JP2006166905A - 狂犬病ウイルスを効果的に中和するヒトＦａｂ抗体遺伝子群 - Google Patents

Abstract

【課題】狂犬病中和ウマ血清は異種タンパクであること、またヒト狂犬病抗血清は他の血液媒介感染症に罹患する危険性をはらんでいる。
【解決手段】コンビナトリアル科学法およびファージディスプレイ法を用いてヒトFabを発現する遺伝子群TC3G7を分離し、その遺伝子産物であるFabTC3G7が、狂犬病ウイルス３株に対して効果的に中和活性を有することを発見した。遺伝子産物であるFabTC3G7はヒトFabであり、現在狂犬病ウイルス暴露後発症予防法としてWHOが推奨するウマ抗血清投与またはヒト抗血清投与が持つ欠点を補う可能性のある分子であると思われた。
【選択図】なし

Description

本発明は、狂犬病ウイルスを効果的に中和するヒトFab抗体遺伝子群に関するものである。

狂犬病ウイルスに暴露後その発症を予防する方法は従来、暴露後に狂犬病ワクチンを接種することおよび抗狂犬病ウイルス中和抗体高免疫状態にあるウマまたはヒト血清を投与するものであった。

しかし、ウマ血清は異種タンパクであること、またヒト抗血清は他の血液媒介感染症に罹患する危険性をはらんでいる。またいずれも供給が十分ではない。
そこで狂犬病ウイルス暴露後、安全で安価でしかも安定的に供給できうる狂犬病治療抗体（製剤）の開発が切望されていた。

本発明は、その遺伝子産物Fab抗体分子が上記問題を解決するヒトFab抗体の遺伝情報を有する遺伝子群である。
すなわち本発明は、ヒトFab抗体を発現する遺伝子群（TC3G7）であって、TC3G7は２つの遺伝子からなり、そのうちの一つは発現されるFabの重鎖部分の遺伝情報を持つTC3G7HCであり、もう一つは発現されるFabの軽鎖部分の遺伝情報を持つTC3G7LCであり、前記TC3G7HCの塩基配列は図１−１に示すごとく、
tcgggcccaagactgatgaagccttcggagaccctgtccctcacgtgcagtgtctccggcgactccgtcagttccaactactggacctggatccggcagtccccagggaaggggctggaatggatcggctacatctactacggaggggccaccagctacaacccctccctcaggagtcgagtcagcatatcaagggacacggccacgaaccagatatccctggagttgacctctgtgaccgctgcggacacggccatttattactgtgcgagatgcggccccaatactcaccggactagcaactggtatctctctctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagtagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaa
であり、前記TC3G7LCの塩基配列は
cagatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagtgttttatacaactccaacaataagaactacttagcttggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttactgggcatctacccgggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtactcctcacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaactctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagttcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgtであり、前記塩基配列から得られるアミノ酸配列は、図１−２に示すごとく前記TC3GHCでは、
FR1：SGPRLMKPSETLSLTCSVSGDSVS、CDR1：SNYWT、FR2：WIRQSPGKGLEWIG、CDR2：YIYYGGATSYNPSLRS、FR3：RVSISRDTATNQISLELTSVTAADTAIYYC、CDR3：ARCGPNTHRTSNWYLSL、FR4：WGRGTLVTVSS、CH1：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKであり、前記TC3GLCのアミノ酸配列は、
FR1：QMTQSPDSLAVSLGERATINC、CDR1：KSSQSVLYNSNNKNYLA、FR2：WYQQKPGQPPKLLIY、CDR2 ：WASTRES、FR3：GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC、CDR3：QQYYSTPHT、FR4：FGQGTKLEIKRT、Cκ（カッパ）：VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECであり、この遺伝子群（TC3G7）の遺伝子産物が狂犬病ウイルスを効果的に中和するヒトFab（FabTC3G7）を発現することを特徴とするヒトFab抗体遺伝子群である。
但し上記FRはフレームワーク部分 (framework region)、CDRはcomplementary determining region、 CH1は重鎖定常部、Cκは軽鎖定常部

即ち本発明の前記遺伝子産物FabTC3G7は、狂犬病ウイルスのGタンパク部分を特異的に認識してそれと結合し中和能を示すことが判明したのである。
そこで本発明において、遺伝子産物として狂犬病に有効な（中和機能を有する）ヒトFab抗体を発現するヒト遺伝子群（TC3G7）は、コンビナトリアル科学とファージディスプレイ法を組み合わせることにより選別した。ヒト抗体であるので、適切に調整した際、副反応の可能性が極めて少なく、理論的には他の血液媒介性感染物による汚染の可能性を否定できる安全な抗体分子（Fab抗体、および完全型IgG1抗体）が作成できる。また抗体分子の大量発現系の構築が可能であるので、本遺伝子を通じて安定的で安価な抗体製剤を医療現場に供給できる可能性がある。
また本発明のヒトFab抗体遺伝子が発現する抗体分子は、狂犬病ウイルスのGタンパク部分に特異的に結合し、これを中和するため、狂犬病の診断等にも応用が可能である等の優れた効果を得ることができる。
本発明の上記ヒトFab抗体遺伝子群は、表１に記載のように次の５つの定量的効能を有する。
1）．遺伝子産物である上記ヒトFabTC3G7は狂犬病ウイルスHEP Flury株を2.7μg/mLの濃度で、ウイルス量を初期投与量の50%に減弱できる。
2）．遺伝子産物であるヒトFabTC3G7は狂犬病ウイルスCVS株を8.9μg/mLの濃度で、ウイルス量を初期投与量の50%に減弱できる。
3)．遺伝子産物であるヒトFabTC3G7は狂犬病ウイルス1088株を11.4μg/mLの濃度で、ウイルス量を初期投与量の50%に減弱できる。
4)．遺伝子産物であるFabTC3G7抗体は、基本的にヒトタンパク分子であり、ヒト投与による異種抗原反応性は理論上存在しない。
5)．通常ヒト血液成分などに混入する未知または既知の血液媒介性ウイルスなどによる汚染は理論上存在しない。
上記遺伝子産物FabTC3G7の狂犬病ウイルスに対する中和効果を表１に示す。

実施例で具体的に詳述するが、本発明の前記TC3G7遺伝子群を発現ベクターに組み込み、大腸菌などに、上記ヒトFabTC3G7抗体を大量に発現させることができる。アフィニティーカラムなどを用いれば、FabTC3G7抗体部分だけを分離・精製することができる。
また、本FabTC3G7抗体遺伝子をヒト抗体Fc部分を含む特殊な発現ベクターに組み替え、CHO細胞などの動物培養細胞などで発現させると、より効率的に狂犬病ウイルスのGタンパク部分を特異的に認識して結合して中和し、かつ血中半減期の長い完全型ヒトIgG1分子（IgG1TC3G7抗体）の産生が可能となる。

本実施例によるヒトFab抗体遺伝子は、目標とする作用効果を、狂犬病ウイルスHEP Flury株を25μg/mLの濃度で完全に細胞への感染を阻止し、また2.7μg/mLの濃度で初期投与狂犬病ウイルス量の細胞への感染を５０％阻止することに設定した。
また狂犬病ウイルスCVS株を100μg/mLの濃度で完全に培養細胞への感染を阻止し、8.9μg/mLの濃度で投与狂犬病ウイルス量の細胞への感染を50%阻止することに設定した。また狂犬病ウイルス1088株を100μg/mLの濃度で完全に培養細胞への感染を阻止し、11.4μg/mLの濃度で投与狂犬病ウイルス量の細胞への感染を５０%阻止することに設定した。
以下に特殊ベクター（pComb3H）による本発明の遺伝子抽出方法と、遺伝子群からの遺伝子産物FabTC3G7抗体発現方法と、アフィニティーカラムでFabTC3G7抗体を分離・精製する方法を具体的に詳述する。
(1)、遺伝子抽出方法（使用ベクターの具体例と新発見遺伝子釣り上げ方法）
市販の狂犬病ワクチンを接種により、抗狂犬病ウイルス中和抗体価が十分高いボランティアより末梢血リンパ球を採取し、そこから全mRNAを抽出の後、oligodTを用いた逆転写反応によりcDNAに変換する。ヒト抗体特異プライマー（重鎖部分9対、軽鎖部分７対）を用い、作成したcDNAをテンプレートにヒトFab部分の重鎖、短鎖部分に相当する塩基配列分子をPCRで増幅する。増幅産物をpComb3Hベクターにそれぞれ組み込み、ヒトFabライブラリーを構築する。大腸菌（XL1-Blue）を構築したFabライブラリーで形質転換し、ヘルパーファージを重感染させると、組み込んだFab部分をファージ表面に発現する（ファージプール）。ポリスチレン製のプレートに市販の狂犬病ワクチン（化血研社製、２５μg/mLに希釈）を固層化する。同ワクチンには死滅させた狂犬病ウイルスが含有されており、そこにFabを発現したファージプールを反応させると、特異的に狂犬病ウイルス抗原に結合するFabを発現するファージが残存し，結合しないものは洗浄除去する。これらの行程を３〜４回行うと、狂犬病ウイルス抗原特異Fab発現ファージが濃縮される。狂犬病ウイルス抗原特異Fab発現ファージが濃縮されたファージプールを大腸菌（XL1-Blue）に感染させ、プラスミドを得る。プラスミドからgeneIII遺伝子を除去し、組み込まれたFab遺伝子群が乳糖誘導体(IPTG)の添加によりFab分子を、大腸菌培養液中に遊離発現できるようにする。ここで発現されたFabのうち、狂犬病ウイルス抗原に特異的に結合するものを抗原―抗体反応（ELISA法）を利用することにより選別する。選別したFab発現クローン群から、狂犬病ウイルスを効果的に中和するFab抗体を発現するクローンを、狂犬病ウイルスを用いた中和反応（RFFIT法）を行うことで決定する。以上のように、効果的に狂犬病ウイルスを中和するFab抗体を発現する遺伝子をつりあげる。
(2)、遺伝子からのFab抗体発現方法
前記(1)で選別した狂犬病ウイルスを効果的に中和するFab抗体を発現する遺伝子が組み込まれたpComb3Hベクターから、定法どおりFab抗体を発現させる。つまり同Fab抗体遺伝子群を含むpComb3Hベクターにより大腸菌（XL1-Blue）を形質転換する。抗生物質アンピシリンを含んだスーパーブロス等に乳糖誘導体（IPTG）を添加し、30度で一夜振揺培養する。遠心により大腸菌沈渣を集め中性緩衝液に懸濁する。超音波により大腸菌を破砕し、大腸菌内部に発現蓄積されたFab抗体を遊離させる。これを「Fab抗体粗精製標品」とする。1.0 Lの大腸菌培養液から約10mLのFab抗体粗精製標品が得られる。
(3)、アフィニティーカラムでFab抗体だけを純化する方法（アフィニティーカラムも詳述）
定法のとおり、希釈した抗ヒトF(ab)₂抗体（市販）をNHS活性化カラム（市販）に充填し、ヒトFab抗体捕捉用アフィニティーカラムを作成する。作成したアフィニティーカラムを液体クロマトグラフィーモジュールであるアクタ・プライムに装着する。上記（２）で作成した「狂犬病ウイルスを効果的に中和するFab抗体粗精製標品」約2.0 mLをカラムに充填する。低pH緩衝液（グリシン塩酸溶液：pH2.7など）を用い、速度1.0 mL/分で溶出するとヒトFab精製標品を含む分画が分取されてくる。pHを中性に調節後、不要な塩を透析除去し、限外ろ過膜でFabを含む部分を濃縮する。約10mLのFab抗体粗精製標品から約1.0 mg程度の精製ヒトFab抗体が回収される。
(4)、抗体製剤にする方法
FabTC3G7抗体はヒト抗体分子であるので理論的にはヒトに投与可能である。ウマ血清などの異種動物由来の抗体製剤の使用の際に起こる副反応やまた、ヒト由来の狂犬病抗血清製剤などに懸念される血液媒介性病原体による汚染は理論上ない。本Fab抗体遺伝子群をヒト完全型IgG1発現ベクターなどに組み替え、培養細胞などにIgG1抗体を発現させる。大量に培養し、アフィニティーカラムであるプロテインAまたはプロテインGカラムなどを用いてIgG1抗体部分を分離・精製する。適切な施設・設備のもとで培養・精製を行うと高純度の産物が得られる。定法どおりタンパク安定剤などで調整し、凍結乾燥粉末とする。使用時に要時調整して抗体製剤として用いる。IgG1抗体の効能部分を決定するのはFab抗体部分の前記特徴に記載の遺伝子配列情報である。

世界保健機構(WHO)では、狂犬病ウイルスなどに高濃度に暴露された際（感染動物による咬傷事故など）、すみやかに狂犬病ワクチン接種かつ高い狂犬病中和活性を有する抗体製剤の投与を推奨している。また、狂犬病は発症すると致死的で、いまだ発症後生還例はないが、ワクチン接種とともに、中和抗体製剤などを数種類混合投与することにより回復にいたる可能性を指摘する報告もある。狂犬病暴露後発症予防抗体製剤は現在極端な品薄でありかつ、安全性が確保されているとは言いがたい。日本国内では抗体製剤そのものの入手が極端に困難である。一方、日本国内では狂犬病の症例が現在見られないが、１．周辺諸国が狂犬病浸淫地区であること、２．ヒトの交流が頻繁に行われていること、３．日本は動物の一大輸入国であること、などより日本国内が狂犬病ウイルスにより再汚染されるのは日を待たないとされる。また、日本人旅行者、長期滞在者が海外浸淫地区で狂犬病ウイルスに暴露された際の対処法も現状では全く不十分である。
本発明のTC3G7抗体遺伝子群によりヒト抗体を発現させ、臨床医学領域に抗体製剤を供給すれば、狂犬病に暴露した人の安全で確実な発症予防に貢献でき、大きな市場性が見込まれる。

Claims (1)

1. ヒトFab抗体を発現する遺伝子群（TC3G7）であって、TC3G7は２つの遺伝子からなり、そのうちの一つは発現されるFabの重鎖部分の遺伝情報を持つTC3G7HCであり、もう一つは発現されるFabの軽鎖部分の遺伝情報を持つTC3G7LCであり、前記TC3G7HCの塩基配列は
   tcgggcccaagactgatgaagccttcggagaccctgtccctcacgtgcagtgtctccggcgactccgtcagttccaactactggacctggatccggcagtccccagggaaggggctggaatggatcggctacatctactacggaggggccaccagctacaacccctccctcaggagtcgagtcagcatatcaagggacacggccacgaaccagatatccctggagttgacctctgtgaccgctgcggacacggccatttattactgtgcgagatgcggccccaatactcaccggactagcaactggtatctctctctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagtagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaa
   であり、前記TC3G7LCの塩基配列は
   cagatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagtgttttatacaactccaacaataagaactacttagcttggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttactgggcatctacccgggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtactcctcacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaactctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagttcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
   であり、前記塩基配列から得られるアミノ酸配列は、前記TC3G7HCでは、
   FR1：SGPRLMKPSETLSLTCSVSGDSVS、CDR1：SNYWT、FR2：WIRQSPGKGLEWIG、CDR2：YIYYGGATSYNPSLRS、FR3：RVSISRDTATNQISLELTSVTAADTAIYYC、CDR3：ARCGPNTHRTSNWYLSL、FR4：WGRGTLVTVSS、CH1：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKであり、
   前記TC3G7LCでは、
   FR1：QMTQSPDSLAVSLGERATINC、CDR1：KSSQSVLYNSNNKNYLA、FR2：WYQQKPGQPPKLLIY、CDR2 ：WASTRES、FR3：GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC、CDR3：QQYYSTPHT、FR4：FGQGTKLEIKRT、Cκ（カッパ）：VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECであり、この遺伝子群（TC3G7）の遺伝子産物が狂犬病ウイルスを効果的に中和するヒトFab（FabTC3G7）を発現することを特徴とするヒトFab抗体遺伝子群である。
   但し上記FRはフレームワーク部分 (framework region)、CDRはcomplementary determining region 、CH1は重鎖定常部、Cκは軽鎖定常部