KR20180132038A - 고친화성 항vegf 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은, VEGF 에 대해서, 종래 기술과 비교하여 현저하게 높은 친화성을 갖는 항체의 제공을 목적으로 한다. 본 발명은, 1 x 10^-11 ㏖/ℓ 이하의 해리 정수로 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF) 에 결합하는, VEGF 에 대한 모노클로날 항체를 제공한다.

Description

고친화성 항VEGF 항체

본 발명은 고친화성 항VEGF 항체에 관한 것이다.

혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF) 는, 생체 내에 있어서 혈관 형성 (혈관 신생) 을 유도하는 것이 가능하고, 혈관 내피 세포에 있어서 특이적으로 발현하고 있는 헤파린 결합형의 증식 인자이다. 인간 VEGF 단백질은, 1989년에 정제 그리고 동정 (同定) 이 이루어지고, 또 그 유전자가 클로닝 됨으로써, 그 유전자 배열의 결정이 이루어졌다.

VEGF 는, 혈관 형성을 촉진하는 것이 가능하고, VEGF 패밀리에 속하는 모든 멤버가, 세포막 표면 상에 존재하고 있는 각각의 패밀리 분자에 대응한 수용체 (VEGFR) 에 결합함으로써, 세포를 활성화한다. 이들 수용체군은, VEGF 가 결합함으로써 2 량체화 된 결과, 자기 인산화를 받음으로써 활성화 된다. VEGFR 은, 7 개의 면역 글로블린형 세포 외 도메인, 1 개의 막 관통 도메인 및 티로신 키나아제 영역을 포함하는 1 개의 세포 내 도메인으로 이루어진다. VEGF-A 는, VEGF 수용체-1 (수용체 Flt-1) 및 VEGF 수용체-2 (KDR/Flk-1) 와 결합하는 것이 가능하다. VEGF 수용체 중에서도, 특히, VEGF 수용체-2 는, VEGF 의 이미 알려진 거의 모든 생물학적 기능을 매개한다. VEGF 의 생리 활성, 그리고 그 수용체에 관해서는, Marti 등 (비특허문헌 1：Angiogenesis in ischemic desease. Thromb. Haemost. 1999. 보유 (補遺) 1：44-52) 및 Matsumoto 등 (비특허문헌 2：VEGF Receptor Signal Transduction. Sci. STKE. 2001. re21) 에 의해, 상세하게 연구가 이루어져 왔다.

미국 및 유럽에 있어서, 결장 직장암, 유방암, 비소세포 폐암, 중추 신경계에 있어서의 신경교종 및 가령 황반 변성 (AMD) 의 치료에 유전자 재조합형 항VEGF 인간형화 모노클로날 항체인 아바스틴 (등록상표) (베바시주맙) 이 사용되고 있다. 아바스틴의 2013년에 있어서 매상고는, 67 억 4600 만 US 달러에 이르지만, VEGF 에 대한 높은 친화성을 갖고 있지는 않았다 (비특허문헌 3：Aflibercept as a Treatment for Age-related Macular Degeneration. US Ophthalimic Rev. 2013. 6：58-63). 또한, 아바스틴의 독점적인 제조, 판매 형태로 인해, 그 사용을 필요로 하고 있는 환자는, 고액의 의료비를 지불하고 있다. 따라서, 환자에 대한 부담을 경감하고, 그 치료비를 삭감한다는 관점에서도, 새로운 항VEGF 모노클로날 항체를 개발하는 것이 요구되고 있다.

그리고, 현재까지 아바스틴보다 VEGF 에 대한 친화성이 높은 항체가 개발되어 있고, 이 항체는, 아바스틴과 비교하여 우위로 높은 종양 억제를 나타내고 있다 (특허문헌 1：일본 공표특허공보 2013-502445호).

일본 공표특허공보 2013-502445호

Marti et al., Thromb. Haemost. 1999. 보유 1：44-52 Matsumoto et al., VEGF Receptor Signal Transduction. Sci. STKE. 2001. re21 US Ophthalimic Rev., 2013. 6：58-63

본 발명은, 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것이며, 그 해결하고자 하는 과제는, 종래 기술과 비교하여 높은 친화성으로 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF) 와 결합하고, VEGF 와 VEGF 수용체의 결합을 저해함으로써, VEGF 의 생리 활성을 저해하는 신규 항체를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 연구를 거듭한 결과, VEGF 와 높은 친화성으로 결합하는 항체를 제조하고, 그 항체가 VEGF 의 생리 작용을 저해하는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 1 x 10^-11 ㏖/ℓ 이하의 해리 정수 (定數) 로 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF) 에 결합하는, VEGF 에 대한 모노클로날 항체.

(2) 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와, 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1) 및 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 수용체와의 결합을 저해하는, 상기 (1) 에 기재된 모노클로날 항체.

(3) 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 모노클로날 항체가 결합하는 부위에 결합하는 모노클로날 항체.

(4) 모노클로날 항체가 키메라 항체 또는 인간형화 항체인, 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체.

(5) 서열 번호 14 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 16 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 18 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하는, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(6) 서열 번호 20 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Trp-Ala-Ser 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 22 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(7) 서열 번호 14 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 16 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 18 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하고, 또한, 서열 번호 20 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Trp-Ala-Ser 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 22 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(8) 서열 번호 24 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 26 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 28 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하는, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(9) 서열 번호 30 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Gly-Thr-Asn 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 32 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(10) 서열 번호 24 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 26 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 28 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하고, 또한, 서열 번호 30 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Gly-Thr-Asn 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 32 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(11) 또한 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열 및 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (7) 또는 (10) 에 기재된 항체.

(12) 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 42 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 또한, 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 44 의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 상기 (11) 에 기재된 항체.

(13) 서열 번호 34 또는 38 의 아미노산 서열 및 서열 번호 42 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 그리고 서열 번호 36 또는 40 의 아미노산 서열 및 서열 번호 44 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 상기 (12) 에 기재된 항체.

(14) 개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열, 및 개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 또는 개 Ig 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 상기 (7) 또는 (10) 에 기재된 항체.

(15) 개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 46 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 48 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 또한, 개 Ig 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 50 의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 상기 (14) 에 기재된 항체.

(16) 서열 번호 34 또는 38 의 아미노산 서열 및 서열 번호 46 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 그리고 서열 번호 36 또는 40 의 아미노산 서열 및 서열 번호 48 또는 50 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 상기 (15) 에 기재된 항체.

(17) 상기 (1) ∼ (16) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체의 단편.

(18) 단편이 항원 결합 단편인 상기 (17) 에 기재된 단편.

(19) 항원 결합 단편이 단쇄 항체 또는 2 본쇄 항체인, 상기 (18) 에 기재된 단편.

(20) 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.

(21) 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는 의약 조성물.

(22) VEGF 매개성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 (21) 에 기재된 의약 조성물.

(23) VEGF 매개성 질환이, 암 또는 VEGF 매개성 안질환인, 상기 (22) 에 기재된 의약 조성물.

(24) 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방이, 혈관 신생 또는 혈관 투과성 항진의 저해에 의한 것인, 상기 (23) 에 기재된 의약 조성물.

(25) 혈관 신생이 병적인 혈관 신생인, 상기 (24) 에 기재된 의약 조성물.

(26) 암이 고형암 또는 혈액 종양인, 상기 (23) 또는 (24) 에 기재된 의약 조성물.

(27) 암이, 결장 직장암, 직장암, 유방암, 비소세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), 신(腎) 세포암, 전립선암, 간장암, 췌장암, 연조직 육종, 카포지 육종, 카르시노이드 종양, 두경부암, 멜라노마, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종으로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 (23) 또는 (24) 에 기재된 의약 조성물.

(28) VEGF 매개성 안질환이, 가령 황반 변성, 당뇨병 망막증, 당뇨병 황반 부종, 혈관 신생 녹내장, 망막 정맥 폐색증, 미숙아 망막증, 병적 근시에 수반하는 맥락막 혈관 신생, 익상편 (翼狀片), 루베오시스, 판누스, 점막피부안 증후군 및 눈에 있어서의 이식 조직의 면역 거절에서 선택되는 적어도 1 종인, 상기 (23) 또는 (24) 에 기재된 의약 조성물.

(29) 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는, 혈관 신생 저해제.

(30) 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는, 시약.

(31) 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는, 키트.

(32) 치료상 유효량의 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 피험자에게 투여하는 공정을 포함하는, 암 또는 VEGF 매개성 안과 질환의 치료 또는 예방 방법.

(33) 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서 사용하기 위한, 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편.

(34) 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 사용하기 위한, 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편.

본 발명에 의해, 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF) 에 대해서, 종래 기술과 비교하여 매우 높은 친화성으로 결합하고, 그 수용체의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 신규 항체를 제공할 수 있다.

도 1 은, 본 발명의 항체의 VEGF 와 VEGFR2 의 결합 저해능을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 본 발명의 항체의 세포 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은, 본 발명의 항체인 KLHa505 의 in vivo 에 있어서의 종양 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는, 본 발명의 항체인 KLHb1501 의 in vivo 에 있어서의 종양 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 본 발명의 인간형 키메라 항체인 KLHb1501HC 의 in vivo 에 있어서의 종양 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은, 본 발명의 개형 키메라 항체인 KLHb1501CC 의 개 VEGFA 에 결합하는 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은, 본 발명의 개형 키메라 항체인 KLHb1501CC 의 in vivo 에 있어서의 인간 유래 암세포에 대한 종양 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은, 본 발명의 개형 키메라 항체인 KLHb1501CC 의 in vivo 에 있어서의 개 유래 암세포에 대한 종양 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 는, 본 발명의 인간형 키메라 항체인 KLHa505HC 의, VEGF165, VEGF121 및 VEGF165b 에 대한 결합능을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은, 본 발명의 인간형 키메라 항체인 KLHb1501HC 의, VEGF165, VEGF121 및 VEGF165b 에 대한 결합능을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 이하의 실시형태는, 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명을 이 실시형태에만 한정되는 취지는 아니다. 본 발명은, 그 요지를 일탈하지 않는 한, 다양한 형태로 실시를 할 수 있다. 또, 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 2016년 1월 6일에 출원된 일본국 특허출원 (일본 특허출원 2016-001277호) 의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.

1. 개요

현재, 암이나 가령 황반 변성의 치료에 유효한 항VEGF 항체로서 아바스틴이 알려져 있지만, 아바스틴은 VEGF 에 대한 친화성이 낮은 것이 알려져 있다.

이에 대해, 본 발명자는, VEGF 에 대해서, 종래 기술과 비교하여 현저하게 친화성이 높은 항체를 개발하고, 이 항체가 혈관 신생의 억제 및 암의 치료에 유효한 것을 알아내었다.

본 발명은 이와 같은 지견에 기초하여 완성된 것이다.

2. 혈관 내피 증식 인자 (VEGF)

VEGF 는, 혈관 신생에 있어서 중요한 역할을 하고 있는 단백질이다. VEGF 는, 그 수용체와 결합함으로써, 세포 내에 시그널을 전달하고, 세포 분열이나 유주, 분화 유도, 혈관 투과성의 항진, 단구나 매크로파지의 활성화 등에 관여하고 있다.

본 발명에 있어서, VEGF 로는, 예를 들어, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PIGF-1, PIGF-2 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 VEGF-A 이다.

본 발명에 있어서의 VEGF 는, 임의의 포유 동물에서 유래하는 것이어도 되고, 그러한 포유 동물로는, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 염소, 원숭이, 인간을 들 수 있으며, 바람직하게는 마우스, 래트, 개, 인간이다.

또, 인간 VEGF-A 로는, 예를 들어, 165 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₆₅), 그 아형 (亞型) 인 121 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₂₁), 145 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₄₅), 183 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₈₃), 189 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₈₉), 206 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₂₀₆), 상기 VEGF₁₆₅ 와는 C 말단 영역의 아미노산 서열이 상이한 VEGF (VEGF_165b), 그리고 그들의 천연으로 발생하는 대립 유전자형 및 프로세싱형을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 인간 VEGF-A 로는, VEGF₁₂₁, VEGF₁₆₅ 가 바람직하다. VEGF 는 염색체 6p12 에 코드되고, mRNA 는 16,272 bp 의 길이이다. VEGF 는, 엑손 1 ∼ 5 와, 6a, 6b, 7a, 7b, 8a 및 8b 로 이루어진다. VEGF₁₆₅ 는, NRP1, VEGFR1 및 VEGFR2 모두에 결합한다.

또한, 개 VEGF 로는, 예를 들어, 164 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₆₄), 120 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₂₀), 144 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₄₄), 147 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₄₇), 162 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₆₂), 182 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₈₂), 188 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₈₈), 205 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₂₀₅), 상기 VEGF₁₆₄ 와는 C 말단 영역의 아미노산 서열이 상이한 VEGF (VEGF_164b), 그리고 그들의 천연으로 발생하는 대립 유전자형 및 프로세싱형을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 마우스, 래트, 개 및 인간의 VEGF, 그리고 VEGF₁₂₁ 및 VEGF₁₆₅ 의 아미노산 서열은, 각각, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12 로 나타낸다. 또, 마우스, 래트, 개 및 인간의 VEGF, 그리고 VEGF₁₂₁ 및 VEGF₁₆₅ 를 코드하는 DNA 의 염기 (뉴클레오티드) 서열은, 각각, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11 로 나타낸다. 각 아미노산 서열 및 염기 서열은, 각각 GenBank 데이터베이스에 있어서, 소정의 액세션 번호 (Accession No.) 에 의해 등록되어 있다.

마우스 VEGF 의 아미노산 서열：NP_001020421.2 (서열 번호 2)

래트 VEGF 의 아미노산 서열：NP_114024.2 (서열 번호 4)

개 VEGF 의 아미노산 서열：NP_001003175 (서열 번호 6)

인간 VEGF-A 의 아미노산 서열：NP_001020537.2 (서열 번호 8)

VEGF₁₂₁ 의 아미노산 서열：ABO26344.1 (서열 번호 10)

VEGF₁₆₅ 의 아미노산 서열：AAM03108.1 (서열 번호 12)

마우스 VEGF 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：NM_001025250.3 (서열 번호 1)

래트 VEGF 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：NM_031836.2 (서열 번호 3)

개 VEGF 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：NM_001003175.2 (서열 번호 5)

인간 VEGF-A 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：NM_001025366.2 (서열 번호 7)

VEGF₁₂₁ 을 코드하는 DNA 의 염기 서열：EF424789.1 (서열 번호 9)

VEGF₁₆₅ 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：AF486837.1 (서열 번호 11)

본 발명에서 사용되는 VEGF 에는, 이하의 (a) ∼ (c) 의 단백질이 포함된다.

(a) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질

(b) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이, 결실 (缺失), 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VEGF 수용체와 결합하는 활성을 갖는 단백질

(c) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열에 대해서 80 ％ 이상의 상동성 (동일성) 을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VEGF 수용체와 결합하는 활성을 갖는 단백질

본 발명에 있어서, 「서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질」 에는, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 포함된다.

또, 「서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이, 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열」 로는, 예를 들어,

(i) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열 중의 1 ∼ 10 개 (예를 들어, 1 ∼ 5 개, 바람직하게는 1 ∼ 3 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 2 개, 더욱 바람직하게는 1 개) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열,

(ii) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열 중의 1 ∼ 10 개 (예를 들어, 1 ∼ 5 개, 바람직하게는 1 ∼ 3 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 2 개, 더욱 바람직하게는 1 개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열,

(iii) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열에 1 ∼ 10 개 (예를 들어, 1 ∼ 5 개, 바람직하게는 1 ∼ 3 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 2 개, 더욱 바람직하게는 1 개) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열,

(iv) 상기 (i) ∼ (iii) 의 조합에 의해 변이된 아미노산 서열

등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 「VEGF 수용체」 는, 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1 (별명 Flt-1)), 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2 (별명 KDR)) 및 혈관 내피 증식 인자 수용체-3 (VEGFR3) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 VEGF 수용체이지만, 바람직하게는 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1) 및/또는 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2) 이며, 보다 바람직하게는 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2) 이다. 또, 「VEGF 수용체와 결합하는 활성」 이란, VEGF 수용체와 특이적으로 결합하는 활성을 의미한다. 당해 결합 활성의 유무에 대해서는, 공지된 방법, 예를 들어 면역 침강법, 웨스턴 블로팅, EIA (enzyme immunoassay), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 등의 면역학적 수법이나 풀다운 어세이 등의 방법을 이용함으로써 측정할 수 있다. 또, 「VEGF 수용체와 결합하는 활성」 이란, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 활성을 100 으로 했을 때와 비교하여, 적어도 10 ％ 이상, 20 ％ 이상, 30 ％ 이상, 40 ％ 이상, 50 ％ 이상, 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상의 활성을 갖는 것을 의미한다.

또, 본 발명에 있어서의 VEGF 에는, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 로 나타내는 아미노산 서열 외에, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 로 나타내는 아미노산 서열과 80 ％ 이상의 상동성 (동일성) 을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 또한 VEGF 수용체와 결합하는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 이와 같은 단백질로는, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 로 나타내는 아미노산 서열에 대해서, 약 80 ％ 이상, 85 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상, 또는 99 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 또한 VEGF 수용체와 결합하는 활성을 갖는 것 (서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 아미노산 서열) 도 포함된다. 상동성은, 인터넷을 이용한 호몰로지 검색 사이트, 예를 들어 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ) 에 있어서, FASTA, BLAST, PSI-BLAST 등의 상동성 검색을 이용할 수 있다. 또, National Center for Biotechnology Information (NCBI) 에 있어서, BLAST 를 이용한 검색을 실시할 수도 있다.

상기의 변이를 갖는 단백질을 조제하기 위해서, 그 단백질을 코드하는 DNA 에 변이를 도입하려면, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit (스트라테이진사 제조), GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등：다카라 바이오사 제조) 등을 사용하여 실시할 수 있다. 또, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)」 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) 등에 기재된 부위 특이적 변이 유발법 등의 방법을 이용할 수 있다.

3. VEGF 에 대한 항체

본 발명에 있어서, VEGF 에 대한 항체 (이하 「항VEGF 항체」 라고도 칭한다.) 란, 상기 VEGF 와 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항VEGF 항체는, VEGF 에 대해서, 종래 기술과 비교하여 높은 친화성으로 결합하고, VEGF 와 VEGF 수용체 (VEGFR) 의 결합을 저해한다.

또한, 항VEGF 항체로서 널리 알려져 있는 베바시주맙 (아바스틴 (등록상표)) 의 VEGF 와의 해리 정수는, 47.9 n㏖/ℓ 인 것이 알려져 있다.

본 발명에 있어서 「결합을 저해한다」 란, 반드시 VEGF 와 VEGFR 의 결합을 100 ％ 저해하는 것을 의미하는 것은 아니다. 본 발명의 항체는, VEGF 와 VEGFR 의 결합을, 예를 들어 50 ％ 이상, 바람직하게는 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상, 99 ％ 이상 저해한다.

결합 저해 효과는, 결합 저해 시험에 관한 공지된 방법, 예를 들어 본 명세서의 실시예 2 에서 사용한 방법을 이용하여 평가할 수 있다.

본 발명의 항체는, VEGF 에 특이적으로 결합하고, VEGF 의 활성을 중화하는 중화 항체이다. 본 발명에 있어서, 「특이적으로 결합한다」 란, 표적 분자에는 결합 (반응) 하지만, 표적 분자 이외에는 실질적으로 결합하지 않는 (반응하지 않는) 것을 의미한다. 또, 본 발명에 있어서, 「중화한다」 란, 적어도, VEGF 의 VEGFR 에 결합하는 활성을 저해 (억제) 하는 것을 의미한다. 결합이 특이적인지 아닌지의 확인은, 면역학적 수법, 예를 들어 ELISA 법, 웨스턴 블롯법, 또는 면역 조직학적 염색 등에 의해 확인할 수 있다.

이하, 항VEGF 항체의 조제 방법에 대해서 설명한다.

(1) 항원의 조제

VEGF 는, 본 발명의 항체를 제조하기 위한 면역원으로서 사용된다.

면역원으로서 VEGF 를 사용하는 경우, VEGF 의 전체 길이 배열 중 일부의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 사용할 수도 있다. 항원 또는 면역원으로서 사용되는 VEGF 및 변이의 도입 방법 등의 설명에 대해서는, 상기 「2. VEGF」 에 기재한 바와 같다.

VEGF 는, 마우스, 래트, 개, 인간 등의 조직이나 세포로부터 정제된 천연형 VEGF 여도 되고, 유전자 공학적으로 생산된 VEGF 여도 된다. 예를 들어, VEGF 가 확인되는 생체 시료를 각종 계면 활성제, 예를 들어 트리톤-X (Triton-X), 사르코실 (Sarkosyl) 등을 사용하여, 가용성 획분과 불용성 획분으로 분획한다. 또한 불용성 획분을 우레아나 구아니딘염산 등에 용해하고, 각종 칼럼, 예를 들어 헤파린 칼럼 혹은 결합 수지에 결합시킴으로써 VEGF 를 얻을 수 있다. 또, 항원으로서 사용하는 VEGF 는, 그 아미노산 서열을 지정함으로써, 고상법 등의 공지된 단백질 합성법 또는 시판되는 단백질 합성 장치를 사용하여 합성할 수도 있다. 합성한 펩티드는, 키홀 림펫 헤모사이아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH) 또는 티로글로불린 (Thyroglobulin) 등의 담체 단백질과 결합시켜, 면역원으로서 사용할 수 있다.

(2) 폴리클로날 항체의 제조

상기와 같이 하여 제조한 VEGF 또는 부분 펩티드를 그 자체로, 혹은 담체, 희석제와 함께 비인간 포유 동물, 예를 들어 토끼, 개, 모르모트, 마우스, 래트, 염소 등에 투여함으로써 면역한다. 항원의 동물 1 마리당 투여량은, 애쥬번트를 사용할 때에는 0.1 ∼ 10 ㎎ 이다. 애쥬번트로는, 프로인트 완전 애쥬번트 (FCA), 프로인트 불완전 애쥬번트 (FIA), 수산화알루미늄 애쥬번트 등을 들 수 있다. 면역은, 주로 정맥내, 피하 또는 복강내 등에 주입함으로써 실시된다. 또, 면역의 간격은 특별히 한정되지 않고, 수 일 내지 수 주일 간격, 바람직하게는 1 ∼ 2 주간 간격으로, 2 ∼ 10 회, 바람직하게는 3 ∼ 5 회 면역을 실시한다. 면역의 간격은, 당업자이면 얻어지는 항체가를 감안하여 설정할 수 있다. 3 ∼ 4 회 피하 면역을 실시한 시점에서 시채혈을 실시하고, 항체가를 측정하는 것이 바람직하다. 혈청 중의 항체가의 측정은, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), EIA (enzyme immunoassay), 방사성 면역 측정법 (RIA ; radioimmuno assay) 등에 의해 실시할 수 있다. 항체가가 충분히 상승한 것을 확인한 후, 전(全) 채혈하고, 통상적으로 실시되는 방법에 의해 항체를 분리 정제할 수 있다. 분리 정제는, 황안염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하여, 또는 이들을 조합함으로써, 정제할 수 있다. 구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 함유하는 혈청을, VEGF 이외의 단백질을 결합한 칼럼에 통과시키고, 그냥 통과하는 획분을 채취함으로써, VEGF 에 대한 특이성을 향상시킨 폴리클로날 항체를 얻을 수 있다.

(3) 모노클로날 항체의 제조

(i) 항체 산생 세포의 채취

폴리클로날 항체의 제조와 마찬가지로, VEGF 또는 부분 펩티드를 그 자체로, 혹은 담체 및 희석제와 함께 비인간 포유 동물에 투여함으로써 면역한다. 동물 1 마리당 항원의 투여량, 사용되는 애쥬번트의 종류, 면역 방법, 면역의 간격은 폴리클로날 항체의 제조와 동일하다. 최종 면역일부터 1 ∼ 30 일 후, 바람직하게는 2 ∼ 5 일 후에, 항체가가 확인된 개체를 선택하여 항체 산생 세포를 채집한다. 항체 산생 세포로는, 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있는데, 비장 세포 또는 림프절 세포가 바람직하다.

(ii) 세포 융합

하이브리도마를 얻기 위해서, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합을 실시한다. 융합 조작은 이미 알려진 방법, 예를 들어 Kohler 등의 방법에 따라서 실시할 수 있다. 항체 산생 세포와 융합시키는 미엘로마 세포로서, 마우스 등의 동물의 일반적으로 입수 가능한 주화 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포주로는, 약제 선택성을 갖고, 미융합 상태에서는 HAT 선택 배지 (히포잔틴, 아미노프테린, 티미딘을 포함한다) 에서 생존하지 못하고, 항체 산생 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 미엘로마 세포로는, 예를 들어 P3-x63-Ag8U.1, SP2/O-Ag14, PAI, P3U1, NSI/1-Ag4-1, NSO/1 등의 마우스 미엘로마 세포주, YB2/0 등의 래트 미엘로마 세포주 등을 들 수 있다.

상기 미엘로마 세포와 항체 산생 세포의 세포 융합은, 혈청을 포함하지 않는 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물 세포 배양용 배지 중에서, 1 × 10⁸ ∼ 5 × 10⁸ 개의 항체 산생 세포와 2 × 10⁷ ∼ 10 × 10⁷ 개의 미엘로마 세포를 혼합하고 (항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포비 10：1 ∼ 1：1), 세포 융합 촉진제 존재 아래에서 융합 반응을 실시한다. 세포 융합 촉진제로서, 평균 분자량 1000 ∼ 6000 달톤의 폴리에틸렌글리콜 또는 센다이 바이러스 등을 사용할 수 있다. 또, 전기 자극 (예를 들어 일렉트로포레이션) 을 이용한 시판되는 세포 융합 장치를 사용하여 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킬 수도 있다.

(iii) 하이브리도마의 선별 및 클로닝

세포 융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 그 방법으로서, 세포 현탁액을, 예를 들어 10 ∼ 20 ％ 의 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등으로 적당하게 희석 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 한계 희석법으로 계산상 0.3 개/웰 정도 뿌리고, 각 웰에 HAT 배지 등의 선택 배지를 첨가하고, 이후 적당하게 선택 배지를 교환하여 배양을 실시한다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시 후, 10 일 전후부터 생육해 오는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다.

다음으로, 생육해 온 하이브리도마를 추가로 스크리닝 한다. 하이브리도마의 스크리닝은, 통상적인 방법에 따르면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 하이브리도마를 배양한 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채집하고, 효소 면역 측정법, 방사성 면역 측정법 등에 의해, 스크리닝 할 수 있다. 구체적으로는, 96 웰 플레이트에 항원을 흡착시킨 후, 송아지 혈청으로 블로킹 한다. 하이브리도마 세포의 배양 상청을 고상화한 항원에 37 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후, 퍼옥시다아제 표지한 항마우스 IgG 를 37 ℃ 에서 1 시간 반응시키고, 오르토페닐렌디아민을 기질로서 사용하여 발색시킨다. 산으로 반응을 정지시킨 후, 490 ㎚ 파장에 있어서의 흡광도를 측정함으로써, 스크리닝 할 수 있다. 상기 측정법에 의해 양성을 나타낸 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를, 한계 희석법 등에 의해 클로닝 한다. 그리고, 최종적으로, VEGF 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 산생하는 세포인 하이브리도마를 수립한다.

(iv) 모노클로날 항체의 채취

수립한 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서, 통상적인 세포 배양법 또는 복수 형성법 등을 채용할 수 있다. 세포 배양법에 있어서는, 하이브리도마를 10 ％ 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지 또는 무혈청 배지 등의 동물 세포 배양 배지 중에서, 통상적인 배양 조건 (예를 들어 37 ℃, 5 ％ CO₂ 농도) 으로 7 ∼ 14 일간 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항체를 취득한다. 복수 형성법의 경우에는, 미엘로마 세포 유래의 포유 동물과 동종계 동물, 예를 들어 마우스 (BALB/c) 의 복강 내에 하이브리도마를 약 5 × 10⁶ ∼ 2 × 10⁷ 개 투여하고, 하이브리도마를 대량으로 증식시킨다. 그리고, 1 ∼ 2 주일 후에 복수를 채취한다. 상기 항체의 채취 방법에 있어서 항체의 정제가 필요해지는 경우에는, 황안염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하여, 또는 이들을 조합함으로써 정제할 수 있다.

본 발명의 항체로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역 (VH) 이, 서열 번호 14 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)1(CDR-H1), 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2(CDR-H2) 및/또는 서열 번호 18 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(CDR-H3) 을 포함하고, 또한/또는 경쇄 가변 영역 (VL) 이, 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1(CDR-L1), 트립토판 (W)-알라닌 (A)-세린 (S) 으로 이루어지는 아미노산 서열 (「아미노산 서열 WAS」, 「아미노산 서열 Trp-Ala-Ser」 이라고도 칭한다) 을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2(CDR-L2) 및/또는 서열 번호 22 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3(CDR-L3) 을 포함하는 항체를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 항체로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역이, 서열 번호 24 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1(CDR-H1), 서열 번호 26 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2(CDR-H2) 및/또는 서열 번호 28 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(CDR-H3) 을 포함하고, 또한/또는 경쇄 가변 영역이, 서열 번호 30 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1(CDR-L1), 글리신 (G)-트레오닌 (T)-아스파라긴 (N) 으로 이루어지는 아미노산 서열 (「아미노산 서열 GTN」, 「아미노산 서열 Gly-Thr-Asn」 이라고도 칭한다) 을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2(CDR-L2) 및/또는 서열 번호 32 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3(CDR-L3) 을 포함하는 항체를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 항체로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이, 서열 번호 34 또는 38 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지고, 또한/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이, 서열 번호 36 또는 40 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 항체를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

(4) 유전자 재조합 항체의 제조

본 발명의 항체의 바람직한 양태의 하나로서, 유전자 재조합 항체를 들 수 있다. 유전자 재조합 항체로는, 한정되지는 않지만, 예를 들어, 키메라 항체, 인간형화 항체, 개형화 항체 등을 들 수 있다.

키메라 항체는, 이종 (異種) 동물의 면역 글로블린 유전자 단편을 연결하여 제조된 항체를 말한다. 본 발명에 있어서, 키메라 항체로는, 예를 들어, 인간형 키메라 항체, 개형 키메라 항체 등을 들 수 있지만, 키메라 항체의 가변 영역 및 정상 영역이 유래하는 동물의 종류는 한정되는 것은 아니다. 인간형 키메라 항체는, 예를 들어, 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 연결 (접합) 한 항체이며 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 등을 참조), 개형 키메라 항체는, 예를 들어, 마우스 유래 항체의 가변 영역을 개 유래의 정상 영역에 연결한 항체이다. 키메라를 제조하는 경우에는, 그와 같이 연결한 항체가 얻어지도록, 유전자 재조합 기술에 의해 용이하게 구축할 수 있다. 여기서, 마우스 유래 항체의 가변 영역으로는, 중쇄 가변 영역이, 예를 들어 서열 번호 34 또는 38 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있으며, 경쇄 가변 영역이, 예를 들어 서열 번호 36 또는 40 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

인간형화 항체를 제조하는 경우에는, 이른바 CDR 그래프팅 (CDR 이식) 이라고 불리는 수법을 채용할 수 있다. CDR 그래프팅이란, 마우스 항체의 가변 영역으로부터 상보성 결정 영역 (CDR) 을 인간 가변 영역에 이식하여, 프레임 워크 영역 (FR) 은 인간 유래의 것으로 CDR 은 마우스 유래의 것으로 이루어지는, 재구성한 가변 영역을 제조하는 방법이다. 다음으로, 이들의 인간형화 된 재구성 인간 가변 영역을 인간 정상 영역에 연결한다. 이와 같은 인간형화 항체의 제조법은, 당분야에 있어서 주지이다 (Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：10029-10033 (1989)；일본 특허공보 제2828340호 등을 참조).

여기서, 본 발명의 인간형화 항체에 사용할 수 있는 마우스 유래의 CDR 의 아미노산 서열로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역의 CDR1 ∼ 3 (CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 으로서, 각각 서열 번호 14, 16 및 18 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있으며, 경쇄 가변 영역의 CDR1 ∼ 3 (CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3) 으로서, 각각 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것, 트립토판 (W)-알라닌 (A)-세린 (S) 으로 이루어지는 아미노산 서열 (아미노산 서열 Trp-Ala-Ser) 을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것 및/또는 서열 번호 22 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 인간형화 항체에 사용할 수 있는 마우스 유래의 CDR 의 아미노산 서열로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역의 CDR1 ∼ 3 (CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 으로서, 각각 서열 번호 24, 26 및 28 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있으며, 경쇄 가변 영역의 CDR1 ∼ 3 (CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3) 으로서, 각각 서열 번호 30 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것, 글리신 (G)-트레오닌 (T)-아스파라긴 (N) 으로 이루어지는 아미노산 서열 (아미노산 서열 Gly-Thr-Asn) 을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것 및/또는 서열 번호 32 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

개형화 항체에 대해서도, 상기의 인간형화 항체의 제조 방법과 동일한 수법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 키메라 항체 및 인간형화 항체에 사용할 수 있는 인간 중쇄 정상 영역으로는, 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 것, 예를 들어, 서열 번호 42 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 인간 중쇄 정상 영역을 들 수 있으며, 인간 경쇄 정상 영역으로는, 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 것, 예를 들어, 서열 번호 44 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 인간 경쇄 정상 영역을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 인간 중쇄 정상 영역을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 41 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있으며, 인간 경쇄 정상 영역을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 43 으로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또, 본 발명에 있어서, 키메라 항체 및 개형화 항체에 사용할 수 있는 개 중쇄 정상 영역으로는, 개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 것, 예를 들어, 서열 번호 46 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 개 중쇄 정상 영역을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 키메라 항체 및 개형화 항체에 사용할 수 있는 개 경쇄 정상 영역으로는, 개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열 또는 개 Ig 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 것, 예를 들어, 서열 번호 48 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 개 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 또는 서열 번호 50 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 개 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 개 중쇄 정상 영역을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 45 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있으며, 개 경쇄 (κ 사슬 또는 λ 사슬) 정상 영역을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 47 또는 49 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서는, 하이브리도마 또는 당해 하이브리도마로부터 추출한 DNA 혹은 RNA 등을 원료로 하여, 상기 서술한 주지의 방법에 준하여 키메라 항체, 인간형화 항체, 개형화 항체를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체가 융합한 단백질은, 항체의 가변 영역과 그 밖의 단백질을 공지된 유전자 재조합 방법을 이용함으로써 제조할 수 있다. 또, 당해 융합 단백질은, 모노클로날 항체와 다른 단백질을 크로스 링커를 사용하여 가교함으로써 제조할 수 있다.

(5) 항체 단편의 제조

본 발명에서 사용되는 VEGF 에 대한 항체의 단편은, VEGF 에 특이적으로 결합한다.

항체의 단편은, 본 발명의 항체의 일부분의 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 항체의 단편으로는, 항원 결합 단편이 바람직하다. 항원 결합 단편으로는, 예를 들어, 단쇄 항체 (scFv (single chain Fv)), sc(Fv)₂), 2 본쇄 항체 (Fab, Fab', 다이아보디 (diabody (dibodies), dsFv), F(ab')₂)등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 상기 항체 단편은, 본 발명의 항체를 목적에 따라 각종 단백질 분해 효소로 절단함으로써 얻을 수 있다.

예를 들어, Fab 는, 항체 분자를 파파인으로 처리함으로써, F(ab')₂ 는, 항체 분자를 펩신으로 처리함으로써 각각 얻을 수 있다. 또, Fab' 는, 상기 F(ab')₂ 의 힌지 영역의 디술파이드 결합을 절단함으로써 얻을 수 있다.

scFv 의 경우에는, 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 구축한다. 이 DNA 를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 발현 벡터를 숙주 생물에 도입하여 발현시킴으로써, scFv 를 제조할 수 있다.

diabody 의 경우에는, 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 취득하고, 펩티드 링커의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 scFv 를 코드하는 DNA 를 구축한다. 이 DNA 를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 발현 벡터를 숙주 생물에 도입하여 발현시킴으로써, diabody 를 제조할 수 있다.

dsFv 의 경우에는, 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 취득하고, dsFv 를 코드하는 DNA 를 구축한다. 이 DNA 를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 발현 벡터를 숙주 생물에 도입하여 발현시킴으로써, dsFv 를 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 중쇄 가변 영역을 코드하는 DNA 의 염기 서열로는, 예를 들어 서열 번호 33 또는 37 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 또는 그 염기 서열로 이루어지는 것을 들 수 있으며, 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA 의 염기 서열로는, 예를 들어 서열 번호 35 또는 39 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 또는 그 염기 서열로 이루어지는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체 단편의 구체예로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역 (VH) 이, 서열 번호 14 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1(CDR-H1), 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2(CDR-H2) 및/또는 서열 번호 18 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(CDR-H3) 을 포함하고, 또한/또는 경쇄 가변 영역 (VL) 이, 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1(CDR-L1), 트립토판 (W)-알라닌 (A)-세린 (S) 으로 이루어지는 아미노산 서열 (아미노산 서열 Trp-Ala-Ser) 을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2(CDR-L2) 및/또는 서열 번호 22 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3(CDR-L3) 을 포함하는 항체 단편을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 항체 단편의 구체예로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역이, 서열 번호 24 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1(CDR-H1), 서열 번호 26 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2(CDR-H2) 및/또는 서열 번호 28 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(CDR-H3) 을 포함하고, 또한/또는 경쇄 가변 영역이, 서열 번호 30 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1(CDR-L1), 글리신 (G)-트레오닌 (T)-아스파라긴 (N) 으로 이루어지는 아미노산 서열 (아미노산 서열 Gly-Thr-Asn) 을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2(CDR-L2) 및/또는 서열 번호 32 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3(CDR-L3) 을 포함하는 항체 단편을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 항체 단편으로는, 중쇄 가변 영역이 서열 번호 34 또는 38 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지고, 또한/또는 경쇄 가변 영역이 서열 번호 36 또는 40 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 항체 단편을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

CDR 을 포함하는 항체 단편 (펩티드) 은, VH 또는 VL 의 CDR (CDR1 ∼ 3) 의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR 을 포함하는 항체 단편은, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 개재하여 결합시킬 수 있다. CDR 을 포함하는 항체 단편은, 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 코드하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다. 또, CDR 을 포함하는 펩티드는, Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법) 및 tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.

VH 의 CDR1 ∼ 3 을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 각각 서열 번호 13, 15 및 17 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있으며, VL 의 CDR1 ∼ 3 을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 각각 서열 번호 19 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA, 티민 (T)-구아닌 (G)-구아닌 (G)-구아닌 (G)-시토신 (C)-아데닌 (A)-티민 (T) -시토신 (C)-시토신 (C) 로 이루어지는 염기 서열 (「염기 서열 TGGGCATCC」 라고도 칭한다) 을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 및 서열 번호 21 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또 다른 양태에 있어서, VH 의 CDR1 ∼ 3 을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 각각 서열 번호 23, 25 및 27 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있으며, VL 의 CDR1 ∼ 3 을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 각각 서열 번호 29 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA, 구아닌 (G)-구아닌 (G)-티민 (T)-아데닌 (A)-시토신 (C)-시토신 (C)-아데닌 (A)-아데닌 (A)-시토신 (C) 로 이루어지는 염기 서열 (「염기 서열 GGTACCAAC」 라고도 칭한다) 을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 및 서열 번호 31 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

(6) 결합 친화성

결합 친화성은, 결합 정수 (KA) 및 해리 정수 (KD) 에 의해 결정할 수 있다. 친화성 평형 정수 (K) 는 KA/KD 의 비로 나타낸다. 그 결합 친화성은, 이하와 같이 하여 검출할 수 있다.

결합 정수 (KA) 및 해리 정수 (KD) 는, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 을 이용하여 측정할 수 있고, 결합률을 리얼타임으로 검출하고, 또한 모니터링 하는 공지된 기기 및 방법을 채용할 수 있다 (예를 들어 Biacore (등록상표)-3000 (GE Healthcare 사), ProteON XPR36 (Bio-Rad 사) 등).

본 발명의 항체는, 1 × 10^-7 ㏖/ℓ 이하 (예를 들어 1 × 10^-7 ㏖/ℓ 이하, 1 × 10^-8 ㏖/ℓ 이하, 1 × 10^-9 ㏖/ℓ 이하이며, 바람직하게는 1 × 10^-10 ㏖/ℓ 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10^-11 ㏖/ℓ 이하이다) 의 IC50 으로 그 표적을 저해할 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체에는, 1 x 10^-11 ㏖/ℓ 이하의 해리 정수로 VEGF 에 결합하는 VEGF 에 대한 모노클로날 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체가 포함된다.

본 발명의 항VEGF 항체가 결합하는 부위는, 항원인 VEGF 의 적어도 일부의 영역이면 되고, 한정되지 않는다. 본 발명의 항VEGF 항체가 결합하는 부위로는, 엑손 1, 2, 3, 4, 5, 6a, 6b, 7a, 7b, 8a 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 영역을 들 수 있지만, 엑손 1 ∼ 5 의 영역이 바람직하다. 당업자이면, Genbank 등의 공지된 정보에 기초하여 각종 VEGF 의 엑손 1 ∼ 5 의 영역을 특정할 수 있다. 예를 들어, 마우스, 래트, 개, 인간의 VEGF 의 엑손 1 ∼ 5 의 아미노산 서열은, 각각, 서열 번호 51, 52, 53 및 54 로 나타낸다.

본 발명의 항VEGF 항체가 결합하는 부위 (영역, 에피토프 등) 또는 이것을 포함하는 폴리펩티드는, 당업자이면, 본 명세서의 기재 및 에피토프 매핑이나 X 선 구조 해석 등의 공지된 수법에 기초하여 특정할 수 있다.

또, 상기 모노클로날 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체는, 폴리클로날 항체여도 되고 모노클로날 항체여도 되며, 모노클로날 항체인 경우에는, 유전자 재조합 항체, 예를 들어, 키메라 항체, 인간형화 항체, 개형화 항체여도 된다.

본 발명의 VEGF 에 대한 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체는, VEGF 와의 결합에 대해서 본 발명의 VEGF 에 대한 항체와 경합하는 항체이다. 당업자이면, VEGF 와의 결합에 대해서 본 발명의 VEGF 에 대한 항체와 경합하는 항체는, 본 발명의 항체 (즉, 1 x 10^-11 ㏖/ℓ 이하의 해리 정수로 VEGF 에 결합하는, VEGF 에 대한 모노클로날 항체) 와 동등한 특이성 및/또는 활성을 갖는 것으로 이해할 수 있다.

항체를 사용한 경합 시험은, 1 세트의 항체가 동일한 (또는 중복된) 부위에 결합하는지 여부를 조사하기 위한 수법으로서 항체의 기술 분야에 있어서 확립된 수법이다 (Ju-Won Kwak et al., Journal of Immunological Methods 191 (1996) 49-54 등을 참조). 그리고, 경합 시험에 있어서, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체가, 시험 대상의 항VEGF 항체에 의해 결합이 경합 저해되는 경우에는, 당해 시험 대상의 항VEGF 항체는, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체라고 동정할 수 있다. 또, 이 시험 방법에 있어서는, 1 세트의 항체가 동일한 (또는 중복된) 부위에 결합하는지 여부를 조사하는 데 있어서, 그 부위가 어떠한 구조인가 하는 정보를 필요로 하지 않는다.

즉, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체는, 당업자이면, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체를 사용하여 경합 시험을 실시함으로써, 과도한 실험을 수반하는 일 없이 얻을 수 있다.

4. 의약 조성물

본 발명의 의약 조성물은, 상기 「3. VEGF 에 대한 항체」 에 기재한 항체 또는 그 단편을 유효 성분으로서 함유하고, 대상 질환에 대한 의약 조성물이다. 본 발명의 의약 조성물은, 대상 질환의 예방 또는 치료에 사용되고, 당해 예방 또는 치료에 유효하다.

본 발명의 의약 조성물의 대상이 되는 질환은, VEGF 가 관여하는 질환 (증상을 포함한다) 이면 한정되는 것은 아니고, 이와 같은 질환으로는, 고형 종양, 특히 문제가 되는 전이성 종양을 포함하는 암, VEGF 매개성 안질환을 들 수 있으며, 그 외 면역성의 질환도 대상이 된다.

종양의 혈관 구조는, 혈액을 공급하는 것이 알려져 있지만, 암 줄기세포를 지탱하는 혈관 니치 환경으로서도 기능한다. 혈관 니치 환경이란, 혈액이나 혈관의 근원이 되는 조혈 줄기세포의 유지나 증식, 분화에 관련된 환경을 나타내고 있으며, 암 줄기세포의 증식에 있어서도 중요한 환경인 것으로 생각되고 있다.

암 세포는, 정상 세포에 비해, 높은 증식력이나 세포 분열의 횟수에 제한이 없고, 주변 조직으로의 침윤이나 전이를 일으킨다고 하는 특징을 가지고 있다. 최근, 암조직 중의 암 세포 전부가 이와 같은 성질을 갖는 것이 아니라, 일부의 한정된 세포가 이와 같은 성질을 가지는 것으로 생각되게 되었다. 즉, 이들 일부의 암 세포는, 자신과 완전히 동일한 세포를 만들어 내는 자기 복제능과, 다종류의 세포로 분화할 수 있는 다분화능이라고 하는, 배성 줄기세포나 체성 줄기세포 등의 줄기세포에 공통되게 보이는 특징을 갖는 세포이며, 암 조직 중에서 자기 복제에 의해 자신과 동일한 세포를 유지하면서, 분화에 의해 주변의 대다수의 암 세포를 만들어내는 근원이 되어 있는 암 줄기세포인 것으로 생각되고 있다.

암 줄기세포는, 암의 재발이나 전이의 주요한 원인이라고 생각되고 있으며, 암 치료에 있어서 암 줄기세포를 표적으로 하는 것의 중요성이 지적되고 있다. 종양 조직 내에 있어서의 암 줄기세포의 증식을 유의하게 저해하는 것이 가능해지면, 효과적으로 암 세포 전체를 살상할 수 있는 새로운 치료법의 개발이 가능해지는 것으로 생각된다.

발명에 있어서 「암 줄기세포성」 이란, 암 줄기세포의 성질을 나타내는 세포의 집단의 성질을 의미한다. 즉, 암 줄기세포성이란,, 줄기세포에 특유의 자기 복제와 다분화능을 갖고, 암의 근원이 되는 세포의 성질을 갖는 성질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 암으로는, 뇌종양, 경암 (頸癌), 식도암, 설암, 폐암, 유방암, 췌암, 위암, 소장의 암, 십이지장암, 대장암, 방광암, 신암, 간암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암, 갑상선암, 담낭암, 인두암, 육종, 멜라노마, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, VEGF 매개성 안질환이란, 눈에 있어서의 병적인 혈관 신생 혹은 혈관 투과성 항진에서 기인하는 질환이며, VEGF 가 관여하는 질환이다. 즉, VEGF 매개성 안질환은, 항VEGF 항체를 사용하여 VEGF 와 VEGF 수용체의 결합을 저해함으로써, 치료 또는 예방이 가능하다. 이와 같은 질환으로는, 예를 들어, 가령 황반 변성 (폴립상 맥락막 혈관증, 망막 혈관종상 증식 등의 특수형을 포함한다), 당뇨병 망막증, 당뇨병 황반 부종, 혈관 신생 녹내장, 망막 정맥 폐색증, 미숙아 망막증, 병적 근시에 수반하는 맥락막 혈관 신생, 익상편, 루베오시스, 판누스, 점막피부안 증후군, 눈에 있어서의 이식 조직 (예를 들어 각막 조직 등) 의 면역 거절 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「병적인 혈관 신생」 이란, 병적 상태 또는 병적 상태를 일으키는 상태에 있어서, 정상적인 생리적 혈관 신생 (혈관 형성) 과 비교하여, 새로운 혈관이 과잉되게, 불충분하게 또는 부적절하게 (예를 들어, 혈관 형성의 의학적 견지에서 보아 바람직하지 않은 위치, 시기 또는 발생에 있어서) 성장할 때 발생하는 혈관 신생을 말한다.

본 발명에 있어서, 「치료」 란, 질환의 발증 후에 본 발명의 항체 혹은 그 단편 또는 그것을 포함하는 의약 조성물 (이하 「본 발명의 의약 조성물 등」 이라고도 칭한다) 을 피험자에게 접촉시킴 (예를 들어, 투여함) 으로써, 접촉시키지 않는 경우에 비해, 당해 질환의 증상을 경감하는 것을 의미하며, 반드시 질환의 증상을 완전히 억제하는 것을 의미하는 것은 아니다. 질환의 발증이란, 질환의 증상이 신체에 나타나는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 「예방」 이란, 질환의 발증 전에 본 발명의 의약 조성물 등을 피험자에게 접촉시킴 (예를 들어, 투여함) 으로써, 접촉시키지 않는 경우에 비해, 질환의 발증 후의 증상을 경감하는 것을 의미하며, 반드시 발증을 완전히 억제하는 것을 의미하는 것은 아니다.

본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체 외에, 약학적으로 허용할 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 「약학적으로 허용할 수 있는 담체」 란, 면역 질환에 대한 의약 조성물에 적합한 임의의 담체 (리포좀, 지질 소포체, 미셀 등), 희석제, 부형제, 습윤제, 완충제, 현탁제, 윤활제, 애쥬번트, 유화제, 붕괴제, 흡수제, 보존료, 계면 활성제, 착색료, 착향료, 또는 감미료를 가리킨다.

본 발명의 의약 조성물 등은, 주사제, 동결 건조품, 정제, 경캡슐제, 연캡슐제, 과립제, 산제, 환제, 시럽제, 좌제, 파프제, 연고제, 크림제, 점안제 등의 제형을 취할 수 있다. 주사제 등의 액체 제제는, 사용 전에 생리 식염수 등으로 용해하는 용시 조제용 분말 (예를 들어 동결 건조 분말) 의 형태여도 된다.

본 발명의 의약 조성물 등은, 당업자에게 이미 알려진 임의의 수단에 의해 국소적 또는 전신에 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 투여 경로로는, 경구투여 및 비경구투여 모두 가능하고, 비경구투여의 경우에는, 조직내 투여 (피하 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여 등), 피내 투여, 국소 투여 (경피투여 등) 또는 경직장적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 이들 투여 경로에 적합한 투여 형태로 투여할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물 등의 투여량은, 피험자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 증상, 동물종, 투여 경로, 투여 횟수, 제형 등의 요인에 따라 변화하고, 구체적인 투여 순서는 당업자에 의해 설정할 수 있다. 암의 치료를 위한 본 발명의 항체의 투여량으로는, 피험자의 체중 1 ㎏ 당, 예를 들어 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎/일, 바람직하게는 1 ㎎ ∼ 15 ㎎/일, 보다 바람직하게는 2 - 12 ㎎/일이지만, 이것에 한정되지 않는다. 투여 횟수로는, 하루에 1 ∼ 5 회 투여할 수 있다. VEGF 매개성 안질환의 치료를 위한 본 발명의 항체의 투여량으로는, 예를 들어 0.01 ㎎ ∼ 100 ㎎/눈이며, 보다 바람직하게는 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎/눈이다. 투여 횟수로는, 1 일 ∼ 2 개월에 1 회 투여할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

투여 시기는, 증상에 따라 적절히 정할 수 있으며, 복수회분을 동시에 또는 시간을 두고 따로 따로 투여할 수 있다. 또, 본 발명의 의약 조성물은, 질환의 발증 전에 피험자에게 투여해도 되고, 질환의 발증 후에 투여해도 된다.

본 발명의 의약 조성물은, 포유 동물을 피험자로서 투여할 수 있다. 포유 동물로는, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 돼지, 양, 소, 말, 원숭이, 인간 등을 들 수 있다.

5. 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법

본 발명에 있어서는, VEGF 에 대한 항체 혹은 그 단편 또는 이것을 포함하는 의약 조성물을 피험자에게 투여함으로써, 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 즉, 본 발명은, 치료상 유효량의 본 발명의 항체 혹은 그 단편 또는 그것을 포함하는 의약 조성물을 피험자에게 투여하는 공정을 포함하는, 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명의 항체 혹은 그 단편 또는 그것을 포함하는 의약 조성물의 치료상의 유효량은, 피험자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 증상, 투여 경로, 투여 횟수, 제형 등의 요인에 따라 변화한다. 당업자이면, 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료, 또는 예방에 필요한 치료상의 유효량을 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「피험자」 에게는, 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험자가 포함된다. 또, 「피험자」 로서 치료 또는 예방의 대상이 되는 포유 동물은, 상기한 바와 같다.

본 발명의 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서, 「암」, 「VEGF 매개성 안질환」, 「치료」 및 「예방」 에 대한 설명은 상기한 바와 같다. 또, 본 발명의 항체 혹은 그 단편 또는 그것을 포함하는 의약 조성물의 제형, 투여 경로, 투여량, 투여 시기 등의 설명에 대해서도 상기한 바와 같다.

6. 혈관 신생 저해제

본 발명의 항체는, VEGF 와 VEGF 수용체의 결합을 저해하기 때문에, 당해 결합에 의해 발생하는 혈관 신생을 저해할 수 있다. 즉, 본 발명은, 상기 「3. VEGF 에 대한 항체」 에 기재된 항체 또는 그 단편을 유효 성분으로서 포함하는 혈관 신생 저해제를 제공한다.

본 발명의 혈관 신생 저해제는, 시약으로서, 혹은 포유 동물의 치료에 사용할 수 있으며, 그 투여 형태, 첨가물, 투여 경로, 투여 대상, 투여량 등은, 상기 「4. 의약 조성물」 의 기재에 준하여 적절히 선택할 수 있다. 단, 본 발명의 혈관 신생 저해제는, 본 발명의 항체 또는 그 단편만을 함유하는 것이어도 된다.

7. 항체의 사용

본 발명의 항체 또는 그 단편은, 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서, 혹은 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서, 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은, 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서 사용하기 위한, 본 발명의 항VEGF 항체 또는 그 단편을 제공한다. 또, 본 발명은, 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 사용하기 위한, 본 발명의 항VEGF 항체 또는 그 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은, 혈관 신생 저해제의 제조에 있어서 사용하기 위한, 항VEGF 항체 또는 그 단편을 제공한다.

이들 양태에 있어서의, 「암」, 「VEGF 매개성 안질환」, 「치료」 및 「예방」 에 대한 설명은 상기한 바와 같다.

8. 병용 요법

본 발명의 의약 조성물은, 다른 항암제의 적어도 1 종과 병용 투여하기 위해서 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 항암제로는, 예를 들어, 소라페니브 (넥사바 (등록상표)), 수니티니브 (스텐트 (등록상표)), 베바시주맙 (아바스틴 (등록상표)), 시스플라틴 (cDDP), 카보플라틴 (파라플라틴 (등록상표)), 파클리탁셀 (택솔 (등록상표)), 도세탁셀 (탁소테르 (등록상표)), 염산겜시타빈 (젬자르 (등록상표)), 게피티니브 (이레사 (등록상표)), 엘로티니브 (타세바 (등록상표)), 염산이리노테칸 (CPT-11), 5-플루오로우라실 (5-FU) 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물과 항암제의 적어도 1 종을 병용 투여함으로써, 각각 단독으로 사용하는 것보다 더욱 우수한 효과가 기대된다. 우수한 효과에는, 치료 효과를 유지하면서 종래보다 부작용을 경감시킨다는 효과가 포함된다.

본 발명에 있어서 「병용」 이란, 본 발명의 의약 조성물과 상기 항암제의 적어도 1 종을, 동시 또는 따로 따로 투여하는 것을 의미한다. 「동시」 란, 하나의 투여 스케줄에 있어서 동일한 타이밍으로 투여되는 것을 의미하며, 투여 시분 (時分) 이 완전히 동일할 필요는 없다. 「따로 따로」 란, 하나의 투여 스케줄에 있어서 상이한 타이밍으로 투여되는 것을 의미한다.

본 발명의 병용 요법에 사용하는 의약 조성물 등 및 항암제의 투여 형태, 투여 경로, 투여 대상은 특별히 한정되지 않고, 상기 「4. 의약 조성물」 의 기재에 준하여 적절히 선택할 수 있다. 또, 병용하는 약제의 투여 형태 또는 투여량이 서로 상이해도 되고, 그 병용하는 조합에 의해, 적절히 조정할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물을 다른 항암제와 병용하는 경우에는, 투여량을 적절히 줄이는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명의 의약 조성물과 다른 항암제의 조합에 있어서는,

(i) 본 발명의 의약 조성물의 유효량과, 다른 항암제의 유효량,

(ii) 본 발명의 의약 조성물의 유효량과, 다른 항암제의 비유효량,

(iii) 본 발명의 의약 조성물의 비유효량과, 다른 항암제의 유효량, 및

(iv) 본 발명의 의약 조성물의 비유효량과, 다른 항암제의 비유효량

의 조합을 채용할 수 있다.

의약 조성물 및 항암제의 일방 또는 양자가 비유효량의 사용 양태이더라도, 병용에 의해 약리 효과를 발휘할 수 있는 경우에는, 그러한 양태에 의해 병용 투여할 수 있다.

9. 시약, 키트

본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 단편은, VEGF 의 검출 시약 또는 키트에 포함시킬 수 있다. 즉, 본 발명은, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는 시약 및 키트를 제공한다. 본 발명의 시약 및 키트는, 예를 들어, VEGF 의 검출용 시약 또는 키트로서 사용할 수 있다.

본 발명의 시약 및 키트에 있어서, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 단편은, 예를 들어 동결 등의 방법에 의해 취급하기 쉽게 한 후, 그대로 혹은 부형제, 증량제, 결합제, 활택제 등 공지된 약학적으로 허용되는 담체, 공지된 첨가제 (완충제, 등장화제, 킬레이트제, 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제 등이 포함된다) 등과 혼합해도 된다.

본 발명의 키트에는, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 단편 외에, 완충액, 효소액, 2 차 항체, 희석용 용액, 사용 설명서 등을 포함시킬 수도 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

모노클로날 항체의 제조

(1) 항원의 조제

CHO 세포에서 발현시킨 인간 재조합체 VEGF₁₆₅ (이하 「VEGF」, 「rhVEGF₁₆₅」 또는 「rhVEGF」 라고도 칭한다) (Prospec 사) 를 항원으로서 사용하였다. VEGF 에 의한 마우스에 대한 영향을 억제하는 목적으로, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) 에 결합시킨 항원을 준비하였다. 이 경우, VEGF 와 KLH 가, 몰비로 4：1 이 되도록 PBS(-) (0.01M 인산-나트륨 버퍼 (sodium-phosphate buffer), 0.138M NaCl, 0.0027M KCl, pH 7.4) 에 혼합한 후, 1 ％ 의 글루타르알데히드를 첨가하고, 1 시간, 실온에서 반응시킴으로써, KLH 와 rhVEGF₁₆₅ 를 가교하였다. 이와 같이 조제한 단백질을, 이하 「KLH-VEGF」 라고도 칭한다.

(2) 면역

rhVEGF 또는 KLH-VEGF 를 프로인트 완전 애쥬번트와 등량 혼합하고, BALB/c 마우스의 복강 내에 100 ㎕ (약 40 ㎍/마우스) 투여하였다. 이어서, 동물을 불완전 프로인트 애쥬번트와 함께 약 40 ㎍ 의 KLH-VEGF 또는 rhVEGF 를 3 주간에 1 회 복강 내에 투여함으로써, 추가 면역을 실시하였다. 추가 면역은, 12 회를 초과하지 않는 범위에서 실시하였다. 최종적인 면역 자극은, 비장 적출의 3 일 전에 약 40 ㎍ 의 KLH-VEGF 혹은 rhVEGF 를 포함하는 생리 식염수를, 꼬리 정맥내 투여에 의해 실시하였다.

(3) 세포 융합

단리한 비세포와 마우스 미엘로마 세포주인 P3-x63-Ag8U.1 (DS 파머 바이오 메디컬사) 을 5：1 의 세포수로 혼합하고, 50 ％ 폴리에틸렌글리콜 3350 (Sigma 사) 을 사용하여 세포 융합을 실시하였다. 세포는 HAT 배지 (1/2 × HT (MP 사), 1/2 × HAT (MP 사), 10 ％ FBS, 50 ng/ℓ 마우스I L-6, 500 ㎎/㎖ D-글루코오스를 첨가한 RPMI1640 배지) 에 현탁하고, 96 구멍의 마이크로 컬처 플레이트에 분주하여 배양하였다.

(4) ELISA

하이브리도마가 증식해 온 웰의 배양 상청을 회수하고, rhVEGF₁₆₅ 에 반응하는 모노클로날 항체를 산생하고 있는 하이브리도마를 선택하였다. rhVEGF₁₆₅ 를 PBS(-) 로 희석하고, 96 웰의 ELISA 플레이트 (Nunc 사) 에 1 웰당 1 ㎍ 가 되도록 분주하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 방치함으로써 플레이트 표면에 결합시켰다. 다음으로, 0.05 ％ 트윈 20 을 포함하는 PBS(-) (이하, 「PBS-T」 라고 기재한다) 350 ㎕ 로 3 회 세정한 후, 1 ％ 스킴 밀크를 포함하는 PBS-T 를 300 ㎕ 씩 각 웰에 분주하고, 1 시간, 실온에서 블로킹 하였다. PBS-T 로 세정 후, 하이브리도마의 배양 상청을 rhVEGF₁₆₅ 를 고상화한 ELISA 플레이트에 분주하고, 1 시간, 실온에서 반응시켰다. PBS-T 로 세정 후, 퍼옥시다아제 (이하, 「POD」 라고 기재한다) 표지 항마우스 면역 글로블린 항체 (BETHYL 사 제조) 를 10000 배 희석한 것을 각 웰 100 ㎕ 분주하고, 1 시간, 실온에서 반응시켰다. 동일한 세정을 실시한 후, 1 ㎎/㎖ POD 가 되도록 조제한 POD 기질을 첨가하고, 실온, 5 분간 발색시켰다. 1.5N 의 황산으로 반응을 정지시킨 후, 490 ㎚ 의 흡수를 플레이트 리더 (몰레큘러 디바이스사) 를 사용하여 측정하였다.

(5) 항VEGF 모노클로날 항체의 수립

rhVEGF₁₆₅ 를 고상화하지 않은 플레이트에 있어서의 흡광도를 기준으로 하여, 흡광도가 3 배 이상인 웰을 양성으로 하여, 한계 희석법으로 클로닝 하였다. 단일 콜로니를 포함하는 웰의 세포 상청의 항체 활성을 상기 (4) 의 방법으로 조사하고, 선택한 후에, 배양하고, rhVEGF₁₆₅ 에 반응하는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마주를 수립하였다. 이와 같이 하여 수립한 하이브리도마 중, 2 개의 양성 클론을 선택하고, 이들 하이브리도마로부터 산생되는 항체를, 각각 KLHa505 및 KLHb1501 이라고 명명하였다.

실시예 2

모노클로날 항체에 의한 VEGF 와 그 수용체의 결합 저해능의 평가

항VEGF 항체는, VEGF 에 결합함으로써, 그 수용체인 VEGFR-1 및/또는 VEGFR-2 에 대한 VEGF 의 결합을 차단하고, VEGF 를 개재한 시그널 전달을 저해할 수 있다.

2 개의 양성 클론의 배양 상청 중으로부터, 프로테인 G (Protein G) 를 사용하여, 각각 KLHa505 및 KLHb1501 을 분리, 정제하였다.

다음으로, 96 웰 ELISA 플레이트 상에, IgG Fc-VEGFR-1, 혹은 IgG Fc-VEGFR2 를 고상화하고, 2 ％ 소 혈청 알부민으로 블로킹 하고, 그곳에 rhVEGF 와 혼합한 정제 항체를 첨가한 후, 실온에서 1 시간 반응시켰다. rhVEGF 를 혼합한 용액을 조제하고, 0.05 ％ 트윈 (TWEEN) (등록상표) 20 을 포함하는 TBS (TBS：50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl；이하 「TBS-T」 라고 칭한다) 로 3 회 세정하였다. 그 후, 토끼 항인간 VEGF 폴리클로날 항체-HRP 를 사용한 발색을 통해서, rhVEGF 함량을 결정하였다.

그 결과, KLHa505 항체는, VEGF 의 VEGFR-1 및 VEGFR-2 와의 결합에 있어서 경합 저해하는 것이 나타났고, KLHb1501 항체는, VEGF 의 VEGFR-2 와의 결합에 있어서 경합 저해하는 것이 나타났다 (도 1).

즉, 본 실시예에 있어서, 본 발명의 항체인 KLHa505 및 KLHb1501 이, VEGF 에 관련된 시그널 전달을 차단할 수 있는 것이 나타났다.

실시예 3

KLHa505 및 KLHb1501 의 rhVEGF 와의 해리 정수의 측정

BIAcore-3000 을 사용하여, KLHa505 및 KLHb1501 의 VEGF 와의 Kd 를 결정하였다. CM5 칩 상에 rhVEGF 를 고상화하고, HBS-EP 완충액으로 2 회 단계 희석한 후, 각각의 항체를 30 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. Kd 는 K_off/K_on 이다.

그 결과, KLHa505 의 rhVEGF 와의 해리 정수는 4.23 p㏖/ℓ 이고, KLHb1501 의 rhVEGF 와의 해리 정수는 0.60 p㏖/ℓ 인 것이 나타났다.

기존 항체의 해리 정수 (예를 들어, 아바스틴 (베바시주맙) 의 해리 정수는 47.9 n㏖/ℓ) 와 비교한 경우, 본 발명의 항체의 해리 정수는, 함께 1/1000 이하이기 때문에, 당해 항체의 VEGF 와의 결합 활성은 매우 강력하다.

즉, 본 실시예에 있어서, VEGF 에 대해서 매우 높은 친화성을 갖는 항체 (고친화성 항VEGF 항체) 를 얻을 수 있었다.

실시예 4

모노클로날 항체 KLHa505 및 KLHb1501 의 HUVEC 증식 저해 효과의 검토

KLHa505 및 KLH1501 이, 정상 인간 제대 정맥 유래 내피 세포 (이하 「HUVEC」 라고 칭한다) 에 대한 VEGF 의 활성을 저해하는지 검토하였다. 시험에 사용한 HUVEC 는, 계대 횟수가 8 회를 초과하지 않는 범위에서 사용하였다. 1 ％ 소 태아 혈청을 포함하는 Medium 200 을 사용하여, 96 웰 세포 배양용 플레이트에 10000 개씩 세포를 파종하고, 종농도 50 ng/㎖ 의 rhVEGF 및 종농도 2500 ng/㎖ 의 KLHa505 또는 KLHb1501 을 첨가하고, 24 시간 배양한 후, 세포수를 계측하였다.

그 결과, 양성 대조 (VEGF 및 아이소 타입 컨트롤 항체 (도 2 중 「Control IgG」)) 와 비교하여, KLHa505 또는 KLHb1501 을 포함하는 세포에서는, 현저하게 세포수가 감소하는 것이 나타났다 (도 2).

따라서, 본 실시예에 의해, 본 발명의 고친화성 항체는, VEGF 에 의한 혈관 유래 세포의 세포 증식 활성을 저해하고, 혈관 신생을 억제할 수 있는 것이 나타났다.

실시예 5

모노클로날 항체 KLHa505 및 KLHb1501 의 in vivo 에 있어서의 세포 증식 저해 효과의 검토

실험 2 주일 전에, 액체 질소 중에 동결 보존한 인간 결장선암 LS174T 세포의 하나의 계통 (약 1 X 10⁷ 세포) 을, 37 ℃ 온욕 (溫浴) 중에서 융해하였다. 이어서, 미리 37 ℃ 로 가온한 10 ％ 소 태아 혈청을 포함하는 McCoy's 5A 배지를 첨가한 100 ㎜ 세포용 디쉬에, 융해한 세포 현탁액을 첨가하고, 세포가 80 ％ 컨플루언시가 될 때까지 증식시켰다. 그 후, 1：5 로 세포를 계대 배양하고, 연속해서 3 회 계대 배양하였다. 전체 세포가 접종에 필요해지는 세포수에 도달했을 때, 0.25 ％ 트립신-EDTA 용액을 사용하여, 세포를 디쉬로부터 박리하고, PBS 를 사용하여 세포를 세정하였다. 그리고, 세정한 세포에 50 ％ MatriGel (등록상표) 를 포함하는 생리 식염수를 첨가하여, 2 X 107/㎖ 로 조제하고, Balb/C 누드 마우스의 복부 피하에, 1 마리당 100 ㎕, 즉 2 x 10⁶ 세포/마우스로 접종하였다.

세포 접종 후, 다음날부터 KLHa505 및 KLHb1501 의 투여를 개시하였다. 항체의 투여량은, 군당 5 마리의 마우스에 투여하고, (i) 모델 대조군 (생리 식염수만), (ii) 5 ㎎/㎏ KLHa505 군, (iii) 2.5 ㎎/㎏ KLHa505 군 및 (iv) 0.5 ㎎/㎏ KLHa505 군을 제조하였다. 또, KLHb1501 에 관해서도, 동일한 투여군을 제조하였다.

투여 방법에 대해서는, 생리 식염수에 용해한 KLHa505 또는 KLHb1501 을, 마우스당 200 ㎕ 의 용량으로, 매주 2 일 및 5 일에 1 회, 복강내 주사에 의해 투여하고, 모델 대조군에는, 200 ㎕ 의 생리 식염수를, 동시에 또한 동일한 방법에 의해 투여하였다.

투여 기간은, KLHa505 에 관해서는 18 일간, KLHb1501 에 관해서는 22 일간 계속하였다. 항체 투여시에 있어서, 누드 마우스의 종양 소결절의 최대 직경 a 및 최소 직경 b 를 측정하고, 식 V = 0.5XaXb2 에 따라서 종양 체적을 계산하였다.

그 결과, KLHa505 및 KLHb1501 은 in vivo 에 있어서 종양 증식을 현저하게 저해하는 능력을 갖는 것이 나타났다 (도 3 및 도 4).

즉, 본 실시예에 의해, 본 발명의 고친화성 항체는 암의 치료 또는 예방에 유효한 것이 나타났다.

실시예 6

모노클로날 항체의 가변 영역에 있어서의 염기 서열 및 아미노산 서열의 결정

KLHa505 및 KLHb1501 을 산생하는 하이브리도마로부터 mRNA 를 추출하고, 역전사 효소를 사용하여 각각 cDNA 를 조제하였다. 이들 cDNA 를 주형 (鑄型) 으로서 사용하여, PCR 법에 의해 마우스 IgG 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 배열을 증폭하고, 뉴클레오티드 배열을 해석함으로써, 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 포함되는 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 결정하였다.

또한, KLHa505 및 KLHb1501 의 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 의 아미노산 서열을, IMGT/V-QUEST 소프트웨어, 버젼 3.3.0 을 사용하여, 「the international ImMunoGeneTics information system (등록상표)」 (IMGT/GENE-DB) 의 면역 글로블린 데이터베이스 상에서 결정하였다.

그 결과를 하기의 표 1 및 2 에 각각 나타낸다.

실시예 7

인간-IgG1 키메라 KLHa505 항체 (KLHa505HC 항체) 의 제조

KLHa505 항체를 산생하는 하이브리도마로부터, KLHa505 항체의 중쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 33, 아미노산 서열：서열 번호 34) 및 경쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 35, 아미노산 서열：서열 번호 36) 를 클로닝 하였다. 다음으로, 이들 유전자를 각각 인간 IgG1 의 중쇄 정상 영역 유전자, 혹은 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 유전자의 염기 서열에 인프레임으로 연결하였다. 중쇄 가변 영역의 5' 말단 염기 서열과 코작 배열과 제한 효소 MluI 배열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 배열과 제한 효소 NheI 배열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 다음으로, 경쇄 가변 영역 유전자의 5' 말단 염기 서열과 제한 효소 BamHI 배열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 배열과 제한 효소 BsiWI 배열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물을 제한 효소 MluI 및 NheI, 또는 BamHI 및 BsiWI 로 처리하고, 인간 IgG1 중쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pEF6/G1) 의 MluI-NheI 사이트, 혹은 인간 Ig 의 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 발현 플라스미드 (pEF1/G1k) 의 BamHI-BsiWI 사이트에 짜넣었다. pEF6/G1 은, 플라스미드 pEF6/myc-His (인비트로젠사) 에 인간 IgG1 의 중쇄 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 41, 아미노산 서열：서열 번호 42) 가, 또 pEF1/G1-k 에는, 플라스미드 pEF1/myc-His (인비트로젠사) 에 인간 Ig 의 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 43, 아미노산 서열：서열 번호 44) 가 클로닝 되어 있다. 제한 효소 NheI 에 의해 마우스 중쇄 가변 영역과 인간 중쇄 정상 영역이 연결되고, 제한 효소 BsiWI 배열에 의해 마우스 경쇄 가변 영역과 인간 경쇄 정상 영역이 연결되었다.

FreeStyle^TM 293 Expression System (써모피셔 사이언티픽사) 을 사용하여, 플라스미드 pEF6/G1-KLHa505 및 pEF1/G1-K-KLHa505 를 293F 세포에 도입하고, 일과성으로 인간 IgG1 키메라 KLHa505 항체 (이하 「KLHa505HC 항체」 라고도 칭한다) 를 발현시켰다. 다음으로, 이 키메라 유전자를 도입한 293F 세포의 배양 상청으로부터 Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE 헬스케어·재팬사) 를 사용하여 KLHa505HC 항체를 정제하였다. 아미콘 울트라-15 원심식 필터 유닛 (머크 밀리포아사) 을 사용하여 용매를 D-PBS(-) 로 치환하였다. 정제한 KLHa505HC 항체의 농도는 Nano drop 1000 (써모피셔 사이언티픽사) 을 사용하여 정량하였다. KLHa505HC 항체의 VEGF 에 대한 결합을, 상기 「모노클로날 항체의 정제 (4) ELISA」 기재의 방법에 의해 평가한 결과, KLHa505HC 항체가 VEGF 에 특이적으로 결합하는 것이 확인되었다.

즉, 본 실시예에 있어서, 본 발명의 고친화성 항VEGF 항체의 키메라 항체를 얻을 수 있었다.

실시예 8

인간-IgG1 키메라 KLHb1501 항체 (KLHb1501HC 항체) 의 제조

KLHb1501 항체를 산출하는 하이브리도마로부터, KLHb1501 항체의 중쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 37, 아미노산 서열：서열 번호 38) 및 경쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 39, 아미노산 서열：서열 번호 40) 를 클로닝 하였다. 다음으로, 이들 유전자를 각각 인간 IgG1 의 중쇄 정상 영역 유전자, 혹은 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역 유전자의 염기 서열에 인프레임으로 연결하였다. 중쇄 가변 영역의 5' 말단 염기 서열과 코작 배열과 제한 효소 XhoI 배열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 배열과 제한 효소 NheI 배열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 다음으로, 경쇄 가변 영역 유전자의 5' 말단 염기 서열과 제한 효소 EcoRI 배열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 배열과 제한 효소 AvrII 배열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물을 제한 효소 XhoI 및 NheI, 또는 EcoRI 및 AvrII 로 처리하고, 인간 IgG1 중쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pFUSE-CHIg-hG1 ; 인비보젠사) 의 XhoI-NheI 사이트, 혹은 인간 Ig 의 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역 발현 플라스미드 (pFUSE2ss-CLIg-hl2 ; 인비보젠사) 의 EcoRI-AvrII 사이트에 짜넣었다. pFUSE-CHIg-hG1 은, 인간 IgG1 의 중쇄 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 41, 아미노산 서열：서열 번호 42) 가, 또 pFUSE2ss-CLIg-hl2 에는, 인간 Ig 의 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 43, 아미노산 서열：서열 번호 44) 가 클로닝 되어 있다. 제한 효소 NheI 에 의해 마우스 중쇄 가변 영역과 인간 중쇄 정상 영역이 연결되고, 제한 효소 AvrII 배열에 의해 마우스 경쇄 가변 영역과 인간 경쇄 정상 영역이 연결되었다.

실시예 9

in vivo 에 있어서의 인간 IgG1 키메라 KLHb1501 항체 (KLHb1501HC 항체) 의 종양 증식 저해 효과

인간 대장암 세포주 LS174T 세포를, 20 마리의 면역 부전 마우스에, 마우스당 2 x 10⁶ 세포의 비율로, 우측 복부에 피하 주사하였다. 주사 다음날에, 0.9 ％ NaCl (대조군 A) 또는 KLHb1501HC 항체 (대조군 B) 중 어느 하나를 복강 내에 투여하였다. 대조군 B 의 마우스에는, KLHb1501HC 항체를, 0.5 ㎎/Kg, 2.5 ㎎/Kg, 혹은 5 ㎎/Kg 으로, 주 2 회 투여하였다. 또, 항체와 마찬가지로, 대조군 A 의 마우스에는, 0.9 ％ NaCl 을 주에 2 회 투여하였다. 세포 접종 후, 1, 5, 8, 12, 15, 19 및 22 일째에, 종양 지름을 측정하고, 종양 양 (Tumor Volume) 을, 식：V (㎣) = (d：단경)² x (D：장경)/2 를 이용하여 산출하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다. 도 5 에 있어서는, A 군 (0.9 ％ NaCl 대조) 을 (◇) 로 나타내고, B 군 (항VEGF 항체를 접종한 마우스) 을, (□：0.5 ㎎/Kg), (△：2.5 ㎎/Kg), (○：5.0 ㎎/Kg) 중 어느 것으로 나타내었다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, 종양 양의 현저한 감소가, KLHb1501HC 항체를 접종한 마우스에서 관찰되었다. 이들 결과로부터, 본 발명의 KLHb1501HC 항체는, in vivo 에 있어서도 종양의 증식을 저해 (억제) 하는 것이 나타났다. 이로부터, 본 발명의 인간 IgG1 키메라 항VEGF 항체를 포함하는 의약 조성물은 암의 치료 또는 예방에 매우 유효한 것이 나타났다.

실시예 10

개-IgGB 키메라 KLHa505 항체 (KLHa505CC 항체) 의 제조

KLHa505 항체를 산생하는 하이브리도마로부터, KLHa505 항체의 중쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 33, 아미노산 서열：서열 번호 34) 및 경쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 35, 아미노산 서열：서열 번호 36) 를 클로닝 하였다. 다음으로, 이들 유전자를 각각 개 IgGB 의 중쇄 정상 영역 유전자, 혹은 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 유전자의 염기 서열에 인프레임으로 연결하였다. 중쇄 가변 영역의 5' 말단 염기 서열과 코작 배열과 제한 효소 EcoRV 배열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 배열과 제한 효소 NheI 배열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 다음으로, 경쇄 가변 영역 유전자의 5' 말단 염기 서열과 제한 효소 EcoRI 배열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 배열과 제한 효소 XhoI 배열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물을 제한 효소 EcoV 및 NheI, 또는 EcoRI 및 XhoI 로 처리하고, 개 IgGB 중쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pFUSE2ss-CHIg-dGB) 의 EcoRV-NheI 사이트, 혹은 개 Ig 경쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pFUSE2ss-CHIg-dK) 의 EcoRI-XhoI 사이트에 짜넣었다. pFUSE2ss-CHIg-dGB 는, 플라스미드 pFUSE2ss-CLIg-hl2 (인비보젠사) 에 개 IgGB 의 중쇄 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 45, 아미노산 서열：서열 번호 46) 가, 또 pFUSE2ss-CHIg-dK 에는, 플라스미드 pFUSE2ss-CLIg-hl2 에 개 Ig 의 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 47, 아미노산 서열：서열 번호 48) 가 클로닝 되어 있다. 제한 효소 NheI 에 의해 마우스 중쇄 가변 영역과 개 중쇄 정상 영역이 연결되고, 제한 효소 XhoI 배열에 의해 마우스 경쇄 가변 영역과 개 경쇄 정상 영역이 연결되었다.

실시예 11

개-IgGB 키메라 KLHb1501 항체 (KLHb1501CC 항체) 의 제조

KLHb1501 항체를 산생하는 하이브리도마로부터, KLHb1501 항체의 중쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 37, 아미노산 서열：서열 번호 38) 및 경쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 39, 아미노산 서열：서열 번호 40) 를 클로닝 하였다. 다음으로, 이들 유전자를 각각 개 IgGB 의 중쇄 정상 영역 유전자, 혹은 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역 유전자의 염기 서열에 인프레임으로 연결하였다. 중쇄 가변 영역의 5' 말단 염기 서열과 코작 배열과 제한 효소 EcoRV 배열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 배열과 제한 효소 NheI 배열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 다음으로, 경쇄 가변 영역 유전자의 5' 말단 염기 서열과 제한 효소 EcoRI 배열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 배열과 제한 효소 ScaI 배열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물을 제한 효소 EcoV 및 NheI, 또는 EcoRI 및 ScaI 로 처리하고, 개 IgGB 중쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pFUSE2ss-CHIg-dGB) 의 EcoRV-NheI 사이트, 혹은 개 Ig 경쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pFUSE2ss-CHIg-dK) 의 EcoRI-ScaI 사이트에 짜넣었다. pFUSE2ss-CHIg-dGB 는, 플라스미드 pFUSE2ss-CLIg-hl2 (인비보젠사) 에 개 IgGB 의 중쇄 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 45, 아미노산 서열：서열 번호 46) 가, 또 pFUSE2ss-CHIg-dK 에는, 플라스미드 pFUSE2ss-CLIg-hl2 에 개 Ig 의 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 49, 아미노산 서열：서열 번호 50) 가 클로닝 되어 있다. 제한 효소 NheI 에 의해 마우스 중쇄 가변 영역과 개 중쇄 정상 영역이 연결되고, 제한 효소 ScaI 배열에 의해 마우스 경쇄 가변 영역과 개 경쇄 정상 영역이 연결되었다.

실시예 12

개-IgGB 키메라 KLHb1501 항체 (KLHb1501CC 항체) 와 인간 VEGF165 및 개 VEGFA 에 대한 교차성

제조한 개-IgGB 키메라 항체가, 인간 VEGF165 및 개 VEGFA (VEGF164) 에 대한 결합능을 가지고 있는지, ELISA 로 확인하였다. 인간 VEGF165 혹은 개 VEGFA 를 TBS 로 희석하고, 96 웰의 ELISA 플레이트 (Nunc 사) 에 1 웰당 20 ng 이 되도록 분주하여, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써 플레이트 표면에 결합시켰다. 다음으로, 0.02 ％ 트윈 20 을 포함하는 PBS(-) (이하, 「PBS-T」 라고 기재한다) 300 ㎕ 로 3 회 세정한 후, 3 ％ 스킴 밀크를 포함하는 PBS(-) 를 300 ㎕ 씩 각 웰에 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간, 블로킹 하였다. PBS-T 로 세정 후, 1 ㎍/㎖ 의 농도로부터 단계 희석한 개-IgGB 키메라 KLHb1501 항체 (KLHb1501CC 항체) 를 VEGF 가 고상화 된 ELISA 플레이트에 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 세정 후, 100 ng/㎖ 로 조제한 퍼옥시다아제 표지 항개 면역 글로블린 항체 (BETHYL 사 제조) 를 각 웰 100 ㎕ 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 동일한 세정을 실시한 후, TMB 단일 용액 (TMB Single Solution) 을 첨가하고, 실온에서 발색시켰다. 1N 의 황산으로 반응을 정지시킨 후, 450 ㎚ 의 흡수를 플레이트 리더 (몰레큘러 디바이스사) 를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다. KLHb1501CC 항체는, 개 VEGFA 에 대해서 인간 VEGF165 와 동일한 정도의 친화성으로 결합하는 것이 나타났다.

이로부터, 본 발명의 개 IgGB 키메라 항VEGF 항체를 포함하는 의약 조성물은, 개에 있어서의 질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있는 것이 나타났다.

실시예 13

in vivo 에 있어서의 개 IgGB 키메라 KLHb1501 항체 (KLHb1501CC 항체) 의 인간 암 세포주에 대한 종양 증식 저해 효과

인간 대장암 세포주 LS174T 세포를, 20 마리의 면역 부전 마우스에, 마우스당 2 x 10⁶ 세포의 비율로, 우측 복부에 피하 주사하였다. 주사 다음날에, 0.9 ％ NaCl (대조군 A) 또는 KLHb1501CC 항체 (대조군 B) 중 어느 하나를 복강 내에 투여하였다. 대조군 B 의 마우스에는, KLHb1501CC 항체를, 0.5 ㎎/Kg, 2.5 ㎎/Kg, 혹은 5 ㎎/Kg 으로, 주 2 회 투여하였다. 또, 항체와 마찬가지로, 대조군 A 의 마우스에는, 0.9 ％ NaCl 을 주에 2 회 투여하였다. 세포 접종 후, 5, 8, 12, 15, 19 및 22 일째에, 종양 지름을 측정하고, 종양 양 (Tumor Volume) 을, 식：V (㎣) = (d：단경)² x (D：장경)/2 를 이용하여 산출하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다. 도 7 에 있어서는, A 군 (0.9 ％ NaCl 대조) 을 (■) 로 나타내고, B 군 (항VEGF 항체를 접종한 마우스) 을, (●：0.5 ㎎/Kg), (▲：2.5 ㎎/Kg), (△：5.0 ㎎/Kg) 중 어느 것으로 나타내었다. 도 7 에 나타내는 바와 같이, 종양 양의 현저한 감소가, KLHb1501CC 항체를 접종한 마우스에서 관찰되었다.

이들 결과로부터, 본 발명의 KLHb1501CC 항체는, in vivo 에 있어서도 인간의 종양의 증식을 저해 (억제) 하는 것이 나타났다. 또, 이로부터, 본 발명의 개 IgGB 키메라 항VEGF 항체를 포함하는 의약 조성물은, 암의 치료 또는 예방에 매우 유효한 것이 나타났다.

실시예 14

in vivo 에 있어서의 개 IgGB 키메라 KLHb1501 항체 (KLHb1501CC 항체) 의 개 암 세포주에 대한 종양 증식 저해 효과

개 골육종 세포주 D-17 세포를, 20 마리의 면역 부전 마우스에, 마우스당 1 x 10⁷ 세포의 비율로, 우측 복부에 피하 주사하였다. 평균 종양 양이 150 ㎣ 에 이르고 나서, 0.9 ％ NaCl (대조군 A) 또는 KLHb1501CC 항체 (대조군 B) 중 어느 하나를 복강 내에 투여하였다. 대조군 B 의 마우스에는, KLHb1501CC 항체를, 0.5 ㎎/Kg, 2.5 ㎎/Kg, 혹은 5 ㎎/Kg 으로, 주 2 회 투여하였다. 또, 항체와 마찬가지로, 대조군 A 의 마우스에는, 0.9 ％ NaCl 을 주에 2 회 투여하였다. 세포 접종 후, 50, 54, 57, 61, 64, 67, 70, 74, 77 및 81 일째에, 종양 지름을 측정하고, 종양 양 (Tumor Volume) 을, 식：V (㎣) = (d：단경)² x (D：장경)/2 를 이용하여 산출하였다. 결과를 도 8 에 나타낸다. 도 8 에 있어서는, A 군 (0.9 ％ NaCl 대조) 을 (■) 로 나타내고, B 군 (항VEGF 항체를 접종한 마우스) 을, (●：0.5 ㎎/Kg), (▲：2.5 ㎎/Kg), (△：5.0 ㎎/Kg) 중 어느 것으로 나타내었다. 도 8 에 나타내는 바와 같이, 종양 양의 현저한 감소가, KLHb1501CC 항체를 접종한 마우스에서 관찰되었다.

이들 결과로부터, 본 발명의 KLHb1501CC 항체는, in vivo 에 있어서도 개의 종양의 증식을 저해 (억제) 하는 것이 나타났다. 또, 이로부터, 본 발명의 개 IgGB 키메라 항VEGF 항체를 포함하는 의약 조성물은, 개의 암의 치료 또는 예방에 매우 유효한 것이 나타났다.

실시예 15

본 발명의 항체의 항원 결합 부위에 관한 검토

VEGF 에 있어서의 본 발명의 항체와의 결합 부위를 조사하기 위해서, 하기하는 바와 같이, ELISA 법에 기초하는 결합 실험을 실시하였다.

본 실시예에 있어서, 항VEGF 항체로는, 실시예 7 및 8 에서 얻어진 KLHa505HC 및 KLHb1501HC 를 포함하는 3 개의 항VEGF 항체를 사용하였다.

또, VEGF 로는, (i) VEGF 의 C 말단 영역인 엑손 8a 를 포함하는 VEGF165, (ii) 헤파린 결합 영역이 부족한 VEGF121, (iii) VEGF165 의 C 말단 영역과는 상이한 아미노산 서열 (엑손 8b) 을 갖는 VEGF165b, 의 3 개 타입의 VEGF 를 사용하였다.

결합 실험은, 구체적으로는 하기와 같이 실시하였다.

인간 VEGF165 (엑손 1, 2, 3, 4, 5, 7 과 8a 로 이루어진다) 인간 VEGF165b (엑손 1, 2, 3, 4, 5, 7 과 8b 로 이루어진다) 혹은 인간 VEGF121 (엑손 1, 2, 3, 4, 5 로 8a 로 이루어진다) 을 TBS 로 희석하고, 96 웰의 ELISA 플레이트 (Nunc 사) 에 1 웰당 20 ng 이 되도록 분주하여, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써 플레이트 표면에 결합시켰다. 다음으로, 0.02 ％ 트윈 20 을 포함하는 PBS(-) (이하, 「PBS-T」 라고 기재한다) 300 ㎕ 로 3 회 세정한 후, 3 ％ 스킴 밀크를 포함하는 PBS(-) 를 300 ㎕ 씩 각 웰에 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간, 블로킹 하였다. PBS-T 로 세정 후, 1 ug/㎖ 의 농도로부터 단계 희석한 KLHa505HC 항체 혹은 KLHb1501HC 항체를 VEGF 가 고상화 된 ELISA 플레이트에 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 세정 후, 100 ng/㎖ 로 조제한 퍼옥시다아제 표지 항인간 면역 글로블린 항체 (BETHYL 사 제조) 를 각 웰 100 ㎕ 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 동일한 세정을 실시한 후, TMB Single Solution 을 첨가하고, 실온에서 발색시켰다. 1N 의 황산으로 반응을 정지시킨 후, 450 ㎚ 의 흡수를 플레이트 리더 (몰레큘러 디바이스사) 를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 항VEGF 항체인 KLHa505HC 및 KLHb1501HC 를 포함하는 3 개의 항VEGF 항체 모두가, 상기 VEGF165, VEGF121 및 VEGF165b 전부에 결합하였다 (도 9, 도 10).

이 결과는, 본 발명의 항체가, VEGF 의 엑손 1 ∼ 5 의 영역에 결합하는 것을 나타낸다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해, 종래 기술과 비교하여 현저하게 높은 친화성으로 VEGF 에 결합하는 신규 항체를 제공할 수 있다.

서열표 프리 텍스트

서열 번호 13：합성 DNA

서열 번호 14：합성 펩티드

서열 번호 15：합성 DNA

서열 번호 16：합성 펩티드

서열 번호 17：합성 DNA

서열 번호 18：합성 펩티드

서열 번호 19：합성 DNA

서열 번호 20：합성 펩티드

서열 번호 21：합성 DNA

서열 번호 22：합성 펩티드

서열 번호 23：합성 DNA

서열 번호 24：합성 펩티드

서열 번호 25：합성 DNA

서열 번호 26：합성 펩티드

서열 번호 27：합성 DNA

서열 번호 28：합성 펩티드

서열 번호 29：합성 DNA

서열 번호 30：합성 펩티드

서열 번호 31：합성 DNA

서열 번호 32：합성 펩티드

서열 번호 33：합성 DNA

서열 번호 34：합성 펩티드

서열 번호 35：합성 DNA

서열 번호 36：합성 펩티드

서열 번호 37：합성 DNA

서열 번호 38：합성 펩티드

서열 번호 39：합성 DNA

서열 번호 40：합성 펩티드

서열 번호 41：합성 DNA

서열 번호 42：합성 펩티드

서열 번호 43：합성 DNA

서열 번호 44：합성 펩티드

서열 번호 45：합성 DNA

서열 번호 46：합성 펩티드

서열 번호 47：합성 DNA

서열 번호 48：합성 펩티드

서열 번호 49：합성 DNA

서열 번호 50 ∼ 54：합성 펩티드

SEQUENCE LISTING <110> Order-made Medical Research Inc. Santen Pharmaceutical Co., Ltd <120> High-affinity anti-VEGF antibody <130> G1354WO <150> JP 2016-001277 <151> 2016-01-06 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3487 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 cggcggcagc ggagctctgt cgcgagacgc agcgacaagg cagactattc agcggactca 60 ccagcccggg agtctgtgct ctgggatttg atattcaaac ctcttaattt ttttttctta 120 aactgtattg ttttacgctt taatttattt ttgcttccta ttcccctctt aaatcgtgcc 180 aacggtttga ggaggttggt tcttcactcc ctcaaatcac ttcggattgt ggaaatcagc 240 agacgaaaga ggtatcaaga gctccagaga gaagtcaagg aagagagaga gagaccggtc 300 agagagagcg cgctggcgag cgaacagaga gagggacagg ggcaaagtga ctgacctgct 360 tttgggggtg accgccagag cgcggcgtga gccctccccc ttgggatctt gcatcggacc 420 agtcgcgctg acggacagac agacagacac cgcccccagc cccagcgccc acctcctcgc 480 cggcgggctg ccgacggtgg acgcggcggc gagccgcgag gaaccgaagc ccgcgcccgg 540 aggcggggtg gagggggtcg gggctcgcgg gattgcacgg aaacttttcg tccaacttct 600 gggctcttct cgctccgtag tagccgtggt ctgcgccgca ggagacaaac cgatcggagc 660 tgggagaagt 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cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct 1560 tgagttaaac gaacgtactt gcagatgtga caagccaagg cggtgagcca ggctgcagga 1620 aggagcctcc ctcagggttt cgggaaccag acctctcacc ggaaagaccg attaaccatg 1680 tcaccaccac gccatcatcg tcaccgttga cagaacagtc cttaatccag aaagcctgac 1740 atgaaggaag aggagactct tcgaggagca ctttgggtcc ggagggcgag actccggcag 1800 acgcattccc gggcaggtga ccaagcacgg tccctcgtgg gactggattc gccattttct 1860 tatatctgct gctaaatcgc caagcccgga agattagggt tgtttctggg attcctgtag 1920 acacacccac ccacatacac acatatatat atattatata tataaataaa tatatatgtt 1980 ttatatataa aatatatata tattcttttt tttaaattaa ctctgctaat gttattggtg 2040 tcttcactgg atatgtttga ctgctgtgga cttgtgttgg gaggaggatg tcctcactcg 2100 gatgccgaca cgggagacaa tgggatgaaa ggcttcagtg tggtctgaga gaggccgaag 2160 tccttttgcc tgccggggag caagcaaggc cagggcacgg gggcacattg gctcacttcc 2220 agaaacacga caaacccatt cctggccctg agtcaagagg acagagagac agatgatgac 2280 agagaaagag ataaagatgc cggttccaac cagaagtttg gggagcctca ggacatggca 2340 tgctttgtgg atccccatga tagtctacaa aagcaccccg cccctctggg cactgcctgg 2400 aagaatcggg agcctggcca gccttcagct cgctcctcca cttctgaggg gcctaggagg 2460 cctcccacag gtgtcccggc aagagaagac acggtggtgg aagaagaggc ctggtaatgg 2520 cccctcctcc tgggacccct tcgtcctctc cttaccccac ctcctgggta cagcccagga 2580 ggaccttgtg tgatcagacc attgaaacca ctaattctgt ccccaggaga cttggctgtg 2640 tgtgtgagtg gcttaccctt cctcatcttc ccttcccaag gcacagagca atggggcagg 2700 acccgcaagc ccctcacgga ggcagagaaa agagaaagtg ttttatatac ggtacttatt 2760 taatagccct ttttaattag aaattaaaac agttaattta attaaagagt agggtttttt 2820 tcagtattct tggttaatat ttaatttcaa ctatttatga gatgtatctc tcgctctctc 2880 ttatttgtac ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtatga 2940 aatctgtgtt tccaatctct ctctcccaga tcggtgacag tcactagctt gtcctgagaa 3000 gatatttaat tttgctaaca ctcagctctg ccctcccttg tccccaccac acattccttt 3060 gaaataaggt ttcaatatac atttacatac tatatatata tttggcaact tgtgtttgta 3120 tataaatata tatatatata tatatgttta tgtatatatg tgattctgat aaaatagaca 3180 ttgctattct gttttttata tgtaaaaaca aaacaagaaa aatagagaat tctacatact 3240 aaatctctct ccttttttaa ttttaatatt tgttatcatt tatttattgg tgctactgtt 3300 tatccgtaat aattgtgggg gaaaaagata ttaacatcac gtctttgtct ctagagcagt 3360 tttccgagat attccgtagt acatatttat ttttaaacag caacaaagaa atacagatat 3420 atcttaaaaa aaaaagcatt ttgtattaaa gaattgaatt ctgatctcaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaa 3487 <210> 2 <211> 392 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Thr Asp Arg Gln Thr Asp Thr Ala Pro Ser Pro Ser Ala His Leu 1 5 10 15 Leu Ala Gly Gly Leu Pro Thr Val Asp Ala Ala Ala Ser Arg Glu Glu 20 25 30 Pro Lys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg Gly 35 40 45 Ile Ala Arg Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Ser Ser Arg Ser Val 50 55 60 Val Ala Val Val Cys Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ile Gly Ala Gly Arg 65 70 75 80 Ser Ala Ser Ser Gly Leu Glu Lys Pro Gly Pro Glu Lys Arg Gly Glu 85 90 95 Glu Glu Lys Glu Glu Glu Arg Gly Pro Gln Trp Ala Leu Gly Ser Gln 100 105 110 Glu Pro Ser Ser Trp Thr Gly Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp Ser Ala 115 120 125 Pro Ala Ala Arg Ala Pro Gln Ala Pro Ala Arg Ala Ser Val Pro Glu 130 135 140 Gly Arg Gly Ala Arg Gln Gly Ala Gln Glu Ser Gly Leu Pro Arg Ser 145 150 155 160 Pro Ser Arg Arg Gly Ser Ala Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg Ala Ser 165 170 175 Glu Thr Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu 180 185 190 Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr 195 200 205 Glu Gly Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe Met Asp Val Tyr 210 215 220 Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln 225 230 235 240 Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro 245 250 255 Leu Met Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val 260 265 270 Pro Thr Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro 275 280 285 His Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Arg 290 295 300 Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Lys Lys Ser 305 310 315 320 Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg 325 330 335 Phe Lys Ser Trp Ser Val His Cys Glu Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys 340 345 350 His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn 355 360 365 Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr 370 375 380 Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 385 390 <210> 3 <211> 3561 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 3 ttggggcagc cgagctgcag cgaggccgcg gcgctggggg cgagctgagc ggcggcagcg 60 gagctctgtc gcgagacgca gcgacaaggc agactattca acggactcat cagccaggga 120 gtctgtgctc tgggatttga tattcaaacc tctttttttt ttcttaaact gtattgtttt 180 acgctttaat ttatttttgc ttcctattcc cctcttaaat cgtgccaacg gtttggagag 240 gttgctcctt cactccctca aattacttcg gattttggaa atcagcagag gaaagaggta 300 gcaggagctc cagagagaag tcaaggaaga gagagagaga gagagaccgg tcagagagcg 360 cgctggcgag cgaacagaga gagggacagg ggcaaagtga ctgacctgct tttgggggtg 420 accgccagag cgcggcgtga gccctccccc ttgggatctt tcatcggacc agtcgcgctg 480 acggacagac agacagacac cgcccccagc cccagcgccc acctcctcgc cggcgggcag 540 ccgacggtgg acgcggcggc gagccgcgag caggagccga agcccgcgcc cggaggcggg 600 gtggaggggg tcggggctcg cgggattgca cggaaacttt tcgtccaact tctgggctct 660 tctctctccg gagtagccgt ggtctgcgcc gcaggaggca aaccgatcgg agctgggaga 720 agtgctagct cgggcctgga gaagccgggg cccgagaaga gaggggagaa agagaaggaa 780 gaggagaggg ggccgcagtg ggcgctcggc tctcgggagc cgggctcatg gacgggtgag 840 gcggcggtgt gcgcagacag tgctccagcc gcgcgcgcgc cccaggcccc ggcccgggcc 900 tcggttccag aagggagagg agcccgccaa ggcgcgcaag agagcgggct gcctcgcagt 960 ccgagccgga gagggagcgc gagccgcgcc ggccccggac gggcctctga aaccatgaac 1020 tttctgctct cttgggtgca ctggaccctg gctttactgc tgtacctcca ccatgccaag 1080 tggtcccagg ctgcacccac gacagaaggg gagcagaaag cccatgaagt ggtgaagttc 1140 atggacgtct accagcgcag ctattgccgt ccaattgaga ccctggtgga catcttccag 1200 gagtaccccg atgagataga gtatatcttc aagccgtcct gtgtgcccct aatgcggtgt 1260 gcgggctgct gcaatgatga agccctggag tgcgtgccca cgtcggagag caacgtcact 1320 atgcagatca tgcggatcaa acctcaccaa agccagcaca taggagagat gagcttcctg 1380 cagcatagca gatgtgaatg cagaccaaag aaagatagaa caaagccaga aaaaaaatca 1440 gttcgaggaa agggaaaggg tcaaaaacga aagcgcaaga aatcccggtt taaatcctgg 1500 agcgttcact gtgagccttg ttcagagcgg agaaagcatt tgtttgtcca agatccgcag 1560 acgtgtaaat gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca aggcgaggca gcttgagtta 1620 aacgaacgta cttgcagatg tgacaagcca aggcggtgag ccaggctgca ggaaggagcc 1680 tccctcaggg tttcgggaac tagacctctc accggaaaga ccgattaacc atgtcaccac 1740 cacaccacca tcgtcaccgt cgacagaaca gtccttaatc cagaaagcct gacatgaagg 1800 gagaggagac tcttcgagga gcactttggg tccggagggc gagactccgg cagacgcatt 1860 cccgggcagg tgaccaagca cggtggtccc tcgtggaact ggattcgcca ttttcttata 1920 tttgctgcta aatcgccaag cccggaagat tagggagttt tgtttctggg attcctgtag 1980 acacacccac ccacatacac acacatatat atatatatat tatatatata aataaatata 2040 tatgttttat atataaaata tatatatatt cttttttttt ttaaattaac tctgctaatg 2100 ttattggtgt cttcactgga tatgtttgac tgctgtggac ttgagttggg aggaggatgt 2160 cctcacttgg atcccgacag ggaagacaat gggatgaaag actccggtgt ggtctttcgt 2220 ccttcttaga gaggccgaag tctgtttgcc tgccagggag cacgcaaggc cagggcacgg 2280 gggcacgttg gctcacttcc agaaacacga caaacccatc cctggccctg agtcaagagg 2340 acagagagac agatgacaga taaagagata aagattctgg ttccgaccag acgtttttgg 2400 ggagcctcag gacatggcac tattgtggat ccccactaga ttctgcaaga gcaccctgcc 2460 cctctgggca ctgcctggaa gaatcaggag cctggccatc aagctctctc ctccacttct 2520 gaggagccta ggaggcctcc cacaggggtc ctggcaaaga gaagacacag tggtggaaga 2580 agaggcctgg taatggctcc tcctcctcct cctgggaacc cctcgtcctc tccctacccc 2640 acttcctggg tatagctcag gaggaccttg tgtgatcaga ccattgaaac cactaattct 2700 gtccccagga gacttggctg tgtgtgtgag tggcttaccc ttccccattt tcccttccca 2760 aggtacagag caatggggca ggacccgcaa gcccctcatg gaggcagaga aaagagaaag 2820 tgttttatat acggtactta tttaatagcc ctttttaatt agaaattaaa acagttaatt 2880 taattaaaga gtagggtttt tttcagtatt cttggttaat atttaatttc aactatttat 2940 gaggatgcat ctcttgctct ttcttatttg tactgttttt ttttgttttg tttttctgtg 3000 tgtgtgtgtg tatgaaatct gtgtttccaa tctctctctc ccagatcggt gacagtcact 3060 agcttgtcct gagaagatat ttaattttgc taacactcag ctctgccctc ccctgtcccc 3120 accacacatt cctttgaaat aaggtttcaa tatacattta catactatat atatatttgg 3180 caacttgtgt ttgtatataa atatatatat atatatatgt ttatgtatat atgtgattct 3240 gataaaatag acattgctat tctgtttttt atatgtaaaa acaaaacgag aaaaaataga 3300 gaattctaca tactaaatct ctctcctttt ttaattttaa tatttgttat catttattta 3360 ttggtgctac tgtttatccg taataattgt gggggaaaag atattaacat cacgtctttg 3420 tctctagagc agttttccga gatattccgt agtacatatt tatttttaaa cagcaacaaa 3480 gaaatacaga tatatcttaa gaaaaaaaaa gcattttgta ttaaagaatt gaattctgat 3540 ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3561 <210> 4 <211> 393 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4 Met Thr Asp Arg Gln Thr Asp Thr Ala Pro Ser Pro Ser Ala His Leu 1 5 10 15 Leu Ala Gly Gly Gln Pro Thr Val Asp Ala Ala Ala Ser Arg Glu Gln 20 25 30 Glu Pro Lys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg 35 40 45 Gly Ile Ala Arg Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Ser Ser Leu Ser 50 55 60 Gly Val Ala Val Val Cys Ala Ala Gly Gly Lys Pro Ile Gly Ala Gly 65 70 75 80 Arg Ser Ala Ser Ser Gly Leu 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tccgtagtac 2772 atatttattt ttaaacaaca acaaagaaat acagatatat cttaaaaaaa aaaaaa 2828 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 6 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Gly Gly 20 25 30 Glu His Lys Pro His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 35 40 45 Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 50 55 60 Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 65 70 75 80 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr 85 90 95 Glu Glu Phe Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln 100 105 110 Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Lys Cys Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Ile Arg 130 135 140 Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys 145 150 155 160 Pro Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu 165 170 175 Phe Val Gln Asp Pro Gln 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tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300 aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360 agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420 aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480 tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540 gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga 576 <210> 12 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly 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<213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(39) <400> 17 gca aga ttt tcc tac ggt att acc tgg ttc ttc gat gtc 39 Ala Arg Phe Ser Tyr Gly Ile Thr Trp Phe Phe Asp Val 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Ala Arg Phe Ser Tyr Gly Ile Thr Trp Phe Phe Asp Val 1 5 10 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(36) <400> 19 cag agt ctg ctc aac agt aga acc cga aag aac tac 36 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(24) <400> 21 aag caa tct tat aat ctg tac acg 24 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr 1 5 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 23 ggc tac tca atc acc agt gat tat gcc 27 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 25 ata agc tac agt ggt agc act 21 Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <400> 27 gca aga ggg ggg gat tac tac ggt agt cgc ccc tgg ttt gct tac 45 Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Pro Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Pro Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 29 act ggg gct gtt aca att agt aac tac 27 Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 31 gct ctc tgg tac agc aac cat ttg gtg 27 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Leu Val 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Leu Val 1 5 <210> 33 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 33 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca aac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat ctt gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Leu Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tac 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg tct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ser Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga ttt tcc tac ggt att acc tgg ttc ttc gat gtc tgg ggc gca 336 Ala Arg Phe Ser Tyr Gly Ile Thr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Leu Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ser Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Ser Tyr Gly Ile Thr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 337 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 35 gac att gtg atg tca cag tct cca tcc tcc ctg gct gtg tca gca gga 48 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 gag aag gtc act atg agc tgc aaa tcc agt cag agt ctg ctc aac agt 96 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 aga acc cga aag aac tac ttg gct tgg tac cag cag aaa cca ggg cag 144 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 tct cct aaa ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat tac tgc aag caa 288 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 tct tat aat ctg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa c 337 Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 367 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 37 gat gtg cag ctt cag gag tcg gga cct ggc ctg gtg aaa cct tct cag 48 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 tct ctg tcc ctc acc tgc act gtc act ggc tac tca atc acc agt gat 96 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 tat gcc tgg acc tgg atc cgg cag ttt cca gga gac aaa ctg gag tgg 144 Tyr Ala Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu Trp 35 40 45 atg ggc tac ata agc tac agt ggt agc act cgc tac aac cca tct ctc 192 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 aaa agt cga atc tct atc act cga gac aca tcc aag aac cag ttc ttc 240 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 ctg cac ttg aat tct gtg act act gag gac acg gcc aca tat ttc tgt 288 Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga ggg ggg gat tac tac ggt agt cgc ccc tgg ttt gct tac tgg 336 Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca g 367 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 38 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 39 <211> 328 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 39 cag gct gtt gtg act cag gaa tct gca ctc acc aca tca cct ggt gaa 48 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aca ctc act tgt cgc tca agt act ggg gct gtt aca att agt 96 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser 20 25 30 aac tac gcc aac tgg gtc caa gaa aaa cca gat cat tta ttc act ggt 144 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 cta ata ggt ggt acc aac aac cga gct cca gat gtt cct gcc aga ttc 192 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Asp Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 tca ggc tcc ctg att gga gac aag gct gcc ctc acc atc aca ggg gca 240 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 cag act gag gat gag gca ata tat ttc tgt gct ctc tgg tac agc aac 288 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 cat ttg gtg ttc ggt gaa gga acc aaa ctg act gtc cta g 328 His Leu Val Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 40 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Asp Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Leu Val Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 41 <211> 1004 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(990) <400> 41 gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tgagtcctag ctgg 1004 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 42 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 45 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(1008) <400> 45 gcc tcc acc acg gcc ccc tcg gtt ttc cca ctg gcc ccc agc tgc ggg 48 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 tcc act tcc ggc tcc acg gtg gcc ctg gcc tgc ctg gtg tca ggc tac 96 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 ttc ccc gag cct gta act gtg tcc tgg aat tcc ggc tcc ttg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 ggt gtg cac acc ttc ccg tcc gtc ctg cag tcc tca ggg ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc atg gtg aca gtg ccc tcc agc agg tgg ccc agc gag acc 240 Leu Ser Ser Met Val 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Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 ccc att ggg cac cag gac tgg ctc aag ggg aag cag ttc acg tgc aaa 624 Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 195 200 205 gtc aac aac aaa gcc ctc cca tcc ccg atc gag agg acc atc tcc aag 672 Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220 gcc aga ggg caa gcc cat cag ccc agt gtg tat gtc ctg ccg cca tcc 720 Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240 cgg gag gag ttg agc aag aac aca gtc agc ttg aca tgc ctg atc aaa 768 Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255 gac ttc ttc cca cct gac att gat gtg gag tgg cag agc aat gga cag 816 Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 260 265 270 cag gag cct gag agc aag tac cgc acg acc ccg ccc cag ctg gac gag 864 Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 275 280 285 gac ggg tcc tac ttc ctg tac agc aag ctc tct gtg gac aag agc cgc 912 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300 tgg cag cgg gga gac acc ttc ata tgt gcg gtg atg cat gaa gct cta 960 Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320 cac aac cac tac aca cag gaa tcc ctc tcc cat tct ccg ggt aaa tga 1008 His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 46 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 46 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 145 150 155 160 Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 195 200 205 Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240 Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255 Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 260 265 270 Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 275 280 285 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300 Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320 His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 47 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(342) <400> 47 ctc gag ata aaa aat gat gcc cag cca gcc gtc tat ttg ttc caa cca 48 Leu Glu Ile Lys Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro 1 5 10 15 tct cca gac cag tta cac aca gga agt gcc tct gtt gtg tgt ttg ctg 96 Ser Pro Asp Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 20 25 30 aat agc ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aaa gtg gat ggt 144 Asn Ser Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly 35 40 45 gtc atc caa gac aca ggc atc cag gaa agt gtc aca gag cag gac aag 192 Val Ile Gln Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys 50 55 60 gac agt acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg atg tcc agt act gag 240 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu 65 70 75 80 tac cta agt cat gag ttg tac tcc tgt gag atc act cac aag agc ctg 288 Tyr Leu Ser His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu 85 90 95 ccc tcc acc ctc atc aag agc ttc caa agg agc gag tgt cag aga gtg 336 Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val 100 105 110 gac tag 342 Asp <210> 48 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 Leu Glu Ile Lys Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro 1 5 10 15 Ser Pro Asp Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 20 25 30 Asn Ser Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly 35 40 45 Val Ile Gln Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys 50 55 60 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu 65 70 75 80 Tyr Leu Ser His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu 85 90 95 Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val 100 105 110 Asp <210> 49 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 49 cag ccc aag gcc tcc ccc tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag 48 Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 gag ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc 96 Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 tac ccc agc ggc gtg acg gtg gcc tgg aag gca agc ggc agc ccc gtc 144 Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Ser Gly Ser Pro Val 35 40 45 acc cag ggc gtg gag acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag 192 Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct 240 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser 65 70 75 80 cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac gag ggg agc acc gtg gag 288 His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 aag aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct tag 318 Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 50 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Ser Gly Ser Pro Val 35 40 45 Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 51 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 51 Ala Pro Thr Thr Glu Gly Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe 1 5 10 15 Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val 20 25 30 Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro 35 40 45 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala 50 55 60 Leu Glu Cys Val Pro Thr Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met 65 70 75 80 Arg Ile Lys Pro His Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu 85 90 95 Gln His Ser Arg Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro 100 105 110 Glu Asn <210> 52 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 52 Ala Pro Thr Thr Glu Gly Glu Gln Lys Ala His Glu Val Val Lys Phe 1 5 10 15 Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val 20 25 30 Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro 35 40 45 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala 50 55 60 Leu Glu Cys Val Pro Thr Ser Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met 65 70 75 80 Arg Ile Lys Pro His Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu 85 90 95 Gln His Ser Arg Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro 100 105 110 Glu Asn <210> 53 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 53 Ala Pro Met Ala Gly Gly Glu His Lys Pro His Glu Val Val Lys Phe 1 5 10 15 Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val 20 25 30 Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro 35 40 45 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly 50 55 60 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Claims (34)

1 x 10^-11 ㏖/ℓ 이하의 해리 정수 (定數) 로 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF) 에 결합하는, VEGF 에 대한 모노클로날 항체.

제 1 항에 있어서,
혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와, 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1) 및 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 수용체와의 결합을 저해하는, 모노클로날 항체.

제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 모노클로날 항체가 결합하는 부위에 결합하는, 모노클로날 항체.

제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
모노클로날 항체가 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 개형화 항체인, 모노클로날 항체.

제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 14 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 16 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 18 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하는, 항체.

제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 20 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Trp-Ala-Ser 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 22 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 항체.

제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 14 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 16 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 18 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하고, 또한, 서열 번호 20 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Trp-Ala-Ser 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 22 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 항체.

제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 24 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 26 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 28 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하는, 항체.

제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 30 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Gly-Thr-Asn 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 32 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 항체.

제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 24 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 26 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 28 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하고, 또한,
서열 번호 30 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Gly-Thr-Asn 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 32 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 항체.

제 7 항 또는 제 10 항에 있어서,
또한 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열 및 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.

제 11 항에 있어서,
인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 42 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 또한, 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 44 의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체.

제 12 항에 있어서,
서열 번호 34 또는 38 의 아미노산 서열 및 서열 번호 42 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 그리고
서열 번호 36 또는 40 의 아미노산 서열 및 서열 번호 44 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체.

제 7 항 또는 제 10 항에 있어서,
개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열, 및
개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 또는 개 Ig 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열
을 추가로 포함하는, 항체.

제 14 항에 있어서,
개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 46 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 48 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 또한, 개 Ig 경쇄 (λ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 50 의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체.

제 15 항에 있어서,
서열 번호 34 또는 38 의 아미노산 서열 및 서열 번호 46 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 그리고
서열 번호 36 또는 40 의 아미노산 서열 및 서열 번호 48 또는 50 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체.

제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된, 모노클로날 항체의 단편.

제 17 항에 있어서,
단편이 항원 결합 단편인, 단편.

제 18 항에 있어서,
항원 결합 단편이 단쇄 항체 또는 2 본쇄 항체인, 단편.

제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체를 산생하는, 하이브리도마.

제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는, 의약 조성물.

제 21 항에 있어서,
VEGF 매개성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 의약 조성물.

제 22 항에 있어서,
VEGF 매개성 질환이, 암 또는 VEGF 매개성 안질환인, 의약 조성물.

제 23 항에 있어서,
암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방이, 혈관 신생 또는 혈관 투과성 항진의 저해에 의한 것인, 의약 조성물.

제 24 항에 있어서,
혈관 신생이 병적인 혈관 신생인, 의약 조성물.

제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
암이 고형암 또는 혈액 종양인, 의약 조성물.

제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
암이, 결장 직장암, 직장암, 유방암, 비소세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), 신(腎) 세포암, 전립선암, 간장암, 췌장암, 연조직 육종, 카포지 육종, 카르시노이드 종양, 두경부암, 멜라노마, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종으로 이루어지는 군에서 선택되는, 의약 조성물.

제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
VEGF 매개성 안질환이, 가령 황반 변성, 당뇨병 망막증, 당뇨병 황반 부종, 혈관 신생 녹내장, 망막 정맥 폐색증, 미숙아 망막증, 병적 근시에 수반하는 맥락막 혈관 신생, 익상편 (翼狀片), 루베오시스, 판누스, 점막피부안 증후군 및 눈에 있어서의 이식 조직의 면역 거절에서 선택되는 적어도 1 종인, 의약 조성물.

제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는, 혈관 신생 저해제.

제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는, 시약.

제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는, 키트.

치료상 유효량의 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 피험자에게 투여하는 공정을 포함하는, 암 또는 VEGF 매개성 안과 질환의 치료 또는 예방 방법.

암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편.

암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편.

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