CN103980364A - 一种全人源抗her2单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全人源抗HER2单克隆抗体及其制备方法与应用。本发明公开的一种抗体，该抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述抗体的轻链可变区包含三个互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述抗体的重链可变区包含三个互补决定区CDRH4、CDRH5、CDRH6。本发明公开的全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1具有显著的抑制HER2高表达的乳腺癌细胞体外增殖活性以及体内成肿瘤作用，该抗体在乳腺癌的治疗中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗体及其制备方法与应用；特别涉及一种全人源抗HER2单克隆抗体及其制备方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一，资料统计表明其发病率占全身各种恶性肿瘤的7％-10％。每年全世界约有120万乳腺癌新发病例，约有50万女性死于乳腺癌。HER2基因为乳腺癌的主要致病相关基因，其产物在20％-30％的患者中有过表达现象，HER2过度表达提示患者预后不良，并对细胞毒性化疗药产生抵抗(Slamon DJ,Clark GM,Wong SG,Levin WJ,Ullrich A,McGuire WL.Human breast cancer:correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene.Science.1987Jan9；235(4785):177-82)。
人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor)家族有4个成员：EGFR、HER2(人类表皮生长因子受体2)、ErbB3和ErbB4，广泛表达于上皮、间质及神经组织，生理状态下它们参与激活一系列复杂的细胞信号转导途径，调控正常组织细胞的生长、分裂、分化等重要生理过程。然而研究表明某些肿瘤的发生、发展及恶性生物学行为与EGFR家族的异常表达和活化关系密切(Albanell J,Codony J,Rovira A,Mellado B,Gascón P.Mechanism of action of anti-HER2monoclonal antibodies:scientific update on trastuzumab and2C4.Adv Exp Med Biol.2003；532:253-68)。HER2没有天然配体，在单体状态下无活性，当形成二聚体时可使酪氨酸激酶活化，激活MAPK和PI3K/Akt通路，最终导致肿瘤细胞增殖和存活(
Hudis CA.Trastuzumab-mechanism of action and use in clinical practice.N Engl J Med.2007Jul5；357(1):39-51)。
抗HER2人源化单克隆抗体Trastuzumab(商品名Herceptin，曲妥珠单抗，赫赛汀)是美国Genentech公司研制的针对HER2的人源化单克隆抗体，于1998年获得美国FDA批准用于HER2高表达转移性乳腺癌的治疗。但Trastuzumab的客观反应率仅为30％(Vogel CL,Cobleigh MA,Tripathy D,Gutheil JC,Harris LN,Fehrenbacher L,Slamon DJ,Murphy M,Novotny WF,Burchmore M,Shak S,Stewart SJ,Press M.Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer.J Clin Oncol.2002Feb1；20(3):719-26；Nahta R,Yu D,Hung MC,Hortobagyi GN,Esteva FJ.Mechanisms of disease:understanding resistance to HER2-targeted therapy in human breast cancer.Nat Clin Pract Oncol.2006May；3(5):269-80；Kümler I,Tuxen MK,Nielsen DL.A systematic review of dual targeting in HER2-positive breast cancer.Cancer Treat Rev.2014；40(2):259-70.)。而且Trastuzumab是一个人源化抗体，保留了鼠源CDR区和少量FR区鼠源残基，仍未能达到全人源化。研制更为有效的抗HER2治疗性抗体是临床治疗的迫切需求。
近年来，随着鼠单抗人源化技术、抗体库技术和转基因鼠技术的进展，人源抗体的研制技术正在得到解决，尤其是通过构建大容量、具有良好多样性的抗体库，为人源抗体的制备提供了有效的技术平台。噬菌体抗体库技术是全套抗体基因展示在噬菌体表面，并能在体外模拟抗体免疫系统的选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选。经过几轮“吸附—洗脱—扩增”的淘筛，可使特异性噬菌体抗体得到富集。利用噬菌体抗体库技术借助高效筛选系统，可以不经免疫方便地制备出人源抗体(王琰,化冰,刘群英,等.半合成抗体库的构建及鉴定.中华微生物学和免疫学杂志,1999；19(3):23.)。第一个来源于噬菌体抗体库的治疗性人源抗体(抗TNF-α，治疗类风湿性关节炎)已于2003年初批准上市，印证了用大容量噬菌体抗体筛选人源抗体的可行性。
Pertuzumab是美国Genentech公司研制的另一株抗HER2人源化抗体(Adams CW,Allison DE,Flagella K,Presta L,Clarke J,Dybdal N,McKeever K,Sliwkowski MX.Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor,pertuzumab.Cancer Immunol Immunother.2006Jun；55(6):717-27；Cortés J,Fumoleau P,Bianchi GV,Petrella TM,Gelmon K,Pivot X.Pertuzumab monotherapy after trastuzumab-based treatment and subsequent reintroduction of trastuzumab:activity and tolerability in patients with advanced human epidermal growth factor receptor2-positive breast cancer.J Clin Oncol2012；30:1594-600；Zagouri F,Sergentanis TN,Chrysikos D,Zografos CG,Filipits M,Bartsch R,Dimopoulos MA,Psaltopoulou T.Pertuzumab in breast cancer:a systematic review.Clin Breast Cancer.2013,13(5):315-24；Metzger-Filho O,Winer EP,Krop I.Pertuzumab:optimizing HER2blockade.Clin Cancer Res.2013；19(20):5552-6；McCormack PL.Pertuzumab:a review of its use for first-line combination treatment of HER2-positive metastatic breast cancer.Drugs.2013；73(13):1491-502)。
发明内容
本发明的目的是提供一种全人源抗HER2单克隆抗体及其制备方法与应用，本发明提供的全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1具有显著的抑制HER2高表达的乳腺癌细 胞体外增殖以及体内成肿瘤作用。
本发明提供一种抗体，该抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述抗体的轻链可变区包含三个互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述抗体的重链可变区包含三个互补决定区CDRH4、CDRH5、CDRH6；
所述CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID No.8中自N末端起第23位至第33位氨基酸所示；
所述CDRL2的氨基酸序列如SEQ ID No.8中自N末端起第49位至第56位氨基酸所示；
所述CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID No.8中自N末端起第90位至第100位氨基酸所示；
所述CDRH1的氨基酸序列如SEQ ID No.6中自N末端起第30位至第35位氨基酸所示；
所述CDRH2的氨基酸序列如SEQ ID No.6中自N末端起第50位至第66位氨基酸所示；
所述CDRH3的氨基酸序列如SEQ ID No.6中自N末端起第99位至第107位氨基酸所示。
上述抗体中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
上述任一所述的抗体中，所述抗体为一种全人源单克隆抗体，由两个相同的半分子组成，其中每个半分子由通过二硫键连接的一条轻链和一条重链组成，所述两个半分子的两条重链之间通过二硫键连接；该抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区为权利要求1或2所述的轻链可变区，所述重链可变区为权利要求1或2所述的重链可变区；
所述抗体的轻链含有的轻链恒定区为人抗体的轻链恒定区；
所述抗体的重链含有的重链恒定区为人抗体的重链恒定区。
上述任一所述的抗体中，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
上述任一所述的抗体中，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
上述任一所述的抗体在制备抗人类表皮生长因子受体2的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
或，
上述任一所述的抗体在制备抑制乳腺癌细胞生长和/或增殖的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
或，
上述任一所述的抗体在制备抑制乳腺癌细胞在动物体内形成肿瘤的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述乳腺癌细胞为人乳腺癌细胞；
所述人乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞BT-474或人乳腺癌细胞MCF-7。
上述任一所述的抗体在制备抗乳腺癌药物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供的抗体在乳腺癌的治疗中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为抗HER2抗体对乳腺癌细胞BT-474的体外生长抑制活性。
图2为抗HER2抗体对乳腺癌细胞MCF-7的体外生长抑制活性。
图3为抗HER2抗体对BT-474乳腺癌的体内抗肿瘤作用。
图4为抗HER2抗体对MCF-7乳腺癌的体内抗肿瘤作用。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例不包括对传统方法的详细描述，如：Overlapping PCR反应，限制性酶切反应，将基因插入到质粒载体，将质粒引入宿主细胞的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit购自QIAGEN公司。
大肠杆菌HB2151购自Pharmacia公司。
乳腺癌细胞BT-474购自American Type Culture Collection(ATCC)，产品目录号为HTB-20。
乳腺癌细胞MCF-7购自ATCC，产品目录号为HTB-22TM。
pGEM-T载体购自Promega公司。
pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司。
CHO-K1细胞购自ATCC，产品目录号为ATCC CRL-9618。
Lipofectamine2000Reagent购自Invitrogen公司。
rProtein A Sepharose4Fast Flow购自GE公司。
CellTiter96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)试剂盒 购自Promega公司，产品目录号为G3580。
抗HER2人源化抗体Pertuzumab(Perjeta)购自Roche公司。
抗HER2人源化抗体Trastuzumab(Herceptin)购自Roche公司。
6周龄雌性BALB/c裸鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
实施例1、全人源抗HER2单克隆抗体的制备
一、全人源抗HER2单克隆抗体重链恒定区、轻链恒定区基因的合成
用淋巴细胞分离液(购自北京鼎国生物技术有限责任公司)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取其总RNA，根据文献“HieterPA，Max EE，Seidman JG，Maizel JV Jr，Leder P.Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments.Cell.1980；22(1Pt1):197-207”和文献“Ellison JW，Berson BJ，Hood LE.The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C gamma1gene.Nucleic Acids Res.1982Jul10；10(13)：4071-9”报道的序列分别设计引物采用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit扩增抗体重链和轻链恒定区基因。将人抗体的重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)基因分别连接到pGEM-T载体中，得到重组质粒分别命名为pGEM-T/CH和pGEM-T/CL，测序验证后确认获得了正确的克隆。
SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别显示了人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别显示了人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。
二、全人源抗HER2噬菌体抗体的筛选
用于淘选的抗原蛋白“人HER2膜外区蛋白”按照文献”Carter P1,Presta L,Gorman CM,Ridgway JB,Henner D,Wong WL,Rowland AM,Kotts C,Carver ME,Shepard HM.Humanization of an anti-p185HER2antibody for human cancer therapy.Proc Natl Acad Sci U S A.1992May15；89(10):4285-9”的方法制备。
利用人HER2膜外区蛋白用全人源噬菌体抗体库(构建方法见文献“乔媛媛，王琰，陈晓穗，王欲晓，化冰.大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定,中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(3),194-197”)，并按照文献“王欲晓乔媛媛周丽君王琰.从大容量抗体库中筛选抗TNF-α人单链抗体.细胞与分子免疫学杂志.2008,24(9):878-880”的方法进行多轮筛选，最终获得了两株HER2特异性噬菌体抗体克隆，经多次淘选噬菌体抗体库后获得了人源抗HER2噬菌体抗体。
可溶性抗HER2抗体的表达
将上述获得的多株人源抗HER2噬菌体抗体108倍稀释后感染大肠杆菌HB2151(方法见文献“王琰,刘群英,化冰,陈宇萍,朱迎春,陈晓穗,从半合成抗体库克隆抗TNF-α人单链抗体,免疫学杂志,1999,15(4):87-89.”)，37℃孵育15分钟后铺培养盘。挑取单个集落接种于含有100μg/ml Amp的2YT培养液中培养过夜，第二天取30μl菌液接种到1ml SB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入IPTG使其在培养基中的终浓度为1mmol/L，30℃培养过夜，收取上清即得到可溶性抗体(scFv)。
非抑制表型菌HB2151中，scFv以游离可溶的形式存在，在GⅢ信号肽介导下分泌表达。将上述获得的可溶性抗体进行特异性检测，其中1株抗HER2scFv的重链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
三、全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1的制备
(一)F0178C1的重链表达载体的构建
以上述scFv抗体重链可变区基因(SEQ ID No.5)和pGEM-T/CH为模板，设计引物通过Overlapping PCR反应获得全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1的重链基因，将此Overlapping PCR产物记作F0178C1SH，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。在SEQ ID No.9中，HindIII限制酶位点为SEQ ID No.9中自5’末端起第1位至第6位核苷酸所示，信号肽序列为SEQ ID No.9中自5’末端起第16位至第72位核苷酸所示，F0178C1抗体重链基因F0178C1VHCH的序列为SEQ ID No.9中自5’末端起第73位至第1416位核苷酸所示，翻译终止密码为SEQ ID No.9中自5’末端起第1417位至第1419位核苷酸所示，限制酶位点EcoRⅠ为SEQ ID No.9中自5’末端起第1420位至第1425位核苷酸所示。
将F0178C1SH插入pGEM-T载体，得到重组质粒，将其命名为pGEM-T/F0178C1SH，将pGEM-T/F0178C1SH送测序，结果正确。
利用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T/F0178C1SH，得到基因片段；利用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1(+)质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pcDNA3.1(+)(F0178C1SH)，将pcDNA3.1(+)(F0178C1SH)送测序，结果正确。
(二)F0178C1的轻链表达载体的构建
以F0178C1抗体轻链可变区基因(SEQ ID No.7)和pGEM-T/CL载体为模板，通过Overlapping PCR反应获得全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1的轻链基因，将此Overlapping PCR产物记作F0178C1SL,其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。在SEQ ID No.10中,HindIII限制酶位点为SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第6位核苷酸所示， 信号肽序列为SEQ ID No.10中自5’末端起第16位至第81位核苷酸所示，F0178C1抗体轻链基因F0178C1VLCL的序列为SEQ ID No.10中自5’末端起第82位至第732位核苷酸所示，翻译终止密码为SEQ ID No.10中自5’末端起第733位至第735位核苷酸所示，限制酶位点EcoRⅠ为SEQ ID No.10中自5’末端起第736位至第741位核苷酸所示。
将F0178C1SL插入pGEM-T载体，得到重组质粒，将其命名为pGEM-T/F0178C1SL，将pGEM-T/F0178C1SL送测序，结果正确。
利用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T/F0178C1SL，得到基因片段；利用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1(+)质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pcDNA3.1(+)(F0178C1SL)，将pcDNA3.1(+)(F0178C1SL)送测序，结果正确。
(三)全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1的表达纯化
于3.5cm组织培养皿中接种5×105CHO-K1细胞，用DMEM培养基进行培养，将细胞培养至90％-95％融合时进行转染，具体步骤如下：取5μg质粒pcDNA3.1(+)(F0178C1SH)，5μg质粒pcDNA3.1(+)(F0178C1SL)及20μlLipofectamine2000Reagent，按Lipofectamine2000Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后，将细胞培养基换为含600μg/ml G418的DMEM培养基筛选抗性克隆。
将筛选得到的稳定表达抗体的CHO-K1细胞株用无血清培养基(EX-CELL302，购自SIGMA-ALDRICH公司)扩大培养，用rProtein A Sepharose4Fast Flow按说明书亲和纯化得到F0178C1抗体。将纯化得到的全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1用PBS进行透析，最后用紫外吸收法测定F0178C1抗体的含量。
全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1的结构描述如下：该抗体由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成，重链由重链可变区和重链恒定区组成，其中一条轻链分别与一条重链通过二硫键连接，形成两个半分子，两个半分子的两条重链之间通过二硫键连接形成所述抗体；该抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，其编码基因序列如SEQ ID No.7所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，其编码基因序列如SEQ ID No.5所示；轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其编码基因序列如SEQ ID No.3所示；重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码基因序列如SEQ ID No.1所示。
F0178C1抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
该抗体的轻链可变区包含三个互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，重链可变区 包含三个互补决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3；
所述CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID No.8中自N末端起第23位至第33位氨基酸所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.7中自5’末端起第67位至第99位核苷酸所示。
所述CDRL2的氨基酸序列如SEQ ID No.8中自N末端起第49位至第56位氨基酸所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.7中自5’末端起第145位至第168位核苷酸所示。
所述CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID No.8中自N末端起第90位至第100位氨基酸所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.7中自5’末端起第268位至第300位核苷酸所示。
所述CDRH1的氨基酸序列如SEQ ID No.6中自N末端起第30位至第35位氨基酸所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.5中自5’末端起第88位至第105位核苷酸所示。
所述CDRH2的氨基酸序列如SEQ ID No.6中自N末端起第50位至第66位氨基酸所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.5中自5’末端起第148位至第198位核苷酸所示。
所述CDRH3的氨基酸序列如SEQ ID No.6中自N末端起第99位至第107位氨基酸所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.5中自5’末端起第295位至第321位核苷酸所示。
实施例2、全人源抗HER2单克隆抗体的体外抗肿瘤活性实验
利用CellTiter96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)试剂盒检测HER2抗体(全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1)对乳腺癌细胞BT-474、MCF-7的体外生长抑制作用。具体方法如下：在2×105/ml的人乳腺癌细胞(BT-474或MCF-7)分别加入10μg/ml的HER2抗体(Pertuzumab,Trastuzumab,F0178C1)作为HER2抗体处理组，或10μg/ml的CTRL(Omalizumab购自Roche)作为对照组，37℃，5％CO2孵育。待培养至加药后第5天用MTS试剂盒按操作步骤进行检测，酶标仪490nm波长下读取背景吸光度值。将490nm的背景吸光度值进行校正，方法如下:3个重复的空白孔(无细胞)(含有与实验孔同样体积的细胞培养基及CellTiterAQueous One Solution Reagent)，从除此孔外的孔的吸光值中减去“无细胞”空白孔在490nm的吸光度平均值，即可得到对照组校正吸光度值和HER2抗体处理组校正吸光度值。细胞生长抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(1-HER2抗体处理组校正吸光度值÷对照组校正吸光度值)×100％。
HER2抗体对乳腺癌细胞BT-474的体外生长抑制作用如图1所示。
HER2抗体对乳腺癌细胞MCF-7的体外生长抑制作用如图2所示。
图1-图2表明全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1能有效抑制BT-474、MCF-7乳腺癌细胞的增殖，抑制率均能够达到50％以上。
图2表明，全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1显示出比Pertuzumab显著增强的抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用。
实施例3、全人源抗HER2单克隆抗体的体内抗肿瘤实验
6周龄雌性BALB/c裸鼠分别皮下接种数量3×106的乳腺癌细胞BT-474或MCF-7，待注射细胞约一周后瘤体体积达到100mm3，得到BT-474乳腺癌荷瘤小鼠组和MCF-7乳腺癌荷瘤小鼠组，分别将两种荷瘤小鼠随机分组，每组10只小鼠。对各荷瘤小鼠的各组小鼠尾静脉注射各HER2抗体(Pertuzumab,Trastuzumab,F0178C1)或20mg/kg对照抗体Omalizumab(该抗体指图3和图4中的Vehicle)，2次/周，持续4周。以第一次注射抗体时为第0天，用游标卡尺每隔一天测量瘤体的长(mm)与宽(mm),运用如下公式计算瘤体体积：肿瘤体积＝长×(宽)2/2。
HER2抗体对BT-474乳腺癌的体内抗肿瘤作用如图3所示。
HER2抗体对MCF-7乳腺癌的体内抗肿瘤作用如图4所示。
图3表明，在BT-474乳腺癌荷瘤小鼠组，全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1的抗肿瘤作用与Pertuzumab相似。
图4表明，在MCF-7乳腺癌荷瘤小鼠组，全人源抗HER2单克隆抗体F0178C1表现出较强的抑瘤活性。
Claims (7)
1.一种抗体，该抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述抗体的轻链可变区包含三个互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述抗体的重链可变区包含三个互补决定区CDRH4、CDRH5、CDRH6；
所述CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID No.8中自N末端起第23位至第33位氨基酸所示；
所述CDRL2的氨基酸序列如SEQ ID No.8中自N末端起第49位至第56位氨基酸所示；
所述CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID No.8中自N末端起第90位至第100位氨基酸所示；
所述CDRH1的氨基酸序列如SEQ ID No.6中自N末端起第30位至第35位氨基酸所示；
所述CDRH2的氨基酸序列如SEQ ID No.6中自N末端起第50位至第66位氨基酸所示；
所述CDRH3的氨基酸序列如SEQ ID No.6中自N末端起第99位至第107位氨基酸所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于：所述抗体为一种全人源单克隆抗体，由两个相同的半分子组成，其中每个半分子由通过二硫键连接的一条轻链和一条重链组成，所述两个半分子的两条重链之间通过二硫键连接；该抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区为权利要求1或2所述的轻链可变区，所述重链可变区为权利要求1或2所述的重链可变区；
所述抗体的轻链含有的轻链恒定区为人抗体的轻链恒定区；
所述抗体的重链含有的重链恒定区为人抗体的重链恒定区。
4.根据权利要求1-3任一所述的抗体，其特征在于：所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.根据权利要求1-4任一所述的抗体，其特征在于：所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
6.权利要求1-5任一所述的抗体在制备抗人类表皮生长因子受体2的产品中的应用；
或，
权利要求1-5任一所述的抗体在制备抑制乳腺癌细胞生长和/或增殖的产品中的应用；
或，
权利要求1-5任一所述的抗体在制备抑制乳腺癌细胞在动物体内形成肿瘤的产品中的应用。
7.权利要求1-5任一所述的抗体在制备抗乳腺癌药物中的应用。
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| 于春芳: "重组抗HER2人源化单克隆抗体抗肿瘤作用的主要药效学研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, 15 July 2012 (2012-07-15) * |
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