab de IgG2 que comprende una región constante de la cadena pesada que termina en la secuencia VERK (SEQ ID NO: 26). En determinados modos de realización, el extremo C de la cadena pesada de un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab de IgG4, divulgado en el presente documento, termina con aminoácidos que tienen una secuencia seleccionada de KYGPP (SEQ ID NO: 18), KYGP (SEQ ID NO: 19), KYG, KY y K. En determinados modos de realización, un Fab de la presente divulgación es un fragmento de Fab de IgG4 que comprende una región constante de la cadena pesada seleccionada de "KYGPP", (SEQ ID NO: 18) "KYGP", (SEQ ID NO: 19) "KYG","KY" y "K", como se divulga en la tabla 1. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 o 13.

Tabla 1: secuencias de la cadena pesada de Fab

La presente divulgación proporciona además fragmentos de anticuerpo que comprenden modificaciones conservadoras de las secuencias divulgadas en el presente documento. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la presente divulgación proporciona fragmentos de anticuerpo que comprenden una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o modificaciones conservadoras de las mismas, y en la que el fragmento de anticuerpo mantiene las propiedades deseadas de los fragmentos de anticuerpo divulgados en el presente documento. Por ejemplo, y no a modo de limitación, dichos fragmentos de anticuerpo tienen una reactividad reducida o nula hacia AHA, como se divulga anteriormente.

Como se usa en el presente documento, el término "modificación de secuencia conservadora" pretende referirse a modificaciones aminoacídicas que no afectan significativamente a las características del fragmento de anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones aminoacídicas. Se pueden introducir modificaciones en un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación por técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones aminoacídicas conservadoras incluyen aquellas en las que el residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Las sustituciones aminoacídicas conservadoras ejemplares se muestran en la tabla 2.

En determinados modos de realización, una secuencia divulgada en el presente documento puede tener hasta aproximadamente uno, hasta aproximadamente dos, hasta aproximadamente tres, hasta aproximadamente cuatro, hasta aproximadamente cinco, hasta aproximadamente seis, hasta aproximadamente siete, hasta aproximadamente ocho, hasta aproximadamente nueve o hasta aproximadamente diez residuos aminoacídicos que están modificados y/o sustituidos.

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las propiedades de cadena lateral comunes:

i. hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

ii. hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

iii. ácidos: Asp, Glu;

iv. básicos: His, Lys, Arg;

v. residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

vi. aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

En determinados modos de realización, las sustituciones no conservadoras pueden conllevar intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Tabla 2

Otras regiones bisagra modificadas de la presente divulgación pueden ser completamente sintéticas y se pueden diseñar para poseer propiedades deseadas tales como longitud, composición y flexibilidad. Por ejemplo, y no a modo de limitación, una región bisagra modificada de la presente divulgación se puede alterar para incrementar o disminuir la flexibilidad de la región bisagra. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las modificaciones que pueden incrementar la flexibilidad de la región bisagra incluyen, pero no se limitan a, la sustitución de uno o más residuos aminoacídicos con uno o más residuos aminoacídicos que incrementan la flexibilidad (por ejemplo, glicina). En determinados modos de realización, las modificaciones que pueden disminuir la flexibilidad de la región bisagra incluyen, pero no se limitan a, la sustitución de uno o más residuos aminoacídicos con uno o más residuos aminoacídicos que incrementan la rigidez del polipéptido (por ejemplo, prolina).

B. Procedimientos de preparación de fragmentos de anticuerpo

En determinados modos de realización, los fragmentos de anticuerpo se preparan por genomanipulación de bisagra.

En determinados modos de realización, el material de partida del fragmento de anticuerpo para su uso en conexión con los procedimientos descritos en el presente documento se puede obtener a partir de cualquier anticuerpo completo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal completo), usando cualquier técnica de escisión y/o digestión enzimática adecuada. En determinados modos de realización, el fragmento de anticuerpo se puede obtener por escisión con IdeS.

En determinados modos de realización, las moléculas Fab se generan por digestión proteolítica o expresión recombinante. La digestión proteolítica fue el procedimiento original de producción de Fab (6). La generación de moléculas Fab por medio de digestión proteolítica da como resultado la secuencia C terminal de la cadena pesada de Fab definida por el sitio de escisión de proteasa. A su vez, una molécula Fab incluye típicamente una porción de la bisagra superior del anticuerpo. Esta región bisagra superior del anticuerpo sirve como conector entre la región Fc y Fab, pero no tiene ningún papel estructural o funcional en una molécula Fab. Se puede considerar como un apéndice no estructurado (véase la figura 1A) ya que a menudo no se resuelve por completo en las estructuras cristalinas de las moléculas Fab. Una molécula Fab terapéutica dirigida contra el receptor de superficie plaquetaria GPIIb/IIIa (abeiximab, REOPRO®) se produce comercialmente por escisión proteolítica.

Con los avances en la clonación molecular, la expresión recombinante de fragmentos de anticuerpo es una vía atractiva para generar moléculas Fab (7). En contraste con la digestión proteolítica como vía de producción, la expresión recombinante de moléculas Fab proporciona flexibilidad para definir la longitud de la región bisagra superior incluida. En determinados modos de realización, los fragmentos Fab se producen por expresión recombinante.

La alta afinidad de un anticuerpo a menudo se permite a menudo por el acoplamiento diana bivalente, facilitando la avidez. Por el contrario, el acoplamiento diana de un Fab es monovalente. Esto a menudo da lugar a una menor afinidad por la diana en comparación con la IgG de longitud completa. Al unir dos fragmentos Fab para crear un F(ab')², se puede restablecer la avidez mientras que se conservan propiedades clave del Fab, tales como semivida sérica corta. Además, la selección de múltiples mediadores de enfermedades por anticuerpos biespecíficos se ha vuelto cada vez más importante para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos (8). Las moléculas F(ab')² pueden proporcionar una estructura natural para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos pequeños. En contraste con la producción de moléculas Fab, la expresión recombinante de F(ab')² no es naturalmente posible porque las moléculas Fab' expresadas requieren dominios de homo- o heterodimerización no naturales como fusión (9, 10). Por lo tanto, existen dos enfoques principales para generar moléculas F(ab')²: (i) conjugación química y (ii) digestión proteolítica. Para la conjugación química, las moléculas Fab' generadas de forma recombinante se acoplan por reticulantes homo- o heterobifuncionales (3, 9, 11, 12). De forma análoga al enfoque de digestión proteolítica para producir moléculas Fab, varias proteasas conocidas pueden escindir el anticuerpo intacto en la región bisagra inferior para producir moléculas F(ab')² (13). Dicha digestión proteolítica da como resultado moléculas F(ab')² muy estables donde las dos moléculas Fab se conectan por los dos enlaces disulfuro de la bisagra central. La pepsina es la más ampliamente usada (14), pero se ha descrito más recientemente una enzima de degradación de IgG altamente específica de Streptococcus pyogenes, IdeS, (15, 16). El uso de IdeS permite la generación de un producto altamente homogéneo eliminando la heterogeneidad C terminal observada en la digestión con pepsina (3). En determinados modos de realización, los fragmentos F(ab')² , se producen por escisión con IdeS.

C. Composiciones y procedimientos recombinantes

Los fragmentos de anticuerpo se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567. En determinados modos de realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un fragmento de anticuerpo descrito en el presente documento o una composición que comprende dicho ácido nucleico. Además, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. También se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En determinados modos de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfocítica (por ejemplo, una célula Y0, NS0, Sp20). En determinados modos de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de una molécula Fab, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el Fab, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del Fab y, opcionalmente, recuperar el Fab de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped).

Para la producción recombinante de un Fab, se aísla un ácido nucleico que codifica un Fab, por ejemplo, como se describe anteriormente, y se inserta en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del Fab).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican Fab incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir Fab en bacterias. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol.

248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de la expresión, el Fab se puede aislar de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar además.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican Fab, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado". Véanse Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión de proteínas glucosiladas también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas de células de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de Fab, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.

255-268 (2003).

D. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas de un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, Fab y F(ab')², como se describe en el presente documento, se preparan mezclando dicho fragmento de anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, las formulaciones de anticuerpo liofilizadas se describen en la patente de EE. Uu . n.° 6.267.958. En determinados modos de realización, las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.

En determinados modos de realización, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación puede tener una pureza mayor de aproximadamente un 80 %, mayor de aproximadamente un 90 %, mayor de aproximadamente un 91 %, mayor de aproximadamente un 92 %, mayor de aproximadamente un 93 %, mayor de aproximadamente un 94 %, mayor de aproximadamente un 95 %, mayor de aproximadamente un 96 %, mayor de aproximadamente un 97 %, mayor de aproximadamente un 98 %, mayor de aproximadamente un 99 %, mayor de aproximadamente un 99,1 %, mayor de aproximadamente un 99,2 %, mayor de aproximadamente un 99,3 %, mayor de aproximadamente un 99,4 %, mayor de aproximadamente un 99,5 %, mayor de aproximadamente un 99,6 %, mayor de aproximadamente un 99,7 %, mayor de aproximadamente un 99,8 % o mayor de aproximadamente un 99,9 %.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. Uu . n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Una composición de la presente divulgación se puede administrar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. La vía y/o modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegen el compuesto contra la liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Muchos procedimientos para la preparación de dichas formulaciones se describen, por ejemplo, por Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. En determinados modos de realización, las composiciones farmacéuticas se fabrican bajo las condiciones de prácticas correctas de fabricación (GMP) de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU.

El vehículo puede ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, raquídea o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, el fragmento de anticuerpo, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Las composiciones farmacéuticas divulgadas también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares, en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede provocar por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

En determinados modos de realización, cuando los anticuerpos de la presente invención se administran como productos farmacéuticos a seres humanos y animales, se pueden administrar solos o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 99,5 % (o de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 90 %) de un fragmento de anticuerpo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

E. Procedimientos y composiciones terapéuticos

Cualquiera de los fragmentos de anticuerpo proporcionados en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos. En determinados modos de realización, se proporciona un fragmento de anticuerpo para su uso como medicamento. En determinados modos de realización, se proporciona un fragmento de anticuerpo para su uso en el tratamiento de una indicación de enfermedad particular. En determinados modos de realización, se puede usar un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación para tratar una enfermedad y/o trastorno ocular. En determinados modos de realización, se puede usar un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación para tratar una enfermedad y/o un trastorno que se beneficiaría de la aplicación de un fragmento de anticuerpo que presenta una semivida sistémica corta. En determinados modos de realización, se proporciona un fragmento de anticuerpo para su uso en un procedimiento de tratamiento.

En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona un fragmento de anticuerpo para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad específica que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del fragmento de anticuerpo o composiciones que comprenden el mismo. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona un fragmento de anticuerpo para su uso en la inhibición de una vía y/o mecanismo molecular particular. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona un fragmento de anticuerpo para su uso en un procedimiento de inhibición de una vía y/o mecanismo molecular particular en un individuo que comprende administrar al individuo un fragmento de anticuerpo eficaz para inhibir la vía y/o mecanismo molecular particular. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona un fragmento de anticuerpo para su uso en la activación de una vía y/o mecanismo molecular particular. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona un fragmento de anticuerpo para su uso en un procedimiento de activación de una vía y/o mecanismo molecular particular en un individuo que comprende administrar al individuo un fragmento de anticuerpo eficaz para inhibir la vía y/o mecanismo molecular particular. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona el uso de un fragmento de anticuerpo en la fabricación o preparación de un medicamento. En determinados modos de realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad particular. En determinados modos de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad particular que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad eficaz del medicamento. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En determinados modos de realización, el medicamento es para inhibir o activar una vía y/o mecanismo molecular particular. En determinados modos de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de inhibición o activación de una vía y/o mecanismo molecular particular en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para inhibir una vía y/o mecanismo molecular particular. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad particular. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene dicha enfermedad una cantidad eficaz de un fragmento de anticuerpo. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona un procedimiento para inhibir una vía y/o mecanismo molecular particular en un individuo. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un fragmento de anticuerpo para inhibir una vía y/o mecanismo molecular particular. En determinados modos de realización, un "individuo" es un ser humano.

En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los fragmentos de anticuerpo proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En determinados modos de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los fragmentos de anticuerpo proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los fragmentos de anticuerpo proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Los fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación se pueden usar solos o en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional.

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o formulaciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del anticuerpo de la presente divulgación se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de la administración del agente o agentes terapéuticos adicionales. En determinados modos de realización, la administración del fragmento de anticuerpo y la administración de un agente terapéutico adicional se producen dentro de aproximadamente un mes, o dentro de aproximadamente una, dos o tres semanas, o dentro de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí. Los fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento también se pueden usar en combinación con radioterapia.

Se puede administrar un fragmento de anticuerpo (y cualquier agente terapéutico adicional) por cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar, intraocular e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraocular, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.

Los fragmentos de anticuerpo se formulan, dosifican y administran de forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores para su consideración en este contexto incluyen la enfermedad particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa de la enfermedad, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. El fragmento de anticuerpo no lo necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar la enfermedad en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de fragmento de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de enfermedad o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de fragmento de anticuerpo, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra fragmento de anticuerpo con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al fragmento de anticuerpo y el criterio del médico especialista. El fragmento de anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de fragmento de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 |jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del fragmento de anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del fragmento de anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores se puede llevar a cabo usando un inmunoconjugado en lugar de o además de un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación.

F. Inmunoconjugados

La materia objeto divulgada actualmente también proporciona inmunoconjugados, que incluyen un fragmento de anticuerpo, divulgado en el presente documento, conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, proteínas, péptidos, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) o isótopos radiactivos. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de la materia objeto divulgada se puede enlazar funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más de otras moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión.

En determinados modos de realización, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un fragmento de anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, incluyendo pero sin limitarse a un maitansinoide (véanse las patentes de EE. Uu . n.os 5.208.020, 5.416.064, y la patente europea EP 0425235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco monometilauristatina DE and DF (MmAE y MMAF) (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de la misma (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, y 5.877.296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (véanse Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En determinados modos de realización, un inmunoconjugado incluye un fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero sin limitarse a cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfasarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

En determinados modos de realización, un inmunoconjugado incluye un fragmento de anticuerpo, como se describe en el presente documento, conjugado con un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos no limitantes incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa un radioconjugado para la detección, puede incluir un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de un fragmento de anticuerpo y un agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúdido al anticuerpo. Véase el documento WO 94/11026. El conector puede ser un "conectar escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020). Los ejemplos no limitantes de conectores se divulgan anteriormente.

Los inmunoconjugados divulgados en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).

G. Artículos de fabricación

En determinados modos de realización de la presente divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación. La ficha técnica o prospecto de envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o terapéutico de otro modo. El artículo de fabricación en este modo de realización de la presente divulgación puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado en lugar de o además de un fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento.

III Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de los procedimientos y composiciones de la presente divulgación. Se entiende que se pueden practicar otros diversos modos de realización, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Ejemplo 1: evadir la respuesta de anticuerpos antibisagra preexistentes por genomanipulación de bisagra

Los fragmentos de anticuerpo Fab y F(ab')² sirven como formatos alternativos a los anticuerpos de longitud completa en ensayos terapéuticos e inmunológicos. Proporcionan la ventaja de un tamaño pequeño, vida media sérica corta y falta de función efectora. Varias proteasas asociadas con enfermedades invasivas son conocidas por escindir anticuerpos en la región bisagra y dar como resultado anticuerpos antibisagra (AHA) hacia los neoepítopos. El AHA preexistente en suero puede actuar como Fc sustituto y reintroducir las propiedades de la Fc carentes en fragmentos de anticuerpo. Aunque se desea esta respuesta durante el proceso natural de lucha contra la enfermedad, comúnmente no es deseada para los fragmentos de anticuerpo terapéuticos. En este estudio, se identificó un truncamiento en la región bisagra inferior del anticuerpo que mantiene una escisión proteolítica eficaz por la proteasa IdeS. El neoepítopo resultante en el extremo C de F(ab')² no tuvo AHA preexistente detectable, proporcionando una vía práctica para producir F(ab')² in vitro por digestión proteolítica cuando no se desea una respuesta de AHA preexistente. En este estudio, también se estudió la región bisagra superior del anticuerpo, que proporcionó un análisis detallado de la contribución de los residuos C terminales de la bisagra superior de IgG1, IgG2 e IgG4 humanas a la reactividad de AHA preexistente en suero humano. Aunque no se observaron anticuerpos preexistentes hacia el Fab de isotipo IgG2 e IgG4, se observó una respuesta significativa hacia la mayoría de los residuos de la bisagra superior de IgG1 humana. Se identificaron una mutación T²²⁵L (también denominada en el presente documento la "variante T²²⁵L") y D²²¹ C terminal natural como soluciones con una reactividad sérica mínima. Este estudio permitió la producción de fragmentos Fab y F(ab')² para ensayos terapéuticos e inmunitarios que tienen una reactividad mínima hacia AHA preexistente.

Materiales y procedimientos

Construcción de plásmido y expresión de anticuerpo: los anticuerpos se clonaron por técnicas estándar de biología molecular en vectores de expresión en E. coli (9, 23) o vectores de expresión en mamífero (24) como se describe previamente. La expresión en E. coli se llevó a cabo como se describe en Simmons et al. (23). Se expresaron IgG y Fab en cultivos de transfección transitoria de 30 ml de células CHO (25) o HEK293T (26) como se describe previamente.

Clonación, expresión y purificación de IdeS: se expresó IdeS como proteína de fusión de glutatión S-transferasa (GST) N terminal. Se optimizó por codón la secuencia madura de IdeS de Streptococcus pyogenes MGAS1882 (Uniprot ID H8HDR0) para la expresión de E. coli y se sintetizó por GeneArt™ y se clonó por técnicas de biología molecular estándar en el vector de expresión de E. coli (23). Se expresó IdeS usando las condiciones descritas en Simmons et al. (23) y se purificó usando una columna de glutatión Sepharose (GSH). Se concentraron las fracciones de eluido en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, glutatión 20 mM de la columna GSH y se cargaron en una columna S200 y se eluyeron con K²HPO⁴200 mM, pH 6,2, KCl 250 mM.

Purificación de anticuerpo y Fab: después de la expresión, se sedimentaron las células por gravedad. Se transfirieron los sobrenadantes a un tubo Falcon de 50 ml (Coming, Corning, NY, EE. UU.). Se añadieron 400 pl de suspensión de afinidad de proteínas MabSelect SuRe™ al 50 % o suspensión Gamma Bind™ Plus (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE. UU.) a los sobrenadantes para la purificación de IgG y Fab, respectivamente. Se incubó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente en un agitador de plataforma Innova 2000 (New Brunswick Scientific, Enfield, CT, EE. UU.). Se retiraron los sobrenadantes y se transfirió la resina a una placa de filtro de 2 ml de 96 pocillos con una membrana de 25 pm de tamaño (Thompson Instrument, Oceanside, CA, EE. UU.). Se lavó la resina tres veces con 1 ml de 1x PBS pH 7,4 por centrifugación a 1.120 x g durante 5 minutos usando una centrífuga Sorvall™ HT6 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Para la purificación de Fab, se lavó la resina además con 0,2x PBS pH 5,0 antes de la elución. Se eluyó IgG usando ácido fosfórico 50 mM pH 2,9 y se neutralizó el eluido con 20x PBS pH 11,0 por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos. Se eluyeron los fragmentos Fab usando citrato de sodio 10 mM pH 2,9 y se neutralizó con Tris 0,3 M pH 9,0. Se filtraron IgG y Fab eluidos a través de una placa de filtro de 96 pocillos de 0,2 pm (Orochem, Naperville, IL, EE. UU.) por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos usando una centrífuga Sorval1HT6 (Thermo Scientific, Waltham, Ma , EE. UU.).

Digestión con IdeS de variantes de bisagra de IgG: se incubó IgG a 1 mg/ml con proporción IdeS:IgG establecida (p/p) a 37 °C durante 24 horas. Para ampliar la digestión para generar material de F(ab')² altamente puro en grandes cantidades para ensayos de AHA, se usó una proporción IdeS:IgG de hasta 1:10 para impulsar la digestión completa.

Purificación de F(ab')² después de la escisión de IgG por IdeS: se diluyó la muestra escindida con IdeS con acetato de sodio 25 mM, pH 4,4 (tampón A) y se cargó en una columna de intercambio catiónico de alto rendimiento SP Sepharose de 1 ml (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE. UU.) a 150 cm/h (0,7 cm de diámetro, 10 cm de altura del lecho) equilibrada en tampón A. Se lavó la columna hasta el valor de referencia con tampón A y F(ab')² eluido con un gradiente salino lineal de NaCl de 0 a 0,5 M sobre 30 volúmenes de columna. Se neutralizó el eluido por adición de Tris 3 M pH 9,0 para ajustar el pH a 7,0 y se filtró a través de STERIFLIP® de 0,22 pm (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). Se purificó además el F(ab')² eluido con SP en una columna de intercambio catiónico fuerte MonoS 5/50 GL (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE. UU.) después de diluir con tampón A para reducir la conductividad <5 mS/cm. Se lavó la columna hasta el valor de referencia (<0,05 mUA) con tampón A y se eluyó el F(ab')² usando un gradiente salino de NaCl 0 a 0,6 M sobre 40 volúmenes de columna. Se neutralizó la solución de F(ab')² eluido con Tris 3 M pH 9,0 para ajustar el pH a 7,0 y se filtró a través de STERIFLIP® de 0,22 pm (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.).

Espectrometría de masas de fragmentos Fab y F(ab'h: los datos de espectrometría de masas se adquirieron usando un sistema Agilent 6224 TOF CLEM (Agilent Technology, Santa Clara, CA, EE. UU.). Se redujo F(ab')² con ditiotreitol 100 mM a 37 °C durante 20 minutos. Se separaron las cadenas polipeptídicas con una columna de fase inversa PLRP-S (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Se obtuvieron masas intactas de las cadenas ligera y pesada reducidas por deconvolución de entropía máxima usando el programa informático MassHunter (Qualitative Analysis B.03.01).

Análisis de proteína por electroforesis capilar: todas las muestras se prepararon mezclando 5 pl de volumen de muestra con 7 pl de tampón de muestra HT Protein Express y se incubaron durante 5 minutos a 70 °C. Se añadieron 32 pl de agua a las muestras y se centrifugó a 1.000 x g durante 5 minutos. El chip se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante proporcionadas en la guía del usuario de LabChip GXII y las muestras se analizaron en un sistema de microfluidos Caliper GX II (PerkinElmer® Biotechnology, Waltham, MA, EE. UU.). Se analizaron las muestras en un sistema de microfluidos Caliper GX II (PerkinElmer® Biotechnology, Waltham, MA, EE. UU.). Todos los reactivos se obtuvieron de PerkinElmer®.

Ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) de anticuerpos antibisagra preexistentes: se recubrieron placas MAXISQRP® (384 pocillos, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, EE. UU.) con 1 pg/ml de F(ab')² o Fab en carbonato 50 mM, pH 9,6 a 4 °C durante la noche. Se lavaron las placas con polisorbato 20 al 0,05 % en PBS, pH 7,4 y a continuación se bloquearon con BSA al 0,5 %, 15 ppm de proclina en PBS, pH 7,4. Se diluyó en serie suero humano combinado de 25 mujeres y 25 hombres (BioreclamationIVT, Westbury, NY, EE. UU.) en tampón de ensayo (BSA al 0,5 %, polisorbato 20 al 0,05 %, 15 ppm de PROCLIN™, en PBS, pH 7,4) y se añadió a las placas. Después de 2 horas de incubación, se detectó el anticuerpo antibisagra preexistente unido usando Fc anti-IgG humana conjugado con anti-F(ab')² de cabra con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en tampón de ensayo, seguido de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB, Moss Inc., Pasadena, MD, EE. UU.) como sustrato. Se detuvo la reacción con ácido fosfórico 1 M y se leyó la absorbancia a 450 nm. Se usaron las lecturas de absorbancia a una dilución 1:30 para permitir la presentación en las figuras de todas las muestras. Se observaron resultados comparables a una dilución de suero 1:10. Para calcular la reactividad de AHA relativa, se ajustó la curva de valoración de F(ab')² con un programa de ajuste de curvas de 4 parámetros (KaleidaGraph, Synerg Software, Reading, PA). Se determinó la DOmed (la Do promedio de las lecturas de DO superior e inferior) de la curva de valoración de F(ab')². Se calcularon las diluciones de Fab DKTHT (SEQ ID NO: 21) y F(ab')² correspondientes a esta DOmed y se usaron para calcular la reactividad de AHA relativa.

SDS-PAGE e inmunotransferencias: para SDS-PAGE, se mezclaron 5 |jg de variantes de F(ab')² purificadas y GST-IdeS con tampón de muestra s Ds , se calentó durante 5 min a 95 °C y se centrifugó durante 1 min a fuerza centrífuga relativa de 16.000. Se cargaron las muestras sobre geles NuPAGE4-12 % BisTris/MES (Invitrogen). Para la inmunotransferencia, se usaron 5 ng de muestras de proteína para SDS-PAGE. Se transfirieron los geles por IBFOT® (Invitrogen) sobre una membrana de nitrocelulosa, se inmunotransfirieron con anti-IdeS (Genovis, EE. UU.; n.° catálogo A3-AF1-010, n.° lote A3AF1-7C17H) como anticuerpo primario y anticuerpo anticaprino de burro conjugado IRDye800CW (Li-COR®, EE. UU.; n.° catálogo 926-32214, n.° lote b 80821-03) como anticuerpo secundario, y se obtuvieron imágenes con un aparato de diagnóstico LI-COR® Odyssey® (LI-COR®, EE. UU.). Se usó el marcador de peso molecular de proteínas Odyssey® Two-color (LI-COR®, EE. UU.) para inmunotransferencias y se usó SEEBFUE® Plus2 (Invitrogen, EE. u U.) teñido previamente para los geles teñidos con Coomassie.

Mediciones de estabilidad de proteínas por fluorimetría de barrido diferencial: se determinó la estabilidad de proteínas en un Biorad CFX96 TOUCH™ Real-Time System (Biorad, EE. UU.) con una dilución final de 1:200 de la reserva de tinte SYPRO® Orange (Molecular Probes™, EE. UU.). Se añadió 1 j l de reserva de tinte SYPRO® Orange a 24 j l del anticuerpo purificado a 100 jg/ml. Se registró la fluorescencia de la muestra de 25 j l final en PBS de 20-100 °C (incrementos de 0,2 °C, retención de 10 segundos por etapa).

Resultados

El extremo C de Fab determina la respuesta a AHA preexistente: originalmente, se estudió la reactividad de autoanticuerpos en suero humano hacia la bisagra superior de moléculas Fab con un anticuerpo escindido con papaína, abciximab (5). La escisión de papaína deja una H²²⁴ C terminal en el Fab. Posteriormente, se llevó a cabo un estudio más exhaustivo usando análogos peptídicos biotinilados para examinar la contribución de residuos C terminales individuales de la bisagra superior (20). En este estudio, solo se observó reactividad de AHA mínima hacia los residuos de bisagra superior de K²²² a H²²⁴. No se observó ninguna señal hacia los péptidos con T²²⁵ como residuo C terminal. El uso de péptidos sintéticos puede confundir los resultados porque la cola de Fab que abarca los residuos de bisagra superior D²²¹ a T²²⁵ (figura 1A) se presenta fuera del contexto de la molécula intacta. Por tanto, se estudió la contribución de la cola de Fab para la unión a AHA preexistente en el marco de un Fab intacto.

La expresión recombinante de moléculas Fab en E. coli y células de mamífero permite producir fácilmente moléculas con extremos C terminales definidos sin necesidad de escisión proteolítica. Para garantizar la integridad del extremo C, se confirmó la masa correcta del Fab purificado por espectrometría de masas intacta. Las moléculas Fab se recubrieron en placas de microvaloración y, después de la incubación con suero de donante humano combinado, se cuantificó la unión de AHA preexistente por detección anti-Fc. De acuerdo con el estudio previo (20), T²²³ en el extremo C (que tiene la secuencia DKT, también denominada en el presente documento "CDKT" (SEQ ID NO: 17)) mostró la mayor reactividad de todas las variantes de bisagra superior hacia AHA preexistente (figura 1B). Se observa una diferencia significativa con los estudios previos con T²²⁵ en el extremo C (que tiene la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 21), también denominada en el presente documento "CDKTHT" (SEQ iD NO: 14)). Esta variante no se unió a AHA como péptido (20); sin embargo, se observó una reactividad de AHA sustancial cuando se sometió a prueba como Fab. Con D²²¹ en el extremo C (que tiene la secuencia D, también denominada en el presente documento "CD"), la unión de AHA se redujo casi al fondo. Por tanto, la terminación del Fab en D²²¹ proporciona una solución para minimizar el reconocimiento por AHA preexistente mientras se mantiene una secuencia de anticuerpo natural.

Como se demuestra por estos experimentos, el residuo de Fab C terminal tiene un profundo impacto en la unión de AHA. Se investigó si la unión por anticuerpos preexistentes también se podría obviar por un único cambio aminoacídico en el extremo C terminal y proporcionar una vía alternativa a D²²¹ para minimizar la reactividad hacia AHA. Se introdujo una variante T²²⁵L para colocar un residuo no natural en el extremo C de Fab, y se sometió a prueba su unión de AHA. La variante T²²⁵L se ha descrito previamente (7). La mutación perturbó la unión del AHA preexistente (figura 1B), lo que destaca además la importancia del extremo C para la unión. Para excluir la posibilidad de que la reducción de AHA en T²²⁵L se deba a una eficacia de recubrimiento reducida, se usó un formato de captura de antígeno para capturar las moléculas Fab y también se observó una cantidad similar de reducción de la señal de AHA. Para determinar si esta observación se puede generalizar, se incubaron tres Fab diferentes con suero humano combinado y se detectó la unión de anticuerpos preexistentes por ELISA. Se observó una señal significativa para los tres Fab diferentes que tenían un extremo C DKTHT (SEQ ID NO: 21) mientras que de hecho se detectó una unión reducida de anticuerpos preexistentes al extremo C D²²¹ y T²²⁵L. (figura 1C).

A continuación, se estudiaron las moléculas Fab de isotipos IgG2 e IgG4. Mientras que IgG1, IgG2 e IgG4 se usan comúnmente para anticuerpos terapéuticos, el uso de Fab de IgG2 e IgG4 no se ha aprovechado para el desarrollo terapéutico hasta ahora. Por tanto, se sometieron a prueba Fab de IgG2 e IgG4 con la región bisagra superior completa (figura 1D; K²¹⁸ y P²²⁵ C terminales, respectivamente). Al contrario que para Fab de IgG1, los Fab de IgG2 e IgG4 no se reconocieron por el AHA preexistente. A continuación, se truncó la bisagra superior de la IgG4. La longitud de la bisagra superior de isotipo IgG4 es más corta en comparación con IgG1 (véase la figura 6A-B); sin embargo, puesto que la cisteína implicada en el disulfuro intercatenario pesada-ligera se localiza en el centro de la estructura primaria Ch1, pudo incluir los residuos K²¹⁸ e Y²¹⁹ en los experimentos de truncamiento. Estos Fab de bisagra superior truncados mostraron una señal similar a la bisagra superior de IgG1 intacta (figura 1B).

Todas las moléculas Fab dentro del mismo isotipo proporcionaron niveles de expresión similares en E. co liy CHO (figura 7). No se observó ningún cambio en la estabilidad térmica dentro del mismo isotipo (tabla 3). La estabilidad térmica de Fab de IgG2 e IgG4 disminuyó en aproximadamente 6 °C en comparación con el isotipo IgG1.

En conclusión, existen múltiples formatos de Fab con reactividad mínima hacia AHA preexistente: IgG1-D221, IgG1-T²²⁵L, IgG2 e IgG4.

Tabla 3. Estabilidad térmica de Fab T30M determinada por fluorimetría de barrido diferencial

IgG1 con la bisagra inferior de IgG2 no se puede escindir eficazmente: los AHA preexistentes hacia la región bisagra inferior de F(ab')² se han descrito ampliamente en la literatura (13, 27). De forma análoga al AHA para la bisagra superior de moléculas Fab, estos AHA pueden actuar como Fc sustituto o introducir artefactos de ensayo. Por tanto, es deseable el desarrollo de un formato de F(ab')² que impida la unión de AHA. Aunque se encuentran AHA en suero hacia F(ab')² de isotipo IgG1, no ha sido posible establecer la existencia de autoanticuerpos para la bisagra inferior del isotipo IgG2. De forma interesante, la falta de dichos autoanticuerpos coincide con la incapacidad de las proteasas humanas fisiológicamente pertinentes para escindir eficazmente IgG2 en fragmentos F(ab')² (28). Sin embargo, se ha observado una escisión ineficaz de IgG2 usando la proteasa IdeS (28). IdeS es una endoproteasa específica de IgG de Streptococcus pyrogenes que se escinde después de G²³⁶. Además del sitio de escisión en la región bisagra de anticuerpo, reconoce un segundo sitio en la Fc que contribuye a su alta especificidad hacia IgG (15, 16). La escisión ineficaz de los anticuerpos IgG2 se podría deber al exositio fuera del sitio de escisión. Por tanto, los residuos de bisagra inferior de IgG2 se injertaron sobre IgG1 para crear una quimera IgG1-2 (figura 2B). Se sometió a prueba la eficacia de escisión a diferentes proporciones IdeS:IgG (figura 2C). Aunque la IgG1 natural se escindió eficazmente en F(ab')² en una proporción IdeS:IgG de 1:500, fue necesaria una concentración de proteasa al menos 50 veces mayor para lograr una escisión similar de la quimera IgG1-2. Se concluyó que las diferencias de secuencia en la bisagra inferior contribuyen al menos parcialmente a la escasa eficacia de escisión de los anticuerpos IgG2. Por tanto, la quimera IgG1-2 puede no ser una estrategia práctica para generar moléculas F(ab')² que no se unen a AHA preexistente.

Caracterización de las posiciones P1 y P2 para una escisión IdeS eficaz: se demostró que la unión de AHA preexistente se puede evitar por una única mutación C terminal T²²⁵L con los experimentos de Fab descritos. Se empleó una estrategia similar para F(ab')². Como primera etapa, se identificaron los residuos en el sitio P1 (EU236) y P2 (EU235) que permiten la escisión por la proteasa IdeS. Se generó un conjunto de 76 variantes de Fab que incluyeron L²³⁵, L²³⁵V, L²³⁵I o L²³⁵M en la posición P2 para IdeS y se combinaron con cualquier aminoácido excepto cisteína en P1 (figura 3D y E). Los anticuerpos se purificaron y digirieron con IdeS en una proporción IdeS:IgG de 1:10 para identificar variantes que se pueden escindir por IdeS. Se eligió una proporción de proteasa con respecto a anticuerpo tan alta para evaluar la proteólisis sin tener en cuenta la eficacia de escisión. Se identificaron siete variantes que se escindieron por IdeS (figura 3A). Aunque la posición P2 toleró los cuatro residuos sometidos a prueba, solo dos aminoácidos con cadenas laterales muy pequeñas, la glicina y alanina naturales, se aceptaron en la posición P1. Este subconjunto se investigó además para determinar su eficacia de escisión en tres proporciones IdeS:IgG diferentes: 1:500, 1:200 y 1:100 (figura 3B) y 1:10 (figura 3C). La variante L²³⁵V en la posición P2 demostró un cambio mínimo en la eficacia de escisión en comparación con la secuencia natural. Todas las otras variantes se caracterizaron por una única escisión dominante en un solo lado de la bisagra, dejando el otro lado del anticuerpo intacto. Mientras que las variantes L²³⁵I y L²³⁵M con glicina en la posición P1 se podían escindir completamente en una proporción IdeS:IgG de 1:200, todas las variantes P2 con alanina en P1 necesitaron cantidades de proteasa significativamente mayores. Por tanto, la escisión eficaz por IdeS requiere glicina en la posición P1.

Las variantes de F(ab')² C terminales no evitan el reconocimiento por AHA preexistente: IdeS puede confundir los resultados del ensayo de AHA preexistente con un resultado positivo falso. Esto se puede explicar por la unión de anticuerpos séricos por IdeS y su posterior reconocimiento por el anticuerpo de detección anti-Fc. Por lo tanto, se garantizó que las moléculas F(ab')² usadas en el ensayo no contenían IdeS de la reacción de proteólisis anterior. La retirada de IdeS en las proteínas F(ab')² purificadas se confirmó por SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie e inmunotransferencia anti-IdeS (figura 4A).

A continuación, se sometieron a prueba las variantes de F(ab')² P1 y P2 purificadas para determinar su reconocimiento por AHA preexistente (figura 4B). Aunque existió una reducción de señal en comparación con la natural, ninguno de los anticuerpos con modificaciones C terminales eliminó la reactividad con autoanticuerpos séricos. Los cambios en la posición P2 solo tuvieron un impacto modesto. El cambio de G²³⁶ A en la posición P1 redujo la señal a niveles comparables a un Fab. Sin limitarse a una teoría particular, no es posible por tanto diseñar una bisagra inferior con una variante aminoacídica que mantenga la escisión por IdeS y simultáneamente elimine la respuesta de anticuerpo preexistente contra el F(ab')².

Las deleciones en la bisagra inferior evitan el reconocimiento por AHA preexistente mientras mantienen la escisión por IdeS: se empleó otra estrategia para retirar el epítopo del AHA truncando la bisagra inferior. Dejando intactos los residuos P1 (EU236) y P2 (EU235) por su importancia en la eficacia de escisión, se generaron deleciones de residuos simples y dobles en los sitios P3 (EU234), P4 (EU233) y P5 (EU232) de IdeS para identificar residuos con un impacto mínimo en la eficacia de escisión (véase la figura 5F). Se observó una eficacia de escisión significativamente escasa con la deleción de la posición P3, por tanto esta posición no se consideró para otros estudios (figura 5A). Se sometieron a prueba anticuerpos con deleciones de P4, P5 y una combinación de ambos (AP45; también denominado en el presente documento una deleción de residuos aminoacídicos en las posiciones EU232-233) para determinar su unión a AHA (figura 5B). Para estas variantes, se observó una señal menor en comparación con la secuencia de bisagra natural. Para reducir además el reconocimiento de bisagra por AHA preexistente, se extendió la deleción para incluir los residuos P6 (EU231) y P7 (EU230) (véase la figura 5F). Aunque la deleción de los sitios P4 a P7 (AP4567; también denominada en el presente documento una deleción de residuos aminoacídicos en las posiciones EU230-233) dio como resultado una eficacia de escisión modestamente reducida, la deleción de los sitios P4 a P6 (AP456; también denominada en el presente documento una deleción de residuos aminoacídicos en las posiciones EU231-233) tuvo una eficacia de escisión comparable a la natural en una proporción IdeS:IgG de 1:200 (figura 5C y figura 8). Ambas variantes no dieron como resultado reconocimiento de AHA preexistente (figura 5D). Para garantizar que se mantiene una alta especificidad de escisión de IdeS, se usó espectrometría de masas ESI-TOF para analizar el F(ab')² escindido con IdeS. Solo se observó una única masa correspondiente al sitio de escisión esperado en G²³⁶ para el F(ab')² natural así como para la variante AP456 de F(ab')² (figura 5E).

Como se muestra en la figura 11, la señal de unión de AHA observada de la variante AP456 de F(ab')² es comparable a las dos variantes C terminales de Fab, D²²¹ de Fab y T²²⁵L de Fab. Las diluciones correspondientes a la DO (1,15) en el medio de las curvas de valoración de F(ab')² fueron 70 y 14 para F(ab')² y Fab, respectivamente. Sin limitarse a una teoría particular, la actividad de AHA cinco veces mayor observada con F(ab')² en comparación con T²²⁵ de Fab se puede explicar por la unión bivalente potencial de AHA al F(ab')², lo que indica que las moléculas F(ab')² deben evitar el a Ha preexistente. Para excluir la posibilidad de que la reactividad de AHA reducida observada en AP456 de F(ab')² y T²²⁵L de Fab se debiera a una eficacia de recubrimiento reducida, se usó un formato de captura de antígeno para detectar AHA. Las lecturas de DO (n=4) fueron 2,2 ± 0,1, 0,34 ± 0,03, 1,3 ± 0,1, 0,36 ± 0,02 y 0,32 ± 0,01 en pocillos recubiertos de antígeno que recibieron F(ab')², AP456 de F(ab')², Fab, T²²⁵L de Fab y tampón en una dilución de suero 1:30, respectivamente. Por tanto, estos resultados confirmaron que AP456 de F(ab')² y T²²⁵L de Fab tuvieron una reactividad de AHA reducida en comparación con sus correspondientes moléculas naturales.

Estos datos muestran que la variante AP456 proporciona una solución para evitar la respuesta de AHA preexistente hacia la bisagra inferior de F(ab')² mientras se mantiene la posibilidad de producir el fragmento de anticuerpo F(ab')² por la vía bien establecida de digestión proteolítica.

Deleciones en la bisagra inferior en variantes de Fíab'b C terminales: Se analizaron las variantes C terminales que tenían deleciones en la región bisagra inferior para determinar si se alteró el reconocimiento por AHA preexistente. Se generó un conjunto de 6 variantes que incluían L²³⁵, L²³⁵V, L²³⁵I o L²³⁵M en la posición P2 para IdeS con alanina o glicina en P1 con diversas deleciones en la región bisagra (figura 9). Este subconjunto se investigó además para determinar su eficacia de escisión en tres proporciones IdeS:IgG diferentes: 1:10 (figura 9A), 1:100 (figura 9B) y 1:500 (figura 9C). Como se muestra en la figura 9D, la variante L²³⁵V o G²³⁶A en combinación con una deleción en P5, dio como resultado una señal de AHA reducida en comparación con la deleción de P5 solo. Como se muestra en la figura 10, la variante AP456 que incluía L²³⁵V, L²³⁵I o L²³⁵M en la posición P2 con alanina o glicina en P1 presentó reducciones similares en la señal de AHA en comparación con AP456 solo (figura 10B); sin embargo, la deleción de AP456 solo presentó una mejor eficacia de escisión en comparación con las variantes en combinación con AP456 (figura 10A).

Análisis

Los fragmentos de anticuerpo tales como Fab y F(ab')² son formatos terapéuticos atractivos cuando se desean simultáneamente una semivida sistémica corta y una molécula inactiva efectora. Determinados fragmentos también son productos naturales de proteasas asociadas con enfermedades invasivas tales como células tumorales y bacterias y se generan en un esfuerzo por evadir la vigilancia inmunológica. Como consecuencia, el neoepítopo C terminal del fragmento Fab y F(ab')² se reconoce por el sistema inmunitario y da como resultado AHA que puede proporcionar Fc sustituto.

En este estudio, se examinó la reactividad de AHA preexistente hacia los residuos C terminales individuales que abarcan la región bisagra superior de isotipo IgG1, IgG2 e IgG4 humanos. Aunque se informó previamente de que no existía AHA preexistente hacia neoepítopos en la bisagra inferior de anticuerpos IgG2 humanos escindidos con IdeS, la reactividad hacia la bisagra superior de isotipos humanos se investigó de forma incompleta hasta ahora. En este estudio, no se detectó AHA preexistente hacia la bisagra superior de isotipo IgG2 e IgG4. Esto, a su vez, puede sugerir que estos isotipos no son la diana de las proteasas de enfermedades invasivas. Esto se puede explicar por la naturaleza atenuada efectora de estos isotipos y el hecho de que retirar la región Fc de estos isotipos no proporciona una ventaja para tumores y bacterias. Por el contrario, el isotipo IgG1 parece ser la diana principal para estas proteasas. De hecho, se han descrito varias proteasas por escindir en la bisagra superior de IgG1 humana, incluyendo plasmina, elastasa neutrófila humana y LysC. Este estudio muestra que existen AHA preexistentes hacia todos los sitios de escisión de la bisagra superior de IgG1 humana con la excepción de D²²¹. Sin limitarse a una teoría particular, la ausencia de AHA hacia D²²¹ puede ser un reflejo de la incapacidad de las proteasas humanas para escindir después de este residuo o la incapacidad de generar anticuerpos hacia este neoepítopo. La mayor reactividad se observó hacia el Fab T²²³ C terminal. De forma interesante, este extremo C coincide con el punto de escisión de la elastasa neutrófila humana, una proteasa que se secreta por neutrófilos y macrófagos durante la inflamación para destruir bacterias y tejido del huésped (29).

Los AHA preexistentes pueden incorporar rápidamente la función efectora a una molécula que se diseña para no ser efectora. El uso de un isotipo Fab de IgG2 o IgG4 puede proporcionar una estrategia para suministrar una molécula sin una respuesta de anticuerpos preexistentes. De forma alternativa, introducir un residuo no natural en el extremo C de la cadena pesada, como la mutación T²²⁵L, o truncar la bisagra superior a D²²¹ es una estrategia para el isotipo IgG1. Aunque la mutación T²²⁵L elimina la respuesta hacia AHA preexistente, implica que en principio, también puede provocar una respuesta inmunitaria. Esto se respalda además por un estudio reciente con un anticuerpo de dominio anti-TNFR1 (34). La adición de una alanina C terminal fue suficiente para reducir la unión de anticuerpos anti-VH humanos preexistentes durante el cribado in vitro; sin embargo, se descubrió que un sujeto desarrolló niveles altos de anticuerpos específicos hacia el extremo C modificado en un ensayo clínico de fase I. Además, la actividad de exopeptidasa potencial en una cola más larga puede dar como resultado finalmente un neoepítopo que se reconoce por AHA preexistente. Retirar la bisagra superior no estructurada por completo como el Fab-D²²¹ minimiza además el riesgo de dichas respuestas secundarias. Esto se respalda por la estructura cristalina de un anticuerpo antibisagra que se ha cristalizado en un complejo con un péptido que abarca la bisagra inferior escindida con IdeS de IgG1 humana (30). El péptido se une al anticuerpo en una conformación extendida, lo que sugiere que truncar la bisagra superior o inferior puede retirar con éxito el neoepítopo y suprimir una respuesta inmunitaria de anticuerpos contra la región bisagra.

Estos hallazgos también pueden tener implicaciones en el diseño de estudios en macacos cangrejeros. Aunque la región bisagra inferior está altamente conservada entre la IgG de macaco cangrejero y humana, existen diferencias considerables en la región bisagra superior (31) que evitarán la reactividad entre especies. Esto puede tener un impacto en los estudios toxicológicos en macacos cangrejeros ya que las predisposiciones del AHA preexistente hacia un Fab humano no se pueden abordar por estos estudios.

Más allá del uso terapéutico, el Fab-D²²¹ también se puede considerar para la expresión recombinante de Fab para estudios cristalográficos, puesto que la bisagra superior no se resuelve comúnmente en estructuras cristalinas debido a la naturaleza no estructurada. Este ejemplo demuestra que se puede lograr la misma estabilidad y expresión con una construcción Fab-D²²i. Eliminar las áreas no estructuradas puede mejorar además los resultados de cristalización.

La vía más eficaz para generar moléculas F(ab')² hasta ahora es por digestión proteolítica y las proteasas con alta especificidad tal como IdeS son preferentes. Como se analiza anteriormente, los AHA preexistentes también existen hacia la bisagra inferior de las moléculas (ab')². El valor de AHA hacia el anticuerpo escindido con IdeS es mayor en comparación con un Fab. Sin limitarse a una teoría particular, esto se puede deber a la naturaleza bivalente del F(ab')² que proporciona un componente de unión basado en avidez en el ensayo o una mayor abundancia natural de F(ab')² que da lugar a un incremento en los valores. Se emplearon varias estrategias para retirar la reactividad de AHA mientras se mantiene la eficacia de escisión por IdeS.

Puesto que el residuo C terminal tiene un papel importante en el reconocimiento de epítopos (22), la primera estrategia fue mutar el residuo C terminal del F(ab')² para retirar la actividad de unión de AHA. Sin embargo, esto no fue posible debido al requisito estricto de glicina en la posición P1 para una escisión eficaz por IdeS. El conjunto seleccionado de mutaciones en el sitio P2 tuvo solo un impacto modesto en la unión de AHA, lo que confirma además la importancia del residuo C terminal para la reactividad con AHA. Las diferencias coincidentes en la unión de AHA con la eficacia de escisión con IdeS de las variantes P1 y P2 quizás explican el motivo por el que el isotipo IgG2 con valina en posición P2 y alanina en P1 es menos susceptible a la respuesta de anticuerpos antibisagra. El requisito de glicina en la posición P1 para una escisión eficaz se acompaña de la alta conservación de este residuo dentro de diferentes isotipos y entre especies.

Al delecionar tres residuos en la bisagra inferior (AP456), se pudo mantener la eficacia de escisión de IdeS mientras se retira el reconocimiento de AHA preexistente. Demuestra que las posiciones secuencia arriba del sitio P3 tienen una relevancia menor para una escisión eficaz. Además de retirar la reactividad hacia AHA preexistente, truncar la bisagra inferior puede amortiguar una respuesta inmunitaria hacia este epítopo. En base a estudios estructurales, un AHA se une a la bisagra inferior en una conformación extendida y los cinco residuos C terminales interactúan con las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo (30). Al retirar tres residuos de la bisagra inferior, solo quedaron 4 residuos después de la escisión con IdeS. Esta secuencia corta puede no ser suficiente para una respuesta inmunitaria fuerte y puede reducir la probabilidad de desarrollar anticuerpos de novo hacia la bisagra genomanipulada.

Los anticuerpos preexistentes también han demostrado que disminuyen la función efectora (32) in vitro y también pueden confundir los ensayos de inmunogenicidad durante el desarrollo de fármacos. Aunque la mayoría de los anticuerpos antiterapéuticos (ATA) hacia un anticuerpo humanizado se dirigen al idiotipo, factor reumatoide, se ha descrito un anticuerpo de baja afinidad hacia la región Fc. Una forma de eliminar artefactos por factor reumatoide en el ensayo de inmunogenicidad es el uso de un fragmento de anticuerpo desprovisto de la región Fc. Sin embargo, es importante usar fragmentos que no se reconocen por otros anticuerpos preexistentes. Estos hallazgos proporcionan múltiples formatos Fab y un formato F(ab')² que puede cumplir estos criterios.

En resumen, eligiendo el fragmento de anticuerpo apropiado, es posible evadir el reconocimiento por AHA preexistente. Para las moléculas Fab, existen varias opciones: (1) usar un isotipo IgG2 o IgG4, (2) una mutación del residuo C terminal (T²²⁵L), o (3) terminar el Fab con el residuo D²²¹. Las opciones son más limitadas para las moléculas F(ab')² debido a la necesidad de digestión proteolítica. Sin embargo, se identificó una deleción en la bisagra inferior de IgG1 que mantiene una alta eficacia y especificidad de escisión y retira la reactividad con AHA preexistente. El uso de estos formatos puede permitir una minimización adicional de los problemas de seguridad con fragmentos de anticuerpo en un entorno terapéutico y retirar la interferencia en el desarrollo del ensayo.

Ejemplo 2: AP456 de F(ab') ² ha reducido la unión de FcYRIIIa y C1q mediada por AHA

Se ha descrito previamente que los anticuerpos AHA purificados pueden actuar como Fc sustituto y restablecer la función ADCC/CDC que se perdió por el F(ab')² generado con IdeS (20, 22). Para estudiar si la unión reducida de AHA por las variantes de Fab y F(ab')² genomanipuladas divulgadas se refleja además por incorporación reducida de receptores Fcy y C1q, se emplearon experimentos de puente. Para evaluar la unión de AHA a FcYRIIIa, se añadió suero humano a pocillos recubiertos con Fab o F(ab')² y se incubó durante 2 horas como se describe anteriormente. Después de lavar las placas, se añadió FcYRIIIa (V158)-His-GST soluble (que consiste en el dominio extracelular fusionado con Gly-His6-glutatión-S-transferasa ("Gly-His6" divulgada como SEQ ID NO: 28) en el extremo carboxílico) a 0,5 |jg/ml. Se detectó FcYRIIIa (V158)-His-GST unido usando anticuerpo anti-His de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Penta-His (SEQ ID NO: 29), Qiagen, Germantown, MD) seguido de TMB como sustrato. Para evaluar la unión de AHA a C1q humano, se añadió suero humano a pocillos recubiertos con Fab o F(ab')² y se incubó durante 2 horas como se describe anteriormente. Después de que se lavaran las placas, se añadió C1q humano purificado (Quidel, San Diego, CA). Se detectó C1q unido con anticuerpo anti-C1q de cabra (Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Países Bajos) seguido de anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) y TMB como sustrato.

Se observó una unión significativa de FcYRIIIa y C1q para F(ab')² mientras que se detectó poca señal para la variante AP456 de F(ab')², lo que indica que la genomanipulación de la variante de F(ab')² redujo significativamente el riesgo de activación ADCC/CDC. Las lecturas de DO (n=3) fueron 0,45 ± 0,05, 0,10 ± 0,02 y 0,09 ± 0,02 para la unión de FcYRIIIa y 0,98 ± 0,09, 0,158 ± 0,004 y 0,107 ± 0,009 para la unión de C1q en F(ab')², variante AP456, y pocilios no recubiertos con suero diluido 1:10, respectivamente.

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un fragmento de anticuerpo aislado, en la que el fragmento de anticuerpo es un Fab del isotipo IgG1 que comprende una región bisagra truncada que termina con el residuo D²²¹ (numeración EU).

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el Fab termina con aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de CD.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el Fab comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 y modificaciones conservadoras de la misma.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que el fragmento de anticuerpo aislado presenta unión reducida a FcYRIIIa, C1q o una combinación de los mismos.

5. Una composición que comprende un ácido nucleico aislado que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1.

6. Una célula huésped que comprende la composición de la reivindicación 5.

7. Un procedimiento de producción de un fragmento de anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 6 de modo que se produzca el fragmento de anticuerpo.

8. Una formulación farmacéutica que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso como medicamento.