JP6409034B2 - 多重特異性多価抗体の生成方法 - Google Patents

Description

関連出願
本願は、2010年8月16日に出願された米国仮出願第61/374,159号、2011年2月15日に出願された米国仮出願第61/443,008号、2011年7月19日に出願された米国仮出願第61/509,260号の恩典を主張するものであり、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

発明の領域
本発明は、免疫グロブリン分子の各結合部位について異なる特異性を保持している新規の二重特異性モノクローナル抗体の生成に関する。本発明の抗体は、1種の重鎖と2種の異なる軽鎖とから構成され、軽鎖の一方はκ定常ドメインを含有しており、他方はλ定常ドメインを含有している。本発明は、特に、異なる特異性を有するが共通の重鎖を有している抗体の単離に関する。本発明は、さらに、単一特異性抗体および二重特異性抗体の構築をもたらす、2種の軽鎖および1種の重鎖の制御された同時発現に関する。本発明は、配列が未改変であって、リンカーまたはその他の非ヒト配列の使用を含んでいない完全ヒト二重特異性二価抗体、および2種の単一特異性抗体と1種の二重特異性抗体との抗体混合物を作製する手段を提供する。本発明は、二重特異性抗体を効率的に精製する手段も提供する。

発明の背景
抗体は、4本のポリペプチド（2本の重鎖および2本の軽鎖）から構成される。抗体の抗原結合部分は、軽鎖可変ドメイン（VL）および重鎖可変ドメイン（VH）により形成される。これらのドメインの一端で、6個のループが抗原結合部位を形成し、それらは相補性決定領域（CDR）とも呼ばれる。3個のCDRがVHドメインに位置し（H1、H2、およびH3）、他の3個はVLドメインにある（L1、L2、およびL3）。B細胞の発達の間、V(D)J組換えとして公知の体細胞組換えにより、独特の免疫グロブリン領域が形成される。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変領域は、異なる遺伝子セグメントによりコードされる。重鎖は、可変（V）セグメント、多様性（D）セグメント、および連結（J）セグメントと呼ばれる3つのセグメントによりコードされ、軽鎖可変は、2つのセグメントVおよびJのみの組換えにより形成される。ゲノムに存在するVセグメント、Dセグメント、およびJセグメントについての複数コピーのうちの1つにおける組換えにより、極めて多数の抗体パラトープが生成され得る。VセグメントはCDR1およびCDR2をコードし、CDR3は組換えイベントにより生成される。免疫応答の間に、体細胞突然変異（SHM）と呼ばれる過程により、さらなる多様性が抗原結合部位へ導入される。この過程においては、重鎖および軽鎖の可変遺伝子、特に、CDRをコードする領域へ点変異が導入される。この付加的な可変性は、同族抗原に対する改良された親和性を有する抗体バリアントを発現しているB細胞の選択および拡大を可能にする。

免疫グロブリンの大部分が、2本の同一の重鎖ポリペプチドと、2本の同一の軽鎖ポリペプチドとから構成されるため、両方のアームに同一の特異性を保持している二価単一特異性分子である。しかしながら、2種のハイブリドーマ間の融合イベントによって、ハイブリッドハイブリドーマが作出され得ることが、ハイブリドーマテクノロジーの開発の極初期に認識された（Suresh MR et al.,Methods Enzymol 1986;121:210-228（非特許文献1））。これらの「クアドローマ（quadromas）」は、2種の異なる重鎖および2種の異なる軽鎖を発現し、従って、重鎖および軽鎖のランダムな対合に起因する多様な異なる抗体種を産生する。これらの異なる種の中に、各アームに異なる特異性を保持している二重特異性抗体（bsAb）が生成される。別の天然に存在する例外は、そのアイソタイプのヒンジ領域により媒介されるより不安定な二量化のため、重鎖交換を起こすことができるIgG4アイソタイプの免疫グロブリンである（van der Neut Kolfschoten M et al.,Science.2007 317(5844):1554-7（非特許文献2））。この交換は、インビボで起こるようであるが、その生物学的意義は未だ不明である。

モノクローナル抗体は、ヒト疾患のいくつかの分野において、治療的介入のための成功した魅力的な分子クラスとして出現した。しかしながら、1種のタンパク質の標的化または中和は、ある種の疾患においては効力を達成するのに必ずしも十分ではなく、そのことから、モノクローナル抗体の治療的使用は制限されている。多数の適応症において、生物学的系の一成分の中和が、効力を達成するのに十分でないことは、ますます明らかになってきている。この問題の一つの解決策は、数種のモノクローナル抗体の同時投与である。しかしながら、組み合わされる抗体が以前に個々に認可されていない場合、このアプローチは規制面で複雑である。さらに、組み合わせアプローチは、製造の観点から高コストでもある。従って、1種の分子による複数種の抗原の標的化を可能にする抗体および治療薬が、必要とされている。

Suresh MR et al.,Methods Enzymol 1986;121:210-228 van der Neut Kolfschoten M et al.,Science.2007 317(5844):1554-7

本発明は、標準的な抗体と配列が識別不可能な二重特異性抗体の同定、作製、および精製を可能にする。本発明は、全て同一の重鎖を保持している3種以上の抗体の単純な抗体混合物の作製および精製も可能にする。本発明の抗体の未修飾の性質は、標準的なモノクローナル抗体に類似した好都合の製造特徴をそれらに与える。

本発明の二重特異性抗体は、以下の工程を用いて生成される：
−異なる特異性を有し、同一の重鎖可変ドメインを有しているが、異なる軽鎖可変ドメインを有している2種の抗体を単離する。この工程は、固定の重鎖を有する抗体ライブラリーまたは1種のVH遺伝子を含有しているトランスジェニック動物の使用により促進される。
−重鎖可変ドメインを重鎖定常領域と融合させ、一方の軽鎖可変ドメインをκ定常ドメインと融合させ、他方の軽鎖可変ドメインをλ定常ドメインと融合させる。好ましくは、κ定常ドメインと融合させられる軽鎖可変ドメインはκ型であり、λ定常ドメインと融合させられる軽鎖可変ドメインはλ型である。しかしながら、本発明は、ハイブリッド軽鎖の生成も可能にするため、同一の型の2種の軽鎖可変ドメインが、本発明の二重特異性抗体を生成するために使用されてもよい。
−3種の鎖を、哺乳動物細胞において同時発現させ、3種の抗体（2種の単一特異性抗体および2種の異なる軽鎖を保持している1種の二重特異性抗体）の構築、ならびにそれらの混合物の上清への分泌をもたらす。異なる抗体の比率は、鎖の相対的な発現およびそれらのIgGへの構築に依る。本発明は、これらの比率を調整し、二重特異性抗体の産生を最大にする方法を提供する。
−抗体混合物を、抗体精製のために使用される標準的なクロマトグラフィ技術を使用して精製する。抗体混合物は、多重標的化剤として特徴決定され使用され得る。
−ヒトκ定常領域およびヒトλ定常領域と特異的に結合するアフィニティクロマトグラフィ媒体を連続的に使用して、二重特異性抗体を精製する。この精製過程は、軽鎖可変ドメインの配列とは無関係であり、従って、本発明の全ての二重特異性抗体について一般的である。
−κ定常ドメインを含有している軽鎖およびλ定常ドメインを含有している軽鎖を保持している単離された二重特異性抗体を、種々の生化学的方法および免疫学的方法を使用して特徴決定する。
−本発明の二重特異性抗体は、治療的介入のため、または研究用もしくは診断用の試薬として使用され得る。

本発明は、各結合部位において異なる特異性を保持し、かつ1種の重鎖ポリペプチドの2コピーと、第1の軽鎖と、第1の軽鎖とは異なる第2の軽鎖とを含むモノクローナル抗体を提供する。

いくつかの抗体において、第1の軽鎖の少なくとも一部はκ型であり、第2の軽鎖の少なくとも一部はλ型である。いくつかの抗体において、第1の軽鎖はκ定常領域を少なくとも含む。いくつかの抗体において、第1の軽鎖はκ可変領域をさらに含む。いくつかの抗体において、第1の軽鎖はλ可変領域をさらに含む。いくつかの抗体において、第2の軽鎖はλ定常領域を少なくとも含む。いくつかの抗体において、第2の軽鎖はλ可変領域をさらに含む。いくつかの抗体において、第2の軽鎖はκ可変領域をさらに含む。いくつかの抗体において、第1の軽鎖はκ定常領域およびκ可変領域を含み、第2の軽鎖はλ定常領域およびλ可変領域を含む。

いくつかの態様において、定常領域および可変フレームワーク領域の配列はヒトのものである。

本発明は、（a）第1の軽鎖可変ドメインと組み合わされた重鎖可変ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離し；（b）第2の軽鎖可変ドメインと組み合わされた、工程（a）の抗体と同一の重鎖可変ドメインにより決定される異なる特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離し；（c）（i）免疫グロブリン重鎖定常領域と融合した共通の重鎖可変ドメイン；（ii）κ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した第1の軽鎖可変ドメイン；および（iii）第1の可変定常ドメインとは異なる型の軽鎖定常ドメインと融合した第2の軽鎖可変ドメイン：を細胞において同時発現させることにより、二重特異性抗体を作製し生成する方法も提供する。

いくつかの方法は、（d）産生された二重特異性抗体を、産生された単一特異性抗体から単離する付加的な工程も含む。例えば、いくつかの方法において、単離は、アフィニティクロマトグラフィ精製工程を使用することにより達成される。いくつかの方法において、精製工程は、κ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、λ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、またはκ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体およびλ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体の両方を使用して実施される。

いくつかの方法において、κ軽鎖可変ドメインがκ型の定常領域と融合させられる。いくつかの方法において、κ軽鎖可変ドメインがλ型の定常領域と融合させられる。いくつかの方法において、λ軽鎖可変ドメインがκ型の定常領域と融合させられる。いくつかの方法において、λ軽鎖可変ドメインがλ型の定常領域と融合させられる。

いくつかの方法において、工程（a）および（b）は、共通の重鎖と、軽鎖可変ドメインに限局した多様性とを有する抗体ライブラリーの使用により促進される。そのようなライブラリーの一つにおいて、固定される重鎖可変ドメインは、種々の可変生殖系列遺伝子に基づいていてよく、CDRおよびフレームワーク領域の両方に種々の配列を有することができる。いくつかの方法において、そのようなライブラリーは、種々の型の重鎖可変ドメインを使用して設計され、本発明の抗体を生成するために使用され得る。

いくつかの方法において、抗体ライブラリーは、糸状バクテリオファージ上、酵母、細菌、もしくは哺乳動物細胞の表面にディスプレイされるか、またはリボソームディスプレイもしくはその他の型のインビトロディスプレイのために使用される。

本発明は、（a）免疫グロブリン定常領域に結合されている、第1の抗原と結合する免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の重鎖可変領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸分子を準備し；（b）第1のκ型またはλ型の軽鎖定常領域に結合されている、第1の抗原と結合する免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の軽鎖可変領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸分子を準備し；（c）第2のκ型またはλ型の軽鎖定常領域に結合されている、第2の抗原と結合する免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の軽鎖可変領域を含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸分子を準備し（第1の軽鎖定常ドメインと第2の軽鎖定常ドメインとは異なる型である）；（d）第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、および第3のポリペプチドの発現を可能にする条件の下で、第1の核酸分子、第2の核酸分子、および第3の核酸分子を含む宿主細胞を培養することにより、第1の抗原、および第1の抗原とは異なる第2の抗原と特異的に結合する二重特異性抗体を調製する方法も提供する。

いくつかの方法は、（e）二重特異性抗体を回収するさらなる工程も含む。例えば、いくつかの方法において、二重特異性抗体は、アフィニティクロマトグラフィ精製工程を用いて、工程（e）において回収される。いくつかの方法において、精製工程は、κ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、λ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、またはκ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体およびλ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体の両方を使用して実施される。

いくつかの方法において、第2の核酸はκ型軽鎖可変ドメインをコードする。いくつかの方法において、第2の核酸はκ型定常領域をコードする。いくつかの方法において、第2の核酸はλ型定常領域をコードする。いくつかの方法において、第2の核酸はλ型軽鎖可変ドメインをコードする。いくつかの方法において、第2の核酸はκ型定常領域をコードする。いくつかの方法において、第2の核酸はλ型定常領域をコードする。いくつかの方法において、第3の核酸はκ型軽鎖可変ドメインをコードする。いくつかの方法において、第3の核酸はκ型定常領域をコードする。いくつかの方法において、第3の核酸はλ型定常領域をコードする。いくつかの方法において、第3の核酸はλ型軽鎖可変ドメインをコードする。いくつかの方法において、第3の核酸はκ型定常領域をコードする。いくつかの方法において、第3の核酸はλ型定常領域をコードする。

本発明は、全てが共通の重鎖を有する2種の単一特異性抗体と1種の二重特異性抗体とを含む、抗体混合物も提供する。例えば、二重特異性抗体は、本明細書に記載された二重特異性抗体のいずれかであるか、または本明細書に記載された方法を使用して作成される。本発明は、（a）第1の軽鎖可変ドメインと組み合わされた重鎖可変ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離し；（b）第2の軽鎖可変ドメインと組み合わされた、工程（a）の抗体と同一の重鎖可変ドメインにより決定される異なる特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離し；（c）（i）免疫グロブリン重鎖定常領域と融合した共通の重鎖可変ドメイン；（ii）κ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した第1の軽鎖可変ドメイン；および（iii）κ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した第2の軽鎖可変ドメイン：を細胞において同時発現させることにより、そのような抗体混合物を生成する方法も提供する。いくつかの方法は、（d）工程（c）において産生された抗体混合物を細胞培養上清から単離する付加的な工程も含む。

本発明は、（a）共通の重鎖を含む、2種以上、例えば、3種以上の非同一抗体を作製するため、共通の免疫グロブリン重鎖と、共通の免疫グロブリン重鎖と対合して機能的な抗原結合ドメインを形成することができる、少なくとも2種、例えば、少なくとも3種の異なる免疫グロブリン軽鎖とをコードする1種以上の核酸配列を、1種の組換え宿主細胞において発現させることにより、1種の組換え宿主細胞において、2種以上、例えば、3種以上の非同一抗体を作製する方法も提供する。いくつかの方法は、2種以上、例えば、3種以上の非同一抗体を、組換え宿主細胞または宿主細胞の培養物から採集するかまたはその他の様式で精製する工程も含む。宿主細胞は、例えば、哺乳動物細胞である。いくつかの方法において、非同一抗体には、単一特異性抗体および二重特異性抗体が含まれる。

いくつかの方法において、非同一抗体は、同一標的抗原の異なるエピトープを標的化する。いくつかの方法において、非同一抗体は、同一標的エピトープに対して異なる親和性を有する。いくつかの方法において、非同一抗体は、異なる抗原と結合する。

いくつかの方法において、2種以上、例えば、3種以上の非同一抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、およびIgMからなる群より独立に選択される。

いくつかの方法において、2種以上、例えば、3種以上の非同一抗体は、抗原依存性細胞傷害（ADCC）、補体依存性細胞傷害（CDC）、抗原依存性細胞貪食（ADCP）のような抗体のエフェクター機能を修飾するか、または新生児型Fc受容体との結合を改変することにより薬物動態学的特性を修飾する修飾型Fc領域を含有している。

いくつかの方法において、2種以上、例えば、3種以上の異なる免疫グロブリンは、F(ab')2フォーマットにある。

いくつかの方法において、1種以上の核酸配列は、宿主細胞において安定的に発現させられる。

いくつかの方法において、2種以上、例えば、3種以上の非同一抗体は、インビトロで宿主細胞により産生される。

いくつかの方法は、組換え宿主細胞により産生された2種以上、例えば、3種以上の非同一抗体を、標的抗原との結合能についてアッセイすることにより、少なくとも1種の宿主細胞を選択し；組換え宿主細胞を培養し；3種以上の非同一抗体を単離する付加的な工程も含む。抗体は、本明細書に記載された技術のいずれかまたは当技術分野において認められている他の適当な方法を使用して単離され得る。

いくつかの方法において、異なる免疫グロブリン軽鎖は同一の定常領域を有する。いくつかの方法において、異なる免疫グロブリン軽鎖は異なる定常領域を有する。
[本発明1001]
各結合部位において異なる特異性を保持し、かつ1種の重鎖ポリペプチドの2コピー、第1の軽鎖、および第1の軽鎖とは異なる第2の軽鎖からなる、単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1002]
第1の軽鎖の少なくとも一部がκ型であり、かつ第2の軽鎖の少なくとも一部がλ型である、本発明1001の単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1003]
第1の軽鎖がκ定常領域を少なくとも含む、本発明1002の単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1004]
第1の軽鎖がκ可変領域をさらに含む、本発明1003の単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1005]
第1の軽鎖がλ可変領域をさらに含む、本発明1003の単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1006]
第2の軽鎖がλ定常領域を少なくとも含む、本発明1002の単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1007]
第2の軽鎖がλ可変領域をさらに含む、本発明1006の単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1008]
第2の軽鎖がκ可変領域をさらに含む、本発明1006の単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1009]
第1の軽鎖がκ定常領域およびκ可変領域を含み、かつ第2の軽鎖がλ定常領域およびλ可変領域を含む、本発明1002の単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1010]
定常領域および可変フレームワーク領域の配列がヒトのものである、前記本発明のいずれかの単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1011]
以下の工程を含む、本発明1001の二重特異性抗体を生成する方法：
（a）第1の軽鎖可変ドメインと組み合わされた重鎖可変ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程；
（b）第2の軽鎖可変ドメインと組み合わされた、工程（a）の抗体と同一の重鎖可変ドメインにより決定される異なる特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程；
（c）以下のものを一つの細胞において同時に発現させる工程：
i. 免疫グロブリン重鎖定常領域と融合した共通の重鎖可変ドメイン；
ii. κ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した第1の軽鎖可変ドメイン；および
iii. 第1の軽鎖の定常ドメインとは異なる型の軽鎖定常ドメインと融合した第2の軽鎖可変ドメイン。
[本発明1012]
κ軽鎖可変ドメインをκ型の定常領域と融合させる、本発明1011の方法。
[本発明1013]
κ軽鎖可変ドメインをλ型の定常領域と融合させる、本発明1011の方法。
[本発明1014]
λ軽鎖可変ドメインをκ型の定常領域と融合させる、本発明1011の方法。
[本発明1015]
λ軽鎖可変ドメインをλ型の定常領域と融合させる、本発明1011の方法。
[本発明1016]
（d）工程（c）において産生された二重特異性抗体を、工程（c）において産生された単一特異性抗体に対して精製する工程をさらに含む、本発明1011〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
工程（d）がアフィニティクロマトグラフィ精製工程である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
精製工程が、κ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、λ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、またはκ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体およびλ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体の両方を使用して実施される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
工程（a）および（b）が、共通の重鎖と、軽鎖可変ドメインに限局した多様性とを有する抗体ライブラリーの使用により促進される、本発明1011〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
抗体ライブラリーが、糸状バクテリオファージ、酵母、細菌、もしくは哺乳動物細胞の表面にディスプレイされるか、またはリボソームディスプレイもしくはその他の型のインビトロディスプレイのために使用される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
以下の工程を含む、第1の抗原、および第1の抗原とは異なる第2の抗原と特異的に結合する二重特異性抗体を調製する方法：
（a）免疫グロブリン定常領域に結合されている、第1の抗原と結合する免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の重鎖可変領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸分子を準備する工程；
（b）第1のκ型またはλ型の軽鎖定常領域に結合されている、第1の抗原と結合する免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の軽鎖可変領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸分子を準備する工程；
（c）第2のκ型またはλ型の軽鎖定常領域に結合されている、工程（a）の免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片と同一の重鎖可変領域を有しかつ第2の抗原と結合する免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の軽鎖可変領域を含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸分子を準備する工程であって、第1の軽鎖定常ドメインと第2の軽鎖定常ドメインとが異なる型である、工程；ならびに
（d）第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、および第3のポリペプチドの発現を可能にする条件の下で、第1の核酸分子、第2の核酸分子、および第3の核酸分子を含む宿主細胞を培養する工程。
[本発明1022]
（e）二重特異性抗体を回収する工程をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
第2の核酸がκ型軽鎖可変ドメインをコードする、本発明1021の方法。
[本発明1024]
第2の核酸がκ型定常領域をコードする、本発明1023の方法。
[本発明1025]
第2の核酸がλ型定常領域をコードする、本発明1023の方法。
[本発明1026]
第2の核酸がλ型軽鎖可変ドメインをコードする、本発明1021の方法。
[本発明1027]
第2の核酸がκ型定常領域をコードする、本発明1026の方法。
[本発明1028]
第2の核酸がλ型定常領域をコードする、本発明1026の方法。
[本発明1029]
第3の核酸がκ型軽鎖可変ドメインをコードする、本発明1021の方法。
[本発明1030]
第3の核酸がκ型定常領域をコードする、本発明1029の方法。
[本発明1031]
第3の核酸がλ型定常領域をコードする、本発明1029の方法。
[本発明1032]
第3の核酸がλ型軽鎖可変ドメインをコードする、本発明1021の方法。
[本発明1033]
第3の核酸がκ型定常領域をコードする、本発明1032の方法。
[本発明1034]
第3の核酸がλ型定常領域をコードする、本発明1032の方法。
[本発明1035]
二重特異性抗体が、工程（e）において、アフィニティクロマトグラフィ精製工程を用いて回収される、本発明1021〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
精製工程が、κ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、λ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、またはκ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体およびλ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体の両方を使用して実施される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
全てが共通の重鎖を有する2種の単一特異性抗体と1種の二重特異性抗体とを含む、抗体混合物。
[本発明1038]
以下の工程を含む、本発明1037の抗体混合物を生成する方法：
（a）第1の軽鎖可変ドメインと組み合わされた重鎖可変ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程；
（b）第2の軽鎖可変ドメインと組み合わされた、工程（a）の抗体と同一の重鎖可変ドメインにより決定される異なる特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程；
（c）以下のものを一つの細胞において同時に発現させる工程：
i. 免疫グロブリン重鎖定常領域と融合した共通の重鎖可変ドメイン；
ii. κ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した第1の軽鎖可変ドメイン；および
iii. κ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した第2の軽鎖可変ドメイン。
[本発明1039]
（d）工程（c）において産生された抗体混合物を細胞培養上清から精製する工程をさらに含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
全てが共通の重鎖を有する3種以上の単一特異性抗体と3種以上の二重特異性抗体とを含む、抗体混合物。
[本発明1041]
以下の工程を含む、本発明1040の抗体混合物を生成する方法：
（a）第1の軽鎖可変ドメインと組み合わされた重鎖可変ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程；
（b）異なる軽鎖可変ドメインと組み合わされた、工程（a）の抗体と同一の重鎖可変ドメインにより決定される異なる特異性を有する数種の抗体または抗体断片の領域を単離する工程；
（c）以下のものを一つの細胞において同時に発現させる工程：
i. 免疫グロブリン重鎖定常領域と融合した共通の重鎖可変ドメイン；
ii. κ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した工程（a）および（b）において単離された抗体の軽鎖全て。
[本発明1042]
（d）工程（c）において産生された抗体混合物を細胞培養上清から精製する工程をさらに含む、本発明1041の方法。

種々の二重特異性抗体フォーマットの模式図である。A.抗体断片に基づくフォーマット：X-Link Fab、架橋されたFab断片；tascFv/BiTE、タンデムscFv/二重特異性T細胞誘導抗体（Engager）；Db、ダイアボディ；taDb、タンデムダイアボディ。B.Fc融合に基づくフォーマット：Db-Fc、ダイアボディ-Fc融合体；taDb-Fc融合体、タンデムダイアボディ-Fc融合体；taDb-CH3、タンデムダイアボディ-CH3融合体；(scFv)₄-Fc、テトラscFv-Fc融合体；DVD-Ig、二重可変ドメイン免疫グロブリン。C.IgGフォーマット：ノブ・ホール（knob-hole）SEED、鎖交換操作ドメイン（strand exchange engineered domain）；CrossMab、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインの交換と組み合わされたノブ・ホール；bsAb、クアドローマ由来二重特異性抗体；sdAb、単一ドメインに基づく抗体。 二重特異性抗体により可能にされる、可能な作用様式の模式図である。2A.2種の抗原の標的化。2B.毒性モエティまたは活性の標的細胞へのリターゲティング。2C.アビディティにより媒介される選択性増加。 図3A〜3Cは、独特の重鎖ポリペプチドの2コピーと、2種の異なる軽鎖ポリペプチドとから構成される、本発明の異なる二重特異性抗体の構造の模式図である。これらの図に示されるκ軽鎖およびλ軽鎖（またはそれらの一部）の位置および／または配置は、限定的なものではない。当業者は、図3A〜3Cに示される二重特異性抗体の鏡像が作製されるよう、κ軽鎖およびλ軽鎖（またはそれらの一部）が配置されてもよいことを認識するであろう。当業者は、図3A〜3Cに完全IgGフォーマットで表される二重特異性抗体が、その他の免疫グロブリンアイソタイプを使用して、またはF(ab')2のようなその他の免疫グロブリンフォーマットで、生成されてもよいことを認識するであろう。3A.κ定常ドメインと融合したκ可変ドメインおよびλ定常ドメインと融合したλ可変ドメイン。3B.κ定常ドメインおよびλ定常ドメインと融合したκ可変ドメイン。3C.κ定常ドメインおよびλ定常ドメインと融合したλ可変ドメイン。 hCXCL10-NusAまたはhIL6RCに特異的であって、かつ同一の重鎖可変ドメインを保持しているクローンを試験したELISAアッセイの図である。特異性を証明するため、各クローンが、両方の標的に対して試験された。 図5A〜Cは、実施例において使用された三つの型のライブラリーを表す一連の図である。各ライブラリー型について、VκライブラリーおよびVλライブラリーは別々に維持された。図5AおよびC：H3の下に示されるCDR H3配列のみが異なる、固定のVH3-23可変ドメインを含有している2セットのライブラリー（CDR定義はIMGTによる）。選択された軽鎖可変遺伝子のCDRL3にランダムな配列を挿入することにより、軽鎖レパートリーが多様化された。異なる多様化戦略は、軽鎖レパートリーの多様化された領域の下の水平線により示される。 図5A〜Cは、実施例において使用された三つの型のライブラリーを表す一連の図である。各ライブラリー型について、VκライブラリーおよびVλライブラリーは別々に維持された。全てのヒト可変遺伝子を含み、3個全てのCDRに多様性を含有することができるヒトドナーから単離された天然に再編成された軽鎖可変ドメインを捕獲することにより、軽鎖レパートリーが多様化された。異なる多様化戦略は、軽鎖レパートリーの多様化された領域の下の水平線により示される。 図5A〜Cは、実施例において使用された三つの型のライブラリーを表す一連の図である。各ライブラリー型について、VκライブラリーおよびVλライブラリーは別々に維持された。図5AおよびC：H3の下に示されるCDR H3配列のみが異なる、固定のVH3-23可変ドメインを含有している2セットのライブラリー（CDR定義はIMGTによる）。選択された軽鎖可変遺伝子のCDRL3にランダムな配列を挿入することにより、軽鎖レパートリーが多様化された。異なる多様化戦略は、軽鎖レパートリーの多様化された領域の下の水平線により示される。 図6A〜6Bは、それぞれ、hIFNγおよびIL6RCに対して選択された、共通の重鎖を保持している単一特異性のIgGλおよびIgGκを使用したELISAの結果を表すグラフである。ELISAフォーマットは、各グラフの隣りに模式的に表される。図6Aにおいては、INFγがプレートに固定化され、抗INFγ IgGλまたは抗IL6RC（即ち、IL-6R受容体/IL-6可溶性複合体）IgGκと共にインキュベートされ、その両方が、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されている抗ヒトCκ抗体または抗ヒトCλ抗体により検出された。シグナルは、比色分析により可視化され、マイクロタイタープレートリーダーを使用して定量化された。 哺乳動物細胞における1種の重鎖および2種の軽鎖の同時発現のために使用されたベクターの模式図である。両方のベクターが、遺伝子発現を駆動するための3種のプロモーター、安定細胞株選択のためのグルタミン合成酵素遺伝子を含有している。第2のベクターpNovIκHλκにおいて、付加的なκ軽鎖の発現は、細胞内リボソーム侵入部位（IRES）により駆動される。種々の遺伝子および遺伝制御要素が示される。hCMV、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター；SV40、V40プロモーター；pA、ポリアデニル化シグナル；VH、重鎖可変ドメイン；VK、軽鎖可変κドメイン；CK、軽鎖定常κドメイン；VL、軽鎖可変λドメイン；CL2、軽鎖定常λドメイン2；GS cDNA、グルタミン合成酵素cDNA；AmpR；アンピシリン耐性についての選択可能マーカー。選択された多数の制限部位が示される。 図8Aは、本発明の二重特異性抗体のための精製過程の模式図である。図8Bは、本発明の二重特異性抗体の同時発現、精製、およびSDS-PAGE分析を表す図である。ゲルはシンプリーブルー（simply blue）を使用して染色された。PA：プロテインA；K：Kappaselect；λ：Lambdaselect；FT：カラムフロースルー；E：溶出画分。 pNovIκHλκベクター内に異なるIRES要素を使用した異なるレベルのκ軽鎖発現を可能にするベクター（レーン1〜5）によりトランスフェクトされた哺乳動物細胞から精製された全IgGのSDS-PAGE分析、およびpNovIκHλベクターとの比較の図である。κ軽鎖およびλ軽鎖の相対強度は、発現レベルがモジュレートされ得ることを示す。 図10Aは、精製された単一特異性IgG（κκおよびλλ）ならびに二重特異性IgG（κλ）のIEFゲル分析を表す図である。図10Bは、単一特異性抗体および二重特異性抗体のIEX-HPLC分析の図である。3種の抗体が独立に注入された。それらの溶出プロファイルがグラフ内に重ねられている。実験において使用された勾配が示される。 二重特異性抗体の両方の標的との結合能、ならびに分子内のκ軽鎖およびλ軽鎖の存在を決定するために使用されたELISAアッセイを表す。図11Aは、ELISAフォーマットの模式図である。図11Bは、INFγがプレートに固定化されたELISAの結果を示すグラフである。図11Cは、IL-6RCがプレートに固定化されたELISAの結果を示すグラフである。IgGκ、抗IL6RC単一特異性抗体；IgGλ、抗INFγ単一特異性抗体；IgGκλ、抗IL6RC/抗INFγ二重特異性抗体。二次検出抗体である抗ヒトλHRPおよび抗ヒトκHRPが示される。 IgGκλ二重特異性抗体のSPR分析の図である。図12Aにおいては、INFγがBiacoreチップの表面に固定化され、抗IL6RC単一特異性抗体（IgGκ）、抗INFγ単一特異性抗体（IgGλ）、および抗IL6RC/抗INFγ二重特異性抗体（IgGκλ）が表面上に注入された後、IL6RCが注入された。図12Bにおいては、抗IL6RC/抗INFγ二重特異性抗体（IgGκλ）がチップ表面に固定化され、抗ヒトκ抗体および抗ヒトλ抗体が、同一の濃度で注入された。抗体注入の順序を逆にして実験が繰り返され、同一の結果が得られた。 本明細書に記載された二重特異性抗体および多重特異性抗体をCHO細胞において生成する一つの方法の概要の模式図である。 図14Aは、三角フラスコにおける小規模作製レベルでの、CHO細胞のプールの増殖および抗体産生のプロファイルを表すグラフである。抗体産生レベルは、プロテインA-HPLC分析により決定された。VCCは生細胞濃度の略語であり、Abは抗体の略語である。図14Bは、増殖および抗体産生のプロファイルの、小規模発酵と中規模発酵との間の比較を表すグラフである。抗体産生レベルは、プロテインA-HPLC分析により決定された。VCCは生細胞濃度の略語であり、Abは抗体の略語である。 図15Aおよび15Bは、2回の独立の実験における、トランスフェクションから5週間後の、モノκ（KK）抗体、モノλ（LL）抗体、および二重特異性κλ（KL）抗体を発現する細胞株の96穴プレート（96wpl）における抗体産生量を表す一連のグラフである。抗体産生レベルはELISAにより決定された。mAbはモノクローナル抗体の略語である。図15Cおよび15Dは、モノκ（KK）、モノλ（LL）、および二重特異性κの、振とう24穴プレート（24wpl）過増殖回分培養における抗体産生量を表す一連のグラフである。 図16Aは、上記の精製工程を通した、単一特異性κIgG分子（即ち、κ軽鎖を有する単一特異性分子、本明細書において「モノκ」分子とも呼ばれる）、単一特異性λIgG分子（即ち、λ軽鎖を有する単一特異性分子、本明細書において「モノλ」分子とも呼ばれる）、ならびにκλ抗体（即ち、κ軽鎖およびλ軽鎖の両方を有する抗体）の還元SDS-PAGE分析の結果を表す図である。図16Bは、上記溶出工程の後に得られたモノκ抗体、モノλ抗体、およびκλ抗体の還元SDS-PAGE分析の結果を表す図である。図16Aおよび16Bにおいて、ゲルはシンプリーブルーを使用して染色された。Eは溶出画分の略語であり、FTはカラムフロースルーの略語であり、MMは分子量マーカーの略語である。図16Cは、精製された単一特異性IgG分子（κκおよびλλ）ならびに二重特異性IgG分子（κλ）の等電点電気泳動（IEF）ゲル分析を表す図である。 図17A〜Dは、本発明の二重特異性抗体を生成する方法が、κ軽鎖およびλ軽鎖の両方を含む抗体を作製すること、そして精製された抗体が二重特異性を示すことを表す一連のグラフおよび図である。グラフは、hIFNγおよびIL6RCに対する精製されたκλボディを使用したELISAの結果を示す。ELISAは、示されるような抗κ検出抗体または抗λ検出抗体を使用して実施された。図17A〜Dは、λ軽鎖がhIFNγと結合し、κ軽鎖がIL6RCと結合することを示している。NI-0501は対照抗hIFNγλ軽鎖抗体であり、NI-1201は対照抗IL6RCκ軽鎖抗体である。 pIの差が抗体軽鎖可変配列に依って変動し得ることを示す、種々の単一特異性抗体および二重特異性抗体のIEFゲルの図である。レーン1、抗NusA IgGκ；レーン2、抗NusA/抗INFγ IgGκλ；レーン3、抗INFγ IgGλ；レーン4、抗IL6RC IgGκ；レーン5、抗IL6RC/抗IL6RC IgGκλ；レーン6、抗IL6RC IgGλ。 可変λ遺伝子およびκ定常遺伝子を組み合わせることにより得られる、3種の異なるハイブリッドタンパク質の模式図である。融合点は異なるハイブリッドで異なる：19Aにおいては、VλがCκと融合しており；19Bにおいては、CDR3までのVλが、VκFR4およびCκと融合しており；19Cにおいては、VλおよびCλの最初の4アミノ酸が、最初の4アミノ酸を除くCκと融合している。CDR、相補性決定領域；FR、フレームワーク領域。 Protein 80チップ（Agilent Technologies）を使用したBionalyzer 2100系における2種のハイブリッド軽鎖構築物の分析の図である。ゲル画像に対応する電気泳動図が示される。 VHドメインが、最初に選択された共通のVH（上曲線）、またはscFvの発現および精製を可能にする他のVHドメイン（下曲線）のいずれかであった、INFγ（A）またはIL6RC（B）に特異的なscFvを使用した用量応答ELISAの結果を表す一連のグラフである。 サンドイッチELISAフォーマットを使用したIgGκλ二重特異性抗体定量化について得られた結果を表すグラフである。アッセイにおける分子の干渉を評価するため、精製された二重特異性抗体を、単独で使用するか、または示されるような異なる比率で単一特異性のκ抗体もしくはλ抗体と混合して使用して、用量応答が実施された。

詳細な説明
1種の抗原のみを標的化することができるモノクローナル一価抗体治療薬の制限を克服するため、または一価抗体治療薬の組み合わせの制限を克服するため、二重特異性抗体フォーマットを使用して、複数の抗原を標的化することを目標として、精力的な努力がなされている。複数の特異性を保持しているそのような抗体は、バイオテクノロジーにおいて興味深く、新規の治療アプローチを可能にする治療剤として大きな可能性を有する（Fischer and Leger,Pathobiology 2007;74:3-14；Morrison SL Nature Biotechnol 2007;25:1233-1234）。二重特異性抗体は、多重標的化を可能にし、治療的可能性を増加させ、生物学的系の重複に取り組み、リターゲティングおよび／または特異性増強のような能力を通して新規の作用機序を提供するため、有利である。バリデートされた単一治療標的は、ますます使い尽くされてきているため、二重特異性抗体により可能となる組み合わせは、治療剤および適用のための標的の新たな拡張的な分野を提供する。

抗体断片の化学的架橋、強制ヘテロ二量体化、クアドローマテクノロジー、ポリペプチドリンカーを介した抗体断片の融合、および単一ドメイン抗体の使用のようないくつかの戦略が、そのような二重特異性分子を生成するために使用されている。組換えDNAテクノロジーの利用可能性は、多数の二重特異性抗体フォーマットの生成をもたらした（例えば、Ridgway JB et al.(1996)Protein Eng 9:617-621を参照のこと）。ヘテロ二量体形成を強制するかまたは異なる結合モエティを1種の分子へと接続するため、リンカーおよび変異が、抗体の異なる領域へ導入されることが多い。しかしながら、これらの操作された分子は、しばしば、不十分な製造特徴のみならず、免疫原性の増大したリスクを有し、そのことにより、臨床への進展が制限されるかまたは妨げられている。さらに、二重特異性フォーマットを開発するための従来の試みは、不十分な安定性および／または発現のような要因によって制限されている。これらのアプローチは以下にさらに記載され、論じられたフォーマットは図1に示される。

化学的架橋。2種の抗体を共有結合的に連結するための化学的架橋試薬の使用は、概念的に簡単なアプローチである。酵素消化によりそれぞれの親抗体から生成された抗体断片、または組換えテクノロジーを通して生成された抗体断片を、二官能性試薬を使用してコンジュゲートさせる（Glennie MJ et al.,J Exp Med 1992;175:217-225）。二重特異性種をホモ二量体に対して精製しなければならず、修飾工程は、タンパク質の完全性および安定性を改変する可能性があるため、生成物の均質性がこのアプローチの主要な制限である。複数の工程が含まれるため、このアプローチは、製造および生成物の均質性に関して困難である。

クアドローマ。クアドローマおよびトリオーマは、それぞれ、2種のハイブリドーマまたは1種のハイブリドーマのいずれかをBリンパ球と融合させることにより生成され得る（Suresh MR et al.,Methods Enzymol 1986;121:210-228）。この場合、2本の重鎖および2本の軽鎖の同時の発現が、10種の抗体組み合わせのランダムな構築をもたらし、所望のbsAbは分泌される抗体のうちの小さな画分のみを表す。bsAbは、クロマトグラフィ技術の組み合わせを使用して精製されなければならず、生成物収率を劇的に低下させる。主要な制限は、クアドローマがげっ歯類起源のbsAbを産生し、従って、免疫原性問題のため治療的可能性が制限されるという点である。

組換え二重特異性抗体。二重特異性抗体フォーマットの大部分が、ポリペプチドリンカーを介して接続されるビルディングブロックとして、scFv断片またはFab断片のような抗体断片を使用して、遺伝子操作技術により生成されている。連結された抗体断片に基づくフォーマットには、タンデムscFv（BiTE）、ダイアボディ、およびタンデムダイアボディが含まれる（Kipriyanov SM.Methods Mol Biol 2003;207:323-333；Korn T et al,Int J Cancer 2002;100:690-697）。これらのビルディングブロックは、さらに免疫グロブリンFc領域に連結され、「IgG様」分子を生ずることができる。これらのフォーマットには、ダイアボディ-Fc、タンデムダイアボディ-Fc、タンデムダイアボディ-CH3、(scFv)₄-Fc、およびDVD-Igが含まれる（Lu D et al.,J Immunol Methods 2003;279:219-232；Lu D et al.,J Biol Chem 2005;280:19665-19672；Lu D et al.,J Biol Chem 2004;279:2856-2865；Wu C et al.,Nat Biotechnol 2007 25:1290-7）。リンカーの使用の可能性のある制限は、これらのペプチドのフレキシブルな性質のため、タンパク質分解切断の傾向が比較的高く、そのことから、不十分な抗体安定性、凝集、および免疫原性の増強がもたらされる可能性があるという点である。さらに、これらの外来ペプチドは、タンパク質とリンカーとの間の連結部またはリンカー自体に対する免疫応答を誘発する可能性がある。一般に、連結されたビルディングブロックに基づくbsAbは、製造に関して困難な分子であり、そのことから治療的可能性が制限されている。

ヒト治療のための理想的な二重特異性分子は、通常のIgGと識別不可能であるべきである。2種の重鎖のヘテロ二量体化の強制に基づく戦略が探究されている。「ノブ・イントゥ・ホール（knob into hole）」と呼ばれる第1のアプローチは、接触界面を修飾するため、CH3ドメインへ変異を導入することにより、2種の異なるIgG重鎖の対合を強制することを目標としている（Ridgway JB et al.,Protein Eng 1996;9:617-621）。一方の鎖には、「ノブ」を作出するため、大きい側鎖を有するアミノ酸が導入された。反対に、他方のCH3ドメインには「ホール」を作出するため、かさの大きいアミノ酸が、短い側鎖を有するアミノ酸に交換された。これらの2種の重鎖を同時発現させることにより、ホモ二量体形成（「ホール・ホール」または「ノブ・ノブ」）に対して、90％を越えるヘテロ二量体形成（「ノブ・ホール」）が観察された。類似の概念が、ヒトIgGおよびヒトIgAの配列に基づく鎖交換操作ドメイン（SEED）ヒトCH3ドメインを使用して、開発された（Davis JH et al.,2010,PEDS 23:195-202）。これらの操作ドメインは、2種の異なる特異性を保持することができるヘテロ二量体分子の形成をもたらす。これらの2種のアプローチは、関心対象のヘテロ二量体の生成に好都合（最大95％）であるため、魅力的であるが、ホモ二量体形成を完全には防止しない。従って、ホモ二量体をヘテロ二量体から除去することができる下流精製手法がやはり必要とされる。これらのアプローチの別の可能性のある問題は、変異型ドメインが完全ヒト配列ではなく、免疫原性をもたらす場合があり、ドメイン安定性および分子の凝集傾向にも影響を与える可能性があるという点である。これらの戦略は、重鎖の強制対合を可能にするため、異なる軽鎖が2種の重鎖のいずれかと無作為に対合することができ、互いに対して精製される必要のある異なる抗体の生成をもたらす。最近、軽鎖対合問題を解決するため、「ノブ・ホール」アプローチの改善が記載された（WO2009/080253A1）。この方法は、「ノブ・ホール」変異に加えて、軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインのうちのいくつかの交換を含む。この方法の主な利点は、2種の異なる重鎖可変ドメインと2種の異なる軽鎖可変ドメインとを有する二重特異性二価抗体を生成することができる点であり、「CrossMab」と呼ばれている。しかしながら、この二重特異性抗体の配列は、ヘテロ二量体化を強制するためのFcの変異および異なる免疫グロブリンドメイン間の非天然の連結点の両方を含有しているため、完全ヒト配列ではない。さらに、これらの修飾は、標準的なモノクローナル抗体と比較して、二重特異性フォーマットの発現レベルを低下させる（Schaefer et al.,PNAS 2011;108:11187-11192）。

単一ドメインに基づく抗体。ラクダ科の動物（ラマおよびラクダ）ならびに軟骨魚（テンジクザメ）の免疫系は、Fcと融合した1種のVドメインを使用しており、このことは、1種のドメインが抗原との高親和性結合を与え得ることを証明している。ラクダ科の動物、サメ、さらにヒトのVドメインは、抗体の代わりになり得るが、bsAb生成のために使用されてもよい。それらは、各アームがVHドメインまたはVLドメインのいずれかを介して2種の標的と結合する可能性を有する、古典的なIgGへとリフォーマットされ得る。この単一ドメインIgGは、IgGに類似した生化学的特性を有し、生成および不均一性に関してその他のbsAbフォーマットが直面する問題を解決する可能性がある。しかしながら、立体障害が、しばしば、両方の抗体アームにおける両方の抗原の同時の結合を防止する可能性が高い。

上記の二重特異性抗体フォーマットの図は、図1に示される。これらのフォーマット図のいくつかは、Fischer and Leger,Pathobiology 2007;74:3-14；およびMorrison SL Nature Biotechnol 2007;25:1233-1234に由来する。

これらの従来のフォーマットとは対照的に、本明細書に提供される二重特異性抗体、多重特異性抗体、組成物、および方法は、そのような開発上の障害を克服する。本明細書に提供される二重特異性抗体は、共通の重鎖と、各々異なる特異性を有する2種の軽鎖（κおよびλ）（即ち、2種の軽鎖、2種の特異性）とを有する。好ましくは、二重特異性抗体は、リンカー、またはアミノ酸変異を含むその他の修飾を含有していない。本明細書に提供される方法は、多様性がVL領域に制限された、特異的な結合を有する分子を作製する。これらの方法は、3種の鎖（1種のVH鎖、2種のVL鎖）の制御された同時発現、および二重特異性抗体の精製を通して、二重特異性抗体を作製する。本明細書に記載された二重特異性抗体および／または多重特異性抗体は、所定の標的に対して、その同一標的に対する単一特異性抗体の親和性と比較して類似した親和性を示す。好ましくは、本明細書に記載された二重特異性抗体および／または多重特異性抗体は、標準的なIgG分子と事実上識別不可能である。

本明細書に提供された方法は、混合物からの二重特異性抗体の精製を含まない、例えば、多重標的化のために有用な、2種の単一特異性抗体と1種の二重特異性抗体との単純な抗体混合物を生成する手段も提供する。

二重特異性抗体の可能な作用様式
2種の標的の同時の阻害。定義により、二重特異性抗体は、2種の特異性を保持し、従って、複数の標的を阻害することができる。これらの標的は、可溶性因子であってもよいし、または細胞の表面に位置していてもよい。複数のサイトカインを標的化する多数のフォーマットが成功裡に生成されている（Wu C et al.,Nat Biotechnol 2007 25:1290-7）。

リターゲティング。二重特異性抗体フォーマットの大部分が、2種の分子と同時に結合することができ、従って、疾患過程に関与している細胞へ細胞傷害性エフェクター細胞または細胞傷害性薬剤をリターゲティングするための橋渡し分子として使用され得る。この適用は腫瘍学において調査されている。いくつかの場合において、抗体の1種の特異性は、CD19、CD20、HER2、癌胎児性抗原（CEA）のような腫瘍細胞マーカーに差し向けられた。二重特異性抗体の第2のアームは、薬物、毒素、サイトカイン、または免疫系からのエフェクター細胞（それぞれ、CD3、CD16、CD64、およびCD89の標的化により、T細胞、NK細胞、単球、および好中球）のような毒性モエティまたは活性を接近させる（Thielemans K,Blood 1996;87:4390-4398；Goldstein J et al.,J Immunol 1997;158:872-879）。

アビディティを介した特異性増強。古典的IgGフォーマットにおいて、抗体結合は、抗原に対する各結合部位の親和性、および二価結合により提供されるアビディティ効果の両方により支配される。抗体が放出されるためには、二つの解離イベントが起こらなければならないため、アビディティ効果は、細胞表面マーカーに対する抗体の見かけの親和性を劇的に増強させる。上記の二重特異性フォーマットの中には、二価のものもあるし（即ち、各標的について1個の結合部位）、四価のものもある。後者は、4個以上の結合部位を有し、二価で各標的に結合する可能性を有する。二価二重特異性治療剤は、細胞表面マーカーの組み合わせを発現している細胞集団を選択的に標的とする。この独特の作用様式は、原理的に、両方の抗原を発現している細胞と、一方のマーカーしか発現していないものとを区別するため、アビディティ成分から利益を得ることができる分子に制限される。

二重特異性抗体により媒介される可能な作用様式の図は、図2に示される。この図は、Fischer and Leger,Pathobiology 2007;74:3-14に由来する。

二重特異性抗体フォーマットの特徴および制限
現在の二重特異性抗体フォーマットの重要な特徴は、表Iに要約される。ヒトドメインに基づくものを除く全てのフォーマットが、ヒト起源でない配列を含有しているか、または異なるタンパク質ドメインの融合により生成された非ヒトタンパク質配列を含有している。リンカーを使用するフォーマットの大部分が、ドメイン凝集による、可能性のある製造上の問題をもたらす。外来配列の存在および不都合な安定性特徴は、免疫原性のリスクを有意に増大させる可能性がある。フォーマット間の重要な違いは、リターゲティングまたはアビディティにより媒介される選択的結合を媒介する能力に直接関係している、結合部位の価数である。従って、全てのフォーマットが、全ての作用様式を可能にすることはできない。特に、完全ヒト免疫グロブリンと識別不可能な唯一のフォーマットは、リターゲティング活性または選択性増加活性を媒介することができない。従って、治療薬の開発のための好都合の特性を有する、即ち、完全ヒト免疫グロブリン分子と識別不可能であり、良好な製造可能性特性を有し、かつ可能な作用様式の完全なスペクトルを可能にする、新規の二重特異性抗体を生成する必要がある。

（表Ｉ）異なる二重特異性抗体フォーマットの特徴

作用様式：DI、二重阻害；R、リターゲティング；IS、選択性増加

二重特異性二価抗体を生成するための改良された方法
本発明は、ヒト免疫グロブリンと構造が同一の二重特異性抗体を生成する方法を提供する。この型の分子は、独特の重鎖ポリペプチドの2コピーと、定常κドメインと融合した第1の軽鎖可変領域と、定常λドメインと融合した第2の軽鎖可変領域とから構成される。各結合部位は、重鎖および軽鎖の両方が寄与する異なる抗原特異性を示す。軽鎖可変領域は、λファミリーまたはκファミリーのものであり得、それぞれ、好ましくは、λ定常ドメインおよびκ定常ドメインと融合される。これは、非天然のポリペプチド連結部の生成を回避するために好ましい。しかしながら、第1の特異性のため、κ軽鎖可変ドメインを定常λドメインと融合させ、第2の特異性のため、λ軽鎖可変ドメインを定常κドメインと融合させることにより、本発明の二重特異性抗体を得ることも可能である（図3）。本明細書に記載された二重特異性抗体は、IgGκλ抗体または「κλボディ」（新たな完全ヒト二重特異性IgGフォーマット）とも呼ばれる。このκλボディフォーマットは、標準的なモノクローナル抗体と識別不可能であって、従って、以前のフォーマットと比較して好都合である特徴を有する、標準的なIgG分子と識別不可能な二重特異性抗体のアフィニティ精製を可能にする。

方法の必須の工程は、同一の重鎖可変ドメインを有し、異なる抗原特異性を有する（各々、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインにより構成される）2種の抗体Fv領域の同定である。モノクローナル抗体およびそれらの断片の生成のための多数の方法が記載されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E,and Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NYを参照のこと）。完全ヒト抗体は、CDR1およびCDR2を含む軽鎖および重鎖の両方の配列が、ヒト遺伝子に起因する抗体分子である。CDR3領域は、ヒト起源であってもよいし、または合成手段により設計されていてもよい。そのような抗体は、本明細書中、「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor,et al.,1983 Immunol Today 4:72を参照のこと）；およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハイブリドーマ技術（Cole,et al,1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96を参照のこと）を使用することにより調製され得る。ヒトモノクローナル抗体が利用され得、ヒトハイブリドーマを使用することにより（Cote,et al.,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030を参照のこと）、またはインビトロでエプスタインバーウイルスによりヒトB細胞を形質転換することにより（Cole,et al.,1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96を参照のこと）作製され得る。

モノクローナル抗体は、例えば、標的抗原、または免疫原性のその断片、誘導体、もしくはバリアントにより、動物を免疫感作することにより生成される。あるいは、標的抗原が発現され、トランスフェクトされた細胞の表面に会合するよう、標的抗原をコードする核酸分子を含有しているベクターによりトランスフェクトされた細胞により、動物を免疫感作する。異種非ヒト動物を作製するための多様な技術が、当技術分野において周知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,075,181号および第6,150,584号を参照のこと。

あるいは、抗体は、抗体配列または抗原結合ドメイン配列を含有しているライブラリーを、標的抗原との結合についてスクリーニングすることにより得られる。このライブラリーは、例えば、構築したファージ粒子の表面に発現されるバクテリオファージコートタンパク質とのタンパク質またはペプチドの融合体、およびファージ粒子内に含有されるコーディングDNA配列として、バクテリオファージにおいて調製される（即ち、「ファージディスプレイライブラリー」）。

次いで、骨髄腫／B細胞融合から得られたハイブリドーマが、標的抗原に対する反応性についてスクリーニングされる。モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975）により記載されたもののようなハイブリドーマ法を使用して調製される。ハイブリドーマ法においては、典型的には、マウス、ハムスター、またはその他の適切な宿主動物が、免疫感作剤と特異的に結合するであろう抗体を産生するかまたは産生可能なリンパ球を誘発するため、免疫感作剤により免疫感作される。あるいは、リンパ球がインビトロで免疫感作されてもよい。

厳密には不可能でないが、同一の重鎖可変ドメインを有するが、異なる抗原に差し向けられる異なる抗体の偶然の同定は、極めて可能性が低い。実際、ほとんどの場合、重鎖が、抗原結合表面に大きく寄与し、配列の可変性も最も高い。特に、重鎖上のCDR3は、配列、長さ、および構造が最も多様なCDRである。従って、異なる抗原に特異的な2種の抗体は、ほぼ必ず、異なる重鎖可変ドメインを保持しているであろう。

本発明の方法は、全てのライブラリーメンバーについて重鎖可変ドメインが同一であり、従って、多様性が軽鎖可変ドメインに限局している抗体ライブラリーの使用により、この制限を克服し、同一の重鎖可変ドメインを有する抗体の単離を大いに促進する。そのようなライブラリーは、例えば、各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、2010年5月20日に出願され、2010年11月25日にPCT公開WO2010/135558として公開された同時係属中の出願PCT/US2010/035619、および2010年11月23日に出願された同時係属中の出願PCT/US2010/057780に記載されている。しかしながら、軽鎖可変ドメインが重鎖可変ドメインと共に発現されるため、両方のドメインが抗原結合に寄与することができる。過程をさらに促進するため、同一の重鎖可変ドメイン、および多様なλ軽鎖可変またはκ軽鎖可変のいずれかを含有している抗体ライブラリーが、平行に、異なる抗原に対する抗体のインビトロ選択のために使用されてもよい。このアプローチは、本発明の完全免疫グロブリンフォーマットの二重特異性抗体の生成のためのビルディングブロックとして使用され得る、共通の重鎖を有するが、一方がλ軽鎖可変ドメインを保持しており、他方がκ軽鎖可変ドメインを保持している2種の抗体の同定を可能にする。本発明の二重特異性抗体は、異なるアイソタイプであり得、それらのFc部分は、異なるFc受容体に対する結合特性を改変し、それにより、抗体のエフェクター機能および薬物動態学的特性を修飾するため、修飾されていてもよい。Fc部分の修飾のための多数の方法が記載されており、本発明の抗体に適用可能である（例えば、Strohl,WR Curr Opin Biotechnol 2009(6):685-91；米国特許第6,528,624号；2009年1月9日に出願されたPCT/US2009/0191199を参照のこと）。本発明の方法は、Fc部分を欠くF(ab')2フォーマットで、二重特異性抗体および抗体混合物を生成するためにも使用され得る。

本発明の別の重要な工程は、本発明の二重特異性抗体の構築を可能にするための、単一細胞における共通の重鎖および2種の異なる軽鎖の同時発現の最適化である。全てのポリペプチドが同一のレベルで発現され、免疫グロブリン分子を形成するために同等に集合するのであれば、単一特異性（同一の軽鎖）と二重特異性（2種の異なる軽鎖）との比率は、50％であるはずである。しかしながら、異なる軽鎖は、異なるレベルで発現され、かつ／または同一の効率で集合しない可能性が高い。従って、本発明の方法は、固有の発現特徴または共通の重鎖と集合する異なる傾向を補うため、異なるポリペプチドの相対的な発現をモジュレートする手段も提供する。このモジュレーションは、プロモーター強度、異なる効率を特色とする細胞内リボソーム侵入部位（IRES）の使用、または転写もしくは翻訳のレベルで作用することができ、mRNA安定性に対して作用してもよい、その他の型の調節要素を介して達成され得る。異なる強度の種々のプロモーターには、CMV（前初期サイトメガロウイルスウイルスプロモーター）；EF1-1α（ヒト伸長因子1αサブユニットプロモーター）；Ubc（ヒトユビキチンCプロモーター）；SV40（シミアンウイルス40プロモーター）が含まれ得る。哺乳動物およびウイルスに由来する種々のIRESも記載されている（例えば、Hellen CU and Sarnow P.Genes Dev 2001 15:1593-612を参照のこと）。これらのIRESは、長さおよびリボソーム動員効率が大きく異なる場合がある。さらに、IRESの複数コピーを導入することにより、活性をさらに調整することが可能である（Stephen et al.2000 Proc Natl Acad Sci USA 97:1536-1541）。ある軽鎖または他の軽鎖を発現する個々の遺伝子のコピー数を増加させ、それにより、相対的な発現を修飾するため、細胞の複数回の逐次トランスフェクションによって、発現のモジュレーションを達成することもできる。本明細書に提供された実施例は、異なる鎖の相対的な発現の制御が、二重特異性抗体の構築および全収率を最大にするために重要であることを証明する。

重鎖および2種の軽鎖の同時発現は、細胞培養上清中に3種の異なる抗体（2種の単一特異性二価抗体および1種の二重特異性二価抗体）の混合物を生成する。関心対象の分子を得るためには、後者を混合物から精製しなければならない。本明細書に記載された方法は、CaptureSelect Fab KappaアフィニティマトリックスおよびCaptureSelect Fab Lambdaアフィニティマトリックス（BAC BV,Holland）のような、κ軽鎖定常ドメインまたはλ軽鎖定常ドメインと特異的に相互作用するアフィニティクロマトグラフィ媒体の使用により、この精製手法を大いに促進する。この多工程アフィニティクロマトグラフィ精製アプローチは、効率的であり、本発明の抗体に一般的に適用可能である。これは、抗体混合物を発現しているクアドローマまたはその他の細胞株に由来する各二重特異性抗体について開発され最適化されなければならない特定の精製法とは極めて対照的である。実際、混合物中の異なる抗体の生化学的特徴が類似している場合、イオン交換クロマトグラフィのような標準的なクロマトグラフィ技術を使用した分離は、困難であるか、または全く不可能であり得る。

本発明は、同一の重鎖を有し、モノクローナル抗体精製のために使用される標準的なクロマトグラフィ技術を使用して精製され得る、2種以上の単一特異性抗体と1種以上の二重特異性抗体との単純な抗体混合物を作製する新たな手段も提供する（例えば、Lowy,I et al.N Engl J Med 2010;362:197-205；Goudsmit,J.et al.J Infect Dis.2006.193,796-801を参照のこと）。そのような単純な混合物は、治療的使用のために多重標的化剤として使用され得る。

重鎖および2種の軽鎖の成功した同時発現、精製、および特徴決定、ならびに二重特異性抗体の精製は、実施例において示される。共通の重鎖および2種の軽鎖をコードする遺伝子が、3種のプロモーターを含有しているベクターへクローニングされた。一過性トランスフェクションの後、PEAK細胞の上清が収集された。

3種の鎖の同時発現は、3種の異なる抗体（2種の単一特異性抗体および1種の二重特異性抗体）の構築をもたらした。発現レベルおよび集合速度が両方の軽鎖について類似しているのであれば、理論上の相対比率は1:1:2であるはずである。二重特異性抗体が、3工程アフィニティクロマトグラフィ手法を使用して精製された：（1）プロテインA：IgGの捕獲（単一特異性および二重特異性）、（2）Kappa select：κ軽鎖を含有しているIgGの捕獲、ならびに（3）Lambda select：λ軽鎖を含有しているIgGの捕獲。KappaselectおよびLambdaselectは、BAC,BVおよびGE Healthcareにより開発されたアフィニティクロマトグラフィ媒体である。

精製された二重特異性抗体は、以下のように特徴決定された。各アフィニティ精製工程からのフロースルーおよび溶出液がSDS-PAGEにより分析された。結果は、各工程で、二重特異性抗体が濃縮されることを示す（図8）。κλボディは、等量のκ軽鎖およびλ軽鎖を含有していた。κλボディは、等電点電気泳動ゲルおよびイオン交換クロマトグラフィにおいて、2種の単一特異性抗体と比較して、中間の移動パターンを示した（図10）。κλボディの特異性および親和性が、ELISAおよび表面プラズモン共鳴により決定された。本発明の方法は、最適化なしに、1ナノモル未満〜ナノモル範囲の親和性を有する抗体の同定を可能にする。本明細書に記載された抗体ライブラリーにおける多様性は、標準的な抗体においては結合エネルギーにあまり寄与しない軽鎖に制限されているため、このことは自明ではない。

κ型およびλ型の軽鎖可変ドメインを有する2種の抗体にアクセスする必要性が、本発明に対する限定として認知されることを回避するため、本明細書に記載された方法は、図3に表されるように、λ可変ドメインがκ定常ドメインと融合していてもよく、反対に、κ可変ドメインがλ定常ドメインと融合していてもよいハイブリッド軽鎖の生成を可能にする。これは、同一の型の軽鎖を有する抗体対へと本発明の適用を拡大する。本明細書に提供される実施例に記載されるように、可変ドメインと定常ドメインとの間の融合点は、重要であり、二重特異性抗体精製過程に影響を与え得る。

本発明の二重特異性抗体および／または多重特異性抗体を作製する一つの方法の概要が、図13に示される。いくつかの態様において、二重特異性抗体および／または多重特異性抗体を生成する方法は、完全無血清既知組成過程を使用する。これらの方法は、製薬産業において最も広範に使用されている哺乳動物細胞株であるチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株を取り入れる。その中に記載された方法は、半安定細胞株および安定細胞株の両方を生成するために使用される。方法は、本発明の二重特異性抗体および／または多重特異性抗体を、小規模（例えば、三角フラスコ）および中規模（例えば、25L Waveバッグ）で製造するために使用され得る。方法は、本発明の二重特異性抗体および／または多重特異性抗体ならびに抗体混合物のより大規模な作製のためにも容易に適応可能である。

本発明の二重特異性抗体および／または多重特異性抗体を生成する方法は、図8Aに示されるような一般的な精製過程を利用するため、有利である。図16は、半安定細胞株から精製された二重特異性抗体の精製および生成物完全性試験を証明する。二重特異性抗体は、以下の3工程アフィニティクロマトグラフィ手法を使用して精製された：（i）単一特異性および二重特異性の両方を含むIgG分子を捕獲するためのプロテインA精製；（ii）κ軽鎖を含有しているIgGを捕獲するためのKappaSelect精製；（iii）λ軽鎖を含有しているIgGを捕獲するためのLambdaSelect精製。各アフィニティ精製工程からのフロースルーおよび溶出液が、SDS-PAGEにより分析された。結果は、精製過程における各単一特異性型（即ち、κ軽鎖を有する単一特異性IgG分子、およびλ軽鎖を有する単一特異性IgG分子）の除去を証明した（図16A）。精製されたκλ含有抗体（即ち、κ軽鎖およびλ軽鎖の両方を有する抗体）は、等量のκ軽鎖およびλ軽鎖を含有していた（図16B）。精製されたκλ含有抗体は、等電点電気泳動ゲル上で、2種の単一特異性抗体と比較して、中間の移動パターンを示した（図16C）。

本発明の二重特異性抗体および／または多重特異性抗体を製造するための既知組成過程は、CHO細胞のプールまたは樹立細胞株を用いて使用され得る。プールまたは樹立細胞株のいずれかを使用した既知組成過程により得られた結果は、対応するκ単一特異性抗体またはλ単一特異性抗体を発現するものと比較可能な産生量および増殖特徴を証明する。従って、κλボディは、古典的なヒトIgGの構造特徴および製造特徴の両方を保存している。

上記の種々の抗体操作アプローチを使用した、均質の二重特異性分子の生成の強制を目標とした、二重特異性抗体フォーマットを作製するための以前のアプローチは、産生量、スケーラビリティ、および生成物の安定性を犠牲にしてなされた。本発明は、モノクローナル抗体の産生量およびスケーラビリティの標準的な特徴を有する単純な抗体混合物の作製を可能にし、混合物から二重特異性抗体を精製するためのまたは抗体混合物を精製するための効率的かつ一般的な手段を提供する、異なるアプローチである。

実施例1：固定の重鎖を有する抗体ライブラリーの生成
重鎖可変ドメインが全てのライブラリーメンバーについて同一の抗体ライブラリーを、以下のように生成した。まず、定義されたCDR3 AKSYGAFDY（SEQ ID NO:1）（CDR命名法はIMGTによる）および定義されたFR4配列を含有している重鎖可変VH3-23ドメインを、SfiIおよびXhoIの制限部位を使用して、pNDSベクターへクローニングし、ファージミドベクターpNDS_VHfixedを得た。VK FR4のアミノ酸配列は、生殖系列J遺伝子JK1によりコードされるFR4領域に相当する。VλFR4のアミノ酸配列は、生殖系列J遺伝子JL2およびJL3によりコードされるFR4領域に相当する。106位に単一アミノ酸置換（アルギニンまたはグリシン）を有するVk FR4配列の2種のバリアントを生成した。各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、2010年5月20日に出願され、WO2010/135558として公開された同時係属中の出願PCT/US2010/035619に記載された方法およびRavn et al.(2010)Nucl Acid Res 38(21):e193に記載された方法に従って、合成または天然起源の多様性がクローニングされ得、高い多様性のライブラリーが生成され得る、17種のアクセプターベクターを生成するため、CDR3コーディング配列の代わりにスタッファー断片を含有している全部で6種のκ可変ドメイン遺伝子（VK1-33、VK1-39、VK3-11、VK3-15、VK3-20、VK4-1）および5種のλ可変ドメイン遺伝子（Vλ1-44、Vλ1-51、Vλ6-57、Vλ2-14、Vλ1-40）を、pNDS_VHfixedへクローニングした。この過程は、全部で6.9×10⁹種のバリアントを含有し、全てが共通のVH3-23ドメインを有し、軽鎖可変相補性決定領域3（CDRL3領域）において多様化されたVκドメインまたはVλドメインを有する、17種のライブラリーの生成をもたらした（図5A）。180の無作為に選ばれた形質転換体の配列決定は、インフレームであって、従って、機能性である可能性のあるCDRL3配列が、クローンの＞90％に組み込まれたことを示した。

実施例2：ライブラリーのファージレスキュー
以下に簡単に要約される標準的なファージディスプレイ手法に従い、各ライブラリーを独立にレスキューした。ライブラリーの理論上の多様性の少なくとも10倍をカバーするのに十分な量の凍結ライブラリーアリコートからの細胞を、2×TYAG（100μg/mlアンピシリン；2％グルコース）500mlに添加し、0.3〜0.5のOD600に到達するまで、撹拌しながら（240rpm）37℃で増殖させた。次いで、培養物にMK13KO7ヘルパーファージを重感染させ、37℃で1時間インキュベートした（150rpm）。次いで、細胞を2000rpmで10分間遠心分離し、培地を除去し、2×TY-AK（100μg/mlアンピシリン；50μg/mlカナマイシン）500mlにペレットを再懸濁させることにより、培地を交換した。次いで、培養物を、30℃で一夜増殖させた（240rpm）。細胞をペレット化するため、培養物を4000rpmで20分間遠心分離した。上清を収集し、混合物を氷上で1時間インキュベートすることにより、ファージ粒子を沈殿させるため、30％(vol/vol)のPEG8000（20％）/2.5M NaClを添加した。ファージ粒子を10,000rpmでの30分間の遠心分離により収集し、TE緩衝液（10mMトリス-HCl pH8.0；1mM EDTA）10mlに再懸濁させた。再懸濁した溶液を、細菌片を除去するために10,000rpmで遠心分離し、沈降手法を繰り返した。最後の再懸濁の後、大腸菌（E.coli）の感染および260nmでの吸収により、ファージを滴定した。ファージの表面におけるscFvのディスプレイレベルも、抗c-mycモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロット分析により評価した。異なるライブラリーから精製されたファージを、15％(w/v)の最終濃度でグリセロールを添加した後、-80℃で凍結保管した。

実施例3：固定重鎖ライブラリーを使用したファージディスプレイ選択
ビオチン化hCXCL10-NusA融合タンパク質（hCXCL10-NusA）およびビオチン化hIL6受容体複合体（hIL6RC）に対する液相選択：VH-VκファージライブラリーおよびVH-Vλファージライブラリー（10¹¹〜10¹²Pfu）のアリコートを、別々に維持し、ロータリーミキサー上で室温で1時間3％(w/v)スキムミルクを含有しているPBSによりブロッキングした。次いで、ブロッキングされたファージを、ロータリーミキサー上で室温で1時間ストレプトアビジン磁性ビーズ（Dynal M-280）上でデセレクト（deselected）した。次いで、デセレクトされたファージを、ロータリーミキサー上で室温で2時間、インビボでビオチン化されたhCXCL10-NusAまたはhIL6RC（100nM）と共にインキュベートした。ビーズを標的に添加し、磁気スタンドを使用して捕獲した後、PBS/0.1％トゥイーン20により4回、PBSにより3回洗浄した。次いで、ビーズを、指数関数的に増殖中のTG1細胞10mlに直接添加し、低速で振とうしながら（100rpm）37℃で1時間インキュベートした。選択アウトプットを滴定するため、感染TG1のアリコートを段階希釈した。残りの感染TG1を、3000rpmで15分間スピンし、2×TYAG（100μg/mlアンピシリンおよび2％グルコースを含有している2×TY培地）0.5mlに再懸濁させ、2×TYAG寒天Bioassayプレート上に播種した。30℃での一夜のインキュベーションの後、2×TYAG 10mlをプレートに添加し、細胞を表面から剥離させ、50mlポリプロピレンチューブに移した。17％グリセロールの最終濃度を得るため、50％グリセロールを含有している2×TYAGを、細胞懸濁物に添加した。選択ラウンドのアリコートを-80℃で維持した。

ファージレスキュー：前選択ラウンドから得られた細胞懸濁物100μlを2×TYAG 20mlに添加し、0.3〜0.5のOD600に到達するまで、撹拌しながら（240rpm）37℃で増殖させた。次いで、培養物に3.3×10¹⁰ MK13KO7ヘルパーファージを重感染させ、37℃で1時間インキュベートした（150rpm）。次いで、3800rpmで10分間細胞を遠心分離し、培地を除去し、2×TY-AK（100μg/mlアンピシリン；50μg/mlカナマイシン）20mlにペレットを再懸濁させることにより、培地を交換した。次いで、培養物を30℃で一夜増殖させた（240rpm）。翌日、遠心分離された上清のアリコートを、次の選択ラウンドのためのインプットとして使用した。

ELISAのためのモノクローナルファージレスキュー：単一クローンを、1ウェル当たり150μlの2×TYAG媒体（2％グルコース）を含有しているマイクロタイタープレートへ選び出し、37℃（100〜120rpm）で5〜6時間増殖させた。10の感染多重度（MOI）（即ち、培養物中の各細胞について10個のファージ）を得るため、M13KO7ヘルパーファージを各ウェルに添加し、37℃（100rpm）で1時間インキュベートした。増殖後、プレートを3,200rpmで10分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、細胞を2×TYAK培地150μlに再懸濁させ、30℃（120rpm）で一夜増殖させた。ELISAのため、5％スキムミルク粉末を含有している2×濃度PBS 150μlを添加した後、室温で1時間インキュベートすることにより、ファージをブロッキングする。次いで、プレートを、3000rpmで10分間遠心分離し、ファージ含有上清をELISAのために使用した。

ファージELISA：ELISAプレート（Maxisorp,NUNC）を、PBS中の2μg/ml hCXCL10-NusAまたはPBS中の2μg/ml hIL6RCにより一夜コーティングした。次いで、室温で1時間、3％スキムミルク/PBSによりプレートをブロッキングした。プレートをPBS 0.05％トゥイーン20により3回洗浄した後、予めブロッキングされたファージ上清を移し、室温で1時間インキュベートした。各クローンを、その特異性を試験するため、両方の標的に対して試験した。次いで、プレートを、PBS 0.05％トゥイーン20により3回洗浄した。（HRP）共役抗M13抗体（Amersham、1:10,000希釈）を含有している3％スキムミルク/PBS 50μlを各ウェルに添加した。室温で1時間インキュベートした後、プレートを、PBS 0.05％トゥイーン20により5回洗浄した。次いで、TMB（Sigma）50μlを添加することにより、ELISAを可視化し、反応を中止するため、2N H₂SO₄ 50μlを添加した。吸収強度を450nmで読み取った。同一の重鎖可変ドメインを保持しているhCXCL10-NusAまたはhIL6RCに特異的なクローンを同定することができた（図4）。

ファージクローン配列決定：単一クローンを、1ウェル当たり5mlの2×TYAG媒体（2％グルコース）において増殖させ、37℃（120rpm）で一夜増殖させた。翌日、ファージミドDNAを精製し、pNDS1に特異的なプライマー：mycseq

を使用したDNA配列決定のために使用した。

大規模scFv精製：2×TYAG 1mlのスターターカルチャーに、新鮮に画線培養された2×TYAG寒天プレートからの単一コロニーを接種し、37℃で振とうしながら（240rpm）5時間インキュベートした。この培養物0.9mlを、同培地の培養物400mlに接種するために使用し、激しく振とうしながら（300rpm）30℃で一夜増殖させた。翌日、1M IPTG 400μlを添加することにより、培養物を誘導し、インキュベーションをさらに3時間続けた。細胞を、4℃での5,000rpmでの10分間の遠心分離により収集した。ペレット化された細胞を、上記のようなプロテアーゼ阻害剤が補足された氷冷TES緩衝液10mlに再懸濁させた。1:5希釈TES緩衝液15mlを添加し、氷上で1時間インキュベートすることにより、浸透圧ショックを達成した。細胞片をペレット化するため、4℃で10,000rpmで20分間細胞を遠心分離した。上清を、新鮮なチューブに注意深く移した。イミダゾールを、10mMの最終濃度で、上清に添加した。PBSで平衡化されたNi-NTA樹脂（Qiagen）1mlを、各チューブに添加し、4℃（20rpm）で1時間ロータリーミキサー上でインキュベートした。チューブを、2,000rpmで5分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ペレット化された樹脂を、冷（4℃）洗浄緩衝液1（50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0）10mlに再懸濁させた。懸濁物をpolyprepカラム（Biorad）に添加した。冷洗浄緩衝液2（50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.0）8mlを、重力流によりカラムを洗浄するために使用した。溶出緩衝液（50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH8.0）2mlにより、カラムからscFvを溶出させた。画分を280nmにおける吸収により分析し、タンパク質含有画分をプールした後、PBSにより平衡化されたNAP5脱塩カラム（Amersham）で緩衝液交換を行った。PBS中のscFvをSDS-PAGEにより分析し、280nmにおける吸収により定量化した。精製されたscFvを、等分し、-20℃および4℃で保管した。精製されたscFvを、それらが選択された標的との特異的結合を確認するため、ELISAにおいて使用した。

実施例4：異なる固定VHライブラリーを使用した付加的な選択
天然に再編成された軽鎖レパートリーを捕獲し、実施例1に記載された単一VHドメインの環境でそれらをクローニングすることによっても、抗体ライブラリーを生成した。この場合、ヒト再編成可変領域の5'領域および3'領域に対応するプライマーを使用して、ヒトcDNAから軽鎖可変遺伝子領域全体を増幅し、実施例1に記載されたpNDS_VHfixedベクターへクローニングした。実施例1に記載されたようにして、ただし、異なるCDRH3配列ARGDDVS（SEQ ID NO:3）を含有している固定のVH3-23ドメインを使用して、もう1セットのライブラリーを生成した。上記のライブラリーは、図5に模式的に表される。これらの固定VHライブラリーを、実施例2および3に記載された選択およびスクリーニングの方法論を使用して、標的タンパク質のパネルに対して使用した。選択は以下の標的を使用して実施された：hCXCL10-NusA、IL-6RC、CD47、CD16、CD8、およびhIFNγ。それらの標的に特異的であることが同定され示された候補は、表IIにリストされる。これらの結果は、異なる標的と結合し共通の重鎖を有する抗体が生成され得ること、そして軽鎖に制限された多様性が抗原特異性を付与するのに十分であることを証明している。異なるCDRH3配列を有するVH3-23ドメインを含有しているか、または異なる戦略を使用して多様化されたVLレパートリーを有するライブラリーから、候補を生成することが可能であった。従って、結果は、特定のVH配列または特定の軽鎖可変ドメイン多様化戦略に、アプローチが制限されないことを証明している。

（表ＩＩ）2種の異なるCDRH3配列を含有している固定のVH配列を有するライブラリーを使用して標的のパネルに対して同定された独立のクローンの数
NA：選択未実施。

実施例5：固定VH候補のIgGへのリフォーマットおよび哺乳動物細胞における一過性発現
スクリーニングの後、scFv候補を、IgGへリフォーマットし、PEAK細胞への一過性トランスフェクションにより発現させた。共通の重鎖を有し、それぞれ、IFNγおよびIL6RCに特異的であり、異なる軽鎖配列を有するいくつかのIgGλ（n＝5）およびIgGκ（n＝9）を、以下のように生成した。選択されたscFvのVH配列およびVL配列を、特異的なオリゴヌクレオチドにより増幅し、重鎖および軽鎖の定常領域を含有している発現ベクターへクローニングし、構築を配列決定により確証した。発現ベクターを、Fugene 6 Transfection Reagent（Roche,Basel,Switzerland）を使用して、哺乳動物細胞へトランスフェクトした。簡単に説明すると、Peak細胞を、ウシ胎仔血清を含有している培養培地2mlにおいて、1ウェル当たり6×10⁵細胞の濃度で、6穴プレートにおいて培養した。候補のVH配列およびVL配列をコードする発現ベクターを、製造業者の説明に従い、Fugene 6 Transfection Reagentを使用して、細胞へコトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、培養培地を吸引し、新鮮な無血清培地3mlを細胞へ添加し、37℃で3日間培養した。3日間の培養期間の後、上清を採集し、製造業者の説明に従い、protein G-Sepharose 4B fast flowカラム（Sigma,St.Louis,MO）でIgGを精製した。簡単に説明すると、トランスフェクトされた細胞からの上清を、ImmunoPure（G）IgG結合緩衝液（Pierce,Rockford IL）と共に4℃で一夜インキュベートした。次いで、試料を、Protein G-Sepharose 4B fast flowカラムに通過させ、従って、溶出緩衝液を使用してIgGを精製した。次いで、溶出したIgG画分を、PBSに対して透析し、280nmにおける吸収によりIgG含量を定量化した。純度およびIgG完全性をSDS-PAGEにより確証した。次いで、ELISAにより、IFNγ、および本明細書中IL6RCと呼ばれるIL-6/IL-6R受容体複合体との結合について、IgGを試験した。ビオチン化されたIFNγおよびIL6RCを、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレート（Streptawell,Roche）に固定化し、次いで、2％BSAが補足されたPBSにより室温で1時間プレートをブロッキングした。プレートを、PBS 0.05％トゥイーン20により3回洗浄した後、いずれかの標的によりコーティングされたウェルに、精製された抗INFγ IgGλまたは抗IL6RC IgGκを添加した。室温での1時間のインキュベーションおよびプレートの洗浄の後、結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されている抗ヒトCκ抗体または抗ヒトCλ抗体により検出した。次いで、TMB（Sigma）50μlを添加することにより、ELISAを可視化し、反応を中止するため、2N H₂SO₄ 50μlを添加した。吸収強度を450nmにおいて読み取った。結果は、固定VHライブラリーから単離されたscFvの結合特異性が、IgGフォーマットにおいて維持されることを示し、同一の重鎖を有し異なる軽鎖を有する2種のIgGが、別個の標的に対して特異的であり得ることを証明した（図6）。

抗INFγ IgGλまたは抗IL6RC IgGκの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、以下に示す：
抗IL6RC Vκ軽鎖

抗INFγVλ軽鎖

共通の重鎖

実施例6：1種の重鎖および2種の軽鎖の哺乳動物細胞における同時発現
同一の細胞における1種の重鎖および2種の軽鎖の同時の発現は、3種の異なる抗体の構築をもたらすことができる（図8A）。同時の発現は、同時発現される鎖のうちの1種を発現する複数のベクターのトランスフェクション、または多重遺伝子発現を駆動するベクターの使用のような、異なる方式で達成され得る。1種の重鎖、1種のκ軽鎖、および1種のλ軽鎖の同時発現を可能にするため、ベクターpNoviκHλを設計した（図7A）。3種の遺伝子の発現はヒトサイトメガロウイルスプロモーター（hCMV）により駆動され、ベクターは、安定細胞株の選択および樹立を可能にするグルタミン合成酵素遺伝子（GS）も含有している。λ軽鎖の後にκ軽鎖の第2のコピーが挿入されており、その発現が細胞内リボソーム侵入部位（IRES）により駆動される、別のベクターpNoviκHλκも構築した。この2シストロン設計を使用すると、κ軽鎖の相対的な発現を増強させることができる。2種のベクターは、図7に模式的に表される。

実施例7：1種の重鎖および2種の軽鎖の哺乳動物細胞における一過性同時発現、ならびに全IgGの精製
抗INFγ IgGλまたは抗IL6RC IgGκのVH遺伝子およびVL遺伝子を、哺乳動物細胞における一過性発現のため、実施例5に記載されたベクターpNoviκHλへクローニングした。Peak細胞を、ウシ胎仔血清を含有している培養培地2mlにおいて、1ウェル当たり6×10⁵細胞の濃度で、6穴プレートにおいて培養した。プラスミドDNA 2μgを、製造業者の説明に従ってTransIT-LT1トランスフェクション試薬（Mirus）を使用して、細胞へトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、培養培地を吸引し、新鮮な無血清培地3mlを細胞へ添加し、37℃で5日間培養した。5日間の培養期間の後、上清を採集し、4000rpmで遠心分離し、製造業者の説明に従ってMabSelect Sure PA樹脂（GE Healthcare）に適用した。全IgGを酸性条件下で溶出させた後、中和およびPBSへの緩衝液交換を行った。IgG含量を、280nmにおける吸収により定量化し、SDS-PAGEにより分析した。2種の軽鎖に対応する2本のバンド、および重鎖に対応する1本のバンドの存在は、同一の細胞において3種の鎖を同時に発現させることが可能であることを示した（図8B）。

実施例8：λ軽鎖とκ軽鎖とを保持している二重特異性抗体の精製
同一の細胞における、1種の重鎖および2種の軽鎖の同時発現は、3種の異なる抗体（両方のアームに同一の軽鎖を保持している2種の単一特異性抗体、および各アームに重鎖と会合した異なる軽鎖を保持している二重特異性抗体）の構築をもたらすことができる。単一特異性抗体と二重特異性抗体との異なる生化学的特性を利用するクロマトグラフィ技術により、後者は、単一特異性抗体から単離され得る。全ての二重特異性抗体の生成に適用可能な一般的な精製アプローチを開発するため、本発明者らは、図8Aに模式的に図示されたアフィニティクロマトグラフィアプローチを使用した。トランスフェクトされた細胞からの培養上清を、実施例7に記載されるように、MabSelect Sure PA樹脂（GE Healthcare）カラムに適用し、全IgGを精製した。次いで、全IgGを、10倍容量のPBSにより平衡化されたCaptureSelect Fab Kappaアフィニティマトリックス（BAC BV,Holland）を含有しているカラムに適用した。次いで、カラムを5〜10倍カラム体積のPBSにより洗浄した。5倍カラム体積の0.1MグリシンpH2.0を適用することにより、κ軽鎖を保持している免疫グロブリン分子をカラムから溶出させ、画分を収集し、中和した。抗体を含有している画分をプールした後、PBSにより平衡化されたPD10脱塩カラム（Amersham）で緩衝液交換を行った。次いで、10倍容量のPBSにより平衡化されたCaptureSelect Fab Lambdaアフィニティマトリックスを含有している第2のカラムに、抗体を適用した。次いで、カラムを5〜10倍カラム体積のPBSにより洗浄した。κ軽鎖のみを保持している免疫グロブリン分子は、カラムに結合せず、フロースルー中に見出された。5倍カラム体積の0.1MグリシンpH3.0を適用することにより、λ軽鎖を保持している抗体をカラムから溶出させ、画分を収集した。二重特異性抗体を含有している画分をプールした後、PBSにより平衡化されたPD10脱塩カラム（Amersham）で緩衝液交換を行った。5倍カラム体積の0.1MグリシンpH2.0を適用することにより、κ軽鎖を保持している免疫グロブリン分子をカラムから溶出させ、画分を収集し、中和した。抗体を含有している画分をプールした後、PBSにより平衡化されたPD10脱塩カラム（Amersham）で緩衝液交換を行った。次いで、抗体を、10倍容量のPBSにより平衡化されたCaptureSelect Fab Lambdaアフィニティマトリックスを含有している第2のカラムに適用した。次いで、カラムを5〜10倍カラム体積のPBSにより洗浄した。κ軽鎖のみを保持している免疫グロブリン分子は、カラムに結合せず、フロースルー中に見出された。5カラム体積の0.1MグリシンpH3.0を適用することにより、λ軽鎖を保持している抗体を、カラムから溶出させ、画分を収集した。二重特異性抗体を含有している画分をプールした後、PBSにより平衡化されたPD10脱塩カラム（Amersham）で緩衝液交換を行った。各精製工程のフロースルーおよび溶出画分をSDS-PAGEにより分析したところ、λ軽鎖を保持している抗体は、CaptureSelect Fab Kappaアフィニティマトリックスのフロースルーの中に見出され、反対に、κ軽鎖を保持している抗体は、CaptureSelect Fab Lambdaアフィニティマトリックスのフロースルーの中に見出されることが示された（図8B）。予想通り、最終的な溶出画分において、2種の軽鎖に対応するバンドの強度は、等しい。このように、この3工程アプローチは、κ軽鎖およびλ軽鎖の両方を保持している二重特異性抗体の精製を可能にする。κ軽鎖およびλ軽鎖を保持している二重特異性抗体の最終的な回収率は、異なる実験においておよそ10〜21％であった。プロテインA溶出画分は、λ軽鎖の方がκ軽鎖より多く、精製されたIgGへと集合することも示し、このことから、κ軽鎖の発現の増強が、二重特異性抗体の構築および回収率を増大させ得ることが示唆された。

実施例9：二重特異性抗体構築を最適化するための軽鎖発現のモジュレーション
κ軽鎖の発現を増強させるため、共通のVH遺伝子と、抗INFγ抗体のVλ遺伝子と、抗IL6RCのVκの2コピーとを、実施例6に記載されたベクターpNoviκHλκへクローニングした。Vκ軽鎖の第2のコピーの発現は、IRESにより駆動される。異なるレベルのVκ軽鎖発現を達成するため、異なるIRES要素を試験した。これは、5種の独立のベクターpNoviκHλκ1〜5の構築をもたらした。これらのベクターを、実施例7に記載されたような、哺乳動物細胞における一過性トランスフェクションのために使用し、プロテインAアフィニティ精製を使用して、上清から全IgGを精製した。SDS-PAGE分析は、異なるpNoviκHλκベクターが、pNoviκHλベクターを使用した発現と比較して、κ軽鎖の発現およびIgGへの集合を増強させたことを示す（図9）。これらの構築物の各々についてプロテインA精製の後に得られた全IgG画分を、実施例8に記載されるようなCaptureSelect Fab KappaおよびCaptureSelect Fab Lambdaを使用した連続的な2工程で精製した。二重特異性抗体の収率は、pNoviκHλについては20％、pNoviκHλκ構築物については33〜41％の範囲であり、このことから、κ軽鎖発現の増強が、二重特異性抗体の構築を増強させることが示された。これらの所見をさらに確認するため、pNoviκHλおよび単一特異性抗IL6RC IgGκを発現するベクターを使用したコトランスフェクションを実施した。それにより、κ軽鎖の相対的なレベルも、二重特異性抗体の収率も増大し、このことから、相対的な軽鎖発現を調整するため、いくつかのアプローチを採用し得ることが示された。

実施例10：精製された二重特異性抗体の特徴決定
上記実施例に記載されるようにして単離された、精製された二重特異性抗体を、異なる技術を使用して特徴決定した。

等電点電気泳動ゲル（IEF）。実施例9に記載されるようにして単離された、精製された二重特異性抗体を、pH3〜10の範囲を有するIsoGel Agarose IEFプレート（Lonza）を使用して分析し、単一特異性の抗INFγ IgGλ抗体および抗IL6RC IgGκ抗体と比較した。電気泳動後、ゲルを固定溶液中に30分間置き、水により5分間洗浄し、次いで、RTで乾燥させた。ゲルを、クーマシー染色により15分間染色し、水により簡単に濯ぎ、脱染溶液により15分間2回濯いだ。最後に、ゲルをRTで乾燥させた後、画像化した。図10Aに示される結果は、IgGκλ二重特異性抗体が、抗体フォーマットおよび理論上の計算から予測されるような2種の単一特異性抗体のpIと比較して、異なる中間のpIを有することを示す。染色は、二重特異性抗体が、実施例8に記載された3工程精製過程の後に、高度に純粋であることも証明した。

イオン交換クロマトグラフィ（IEX）。精製された単一特異性抗体および二重特異性抗体50μgを、Agilent column Bio Mab,NP5（Agilent）を使用したIon Exchange-High Performance Liquid Chromatography（IEX-HPLC）（HPLC Waters e2695/検出器2489）により分析した：移動相は以下の通りであった：A：Na2HPO4/NaH2PO4 10mM、pH6.5；B：Na2HPO4/NaH2PO4 10mM、NaCl 100mM、pH6.5；0.8mL/分の流速、133分での20％〜60％勾配を使用。3種の抗体は、異なる保持時間を有し、二重特異性抗体に対応するピークは、単一特異性抗体と比較して、中間のプロファイルを有する（図10B）。

ELISA。単一特異性の抗INFγ IgGλ抗体、抗IL6RC IgGκ抗体、および二重特異性IgGκλ抗体を、INFγおよびIL6RCとの結合について、ELISAにより試験した。図11に示される結果は、二重特異性IgGκλが、両方の標的と結合することができ、抗ヒトCκ二次抗体および抗ヒトCλ二次抗体の両方により検出され得ることを示す。

表面プラズモン共鳴（SPR）。単一特異性の抗INFγ IgGλ抗体、抗IL6RC IgGκ抗体、および二重特異性IgGκλ抗体の親和性および結合動力学を、Biacore 2000装置（Biacore AB,Uppsala,Sweden）で特徴決定した。200RUのヤギ抗ヒトポリクローナルIgG（ahIgG；Biacore）を、EDC/NHS化学によりCM5 Biacoreチップに固定化した。この表面を単一特異性ヒトIgGまたは二重特異性ヒトIgGを捕獲するために使用した。30μL/分で30秒間、10mMグリシンpH＝1.5を注入した後、HBS-EP緩衝液で1分間安定化することにより、各サイクルの後、表面を再生させた。データを、1:1ラングミュアモデルに従って適合させ、K_on値、K_off値、およびK_D値を決定した（表III）。単一特異性抗体および二重特異性IgGκλ抗体について、類似した親和性値が得られた。データは、2種の抗体結合部位が、単一特異性フォーマットまたは二重特異性フォーマットにおいて、同様に、hIFNγおよびIL6RCと結合することを示す。

両方の標的と同時に相互作用する二重特異性IgGκλの能力を、SPRにより試験した。ビオチン化INFγを、ストレプトアビジンでコーティングされたCM5 Biacoreチップに固定化した。単一特異性抗体および二重特異性抗体を、この表面に注入した後、IL6RCを注入した。図11Aに示されるセンサーグラムは、二重特異性IgGκλ抗体が、固定化されたINFγと結合することができ、同時にIL6RCを捕獲することもできたことを示す。精製された二重特異性抗体におけるκ軽鎖およびλ軽鎖の相対量を査定するためにも、SPRを使用した。IgGκλを、アミン共役を介してCM5 Biacoreチップの表面に直接固定化し、抗ヒトCκ抗体を注入した後、同濃度の抗ヒトCλ抗体を注入した。両方の抗軽鎖抗体により同等の応答が得られ、このことから、フォーマットから予測される通り、等量のκ軽鎖およびλ軽鎖が二重特異性IgGκλ抗体に存在することが示された（図12B）。

（表ＩＩＩ）Biacore 2000系で測定されたIFNγおよびIL6RCに対する単一特異性抗体およびIgGκλ二重特異性抗体についての結合動力学的分析

実施例11：二重特異性IgGκλ抗体の製造
IgGκλ二重特異性抗体の発現を、モノクローナル抗体の製造のために広範に使用されているチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞においても実施した。本明細書に提示された実施例において、トランスフェクトされたCHO細胞の半安定プールおよび安定細胞CHO株の両方が、IgGκλ二重特異性抗体の生成のために生成された。本明細書に提示された研究において、安定CHO株は、既知組成動物成分不含（CDACF）製造過程を使用して、生成され増殖させられた。全過程が図13に示される。

CHOプール。上記実施例に記載されたIgGκλ抗INFγ/抗IL6RC二重特異性抗体をコードする直鎖化されたベクターpNoviκHλκ、ならびに単一特異性の抗INFγ IgGλおよび抗IL6RC IgGκの発現を駆動するプラスミドにより、CHO細胞を電気穿孔した。電気穿孔の後、トランスフェクトされた細胞のプールを、非流加10日間過増殖条件において増殖させた。二重特異性構築物によりトランスフェクトされた細胞は、単一特異性発現ベクターによりトランスフェクトされた細胞と比較して、類似している増殖プロファイルを示した。さらに、産生量も比較可能であって、非流加過増殖プール培養物について、典型的な抗体産生量の範囲：100〜200mg/Lに達した（図14A）。三角フラスコ（100mL）における小規模作製から25L Waveバッグにおける中規模作製への規模拡大は、成功裡に達成された（図14B）。これらの結果は、CHO細胞株における二重特異性IgGκλ抗体および対応する単一特異性抗体の発現において、類似した増殖曲線および産生量が得られることを示す。

安定CHO細胞株。二重特異性抗体を産生する組換え細胞株を、pNoviκHλκベクターによるCHO細胞の電気穿孔により生成した。トランスフェクション後、最終濃度50μMのメチオニンスルホキシミン（MSX）の存在下で細胞培養物を希釈することにより、組換え細胞株を選択した。6週間のインキュベーションの後、組換え細胞株のコロニーを、FastELISA（登録商標）（R&D Biotech）により、全IgG産生量についてスクリーニングした（図15A〜B）。選択された細胞株を、25μM MSXを含有している細胞培養培地において増大させ、24穴マイクロタイタープレートに移し、懸濁培養における産生量および増殖特徴についてスクリーニングした（図15C〜D）。結果は、IgGκλ二重特異性抗体が、振とうバッチ過増殖条件において、標準的な単一特異性抗体を発現する細胞株と比較可能なレベルで産生され得ることを明らかにした。上位産生細胞株を選択し、最長で10日間、振とうフラスコにおいて50mLバッチ過増殖培養を行った。プロテインA HPLCを、上清中の全IgGの定量化のために使用した。上位10の産生細胞株の上清からの全IgGを、1mL HiTrap（GE Healthcare）プレパックカラムを使用したMabSelect SuREクロマトグラフィにより精製した。精製された全IgGの中の単一特異性抗体と二重特異性抗体との相対量を、実施例10に記載されるようなIEX-HPLCにより査定した。細胞株の大部分について、IgGκλ二重特異性抗体の画分は、全IgGの37〜42％の間であり、2種の細胞株は、より少量のIgGκλを発現していた（22％および25％）。10のCHO細胞株についての結果は、表IVに要約される。

（表ＩＶ）

CHOにおいて発現されたIgGκλ二重特異性抗体の精製および特徴決定。二重特異性構築物および単一特異性構築物によりトランスフェクトされたCHO細胞プールの上清を、精製のために使用した。単一特異性の抗INFγ IgGλおよび抗IL6RC IgGκを、プロテインAアフィニティクロマトグラフィを使用して精製し、PBSへと脱塩し、二重特異性IgGκλ抗体を、実施例8に記載された3工程アフィニティクロマトグラフィ過程を使用して精製した。異なる工程の溶出画分およびフロースルー、ならびに最終精製試料を、SDS-PAGEおよびIEFにより分析した（図16）。IgGκλの特異性を、ELISAにより、各精製工程の後にモニタリングした（図17）。結果は、精製過程が、頑強であり、CHOにおける発現と適合性であり、高度に純粋なIgGκλ二重特異性抗体を与えることを証明している。

実施例12：二重特異性IgGκλ抗体の付加的な例
上記実施例に記載されたようにして、IgGκλ二重特異性抗体のその他の例を単離し、発現させ、精製した。これらには、抗NusA／抗INFγ IgGκλ二重特異性抗体、および両方の結合部位がIL6RCと結合するが、κ軽鎖およびλ軽鎖を保持している抗IL6RC/抗IL6RC IgGκλ二重特異性抗体が含まれた。これらの精製された二重特異性抗体を、それぞれの単一特異性カウンターパートと共にIEFにより分析した（図18）。結果は、二重特異性抗体のpIは、常に、単一特異性抗体のpIの中間にあるが、その差は、軽鎖可変ドメインの配列に依って有意に変動し得ることを示している。これは、2種の軽鎖が類似した生化学的特性を有する場合、電荷の差に基づく二重特異性抗体の精製は困難であり得ることを例証しており、本発明のアフィニティ精製アプローチの利点を強調する。

実施例13：2種のκ可変ドメインまたは2種のλ可変ドメインを使用した二重特異性IgGκλ抗体の生成
二重特異性抗体は、同一の型（λまたはκ）の2種の可変ドメインを使用しても生成され得る。アフィニティ精製工程は、軽鎖の定常κドメインおよび定常λドメインの存在を必要とするため、原理的には、任意の軽鎖可変ドメインを、図3に示されるようなハイブリッド軽鎖を生成するため、これらの定常ドメインと融合させることができる。これは、実施例1に記載された固定VH抗体ライブラリーから単離されたINFγおよびIL6RCに対する2種の抗体を使用することにより証明された。この場合、両方の抗体が、同一のVHを有し、λ軽鎖可変ドメインを有する。抗INFγ抗体のVλドメインをλ定常ドメインと組み合わせ、抗IL6RC抗体のVλドメインをκ定常ドメインと組み合わせた。後者について、VλドメインとCκドメインとの間の異なる融合点を含む、3種の異なる構築物が生成された。1種の構築物（ハイブリッド1）において、融合点は、Vλドメインのフレームワーク4（FR4）領域の末端にあり、定常κドメイン全体を含む（図19A）。もう1種の構築物（ハイブリッド2）においては、λFR4領域がκFR4領域に交換された（図19B）。第3の構築物（ハイブリッド3）においては、定常κドメインの最初の4アミノ酸が、定常λドメインの4アミノ酸に置換された（図19C）。これらの異なるハイブリッドλ軽鎖-κ軽鎖を、共通の重鎖およびλ軽鎖と共にpNoviκHλベクターへクローニングした。上記実施例に記載されるようにして、哺乳動物細胞トランスフェクション、タンパク質発現、およびIgGκλの3工程アフィニティ精製を実施した。溶出画分の分析は、ハイブリッド3の軽鎖が、Kappaselect樹脂と結合せず、従って、効率的な二重特異性抗体精製を可能にしないことを示した。ハイブリッド1およびハイブリッド2は、効率的なIgGκλ二重特異性精製を可能にした。Protein 80チップ（Agilent Technologies）を使用したAgilent Bionalyzer 2100で分析された、ハイブリッド軽鎖を保持しているこれらの精製されたIgGκλ、および軽鎖に対応する電気泳動図上のピークは、等しいことが示された（図20）。結果は、共通の重鎖と、同一の型（κまたはλ）の可変ドメインを有する2種の軽鎖とを有する2種の抗体を使用して、本発明の二重特異性抗体が、生成され得ることを示す。

実施例14：記載された抗体のVHおよびVLの両方が抗原結合に関与している
共通のVHの抗原結合への寄与を試験するため、実施例1および4において選択された共通のVHを保持しているscFvの異なる軽鎖を、最初の共通のVHとは異なる2種の異なるVHと組み合わせた。実施例3に記載されたようにして、異なるscFvを発現させ、精製し、それらが選択された標的に対する結合について試験した。図21に示される例は、INFγに特異的なscFvおよびIL6RCに対して特異的なscFvが、それらが最初に選択されたVHドメインと組み合わされた時にのみ、それぞれの標的と結合することができ、発現および精製を可能にする2種の他のVHドメインと組み合わされた時には、結合が観察されないことを示している。結果は、多様性がVLドメインに制限されているという事実にも関わらず、共通のVHおよびVLの両方が、抗原結合に寄与することを示す。

実施例15：IgGκλ二重特異性抗体定量化のためのELISAの開発
IgGκλ二重特異性抗体を定量化するためのサンドイッチELISAを開発した。96穴Maxisorp（Nunc）プレートを、10ug/mlマウス抗ヒトλ抗体（Southern Biotech）によりコーティングし、4℃で一夜インキュベートした。洗浄（0.05％PBSトゥイーン20、3回）の後、PBS-BSA 3％（Sigma）により室温で2時間プレートをブロッキングした。試料定量化のための良好な直線範囲を得るため、精製されたIgGκλ標準物を、PBS-BSA 1％により500ng/ml〜1ng/mlの間に段階希釈した。起源に依って、以下のような定量化範囲に入るよう試料を希釈した：粗CHO上清1/1500；プロテインA精製1/15000。次いで、試料を1:2に段階希釈した。プレートの洗浄後、調製された各希釈物50ulをデュプリケートで添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、1:2000抗ヒトκ抗体（Southern Biotech）50ulと共に室温で1時間インキュベートした。最後の洗浄（PBST 0.05％、5回）の後、反応をTMB基質（Sigma）50ulにより可視化し、15分後、H₂SO₄（水酸化ナトリウム2N）50ulを添加することにより中止した。450nmにおける吸収を、精密マイクロプレートリーダー（Epoch,Witec）を使用して記録した。単一特異性抗体が、コーティングされた捕獲抗体と結合することによりアッセイに影響を与える可能性があるため、増加する量の単一特異性IgGκ抗体および単一特異性IgGλ抗体をIgGκλ二重特異性標準物に添加することにより、スパイキング実験を実施した。異なる比率を試験した：（50％IgGκλ二重特異性、25％単一特異性IgGκ、25％単一特異性IgGλ）；（67％IgGκλ二重特異性；33％単一特異性IgGλ）；（50％IgGκλ二重特異性、50％単一特異性IgGλ）；（25％IgGκλ二重特異性、75％単一特異性IgGλ）；（50％IgGκλ二重特異性、50％単一特異性IgGκ）。

図22に示される結果は、アッセイが、単一特異性抗体により有意に影響を受けず、従って、細胞培養上清のような複雑な試料におけるIgGκλ二重特異性抗体の定量化のために使用され得ることを示す。安定CHO細胞株からの上清、およびプロテインAアフィニティクロマトグラフィにより同上清から精製された全IgGの中のIgGκλ二重特異性抗体を定量化するため、ELISAを使用した。ELISA定量化結果が、プロテインA HPLCまたは280nmにおける吸収により決定された全IgG含量と比較され、表Vに要約される。ELISAにより得られた濃度は、予想される二重特異性の割合である全IgGの30〜40％に相当した。データは、このアッセイが、細胞培養上清中のIgGκλ二重特異性抗体の量を決定するために使用可能であり、IgGκλ二重特異性抗体の産生量についての安定細胞株のスクリーニングを促進することを示す。

（表Ｖ）ELISAによる粗上清または全IgGを使用した異なる安定CHO細胞株についてのIgGκλ二重特異性抗体の定量化、ならびにプロテインA HPLCおよびA280による全IgGの定量化の結果との比較

その他の態様
本発明を、その詳細な説明と共に記載したが、上記の記載は、本発明を例示するためのものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を制限するものではない。その他の局面、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (19)

1. ａ．同一のポリペプチド配列を有する２つの重鎖ポリペプチド、
   ｂ．可変領域およびκ定常領域を有する第1の軽鎖ポリペプチド、および
   ｃ．可変領域およびλ定常領域を有する第2の軽鎖ポリペプチド、
   を含む、各結合部位において異なる特異性を有する抗体。
2. 第1の軽鎖が、λまたはκ可変領域を含む、請求項1記載の抗体。
3. 第2の軽鎖が、λまたはκ可変領域を含む、請求項1記載の抗体。
4. 定常領域および可変フレームワーク領域の配列がヒトのものである、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
5. 以下の工程を含む、各結合部位において異なる特異性を有する抗体を作製する方法：
   （a）第1の軽鎖可変領域ドメインと組み合わされた重鎖可変領域ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程；
   （b）第2の軽鎖可変領域ドメインと組み合わされた、工程（a）の抗体と同一の重鎖可変領域ドメインにより決定される異なる特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程；
   （c）i. 重鎖定常領域ドメインと融合した重鎖可変領域ドメイン；
   ii. κ定常領域ドメインと融合した第1の軽鎖可変領域ドメイン；および
   iii.λ定常領域ドメインと融合した第2の軽鎖可変領域ドメイン、
   を一つの細胞において同時に発現させ、各結合部位において異なる特異性を有する抗体を産生する工程。
6. 第１の軽鎖が、λまたはκ可変領域ドメインを含む、請求項5記載の方法。
7. 第２の軽鎖が、λまたはκ可変領域ドメインを含む、請求項5記載の方法。
8. （d）工程（c）において産生された抗体を精製する工程をさらに含む、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
9. 工程（d）が、アフィニティクロマトグラフィ精製工程である、請求項8記載の方法。
10. 精製工程が、κ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、λ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、またはκ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体およびλ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体の両方を使用して実施される、請求項9記載の方法。
11. 工程（a）および（b）が、共通の重鎖と、軽鎖可変ドメインに限局した多様性とを有する抗体ライブラリーの使用により促進される、請求項5〜10のいずれか一項記載の方法。
12. 抗体ライブラリーが、糸状バクテリオファージ、酵母、細菌、もしくは哺乳動物細胞の表面にディスプレイされるか、またはリボソームディスプレイもしくはその他の型のインビトロディスプレイのために使用される、請求項11記載の方法。
13. 以下の工程を含む、各結合部位において異なる特異性を有する抗体を作製する方法：
    （a）第1の軽鎖可変領域ドメインと組み合わされた重鎖可変領域ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を同定する工程；
    （b）第2の軽鎖可変領域ドメインと組み合わされた、工程（a）の抗体と同一の重鎖可変領域ドメインにより決定される異なる特異性を有する抗体または抗体断片の領域を同定する工程；
    （c）i．重鎖定常領域ドメインと融合した重鎖可変領域ドメインをコードする核酸；
    ii．κ定常領域ドメインと融合した第１の軽鎖可変領域ドメインをコードする核酸；
    iii．λ定常領域ドメインと融合した第２の軽鎖可変領域ドメインをコードする核酸；
    を、細胞へトランスフェクトする工程；および
    （d）該細胞を、抗体の発現を可能にする条件の下で培養し、各結合部位において異なる特異性を有する抗体を産生する工程。
14. 第１の軽鎖が、λまたはκ可変領域ドメインを含む、請求項13記載の方法。
15. 第２の軽鎖が、λまたはκ可変領域ドメインを含む、請求項13記載の方法。
16. （e）工程（d）において産生された抗体を精製する工程をさらに含む、請求項13〜15のいずれか一項記載の方法。
17. 工程（e）が、アフィニティクロマトグラフィ精製工程である、請求項16記載の方法。
18. 精製工程が、κ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、λ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、またはκ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体およびλ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体の両方を使用して実施される、請求項17記載の方法。
19. 以下を含む、抗体混合物：
    （a）i．同一のポリペプチド配列を有する２つの重鎖ポリペプチド、
    ii．可変領域およびκ定常領域を有する第1の軽鎖ポリペプチド、および
    iii．可変領域およびλ定常領域を有する第2の軽鎖ポリペプチド、
    を含む、各結合部位において異なる特異性を有する抗体；
    （b）該（a）の抗体の第1の軽鎖と同じ軽鎖ポリペプチドを有する第１のモノクローナル抗体；および
    （c）該（a）の抗体の第2の軽鎖と同じ軽鎖ポリペプチドを有する第２のモノクローナル抗体、
    ここで、該混合物中の抗体の全てが、同一のポリペプチド配列を有する重鎖ポリペプチドを有する。

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