KR102669444B1

KR102669444B1 - Etar 항체 및 이의 약학 조성물 및 용도

Info

Publication number: KR102669444B1
Application number: KR1020237021437A
Authority: KR
Inventors: 쳉 장; 케슈오 판; 용 궈; 첸지앙 야오; 후아 장; 샤오펭 왕; 슈퀴안 징
Original assignee: 지맥스 바이오팜 엘엘씨
Priority date: 2016-05-31
Filing date: 2017-05-27
Publication date: 2024-05-28

Abstract

본원에서는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형 및 폐동맥 고혈압의 하나 이상의 증상 또는 생식 기관 암의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는데 있어서의 이의 용도가 제공된다.

Description

ETAR 항체 및 이의 약학 조성물 및 용도 {ETAR ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE THEREOF}

본원에서는 ET_AR 항체 및 이의 약학 조성물, 예를 들어 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형이 제공된다. 또한 본원에서는 폐동맥 고혈압의 하나 이상의 증상 또는 생식 기관 암의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 방법이 제공된다.

엔도텔린(endothelin; ET)은 심혈관계의 항상성(homeostasis) 및 생물학적 기능의 조절에 중요한 혈관수축 펩티드 호르몬이다. ET는 내피뿐만 아니라 다수의 기타 조직 및 세포 유형에서 발견된다(문헌[Barton et al., 2008, Can. J. Physiol. Pharmacol. 86: 485~498]). ET는 이의 N-말단에 2개의 이황화 결합을 갖고, 21개의 아미노산으로 이루어진 2,400 Da의 펩티드로서, 1번과 15번째 시스테인 잔기 및 3번과 11번째 시스테인 잔기를 각각 연결시킨다. 이의 C-말단은 소수성 아미노산 잔기를 함유한다. 이의 N-말단 구조는 이의 수용체에 결합하는데 중요한 반면, 이의 C-말단 구조는 수용체가 결합하는 장소에 대해 중요하다. ET는 3개의 동형체(isoform)를 갖는다: ET-1, ET-2 및 ET-3. 이들은 몇몇 아미노산 잔기 정도가 다르다. ET-1은 심혈관계의 생물학적 기능의 조절에 중요한 역할을 한다. 자극 시에 내피 세포는 ET-1을 합성하고 방출한다. ET-1은 주로 전사 수준에서 조절된다.

엔도텔린 수용체(ETR)는 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 패밀리에 속하는 2개의 동형체를 갖는다: ET_AR 및 ET_BR. 자극 시에 ET_AR은 막 Na⁺/Ca²⁺ 교환체(NCX) 및 Na⁺/H⁺ 교환체(NHE)를 활성화시켜 세포성 Ca²⁺ 농도를 증가시키고 Ca²⁺에 대해 근육 섬유를 감작화(sensitization)시키며, 그 결과 혈관 평활근 및 심근의 수축을 초래한다(문헌[Neylon, 1999, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26: 149~153]). ET_AR과는 달리, ET_BR은 주로 혈관 평활근 세포 및 심근 세포를 이완시킨다(문헌[Nelson et al., 2003, Nat. Rev. Cancer 3: 110~113]).

ET_AR은 GPCR 패밀리 A에 속하며, 7개의 막통과 도메인을 갖는다. 세포 외 도메인은 짧고, 작으며, 단지 전장 수용체의 약 1/7을 차지하는 반면, GPCR 항체는 이의 세포 외 도메인만을 표적화(targeting)할 수 있다. 따라서 GPCR의 구조적 특징 및 자연적으로 낮은 발현 수준은 생물학적 활성 항원을 생성하기 어렵게 한다.

폐동맥 고혈압(PAH)은 폐 또는 폐 관련 맥관구조의 혈관수축에서 기인하며, 그 결과 폐동맥 부전증 및 심장 혈압의 보상적 증가를 초래한다. 현미경 수준에서, 내막 섬유증, 중막 비대 및 총상 병변(plexiform lesion)을 포함하는 폐 소동맥에서의 변화가 있는 것으로 나타나며, 이로 인해 탄력성 폐 소동맥의 원위치 혈전증(in situ thrombosis)을 야기하고 폐 맥관구조 전체에서 혈액 순환의 저항 증가를 초래한다(문헌[Simonneau et al., 2004, J. Am. Coll. Cardiol. 43: 5S~12S]; 문헌[Barst et al., 2004, J. Am. Coll. Cardiol. 43: 40S~47S]). PAH는 장애율 및 사망률이 매우 높은 질병이다. 이는 환자의 건강에 악영향을 미치며 사회에 큰 부담을 지우는 위험한 질병이다.

PAH의 중증도(severity)는 관련 심장 기형(cardiac deformity) 정도에 의존하며, 이차적인 PAH를 초래하는 흔한 선천성 심장 이상(cardiac abnormality)으로는 대동맥 협착증, 대동맥폐동맥창(aortopulmonary window), 심방 중격 결손(atrial septal defect), 완전 방실 중격 결손(complete atrioventricular septal defect), 동맥 협착(artery coarctation), 확장형 심근병증(dilated cardiomyopathy), 양대혈관 우심실 기시증(double outlet right ventricle), 비대성 심근병증, 승모판 협착증, 동맥관 개존증(patent ductus arteriosus), 단심실(single ventricle), 총동맥간 존속증(persistent truncus arteriosus) 및 심실 중격 결손(ventricular septal defect)을 들 수 있다. PAH는 주로 폐동맥 및 우측 심장에 영향을 미치며, 이로 인해 우심실 비대, 우심방 확장, 폐동맥간의 확장 및 주변 폐 세동맥(pulmonary arteriole)의 결핍(sparsity)이 야기된다. 폐 세동맥의 내피 세포 및 평활근 세포의 비대는 내막 섬유증(tunica intima fibrosis), 중막 비대(tunica media hypertrophy), 루멘 협착증(lumina stenosis), 폐색(occlusion) 또는 염좌(distortion) 및 망상조직 변화(plexus change)를 초래한다. 내막 섬유증 및 루멘 폐색은 또한 폐 세정맥(pulmonary venule)을 손상시킬 수 있다.

ET_AR 길항제는 PAH 증상을 완화시키고 PAH 환자에서 운동 능력 및 혈류동태(hemodynamics)를 개선시키기 위해 엔도텔린에 의해 야기되는 혈관 압력의 증가를 효과적으로 차단할 수 있는 것으로 나타나 있다(문헌[Serasli et al., 2010, Recent Pat. Cardiovasc. Drug Discov. 5: 184~95]). 본원에서 제공되는 항체는 동물 모델에서 인간 ET_AR에 특이적으로 결합할 수 있고, 폐동맥압을 약화시킬 수 있다. 이는 동물 모델에서 PAH의 증상을 유의하게 개선시킬 수 있다.

본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은,

a. 경쇄 CDR1 아미노산 서열: 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 30;

b. 경쇄 CDR2 아미노산 서열: 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46 및 서열번호 48;

c. 경쇄 CDR3 아미노산 서열: 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66 및 서열번호 68;

d. 중쇄 CDR1 아미노산 서열: 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86, 서열번호 88 및 서열번호 90;

e. 중쇄 CDR2 아미노산 서열: 서열번호 92, 서열번호 94, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 100, 서열번호 102, 서열번호 104, 서열번호 106, 서열번호 108, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114; 및

f. 중쇄 CDR3 아미노산 서열: 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120, 서열번호 122, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 134 및 서열번호 136으로부터 독립적으로 선택된다.

또한 본원에서는 본원에서 제공되는 ET_AR 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본원에서는 본원에서 제공되는 ET_AR 항체 및 완충제를 포함하는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형이 제공된다.

본원에서는 개체에서 폐동맥 고혈압의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 개체에 본원에서 제공되는 약학 조성물, 예를 들어 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

본원에서는 개체에서 폐동맥압 증가(elevated pulmonary arterial pressure)와 연관된 질병의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 개체에 본원에서 제공되는 약학 조성물, 예를 들어 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

본원에서는 개체에서 생식 기관 암의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 개체에 본원에서 제공되는 약학 조성물, 예를 들어 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

본원에서는 폐동맥 고혈압, 폐동맥압 증가와 연관된 질병 또는 생식 기관 암을 치료하기 위한 키트가 제공되며, 이때 상기 키트는 본원에서 제공되는 약학 조성물을 포함한다.

본원에서는 폐동맥 고혈압, 폐동맥압 증가와 연관된 질병 또는 생식 기관 암을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서의 본원에서 제공되는 약학 조성물의 용도가 제공된다.

본원에서는 본원에서 제공되는 ET_AR 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다.

본원에서는 본원에서 제공되는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공된다.

본원에서는 본원에서 제공되는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.

본원에서는 ET_AR 항체를 생산하기 위한 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 본원에서 제공되는 항체를 발현시키기에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

도 1은 CHO-DHFR-ET_AR 세포(도면에서 CHO-ET_AR로서 표지됨)에 대한 결합을 위해 하이브리도마(hybridoma) 상층액에 대한 ELISA 선별 결과를 보여준다. 이들 중에서, ET_AR 항체 A-1(서열번호 138 및 서열번호 166을 포함함)은 하이브리도마 클론(hybridoma clone) 15F3으로부터 수득되었다.
도 2는 FACS에 의해 결정될 때 인간 ET_AR에 대한 재조합 ET_AR 항체(A-1, A-2(서열번호 140 및 서열번호 168을 포함함), A-7(서열번호 150 및 서열번호 178을 포함함) 및 A-12(서열번호 160 및 서열번호 188을 포함함))의 특이적 결합을 보여준다. 회색 피크 및 점선 피크는 음성 대조군으로서, 점선 피크는 CHO-DHFR-에 대한 ET_AR 항체의 결합 곡선을 나타내고, 실선 피크는 CHO-DHFR-ET_AR에 대한 ET_AR 항체의 결합 곡선을 나타낸다.
도 3은 칼슘 유동 검정(calcium flux assay)을 이용하여 결정될 때 하이브리도마의 상층액이 세포성 ET_AR 매개 Ca²⁺ 변화에 미치는 억제 효과를 보여준다.
도 4는 칼슘 유동 검정을 이용하여 결정될 때 인간 ET_AR의 억제에 대한 재조합 ET_AR 항체의 용량 반응을 보여준다(IC₅₀ = 37.91 nM, R² = 0.97) (A-1); (IC₅₀ = 87.84 nM, R² = 0.97) (A-9(서열번호 154 및 서열번호 182를 포함함)).
도 5는 저산소증(hypoxia) 유도 PAH 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey) 모델에서 재조합 ET_AR(A-1)의 생체 내 활성(in vivo activity)을 보여준다. A-1은 저산소증 유도 폐동맥 수축기압(pulmonary systolic pressure)을 유의하게 감소시킬 수 있고 또한 시간 대비 폐동맥 수축기압의 곡선 아래 부분의 면적으로 측정될 때 96시간 이내에 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 있다.
도 6은 pH 5.8 및 4℃에서 20 mM 시트르산나트륨, 140 mM 아르기닌-HCl 및 0.04% 트윈-80(TWEEN-80)을 함유하는 제형 용액에서 3개월간의 저장 이후에 ET_AR 항체 A-1(25 ㎎/㎖)의 생물학적 활성이 유의하게 변하지 않는다는 것을 보여준다.
도 7은 pH 5.8 및 25℃에서 20 mM 시트르산나트륨, 140 mM 아르기닌-HCl 및 0.04% 트윈-80을 함유하는 제형 용액에서 3개월간의 저장 이후에 ET_AR 항체 A-1(25 ㎎/㎖)의 생물학적 활성이 유의하게 변하지 않는다는 것을 보여준다.

정의

본원에서 달리 한정되지 않는 한, 본원에서 제공되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 약리학, 생물학, 생화학, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화(hybridization)와 관련하여 본원에서 제공되는 명명법 및 기법은 당해 기술분야에 널리 공지되고 흔히 사용되는 것이다.

본원에서 제공되는 표준 1문자 또는 3문자 약어는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 설명한다. 달리 명시하지 않는 한, 폴리펩티드 서열은 좌측에 이들의 아미노 말단을 갖고 우측에 이들의 카르복실 말단을 가지며, 단일 가닥 핵산 서열 및 이중 가닥 핵산 서열의 상부 가닥은 좌측에 이들의 5' 말단을 갖고 우측에 이들의 3' 말단을 갖는다. 폴리펩티드의 특정 부분은 80번 내지 130번째 아미노산과 같이 아미노산 잔기 번호로 표시되거나, Lys80 내지 Lys130과 같이 상응하는 실제 잔기와 함께 표시될 수 있다. 특정한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 기준 서열과의 차이를 보여줌으로써 기술될 수 있다.

"펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"란 용어는 각각 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 이들 용어는, 예를 들어 천연 및 인공 단백질, 단백질 단편(fragment) 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체(예를 들어, 뮤테인(mutein), 변이체 및 융합 단백질)뿐만 아니라 번역 후 변형된 단백질 또는 그 외의 공유결합적 또는 비공유결합적으로 변형된 단백질을 포함한다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 중합체일 수 있다.

"폴리펩티드 단편"이란 용어는 상응하는 전장 단백질과 비교하여 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단이 결실된 폴리펩티드를 지칭한다. 단편은, 예를 들어 아미노산 길이가 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 50개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150 또는 200개일 수 있다. 또한 단편은, 예를 들어 아미노산 길이가 최대 1,000개, 750개, 500개, 250개, 200개, 175개, 150개, 125개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 20개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개 또는 10개일 수 있다. 단편은 이의 말단 중 하나 또는 둘 모두에 하나 이상의 부가적인 아미노산, 예를 들어 자연적으로 발생하는 상이한 단백질(예를 들어, Fc 또는 류신 지퍼 도메인(leucine zipper domain))에서 유래하는 아미노산의 서열 또는 인공 아미노산 서열(예를 들어, 인공 링커 서열)을 추가로 포함할 수 있다.

본 개시내용의 폴리펩티드는, 예를 들어 (1) 단백질 분해(proteolysis)에 대한 민감성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위해 민감성을 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하고, (5) 기타 물리 화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키기 위해 임의의 이유로 인해 임의의 방식으로 변형되어 있는 폴리펩티드를 포함한다. 유사체는 폴리펩티드의 뮤테인을 포함한다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 서열(예를 들어, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부에 있는 폴리펩티드의 일부)에서 단일 또는 다중 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)이 이루어질 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 모 서열(parent sequence)의 구조적 특징을 실질적으로 변경시키지 않는 치환이다(예를 들어, 아미노산의 대체(replacement)는 모 서열에서 발생하는 나선(helix)을 절단하지 않아야 하거나, 모 서열을 특성화하거나 이의 기능성을 위해 필요로 하는 기타 유형의 이차 구조를 파괴하지 않아야 함).

폴리펩티드의 "변이체"는 다른 폴리펩티드 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 본 개시내용의 변이체는 융합 단백질을 포함한다.

폴리펩티드의 "유도체"는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 같은 다른 화학적 모이어티(chemical moiety)에 대한 접합, 인산화 및 글리코실화를 통해 화학적으로 변형되어 있는 폴리펩티드이다.

달리 표시하지 않는 한, "항체"란 용어는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체 이외에도 이의 유도체, 변이체, 단편 및 뮤테인을 포함하며, 이들의 예는 하기에 개시되어 있다.

"항체"는 항원에 결합하는 부분, 및 임의적으로는 항체가 항원에 대한 항체의 결합을 용이하게 하는 형태(conformation)를 채택하도록 하는 스캐폴드(scaffold) 또는 골격 부분을 포함하는 단백질이다. 항체의 예로는 항체, 항체 단편(예를 들어, 항체의 항원 결합 부분), 항체 유도체 및 항체 유사체를 들 수 있다. 항체는, 예를 들어 CDR 또는 CDR 유도체가 이식된 대안적인 단백질 스캐폴드 또는 인공 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이 같은 스캐폴드는, 예를 들어 생체 적합성 중합체를 포함하는 완전 합성 스캐폴드뿐만 아니라, 예를 들어 항체의 3차원 구조를 안정화시키기 위해 도입되는 돌연변이를 포함하는 항체 유래 스캐폴드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53: 121~129]; 문헌[Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639~654]을 참고한다. 게다가, 펩티드 항체 모방체("PAM")뿐만 아니라 피브로넥틴(fibronectin) 성분을 스캐폴드로 이용하는 항체 모방체에 기초하는 스캐폴드가 사용될 수 있다.

항체는, 예를 들어 자연적으로 발생하는 면역 글로불린(immunoglobulin)의 구조를 가질 수 있다. "면역 글로불린"는 사량체 분자이다. 자연적으로 발생하는 면역 글로불린에서, 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬로 이루어진 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50~70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복실 말단 부분은 주로 효과기 기능(effector function)을 담당하는 불변 영역을 한정한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 뮤(mu), 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로서 분류되며, 항체의 아이소타입(isotype)을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 한정한다. 경쇄 및 중쇄 내에는 가변 및 불변 영역이 약 12개 이상의 아미노산으로 구성된 "J" 영역에 의해 연결되어 있다. 또한 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산으로 구성된 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))(모든 면에서 그 전체가 본원에서 참고로 포함됨)]을 참고한다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 온전한 면역 글로불린이 2개의 결합 부위를 갖도록 항체 결합 부위를 형성한다.

자연적으로 발생하는 면역 글로불린 사슬은 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는 상대적으로 보존된 골격 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. N-말단에서 C-말단까지에서 경쇄 및 중쇄 둘 모두는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 영역을 포함한다. 각각의 영역에 대한 아미노산의 배치는 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991]에서 카바트(Kabat) 등의 정의에 따른다.

달리 명시하지 않는 한, "항체"는 온전한 면역 글로불린, 또는 특이적 결합을 위해 온전한 항체와 경쟁하는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 수 있거나, 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 개열(cleavage)에 의해 생성될 수 있다. 그 중에서도, 항원 결합 부분은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 도메인 항체(dAb), 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 단편, 단일 사슬 항체(scFv), 키메라 항체, 다이아바디(diabody), 트리바디(tribody), 테트라바디(tetrabody), 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역 글로불린의 적어도 일부분을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.

Fab 단편은 V_L, V_H, C_L 및 C_H1 영역을 갖는 1가 단편이고; F(ab')₂ 단편은 힌지 영역(hinge region)에서 이황화 결합에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 갖는 2가 단편이고; Fd 단편은 V_H 및 C_H1 영역을 갖고; dAb 단편은 V_H 영역, V_L 영역, 또는 V_H 또는 V_L 영역의 항원 결합 단편을 갖는다(미국 특허 제6846634호, 제6696245호, 미국 특허 공개공보 제05/0202512호, 제04/0202995호, 제04/0038291호, 제04/0009507호, 제03/0039958호, 문헌[Ward et al., 1989, Nature 341: 544~546]).

단일 사슬 항체(scFv)는 V_L 및 V_H 영역이 링커(예를 들어, 아미노산 잔기의 합성 서열)를 통해 연결되어 연속 단백질 사슬을 형성하는 항체이며, 이때 링커는 단백질 사슬 자체가 뒤로 접히고 1가 항원 결합 부위를 형성하도록 하기에 충분히 길다(예를 들어, 문헌[Bird et al., 1988, Science 242: 423~26] 및 문헌[Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879~83] 참고). 다이아바디는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 2가 항체이며, 이때 각각의 폴리펩티드 사슬은 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 2개의 영역 사이의 쌍 형성을 허용할 수 없는 링커에 의해 연결되는 V_H 및 V_L 영역을 포함하며, 이로 인해 각각의 영역이 다른 폴리펩티드 사슬 상의 상보적인 영역과 쌍을 형성하도록 한다(예를 들어, 문헌[Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444~48] 및 문헌[Poljak et al., 1994, Structure 2: 1121~23] 참고). 다이아바디의 2개의 폴리펩티드 사슬이 동일한 경우, 이들의 쌍 형성으로 생성되는 다이아바디는 2개의 동일한 항원 결합 부위를 가질 것이다. 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 다이아바디를 제조하기 위해 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드 사슬이 사용될 수 있다. 유사하게, 트리바디 및 테트라바디는 각각 3개 및 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고 각각 3개 및 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 항체이며, 여기서 항원 결합 부위는 동일하거나 상이할 수 있다.

소정의 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 및 골격 영역(FR)은 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991]에서 카바트 등에 의해 개시된 시스템을 이용하여 확인될 수 있다. 하나 이상의 CDR은 공유결합적 또는 비공유결합적으로 분자 내로 혼입되어 이를 항체로 만들 수 있다. 항체는 보다 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 CDR(들)을 포함할 수 있거나, CDR(들)을 다른 폴리펩티드 사슬에 공유 결합시킬 수 있거나, CDR(들)를 비공유결합적으로 포함할 수 있다. CDR은 항체가 관심 있는 특정 항원에 특이적으로 결합하도록 한다.

항체는 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 하나 초과의 결합 부위가 존재하는 경우, 결합 부위는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 인간 면역 글로불린은 전형적으로 2개의 동일한 결합 부위를 갖는 반면, "이중 특이성" 또는 "이중 기능성" 항체는 2개의 상이한 결합 부위를 갖는다.

"쥐 항체"란 용어는 쥐 면역 글로불린 서열에서 유래하는 하나 이상의 가변 및 불변 영역을 갖는 모든 항체를 포함한다.

"인간화 항체"란 용어는 쥐 항체 분자의 상보성 결정 영역 서열을 인간 항체 가변 영역 골격에 이식함으로써 생성되는 항체를 지칭한다.

"항원 결합 도메인", "항원 결합 영역" 또는 "항체-결합 부위"란 용어는 항원과 상호 작용을 하고 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화도에 기여하는 아미노산 잔기(또는 기타 부분)을 포함하는 항체의 일부분이다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 있어서, 이는 이의 CDR 영역들 중 적어도 하나의 적어도 일부분을 포함할 것이다.

"에피토프(epitope)"란 용어는 항체(예를 들어, 항체)에 의해 결합되는 분자의 일부분이다. 에피토프는 분자의 비인접 부분(non-contiguous portion)을 포함할 수 있다(예를 들어, 폴리펩티드에서 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 일차 서열에서 인접하지 않지만, 폴리펩티드의 3차 및 4차 구조의 맥락에서는 항체에 의해 서로 연결되기에 거의 충분함).

2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 "동일성 비율(percent identity)"은 이의 기본 매개변수(default parameter)를 이용하는 GAP 컴퓨터 프로그램(GCG 위스콘신 패키지 버전10.3(캘리포니아주 샌디애고 소재의 엑설리스(Accelrys))의 일부)을 이용하여 서열을 비교함으로써 결정된다.

"폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"이란 용어는 전반에 걸쳐 상호 교환 가능하게 사용되며, DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 펩티드 핵산 및 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체)를 이용하여 생성되는 DNA 또는 RNA의 유사체 및 이의 하이브리드(hybrid)를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 항체, 또는 이의 단편, 유도체, 뮤테인 또는 변이체를 암호화하는 인접한 개방 판독 프레임(open reading frame)을 포함한다.

2개의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 이들 서열이 하나의 폴리뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오티드가 간극의 도입 없이, 그리고 각 서열의 5' 또는 3' 말단에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 없이 기타 폴리뉴클레오티드 내의 이의 상보적인 뉴클레오티드와 마주보도록 역병렬 배향으로 배열될 수 있는 경우에 서로에 대한 "상보체(complement)"이다. 2개의 폴리뉴클레오티드가 적당히 엄격한 조건 하에 서로 혼성화될 수 있는 경우에 폴리뉴클레오티드는 다른 폴리뉴클레오티드에 대해"상보적"이다. 따라서 폴리뉴클레오티드는 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적일 수 있으며, 이때 이의 상보체는 없다.

"벡터"란 용어는 핵산에 연결된 다른 핵산을 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있는 핵산이다. 하나의 유형의 벡터는 부가적인 핵산 절편(segment)이 연결될 수 있는 선형 또는 환형 이중 가닥 DNA 분자를 지칭하는 "플라스미드"이다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)이며, 여기서 부가적인 DNA 절편은 바이러스 게놈 내로 도입될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 원점(origin of replication)을 포함하는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 기타 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내에 통합되며, 이로 인해 숙주 게놈과 함께 복제된다. "발현 벡터"는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 유형의 벡터이다.

뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현(예를 들어, 발현 수준, 시기 또는 위치)에 영향을 미치는 경우에 조절 서열에 "작동 가능하게 연결"된다. "조절 서열"은 이것이 작동 가능하게 연결되어 있는 핵산의 발현(예를 들어, 발현 수준, 시기 또는 위치)에 영향을 미치는 핵산이다. 조절 서열은, 예를 들어 조절된 핵산에 대해 직접 영향을 미칠 수 있거나, 하나 이상의 기타 분자(예를 들어, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩티드)의 작용을 통해서 영향을 미칠 수 있다. 조절 서열의 예로는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer) 및 기타 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 들 수 있다. 조절 서열의 추가적인 예는, 예를 들어 문헌[Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in EnZymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. and Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 3605~06]에 개시되어 있다.

"숙주 세포"란 용어는 핵산, 예를 들어 본 발명의 핵산을 발현하기 위해 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어 대장균(E. coli)일 수 있거나, 이는 진핵생물, 예를 들어 단세포 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 기타 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드 암호화 핵산과 함께 형질 전환 또는 형질 감염된 후, 숙주 세포에서 발현될 수 있는 배양된 세포이다. "재조합 숙주 세포"란 문구는 발현될 핵산과 함께 형질 전환 또는 형질 감염되어 있는 숙주 세포를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 또한 숙주 세포는 조절 서열이 숙주 세포 내로 도입되어 핵산과 작동 가능하게 연결되어 있지 않는 한 핵산을 포함하지만 이를 목적하는 수준으로 발현하지 않는 세포일 수 있다. 숙주 세포란 용어는 특정 대상 세포를 지칭할 뿐만 아니라 이 같은 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 특정 변형이, 예를 들어 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에 이 같은 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 이는 여전히 본원에서 사용된 바와 같은 용어의 범주 내에 포함된다.

엔도텔린 수용체

엔도텔린 A 수용체(ET_AR)는 이종 삼량체성 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질(G 단백질)을 통해 하나 이상의 세포 내 신호전달 경로에 결합되는 7개의 막통과 수용체의 패밀리 A에 속한다(문헌[Jelinek et al., 1993, Science 259: 1614~1616, Segre et al., 1993, Trends Endocrinol. Metab. 4: 309~314]). 본원에서 사용된 바와 같이, "엔도텔린 수용체" 및 "ET_AR"은 상호 교환 가능하게 사용된다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 세포 상에서 발현될 때 막 결합 엔도텔린 수용체에 결합하고, 엔도텔린 수용체를 통해 엔도텔린 신호전달을 억제 또는 차단하도록 선택될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 인간 엔도텔린 수용체에 특이적으로 결합한다. 추가의 실시형태에서, 인간 엔도텔린 수용체에 결합하는 항체는 다른 종, 예를 들어 래트의 엔도텔린 수용체에도 결합할 수 있다. 하기 실시예에는 인간 막 결합 엔도텔린 수용체에 결합하는 쥐 항체, 및 추가의 실시형태에서는 다른 종의 엔도텔린 수용체에 결합하는 쥐 항체를 생성하는 하나의 방법이 제공된다.

몇몇 엔도텔린 수용체의 종에 대한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열이 공지되어 있다. 서열번호 1 내지 서열번호 6은 인간, 원숭이 및 래트에 대한 서열을 나타낸다. 서열 데이터는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 유전자은행 데이터베이스로부터 수득되었다.

엔도텔린 A 수용체:

인간(호모사피엔스(Homo sapiens)) 폴리뉴클레오티드(서열번호 1); 기탁 번호: S63938.

인간(호모사피엔스) 아미노산(서열번호 2); 기탁 번호: AAB20278.

시노몰구스 원숭이(호모사피엔스) 폴리뉴클레오티드(서열번호 3); 기탁 번호: JV635771.

시노몰구스 원숭이(호모사피엔스) 아미노산(서열번호 4); 기탁 번호: AFJ71111.

래트(집쥐) 폴리뉴클레오티드(서열번호 5); 기탁 번호: M60786.

래트(집쥐) 아미노산(서열번호 6); 기탁 번호: AAA41114.

엔도텔린 수용체 A(ET_AR) 항체

하나의 실시형태에서, ET_AR 항체(예를 들어, 전장 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 항체 변이체 및 항체 뮤테인)가 본원에서 제공된다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

f. 중쇄 CDR3 아미노산 서열: 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120, 서열번호 122, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 134 및 서열번호 136.

표 1에는 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 경쇄 CDR 아미노산 서열뿐만 아니라 이들의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열이 나열되어 있다. 표 2에는 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 중쇄 CDR 아미노산 서열뿐만 아니라 이들의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열이 나열되어 있다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 부가(들), 치환(들) 및/또는 결실(들)에 의해 표 1 및 표 2에 나열된 CDR 서열과 상이한 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 부가(들), 치환(들) 및/또는 결실(들)에 의해 표 1 및 표 2에 나열된 CDR 서열과 상이한 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 부가(들), 치환(들) 및/또는 결실(들)에 의해 표 1 및 표 2에 나열된 CDR 서열과 상이한 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 2개 또는 1개의 아미노산 부가(들), 치환(들) 및/또는 결실(들)에 의해 표 1 및 표 2에 나열된 CDR 서열과 상이한 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 1개의 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실에 의해 표 1 및 표 2에 나열된 CDR 서열과 상이한 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체(ET_AR-1 항체)는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

a. 경쇄 CDR1 아미노산 서열: 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 30; 및

b. 중쇄 CDR1 아미노산 서열: 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86, 서열번호 88 및 서열번호 90.

하나의 양태에서, ET_AR-1 항체는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

a. 경쇄 CDR2 아미노산 서열: 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46 및 서열번호 48; 및

b. 중쇄 CDR2 아미노산 서열: 서열번호 92, 서열번호 94, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 100, 서열번호 102, 서열번호 104, 서열번호 106, 서열번호 108, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114.

다른 양태에서, ET_AR-1 항체는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

a. 경쇄 CDR3 아미노산 서열: 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66 및 서열번호 68; 및

b. 중쇄 CDR3 아미노산 서열: 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120, 서열번호 122, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 134 및 서열번호 136.

또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체(ET_AR-2 항체)는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

하나의 양태에서, ET_AR-2 항체는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

다른 양태에서, ET_AR-2 항체는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체(ET_AR-3 항체)는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

하나의 양태에서, ET_AR-3 항체는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

다른 양태에서, ET_AR-3 항체는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 하기 아미노산 서열을 포함한다:

a. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 CDR1 아미노산 서열: 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 30;

b. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 CDR2 아미노산 서열: 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46 및 서열번호 48;

c. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 CDR3 아미노산 서열: 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66 및 서열번호 68;

d. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 중쇄 CDR1 아미노산 서열: 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86, 서열번호 88 및 서열번호 90;

e. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 중쇄 CDR2 아미노산 서열: 서열번호 92, 서열번호 94, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 100, 서열번호 102, 서열번호 104, 서열번호 106, 서열번호 108, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114; 및

f. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 중쇄 CDR3 아미노산 서열: 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120, 서열번호 122, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 134 및 서열번호 136.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66 및 서열번호 68. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120, 서열번호 122, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 134 및 서열번호 136. 또 다른 실시형태에서, ET_AR 항체는 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 및 중쇄 CDR3 아미노산 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 50 대 서열번호 116, 서열번호 62 대 서열번호 128, 서열번호 62 대 서열번호 130, 서열번호 64 대 서열번호 132, 서열번호 66 대 서열번호 134, 및 서열번호 68 대 서열번호 136.

다른 실시형태에서, ET_AR 항체는 1개 또는 2개의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 각각의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

a. 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 138(L1), 서열번호 140(L2), 서열번호 142(L3), 서열번호 144(L4), 서열번호 146(L5), 서열번호 148(L6), 서열번호 150(L7), 서열번호 152(L8), 서열번호 154(L9), 서열번호 156(L10), 서열번호 158(L11), 서열번호 160(L12), 서열번호 162(L13), 서열번호 164(L14), 및 상기에 나열된 아미노산 서열들 중 하나에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열; 및

b. 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 166 (H1), 서열번호 168(H2), 서열번호 170(H3), 서열번호 172(H4), 서열번호 174(H5), 서열번호 176(H6), 서열번호 178(H7), 서열번호 180(H8), 서열번호 182(H9), 서열번호 184(H10), 서열번호 186(H11), 서열번호 188(H12), 서열번호 190(H13) 및 서열번호 192(H14), 및 상기에 나열된 아미노산 서열들 중 하나에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열.

또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 1개 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 각각의 폴리뉴클레오티드 서열은 하기에 나열되는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 독립적으로 선택된다:

a. 경쇄 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열: 서열번호 137, 서열번호 139, 서열번호 141, 서열번호 143, 서열번호 145, 서열번호 147, 서열번호 149, 서열번호 151, 서열번호 153, 서열번호 155, 서열번호 157, 서열번호 159, 서열번호 161, 서열번호 163, 및 상기에서 나열된 폴리뉴클레오티드 서열들 중 하나에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열; 및

b. 중쇄 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열: 서열번호 165, 서열번호 167, 서열번호 169, 서열번호 171, 서열번호 173, 서열번호 175, 서열번호 177, 서열번호 179, 서열번호 181, 서열번호 183, 서열번호 185, 서열번호 187, 서열번호 189, 서열번호 191 및 상기에서 나열된 폴리뉴클레오티드 서열들 중 하나에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열.

또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 하기 아미노산 서열을 포함한다:

a. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 138(L1), 서열번호 140(L2), 서열번호 142(L3), 서열번호 144(L4), 서열번호 146(L5), 서열번호 148(L6), 서열번호 150(L7), 서열번호 152(L8), 서열번호 154(L9), 서열번호 156(L10), 서열번호 158(L11), 서열번호 160(L12), 서열번호 162(L13), 서열번호 164(L14), 및 상기에서 나열된 아미노산 서열들 중 하나에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열; 및

b. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 166(H1), 서열번호 168(H2), 서열번호 170(H3), 서열번호 172(H4), 서열번호 174(H5), 서열번호 176(H6), 서열번호 178(H7), 서열번호 180(H8), 서열번호 182(H9), 서열번호 184(H10), 서열번호 186(H11), 서열번호 188(H12), 서열번호 190(H13), 서열번호 192(H14), 및 상기에서 나열된 아미노산 서열들 중 하나에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열.

a. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 138(L1), 서열번호 140(L2), 서열번호 142(L3), 서열번호 144(L4), 서열번호 146(L5), 서열번호 148(L6), 서열번호 150(L7), 서열번호 152(L8), 서열번호 154(L9), 서열번호 156(L10), 서열번호 158(L11), 서열번호 160(L12), 서열번호 162(L13) 및 서열번호 164(L14); 및

b. 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 166(H1), 서열번호 168(H2), 서열번호 170(H3), 서열번호 172(H4), 서열번호 174(H5), 서열번호 176(H6), 서열번호 178(H7), 서열번호 180(H8), 서열번호 182(H9), 서열번호 184(H10), 서열번호 186(H11), 서열번호 188(H12), 서열번호 190(H13) 및 서열번호 192(H14).

또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 138 및 서열번호 166(L1H1), 서열번호 140 및 서열번호 168(L2H2), 서열번호 142 및 서열번호 170(L3H3), 서열번호 144 및 서열번호 172(L4H4), 서열번호 146 및 서열번호 174(L5H5), 서열번호 148 및 서열번호 176(L6H6), 서열번호 150 및 서열번호 178(L7H7), 서열번호 152 및 서열번호 180(L8H8), 서열번호 154 및 서열번호 182(L9H9), 서열번호 156 및 서열번호 184(L10H10), 서열번호 158 및 서열번호 186(L11H11), 서열번호 160 및 서열번호 188(L12H12), 서열번호 162 및 서열번호 190(L13H13), 및 서열번호 164 및 서열번호 192(L14H14).

본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 "LxHy"(여기서 "x"는 경쇄 가변 영역의 서열 번호에 상응하고, "y"는 중쇄 가변 영역의 서열 번호에 상응함)의 명명법을 이용하여 표시될 수 있다. 예를 들어, L2H1은 서열번호 140(L2)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 166(H1)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.

또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 L1 내지 L14로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인 또는 H1 내지 H14로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 이의 단편, 유도체, 뮤테인 또는 변이체를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 하기 목록으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 및 중쇄 CDR3 아미노산 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 138 및 서열번호 166, 서열번호 150 및 서열번호 178, 서열번호 152 및 서열번호 180, 서열번호 154 및 서열번호 182, 서열번호 156 및 서열번호 184, 서열번호 158 및 서열번호 186, 서열번호 160 및 서열번호 188, 서열번호 162 및 서열번호 190, 및 서열번호 164 및 서열번호 192.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 138) 또는 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 166)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 138) 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 166)의 조합을 포함한다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 불변 도메인의 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 이때 불변 도메인의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택된다:

a. 경쇄 불변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 194 및 서열번호 196; 및

b. 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 198.

또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 불변 도메인의 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 이때 각각의 불변 도메인의 아미노산 서열은 하기에 나열되는 경쇄 및 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열의 조합으로부터 독립적으로 선택된다;

a. 경쇄 불변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 194) 및 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 198)의 조합; 및

b. 경쇄 불변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 196) 및 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 198)의 조합.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 상기에 나타낸 경쇄 및 중쇄 CDR 및 FR(골격)의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 경쇄 CDR1 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 경쇄 CDR2 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 경쇄 CDR3 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 중쇄 CDR1 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 중쇄 CDR2 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 경쇄 FR1 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 경쇄 FR2 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 경쇄 FR3 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 경쇄 FR4 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 중쇄 FR1 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 중쇄 FR2 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 중쇄 FR3 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 중쇄 FR4 서열을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 항체의 CDR3 서열은 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 부가(들), 치환(들) 및/또는 결실(들)에 의해 상기에 나타낸 경쇄 및 중쇄 CDR3 서열의 서열번호 50 및 서열번호 116의 조합과는 상이하다. 다른 실시형태에서, 항체의 경쇄 CDR3 서열은 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 부가(들), 치환(들) 및/또는 결실(들)에 의해 상기에 나타낸 경쇄 CDR3 서열의 서열번호 50과 상이하다. 다른 실시형태에서, 항체의 경쇄 CDR3 서열은 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 부가(들), 치환(들) 및/또는 결실(들)에 의해 상기에 나타낸 경쇄 CDR3 서열의 서열번호 50과는 상이하고, 항체의 중쇄 CDR3 서열은 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 부가(들), 치환(들) 및/또는 결실(들)에 의해 상기에 나타낸 중쇄 CDR3 서열의 서열번호 116 또는 서열번호 118과는 상이하다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 경쇄 및 중쇄 CDR 서열의 조합을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 경쇄 및 중쇄 CDR 서열의 조합을 추가로 포함하며, 이때 각각의 서열은 독립적으로는 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 부가(들), 치환(들) 및/또는 결실(들)에 의해 경쇄 및 중쇄 CDR3 서열의 서열번호 50 및 서열번호 116의 조합과는 상이하다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 경쇄 가변 영역의 CDR 및 중쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 상기에 나타낸 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및/또는 6개의 경쇄 및 중쇄 CDR 서열의 조합을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 항체(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)는 상기에 나타낸 경쇄 가변 도메인 L1의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인의 서열은 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 결실(들), 삽입(들) 또는 치환(들)에 의해 경쇄 가변 도메인 L1의 서열과는 상이하다. 다른 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인 L1의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 L1의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 암호화 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 적당히 엄격한 조건 하에 경쇄 가변 도메인 L1의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열의 상보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 엄격한 조건 하에 경쇄 가변 도메인 L1의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열의 상보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 항체(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)는 상기에 나타낸 중쇄 가변 도메인 H1의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인의 서열은 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 결실(들), 삽입(들) 또는 치환(들)에 의해 중쇄 가변 도메인 H1의 서열과는 상이하다. 다른 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인 H1의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 H1의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 적당히 엄격한 조건 하에 중쇄 가변 도메인 H1의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열의 상보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 엄격한 조건 하에 중쇄 가변 도메인 H1의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열의 상보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13 또는 L14H14의 조합; 또는 이의 아이소타입(예를 들어, IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgE 또는 IgD）또는 이의 Fab 또는 F(ab')₂ 단편을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 L1H1의 조합을 포함하는 항체, 또는 이의 변환된 아이소타입 항체(예를 들어, IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgE 또는 IgD) 또는 이의 Fab 또는 F(ab')₂ 단편을 포함한다.

본원에서 제공되는 항체(예를 들어, 항체, 항체 단편 및 항체 유도체)는 당해 기술 분야에 공지되는 임의의 불변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은, 예를 들어 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역, 예를 들어 쥐 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은, 예를 들어 알파형, 델타형, 엡실론형 감마형 또는 뮤형 중쇄 불변 영역, 예를 들어 쥐 알파형, 델타형, 엡실론형, 감마형 또는 뮤형 중쇄 불변 영역일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 경쇄 또는 중쇄 불변 영역은 자연적으로 발생하는 불변 영역의 단편, 유도체, 변이체 또는 뮤테인이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 불변 경쇄 κ 또는 λ 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 경쇄 불변 영역 서열 및 이의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열이 하기와 같이 제공된다.

경쇄 불변 영역:

폴리뉴클레오티드(κ): (서열번호 193); 아미노산(κ): (서열번호 194)

폴리뉴클레오티드(λ): (서열번호 195); 아미노산(λ): (서열번호 196)

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 중쇄 불변 영역 서열 및 이의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 하기에 같이 제공된다:

폴리뉴클레오티드(IgG1): (서열번호 197); 아미노산(IgG1): (서열번호 198)

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 쥐 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 재조합 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 이중 사슬 항체, 삼중 사슬 항체, 사중 사슬 항체, Fab 단편, F(ab')x 단편, 도메인 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 및 IgG4 항체로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 ET_AR 단클론성 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 마우스 ET_AR 항체이다. 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 인간화 ET_AR 항체이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 단클론성 항체 A-1(서열번호 138 및 서열번호 166을 포함함), A-7(서열번호 150 및 서열번호 178을 포함함), A-8(서열번호 152 및 서열번호 180을 포함함), A-9(서열번호 154 및 서열번호 182를 포함함), A-10(서열번호 156 및 서열번호 184를 포함함), A-11(서열번호 158 및 서열번호 186을 포함함), A-12(서열번호 160 및 서열번호 188을 포함함), A-13(서열번호 162 및 서열번호 190을 포함함) 또는 A-14(서열번호 164 및 서열번호 192를 포함함)이다.

항체 및 항체 단편

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 전장 항체(전장 중쇄 및/또는 경쇄를 갖는 다클론성, 단클론성, 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함함)이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 항체 단편, 예를 들어 F(ab')₂, Fab, Fab', Fv, Fc 또는 Fd 단편이며, 단일 도메인 항체, 단일 사슬 항체, 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 이중 사슬 항체, 삼중 사슬 항체, 사중 사슬 항체, v-NAR 및 bis-scFv 내로 통합될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126~1136] 참고). 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 또한 미국 특허 제6703199호에 개시된 바와 같은 항체 폴리펩티드를 포함하며, 이때 상기 항체 폴리펩티드는 피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디(monobody)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 또한 미국 특허 공개공보 제2005/0238646호에 개시된 기타 항체 폴리펩티드를 포함하며, 이때 상기 항체 폴리펩티드는 단일 사슬 폴리펩티드이다.

하나의 실시형태에서, 관심 있는 단클론성 항체를 발현하는 유전자의 가변 영역은 하이브리도마에서 뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭된다. 이들 프라이머는 당업자에 의해 합성될 수 있거나, 시판되는 공급원으로부터 구입 가능하며(예를 들어, 캘리포니아주 라호이아 소재의 스트라타젠(Stratagene) 참조), 그 중에서도 V_Ha, V_Hb, V_Hc, V_Hd, C_H1, V_L 및 C_L 영역용 프라이머를 포함하는 마우스 및 인간 가변 영역용 프라이머가 판매되고 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 증폭하기 위해 이들 프라이머가 사용될 수 있으며, 이어서 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 IMMUNOZAP^TMH 또는 IMMUNOZAP^TML(스트라타젠)과 같은 벡터 내로 각각 삽입될 수 있다. 이어서 이들 벡터는 발현을 위해 대장균, 효모, 또는 포유동물 기반 시스템에 도입될 수 있다. V_H 및 V_L 영역의 융합체를 함유하는 다량의 단일 사슬 단백질은 이들 방법을 이용하여 생성될 수 있다(문헌[Bird et al., 1988, Science 242: 423~426]).

일단 본 발명의 항체 생성 세포가 임의의 상술한 면역화 및 기타 기법을 이용하여 수득되는 경우, 특정 항체의 유전자는 본원에 개시된 표준 절차에 따라 이로부터 DNA 또는 mRNA를 단리하고 증폭함으로써 클로닝될 수 있다. 이로부터 생성된 항체는 CDR을 확인하기 위해 서열 분석될 수 있고, CDR의 암호화 DNA는 상술한 바와 같이 조작(manipulation)되어 본원에서 제공되는 기타 항체를 생성할 수 있다.

본원에서 제공되는 항체는 바람직하게는 본원에 개시된 세포 기반 검정 및/또는 본원에 개시된 생체 내 검정에서 엔도텔린 신호전달을 조절하고/하거나, 본원에 개시된 항체들 중 하나의 결합을 교차 차단하고/하거나, 본원에 개시된 항체들 중 하나에 의해 ET_AR과 결합하지 못하도록 교차 차단된다. 따라서 이 같은 결합제는 본원에 개시된 검정을 이용하여 확인될 수 있다.

특정 실시형태에서, 항체는 먼저 ET_AR을 과발현하는 세포에 결합하고/하거나, 본원에 개시된 세포 기반 및/또는 생체 내 검정에서 중화되고/되거나, 본원에 개시된 항체를 교차 차단하고/하거나, 본원에 개시된 항체들 중 하나에 의해 ET_AR과 결합하지 못하도록 교차 차단되는 항체를 확인함으로써 생성된다.

당업자라면 항체와 같은 특정 단백질은 다양한 번역 후 변형을 겪게 된다는 것을 이해할 것이다. 이들 변형의 유형 및 정도는 종종 단백질을 발현시키기 위해 사용되는 숙주 세포주뿐만 아니라 배양 조건에 의존한다. 이 같은 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르트산 이성질화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변경을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase)의 작용으로 인해 카르복실 말단 염기성 잔기(예를 들어, 리신 또는 아르기닌)가 손실되는 것이다(문헌[Harris, R. J., 1995, Journal of Chromatography 705: 129~134]에 개시된 바와 같음).

쥐 단클론성 항체의 생산을 위한 대안적인 방법은 동계 마우스(syngeneic mouse), 예를 들어 단클론성 항체를 함유하는 복수액(ascites fluid)의 형성을 용이하게 하기 위해 처리(예를 들어, 프리스틴 프라이밍(pristine-priming))되어 있는 마우스의 복강 내로 하이브리도마 세포를 주입하는 것이다. 단클론성 항체는 다양한 확립된 기법에 의해 단리되고 정제될 수 있다. 이 같은 단리 기법으로는 단백질-A 세파로오스가 구비된 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 들 수 있다(예를 들어, 문헌[Coligan at pages 2.7.1~2.7.12 and pages 2.9.1~2.9.3]; 문헌[Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79~104 (The Humana Press, Inc. 1992)] 참조). 단클론성 항체는 항체의 특정한 성질(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 아이소타입, 결합 특이성 등)에 기초하여 선택되는 적절한 리간드를 이용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 고체 지지체 상에 고정되는 적합한 리간드의 예로는 단백질 A, 단백질 G, 항-불변 영역(경쇄 또는 중쇄) 항체, 항-이디오타입 항체(anti-idiotype antibody) 및 TGF-β 결합 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 들 수 있다.

또한 항체 결합 부위의 중심에 있는 상보성 결정 영역(CDR)의 분자 진화는, 문헌[Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263: 551~567]에 개시된 바와 같이, 친화도가 증가된 항체, 예를 들어 c-erbB-2에 대한 친화도가 증가된 항체를 단리하기 위해 사용되어 왔다. 따라서 이 같은 기법은 인간 엔도텔린 A 수용체의 항체를 제조하는데 유용하다.

시험관 내(in vitro) 또는 생체 내에서 엔도텔린 A 수용체의 존재를 검출하기 위한 검정에서, 예를 들어 인간 엔도텔린 A 수용체에 대한 항체가 사용될 수 있다.

또한 항체는 임의의 통상적인 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이들은 이들을 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제될 수 있거나(예를 들어, 항체는 이를 생산하는 하이브리도마로부터 정제될 수 있음), 당해 기술분야에 공지된 임의의 기법을 이용하여 재조합 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980)]; 및 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]을 참고한다. 이는 하기 핵산 섹션에서 논의된다.

항체는 임의의 공지된 기법에 의해 목적하는 특성을 얻기 위해 제조되고 선별될 수 있다. 일부 기법은 관련 항체(예를 들어, 항-ET_AR 항체)의 폴리펩티드 사슬(또는 이의 일부분)을 암호화하는 핵산의 단리, 및 핵산의 조작에 관한 것이다. 핵산은 다른 관련된 핵산과 융합될 수 있거나, 재조합 DNA 기법(예를 들어, 돌연변이 유도 또는 기타 통상적인 기법)에 의해 변형되어 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가, 결실 또는 대체할 수 있다.

하나 이상의 상술한 CDR을 함유하는 본 발명에 따른 항체의 친화도를 향상시키는 것이 요구되는 경우, 이 같은 항체는, CDR의 유지(문헌[Yang et al., 1995, J. Mol. Biol., 254: 392~403]), 사슬 셔플링(chain shuffling)(문헌[Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10: 779~783]), 돌연변이 대장균 균주의 사용(문헌[Low et al., 1996, J. Mol. Biol., 250: 350~368]), DNA 셔플링(문헌[Patten et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 724~733]), 파지 디스플레이(phage display)(문헌[Thompson et al., 1996, J. Mol. Biol., 256: 7~88]) 및 부가적인 PCR 기법(문헌[Crameri et al., 1998, Nature, 391: 288~291])을 포함하는 다수의 친화도 성숙 프로토콜(affinity maturation protocol)에 의해 수득될 수 있다. 이들 방법 또는 친화도 성숙 모두는 문헌[Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535~539]에 논의되어 있다.

하나의 실시형태에서, ET_AR 항체의 단편이 본원에서 제공된다. 이 같은 단편은 완전 항체 유래 서열 또는 부가적인 서열을 포함할 수 있다. 항원 결합 단편의 예로는 Fab, F(ab')₂, 단일 사슬 항체, 다이아바디, 트리바디, 테트라바디 및 도메인 항체를 들 수 있다. 문헌[Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30: 500~06]에는 기타 예들이 제공된다.

단일 사슬 항체는 아미노산 가교(amino acid bridge; 짧은 펩티드 링커)를 통해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(Fv 영역) 단편을 연결함으로써 형성될 수 있으며, 그 결과 단일 폴리펩티드 사슬이 생성된다. 이 같은 단일 사슬 Fv(scFv)은 2개의 가변 도메인 폴리펩티드(V_L 및 V_H)를 암호화하는 DNA 사이에 펩티드 링커를 암호화하는 융합 DNA에 의해 제조되었다. 얻어진 폴리펩티드 자체는 뒤로 접혀서 항원 결합 단량체를 형성할 수 있거나, 이들은 2개의 가변 도메인 사이의 가요성 링커의 길이에 따라 다합체(예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체)를 형성할 수 있다(문헌[Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10: 423]; 문헌[Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 95~108]). 상이한 V_L 및 V_H 포함 폴리펩티드를 조합함으로써 상이한 에피토프에 결합하는 다합체성 scFv가 형성될 수 있다(문헌[Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 31~40]). 단일 사슬 항체의 생산을 위해 개발된 기법으로는 미국 특허 제4946778호; 문헌[Bird, 1988, Science 242: 423]; 문헌[Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879]; 문헌[Ward et al., 1989, Nature 334: 544]; 문헌[de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178: 379~87]에 개시된 것을 들 수 있다. 가변 도메인의 조합인 L1H1을 포함하는 scFv를 포함하지만 이에 제한되지 않은, 본원에서 제공되는 항체에서 유래하는 단일 사슬 항체가 본 발명에 포함된다.

또한 하나의 항체에서 유래하는 항체는, 예를 들어 항체의 단백질 가수분해, 예를 들어 통상적인 방법에 따라 전체 항체의 펩신(pepsin) 또는 파파인 분해에 의해 수득될 수 있다. 일례로서, 항체 단편은 F(ab')₂로 지칭되는 SS 단편을 제공하기 위해 펩신을 이용한 항체의 효소적 개열에 의해 생산될 수 있다. 이러한 단편은 3.5S Fab' 1가 단편을 생산하기 위해 티올 환원제를 이용하여 추가로 개열될 수 있다. 임의적으로는, 개열 반응은 이황화결합의 개열로 인해 생성되는 설프하이드릴기에 대한 차단기를 이용하여 수행될 수 있다. 대체 실시예로서, 파파인을 이용한 효소적 개열에 의해 2개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편이 직접 생산된다. 이들 방법은, 예를 들어 골든버그(Goldenberg)의 미국 특허 제 4331647호, 문헌[Nisonoffet et al., 1960, Arch. Biochem. Biophys. 89: 230]; 문헌[Porter, 1959, Biochem. J. 73: 119]; 문헌[Edelman et al., Methods in Enzymology 1: 422 (Academic Press 1967)]; 및 문헌[Andrews, S. M. and Titus, J. A. in Current Protocols in Immunology (Coligan J. E. , et al., eds), John Wiley & Sons, New York (2003), pages 2.8.1~2.8.10 and 2.10A.1~2.10A.5]에 개시되어 있다. 단편이 온전한 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 1가 경쇄-중쇄 단편(Fd)을 형성하기 위해 중쇄를 분리하고 단편을 추가로 개열하는 방법과 같은 항체를 개열하기 위한 기타 방법, 또는 기타 효소적, 화학적 또는 유전적 기법이 또한 사용될 수 있다.

다른 형태의 항체 단편은 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 펩티드이다. CDR은 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구축함으로써 수득될 수 있다. 이 같은 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 mRNA 또는 항체 생성 세포를 주형으로 사용하여 가변 영역을 합성하기 위해 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)을 이용함으로써 제조된다(예를 들어, 문헌[Larrick et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106]; 문헌[Courtenay-Luck, "(Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)]; 및 문헌[Ward el al., "Genetic Manipulation and Expression or Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995] 참고). 항체 단편은 본원에 개시된 항체의 적어도 하나의 가변 영역 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 V 영역 도메인은 단량체성일 수 있으며, 후술된 바와 같이 1 x 10^-7 M 이하의 친화도를 갖는 ET_AR에 결합하는 V_H 또는 V_L 도메인일 수 있다.

가변 영역 도메인은 임의의 자연적으로 발생하는 가변 도메인 또는 이의 유전자 조작 버전(engineered version)일 수 있다. 유전자 조작 버전은 재조합 DNA 조작 기법을 이용하여 생성되는 가변 영역 도메인을 의미한다. 이 같은 유전자 조작 버전으로는, 예를 들어 특정 항체의 아미노산 서열의 삽입, 결실 또는 변화에 의해 특정 항체 가변 영역으로부터 생성되는 것을 들 수 있다. 구체적인 예로는 제1 항체에서 유래하는 적어도 하나의 CDR 및 임의적으로는 하나 이상의 골격 아미노산 및 제2 항체로부터 유래하는 가변 영역 도메인의 나머지 부분을 함유하는 유전자 조작된 가변 영역 도메인을 포함한다.

가변 영역 도메인은 C-말단 아미노산에서 적어도 하나의 기타 항체 도메인 또는 이의 단편에 공유 결합될 수 있다. 따라서, 예를 들어 가변 영역 도메인에 존재하는 V_H 도메인은 면역 글로불린 C_H1 도메인 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 유사하게, V_L 도메인은 C_k 도메인 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어 항체는 Fab 단편일 수 있으며, 이때 항원 결합 도메인은 이들의 C 말단에서 C_H1 및 Cκ 도메인에 각각 공유 결합되는 연관된 V_H 및 V_L 도메인을 함유한다. C_H1 도메인은, 예를 들어 Fab' 단편에서 발견되는 바와 같은 힌지 영역 또는 힌지 영역 도메인의 일부분을 제공하거나 항체 C_H2 및 C_H3 도메인과 같은 추가의 도메인을 제공하기 위해 추가의 아미노산으로 확장될 수 있다.

항체의 유도체 및 변이체

A-1의 상응하는 아미노산 서열을 암호화하는 L1 및 H1의 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 랜덤 돌연변이 유발(random mutagenesis) 또는 부위 지정 돌연변이 유발(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 지정 부위 특이적 돌연변이 유발)에 의해 변경되어, 돌연변이되지 않은 폴리뉴클레오티드와 비교하여 하나 이상의 특정 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 변경된 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 이 같은 변경을 수행하기 위한 기법의 예는 문헌[Walder et al., 1986, Gene 42: 133]; 문헌[Bauer et al., 1985, Gene 37: 73]; 문헌[Craik, 1985, BioTechniques, 3: 12~19]; 문헌[Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press]; 미국 특허 제4518584호 및 제4737462호에 개시되어 있다. 이들 및 기타 방법은, 예를 들어 친화도, 결합도(avidity) 또는 엔도텔린 수용체에 대한 특이성의 증가 또는 생체 내 또는 시험관 내 안정성의 증가, 또는 비유도성 항체에 비교하여 생체 내 부작용의 감소와 같은 목적하는 특성을 갖는 항-엔도텔린 A 수용체 항체의 유도체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 범주 내에 있는 항-엔도텔린 수용체 항체의 기타 유도체는 공유결합성 또는 응집성 접합체 또는 항-엔도텔린 수용체 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 이때 발현 또는 재조합 융합 단백질과 같은 기타 단백질 또는 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단에 융합되는 이종성 폴리펩티드 또는 항-엔도텔린 수용체 항체 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 접합된 펩티드는 이종성 신호(또는 리더(leader)) 폴리펩티드, 예를 들어 효모 알파-인자 리더(alpha-factor leader) 또는 펩티드(예를 들어, 에피토프 태그(tag))일 수 있다. 융합 단백질을 함유하는 항체는 항원 결합 단백질(예를 들어, 폴리-His)의 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위해 부가되는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한 항체는 문헌[Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6: 1204] 및 미국 특허 제5011912호에 개시되어 있는 바와 같이 FLAG 펩티드에 연결될 수 있다. FLAG 펩티드는 고도로 항원성이며, 특정한 단클론성 항체(mAb)에 의해 가역적으로 결합되는 에피토프를 제공하여, 발현된 재조합 단백질의 신속한 검정 및 용이한 정제를 가능케 한다. FLAG 펩티드가 소정의 폴리펩티드에 융합되어 있는 융합 단백질을 제조하는데 유용한 시약은 시판되고 있다(미주리주 세인트루이스 소재의 시그마(Sigma)). 다른 실시형태에서, 하나 이상의 항체를 함유하는 올리고머는 엔도텔린 수용체 길항제로서 이용될 수 있다. 올리고머는 공유 결합 또는 비공유 결합된 이량체, 삼량체 또는 고등 올리고머의 형태일 수 있다. 2개 이상의 항체를 포함하는 올리고머가 사용 목적으로 고려되며, 이때 일례가 동종 이량체이다. 기타 올리고머로는 이종 이량체, 동종 삼량체, 이종 삼량체, 동종 사량체, 이종 사량체 등을 들 수 있다.

하나의 실시형태는 항체에 융합된 펩티드 모이어티 사이의 공유결합 또는 비공유결합적 상호 작용을 통해 연결되는 다중 항체를 포함하는 올리고머에 관한 것이다. 이 같은 펩티드는 펩티드 링커(스페이서(spacer))일 수 있거나, 올리고머화를 용이하게 하는 특성을 갖는 펩티드일 수 있다. 하기에 보다 상세하게 개시된 바와 같이, 여기에 부착되는 항체의 올리고머화를 용이하게 할 수 있는 펩티드 중에는 항체에서 유래하는 류신 지퍼 및 특정 폴리펩티드가 있다.

특정한 실시형태에서, 올리고머는 2개 내지 4개의 항체를 포함한다. 올리고머의 항체는 상술한 임의의 형태, 예를 들어 변이체 또는 단편과 같은 임의의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 올리고머는 엔도텔린 수용체 결합 활성을 갖는 항체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 올리고머는 면역 글로불린에서 유래하는 폴리펩티드를 사용하여 제조된다. 항체 유래 폴리펩티드의 다양한 부분(Fc 도메인을 포함함)에 융합되는 특정한 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들어 문헌[Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535]; 문헌[Byrn et al., 1990, Nature 344: 677]; 및 문헌[Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1~10.19.11]에 개시되어 있다. 본원에서 제공되는 하나의 실시형태는 항-엔도텔린 A 수용체 항체의 엔도텔린 수용체 결합 단편을 항체의 Fc 영역에 융합시킴으로써 생성되는 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체에 관한 것이다. 이량체는, 예를 들어 융합 단백질을 암호화하는 유전자 융합체를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에서 유전자 융합체를 발현하고, 발현된 융합 단백질이 항체 분자와 매우 유사하게 조립하도록 함으로써 제조될 수 있으며, 그 결과 Fc 모이어티 사이에 사슬간 이황화 결합이 형성되어 이량체를 형성한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "Fc 폴리펩티드"란 용어는 항체의 Fc 영역에서 유래하는 폴리펩티드의 천연 및 뮤테인 형태를 포함한다. 이량체화를 용이하게 하는 힌지 영역을 함유하는 이 같은 폴리펩티드의 절단된 형태(truncated form)가 또한 포함된다. Fc 모이어티(및 이로부터 형성되는 올리고머)를 포함하는 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 상의 친화도 크로마토그래피에 의해 용이하게 정제된다는 이점을 제공한다.

PCT 출원 제WO 93/10151호(본원에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있는 하나의 적합한 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG1 항체의 N-말단 힌지 영역에서 Fc 영역의 천연 C-말단까지 확장되어 있는 단일 사슬 폴리펩티드이다. 다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 미국 특허 제5457035호 및 문헌[Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992~4001]에 개시되어 있는 Fc 뮤테인이다. 19번째 아미노산이 Leu에서 Ala로 변경되고, 20번째 아미노산이 Leu에서 Glu로 변경되고, 22번째 아미노산이 Gly에서 Ala로 변경되었다는 것을 제외하고, 이러한 뮤테인의 아미노산 서열은 WO 93/10151에서 제시된 천연 Fc 서열의 아미노산 서열과 동일하다. 뮤테인은 Fc 수용체에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 기타 실시형태에서, 항-엔도텔린 수용체 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분은 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분으로 치환될 수 있다.

대안적으로, 올리고머는 펩티드 링커(스페이서 펩티드)가 존재 또는 부재하는 다중 항체를 포함하는 융합 단백질이다. 적합한 펩티드 링커 중에는 미국 특허 제4751180호 및 제4935233호에 개시된 펩티드 링커가 있다.

올리고머성 항체를 제조하기 위한 다른 방법은 류신 지퍼의 사용을 포함한다. 류신 지퍼 도메인은 이들이 발견되는 단백질의 올리고머화를 용이하게 하는 펩티드이다. 류신 지퍼는 몇몇 DNA 결합 단백질에서 최초로 확인되었으며(문헌[Landschulz et al., 1988, Science 240: 1759]), 그 이후로 다양한 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지된 류신 지퍼 중에는 이량화 또는 삼량화되는 자연적으로 발생하는 펩티드 및 이의 유도체가 있다. 용해성 올리고머성 단백질을 생산하는데 적합한 류신 지퍼 도메인의 예는 PCT 출원 제WO 94/10308호에 개시되어 있으며, 폐 계면 활성제 단백질 D(SPD)에서 유래하는 류신 지퍼는 본원에서 참고로 포함되는 문헌[Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344: 191]에 개시되어 있다. 여기에 융합된 이종성 단백질의 안정된 삼량체화를 허용하는 변형된 류신 지퍼의 용도는 문헌[Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267~78]에 개시되어 있다. 하나의 방법에서, 류신 지퍼 펩티드에 융합되는 항-엔도텔린 수용체 항체 단편 또는 유도체를 포함하는 재조합 융합 단백질은 적합한 숙주 세포에서 발현되고, 형성되는 용해성 올리고머성 항-엔도텔린 수용체 항체 단편 또는 유도체는 배양 상층액으로부터 회수된다.

다른 실시형태에서, 항체 유도체는 본원에 개시된 적어도 하나의 CDR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 CDR은 공지된 항체 골격 영역(IgG1, IgG2 등) 내로 통합될 수 있거나, 이의 반감기를 향상시키기 위해 적합한 비히클(vehicle)에 접합될 수 있다. 적합한 비히클로는 Fc, 알부민, 트랜스페린(transferrin) 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 및 기타 적합한 비히클은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이 같은 접합된 CDR 펩티드는 단량체, 이량체, 사량체 또는 기타 형태일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 결합제의 하나 이상의 특정 위치, 예를 들어 아미노 말단에서 결합된다. 일 실시예에서, 항체 유도체는 하나 이상의 수용성 중합체 부착물을 포함하며, 이때 상기 부착물로는 폴리에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌글리콜 또는 폴리프로필렌글리콜을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 제4640835호, 제4496689호, 제4301144호, 제4670417호, 제4791192호 및 제4179337호를 참고한다. 특정 실시형태에서, 유도체는 모노메톡시-폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 기타 탄수화물 기반 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌옥시드/에틸렌옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐알콜뿐만 아니라 이 같은 중합체의 혼합물 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 하나 이상의 곁사슬에 랜덤하게 부착된다. 특정 실시형태에서, PEG은 항체와 같은 결합제에 대한 치료 능력을 개선시키는 작용을 할 수 있다. 이 같은 특정 방법은, 예를 들어 모든 면에서 본원에서 참고로 포함되는 미국 특허 제6133426호에 논의되어 있다.

본원에서 제공되는 항체는 적어도 하나의 아미노산 치환을 가질 수 있으며, 그 결과 항체는 결합 특이성을 보유하게 된다는 것을 인지할 것이다. 따라서 항체 구조에 대한 변형이 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이들은 보존적 또는 비보존적일 수 있는 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 아미노산 치환은 항체의 인간 엔도텔린 수용체 결합 능력을 손상시키지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 생물 시스템에서의 합성이 아닌 화학적 펩티드 합성에 의해 전형적으로 통합되는 비자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이들은 단백질 모방체(peptidomimetic) 및 기타 역전 또는 반전된 형태의 아미노산 모이어티를 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 또한 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 미치는 영향이 거의 없도록 규범 잔기에 의한 천연 아미노산 잔기의 치환을 포함할 수 있다. 비보존적 치환은 아미노산 또는 아미노산 모방체의 하나의 부류의 멤버를 상이한 물리적 특성(예를 들어, 크기, 극성, 소수성, 전하)을 갖는 다른 부류의 멤버로 교환하는 것을 포함할 수 있다.

게다가, 당업자라면 각각의 목적하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험될 변이체를 생성할 수 있다. 이이서 변이체는 당업자에게 공지된 활성 검정을 이용하여 선별될 수 있다. 적합한 변이체에 관한 정보를 수집하기 위해 이 같은 변이체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 당업자가 특정한 아미노산 잔기에 대한 변경이 활성의 파괴, 바람직하지 않은 감소 또는 부적합한 활성을 초래한다는 것을 발견한 경우, 이 같은 변경을 나타내는 변이체를 피할 수 있다. 즉, 이 같은 통상의 실험으로부터 수집되는 정보에 기초하여 당업자는 추가적인 치환을 단독으로 또는 기타 돌연변이와 함께 피해야 하는 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.

당업자라면 널리 공지된 기법을 이용하여 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 특정 실시형태에서, 당업자라면 활성에 중요하지 않는 영역을 표적화함으로써 활성을 손상시키지 않으면서 변경될 수 있는 분자의 적합한 영역을 확인할 수 있다. 특정 실시형태에서, 당업자는 유사한 폴리펩티드들 중에서 보존되어 있는 분자의 잔기 또는 일부분을 확인할 수 있다. 특정 실시형태에서, 심지어 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역에도 생물학적 활성을 손상시키지 않거나 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환이 적용될 수 있다. 더욱이, 당업자라면 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드 내의 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 이 같은 비교를 고려하여, 당업자는 유사한 단백질에서의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 단백질에서의 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자라면 이 같이 중요하고 예상된 아미노산 잔기에 대한 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.

또한 당업자라면 유사한 폴리펩티드 내의 이러한 구조와 관련하여 3차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 이 같은 정보를 고려하여, 당업자라면 이의 3차원 구조에 대한 항체의 아미노산 잔기의 배열을 예측할 수 있다. 특정 실시형태에서, 당업자라면 이 같은 잔기가 기타 분자와의 중요한 상호 작용과 관련이 있을 수 있기 때문에 단백질의 표면 상에 있는 것으로 예측되는 아미노산 잔기에 대한 근본적인 변경을 할 수 없도록 선택할 수 있다. 다수의 과학 간행물은 이차 구조의 예측에 기여하였다. 문헌[Moult, 1996, Curr. Op. Biotech. 7: 422~427]; 문헌[Chou et al., 1974, Biochemistry 13: 222~245]; 문헌[Chou et al., 1974, Biochemistry 113: 211~222]; 문헌[Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47: 45~148]; 문헌[Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47: 251~276] 및 문헌[Chou et al., Biophys. J. 26: 367~384]을 참고한다. 게다가, 이차 구조를 예측하는 것을 돕기 위해 현재 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 예를 들어, 30% 초과의 서열 동일성 또는 40% 초과의 유사성을 갖는 2개의 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 위상(structural topology)을 갖는다. 단백질 구조 데이터베이스(PDB)의 최근 성장으로 인해 폴리펩티드 또는 단백질의 구조 내의 잠재적인 접힘 개수를 포함하는 이차 구조의 향상된 예측 가능성이 제공되었다. 문헌[Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27: 244~247]을 참고한다. 소정의 폴리펩티드 또는 단백질에서 접힘 개수가 제한되며, 일단 구조의 임계 개수가 결정되면 구조적 예측이 훨씬 더 정확하게 될 수 있는 것으로 제안되어 왔다(문헌[Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7: 369~376]).

이차 구조를 예측하는 부가적인 방법으로는 "쓰레딩(threading)"(문헌[Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 377~87]; 문헌[Sippl et al., 1996, Structure 4: 15~19]), "프로파일 분석"(문헌[Bowie et al., 1991, Science 253: 164~170]; 문헌[Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183: 146~159]; 문헌[Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 4355~4358]) 및 "진화적 연계(evolutionary linkage)"(문헌[Holm, supra (1999), and Brenner, supra (1997)] 참고)를 들 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체의 변이체로는 글리코실화 변이체를 들 수 있으며, 이때 글리코실화 부위의 개수 및/또는 유형은 모 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 변경되어 있다. 특정 실시형태에서, 변이체는 천연 단백질보다 많거나 적은 개수의 N-결합 글리코실화 부위를 포함한다. 대안적으로, 치환에 의한 이 같은 서열의 제거에 의해 기존의 N-결합 탄수화물 사슬이 제거된다. N-결합 탄수화물 사슬의 재배열이 또한 제공되며, 이때 하나 이상의 N-결합 글리코실화 부위(전형적으로 자연적으로 발생하는 부위)가 제거되거나, 하나 이상의 새로운 N-결합 부위가 생성된다. 부가적인 바람직한 항체 변이체는 시스테인 변이체를 포함하며, 이때 하나 이상의 시스테인 잔기는 모 아미노산 서열로부터 결실되거나, 모 아미노산 서열과 비교하여 다른 아미노산(예를 들어, 세린)으로 치환될 수 있다. 시스테인 변이체는 항체가 불용성 봉입체(inclusion body)의 단리 이후와 같이 생물학적 활성 형태 내로 다시 접혀야 하는 경우에 유용할 수 있다. 시스테인 변이체는 일반적으로 천연 단백질보다 적은 시스테인 잔기를 가지며, 전형적으로는 쌍을 이루지 않은 시스테인으로부터 유래하는 상호 작용을 최소화하기 위해 짝수를 갖는다.

목적하는 아미노산 치환(보존적 또는 비보존적 치환인지 여부와는 무관함)은 이 같은 치환이 요구될 때 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 인간 엔도텔린 수용체에 대한 항체의 중요한 잔기를 확인하기 위해 사용될 수 있거나, 본원에 개시된 인간 엔도텔린 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시형태에 따르면, 바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 민감성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하고/하거나, (5) 이 같은 폴리펩티드에 기타 물리 화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형하는 치환이다. 특정 실시형태에 따르면, 단일 또는 다중 아미노산 치환(특정 실시형태에서 보존적 아미노산 치환)은 자연적으로 발생하는 서열(특정 실시형태에서 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부에 있는 폴리펩티드의 일부)에서 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 전형적으로는 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변경시키지 못한다(예를 들어, 아미노산의 대체는 모 서열에서 발생하는 나선을 절단하지 않거나, 모 서열을 특성화하는 기타 유형의 이차 구조를 파괴하지 않을 것이다). 당업계에서 인식되는 폴리펩티드 이차 및 삼차 구조의 예는 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; 문헌[Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, Eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 문헌[Thornton et al., 1991, Nature 354: 105]에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에서 참고로 포함된다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 중합체, 지질 또는 기타 모이어티와 화학적으로 결합될 수 있다.

항원 결합제는 생체 적합성 골격 구조 내로 통합되는 본원에 개시된 적어도 하나의 CDR을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 생체 적합성 골격 구조는 형태적으로 안정된 구조 지지체 또는 골격, 또는 국부화된 표면 영역에서 항원에 결합하는 아미노산(예를 들어, CDR, 가변 영역 등)의 하나 이상의 서열을 제시할 수 있는 스캐폴드를 형성하기에 충분한 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 포함한다. 이 같은 구조는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 "접힘"(구조적 모티프(motif))일 수 있거나, 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 접힘에 대해 아미노산의 부가, 결실 또는 치환과 같은 하나 이상의 변형을 가질 수 있다. 이들 스캐폴드는 인간, 기타 포유동물, 기타 척추동물, 무척추동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스와 같은 임의의 종(또는 하나 초과의 종)의 폴리펩티드에서 유래할 수 있다.

전형적으로, 생체 적합성 골격 구조는 면역 글로불린 도메인이 아닌 단백질 스캐폴드 또는 뼈대에 기반을 두고 있다. 예를 들어, 피브로넥틴, 안키린(ankyrin), 리포칼린(lipocalin), 네오카르지노스타인(neocarzinostain), 시토크롬 b, CP1 징크 핑거(zinc finger), PST1, 이중 코일(coiled coil), LACI-D1, Z 도메인 및 텐다미스타트(tendamistat) 도메인 기반의 골격 구조가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology 7: 463~469] 참고).

더욱이, 당업자라면 적합한 결합제가 본원에 구체적으로 개시된 바와 같은 하나 이상 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3과 같은 이들 항체의 일부분을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1, CDR2 및 CDR3의 영역들 중 적어도 하나는 적어도 하나의 아미노산 치환을 가질 수 있으며, 단 항체는 치환되지 않은 CDR의 결합 특이성을 보유한다. 항체의 비-CDR 부분은 비단백질 분자일 수 있으며, 이때 결합제는 인간 엔도텔린 수용체에 대한 본원에 개시된 항체의 결합을 교차 차단하고/하거나, 수용체를 통한 엔도텔린-1 신호전달 활성을 억제한다. 항체의 비-CDR 부분은 항체가 항체 A1/A2 중 적어도 하나에 의해 나타나는 바와 같이 경쟁 결합 검정에서 인간 엔도텔린 수용체 펩티드에 대한 유사한 결합 패턴을 나타내고/내거나, 엔도텔린-1의 활성을 중화시키는 비단백질 분자일 수 있다. 항체의 비-CDR 부분은 아미노산으로 구성될 수 있으며, 이때 항체는 재조합 결합 단백질 또는 합성 펩티드이며, 재조합 결합 단백질은 인간 ET_AR에 대한 본원에 개시된 항체의 결합을 교차 차단하고/하거나, 시험관 내 또는 생체 내에서 엔도텔린-1 활성을 중화시킨다. 항체의 비-CDR 부분은 아미노산으로 구성될 수 있으며, 이때 항체는 재조합 항체이며, 재조합 항체는 항체 A1/A2 중 적어도 하나에 의해 나타나는 바와 같이 경쟁 결합 검정에서 인간 ET_AR 펩티드에 대한 유사한 결합 패턴을 나타내고/내거나, 엔도텔린-1 신호전달을 중화시킨다.

핵산

하나의 양태에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 핵산은, 예를 들어 항체 전체 또는 일부분, 예를 들어 본 발명의 항체의 하나 또는 2개의 사슬을 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 유도체, 뮤테인 또는 변이체; 혼성화 탐침으로서 사용하기에 충분한 폴리뉴클레오티드; 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 확인, 분석, 돌연변이 또는 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 또는 서열 분석 프라이머; 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하기 위한 안티센스 핵산 및 이의 상보적인 서열을 포함한다. 핵산은 임의의 길이를 가질 수 있다. 이들은, 예를 들어 뉴클레오티드의 길이가 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상, 175개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 500개 이상, 750개 이상, 1,000개 이상, 1,500개 이상, 3,000개 이상, 5,000개 이상일 수 있고/있거나, 하나 이상의 부가적인 서열, 예를 들어 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 보다 큰 핵산, 예를 들어 벡터의 일부일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, RNA 및/또는 DNA 뉴클레오티드 및 이의 인공 변이체(예를 들어, 펩티드 핵산)를 포함할 수 있다.

항체 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄, 가변 도메인 단독 또는 전장)를 암호화하는 핵산은 ET_AR 항원으로 면역화되어 있는 마우스의 B세포로부터 단리될 수 있다. 핵산은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 통상적인 절차에 의해 단리될 수 있다.

중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열이 상기에 나타나 있다. 당업자라면 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 본원에 개시된 폴리펩티드 서열 각각이 다량의 기타 핵산 서열에 의해 암호화된다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 본 발명의 각각의 항체를 암호화하는 축퇴성 뉴클레오티드 서열 각각을 제공한다.

본 발명은 특정한 혼성화 조건 하에 기타 핵산(예를 들어, 임의의 A-1/A-2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산)에 혼성화되는 핵산을 추가로 제공한다. 핵산을 혼성화하기 위한 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1~6.3.6]을 참고한다. 본원에 정의된 바와 같이, 예를 들어 적당히 엄격한 혼성화 조건에서는 5x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)을 함유하는 예비 세척 용액, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0), 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충제, 6x SSC 및 55℃의 혼성화 온도(또는 42℃의 혼성화 온도와 함께 약 50% 포름아미드를 함유하는 혼성화 용액과 같은 기타 유사한 혼성화 용액)가 사용되며, 0.5x SSC, 0.1% SDS에서 60℃의 세척 조건이 사용된다. 엄격한 혼성화 조건에서는 45℃에서 6x SSC에서 혼성화한 후, 68℃에서 0.1x SSC, 0.2% SDS에서 1회 이상 세척한다. 더욱이, 당업자라면, 서로에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 전형적으로 서로 혼성화된 상태로 유지되도록 혼성화 엄격성을 증가 또는 감소시키기 위해 혼성화 및/또는 세척 조건을 조작할 수 있다. 혼성화 조건의 선택 및 적합한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본적인 매개변수는, 예를 들어 샘브룩(Sambrook), 프릿츠(Fritsch) 및 마니아티스(Maniatis)(문헌[1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11]; 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3~6.4])에 의해 개시되어 있으며, 예를 들어 DNA의 길이 및/또는 염기 조성에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 변경은 돌연변이에 의해 핵산 내로 도입될 수 있으며, 이로 인해 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드(예를 들어, 항체)의 아미노산 서열에서의 변경을 초래한다. 돌연변이는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기법을 이용하여 도입될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 특정 아미노산 잔기는, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발 프로토콜을 이용하여 변경된다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 랜덤하게 선택된 잔기는, 예를 들어 랜덤 돌연변이 유발 프로토콜을 이용하여 변경된다. 변경이 어떻게 이루어지든 간에, 돌연변이 폴리펩티드는 목적하는 특성을 얻기 위해 발현되고 선별될 수 있다.

돌연변이는 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유의하게 변경하지 않으면서 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 비필수 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 초래하는 뉴클레오티드를 치환할 수 있다. 하나의 실시형태에서, L1 내지 L2 및 H1 내지 H2 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 대해 본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열은 이들이 L1 내지 L2 및 H1 내지 H2에 대해 본원에서 제공되는 아미노산 서열을 암호화하도록 돌연변이되며, 이때 이들은 2개 이상의 상이한 아미노산 잔기를 보유하는 서열을 야기하기 위해 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실 또는 치환을 포함한다. 다른 실시형태에서, 돌연변이 유발은 2개 이상의 상이한 아미노산 잔기를 갖는 서열을 야기하기 위해 L1 내지 L2 및 H1 내지 H2에 대해 본원에 나타나 있는 하나 이상의 아미노산 잔기에 인접하게 아미노산을 삽입한다. 대안적으로, 하나 이상의 돌연변이는 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성(예를 들어, ET_AR에 대한 결합)을 선택적으로 변경하는 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 생물학적 활성을 정량적 또는 정성적으로 변경할 수 있다. 정량적 변경의 예로는 활성의 증가, 감소 도는 제거를 들 수 있다. 정성적 변경의 예로는 항체의 항원 특이성의 변경을 들 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열의 검출을 위한 프라이머 또는 혼성화 탐침로서 사용하기에 적합한 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 전장 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 일부, 예를 들어 탐침 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 단편, 또는 본 발명의 폴리펩티드의 활성 부분(예를 들어, ET_AR 결합 부분)을 암호화하는 단편만을 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산의 서열에 기초한 탐침은 핵산 또는 유사한 핵산, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 전사체(transcript)를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 탐침은 표지 그룹, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자를 포함할 수 있다. 이 같은 탐침은 폴리펩티드를 발현하는 세포을 확인하기 위해 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 본원에서 제공되는 벡터는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산을 포함한다. 벡터의 예로는 플라스미드, 바이러스 벡터, 비에피솜성 포유동물 벡터 및 발현 벡터, 예를 들어 재조합 발현 벡터를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 제공되는 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 핵산의 발현에 적합한 형태인 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 발현용으로 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택되는 하나 이상의 조절 서열을 포함하며, 이때 상기 조절 서열은 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 조절 서열로는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 조절 서열(예를 들어, SV40 초기 유전자 인핸서, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터 및 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터), 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 조절 서열(예를 들어, 조직 특이적 조절 서열(문헌[Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11: 287], 문헌[Maniatis et al., 1987, Science 236: 1237]을 참고하며, 이들 각각의 전문은 그 전체가 본원에서 참고로 포함됨)), 및 특정 처리 또는 조건에 반응하여 뉴클레오티드 서열의 유도성 발현을 지시하는 조절 서열(예를 들어, 포유동물 세포 내의 메탈로티오닌(metallothionin) 프로모터 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 모두에서의 tet-반응성 및/또는 스트렙토마이신 반응성 프로모터(동일 참조))을 들 수 있다. 발현 벡터의 설계는 형질 전환될 숙주 세포의 선택, 요구되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 본원에 개시된 바와 같은 핵산에 의해 암호화되는 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 원핵 숙주 세포는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 대장균 또는 바실루스(Bacillus)를 포함한다. 고등 진핵 세포는 곤충 세포, 효모 세포 및 포유동물 기원의 확립 세포주를 포함한다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 무혈청 배지에서 성장하는 Veggie CHO 및 관련 세포주와 같은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 이들의 유도체(문헌[Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31] 참고), 또는 DHFR이 결핍되어 있는 CHO 균주 DXB-11(문헌[Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216~20])을 들 수 있다. 부가적인 CHO 세포주로는 CHO-K1(ATCC#CCL-61), EM9(ATCC# CRL-1861) 및 W20(ATCC# CRL-1862)을 들 수 있다. 부가적인 숙주 세포로는 COS-7 원숭이 신장 세포주(ATCC# CRL-1651)(문헌[Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175] 참고), L 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL-163), AM-1/D 세포(미국 특허 제6210924호에 개시되어 있음), HeLa 세포, BHK(ATCC CRL-10) 세포주, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CV1(ATCC CCL-70)에서 유래하는 CV1/EBNA 세포주(문헌[McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821] 참고), 인간 배아 신장 세포(예를 들어, 293, 293 EBNA 또는 MSR 293), 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 기타 형질 전환된 영장류 세포주, 정상 2배체 세포, 1차 조직의 시험관 내 배양에서 유래하는 세포 균주, 일차 절편체(primary explant), HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포를 들 수 있다. 박테리아, 균류, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 포웰스(Pouwels) 등(문헌[Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985])에 의해 개시되어 있다.

벡터 DNA는 통상적인 형질 전환 또는 형질 감염 기법을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 포유동물 세포의 안정된 형질 감염을 위해, 사용되는 발현 벡터 및 형질 감염 기법에 따라 세포의 작은 분획만이 외래 DNA를 이들의 게놈 내로 통합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이들 통합체(integrant)를 확인하고 선별하기 위해, (예를 들어, 항생제에 대한 내성을 위해) 선택 마커를 암호화하는 유전자는 일반적으로 관심 있는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직한 선택 마커로는 G418, 히그로마이신(hygromycin) 및 메토트렉세이트(methotrexate)과 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 선택 마커를 들 수 있다. 도입된 핵산에 의해 안정하게 형질 감염되는 세포는 여러 방법들 중에서도 특히 약물 선택(예를 들어, 선택 마커 유전자가 통합되어 있는 세포는 생존하는 반면, 기타 세포는 사멸할 것임)에 의해 확인될 수 있다.

형질 전환된 세포는 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하는 조건 하에 배양될 수 있으며, 이때 상기 폴리펩티드는 통상적인 단백질 정제 절차에 의해 회수된다. 이 같은 하나의 정제 절차는 하기 실시예에 개시되어 있다. 본원에서 사용하기 위해 고려되는 폴리펩티드는 실질적으로 균질한 재조합 포유동물 항-엔도텔린 수용체 항체 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드에는 내생성 오염 물질이 실질적으로는 존재하지 않는다.

항체의 활성

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 엔도텔린 수용체에 특이적으로 결합하고, 신호 전달(signaling transduction)을 억제하고, 치료적 생물학적 효과, 예를 들어 동물 모델에서 폐동맥 고혈압의 약화를 증명한다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 마우스 또는 인간화 항체는 인간 엔도텔린 수용체에 특이적으로 결합한다. 이 같은 항체로는 엔도텔린 신호전달을 감소 또는 중화시키는 길항성 또는 중화 항체를 들 수 있다.

하나의 실시형태에서, 인간 엔도텔린 수용체 ET_AR에 결합하는 본원에서 제공되는 항체의 K_d는 대략 0.01 nM 내지 1000 nM, 0.1 nM 내지 500 nM, 0.5 nM 내지 200 nM, 1 nM 내지 200 nM, 또는 10 nM 내지 100 nM 범위이다. 다른 실시형태에서, 인간 엔도텔린 수용체 ET_AR에 결합하는 본원에서 제공되는 항체의 K_d는 대략 1 nM 내지 200 nM이다. 또 다른 실시형태에서, 인간 엔도텔린 수용체 ET_AR에 결합하는 본원에서 제공되는 항체의 K_d는 대략 10 nM 내지 100 nM이다. 또 다른 실시형태에서, 인간 엔도텔린 수용체 ET_AR에 결합하는 본원에서 제공되는 항체의 K_d는 대략 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM 또는 100 nM이다.

하나의 실시형태에서, 엔도텔린 신호전달에 대해 길항 작용하는 본원에서 제공되는 항체의 IC₅₀은 대략 0.01 nM 내지 500 nM, 0.1 nM 내지 200 nM, 0.5 nM 내지 200 nM, 1 nM 내지 200 nM, 또는 10 nM 내지 100 nM 범위이다. 다른 실시형태에서, 엔도텔린 신호전달에 대해 길항 작용하는 본원에서 제공되는 항체의 IC₅₀은 대략 1 nM 내지 200 nM이다. 또 다른 실시형태에서, 엔도텔린 신호전달에 대해 길항 작용하는 본원에서 제공되는 항체의 IC₅₀은 대략 10 nM 내지 100 nM이다. 또 다른 실시형태에서, 엔도텔린 신호전달에 대해 길항 작용하는 본원에서 제공되는 항체의 IC₅₀은 대략 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM 또는 100 nM이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항체는 하나 이상의 하기 특성을 갖는 인간 엔도텔린 수용체 ET_AR에 특이적으로 결합한다:

a. 인간 엔도텔린 수용체 ET_AR에 결합할 때 기준 항체와 동일한 K_d를 갖고;

b. 엔도텔린에 의해 활성화되는 인간 엔도텔린 수용체 ET_AR에 대해 길항 작용할 때 기준 항체와 동일한 IC₅₀을 갖고;

c. 인간 엔도텔린 수용체 ET_AR에 대한 기준 항체와 상호 경쟁 결합한다.

하나의 양태에서, 기준 항체는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 138) 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 166)의 조합을 포함한다. 다른 양태에서, 기준 항체는 단클론성 항체 A-1, A-2, A-7, A-9 또는 A-12이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 유사한"이란 용어는 기준 항체의 IC₅₀ 또는 K_b(또는 K_d)에 필적하거나 대략 100%, 99%, 98%, 97%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% 또는 50% 동일하다는 것을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 기준 항체는, 예를 들어 중쇄 및 경쇄 조합인 L1H1 또는 L2H2를 포함하는 항체이다. 다른 실시형태에서, 기준 항체는 A-1을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체는 인간 엔도텔린 수용체에 특이적으로 결합할 수 있고, 동물 모델에서 폐동맥 고혈압을 저하시킬 수 있다. 하나의 실시형태에서, 폐동맥 고혈압은 치료가 없는 동물과 비교하여 약 2% 정도 저하된다. 다른 실시형태에서, 폐동맥 고혈압은 치료가 없는 동물과 비교하여 약 5% 정도 저하된다. 또 다른 실시형태에서, 폐동맥압은 치료가 없는 동물과 비교하여 약 10% 정도 저하된다. 또 다른 실시형태에서, 폐동맥 고혈압은 치료가 없는 동물과 비교하여 약 15% 정도 저하된다. 또 다른 실시형태에서, 폐동맥 고혈압은 치료가 없는 동물과 비교하여 약 20% 정도 저하된다. 또 다른 실시형태에서, 폐동맥 고혈압은 치료가 없는 동물과 비교하여 약 25% 정도 저하된다. 폐동맥 고혈압의 감소량은 복용량에 의해 제어된다. 치료적 유효 복용량은 동물 또는 인간 환자에 있어서 폐동맥 고혈압을 정상 범위 내로 감소시키기 위해 요구되는 복용량이다.

약학 조성물

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 약학 조성물은 본원에서 제공되는 ET_AR 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형이 본원에서 제공된다. ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 안정하며, 생체 내에서 보다 긴 반감기로 인해 효율적이며, 폐동맥 고혈압 및 관련 질병 및 생식 기관 암을 효과적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 본원에서 제공되는 ET_AR 항체 및 완충제를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형의 pH는 대략 4 내지 11, 5 내지 7 또는 5 내지 6 범위이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형 pH는 대략 5 내지 7이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형의 pH는 대략 5 내지 6이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형의 pH는 대략 5.3 내지 6.5이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형의 pH는 약 5.8이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 농도는 대략 10 내지 500 ㎎/㎖, 10 내지 250 ㎎/㎖, 10 내지 200 ㎎/㎖, 또는 10 내지 100 ㎎/㎖ 범위이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 농도는 대략 10 ㎎/㎖, 15 ㎎/㎖, 20 ㎎/㎖, 25 ㎎/㎖, 30 ㎎/㎖, 35 ㎎/㎖, 40 ㎎/㎖, 45 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖, 55 ㎎/㎖, 60 ㎎/㎖, 65 ㎎/㎖, 70 ㎎/㎖, 75 ㎎/㎖, 80 ㎎/㎖, 85 ㎎/㎖, 90 ㎎/㎖, 95 ㎎/㎖ 또는 100 ㎎/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 농도는 대략 110 ㎎/㎖, 120 ㎎/㎖, 130 ㎎/㎖, 140 ㎎/㎖, 150 ㎎/㎖, 160 ㎎/㎖, 170 ㎎/㎖, 180 ㎎/㎖, 190 ㎎/㎖ 또는 200 ㎎/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 농도는 대략 25 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖, 75 ㎎/㎖ 또는 100 ㎎/㎖이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 완충제의 농도는 대략 1 mM 내지 200 mM, 2 mM 내지 50 mM 또는 5 mM 내지 25 mM 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 완충제의 농도는 대략 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 또는 50 mM이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 완충제의 농도는 대략 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM 또는 30 mM이다.

하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 완충제는 시트르산, 시트르산의 염, 아스코르브산, 아스코르브산의 염, 글루콘산, 글루콘산의 염, 탄산, 탄산의 염, 타르타르산, 타르타르산의 염, 숙신산, 숙신산의 염, 아세트산, 아세트산의 염, 프탈산, 프탈산의 염, 인산, 인산의 염, 염산, 트리스, 트로메타민(tromethamine) 및 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 완충제는 시트르산의 염이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 완충제는 시트르산나트륨이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 완충제는 히스티딘이다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형은 또한 계면 활성제를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 계면 활성제의 농도는 대략 0.001 내지 1 중량/부피%, 0.01 내지 0.5 중량/부피%, 또는 0.01 내지 0.1 중량/부피% 범위이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 계면 활성제의 농도는 대략 0.01 내지 0.1 중량/부피%이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 계면 활성제의 농도는 대략 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 또는 0.1 중량/부피%이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 계면 활성제의 농도는 대략 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 또는 0.06 중량/부피%이다.

하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 계면 활성제는 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자 오일, 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체, 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드, C10~C18 알킬 설페이트, 평균 2 내지 4몰의 옥시란기가 첨가된 폴리옥시에틸렌 C10~C16 알킬 에테르 설페이트, C1~C18 알킬 설포숙시네이트 에스테르 염, 천연 계면 활성제, 스핑고인지질, 및 C12~C18 지방산의 수크로오스 에스테르로부터 선택되는 하나 이상이다.

다른 실시형태에서, 본원에 개시된 계면 활성제는 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 트리올리에이트; 글리세린 지방산 에스테르, 예를 들어 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리스테이트, 글리세린 모노스테아레이트; 폴리글리세린 지방산 에스테르, 예를 들어 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 디스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀리에이트; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(여기서, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트는 트윈-20이고, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트는 트윈-40임), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(여기서, 폴리옥시에틸렌 (80) 소르비탄 모노올리에이트는 트윈-80임), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(여기서, 폴리옥시에틸렌 (60) 소르비탄 모노스테아레이트는 트윈-60이고, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올리에이트는 트윈-85이고, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트는 트윈-65임); 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라올리에이트; 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트; 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 디스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸 에테르; 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르; 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자 오일, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 피마자 오일, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자 오일; 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 밀랍; 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 라놀린; 및 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아르산 아미드; C10~C18 알킬 설페이트, 예를 들어 소듐 세틸 설페이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 올레일 설페이트; 평균 2 내지 4몰의 에틸렌옥시드 유닛이 첨가된 폴리옥시에틸렌 C10~C16 알킬 에테르 설페이트, 예를 들어 소듐 폴리옥시에틸렌 라우릴 설페이트; 및 C1~C18 알킬 설포숙시네이트 에스테르 염, 예를 들어 소듐 라우릴 설포숙시네이트 에스테르; 및 레시틴, 글리세로인지질, 스핑고인지질(예를 들어, 스핑고미엘린(sphingomyelin)), 및 C12~C18 지방산의 수크로오스 에스테르와 같은 천연 계면 활성제로부터 선택되는 하나 이상이다.

하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 계면 활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 트윈-20, 트윈-40, 트윈-60 및 트윈-80이다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 계면 활성제는 트윈-20 또는 트윈-80이다.

다른 실시형태에서, ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 또한 아미노산 보호제를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 아미노산 보호제의 농도는 대략 1 mM 내지 500 mM 또는 10 mM 내지 200 mM 범위이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 아미노산 보호제의 농도는 대략 10 mM 내지 200 mM이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 아미노산 보호제의 농도는 대략 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM 또는 200 mM이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 아미노산 보호제의 농도는 대략 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM 또는 160 mM이다.

하나의 실시형태에서, 아미노산 보호제는 히스티딘, 아르기닌, 글리세린 및 프롤린으로부터 선택되는 하나 이상이다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 아미노산 보호제는 히스티딘, 아르기닌 및 글리세린으로부터 선택되는 하나 이상이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 아미노산 보호제는 아르기닌 또는 이의 염이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 아미노산 보호제는 아르기닌 염산염이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 10 내지 200 ㎎/㎖이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.01 내지 0.1 중량/부피%이고; 아미노산 보호제의 농도는 대략 10 내지 200 mM이고; 완충제의 농도는 대략 1 내지 50 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 7이다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 25, 50, 75, 또는 100 ㎎/㎖이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.04 중량/부피%이고; 아미노산 보호제의 농도는 대략 140 mM이고; 완충제의 농도는 대략 20 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 6이다.

또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 또한 폴리올 보호제를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 폴리올의 농도는 대략 0.1% 내지 50%, 1% 내지 20%, 1% 내지 15%, 2% 내지 10%, 또는 4% 내지 10% 범위이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형에서, 본원에 개시된 폴리올의 농도는 대략 4 내지 10 중량/부피%이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형에서, 본원에 개시된 폴리올의 농도는 대략 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 중량/부피%이다.

하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 폴리올 보호제는 소르비톨, 만니톨, 수크로오스 또는 트레할로오스이다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 폴리올 보호제는 소르비톨 또는 만니톨이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR의 농도는 대략 10 내지 200 ㎎/㎖이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.01 내지 0.1 중량/부피%이고; 폴리올 보호제의 농도는 대략 1 내지 20 중량/부피%이고; 완충제의 농도는 대략 1 내지 50 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 7이다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 25, 50, 75 또는 100 ㎎/㎖이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.04 중량/부피%이고; 폴리올 보호제의 농도는 대략 4 내지 10 중량/부피%이고; 완충제의 농도는 대략 20 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 6이다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형은 또한 금속 킬레이트제를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 금속 킬레이트제의 농도는 대략 0.001 mM 내지 1 mM, 0.005 mM 내지 0.5 mM, 또는 0.01 mM 내지 0.2 mM 범위이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 금속 킬레이트제의 농도는 대략 0.01 mM 내지 0.2 mM이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 금속 킬레이트제의 농도는 대략 0.01 mM, 0.02 mM, 0.03 mM, 0.04 mM, 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM, 0.08 mM, 0.09 mM 또는 0.1 mM이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 금속 킬레이트제의 농도는 대략 0.01 mM, 0.02 mM, 0.03 mM, 0.04 mM, 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM, 0.08 mM, 0.09 mM 또는 0.1 mM이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 금속 킬레이트제의 농도는 대략 0.03 mM, 0.04 mM, 0.05 mM, 0.06 mM 또는 0.07 mM이다.

하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 금속 킬레이트제는 EDTA, DTPA 또는 EGTA이다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 금속 킬레이트제는 EDTA이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 10 내지 200 ㎎/㎖이고; 금속 킬레이트제의 농도는 대략 0.01 내지 0.2 mM이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.01 내지 0.1 중량/부피%이고; 아미노산 보호제의 농도는 대략 10 내지 200 mM이고; 완충제의 농도는 대략 1 내지 50 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 7이다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 25, 50, 75 또는 100 ㎎/㎖이고; 금속 킬레이트제의 농도는 대략 0.05 mM이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.04 중량/부피%이고; 아미노산 보호제의 농도는 대략 140 mM이고; 완충제의 농도는 대략 20 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 6이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 10 내지 200 ㎎/㎖이고; 금속 킬레이트제의 농도는 대략 0.01 mM 내지 0.2 mM이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.01 내지 0.1 중량/부피%이고; 폴리올 보호제의 농도는 대략 1 내지 20 중량/부피%이고; 완충제의 농도는 대략 1 내지 50 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 7이다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 25, 50 또는 100 ㎎/㎖이고; 금속 킬레이트제의 농도는 대략 0.05 mM이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.04 중량/부피%이고; 폴리올 보호제의 농도는 대략 4 내지 10 중량/부피%이고; 완충제의 농도는 대략 20 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 6이다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형은 또한 산화 방지제를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 산화 방지제의 농도는 대략 0.1 mM 내지 50 mM, 0.5 mM 내지 20 mM, 또는 1 mM 내지 10 mM 범위이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 산화 방지제의 농도는 대략 1 내지 10 mM이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 산화 방지제의 농도는 대략 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM 또는 10 mM이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, 본원에 개시된 산화 방지제의 농도는 대략 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM 또는 7 mM이다.

하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 산화 방지제는 메티오닌, 비타민-C, 티오설페이트, 티오설페이트 또는 벤질 메티오닌이다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 산화 방지제는 메티오닌이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 10 내지 200 ㎎/㎖이고; 산화 방지제의 농도는 대략 1 내지 10 mM이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.01 내지 0.1 중량/부피%이고; 아미노산 보호제의 농도는 대략 10 내지 200 mM이고; 완충제의 농도는 대략 1 내지 50 mM이고; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 7이다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 25, 50, 75 또는 100 ㎎/㎖이고; 산화 방지제의 농도는 대략 5 mM이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.04 중량/부피%이고; 아미노산 보호제의 농도는 대략 140 mM이고; 완충제의 농도는 대략 20 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 6이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 10 내지 200 ㎎/㎖이고; 산화 방지제의 농도는 대략 1 mM 내지 10 mM이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.01 내지 0.1 중량/부피%이고; 폴리올 보호제의 농도는 대략 1 내지 20 중량/부피%이고; 완충제의 농도는 대략 1 내지 50 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 7이다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 용액 제형에서, ET_AR 항체의 농도는 대략 25, 50, 75 또는 100 ㎎/㎖이고; 산화 방지제의 농도는 대략 5 mM이고; 계면 활성제의 농도는 대략 0.04 중량/부피%이고; 폴리올 보호제의 농도는 대략 4 내지 10 중량/부피%이고; 완충제의 농도는 대략 20 mM이며; 여기서 제형의 pH는 대략 5 내지 6이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은,

10 내지 150 ㎎/㎖의 ET_AR 단클론성 항체;

0.1 mM 내지 1 mM의 금속 킬레이트제;

0.01% 내지 0.1%의 계면 활성제;

1% 내지 50%의 폴리올 보호제 또는 10 내지 200 mM의 아미노산 보호제; 및

완충 시스템(5.0 내지 7.0의 pH를 제공함)을 포함한다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은

10 내지 150 ㎎/㎖의 ET_AR 단클론성 항체;

0.02 mM 내지 0.2 mM의 금속 킬레이트제;

0.01% 내지 0.1%의 계면 활성제;

1% 내지 10%의 폴리올 보호제 또는 50 내지 200 mM의 아미노산 보호제; 및

완충 시스템(5.3 내지 6.5의 pH를 제공함)을 포함한다.

10 내지 150 ㎎/㎖의 ET_AR 단클론성 항체;

0 내지 1 ㎎/㎖의 금속 킬레이트제;

0 내지 0.1%의 계면 활성제;

0 내지 50%의 폴리올 보호제 또는 0 내지 200 mM의 아미노산 보호제; 및

완충 시스템(5.0 내지 7.0의 pH를 제공함)을 포함한다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은,

10 내지 150 ㎎/㎖의 ET_AR 단클론성 항체;

0 내지 0.1 ㎎/㎖의 EDTA;

0 내지 0.1%의 계면 활성제;

0 내지 10%의 폴리올 보호제 또는 50 내지 200 mM의 아미노산 보호제; 및

완충 시스템(5.3 내지 6.5의 pH를 제공함)을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 수용액이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 약학적 ET_AR 항체의 안정된 제형은 멸균 용액이다.

하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형의 안정성은 ET_AR 항체의 응집 정도에 의해 결정된다. 하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 12개월 또는 24개월 동안 약 40℃ 및 약 75% 습도에서 저장된 이후에 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하 또는 0.1% 이하의 응집된 ET_AR 항체를 함유한다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 3개월, 6개월, 12개월 또는 24개월 동안 실온 및 약 65% 습도에서 저장된 이후에 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하 또는 0.1% 이하의 응집된 ET_AR 항체를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 6개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월 또는 48개월 동안 2 내지 8℃에서 저장된 이후에 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하 또는 0.1% 이하의 응집된 ET_AR 항체를 함유한다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형의 안정성은 ET_AR 항체의 분해 정도에 의해 결정된다. 하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 12개월 또는 24개월 동안 약 40℃ 및 약 75% 습도에서 저장된 이후에 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하 또는 0.1% 이하의 ET_AR 항체 분해 정도를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 3개월, 6개월, 12개월 또는 24개월 동안 실온 및 약 65% 습도에서 저장된 이후에 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하 또는 0.1% 이하의 ET_AR 항체 분해 정도를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형은 6개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월 또는 48개월 동안 2 내지 8℃에서 저장된 이후에 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하 또는 0.1% 이하의 ET_AR 항체 분해 정도를 갖는다.

하나의 실시형태에서, ET_AR 항체의 응집 및 단량체성 ET_AR 항체의 손실은 SEC-HPLC에 의해 결정된다.

다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형의 안정성은 ET_AR 항체의 생물학적 활성의 변화에 의해 결정된다. 하나의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형 중의 ET_AR 항체는 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 12개월 또는 24개월 동안 약 40℃ 및 약 75% 습도에서 저장된 이후에 이의 본래의 생물학적 활성 대비 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.9% 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형 중의 ET_AR 항체는 3개월, 6개월, 12개월 또는 24개월 동안 실온 및 약 65% 습도 하에 저장된 이후에 이의 본래의 생물학적 활성 대비 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.9% 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형 중의 ET_AR 항체는 6개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월 또는 48개월 동안 2 내지 8℃의 온도 하에 저장된 이후에 이의 본래의 생물학적 활성 대비 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.9% 이상의 생물학적 활성을 갖는다.

하나의 실시형태에서, ET_AR 항체의 생물학적 활성에서의 변화는 시험관 내에서 ET_AR을 억제하는 ET_AR 항체의 능력을 결정하기 위해 칼슘 유동 검출 방법에 의해 결정된다.

치료 방법

하나의 실시형태에서, 본원에서는 개체에서 고혈압(예를 들어, PAH)을 저하시키는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 개체에 본원에서 제공되는 약학 조성물, 예를 들어 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 본원에서는 개체에서 PAH를 치료하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 개체에 본원에서 제공되는 약학 조성물, 예를 들어 본원에서 제공되는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "개체"란 용어는 인간을 포함하는 포유동물을 지칭하고, "환자"란 용어와 상호 교환 가능하게 사용된다. "치료"란 용어는 질환의 적어도 하나의 증상 또는 기타 양상의 완화 또는 예방, 또는 질병 중증도의 감소 등을 포함한다. 본원에서 제공되는 항체는 질병의 완전한 치료를 제공하거나 질병의 모든 증상 또는 징후를 제거하는데 효과적인 치료제일 필요도 없다. 관련 분야에서 인식되는 바와 같이, 치료제는 소정의 질병 상태의 중증도를 감소시킬 수 있지만, 질병의 모든 징후를 제거하는데 효과적일 필요는 없다. 유사하게, 예방제는 효과를 나타내기 위해 병태의 개시를 완전히 예방할 필요는 없다. (예를 들어, 질병의 증상의 개수 또는 중증도를 감소시키거나, 다른 치료의 효율성을 증가시키거나, 다른 유익한 효과를 나타냄으로써) 단순히 질병의 영향을 감소시키거나 개체에서 질병이 발생하거나 악화될 가능성을 줄이는 것은 충분하다. 본 발명의 하나의 실시형태는 특정 질환의 중증도를 반영하는 지표의 기준선에 대해 지속적인 개선을 유도하기에 충분한 시간 동안 충분한 양으로 항체를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

약학 조성물은 비경구적, 국부적 또는 흡입에 의한 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 기법에 의해 투여될 수 있다. 주사되는 경우, 약학 조성물은, 예를 들어 관절 내, 정맥 내, 근육 내, 병소 내, 복강 내 또는 피하 경로를 통해, 볼러스(bolus) 주사에 의해, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 임플란트(implant)의 경피 투여 및 지속 방출과 같은 질병 또는 상처 부위에서의 국부화된 투여가 고려된다. 흡입에 의한 전달은, 예를 들어 비강 또는 경구 흡입, 연무기(nebulizer)의 사용, 에어로졸 형태의 항체의 흡입 등을 포함한다. 기타 대안은 환제, 시럽 또는 로젠지(lozenge)를 포함하는 경구용 제제를 포함한다.

유리하게는, 본원에서 제공되는 항체는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 하나 이상의 부가적인 성분을 포함하는 조성물로 투여된다. 조성물은 후술한 바와 같은 하나 이상의 생리학적 활성제를 부가적으로 포함한다. 다수의 특정 실시형태에서, 조성물은 본원에서 제공되는 하나 이상의 항체(예를 들어, 쥐 항체 또는 인간화 항체) 이외에도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 생리학적 활성제를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 약학 조성물은 적합한 pH에서 항체에 적합한 완충제, 아스코르브산과 같은 산화 방지제, 저분자량 폴리펩티드(예를 들어, 10개 미만의 아미노산을 갖는 폴리펩티드), 단백질, 아미노산, 탄수화물(예를 들어, 덱스트린), EDTA와 같은 킬레이트제(chelating agent), 글루타티온, 안정제 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질과 함께 본 발명의 쥐 항체 또는 인간화 항체를 포함한다. 적절한 산업 규격에 따라 보존제가 또한 첨가될 수 있다. 조성물은 적절한 부형제 용액을 희석제로 사용하여 동결 건조물(lyophilizate)로서 제형화될 수 있다. 적합한 성분은 사용된 복용량 및 농도에서 수용체에 대해 독성이 없다. 약학적 제형에 사용될 수 있는 성분의 추가적인 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. (1980) and 20th Ed. (2000)]에 나타나 있다. 개업의가 사용하기 위한 맥 퍼블리싱 컴퍼니(Mack Publishing Company) 키트가 제공되며, 이때 상기 키트는 본 발명의 하나 이상의 항체 및 표지, 또는 본원에 논의된 임의의 병태를 치료하는데 사용하기 위한 기타 지침서를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 인간 항체의 멸균 제제를 포함하며, 이는 상술한 바와 같은 조성물의 형태일 수 있거나, 하나 이상의 바이얼(vial)에 담겨 있을 수 있다.

투여 복용량 및 빈도는 투여 경로, 사용되는 특정 항체, 치료될 질병의 특성 및 중증도, 병태가 급성 또는 만성인지의 여부, 및 개체의 크기 및 전반적인 상태와 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 적절한 복용량은, 예를 들어 용량 증가 연구를 포함할 수 있는 임상 시험에서 관련 분야에 공지되어 있는 절차에 의해 결정될 수 있다.

본원에 제공되는 항체는, 예를 들어 1회 또는 1회 이상, 예를 들어 소정의 기간에 걸쳐 일정 간격으로 투여될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 쥐 항체 또는 인간화 항체는, 예를 들어 1개월, 2개월 또는 3개월 동안, 또는 심지어 무기한으로 1개월 이상의 기간에 적어도 1회 투여된다. 만성 병태를 치료하기 위해 장기적인 치료가 일반적으로 가장 효과적이다. 그러나 급성 병태를 치료하기 위해 보다 짧은 기간, 예를 들어 1주 내지 6주의 기간 동안의 투여가 충분할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 환자가 선택된 지표(들)에 대한 기준선에 대해 의료적으로 적절한 개선 정도를 나타낼 때까지 투여된다.

본원에서 제공되는 치료 요법의 일례는 폐동맥압 수준이 소정의 역할을 하는 병태를 치료하기 위해 적절한 복용량으로 1주에 1회 항체의 피하 주사를 포함한다. 항체의 주간 또는 월간 투여는 목적하는 결과가 달성될 때까지, 예를 들어 개체의 증상이 진정될 때까지 계속될 수 있다. 필요한 경우 치료는 재개될 수 있거나, 대안적으로는 유지 용량이 투여될 수 있다.

개체의 폐동맥압 수준은 존재하는 경우 이들의 수준의 변화를 검출하기 위해 인간화 항체와 같은 항체에 의한 처리 이전, 도중 및/또는 이후에 모니터링될 수 있다. 일부 질환에 있어서, 폐동맥압 증가의 발생은 질병의 단계와 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 폐동맥압 수준을 측정하기 위해 공지된 기법이 사용될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물의 특정 실시형태는 항체 및 하나 이상의 ET_AR 길항제, 예를 들어 본 발명의 2개 이상의 항체, 또는 본 개시내용의 항체 및 하나 이상의 기타 ET_AR 길항제의 사용을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 항체는 단독으로 또는 환자가 앓고 있는 병태를 치료하는데 유용한 기타 약제와 함께 투여된다. 이 같은 약제의 예로는 단백질성 및 비단백질성 약물을 들 수 있다. 다수의 치료제가 공동 투여되는 경우, 복용량은 관련 분야에서 인식되는 바와 같이 상응하게 조절될 수 있다. "공동 투여" 및 복합 요법은 동시 투여에 제한되지 않지만, 또한 적어도 하나의 기타 치료제를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 치료 과정 도중에 항체를 적어도 1회 투여되는 치료 요법을 포함한다.

다른 양태에서, 폐동맥 고혈압 및 관련 질환을 치료하기 위한 약제를 제조하는 방법은 본원에서 제공되는 항체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제의 혼합물을 포함한다. 약제의 제조 방법은 상술한 바와 같다.

인간 엔도텔린 수용체에 특이적으로 결합하는 항체와 관련된 조성물, 키트 및 방법이 본원에서 추가로 제공된다. ET_AR과 상호 작용하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체, 예를 들어 엔도텔린 수용체 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체의 전체 또는 일부를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 분자 및 이의 유도체 및 단편이 또한 제공된다. 핵산 및 세포를 포함하는 벡터 및 플라스미드, 및 핵산 및/또는 벡터 및 플라스미드를 포함하는 세포주가 본원에서 추가로 제공된다. 본원에서 제공되는 방법은, 예를 들어 인간 ET_AR과 상호 작용하는 항체의 제조, 확인 또는 분리를 위한 방법, 예를 들어 ET_AR 항체의 방법, 항체가 ET_AR에 결합하는지를 확인하는 방법, 및 ET_AR에 결합하는 항체를 동물 모델에 투여하기 위한 방법을 포함한다.

본원에 개시된 기술적 해결방안은 하기 실시예에 의해 추가로 이해될 것이다.

실시예

명시되지 않는 경우, 본원에 개시된 출발 물질 및 장비는 시판되거나, 당해 기술분야에서 흔히 사용된다. 달리 명시하지 않는 한, 하기 실시예에서의 방법은 모두 당해 기술분야에서 통상적인 방법이다.

1. 면역화를 위한 안정된 항원 세포주의 구축

CHO-DHFR- 세포를 6웰 플레이트에 분주하였다. 24시간 배양 이후, hET_AR 유전자(뉴클레오티드 서열에 대해 서열번호 1을 참고하고, 아미노산 서열에 대해 서열번호 2를 참고함)를 함유하도록 변형된 pIRES 플라스미드(클론테크(Clontech); 시판용)에 의해 세포를 형질 감염시킨다. 형질 감염은 인비트로젠(Invitrogen)이 리포펙타민 2000에 대해 추천하는 형질 감염 조건을 따르면서 수행되었다. 형질 감염 48시간 후, 배지를 10 nM MTX(메토트렉세이트)를 함유하는 완전 배지로 교체하였다. 안정된 클론이 나타날 때까지 배지를 약 2주 동안 3일마다 교체하였다. 분산된 세포 콜로니를 플레이트로부터 탈착하고 수집하였다. 세포가 약 50%의 밀집도(confluence)까지 성장한 후, MTX의 농도를 압력 선택을 위해 최대 10 μM까지 점진적으로 증가시켰다. 압력 선택 이후에 세포 클론을 확인하기 위해 hET_AR에 대한 다클론성 항체(Abcam)를 이용하는 FACS에 의해 구축된 안정된 세포주를 분석하였다. 다량의 hET_AR 발현이 선택된 CHO-DHFR-hET_AR 세포막 상에서 검출되었다. 최종적으로 서브클로닝을 통해 6개의 높은 ET_AR 발현 및 안정된 세포주가 확인되고 수득되었다.

2. 항체의 제조

CHO-DHFR-hET_AR 전 세포 및 프로이드 어주번트(Freund's adjuvant)의 유화액을 2 x 10⁶개의 세포/마우스로 BALB/c 마우스(6 내지 8주) 내로 피하 주사하였다. 2주 후, 마우스를 불완전 프로이드 어주번트 유화 면역원으로 부스팅(boosting)한 후, 매주 1회 부스팅하였다. 총 6회의 면역화 이후, 절개된 꼬리 말단으로부터 혈액 샘플을 수집하고, 원심 분리하여 혈청을 수집하였다. 혈청 역가(serum titer)를 얻기 위해 혈청을 FACS로 분석하였다. 허용 가능한 항체 역가가 달성된 이후, 마우스를 희생시키고, 무균 조건 하에 이들의 비장 세포를 수확하였다. SP2/0 세포는 대수 성장기에 3분 동안 2,000 rpm으로 원심 분리하여 수집하였다. 세포 펠릿(cell pellet)을 무혈청 배양 배지로 재현탁한 후, 원심 분리하고, 이차로 재현탁하고, 계수하였다. 비장 세포 및 SP2/0 세포를 1:1 이상의 SP2/0 세포:비장 세포의 비율로 혼합한 후, 3회의 세척 및 원심 분리를 수행하였다. 마지막 원심 분리에서 얻어진 펠릿을 탈착시키고, 1 ㎖의 미리 가온된 PEG-1350을 적가하고(30초 이내에 완료함), 1분 동안의 피펫 혼합 이후에 30 ㎖의 미리 가온된 무혈청 배지(인비트로젠)를 천천히 첨가하여 PEG 융합을 중단시켰다. 1,500 rpm에서 5분간의 원심 분리 이후, 융합 배양 배지에서 세포 펠릿을 재현탁하였다. 100 ㎕ 중의 비장 세포(20,000개) 및 영양층 세포(feeder layer cell)(5,000개)를 96웰 플레이트의 각 웰에 도말하였다. 융합되지 않은 세포를 제거하기 위해 HAT(사르신(sarcine), 아메톱테린(amethopterin) 및 티미딘)를 선택하면서 융합된 하이브리도마 세포 및 영양층 세포를 96웰 플레이트에서 동시 배양하였다. 10일 후, ELISA 분석을 위해 배양 플레이트 내의 하이브리도마 세포의 상층액을 수집하였다.

3. 전 세포의 ELISA 선별

hET_AR를 과발현하는 CHO-DHFR-hET_AR 세포 및 hET_AR을 발현하지 않는 CHO-DHFR- 세포를 96웰 플레이트에 개별적으로 전달하고, 90%의 밀집도까지 성장하도록 하였다. 배양 배지의 상층액을 제거하고, 부착된 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 100 ㎕의 100% 메탄올을 첨가하여 4℃에서 10분 동안 세포를 고정시켰다. 이어서 100 ㎕의 새로 만든 0.6% H₂O₂-PBS를 첨가하고, 실온에서 20분 동안 배양한 후, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. PBS-1% BSA 용액으로 차단한 후, 하이브리도마 상층액을 첨가하고, 4℃에서 90분 동안 배양하였다. 수회의 세척 이후, 100 ㎕의 이차 항체 GxM-HRP-Fc(시그마-알드리치)를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 0.5시간 동안 배양하였다. 5회의 세척 이후, 100 ㎕의 TMB 발색 기질을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 배양한 후, 2M H₂SO₄를 첨가하여 중단시키고, OD₄₅₀ 값을 판독하였다. 양성 대조군은 면역화 이후의 마우스 혈청이고; 음성 대조군은 세포 배양 상층액이었다. 도 1에 도시된 바와 같이, ELISA에 의한 초기 분석 이후, 항-hET_AR 항체를 분비하는 몇몇 하이브리도마 클론을 선택하고, 세포 클로닝 이후에 hET_AR에 대한 안정된 분비 세포주를 수득하였다. 마지막으로, 하이브리도마에 의해 분비되는 항체 상층액을 FACS 분석에 의해 확인하였다.

4. 항체 유전자의 클로닝 및 서브클로닝

항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 수집하였다. QIAGEN mRNA 추출 키트에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 하이브리도마 mRNA를 추출하였다. 이어서 추출된 mRNA을 cDNA로 역전사시켰다. 역전사 프라이머는 마우스의 경쇄 및 중쇄 불변 영역에 특이적인 프라이머로서, 중쇄 역전사 프라이머는 (5'-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3')(서열번호 199)이고, 경쇄 역전사 프라이머는 (5'-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3')(서열번호 200) 및 (5'-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3')(서열번호 201)이다. RT-PCR 반응 조건은 하기와 같다: 25℃에서 5분, 50℃에서 60분 및 70℃에서 15분. 역전사된 cDNA를 500 ㎕가 될 때까지 0.1 mM TE로 희석하고, 초원심 분리 튜브(아미콘 울트라-0.5(Amicon Ultra-0.5))에 첨가하고, 10분 동안 2,000 g로 원심 분리하였다. 여액을 제거하고, 500 ㎕의 0.1 mM TE를 첨가하고, 10분 동안 2,000 g로 원심 분리하였다. 여액을 제거하고, 제조 튜브(preparation tube)를 새로운 원심 분리 튜브에 대해 전도되게 배치하고, 10분 동안 2,000 g로 원심 분리하여 정제된 cDNA를 수득하였다. 정제된 cDNA(10 ㎕)를 주형으로서 분취한 후, 4 ㎕의 5x 테일링 완충제(tailing buffer; 프로메가(Promega)), 4 ㎕의 dATP(1 mM) 및 10 U의 말단 전이효소(프로메가)를 첨가하고, 균일하게 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 배양한 후, 65℃에서 5분 동안 배양하였다. 폴리A 테일 cDNA를 주형으로서 사용하였으며, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 유전자를 증폭하기 위해 PCR을 수행하였다. 상류 프라이머는 모두 올리고dT로서, 중쇄 하류 프라이머는 (5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3')(서열번호 202) 및 (5'-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3')(서열번호 203)이며, 경쇄 하류 프라이머는 (5'-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3')(서열번호 204)이었다. PCR 반응 조건은 하기와 같다: 95℃에서 5분; 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분, 40사이클; 및 72℃에서 7분. 서열 분석을 위해 PCR 생성물을 PMD 18-T 벡터(다카라바이오(Takara Bio))에 연결하였다. 항체 클론의 서열은 표 2에 나열되어 있다.

PCR 프라이머는 항체의 DNA 서열에 기초하여 설계되었으며, 따라서 완전한 경쇄, 중쇄 신호 펩티드 및 가변 도메인 및 마우스 IgG1 불변 영역이 발현 벡터 pTM5에 연결되었다.

5. 항체 인간화 및 최적화

먼저, 인간화를 위해 선택된 항체의 가변 영역 서열과 상동성인 인간화 항체의 생식세포 유전자 서열(Ig 생식세포 유전자 서열)을 검색하기 위해 NCBI 온라인 항체 가변 영역 서열 정렬 도구(Ig Blast)를 이용하여 선별된 마우스 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 서열을 상동성 항체와 함께 정렬하였으며, 인간화 항체의 가변 영역 서열을 수득하고 CRO를 통해 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 합성하기 위해 CDR 서열을 제외하고 가장 높은 상동성을 갖는 인간화 유전자 서열을 CDR 이식용 주형으로서 사용하였다. 서열에 따라 PCR 프라이머를 설계하고, 5' 말단 및 3' 말단에 적절한 제한 효소 부위를 도입하였다. PCR에 의해 인간화 항체의 가변 영역을 증폭한 후, 인간 IgG2 또는 IgG4 불변 영역 서열과 조합하여 재조합 인간화 항체의 전체 서열을 수득하였다. 단계 7에 따라 재조합 항체의 발현을 달성하였으며, ET_AR에 대한 이들의 친화도를 단계 9에 개시된 바와 같이 FACS에 의해 분석하였다. ET_AR에 대한 친화도를 보유하는 최고의 인간화 항체 후보는 상기 그룹으로부터 선택되었으며, 이의 가변 영역 서열은 ET_AR에 대한 개선된 친화도를 얻기 위해 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 추가로 개선되었다.

6. 인간화 항-hET_AR 항체의 유전자의 서브클로닝

최적화된 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 5'-말단 및 3'-말단에 각각 NheI 및 SalI의 2개의 제한 부위를 도입함으로써 진스크립트 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드(Genscript Biotechnology CO., LTD)에 의해 합성되었다. 전체 중쇄 가변 영역을 pTM5의 발현 벡터 내의 중쇄 불변 영역과 연결하였다. 유사하게, 5'-말단 및 3'-말단에 각각 NheI 및 BsiwI를 도입함으로써 경쇄 가변 영역을 pTM5의 발현 벡터 내의 경쇄 불변 영역과 연결하였다.

7. 항-ET_AR 항체의 일시적인 발현

HEK293 또는 CHO 발현 세포주(5 x 10⁵/㎖)의 현탁액을 진탕 플라스크(shaker flask)에 접종하였다. 37℃에서 24시간의 회전 이후, 세포 밀도는 1 x 10⁶/㎖에 도달하였고, 형질 감염용으로 준비가 되었다. 형질 감염 시약으로서 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하였으며, 여기서 PEI 대 DNA의 최적의 혼합 비율은 3:1이었다(DNA의 양은 0.5 ㎍/ℓ x 10⁶개의 세포이고; 항체 경쇄 DNA 및 항체 중쇄 DNA의 비율은 3:2임). 15분간의 배양 이후에 둘 모두에 대한 혼합물을 세포 배양액에 첨가하였다. 세포를 PEI/DNA 혼합물로 처리한 이후에 37℃ 및 5% CO₂에서 24시간 넘게 회전시켰다. 이어서 발현에 필요한 보충물로서 0.5%의 트립톤을 세포 배양액에 첨가하고, 발현이 완료된 이후(96시간 초과), 항체의 정제 및 분리를 위해 세포 상층액을 수집하였다.

8. 항체의 정제 및 준비

원심 분리(8000 rpm, 15분) 이후 세포 및 세포 잔해를 배양액으로부터 제거하고, 상층액을 정제용 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 크로마토그래피를 통해 정제 과정을 수행하였다. 먼저, 상층액을 G 단백질 결합형 친화도 크로마토그래피 칼럼을 통과시켰으며, G 단백질에 결합된 항체는 칼럼 내에 남아 있었다. pH가 3.0 이하인 용리액을 사용하여 크로마토그래피 칼럼으로부터 항체를 용리하였다. 낮은 pH 용리액을 1 M 트리스-HCl로 즉시 중화시켜 항체의 변성 및 활성의 손실을 방지하였다. 이어서 항체 용액을 16시간에 걸쳐 PBS 완충제 내로 투석하였다.

9. 기능성 항체에 대한 FACS 분석

10 mM EDTA를 함유하는 PBS를 사용하여 10⁵개의 CHO-DHFR-hET_AR 세포를 탈착하고 1.5 ㎖ EP 튜브에 수집하였다. 원심 분리 이후에 상층액을 제거하였으며, 음성 대조군 샘플을 로딩 완충제(PBS, 2% FBS)로 재현탁하였다. 양성 대조군의 경우, 200 ㎕의 항체 상층액을 재현탁 세포에 첨가하고, 실온에서 배양한 후, 세포를 1500 rpm로 원심 분리하여 상층액을 제거하였으며, FACS 로딩 완충제로 세척하고, 다시 원심 분리하였다. FITC-표지 염소 항-마우스 형광 항체(BD 파밍겐(BD Pharmingen))를 1:50의 희석율로 첨가하면서(200 ㎕/웰) 세포를 재현탁하고, 암실에서 30분 동안 실온으로 배양하였다. 원심 분리 이후에 상층액을 제거하고, 세포를 FACS 로딩 완충제로 세척하고, 다시 원심 분리하고, 분석을 위해 로딩 완충제로 재현탁하였다. 재조합 항체 상층액 및 CHO-DHFR-hET_AR 세포는 특이적 결합을 나타냈다. 회색 피크 및 점선 피크는 음성 대조군이고; 항체 상층액에 상응하는 실선 피크는 오른쪽으로 유의하게 이동하였다.

10. 기능성 항체에 대한 칼슘 유입 검정

hET_AR-에쿼린(Aequorin)을 동시 발현하는 CHO-DHFR 세포를 웰 당 25,000개의 세포로 96웰 세포 배양 플레이트에 접종하고, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 배양 상층액을 제거하였다. 코엘렌테라진(coelenterazine; 50 ㎕)(프로메가)을 암실에서 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 50 ㎕의 하이브리도마 상층액 또는 정제된 항체를 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 이후, 50 ㎕의 엔도텔린 1을 첨가하고, 40초 이내의 칼슘 유입의 변화를 스펙트라맥스 L(SpectraMax L) 마이크로플레이트 판독기(몰레큘러 디바이스(Molecular Devices))를 사용하여 기록하였다. 상이한 하이브리도마 상층액은 hET_AR을 통해 매개되는 칼슘 유입을 상이하게 억제하였으며, A-1 항체는 hET_AR을 통해 매개되는 칼슘 유입을 유의하게 억제하였다. 재조합 항-hET_AR 기능성 항체는 hET_AR을 통해 매개되는 칼슘 유입을 유의하게 억제하였으며, 이는 항체 농도의 증가와 함께 증가하였다.

11. 항체의 생체 내 활성을 연구하기 위한 저산소증 유도 PAH 시노몰구스 원숭이 모델의 확립

시노몰구스 원숭이의 급성 저산소증 유도 폐동맥 고혈압(PAH) 모델은 크라운 바이오사이언스 인코포레이티드(Crown Bioscience Inc.; 타이창(Taicang) 소재)와 공동 개발하였으며, 이러한 PAH 모델에서 1회용 정맥 내 주사액으로서 A-1 항체의 효능을 평가하였다. 모든 동물은 하룻밤 동안 단식하고, 몸무게를 측정한 후, 10 ㎎/㎏의 A-1 항체의 정맥 내 주사액을 1회 투여 받았다. 3시간 후, 동물을 마취시켰다. 심박동수 및 산소 포화도와 함께 도플러 색채 심초음파검사(Doppler color echocardiography)에 의한 삼첨판 역류 속도(tricuspid regurgitation velocity)를 동시에 모니터링하였다. 기준선을 얻은 후, 12% 저산소증을 유도하였으며, 동시에 삼첨판 역류 속도를 측정하고; 항체가 12% 저산소증 하에 저산소증 유도 폐동맥압을 개선시킬 수 있는지를 확인하기 위해 분석을 실시하였다. 투여 48시간 후, 시험을 다시 수행하였다. 동물을 마취시키고, 심박동수 및 산소 포화도와 함께 도플러 색채 심초음파검사에 의한 삼첨판 역류 속도를 동시에 모니터링하였다. 기준선을 얻은 후, 12% 저산소증을 유도하였으며, 동시에 삼첨판 역류 속도를 측정하였다. 항체가 여전히 저산소증 유도 폐동맥압을 개선시킬 수 있는지를 확인하기 위해 분석을 실시하였다. 48시간 이후에 효능이 남아 있는 경우, 96시간 후에 저산소증 유도 실험을 다시 수행하였다. 시간 대비 폐동맥 수축기압의 곡선 아래 부분의 면적을 계산하고, 곡선 아래 부분의 면적을 비교하여 A-1이 96시간 이내에 폐동맥압을 감소시키는 효능을 유지한다는 것을 확인하였다.

12. ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형:

하기는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형의 실시예이다:

실시예 1:

실시예 1의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

실시예 2:

실시예 2의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

실시예 3:

실시예 3의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

실시예 4:

실시예 4의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

실시예 5:

실시예 5의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

실시예 6:

실시예 6의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

실시예 7:

실시예 7의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

실시예 8:

실시예 8의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

실시예 9:

실시예 9의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

실시예 10:

실시예 10의 안정된 용액 제형의 pH는 5.8이다.

13. ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형을 분석하기 위한 방법:

단량체성의 응집된 ET_AR 항체를 분석하기 위한 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC).

SEC-HPLC를 이용하여 ET_AR 항체의 응집체((용해성 응집체)의 형성 및 이의 단량체 형태의 손실을 확인하였다. 25℃의 애질런트(Agilent) 1100 HPLC에서, UV 흡광도의 기준선이 일정하고 안정될 때까지 TSK-G3000SWxl 고성능 SEC 칼럼을 이동상으로서의 200 mM 인산 완충제(pH 6.8)로 플러싱(flushing)하였다. 1 내지 3 ㎎/㎖의 농도(이동상으로 미리 희석됨)의 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형을 50 ㎕의 양으로 주사하였다. 0.5 ㎖/분의 유속으로 샘플을 이동상으로 용출하고, UV 280 ㎚에서의 흡광도를 기록하였다. 각각의 실행 이후, 단량체(주요 피크), 이량체 및 다합체의 흡광도 피크의 AUC를 계산하고, 총 AUC에 대한 주요 피크의 AUC의 비율(%)을 계산하고, 이를 샘플의 순도로서 기록하였다.

환원형 및 비환원형 ET_AR 항체 샘플의 순도를 분석하기 위한 모세관 전기영동(CE-SDS).

모세관 전기영동 장치(베크만(Beckmann) MDQP/ACE)를 사용하고, 환원형 샘플에 베타-메르캅토에탄올을 첨가하거나 비환원형 샘플에 요오도아세트아미드를 첨가함으로써 샘플을 IgG 순도/이종성 검정 키트(베크만)로 처리하였다. 베크만 미코팅 모세관을 사용하여 샘플을 분리하고, 샘플을 자동적으로 1 ㎎/㎖의 농도로 로딩하였다. 샘플 로딩을 완료한 후, 15 kV 역전압에서 분리를 수행하고, UV 214 ㎚ 흡광도 시간 곡선을 기록하였다. 이 과정이 완료되면, 주요 피크, 단편 및 집성체에 대한 UV 214 ㎚에서의 흡수 피크를 통합하였다. 비환원형 샘플에 있어서, 총 면적 대비 주요 피크의 비율을 계산하였으며, 이는 비환원형 샘플의 순도를 나타낸다. 환원형 샘플에 있어서, 총 면적 대비 경쇄 및 중쇄 피크 면적의 비율을 계산하였으며, 이는 환원형 샘플의 순도를 나타낸다.

시험관 내에서 ET_AR에 대한 ET_AR 항체의 억제 활성을 확인하기 위한 칼슘 유동 검출 방법

hET_AR-에쿼린을 안정하게 발현하는 ET_AR-Aq-#105 세포를 3.5 x 10⁴개의 세포/웰 및 100 ㎕/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 방치하였다. 100 ㎕의 코엘렌테라진-h(Colenterazine-h; 0.23 μM 저장 용액)를 페놀 레드가 없는 3.2 ㎖의 DMEM/F12 배지로 희석하였다. 배양기에서 플레이트를 제거하고, 배지를 흡인하고, 50 ㎕/웰의 희석된 코엘렌테라진-h를 (암실에서) 첨가하고, 플레이트를 2시간 동안 37℃ 배양기에 놓아두었다. 기준 항체 A-1 및 시험 샘플을 연속적으로 희석하고, 96-웰 플레이트에 50 ㎕/웰의 희석액을 (암실에서) 첨가하였다. 샘플의 첨가 이후, 플레이트를 추가의 30분 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 배양기에 놓아두었다. 마이크로플레이트 판독기 상에 각 웰의 형광 강도를 판독하였다. DMEM/F12 배지만을 갖는 3개의 웰(페놀 레드 부재)에 대한 판독 값은 배경 값이고, 웰의 나머지에는 20 nM 엔도텔린-1이 첨가되었다.

판독 데이터를 분석용 엑셀에 붙여 넣고, 피크 형광 강도의 시점을 계산 값으로서 선택하였다. 블랭크 대조군(blank control）의 형광 값의 평균을 수득한 후, 각각의 본래의 값에서 평균값을 제하였다. 이러한 처리 이후, 최대 형광 강도 값의 평균을 내고, 최종적으로 최대 응답 평균에 대한 각 웰의 상대적인 비율(%)을 계산하였다. 프리즘(Prism) 소프트웨어를 통해 각 웰의 비율(%) 및 농도를 이용하여 곡선 적합 상관 계수(curve fitting correlation coefficient; R²)뿐만 아니라 기준 ET_AR 항체 및 시험 샘플에 대한 IC₅₀ 값을 계산하였다. 시험 샘플의 생물학적 활성(%) = (기준 물질의 IC₅₀/시험 샘플의 IC₅₀) x 100.

14. pH 및 완충제의 선별:

65℃ 수조에서의 2시간 이후에 항체 A-1의 외형 및 A340 흡수를 확인하기 위해 4.7 내지 6.3의 pH를 갖는 20 mM 시트르산나트륨 완충제에서 항체 A-1을 이용한 pH 단일 인자 실험으로부터 pH를 선별하였으며, 실험은 총 7회 수행되었다(표 3 참조). 표 3에 나타낸 바와 같이, 실험 결과에 따르면 항체 A-1은 pH 5.0 및 pH 5.7 내지 6.3에서 상대적으로 양호한 열적 안정성을 갖는 것으로 나타났다.

15. 완충제 염의 농도 및 유형이 단백질 안정성에 미치는 효과:

상술한 pH 선별 결과에 기초하여, pH 및 완충제에 대해 추가의 선별 실험을 수행하였다. 시트르산나트륨과 히스티딘의 2개의 완충제 시스템을 선택하고, 2개의 영향 인자를 이용하여 실험을 설계하였다. 3개의 상이한 pH 값에서 완충하기 위해 2개의 세트의 샘플을 준비하였다: pH 4.7, 5.1 및 5.3에서의 20 mM 시트르산나트륨, 200 mM 염화나트륨 및 0.02% 트윈-80; 및 pH 5.7, 6.0 및 6.3 에서의 20 mM 히스티딘, 200 mM 염화나트륨 및 0.02% 트윈-80(표 4 참조). 1개 내지 6개의 그룹의 가속화 분해 실험을 수행하였으며, 항체 A-1의 농도를 50 ㎎/㎖로 유지하였다. 실험 조건은 동결-해동이었다: -20℃에서 동결 및 실온에서의 해동의 3회 사이클; 10일, 13일 동안 고온: 37℃; 조명: 5000 lx, 300 ㎼/㎠, 25℃, 5일; 시험 매개변수: 외형, 가시 입자(visible particle), 순도(SEC-HPLC, 비환원형 CE-SDS), 전하 변이체.

결과는 표 5 내지 표 8에 요약되어 있다. 실험 결과에 따르면 동결-해동 사이클은 항체 A-1에 유의한 영향을 미치지 않았지만, 고온 및 광 노출 시의 결과에 따르면 시트르산나트륨의 pH가 낮을수록 응집 및 순도 손실이 용이하게 야기되는 것으로 나타났다. 항체 A-1은 특히 전하 변이체의 측면에서 상대적으로 빛에 민감하며, 5일간의 광 노출 이후에 주요 피크가 상당히 감소하였으며, 기본 피크는 감소하였다. 제형 4만이 거의 변하지 않았으며, 그 다음이 제형 5이었다. 따라서 제형 4는 차기 보호제 선별을 위한 제형으로서 선택되었다.

16. 보호제 선별:

실험 계획

2개 그룹의 실험을 수행하였다. 첫 번째 실험 그룹에서 6개의 보호제를 시험하였으며, 이들은 5% 수크로오스, 2% 만니톨, 2% 소르비톨, 100 mM NaCl, 140 mM 아르기닌 및 150 mM 프롤린이었다. 이러한 그룹에서, 항체 A-1의 단백질 농도는 60 ㎎/㎖이고, 완충제 염로서의 히스티딘의 농도는 20 mM이고, 트윈-80의 농도는 0.02%이고, pH는 5.8이었다. 실험 조건은 동결-해동이었다: -20℃에서 동결 및 실온에서의 해동의 5회 사이클; 10일, 13일 동안 고온: 40℃; 조명: 5000 lx, 300 ㎼/㎠, 25℃, 5일; 진탕: 암실에서 3일 동안 실온에서 300 rpm; 시험 매개변수: 외형, 가시 입자, 순도(SEC-HPLC, 비환원형 CE-SDS), 전하 변이체. 설계 계획은 표 9에 나타나 있다.

첫 번째 그룹의 실험에 기초하여, 두 번째 그룹의 실험을 수행하였으며, 시트르산나트륨을 완충제 시스템으로서 선택하였다. 시트르산나트륨의 농도는 20 mM이고, pH는 5.8이고, 항체 A-1의 농도는 약 30 ㎎/㎖이었다. F1 제형에서, 아르기닌을 아르기닌 염산염으로 교체하였으며, 이의 농도는 140 mM이었다. 또한 보호제의 선택을 위한 실험을 수행하였으며, 고온 및 조명의 조건을 40℃/2와트, 1개월, 5000 lx, 0일, 2일, 5일 및 10일로 변경하였다. 설계 계획은 표 10에 나타나 있다.

실험 결과

첫 번째 그룹의 실험 결과에 따르면 5일간의 조명 이후에 6개의 제형 샘플 모두의 색깔이 황색으로 상이한 정도로 변하는 것으로 나타났다. SEC-HPLC 결과에 따르면 기타 보호제와 비교하여 아르기닌이 집성체의 형성을 감소시키는데 보다 효과적인 것으로 나타났다(표 11).

40℃의 고온에서 7일, 13일: SEC-HPLC 결과에 따르면 0일째 날의 단량체 순도(98%)와 비교하여 각각의 제형에서 단량체의 감소에서의 차이가 유의하지 않았으며, 수크로오스, 아르기닌 및 프롤린을 함유하는 제형에 있어서 순도의 감소가 훨씬 더 적은 것으로 나타났다. 결과는 하기 표 12에 나타나 있다.

진탕 및 동결-해동에 대한 시험 결과(표 13 참조)에 따르면 0일째 날과 비교하여 집성체 및 전하 변이체에 있어서 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.

두 번째 그룹의 실험에서, 시트르산나트륨을 완충제로 사용하였으며, 그 결과에 따르면 고온 및 조명 이후에 항체 A-1의 제형은 옅은 유백색을 나타내는 것으로 나타났다(표 14 참조). 몇몇 보호제의 효과를 비교함으로써 본 발명자들은 항체 A-1의 순도를 보존하는데 가장 좋은 것이 아르기닌 염산염인 것으로 간주하였다(표 15 참조). 조명에 의해 전하 변이체의 유의한 변화가 유도되었으며(표 16 참조), 따라서 암실에 항체 A-1을 저장하는 것이 추천되었다.

17. 산화 방지제에 영향을 미치는 인자에 대한 실험

실험 계획

실험은 0.0187 ㎎/㎖의 EDTA의 보호 효과를 평가하기 위한 것이며, 0.02% 및 0.1%의 트윈-80과 함께 2개의 완충제인 20 mM 히스티딘 염 및 20 mM 시트르산나트륨이 선택되었다(표 17). 항체 A-1의 농도는 60 ㎎/㎖이고, 아르기닌 염산염은 140 mM이었으며, pH는 5.8이었다. 3개의 제형 샘플에는 가속화 분해 실험이 적용되었으며, 실험 조건은 5000 lx, 300 ㎼/㎠, 25℃, 3일, 6일간의 조명; 시험 항목: 외형, 가시 입자, 순도(SEC-HPLC) 및 전하 변이체였다.

상기 실험에 기초하여, 메티오닌을 선별용 산화 방지제로 첨가하였으며, 세부 계획은 표 18에 있다. 실험 조건은 2주, 1개월 동안 40℃의 고온; 0일, 2일, 5일, 10일 동안 5000 lx에 의한 조명이었다.

실험 결과

2개의 그룹의 실험 결과에 기초하여, 2개의 보호제 중 어떠한 것도 항체 A-1에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 사용된 트윈의 상이한 농도에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았지만(표 19, 표 20, 표 21, 표 22), 히스티딘을 제형 완충제 염으로서 사용하는 경우, 조명 이후에 제형은 황색으로 변하였으며, 따라서 시트르산나트륨은 제형 완충제 염으로서 보다 나은 선택이었다. 조명에 의한 3일간의 분해 이후, 제형 샘플 13 내지 15의 SEC-HPLC 피크는 감소하였으나 이들 사이에는 큰 차이가 없었다. 3일째 날의 제형 샘플의 피크는 암실에서의 0일째 날의 피크와 동일하였다. 조명에 의한 6일간의 분해 이후, 샘플 13의 피크는 보다 큰 감소를 나타내는 반면, 샘플 14 및 15는 추가적인 감소를 나타내지 않았다. 6일째 날의 제형 샘플의 피크는 암실에서의 0일째 날의 피크와 동일하였다.

18. 다양한 단백질 농도에서의 장기 및 가속화 안정성 연구:

실험 계획

초기 제형을 측정한 이후, 본 발명자들은 또한 다양한 농도의 항체 A-1에 대해 장기 및 가속화 안정성 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 항체의 농도를 25, 50 및 100 ㎎/㎖로 설정하고, 상기 정의된 제형을 사용하여 장기(4℃에서 0일, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월) 및 가속화(25℃에서 0일, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월) 안정성 연구를 계속하였다. 시험 항목은 다음과 같다: 단백질 농도, 외형, 가시 입자, pH, 순도(SEC-HPLC, 비환원형 CE-SDS), 전하 변이체, 생물 활성. 설계 계획은 하기 표 23에 나타나 있다.

실험 결과

외형에 있어서, 단백질 농도가 증가함에 따라 유백색이 증가하였으며, 항체의 농도가 높을 때의 제형 샘플은 보다 용이하게 황색으로 변하였다(표 24 참조). 그러나 9개월간의 장기 및 가속화 안정성 시험 이후, 제형 샘플은 여전히 투명하고 가시 입자가 없었으며, 그 결과 주사 요건을 충족하였다. 연구 도중에 단백질 농도 및 pH의 유의한 변화는 없었다(표 25 및 표 26 참조).

순도 시험 결과에 따르면 시간이 경과하고 농도가 증가함에 따라 항체 A-1의 SEC 및 CE-SDS 순도는 감소하는 것으로 나타났다. 샘플의 CE-SDS 순도는 약간 더 감소하였다(표 27, 표 28 및 표 29 참조). 그러나 9개월간의 안정성 시험 이후, 제품의 순도는 여전히 상응하는 품질 표준을 충족하였으며, 순도의 변화는 허용 가능한 범위 내에 있었다.

전하 변이체에 대한 시험 결과에 따르면(표 30 참조) 항체 A-1의 단백질 농도가 증가함에 따라 집성체 및 산성/염기성 전하 변이체가 증가하였으며, 보다 낮은 단백질 농도에서의 안정성이 보다 양호한 것으로 나타났다. 그러나 피크의 형태를 보고 판단하면, 3개의 농도에서 큰 차이가 없었으며, 양상도 일정하였다. 3개월째의 샘플에 대한 생물 활성 시험에 따르면, 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이 생물 활성은 비교적 안정한 것으로 나타났다. 상기 결과에 기초하여, 이러한 제형에서 단백질은 적어도 18개월 동안 안정하였다.

장기 및 가속화 안정성 연구에서 3개의 상이한 항체 농도에서 항체 A-1의 제형(20 mM 시트르산나트륨, 140 mM 아르기닌 염산염, 0.04% 트윈-80, pH 5.8)을 시험하였다. 9개월 후, 가속화 및 장기 안정성 연구와는 무관하게 단백질의 품질은 설정된 품질 표준을 여전히 충족하였다. 특히 9개월간의 장기 저장 이후에도 항체 A-1의 순도는 98% 초과로 유지되었다.

당업자에게 청구된 실시형태를 구성하고 이용하는 방법을 충분히 개시하고 설명하기 위해 상술한 실시형태가 제공되며, 이들은 본 개시내용의 범주를 제한하기 위한 것은 아니다. 당업자에게 자명한 변경은 본원의 청구범위의 범주 내에 있다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원 각각이 구체적이고 독립적으로 본원에서 참고로 포함되는 바와 같이 이들 모두는 본원에서 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Gmax Biopharm LLC <120> ETAR Antibody, and Pharmaceutical Compositions and Use Thereof <130> 2016 <160> 205 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1868 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 gaattcggga aaaagtgaag gtgtaaaagc agcacaagtg caataagaga tatttcctca 60 aatttgcctc aagatggaaa ccctttgcct cagggcatcc ttttggctgg cactggttgg 120 atgtgtaatc agtgataatc ctgagagata cagcacaaat ctaagcaatc atgtggatga 180 tttcaccact tttcgtggca cagagctcag cttcctggtt accactcatc aacccactaa 240 tttggtccta cccagcaatg gctcaatgca caactattgc ccacagcaga ctaaaattac 300 ttcagctttc aaatacatta acactgtgat atcttgtact attttcatcg tgggaatggt 360 ggggaatgca actctgctca ggatcattta ccagaacaaa tgtatgagga atggccccaa 420 cgcgctgata gccagtcttg cccttggaga ccttatctat gtggtcattg atctccctat 480 caatgtattt aagctgctgg ctgggcgctg gccttttgat cacaatgact ttggcgtatt 540 tctttgcaag ctgttcccct ttttgcagaa gtcctcggtg gggatcaccg tcctcaacct 600 ctgcgctctt agtgttgaca ggtacagagc agttgcctcc tggagtcgtg ttcagggaat 660 tgggattcct ttggtaactg ccattgaaat tgtctccatc tggatcctgt cctttatcct 720 ggccattcct gaagcgattg gcttcgtcat ggtacccttt gaatataggg gtgaacagca 780 taaaacctgt atgctcaatg ccacatcaaa attcatggag ttctaccaag atgtaaagga 840 ctggtggctc ttcgggttct atttctgtat gcccttggtg tgcactgcga tcttctacac 900 cctcatgact tgtgagatgt tgaacagaag gaatggcagc ttgagaattg ccctcagtga 960 acatcttaag cagcgtcgag aagtggcaaa aacagttttc tgcttggttg taatttttgc 1020 tctttgctgg ttccctcttc atttaagccg tatattgaag aaaactgtgt ataacgagat 1080 ggacaagaac cgatgtgaat tacttagttt cttactgctc atggattaca tcggtattaa 1140 cttggcaacc atgaattcat gtataaaccc catagctctg tattttgtga gcaagaaatt 1200 taaaaattgt ttccagtcat gcctctgctg ctgctgttac cagtccaaaa gtctgatgac 1260 ctcggtcccc atgaacggaa caagcatcca gtggaagaac cacgatcaaa acaaccacaa 1320 cacagaccgg agcagccata aggacagcat gaactgacca cccttagaag cactcctcgg 1380 tactcccata atcctctcgg agaaaaaaat cacaaggcaa ctgtgagtcc gggaatctct 1440 tctctgatcc ttcttcctta attcactccc acacccaaga agaaatgctt tccaaaaccg 1500 caagggtaga ctggtttatc 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cagcgtcgag aggtggcaaa 960 gaccgtcttc tgcttggttg tcatcttcgc cctgtgctgg ttccctcttc acttaagccg 1020 aattttgaag aaaaccgtct atgatgagat ggataagaac cggtgtgaac tgctcagctt 1080 cttgctgctc atggattaca ttggcattaa cctggcaacc atgaactctt gcataaaccc 1140 aatagctctg tattttgtga gcaagaaatt caaaaattgt tttcagtcat gcctctgttg 1200 ctgttgtcac cagtccaaaa gcctcatgac ctcggtcccc atgaatggaa cgagtatcca 1260 gtggaagaac caggagcaga accacaacac agaacggagc agccacaagg acagcatgaa 1320 ctaaccctgt gcagaagcac cgagcagtgt gccttcgagt cccaggatga aacggtcacg 1380 cagcagctgc gctcccaaaa cctcccaggt ctctcccctg ctttttgtct aagctt 1436 <210> 6 <211> 426 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Met Gly Val Leu Cys Phe Leu Ala Ser Phe Trp Leu Ala Leu Val Gly 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Asp Asn Ala Glu Arg Tyr Ser Ala Asn Leu Ser Ser 20 25 30 His Val Glu Asp Phe Thr Pro Phe Pro Gly Thr Glu Phe Asp Phe Leu 35 40 45 Gly Thr Thr Leu Arg Pro Pro Asn Leu Ala Leu Pro Ser Asn Gly Ser 50 55 60 Met His Gly Tyr Cys Pro Gln Gln Thr Lys Ile Thr Thr Ala 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275 280 285 Ser Leu Arg Ile Ala Leu Ser Glu His Leu Lys Gln Arg Arg Glu Val 290 295 300 Ala Lys Thr Val Phe Cys Leu Val Val Ile Phe Ala Leu Cys Trp Phe 305 310 315 320 Pro Leu His Leu Ser Arg Ile Leu Lys Lys Thr Val Tyr Asp Glu Met 325 330 335 Asp Lys Asn Arg Cys Glu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Met Asp Tyr 340 345 350 Ile Gly Ile Asn Leu Ala Thr Met Asn Ser Cys Ile Asn Pro Ile Ala 355 360 365 Leu Tyr Phe Val Ser Lys Lys Phe Lys Asn Cys Phe Gln Ser Cys Leu 370 375 380 Cys Cys Cys Cys His Gln Ser Lys Ser Leu Met Thr Ser Val Pro Met 385 390 395 400 Asn Gly Thr Ser Ile Gln Trp Lys Asn Gln Glu Gln Asn His Asn Thr 405 410 415 Glu Arg Ser Ser His Lys Asp Ser Met Asn 420 425 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 7 agggccagtc agaacattgg cacaagcata cac 33 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 8 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 9 cgagcaagtg aaaatattta cagttattta gca 33 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 10 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 11 cagagcctct ttgatattga tggaaagaca tatttgaat 39 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 12 Gln Ser Leu Phe Asp Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 13 cgggcaagtc aggacattgg tggtagctta aac 33 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 14 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Gly Ser Leu Asn 1 5 10 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 15 agggccagcc agactattag cgacttctta cac 33 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 16 Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Phe Leu His 1 5 10 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 17 agggcaagtg aggacataca cactcaatta gcc 33 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 18 Arg Ala Ser Glu Asp Ile His Thr Gln Leu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 19 agatctagtc agtacattgt tcatagtact ggaaccacct atttagaa 48 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 20 Arg Ser Ser Gln Tyr Ile Val His Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 21 agatctagtc attaccttgt tcatgataac ggaaacacct atgttgaa 48 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 22 Arg Ser Ser His Tyr Leu Val His Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Val Glu 1 5 10 15 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 23 agatctagtc agaacattgt ccatagtact ggaaacacct atttagaa 48 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 24 Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 25 agtgtcagct caagtgtaag ttacatacac 30 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 26 Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 1 5 10 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 27 agtgccagct caagtgtaag ttacatgtgc 30 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 28 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Cys 1 5 10 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 29 cagggcatta acaattat 18 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 30 Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 31 tatgcttcta agtctatatc t 21 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 32 Tyr Ala Ser Lys Ser Ile Ser 1 5 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 33 aatgcaaaaa ccttagcaga a 21 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 34 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 35 ctggtgtctg aattggactc t 21 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 36 Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser 1 5 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 37 gccacatcca gcttagattc t 21 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 38 Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser 1 5 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 39 tatgcttccc aatccatctc t 21 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 40 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 41 ggtgcagcca gtttgaaaag t 21 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 42 Gly Ala Ala Ser Leu Lys Ser 1 5 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 43 aaagtttcca accgattttc t 21 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 44 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 45 gacacatcca aactggcttc t 21 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 46 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 47 tatacatcaa ctttacagtc a 21 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 48 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 49 caacatagtt atagcttccc gtggacg 27 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 50 Gln His Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 51 cagcatcatt atggtattcc gttcacg 27 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 52 Gln His His Tyr Gly Ile Pro Phe Thr 1 5 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 53 tggcaaggta cacattttcc gctcacg 27 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 54 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 55 ctacaatatg ctagttctcc gtatacg 27 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 56 Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 57 caaagtggta acacctttcc gtggacg 27 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 58 Gln Ser Gly Asn Thr Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 59 caacagtata ggagtattcc gtggacg 27 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 60 Gln Gln Tyr Arg Ser Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 61 tttcaaggtt cacattttcc attcacg 27 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 62 Phe Gln Gly Ser His Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 63 tttcaaggtt cacatttccc attcacg 27 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 64 His Gln Trp Ser Thr Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 65 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 65 cagcagtgga gtagtaaccc acccacg 27 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 66 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 67 cagcagttta gtaaacttcg gaca 24 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 68 Gln Gln Phe Ser Lys Leu Arg Thr 1 5 <210> 69 <211> 36 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 69 gggttctcac tgaccacttc tggcttgggt gttgcc 36 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 70 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly Leu Gly Val Ala 1 5 10 <210> 71 <211> 30 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 71 ggctacacct ttactagcta ctggatacac 30 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 72 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His 1 5 10 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 73 ggcctcaaca ttaaagacat ctatattcac 30 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 74 Gly Leu Asn Ile Lys Asp Ile Tyr Ile His 1 5 10 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 75 ggttactcat tcaccaacta ctggatacac 30 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 76 Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His 1 5 10 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 77 ggattcactt tcagtgacta tcccatgtct 30 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 78 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Pro Met Ser 1 5 10 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 79 ggattcactt tcagtagctt tggcatgtct 30 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 80 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 81 ggattcactt tcagtaccta tggcatgtct 30 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 82 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 83 ggattcactt tcagtagtta tggcatgtct 30 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 84 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 85 <211> 36 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 85 gggttttcac tgaccacttc tggtatgggt gtaggc 36 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 86 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly Met Gly Val Gly 1 5 10 <210> 87 <211> 36 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 87 ggattttcac tgagcacttc tggtttgggt gtaggc 36 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 88 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Leu Gly Val Gly 1 5 10 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 89 ggattcacct tcagtgatta ttac 24 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 90 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 91 <211> 48 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 91 cacatttggt cggatggtga cacgcgctat tacccagccc tgaagaac 48 <210> 92 <211> 16 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 92 His Ile Trp Ser Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Tyr Pro Ala Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 93 <211> 36 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 93 tacattaatc ctgacactga ttatagtgag tacaat 36 <210> 94 <211> 12 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 94 Tyr Ile Asn Pro Asp Thr Asp Tyr Ser Glu Tyr Asn 1 5 10 <210> 95 <211> 36 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 95 aggattgatc ctgcgaacgg taagactgca tatgac 36 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 96 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Ala Tyr Asp 1 5 10 <210> 97 <211> 36 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 97 atgattgatc cttccgatgc tgaaactggg ttaaat 36 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 98 Met Ile Asp Pro Ser Asp Ala Glu Thr Gly Leu Asn 1 5 10 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 99 gttagtgatg gtggtggttc cacc 24 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 100 Val Ser Asp Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 101 attagtagtg ctggtagttt cacc 24 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 102 Ile Ser Ser Ala Gly Ser Phe Thr 1 5 <210> 103 <211> 51 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 103 accattaata ctaatggtgg taccacctat tatcgagaca gtgtgaaggg c 51 <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 104 Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 105 <211> 51 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 105 accataaata ctaatggtgg taacacctat tattcagaca atgtgaaggg c 51 <210> 106 <211> 17 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 106 Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 107 <211> 51 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 107 accattagta ctaatggtgc caccgccaat tatccagaca gtgtgaaggg c 51 <210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 108 Thr Ile Ser Thr Asn Gly Ala Thr Ala Asn Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 109 <211> 48 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 109 cacatttggt gggatgatga taagtactat aatccatccc tgaagagc 48 <210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 110 His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 111 <211> 48 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 111 cacatttggt gggatgatga taagtactat aatccatccc ttaagaga 48 <210> 112 <211> 16 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 112 His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Arg 1 5 10 15 <210> 113 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cttcctacta tagctacgac cattctatgg actac 45 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 124 Thr Arg His Ala Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp His Ser Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 125 <211> 36 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 125 gcaagacggg ggtacgacgt tgggtgcttt gaccac 36 <210> 126 <211> 12 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 126 Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Val Gly Cys Phe Asp His 1 5 10 <210> 127 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 127 gcaagagact acggggctat ggactac 27 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 128 Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 129 <211> 27 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 129 gcaactgaaa agggagctat gggctac 27 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 130 Ala Thr Glu Lys Gly Ala Met Gly Tyr 1 5 <210> 131 <211> 57 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 131 gctcgaagaa ctgagactat gattacgaca gtgctatatt actatgctat ggactac 57 <210> 132 <211> 19 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 132 Ala Arg Arg Thr Glu Thr Met Ile Thr Thr Val Leu Tyr Tyr Tyr Ala 1 5 10 15 Met Asp Tyr <210> 133 <211> 54 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 133 gctcgaagga gggaagttaa cttcggtatt aactattact attctatgga ctac 54 <210> 134 <211> 18 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 134 Ala Arg Arg Arg Glu Val Asn Phe Gly Ile Asn Tyr Tyr Tyr Ser Met 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 135 <211> 36 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 135 gtaagagatt cctatcacta cgggtacttc gatgtc 36 <210> 136 <211> 12 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 136 Val Arg Asp Ser Tyr His Tyr Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 137 <211> 324 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 137 gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaaa aagagtcagt 60 ttctcctgca gggccagtca gaacattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120 aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctaagt ctatatctgg gatttcttcc 180 aggtttagtg gcagtggctc agggacagat tttactctta gtatcaacag tgtggagtct 240 gaagatattg cagcttatta ctgtcaacat agttatagct tcccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324 <210> 138 <211> 108 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 138 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser 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muscus <400> 152 Glu Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser His Tyr Leu Val His Asp 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Val Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 153 <211> 339 <212> DNA <213> Mus muscus <400> 153 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gaacattgtc catagtactg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgattt ataaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc caaacaggtt ccgtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 accagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acattttcca 300 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaacgg 339 <210> 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tgggcctcag ctggttaggc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcgagg cttctggtta ctcattcacc aactactgga tacactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gtcttgagtg gattggcatg attgatcctt ccgatgctga aactgggtta 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcccgac atctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagaattggc 300 gattactata atatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 172 <211> 118 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 172 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ala Glu Thr Gly Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Gly Asp Tyr Tyr Asn Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 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acatgagcac cctgagacct gaggacagtg ccacttatta ctgtgtaaga 300 gattcctatc actacgggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 188 <211> 121 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 188 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Arg Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu His Met Ser Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg Asp Ser Tyr His Tyr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 189 <211> 360 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 189 caggtgaccc tgaaggaatc cgggcctact ctggtgaaac ctacccagac tctgactctg 60 acttgtactt ttagcggctt ctcactgacc acatctggac tgggagtggc ttggatcaga 120 cagcctcctg gaaaggccct ggagtggctg gctcacattt 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tacaactggc 60 tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 120 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960 tctcctggta aaggc 975 <210> 198 <211> 325 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 198 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 100 105 110 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys Gly 325 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 199 tttggrggga agatgaagac 20 <210> 200 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 200 ttaacactct cccctgttga a 21 <210> 201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 201 ttaacactca ttcctgttga a 21 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 202 tggacaggga tccagagttc c 21 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 203 tggacagggc tccatagttc c 21 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 204 actcgtcctt ggtcaacgtg 20 <210> 205 <211> 9 <212> PRT <213> Mus muscus <400> 205 Gln His Ser Tyr Ser Trp Pro Trp Thr 1 5 　　

Claims

ET_AR 항체, 완충제, 계면 활성제 및 아미노산 보호제를 포함하는 ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형으로서, 상기 제형은 5 내지 7 의 pH를 갖고,
상기 ET_AR 항체의 농도는 10 내지 200 ㎎/㎖ 이고,
상기 완충제의 농도는 1 mM 내지 200 mM 이고,
상기 계면 활성제는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하며, 상기 계면 활성제의 농도는 0.001 내지 1 중량/부피% 이고,
상기 아미노산 보호제는 아르기닌 또는 이의 염을 포함하며, 상기 아미노산 보호제의 농도는 1 mM 내지 500 mM 이고,
상기 ET_AR 항체는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 162 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 190을 포함하고,
상기 ET_AR 항체는 추가적으로 경쇄 불변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 194 또는 서열번호 196; 및 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열: 서열번호 198을 포함하는 것인, ET_AR 항체의 안정된 약학적 용액 제형.
제1항에 있어서, 상기 ET_AR 항체는 쥐 ET_AR 항체 또는 인간화 ET_AR 항체인 제형.
제1항에 있어서, 상기 ET_AR 항체는 단클론성 ET_AR 항체인 제형.
제1항에 있어서,
(i) 상기 ET_AR 항체는 엔도텔린의 신호 전달(signal transduction)이 감소할 때 1 nM 내지 200 nM 또는 10 nM 내지 100 nM 의 IC₅₀을 갖거나; 또는
(ii) 상기 ET_AR 항체의 농도는 10 내지 100 ㎎/㎖ 이거나; 상기 ET_AR 항체의 농도는 25 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖, 75 ㎎/㎖ 또는 100 ㎎/㎖ 이거나; 또는
(iii) 상기 완충제의 농도는 2 mM 내지 50 mM 또는 5 mM 내지 25 mM 이거나; 상기 완충제의 농도는 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM 또는 30 mM 이거나; 또는
(iv) 상기 완충제는 시트르산 또는 히스티딘의 염을 포함하는 것인 제형.
제1항에 있어서,
(i) 상기 계면 활성제의 농도는 0.001 내지 1 중량/부피%, 0.01 내지 0.5 중량/부피% 또는 0.01 내지 0.1 중량/부피% 이거나; 상기 계면 활성제의 농도는 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 또는 0.06 중량/부피% 이거나; 또는
(ii) 상기 아미노산 보호제는 아르기닌 염산염을 포함하거나; 또는
(iii) 상기 아미노산 보호제의 농도는 10 mM 내지 200 mM 이거나; 상기 아미노산 보호제의 농도는 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM 또는 160 mM 인 것인 제형.
제1항에 있어서, 상기 ET_AR 항체의 농도는 10 내지 200 ㎎/㎖ 이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.01 내지 0.1 중량/부피% 이고; 상기 아미노산 보호제의 농도는 10 내지 200 mM 이고; 상기 완충제의 농도는 1 내지 50 mM 이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 7 인 것인 제형.
제6항에 있어서, 상기 ET_AR 항체의 농도는 25, 50, 75, 또는 100 ㎎/㎖이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.04 중량/부피%이고; 상기 아미노산 보호제의 농도는 140 mM이고; 상기 완충제의 농도는 20 mM이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 6 인 것인 제형.
제1항에 있어서, 폴리올 보호제를 추가로 포함하는 것인 제형.
제8항에 있어서,
(i) 상기 폴리올 보호제는 소르비톨, 만니톨, 수크로오스 또는 트레할로오스를 포함하거나; 또는
(ii) 상기 폴리올 보호제의 농도는 0.1 내지 50 중량/부피%, 1 내지 20 중량/부피% 또는 1 내지 10 중량/부피% 이거나; 상기 폴리올 보호제의 농도는 4 내지 10 중량/부피% 인 것인 제형.
제9항에 있어서,
(i) 상기 ET_AR 항체의 농도는 10 내지 200 ㎎/㎖ 이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.01 내지 0.1 중량/부피% 이고; 상기 폴리올 보호제의 농도는 1 내지 20 중량/부피% 이고; 상기 완충제의 농도는 1 내지 50 mM 이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 7 이거나; 또는
(ii) 상기 ET_AR 항체의 농도는 25, 50, 75 또는 100 ㎎/㎖이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.04 중량/부피%이고; 상기 폴리올 보호제의 농도는 4 내지 10 중량/부피% 이고; 상기 완충제의 농도는 20 mM이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 6 인 것인 제형.
제1항에 있어서, 금속 킬레이트제(metal chelator)를 추가로 포함하는 것인 제형.
제11항에 있어서,
(i) 상기 금속 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 또는 에틸렌글리콜 디에틸 에테르 디아민테트라아세트산을 포함하거나; 또는
(ii) 상기 금속 킬레이트제의 농도는 0.001 mM 내지 1 mM, 0.005 mM 내지 0.5 mM 또는 0.01 mM 내지 0.2 mM 이거나; 상기 금속 킬레이트제의 농도는 0.03 mM, 0.04 mM, 0.05 mM, 0.06 mM 또는 0.07 mM 인 것인 제형.
제12항에 있어서,
(i) 상기 ET_AR 항체의 농도는 10 내지 200 ㎎/㎖ 이고; 상기 금속 킬레이트제의 농도는 0.01 mM 내지 0.2 mM 이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.01 내지 0.1 중량/부피% 이고; 상기 아미노산 보호제의 농도는 10 내지 200 mM 이고; 상기 완충제의 농도는 1 내지 50 mM 이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 7 이거나; 또는
(ii) 상기 ET_AR 항체의 농도는 25, 50, 75 또는 100 ㎎/㎖이고; 상기 금속 킬레이트제의 농도는 0.05 mM이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.04 중량/부피% 이고; 상기 아미노산 보호제의 농도는 140 mM이고; 상기 완충제의 농도는 20 mM이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 6인 것인 제형.
제12항에 있어서, 폴리올 보호제를 추가로 포함하는 것인 제형.
제14항에 있어서,
(i) 상기 ET_AR 항체의 농도는 10 내지 200 ㎎/㎖ 이고; 상기 금속 킬레이트제의 농도는 0.01 mM 내지 0.2 mM 이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.01 내지 0.1 중량/부피% 이고; 상기 폴리올 보호제의 농도는 1 내지 20 중량/부피% 이고; 상기 완충제의 농도는 1 내지 50 mM 이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 7 이거나; 또는
(ii) 상기 ET_AR 항체의 농도는 25, 50, 75 또는 100 ㎎/㎖이고; 상기 금속 킬레이트제의 농도는 0.05 mM이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.04 중량/부피%이고; 상기 폴리올 보호제의 농도는 4 내지 10 중량/부피% 이고; 상기 완충제의 농도는 20 mM이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 6 인 것인 제형.
제1항에 있어서, 산화 방지제를 추가로 포함하는 것인 제형.
제16항에 있어서,
(i) 상기 산화 방지제는 메티오닌, 비타민 C, 티오설페이트, 티오설페이트 또는 벤질 메티오닌을 포함하거나; 또는
(ii) 상기 산화 방지제의 농도는 0.5 mM 내지 20 mM 또는 1 mM 내지 10 mM 이거나; 상기 산화 방지제의 농도는 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM 또는 7 mM 인 것인 제형.
제17항에 있어서,
(i) 상기 ET_AR 항체의 농도는 10 내지 200 ㎎/㎖ 이고; 상기 산화 방지제의 농도는 1 mM 내지 10 mM 이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.01 내지 0.1 중량/부피% 이고; 상기 아미노산 보호제의 농도는 10 내지 200 mM 이고; 상기 완충제의 농도는 1 내지 50 mM 이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 7 이거나; 또는
(ii) 상기 ET_AR 항체의 농도는 25, 50, 75 또는 100 ㎎/㎖이고; 상기 산화 방지제의 농도는 5 mM이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.04 중량/부피%이고; 상기 아미노산 보호제의 농도는 140 mM이고; 상기 완충제의 농도는 20 mM이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 6 인 것인 제형.
제17항에 있어서, 폴리올 보호제를 추가로 포함하는 것인 제형.
제19항에 있어서,
(i) 상기 ET_AR 항체의 농도는 10 내지 200 ㎎/㎖ 이고; 상기 산화 방지제의 농도는 1 mM 내지 10 mM 이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.01 내지 0.1 중량/부피% 이고; 상기 폴리올 보호제의 농도는 1 내지 20 중량/부피% 이고; 상기 완충제의 농도는 1 내지 50 mM이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 7 이거나; 또는
(ii) 상기 ET_AR 항체의 농도는 25, 50, 75 또는 100 ㎎/㎖이고; 상기 산화 방지제의 농도는 5 mM이고; 상기 계면 활성제의 농도는 0.04 중량/부피% 이고; 상기 폴리올 보호제의 농도는 4 내지 10 중량/부피% 이고; 상기 완충제의 농도는 20 mM이며; 이때 상기 제형의 pH는 5 내지 6 인 것인 제형.
제1항에 있어서,
(i) 상기 제형은 수용액이거나; 또는
(ii) 상기 제형은 2 내지 8℃에서 12개월간의 저장 이후에 10% 이하의 응집된 ET_AR 항체를 함유하거나; 또는
(iii) 항체 분해 정도가 2 내지 8℃에서 12개월간의 저장 이후에 10%를 초과하지 않거나; 또는
(iv) 상기 ET_AR 항체의 생물학적 활성은 2 내지 8℃에서 12개월간의 저장 이후에 본래의 생물학적 활성의 50% 이상인 것인 제형.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형은 개체에서 폐동맥 고혈압, 개체에서 폐동맥압 증가(elevated pulmonary arterial pressure)와 연관된 질병, 개체에서 생식 기관 암, 또는 개체에서 폐동맥압 증가가 동반되는 생식 기관 암의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키기 위한 것인 제형이고, 상기 제형은 정맥 내 또는 피하 투여되는 것인 제형.
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