JP2015500829A - 上皮細胞増殖因子受容体３（ｈｅｒ３）のドメインｉｉに対するｈｅｒ３の抗体 - Google Patents

上皮細胞増殖因子受容体３（ｈｅｒ３）のドメインｉｉに対するｈｅｒ３の抗体 Download PDF

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Abstract

本発明は、リガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達および腫瘍増殖を遮断するためのＨＥＲ３受容体のドメイン２に存在するＨＥＲ３受容体のエピトープを標的とする抗体またはそのフラグメント；およびその組成物および使用方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１１年１２月５日出願の米国仮出願番号６１／５６６,９０５に対する優先権を主張し、その内容を引用により本明細書に包含させる。
発明の分野
本発明は、一般的に、ドメイン２内の残基を含むＨＥＲ３のエピトープを認識し、リガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達の両者および腫瘍増殖をもたらす抗体またはそのフラグメント；および該抗体またはそのフラグメントの組成物および使用方法に関する。
ヒト上皮細胞増殖因子受容体３(ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ３としても知られる)は、受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、受容体タンパク質チロシンキナーゼ群の上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)サブファミリーに属し、ＥＧＦＲ(ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１)、ＨＥＲ２(ＥｒｂＢ２、Ｎｅｕ)およびＨＥＲ４(ＥｒｂＢ４)もまた誘発する(Plowman et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4905-4909; Kraus et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:9193-9197;およびKraus et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2900-2904)。プロトタイプ上皮細胞増殖因子受容体と同様、膜貫通型受容体ＨＥＲ３は、細胞外リガンド結合ドメイン(ＥＣＤ)、ＥＣＤ内に二量体化ドメイン、膜貫通型ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼ様ドメイン(ＴＫＤ)およびＣ末端リン酸化ドメインから成る。他のＨＥＲファミリーメンバーと異なり、ＨＥＲ３のキナーゼドメインは極めて低い内因性キナーゼ活性を示す。
リガンドニューレグリン(ＮＲＧ)１またはニューレグリン２は、ＨＥＲ３の細胞外ドメインと結合し、他の二量体化パートナー、例えばＨＥＲ２との二量体化を促進することにより受容体仲介シグナル伝達経路を活性化する。ヘテロ二量体化はＨＥＲ３の細胞内ドメインの活性化およびトランスリン酸化を誘発し、シグナル多様化だけでなく、またシグナル増幅のための手段である。さらに、ＨＥＲ３ヘテロ二量体化はまた活性化リガンド非存在下でも起こることができ、これは、通常リガンド非依存性ＨＥＲ３活性化と呼ばれる。例えば、ＨＥＲ２が、遺伝子増幅の結果として高レベルで発現されたとき(例えば乳癌、肺癌、卵巣癌または胃癌において)、自発性ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体が形成され得る。この状況において、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３は最も活性なＥｒｂＢシグナル伝達二量体であり、それゆえに、高度にトランスフォーミングであると考えられる。
ＨＥＲ３増加は数タイプの癌、例えば乳癌、肺癌、消化器癌および膵癌で発見されている。興味深いことに、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３発現と非浸潤段階から浸潤段階への進行の相関が示されている(Alimandi et al., (1995) Oncogene 10:1813-1821; DeFazio et al., (2000) Cancer 87:487-498; Naidu et al., (1988) Br. J. Cancer 78:1385-1390)。従って、ＨＥＲ３仲介シグナル伝達を妨害する薬物が必要である。
発明の要約
本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体のエピトープ(線形、非線形、立体構造的)と結合する抗体またはそのフラグメントの発見に基づく。驚くべきことに、該抗体またはそのフラグメントのＨＥＲ３のドメイン２内のエピトープへの結合は、リガンド依存性(例えばニューレグリン)およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナル伝達経路を遮断する。
したがって、一つの面において、本発明は、ＨＥＲ３受容体のエピトープを認識する単離抗体またはそのフラグメントに関し、ここで、エピトープはＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２０８〜３２８を含み、該抗体またはそのフラグメントは、少なくともドメイン２のアミノ酸残基２６８を認識し、ここで、該抗体またはそのフラグメントはリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する。
エピトープは線形エピトープ、非線形エピトープ、および立体構造的エピトープから成る群から選択される。一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは不活性状態のＨＥＲ３受容体と結合する。一つの態様において、リガンド結合部位に結合したＨＥＲ３リガンドは、ＨＥＲ３シグナル伝達の活性化ができない。一つの態様において、ＨＥＲ３リガンドは、ＨＥＲ３受容体上のリガンド結合部位と同時に結合できる。一つの態様において、ＨＥＲ３リガンドはニューレグリン(ＮＲＧ)１、ニューレグリン２、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮増殖因子およびエピレギュリンから成る群から選択される。ここに記載する抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸残基２６８(ドメイン２内)と結合できる。一つの態様において、結合アミノ酸２６８はドメイン２の結合に影響し、それにより抗体または抗体フラグメント結合を遮断する。一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、分解に感受性とする、細胞表面ＨＥＲ３の下方制御を加速する、他のＨＥＲ受容体との二量体化を阻害するおよびタンパク質分解に感受性であるまたは他の受容体チロシンキナーゼ類と二量体できない非天然ＨＥＲ３二量体を産生するようにＥＲ３を脱安定化することから成る群から選択される特徴を有する。一つの態様において、ＨＥＲ３リガンド非存在下の抗体またはそのフラグメントのＨＥＲ３受容体への結合は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現細胞中のＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体のリガンド非依存性形成を減少させる。一つの態様において、ＨＥＲ３受容体は、ＨＥＲ２受容体が二量体化してＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成することを失敗させる。一つの態様において、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体形成失敗は、シグナル伝達の活性化を妨げる。一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３リガンド非依存性リン酸化アッセイで測定して、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する。一つの態様において、ＨＥＲ３リガンド非依存性リン酸化アッセイはＨＥＲ２増幅細胞を使用し、ここで、ＨＥＲ２増幅細胞はSK-Br-3細胞およびBT-474である。一つの態様において、ＨＥＲ３リガンド存在下の抗体またはそのフラグメントのＨＥＲ３受容体への結合は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現細胞内でのＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体リガンド依存性形成を失敗させる。一つの態様において、ＨＥＲ３受容体は、ＨＥＲ３リガンド存在下でＨＥＲ２受容体と二量体化し、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成することを失敗する。一つの態様において、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体形成失敗は、シグナル伝達の活性化を妨げる。一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３リガンド依存性リン酸化アッセイで評価してＨＥＲ３のリン酸化を阻害する。一つの態様において、ＨＥＲ３リガンド依存性リン酸化アッセイは、ニューレグリン(ＮＲＧ)存在下、刺激MCF7細胞を使用する。一つの態様において、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および合成抗体から成る群から選択される。
他の面において、本発明は、ＨＥＲ３受容体のドメイン２内のＨＥＲ３受容体のエピトープを認識する単離抗体またはそのフラグメントに関し、ここで、エピトープは、ＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２０８〜３２８を含み、抗体またはそのフラグメントは、ドメイン２内の少なくともアミノ酸残基２６８を認識し、抗体またはそのフラグメントは少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１の解離(ＫＤ)を有し、ここで、該抗体またはそのフラグメントはリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する。一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、ホスホ−ＨＥＲ３およびホスホ−Ａｋｔから成る群から選択されるインビトロリン酸化アッセイで測定して、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する。一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、表１に記載した抗体と同じエピトープに結合する。一つの態様において、単離抗体またはそのフラグメントは表１に記載する抗体と交差競合する。一つの態様において、抗体のフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ２)’、Ｆ(ａｂ)２’、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂｓから成る群から選択される。
他の面において、本発明は抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関し、ここで、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２０８〜３２８を含むＨＥＲ３受容体と結合し、抗体またはそのフラグメントはドメイン２内の少なくともアミノ酸残基２６８を認識し、ここで、該抗体またはそのフラグメントはリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する。一つの態様において、医薬組成物は、さらに別の治療剤を含む。一つの態様において、別の治療剤はＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される。一つの態様において、他の治療剤は、マツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベクティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およびTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツマブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤である。一つの態様において、他の治療剤はテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。一つの態様において、他の治療剤はGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３キナーゼ阻害剤である。
他の面において、本発明は、ＨＥＲ３を発現する癌を有する対象を選択し、対象に表１に開示する抗体またはそのフラグメントを含む組成物の有効量を投与する癌の処置方法に関し、ここで、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２０８〜３２８を含むＨＥＲ３受容体のエピトープを認識し、ここで、抗体またはそのフラグメントはドメイン２内の少なくともアミノ酸残基２６８を認識し、ここで、該抗体またはそのフラグメントはリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する。一つの態様において、対象はヒトであり、癌は乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、胃癌、膵癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症から成る群から選択される。一つの態様において、癌は乳癌である。
一つの面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル伝達またはリガンド非依存性シグナル伝達経路により仲介される癌の処置に使用するための抗体またはそのフラグメントに関する。一つの面において、本発明は、医薬として使用するための抗体またはそのフラグメントに関する。一つの面において、本発明は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、胃癌、膵癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症から成る群から選択されるＨＥＲ３リガンド依存性シグナル伝達またはリガンド非依存性シグナル伝達経路により仲介される癌の処置用医薬の製造のための、抗体またはそのフラグメントの使用に関する。
ヒトＨＥＲ３で得た代表的MOR12616およびMOR12925 ＳＥＴ曲線。 ＦＡＣＳ力価測定によるSK-Br-3細胞結合決定。 ＨＥＲ３ドメイン結合ＥＬＩＳＡ力価測定曲線。 ＨＥＲ３変異体結合ＥＬＩＳＡ曲線。 ＥＬＩＳＡによるＨＥＲ３エピトープ競合。 リガンド誘発ＨＥＲ３およびＡｋｔリン酸化の阻害。 ＨＥＲ２増幅細胞株におけるリガンド非依存性ＨＥＲ３およびＡｋｔリン酸化の阻害。 (Ａ)リガンド依存性および(Ｂ、Ｃ)リガンド非依存性細胞増殖の阻害。 インビボでのBxPC3(Ａ)およびBT474(Ｂ)における腫瘍増殖の阻害を示すデータ。
発明の詳細な記載
定義
本発明をより容易に理解するために、いくつかの用語をまず定義する。更なる定義は詳細な説明中で随時示す。
ここで使用する用語“シグナル伝達”または“シグナル伝達活性”は、一般的にタンパク質−タンパク質相互作用、例えば増殖因子の受容体への結合により開始され、細胞の一つの部位から細胞の他の部位へのシグナルの伝達をもたらす生化学的因果関係を意味する。ＨＥＲ３について、伝達は、シグナル伝達を起こす一連の反応における１個以上のタンパク質上の１個以上のチロシン残基、セリン残基またはスレオニン残基の特異的リン酸化を含む。最後から２番目の過程は、典型的に核事象を含み、遺伝子発現を変化させる。
用語“ＨＥＲ３”または“ＨＥＲ３受容体”は“ＥｒｂＢ３”としても知られ、ここでは哺乳動物ＨＥＲ３タンパク質を言い、“ｈｅｒ３”または“ｅｒｂＢ３”は哺乳動物ｈｅｒ３遺伝子を意味する。好ましいＨＥＲ３タンパク質は、細胞の細胞膜に存在するヒトＨＥＲ３タンパク質である。ヒトｈｅｒ３遺伝子は米国特許番号５,４８０,９６８およびPlowman et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909に記載されている。
ヒトＨＥＲ３はAccession No. NP_001973(ヒト)に規定され、下に配列番号１として示す。全ての命名法は完全長、未成熟ＨＥＲ３(アミノ酸１〜１３４２)である。未成熟ＨＥＲ３は１９位と２０位の間で開裂し、成熟ＨＥＲ３タンパク質(２０〜１３４２アミノ酸)となる。
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eymnrqrdgg gpggdyaamg acpaseqgye emrafqgpgh qaphvhyarl ktlrsleatd
safdnpdywh srlfpkanaq rt (配列番号１)
ここで使用する用語“ＨＥＲ３リガンド”は、ＨＥＲ３と結合し、活性化するポリペチドを意味する。ＨＥＲ３リガンドの例は、ニューレグリン(ＮＲＧ)１およびニューレグリン２、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子およびエピレギュリンを含むが、これらに限定されない。本用語は、天然に存在するポリペチドの生物学的活性フラグメントおよび／または変異体を含む。
“ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体”は、ＨＥＲ２受容体およびＨＥＲ３受容体を含む非共有結合性に結合したオリゴマーである。この複合体は、これらの受容体の両者を発現する細胞がＨＥＲ３リガンド、例えば、ＮＲＧに暴露されたときまたはＨＥＲ２が活性／過発現されたときに形成できる。
ここで使用する用語“ＨＥＲ３活性”または“ＨＥＲ３活性化”は、オリゴマー形成増加(例えばＨＥＲ３含有複合体増加)、ＨＥＲ３リン酸化、立体構造再配列(例えばリガンドにより誘発されるもの)およびＨＥＲ３仲介下流シグナル伝達を含む。
ＨＥＲ３の文脈で使用する用語“安定化”または“安定化する”は、リガンド結合がもはやＨＥＲ３を活性化できないように、ＨＥＲ３へのリガンド結合を遮断することなくＨＥＲ３の不活性状態または配座を直接維持(ロック、係留、保持、優先的結合、支持)する抗体またはそのフラグメントを意味する。
ここで使用する用語“リガンド依存性シグナル伝達”は、リガンドを介するＨＥＲ３の活性化を意味する。ＨＥＲ３活性化は、下流シグナル伝達経路(例えばＰＩ３Ｋ)が活性化されるようなヘテロ二量体化および／またはＨＥＲ３リン酸化の増加により証明される。抗体またはそのフラグメントは、実施例に記載するアッセイを使用して測定して、未処置(対照)細胞に対して抗体またはそのフラグメントに曝された刺激細胞のリン酸化ＨＥＲ３の量を統計学的有意に減少できる。ＨＥＲ３を発現する細胞は天然に存在する細胞株(例えばMCF7)でも、ＨＥＲ３タンパク質をコードする核酸の宿主細胞への導入により組み換え的に産生してもよい。細胞刺激は、活性化ＨＥＲ３リガンドの外因性添加を介しても、活性化リガンドの内因性発現を介しても起こり得る。
“細胞内のニューレグリン誘発ＨＥＲ３活性化を減少させる”抗体またはそのフラグメントは、実施例に記載するアッセイを使用して測定して、未処置(対照)細胞に対してＨＥＲ３チロシンリン酸化を統計学的有意に減少させるものである。これは、ＨＥＲ３のＮＲＧおよび目的の抗体への暴露後のＨＥＲ３ホスホチロシンレベルに基づき決定できる。ＨＥＲ３を発現する細胞タンパク質は、天然に存在する細胞または細胞株(例えばMCF7)でも、組み換え的に産生したものでもよい。
ここで使用する用語“リガンド非依存性シグナル伝達”は、リガンド結合に対する必要性がない細胞性ＨＥＲ３活性(例えばリン酸化)を意味する。例えば、リガンド非依存性ＨＥＲ３活性化は、ＨＥＲ２過発現またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のようなＨＥＲ３ヘテロ二量体パートナーの活性化変異の結果であり得る。抗体またはそのフラグメントは、未処置(対照)細胞と比較して、抗体またはそのフラグメントに暴露された細胞におけるリン酸化ＨＥＲ３の量を統計学的有意に減少させる。ＨＥＲ３を発現する細胞は天然に存在する細胞株(例えばSK-Br-3)でも、ＨＥＲ３タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入することにより組み換え的に産生したものでもよい。
ここで使用する用語“遮断”は、相互作用または過程の停止または阻止、例えば、リガンド依存性またはリガンド非依存性シグナル伝達停止を意味する。
ここで使用する用語“認識”は、ＨＥＲ３のドメイン２内のエピトープを発見し、相互作用(例えば結合)する抗体またはそのフラグメントを意味する。例えば、ＨＥＲ３のドメイン２(配列番号１のアミノ酸残基２０８〜３２８)内の少なくとも１個のアミノ酸残基と相互作用する抗体またはそのフラグメント。他の例において、ＨＥＲ３のドメイン２内の少なくともＬｙｓ２６８と相互作用する抗体またはそのフラグメント。
ここで使用する用語“同時的結合”は、ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントと共にＨＥＲ３受容体上のリガンド結合部位と結合できるＨＥＲ３リガンドを意味する。これは、抗体およびリガンドの両方が一緒にＨＥＲ３受容体に結合できることを意味する。単に説明を目的として、ＨＥＲ３リガンドＮＲＧは、ＨＥＲ３受容体にＨＥＲ３抗体と共に結合できる。リガンドおよび抗体の同時結合を測定するためのアッセイは、実施例セクションに記載する。
ここで使用する用語“失敗”は、特定の事象を行わない抗体またはそのフラグメントを意味する。例えば、“シグナル伝達の活性化を失敗した”抗体またはそのフラグメントはシグナル伝達を誘発しないものである。
ここで使用する用語“抗体”は、ＨＥＲ３エピトープと相互作用(例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布により)し、シグナル伝達を阻害する全抗体を意味する。天然に存在する“抗体”は、ジスルフィド結合により相互接続した少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３ドメインから成る。各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域はＣＬである１ドメインから成る。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれるより保存性の領域に分散した相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変性の領域に細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に次のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置された３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから成る。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体活性化経路の第一補体(Ｃｌｑ)を含む宿主組織または因子への結合を仲介し得る。用語“抗体”は、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖ)、ジスルフィド結合Ｆｖｓ(ｓｄＦｖ)、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ’)フラグメントおよび抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体(例えば、本発明の抗体への抗Ｉｄ抗体を含む)および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含む。抗体は任意のアイソタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブクラスのものであり得る。
軽鎖および重鎖のいずれも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。用語“定常”および“可変”は機能的に使用する。これに関して、当然であるが、軽(ＶＬ)鎖および重(ＶＨ)鎖部分の両者の可変ドメインは抗原認識および特異性を決定する。逆に、軽鎖(ＣＬ)および重鎖(ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３)の定常ドメインは重要な生物学的特性、例えば分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などを与える。慣例により定常領域ドメインの番号は抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるに連れて増える。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である；ＣＨ３およびＣＬドメインは実際それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
ここで使用する用語“抗体フラグメント”は、ＨＥＲ３エピトープと特異的に相互作用し(例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布により)、シグナル伝達を阻害する能力を維持する抗体の１個以上の部分を意味する。結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメント；ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した１個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ)２フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；抗体の単アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；および単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)を含むが、これらに限定されない。
さらに、Ｆｖフラグメントの２個のドメインであるＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によりコードされるが、これらは、組み換え方法により、ＶＬおよびＶＨ領域が対となり一価分子を形成する、一タンパク質鎖として製造されることを可能とする合成リンカーによりあわせることができる(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる；例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体もまた用語“抗体フラグメント”に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られる慣用法を使用して得て、フラグメントを、インタクト抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングする。
抗体フラグメントはまた一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも含まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136参照)。抗体フラグメントはポリペチドに基づきスキャフォールド、例えばフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)に接木され得る(フィブロネクチンポリペチドモノボディを記載する米国特許番号６,７０３,１９９参照)。
抗体フラグメントは、直列Ｆｖセグメント(ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１)の対を含む一本鎖分子に包含され、相補的軽鎖ポリペチドと共に、抗原結合領域の対を形成し得る(Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062; および米国特許番号５,６４１,８７０)。
用語“エピトープ”は、免疫グロブリンと特異的結合できるまたは他に分子と相互作用する、あらゆるタンパク質決定基を意味する。エピトープ決定基は、一般的に分子の化学活性表面グルーピング、例えばアミノ酸または炭水化物または糖側鎖から成り、特異的三次元構造的特徴、ならびに特異的電荷特徴を有し得る。エピトープは“線形”、“非線形”または“立体構造的”であり得る。一つの態様において、エピトープはＨＥＲ３のドメイン２内である。一つの態様において、エピトープは、ＨＥＲ３のドメイン２内の線形エピトープである。一つの態様において、エピトープは、ＨＥＲ３のドメイン２内の非線形エピトープである。他の態様において、エピトープは、ＨＥＲ３のドメイン２内のアミノ酸残基を含む立体構造的エピトープである。一つの態様において、エピトープは、ＨＥＲ３のドメイン２(配列番号１のアミノ酸２０８〜３２８)内のアミノ酸残基の少なくとも１個またはそのサブセットである。一つの態様において、エピトープは、配列番号１の少なくともアミノ酸Ｌｙｓ２６８(ドメイン２内)を含む。ここに記載する抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のドメイン２内のＬｙｓ２６８と結合できる。
用語“直線状エピトープ”は、タンパク質と相互作用分子(例えば抗体)の相互作用の全ての点が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線状に生じるエピトープを意味する(すなわち連続的アミノ酸)。抗原上の所望のエピトープが決定されたら、例えば、本明細書に記載する技術を使用して該エピトープに対する抗体を産生できる。あるいは、発見過程で、抗体の産生および特徴づけは、望ましいエピトープに関する情報を明らかにし得る。この情報から、続いて、同エピトープに対して結合抗体を競合的スクリーニングできる。これを達成するための方法は、互いに競合的に結合する抗体、例えば抗原に対する結合を競合する抗体を発見するための交差競合試験の実施である。交差競合に基づく“ビンニング”抗体のためのハイスループット方法は、国際特許出願番号ＷＯ２００３／４８７３１に記載されている。当業者に認識されるとおり、抗体が特異的に結合できるものは実際的にエピトープであり得る。エピトープは、抗体が結合する残基を含み得る。
用語“非線形エピトープ”は、特定のドメイン(例えば、ドメイン１内、ドメイン２内、ドメイン３内またはドメイン４内)と三次元構造を形成する非連続的アミノ酸のエピトープを意味する。一つの態様において、非線形エピトープはドメイン２内である。非線形エピトープは２個以上のドメイン間で起こり得る(例えば、ドメイン３〜４の海面)。非線形エピトープはまた、特定のドメイン内の三次元構造をもたらす非連続的アミノ酸を意味する。用語“立体構造的エピトープ”は、非連続アミノ酸がドメイン２およびドメイン４；またはドメイン３およびドメイン４のような少なくとも２個の異なるドメインが関与する、一体となって三次元配置となる、エピトープを意味する。立体構造的エピトープにおいて、相互作用点は、互いに離れたタンパク質上のアミノ酸残基の全域で起こる。当業者に認識されるとおり、分子の形を作る残基または側鎖により占拠されている空間はエピトープが何であるかの決定を助ける。
一般的に、特定の標的抗原に対する抗体特異的は、タンパク質および／または巨大分子の複合体混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
エピトープを含むポリペチドのある領域は、当分野で周知のエピトープマッピング技術をいくつでも使用して同定できる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey参照。例えば、直線状エピトープは、例えば、固体支持体上に多数のペプチドを同時に合成し、該ペプチドはタンパク質分子の部分に対応し、該ペプチドと抗体を、ペプチドを支持体に結合させたまま反応させることにより決定できる。このような技術は当分野で知られ、例えば、米国特許番号４,７０８,８７１；Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715に記載されている。同様に、立体構造エピトープは、例えば、アミノ酸の空間的立体構造の、例えば、水素／重水素交換、ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴による決定により容易に同定できる。例えば、Epitope Mapping Protocols, supra参照。タンパク質の抗原性領域もまた、例えば標準的抗原性およびヒドロパシープロットを使用して、例えば、Oxford Molecular Groupから入手可能なOmiga version 1.0ソフトウェアプログラムを使用して計算するものにより同定できる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルの決定にHopp/Woods法(Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828)を使用し、ヒドロパシープロットのためにKyte-Doolittle技術(Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132)を使用する。
ここで使用する用語“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”は、アミノ酸配列が実質的に同一であるかまたは同じ遺伝源に由来する抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体などを含むポリペチドを意味する。この用語はまた一分子組成物の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、一結合特異性および特定のエピトープに対する親和性を示す。
ここで使用する用語“ヒト抗体”は、フレームワークおよびＣＤＲ領域のいずれもヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含むならば、定常領域はまたこのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列またはヒト生殖系列配列突然変異型またはヒトフレームワーク配列分析由来のコンセンサスフレームワーク配列を含む抗体に由来する(例えば、Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86に記載のとおり)。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの構造および位置は、周知の番号付けスキーム、例えば、Kabat番号付けスキーム、Chothia番号付けスキームまたはKabat-Chothiaの組合せスキームを使用して規定し得る(例えば、Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927-948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; およびAl-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948参照)。
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでよい(例えば、インビトロでの無作為または部位特異的突然変異誘発により導入された変異またはインビボでの体細胞変異または安定性または製造を促進するための保存的置換)。
ここで使用する用語“ヒトモノクローナル抗体”は、フレームワークおよびＣＤＲ領域のいずれもヒト配列由来である可変領域を有する、一結合特異性を示す抗体を意味する。一つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
ここで使用する用語“組み換えヒト抗体”は、組み換え手段により製造、発現、創製または単離された全てのヒト抗体、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス)から単離された抗体またはそれらから調製されたハイブリドーマ、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体およびヒト免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部のスプライシング、他のＤＮＡ配列に対する配列決定を含む他の手段により製造、発現、創製または単離された抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を含む。ある態様において、しかしながら、このような組み換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発(または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用するとき、インビボ体細胞突然変異誘発)に付し、それゆえに、組み換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連はしているものの、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリーに天然に存在し得ない配列であり得る。
２個の物体の間の特異的結合は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１または少なくとも５×１０１５Ｍ−１の平衡定数(ＫＡ)(ｋｏｎ／ｋｏｆｆ)での結合を意味する。
用語“特異的に(または選択的に)結合する”は、ＨＥＲ３結合抗体とＨＥＲ３受容体の、タンパク質および他の生物製剤の不均質集団における結合反応を意味する。上記平衡定数(ＫＡ)に加えて、本発明のＨＥＲ３結合抗体は、典型的にまた５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満またはそれより低い解離速度定数(ＫＤ)(ｋｏｆｆ／ｋｏｎ)を有し、ＨＥＲ３に非特異的抗原(例えば、ＨＳＡ)への結合に対する親和性より少なくとも２倍高い親和性で結合する。
一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、ここに記載するまたは当業者に知られた方法(例えば、Biacoreアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＳＥＴ)(Biacore International AB, Uppsala, Sweden)で評価して、３０００pM未満、２５００pM未満、２０００pM未満、１５００pM未満、１０００pM未満、７５０pM未満、５００pM未満、２５０pM未満、２００pM未満、１５０pM未満、１００pM未満、７５pM未満、１０pM未満、１pM未満の解離定数(Ｋｄ)を有する。
ここで使用する用語“Ｋａｓｓｏｃ”または“Ｋａ”は特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を意味し、一方、ここで使用する用語“Ｋｄｉｓ”または“Ｋｄ”は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味する。ここで使用する用語“ＫＤ”は、Ｋｄ対Ｋａ比(すなわちＫｄ／Ｋａ)により得られる解離定数を言い、モル濃度(Ｍ)として表す。抗体のＫＤ価は、当分野で十分確立されている方法を使用して決定できる。抗体のＫＤを決定する方法は、表面プラズモン共鳴を使用するまたはバイオセンサーシステム、例えばBiacore(登録商標)システムを使用することによる。
ここで使用する用語“親和性”は、一抗原性部位での抗体と抗原の相互作用の強度を意味する。各抗原性部位内で、抗体“アーム”の可変領域は、抗原と多くの部位で弱い非共有結合的力を介して相互作用し、相互作用が多いほど、親和性が強くなる。
ここで使用する用語“結合活性”は、抗体−抗原複合体の全体的安定性または強度の情報手段である。これは、抗体エピトープ親和性；抗原および抗体両者の結合価；および相互作用部分の構造的配置である３つの主要な因子により制御される。最終的にこれらの因子は抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が的確な抗原エピトープに結合する可能性を規定する。
ここで使用する用語“結合価”は、ポリペチド中の潜在的標的結合部位の数を意味する。各標的結合部位は、１個の標的分子または標的分子上の特異的部位(すなわち、エピトープ)と特異的に結合する。ポリペチドが１個を超える標的結合部位を含むとき、各標的結合部位は、同一または異なる分子(例えば、異なる分子、例えば、同一分子上の異なる抗原または異なるエピトープ)と特異的に結合し得る。
ここで使用する用語“阻害抗体”は、ＨＥＲ３と結合し、ＨＥＲ３シグナル伝達の生物学的活性を阻害する、例えば、ホスホ−ＨＥＲ３またはホスホ−Ａｋｔアッセイにおいて、例えば、ＨＥＲ３誘発シグナル伝達活性を減少、減弱および／または阻害する抗体である。アッセイの例は下記実施例にさらに詳細に記載する。従って、当分野で知られるおよびここに記載する方法に従い決定して、これらのＨＥＲ３機能的特性(例えば、生化学、免疫化学、細胞、生理学的または他の生物学的活性など)の１個以上を“阻害”する抗体は、該抗体非存在下(例えばまたは無関係の特異性の対照抗体が存在するとき)に見られるものに対する特定の活性の統計学的に有意な減少と関連すると理解される。ＨＥＲ３活性を阻害する抗体は、測定パラメータの少なくとも１０％少なくとも５０％、８０％または９０％の統計学的に有意な減少を起こし、ある態様において、本発明の抗体は、細胞性ＨＥＲ３リン酸化レベルの減少により証明されるとおり、ＨＥＲ３機能的活性を９５％、９８％または９９％より多く阻害し得る。
用語“単離抗体”は、異なる抗原性特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する(例えば、ＨＥＲ３と特異的に結合する単離抗体は、ＨＥＲ３以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。ＨＥＲ３と特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、他の抗原と交差反応し得る。さらに、単離抗体は他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
用語“保存的修飾変異体”はアミノ酸および核酸配列のいずれにも使用する。特定の核酸配列に関して、保存的修飾変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸または核酸がアミノ酸配列をコードしないとき本質的に同一の配列を意味する。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸があるタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。それゆえに、アラニンがコードにより特定される全ての位置で、該コドンは、コードされるポリペチドを変えることなく、記載した対応するコドンのいずれかに変えることができる。このような核酸多様性は“サイレント多様性”であり、これは、保存的修飾多様性の１種である。ポリペチドをコードするここでの全ての核酸配列も、核酸の全ての可能なサイレント多様性を記載する。当業者は、核酸における各コドン(通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧおよび通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧ以外)を修飾して、機能的に同一の分子が得られることを認識する。従って、ポリペチドをコードする核酸の各サイレント多様性は、記載した配列の各々に潜在する。
ポリペチド配列に関して、“保存的修飾変異体”は、あるアミノ酸の化学的に類似のアミノ酸への置換を起こす、ポリペチド配列への個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は当分野で周知である。このような保存的修飾変異体は本発明の多型変異体、種間相同体および対立遺伝子に加えられ、これらを除外しない。次の８群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１)アラニン(Ａ)、グリシン(Ｇ)；２)アスパラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)；３)アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)；４)アルギニン(Ｒ)、リシン(Ｋ)；５)イソロイシン(Ｉ)、ロイシン(Ｌ)、メチオニン(Ｍ)、バリン(Ｖ)；６)フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)；７)セリン(Ｓ)、スレオニン(Ｔ)；および８)システイン(Ｃ)、メチオニン(Ｍ)(例えば、Creighton, Proteins (1984)参照)。ある態様において、用語“保存的配列修飾”は、該アミノ酸配列が包含される抗体の結合特徴に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾を意味するために使用する。
用語“交差競合”および“交差競合する”は、ここでは互換的に、抗体またはそのフラグメントが、標準的競合的結合アッセイにおいてＨＥＲ３への他の抗体またはそのフラグメントの結合を妨害する能力を意味するために使用する。
抗体またはそのフラグメントが他の抗体またはそのフラグメントのＨＥＲ３への結合を妨害する能力または程度、すなわち、本発明に従い交差競合と言えるか否かは、標準的競合結合アッセイを使用して決定できる。一つの適切なアッセイは、表面プラズモン共鳴方法を使用して相互作用の程度を測定できるBiacore方法(例えばBiacore 3000装置(Biacore, Uppsala, Sweden)の使用による)の使用を含む。交差競合を測定する他のアッセイはＥＬＩＳＡ利用方法を使用する。
ここで使用する用語“最適化”は、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物、一般的に真核細胞、例えば、ピキア属の細胞、トリコデルマ属の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変えられていることを意味する。最適化ヌクレオチド配列は、“親”配列としても知られる出発ヌクレオチド配列により元々コードされていたアミノ酸配列を完全にまたは最大限残すように操作する。
多様な種のＨＥＲ３に対して抗体の結合能力を評価する標準的アッセイは当分野で知られ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。適切なアッセイは実施例に詳述する。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)も、当分野で知られた標準的アッセイ、例えばBiacore分析またはＦＡＣＳ相対親和性(Scatchard)により評価できる。ＨＥＲ３の機能的特性(例えば、ＨＥＲ３シグナル伝達経路を調節する、受容体結合アッセイ)に対する抗体の効果を評価するためのアッセイは実施例にさらに詳述する。
用語“同一パーセント”または“同一性パーセント”、２個以上の核酸またはポリペチド配列の状況で、同じである２個以上の配列または部分配列を意味する。２個の配列は、次の配列比較アルゴリズムの一つを使用して、または手動整列および目視により測定して比較ウィンドウまたは指定領域で最大一致について比較し、整列したとき、２個の配列の特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドが同一であるならば、“実質的に同一”である(すなわち、特定の領域にわたり、または特定していないとき、全配列にわたり６０％同一性、所望により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一性)。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長以上である領域、好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)である領域にわたり存在する。
配列比較のために、典型的に１個の配列は参照配列として働き、それに対し試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要であるならば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用しても、別のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一パーセントを計算する。
ここで使用する“比較ウィンドウ”は、配列を、２個の配列を最適に整列後同数の連続位置の参照配列と比較し得る、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに一般的には約１００〜約１５０から成る群から選択される連続位置の数のいずれか一つのセグメントも意味する。比較のための配列の整列方法は当分野で周知である。比較のための配列の最適整列は、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性整列アルゴリズム、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性方法の試験、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動整列および目視(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)により実施できる。
配列同一性パーセントおよび配列類似度決定に適切な二つのアルゴリズムの例は、BLASTアルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410にそれぞれ記載されている。BLAST解析実施用ソフトウェアはNational Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初にクエリー配列中の短ワード長Ｗの同定により高スコア配列対(ＨＳＰ)を同定し、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列したとき、ある正値閾値スコアＴとマッチするかまたは充足する。Ｔは隣接ワードスコア閾値を意味する(Altschul et al., supra)。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰの探索を開始するための種として作用する。ワードヒットは累積的整列スコアが増え続ける限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積的スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ(整合残基対の報酬スコア；常に＞０)およびＮ(不整合残基のペナルティスコア；常に＜０)を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコア付けマトリクスを使用して、累積的スコアを計算する。各方向でのワードヒット伸長は、累積的整列スコアがその達成した最大価から数Ｘ落ちたとき、累積的スコアが１個以上の負のスコアの残基整列の蓄積により０以下になったとき、またはいずれかの配列末端に達したとき停止する。BLASTアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、感受性および整列速度を決定する。BLASTＮプログラム(ヌクレオチド配列について)はデフォルトとしてワード長(Ｗ)１１、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３および期待値(Ｅ)１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス(HenikoffおよびHenikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照)、整列(Ｂ)５０、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。
BLASTアルゴリズムはまた２配列間の類似度の統計学的分析も行う(例えば、Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似度の一つの指標は、２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然起こる確率の指標を提供する、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))である。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が約０.２未満、より好ましくは約０.０１未満および最も好ましくは約０.００１未満であるならば、参照配列と類似であると見なす。
２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムを使用する。さらに、２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Blossom 62マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)におけるＧＡＰプログラムに組み込まれている、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453アルゴリズムを使用して決定できる。
上記配列同一性パーセンテージ以外に、２個の核酸配列またはポリペチドが実質的に同一との他の指標は、下記のとおり、第一核酸によりコードされるポリペチドが、第二核酸によりコードされるポリペチドに対して惹起した抗体と免疫学的に交差反応性であることである。それゆえに、ポリペチドは、例えば、２個のペプチドが保存的置換によってのみ異なるとき、第二ポリペチドと典型的に実質的に同一である。２個の核酸配列が実質的に同一である他の指標は、下記のとおり２個の分子またはそれらの補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２個の核酸配列が実質的に同一であるさらに他の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅できることである。
用語“核酸”は、ここでは用語“ポリヌクレオチド”と互換的に使用し、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。本用語は、既知ヌクレオチドアナログまたは修飾された主鎖残基または結合を含み、合成され、天然に存在するおよび天然に存在せず、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝される核酸を意味する。このようなアナログの例は、ホスホロチオエート類、ホスホロアミデート類、メチルホスホネート類、キラル−メチルホスホネート類、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(ＰＮＡ)を含むが、これらに限定されない。
特に断らない限り、特定の核酸配列はまたその保存的修飾変異体(例えば、コドン置換変性)および相補的配列、ならびに明示的に示す配列も潜在的に包含する。具体的に、下記のとおり、コドン置換変性は、１個以上の選択した(または全)コドンの３位が混合残基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の産生により達成し得る(Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; およびRossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98)。
用語“操作可能に結合”は、２個以上のポリヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)セグメント間の機能的関係を意味する。典型的に、転写調節配列と転写配列との機能的関連を意味する。例えば、プロモータまたはエンハンサ配列は、適当な宿主細胞または他の発現系においてコーディング配列の転写を刺激または調節するならば、コーディング配列に操作可能に結合している。一般的に、転写配列に操作可能に結合しているプロモータ転写調節配列は、転写配列と物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、ある転写調節配列、例えばエンハンサは、転写を促進するコーディング配列に物理的に連続しているか近接している必要はない。
用語“ポリペチド”および“タンパク質”は、ここでは互換的にアミノ酸残基のポリマーを意味するために使用する。本用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。特に断らない限り、特定のポリペチド配列はまたその保存的修飾変異体を潜在的に包含する。
ここで使用する用語“対象”はヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は全脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、トリ、両生類および爬虫類を含む。示していない限り、用語“患者”または“対象”はここでは互換的に使用する。
ここで使用する用語“抗癌剤”は、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線療法および放射線治療剤、標的抗癌剤および免疫治療剤を含む、細胞増殖性障害、例えば癌の処置に使用できる薬剤を意味する。
ここで使用する用語“腫瘍”は、悪性であれ良性であれ、新生物細胞成長および増殖、および全前癌性および癌性細胞および組織を意味する。
ここで使用する用語“抗腫瘍活性”は、腫瘍細胞増殖速度、生存能または転移活性の減少を意味する。抗腫瘍活性を示す可能な方法は、治療中の異常細胞の増殖速度減少または腫瘍サイズ安定化または減少の提示である。このような活性は、異種移植片モデル、同種移植片モデル、ＭＭＴＶモデルおよび他の抗腫瘍活性の試験において当分野で知られた既知モデルを含むが、これらに限定されない認められたインビトロまたはインビボ腫瘍モデルを使用して評価できる。
ここで使用する用語“悪性腫瘍”は、非良性腫瘍または癌を意味する。
ここで使用する、用語“癌”は、調節解除されたまたは制御されない細胞増殖により特徴付けられる悪性腫瘍を意味する。癌の例は、癌腫、肉腫、白血病およびリンパ腫を含む。用語“癌”は原発悪性腫瘍(例えば、細胞が元の腫瘍以外の対象体内の他の部位に郵送していない)および二次的悪性腫瘍(例えば、元の腫瘍の部位と異なる二次的部位への腫瘍細胞の遊走である転移)を含む。
本発明の種々の面を次のセクションおよびサブセクションでさらに詳述する。
ＨＥＲ受容体の構造および活性化機構
全４種のＨＥＲ受容体は細胞外リガンド結合ドメイン、一膜貫通型ドメインおよび細胞質チロシンキナーゼ含有ドメインを有する。ＨＥＲ受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインは高度に保存されているが、ＨＥＲ３のキナーゼドメインは、重大なアミノ酸の置換を有し、それゆえにキナーゼ活性を欠く(Guy et al., (1994):PNAS 91, 8132-8136)。ＨＥＲ受容体のリガンド誘発二量体化は、キナーゼの活性化、Ｃ末端テイルのチロシン残基の受容体トランスリン酸化、続く細胞内シグナル伝達エフェクターの動員および活性化を誘発する(Yarden and Sliwkowski, (2001) Nature Rev 2, 127-137; Jorissen et al., (2003) Exp Cell Res 284, 31-53)。
ＨＥＲの細胞外ドメインの結晶構造は、リガンド誘発受容体活性化の過程について幾分見識を提供する(Schlessinger, (2002) Cell 110, 669-672)。各ＨＥＲ受容体の細胞外ドメインは４サブドメインから成る：サブドメインＩおよびIIIはリガンド結合部位形成に協調し、一方サブドメインII(およびおそらくサブドメインIV)は、直接受容体−受容体相互作用を介する受容体二量体化に関与する。リガンド結合ＨＥＲ１の構造において、サブドメインIIのβハルピン(二量体化ループと呼ばれる)はパートナー受容体の二量体化ルーと相互作用し、受容体二量体化を仲介する(Garrett et al, (2002) Cell 110, 763-773; Ogiso et al., (2002) Cell 110, 775-787)。対照的に、不活性ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の構造において、二量体化ループは、サブドメインIVとの分子内相互作用に関与し、これはリガンド非存在下での受容体二量体化を阻止する(Cho and Leahy, (2002) Science 297, 1330-1333; Ferguson et al., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Bouyan et al., (2005) PNAS102, 15024-15029)。ＨＥＲ２の構造はＨＥＲ群の中で独特である。リガンド非存在下で、ＨＥＲ２は、他のＨＥＲ受容体との相互作用に利用可能な突出二量体化ループと共に、ＨＥＲ１のリガンド活性化状態を模倣する立体構造を有する(Cho et al., (2003) Nature 421, 756-760; Garrett et al., (2003) Mol Cell 11, 495-505)。これは、ＨＥＲ２の亢進されたヘテロ二量体化能を説明し得る。
ＨＥＲ受容体結晶構造は、ＨＥＲ受容体ホモおよびヘテロ二量体化のモデルを提供するが、あるＨＥＲホモおよびヘテロ二量体が他より多いこと(Franklin et al., (2004) Cancer Cell 5, 317-328)ならびに受容体二量体化および自己阻害における各ドメインの役割(Burgess et al., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Mattoon et al., (2004) PNAS101, 923-928)はまた幾分未解明のままである。
ＨＥＲ３構造およびエピトープ
抗ＨＥＲ３抗体が結合する立体構造的エピトープは、いずれも２０１１年８月２２日に出願され、その全体を引用により本明細書に包含させるＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６４４０７およびＵＳＳＮ：６１／３７５,４０８に記載されている。ＨＥＲ３抗体フラグメントと複合体化したＨＥＲ３の切断型の三次元構造は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４を含む立体構造的エピトープを示した。
本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２内の線形、非線形または立体構造的エピトープと結合するさらなるクラスの抗体またはそのフラグメントを提供する。これらの抗体またはそのフラグメントはＨＥＲ３と相互作用して、リガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも阻害する。
ＨＥＲ３に結合したドメイン２抗体またはそのフラグメントの結晶構造を試験するために、ＨＥＲ３の結晶をＨＥＲ３またはその変異体をコードするヌクレオチド配列を適切な宿主細胞で発現させ、精製タンパク質を関連するＨＥＲ３標的化Ｆａｂ存在下で結晶化させることにより製造し得る。好ましくは、ＨＥＲ３ポリペプチドは細胞外ドメイン(ヒトポリペプチド(配列番号１)のアミノ酸２０〜６４０またはその切断型、好ましくはアミノ酸２０〜６４０を含む)を含むが、膜貫通および細胞内ドメインを欠く。
ＨＥＲ３ポリペチドはまた、例えば抽出および精製の助けとなるように、融合タンパク質で製造してもよい。融合タンパク質パートナーの例は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、ヒスチジン(ＨＩＳ)、ヘキサヒスチジン(６ＨＩＳ)、ＧＡＬ４(ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン)およびベータ−ガラクトシダーゼを含む。融合タンパク質配列の除去を可能にするために、融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列の間にタンパク分解開裂部位を包含させるのも好都合であり得る。
発現後、タンパク質を、例えば固定化金属親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過により、精製および／または濃縮してよい。
タンパク質を、ここに記載する技術を使用して結晶化させ得る。一般に、結晶化工程において、タンパク質溶液含有液滴を結晶化緩衝液と混合し、密閉容器中で平衡化させる。平衡化は既知技術、例えば“懸滴”または“座滴”方法により達成し得る。これらの方法において、液滴をはるかに大きな結晶化緩衝液貯蔵部の上に吊るすかまたは横に置き、平衡化を蒸気拡散により達成する。あるいは、平衡化を他の方法で、例えば油下、半透膜または自由界面拡散により行ってよい(例えば、Chayen et al., (2008) Nature Methods 5, 147 - 153参照)。
結晶が得られたら、構造を既知Ｘ線回折技術で解析し得る。多くの技術が、適当な総への化学的に修飾した結晶、例えば重原子誘導体化により修飾したものに使用でされる。実施に際し、結晶を、結晶を通して拡散し、タンパク質表面に結合できる、重金属原子塩類または有機金属化合物、例えば、塩化鉛、チオマレイン酸金、チメロサールまたは酢酸ウラニル含有溶液に浸漬する。結合重金属原子の位置を、次いで、浸漬結晶のＸ線回折分析により決定できる。結晶の原子(散乱中心)によるＸ線の単色ビームの回折により得られたパターンを、数学的方程式により解析して、数学的座標を得る。回折データを使用して、結晶の反復単位の電子光度地図を計算する。相情報を得る他の方法は、分子置換として知られる技術である。この方法において、回転性アルゴリズムおよび翻訳アルゴリズムを、関連構造に由来する検索モデルに適用し、目的のタンパク質について凡その方向を得る(Rossmann, (1990) Acta Crystals A 46, 73-82参照)。電子密度地図を使用して、結晶単位セル内の個々の原子の位置を確立する(Blundel et al., (1976) Protein Crystallography, Academic Press)。
ＨＥＲ３の細胞外ドメインの近似ドメイン境界は次のとおりである；ドメイン１：アミノ酸２０〜２０７；ドメイン２：アミノ酸２０８〜３２８；ドメイン３：アミノ酸３２９〜４９８；およびドメイン４：アミノ酸４９９〜６４２。ＨＥＲ３および抗体の三次元構造は、可能性のあるＨＥＲ３モジュレータのための標的結合部位の同定を可能にする。好ましい標的結合部位はＨＥＲ３活性化に関与するものである。一つの態様において、標的結合部位はＨＥＲ３のドメイン２内に位置する。それゆえに、ドメイン２と結合する抗体またはそのフラグメントは、例えば、ＨＥＲ３活性化を、それ自体または他のＨＥＲ３ドメインと関連するドメインの相対的位置の修飾により修飾できる。それゆえに、抗体またはそのフラグメントのドメイン２内のアミノ酸残基への結合は、タンパク質が活性化を妨げるまたは二量体化パートナー(例えば、ＨＥＲ２)と二量体することを妨げる配置に適用する。
ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、抗体またはそのフラグメントが、ＨＥＲ３が共受容体(ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４を含むが、これらに限定されない)と相互作用するのを妨げるようにＨＥＲ３の特異的立体構造的状態を認識する。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３が、ＨＥＲ３受容体を不活性化または閉状態に安定化することにより共受容体と相互作用することを妨げる。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３受容体を、ＨＥＲ３のドメイン２内のアミノ酸残基との結合により安定化し得る。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ドメイン２内のＨＥＲ３アミノ酸残基(配列番号１のアミノ酸２０８〜３２８)またはそのサブセットを含むエピトープを有するヒトＨＥＲ３タンパク質と結合する。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ドメイン２内のアミノ酸残基(配列番号１のアミノ酸２０８〜３２８)内のまたは重複するアミノ酸と結合する。ここに記載する抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のドメイン２内のＬｙｓ２６８と結合できる。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のドメイン２内の線形エピトープと結合する。ある態様において、抗体またはそのフラグメントはＨＥＲ３のドメイン２内の非線形エピトープと結合する。ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のドメイン２内の立体構造的エピトープと結合する。
ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のドメイン２内の二量体化ループが共受容体との二量体化に利用不可能となるように、ＨＥＲ３のドメイン２のエピトープと結合する。ホモまたはヘテロ二量体形成失敗は、活性化シグナル伝達失敗をもたらす。
ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、活性または不活性化状態のＨＥＲ３とドメイン２内のエピトープで結合できる。
ある態様において、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のドメイン２受容体のエピトープと結合し、ここで、抗体またはそのフラグメントのＨＥＲ３受容体への結合は、共受容体と二量体化し、不活性化受容体−受容体複合体を形成することを可能にする。不活性化受容体−受容体複合体の形成は、リガンド非依存性シグナル伝達の活性化を妨げる。例えば、リガンド非依存性シグナル伝達において、ＨＥＲ３は不活性状態で存在し得るが、ＨＥＲ２の過発現はＨＥＲ２−ＨＥＲ３複合体形成をもたらすが、しかしながらこれらの得られた複合体は不活性化であり、リガンド非依存性シグナル伝達の活性化を妨げる。
ある態様において、抗体と接触するまたは抗体に包埋される残基を含むドメイン／領域を、ＨＥＲ３(例えば、野生型抗原)における特異的残基を突然変異させ、抗体またはそのフラグメントが該変異体、または変異体ＨＥＲ３タンパク質と結合できるかを決定するまたは野生型からの親和性変化を測定することにより同定できる。多数の個々の変異を製造することにより、結合に直接役割を有するまたは変異が抗体と抗原の結合に影響を与え得るように抗体と十分に極めて接近している残基を同定できる。これらのアミノ酸の知識から、抗体と接触するまたは抗体に覆われる残基を含む抗原(ＨＥＲ３)のドメインまたは領域を解明できる。既知技術、例えばアラニン走査を使用した突然変異誘発は、機能的に関連するエピトープの定義を助ける。アルギニン／グルタミン酸走査プロトコルを使用する突然変異誘発もまた使用できる(例えば、Nanevicz et al., (1995), J. Biol. Chem. 270(37):21619-21625 and Zupnick et al., (2006), J. Biol. Chem. 281(29):20464-20473参照)。一般に、アルギニンおよびグルタミン酸は、これらのアミノ酸が荷電を有し、嵩高く、それゆえに、変異が導入される抗原の領域における抗原結合タンパク質と抗原の結合を破壊する可能性があるために、野生型ポリペチドにおいてはアミノ酸に置換されている(典型的に個々に)。野生型抗原に存在するアルギニンはグルタミン酸に置き換える。多様なこのような個々の変異体を得て、集めた結合結果を分析して、どの残基が結合に影響するか決定できる。一連の変異体ＨＥＲ３抗原を創製し、この各々一変異を有する変異体抗原である。種々のＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントとの各変異体ＨＥＲ３抗原の結合を測定し、選択した抗体またはそのフラグメントが野生型ＨＥＲ３(配列番号１)と結合する能力を比較し得る。このような変異体の例は下記実施例セクションに示し、例えば、Ｌｙｓ２６８ Ａｌｓ変異体である。
ここで使用する抗体またはそのフラグメントと突然変異体または変異体ＨＥＲ３との結合の変更(例えば減少または増加)は、結合親和性(例えば、既知方法、例えば下記実施例に記載するBiacore試験またはビーズベースのアッセイで測定して)、ＥＣ５０における変化および／または抗原結合タンパク質の総結合能(例えば、抗原結合タンパク質濃度対抗原濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少により証明される)における変化(例えば減少)があることを意味する。結合の顕著な変更は、変異残基が抗体またはそのフラグメントへの結合に関与していることを示す。
ある態様において、結合の顕著な減少は、抗体またはそのフラグメントと変異体ＨＥＲ３抗原の間の結合親和性、ＥＣ５０および／または能力が抗体またはそのフラグメントと野生型ＨＥＲ３(例えば、配列番号１)の結合に対して１０％を超えて、２０％を超えて、４０％を超えて、５０％を超えて、５５％を超えて、６０％を超えて、６５％を超えて、７０％を超えて、７５％を超えて、８０％を超えて、８５％を超えて、９０％を超えてまたは９５％を超えて減少していることを意味する。
ある態様において、抗体またはそのフラグメントの結合は、野生型ＨＥＲ３タンパク質(例えば、配列番号１)と比較して１箇所以上(例えば、１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所またはそれ以上)の変異を有する変異体ＨＥＲ３タンパク質に対して顕著に減少または増加している。
変異体形態は、配列番号１に示す野生型配列を参照して述べているが、当然であるが、ＨＥＲ３の対立遺伝子またはスプライス変異体において、アミノ酸は異なり得る。このようなＨＥＲ３の対立遺伝子形質について顕著に変更された結合(例えば、低いまたは高い結合)を示す抗体またはそのフラグメントも意図される。
抗体の一般的構造的面に加えて、パラトープとエピトープの間のより特異的な相互作用を構造的手法を介して試験し得る。一つの態様において、ＣＤＲの構造はパラトープに寄与し、これを介して抗体はエピトープに結合できる。このようなパラトープの形態は多くの方法で決定し得る。伝統的構造的試験手法、例えばＮＭＲまたはｘ線結晶学を使用できる。これらの手法はパラトープ単独またはエピトープに結合中の形を試験できる。あるいは、分子モデルをインシリコで作成し得る。構造を、商用パッケージ、例えばAccelrys(San Diego, Calif.)のInsightIIモデリングパッケージの助けを借りて相同性モデリングを介して作成し得る。要約すると、既知構造のタンパク質のデータベース、例えばProtein Data Bankに対して検索するために試験すべき抗体の配列を使用できる。既知構造との相同タンパク質を同定したら、これらの相同タンパク質をモデリング鋳型として使用する。可能な鋳型の各々を整列し、そうして、鋳型の構造に基づく配列整列を作成できる。未知構造の抗体の配列を、次いで、これらの鋳型と整列させて、未知構造を有する抗体の分子モデルを作成できる。当業者に認識されるとおり、このような構造をインシリコで作成する多くの代替法があり、このいずれも使用し得る。例えば、QUANTA(Polygen Corp., Waltham, Mass.)およびＣＨアーム(Brooks et al., (1983), J. Comp. Chem. 4:187)を用いる米国特許番号５,９５８,７０８として発行されたHardman et al.に記載のものに準じる方法を使用し得る(引用によりその全体を本明細書に包含させる)。
パラトープの形が可能なパラトープがエピトープと結合するかおよびいかによく結合するかを決定するだけでなく、エピトープとパラトープの間の相互作用それ自体も変異体抗体の設計における大きな情報源である。当業者には認識されるとおり、この相互作用を試験できる多様な方法がある。ひとつの方法は、おそらく上記のとおり作成した構造的モデルを使用し、次いで、とりわけ、パラトープとそのエピトープの間の立体構造および方向性空間のMonte Carloサーチの実施を可能にするドッキングモジュールを有する例えばInsightII(Accelrys, San Diego, Calif.)を使用する。結果は、エピトープがパラトープとどこでどのように相互作用するかを推測できるものである。一つの態様において、エピトープの一つのフラグメントまたは変異体のみを使用して決定関連相互作用の決定を助ける。一つの態様において、全エピトープを、パラトープとエピトープの間の相互作用のモデリングに使用する。
これらのモデル化構造を使用して、どの残基がエピトープとパラトープの間の相互作用に最も重要であるか予測できる。それゆえに、一つの態様において、どの残基を、抗体の結合特徴を変えるために変化させるかを容易に選択できる。例えば、ドッキングモデルから、パラトープのある残基の側鎖は、エピトープの結合を立体障害し得て、それゆえに、これらの残基の小さな側鎖を有する残基への変更が有利であり得ることは明らかであり得る。これを多くの方法で決定できる。例えば、２個のモデルを単に調査し、官能基および近接に基づき相互作用を概算し得る。あるいは、より有利なエネルギー相互作用を得るために、上記のとおりエピトープとパラトープの反復対合を行い得る。また、抗体がエピトープと結合し得る、別の方法で決定するために、抗体の多様な変異体のこれらの相互作用も決定できる。また、所望である特定の特徴を有する抗体を得るために、抗体の構造をどのように変えるべきかを決定するための多様なモデルを組み合わせることができる。
上で決定したモデルを種々の技術により試験できる。例えば、相互作用エネルギーを、どの変異体をさらに試験すべきかを決定するために上記プログラムで決定できる。また、クーロン力およびファンデルワールス相互作用を使用して、エピトープと変異体パラトープの相互作用エネルギーを決定できる。また部位特異的突然変異誘発を使用して、抗体構造における予測した変化が、実際結合特徴における所望の変化をもたらすかに使用する。あるいは、モデルが正確であることを確認するためまたはパラトープとエピトープの間で起こり得る一般的結合テーマを決定するために、エピトープを変化させ得る。
当業者に認識されるとおり、これらのモデルは本態様の抗体およびその変異体の製造に必要なガイダンスを提供するが、おそらく、インビトロを介する、インシリコモデルの日常的試験の実施がなお望ましいことがある。さらに、当業者に明らかなとおり、修飾はまた抗体の活性に付加的副作用を有し得る。例えば、結合を強くすると予測される何らかの変更が、大きな結合を誘発し得るが、また抗体の活性を減少または変更する他の構造的変化も起こし得る。これが当てはまるか否かの決定は当分野で日常的であり、多くの方法で達成できる。例えば、活性を、ＥＬＩＳＡ試験を介して試験できる。あるいは、サンプルを、表面プラズモン共鳴デバイスの使用を介して試験できる。
ＨＥＲ３抗体
本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２内のエピトープを認識する抗体を提供する。本発明は、ＨＥＲ３に対する一群の抗体がリガンド依存性およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナル伝達経路のいずれも遮断するとの驚くべき発見に基づく。ＨＥＲ３のドメイン２内のエピトープと結合する一群の抗体を表１に開示する。一つの態様において、抗体はリガンド依存性およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナル伝達のいずれも阻害する。他の態様において、抗体はＨＥＲ３と結合し、ＨＥＲリガンドのリガンド結合部位への結合を遮断しない(すなわちリガンドおよび抗体の両者が同時にＨＥＲ３と結合できる)。
本発明は、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と特異的に結合する抗体を提供し、該抗体は、配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、２１４、２３４、２５４、２７４、２９４、３１４、３３４、３５４、３７４、３９４、４１４、４３４、４５４、４７４、４９４、５１４および５２４のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。本発明は、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と特異的に結合する抗体を提供し、該抗体は、配列番号１５、３５、５５、７５、９５、１１５、１３５、１５５、１７５、１９５、２１５、２３５、２５５、２７５、２９５、３１５、３３５、３５５、３７５、３９５、４１５、４３５、４５５、４７５、４９５、５１５および５３５のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。本発明はまたＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と特異的に結合する抗体も結合し、該抗体は、表１に挙げるＶＨ ＣＤＲのいずれか一つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む。特に、本発明は、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と特異的に結合する抗体を提供し、該抗体は、表１に挙げるＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のＶＨ ＣＤＲを含む(あるいはこれらから成る)。
本発明の他の抗体は、変異しているが、ＣＤＲ領域において表１に記載する配列に示すＣＤＲ領域と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸を含む。ある態様において、表１に記載する配列に示すＣＤＲ領域と比較したとき、１個、２個、３個、４個または５個を超えないアミノ酸が変異しているが、なお、元の抗体のエピトープに対する特異性を維持する変異体アミノ酸配列を含む。
本発明の他の抗体は、変異しているが、フレームワーク領域において表１に記載する配列に示すフレームワーク領域なお少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸を含む。ある態様において、表１に記載する配列に示すフレームワーク領域と比較したときフレームワーク領域において１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個までのアミノ酸が変異されているが、なお、元の抗体のエピトープに対する特異性を維持する、変異体アミノ酸配列を含む。本発明はまた、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖および完全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。
本発明の他の抗体アミノ酸変異しているが、表１に記載する配列となお少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸または該アミノ酸をコードする核酸を含む。ある態様において、表１に記載する配列に示す可変領域と比較して可変領域において１個、２個、３個、４個または５個を超えないアミノ酸が変異しているが、実質的に同一の治療活性を維持する変異体アミノ酸配列を含む。
これらの抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３に結合できるため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖および完全長重鎖配列(アミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列)を本発明の他のＨＥＲ３抗体を創製するために“混合および整合”させ得る。このような“混合および整合”ＨＥＲ３抗体は、当分野で知られる結合アッセイ(例えば、例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例セクションに記載する他のアッセイ)を使用して試験できる。これらの鎖を混合および整合するとき、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列と置き換えなければならない。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長重鎖配列を、構造的に類似する完全長重鎖配列と置き換えなければならない。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列と置き換えなければならない。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長軽鎖配列を、構造的に類似する完全長軽鎖配列と置き換えなければならない。
したがって、一つの面において、本発明は、配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、２１４、２３４、２５４、２７４、２９４、３１４、３３４、３５４、３７４、３９４、４１４、４３４、４５４、４７４、４９４、５１４および５２４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号１５、３５、５５、７５、９５、１１５、１３５、１５５、１７５、１９５、２１５、２３５、２５５、２７５、２９５、３１５、３３５、３５５、３７５、３９５、４１５、４３５、４５５、４７５、４９５、５１５および５３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを有する単離モノクローナル抗体またはそのフラグメントに関し、ここで、該抗体はＨＥＲ３(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザル)に特異的に結合する。
具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号１４のＶＨおよび配列番号１５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３４のＶＨおよび配列番号３５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号５４のＶＨおよび配列番号５５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号７４および配列番号７５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号９４のＶＨおよび配列番号９５のＶＬを含むを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号１１４のＶＨおよび配列番号１１５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号１３４のＶＨおよび配列番号１３５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号１５４のＶＨおよび配列番号１５のＶＬ５を含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号１７４のＶＨおよび配列番号１７５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号１９４のＶＨおよび配列番号１９５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号２１４のＶＨおよび配列番号２１５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号２３４のＶＨおよび配列番号２３５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号２５４のＶＨおよび配列番号２５５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号２７４のＶＨおよび配列番号２７５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号２９４のＶＨおよび配列番号２９５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号３１４のＶＨおよび配列番号３１５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号３３４のＶＨおよび配列番号３３５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号３５４のＶＨおよび配列番号３５５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号３７４のＶＨおよび配列番号３７５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号３９４のＶＨおよび配列番号３９５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号４１４のＶＨおよび配列番号４１５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号４３４のＶＨおよび配列番号４３５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号４５４のＶＨおよび配列番号４５５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号４７４のＶＨおよび配列番号４７５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号４９４のＶＨおよび配列番号４９５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号５１４のＶＨおよび配列番号５１５のＶＬを含む。具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は配列番号５３４のＶＨおよび配列番号５３５のＶＬを含む。
他の面において、本発明は、表１に記載する重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはこれらの組み合わせを含むＨＥＲ３抗体を提供する。ＣＤＲ領域はKabatシステムを使用して描かれる(Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342: 877-883; およびAl-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948)。したがって、一つの態様において、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、２８２、３０２、３２２、３４２、３６２、３８２、４０２、４２２、４４２、４６２、４８２、５０２および５２２から成る群から選択されるＣＤＲ１配列；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、２０３、２２３、２４３、２６３、２８３、３０３、３２３、３４３、３６３、３８３、４０３、４２３、４４３、４６３、４８３、５０３および５２３から成る群から選択されるＣＤＲ２配列；および／または配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、２８４、３０４、３２４、３４４、３６４、３８４、４０４、４２４、４４４、４６４、４８４、５０４および５２４から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；および配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、２８８、３０８、３２８、３４８、３６８、３８８、４０８、４２８、４４８、４６８、４８８、５０８および５２８から成る群から選択されるＣＤＲ１配列；配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９、１６９、１８９、２０９、２２９、２４９、２６９、２８９、３０９、３２９、３４９、３６９、３８９、４０９、４２９、４４９、４６９、４８９、５０９および５２９から成る群から選択されるＣＤＲ２配列；および／または配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、３５０、３７０、３９０、４１０、４３０、４５０、４７０、４９０、５１０および５３０から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列を含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントはＨＥＲ３のドメイン２と結合する。
具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号５０２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５０３のＣＤＲ２；配列番号５０４のＣＤＲ３の；配列番号５０８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５０９のＣＤＲ２；および配列番号５１０のＣＤＲ３を含む。
具体的態様において、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号５２２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５２３のＣＤＲ２；配列番号５２４のＣＤＲ３；配列番号５２８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５２９のＣＤＲ２；および配列番号５３０のＣＤＲ３を含む。
ここで使用する、ヒト抗体は、抗体の可変領域または完全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られるならば、特定の生殖系列配列の“産物である”またはこれに“由来する”重鎖または軽鎖可変領域または完全長重鎖または軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免疫化するかまたはファージ上に示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを目的の抗原についてスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の“産物である”またはこれに“由来する”ヒト抗体は、それ自体、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近い(すなわち、最大％同一性)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の“産物である”またはこれに“由来する”ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異または部位特異的変異の意図的導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を有し得る。しかしながら、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域において、選択したヒト抗体は、典型的に、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較したとき、ヒト抗体をヒトと同定するアミノ酸残基を含む。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％またはさらに９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。典型的に、組み換えヒト抗体は、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域においてにおいて、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０個を超えないアミノ酸差異を示す。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と５個を超えないまたは４個、３個、２個または１個を超えないアミノ酸差異を示し得る。Kabatを使用した、代表的数のＨＥＲ３抗体についてＶＨおよびＶＬ生殖系列配列を使用する異なる生殖系列化物(germlined versions)を、表２に示す。ＣＤＲ位置を太字で強調する。表において生殖系列化(germlined)配列と共に使用した注記は次のとおりである：MOR10701−ＶＨ＿３−０７はＶＨ生殖系列配列３−０７のフレームワーク領域内のMOR10701 ＣＤＲループを意味し(命名法はVbaseに従う)、MOR10703−ＶＫ＿Ｌ１は、ＶＫ＿Ｌ１の生殖系列フレームワーク領域のMOR10703からのＣＤＲを意味し、ここで、ＶＫはカッパ軽鎖である。
ここに開示する抗体は一本鎖抗体、二重特異性抗体、ドメイン抗体、ナノボディおよびユニボディの誘導体であり得る。“一本鎖抗体”(ｓｃＦｖ)は、ＶＨドメインに結合したＶＬドメインを含む一ポリペチド鎖から成り、ここで、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは対合して一価分子を形成する。一本鎖抗体は当分野で知られた方法に従い製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。“摘芽(disbud)”は２本の鎖から成り、各鎖は、同ポリペチド鎖上の軽鎖可変領域に短ペプチドリンカーを介して結合した重鎖可変領域を含み、ここで、同じ鎖上の２個の領域は互いに対合しないが、他の鎖上の相補的ドメインと対合して、二重特異性分子を形成する。二重特異性抗体の製造方法は当分野で知られている(例えば、Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448およびPoljak et al., (1994) Structure 2:1121-1123参照)。ドメイン抗体(ｄＡｂｓ)は抗体の小さな機能的結合単位であり、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域に対応する。ドメイン抗体は細菌、酵母および哺乳動物細胞系で十分発現する。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細は当分野で知られている(例えば、米国特許６,２９１,１５８；６,５８２,９１５；６,５９３,０８１；６,１７２,１９７；６,６９６,２４５；欧州特許０３６８６８４および０６１６６４０；ＷＯ０５／０３５５７２、ＷＯ０４／１０１７９０、ＷＯ０４／０８１０２６、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９およびＷＯ０３／００２６０９参照)。ナノボディは、抗体の重鎖に由来する。ナノボディは典型的に１個の可変ドメインおよび２個の定常ドメイン(ＣＨ２およびＣＨ３)を含み、元の抗体の抗原結合能力を維持する。ナノボディは、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、米国特許番号６,７６５,０８７、米国特許番号６,８３８,２５４、ＷＯ０６／０７９３７２参照)。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体の１個の軽鎖および１個の重鎖から成る。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去により製造し得る。ユニボディおよびその製造方法のさらなる詳細はＷＯ２００７／０５９７８２に見ることができる。
相同抗体
さらに他の態様において、本発明は、表１に記載した配列と相同であるアミノ酸配列を含む抗体またはそのフラグメントに関し、該抗体はＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と結合し、表１に記載した抗体の所望の機能的特性を維持する。
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体(またはその機能的フラグメント)を提供し、ここで、重鎖可変領域は配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、２１４、２３４、２５４、２７４、２９４、３１４、３３４、３５４、３７４、３９４、４１４、４３４、４５４、４７４、４９４、５１４および５２４から成る群から選択されるアミノ酸と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、２１４、２３４、２５４、２７４、２９４、３１４、３３４、３５４、３７４、３９４、４１４、４３４、４５４、４７４、４９４、５１４および５２４から成る群から選択されるアミノ酸と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み；該抗体はＨＥＲ３(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)と結合し、ＨＥＲ３のシグナル伝達活性を阻害し、これは、リン酸化アッセイまたは他のＨＥＲシグナル伝達指標により測定できる(実施例に記載する例えば、ホスホ−ＨＥＲ３アッセイ、ホスホ−Ａｋｔアッセイ、細胞増殖およびリガンド遮断アッセイ)。また本発明の範囲に包含されるのは、可変重鎖および軽鎖親ヌクレオチド配列；および哺乳動物細胞での発現のための完全長重鎖および軽鎖配列最適化である。本発明の他の抗体は、変異されているが、上記配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸または核酸を含む。ある態様において、上記配列に示す可変領域と比較したとき、可変領域において１個、２個、３個、４個または５個を超えないアミノ酸がアミノ酸欠失、挿入または置換により置換されている変異アミノ酸配列を含む。
他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示す配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、１個、２個、３個、４個または５個を超えないアミノ酸位置のアミノ酸置換以外同一である。表１に記載した抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と高い(すなわち、８０％以上)同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は突然変異誘発(例えば、部位特異的またはＰＣＲ仲介突然変異誘発)、その後のここに記載する機能的アッセイを使用するコードされた改変された抗体の残存機能についての試験により得ることができる。
他の態様において、重鎖および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、上記配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
ここで使用する、２配列間の“同一性パーセント”は、２配列の最適整列のために導入する必要がある、ギャップ数およびギャップ長を考慮に入れた、これらの配列により共有される同一位置の数の関数(すなわち、％同一性は同一位置数／位置の総数×１００である)である。２配列間の配列比較および同一性パーセント決定は、下記非限定的例に記載する数学的アルゴリズムを使用して達成できる。
これに加えてまたはこれ以外に、本発明のタンパク質配列は、さらに、例えば、関連配列を同定するための、公的データベースに対する検索を実施するための“クエリー配列”として使用できる。例えば、このような検索はAltschul et al., (1990) J.Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。
保存的修飾を有する抗体
ある態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、ここで、これらのＣＤＲ配列の１個以上がここに記載する抗体またはその保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、該抗体は本発明のＨＥＲ３抗体の所望の機能的特性を維持する。
したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域から成る単離ＨＥＲ３モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供し、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列は配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、２８２、３０２、３２２、３４２、３６２、３８２、４０２、４２２、４４２、４６２、４８２、５０２および５２２およびその保存的修飾体から成る群から選択されから成る群から選択され；重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列は配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、２０３、２２３、２４３、２６３、２８３、３０３、３２３、３４３、３６３、３８３、４０３、４２３、４４３、４６３、４８３、５０３および５２３およびその保存的修飾体から成る群から選択され；重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列は配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、２８４、３０４、３２４、３４４、３６４、３８４、４０４、４２４、４４４、４６４、４８４、５０４および５２４およびその保存的修飾体から成る群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列は配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、２８８、３０８、３２８、３４８、３６８、３８８、４０８、４２８、４４８、４６８、４８８、５０８および５２８およびその保存的修飾体から成る群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列は配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９、１６９、１８９、２０９、２２９、２４９、２６９、２８９、３０９、３２９、３４９、３６９、３８９、４０９、４２９、４４９、４６９、４８９、５０９および５２９およびその保存的修飾体から成る群から選択され；軽鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列は配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、３５０、３７０、３９０、４１０、４３０、４５０、４７０、４９０、５１０および５３０およびその保存的修飾体から成る群から選択され；該抗体またはそのフラグメントはＨＥＲ３と特異的に結合し、ＨＥＲ３シグナル伝達経路阻害によりＨＥＲ３活性を阻害し、これは、リン酸化アッセイまたは他のＨＥＲシグナル伝達指標により測定できる(実施例に記載する例えば、ホスホ−ＨＥＲ３アッセイ、ホスホ−Ａｋｔアッセイ、細胞増殖およびリガンド遮断アッセイ)。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に記載したＨＥＲ３抗体と同じエピトープと相互作用(例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布による)する、抗体を提供する。さらなる抗体は、それゆえに、ＨＥＲ３結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合(例えば、統計学的に有意な方法での結合の競合的阻害)する能力に基づき同定できる。試験抗体が本発明の抗体のＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)への結合を阻害する能力は、試験抗体がＨＥＲ３への結合について該抗体と競合することを意味し、このような抗体は、理論に縛られないが、ＨＥＲ３タンパク質上の競合する抗体と同じまたは関連(例えば、構造的に類似または空間的に近位)エピトープに結合する。ある態様において、ＨＥＲ３上の本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体はここに記載するとおり製造および単離できる。
一つの態様において、抗体またはそのフラグメントはＨＥＲ３のドメイン２と結合し、ＨＥＲ３を、ドメイン２内に存在する二量体化ループの露出を妨げる立体構造に維持する。これは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４のような他のファミリーメンバーとのヘテロ二量体化を妨げる。抗体またはそのフラグメントはリガンド依存性およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナル伝達のいずれも阻害する。
他の態様において、抗体またはそのフラグメントは、ニューレグリンのようなＨＥＲ３リガンドの同時結合を遮断することなく、ＨＥＲ３のドメイン２と結合できる。理論を述べる必要はないが、ＨＥＲ３のドメイン２と結合する抗体またはそのフラグメントが、ＨＥＲ３を、ＨＥＲ３上のリガンド結合部位を遮断しない立体構造に維持することはありそうである。それゆえに、ＨＥＲ３リガンド(例えば、ニューレグリン)は本抗体またはそのフラグメントと同時にＨＥＲ３に結合できる。
本発明の抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３のリガンド依存性および非依存性活性化の両者を、リガンド結合を妨げることなく阻害する。これは次の理由から有利であると考えられる：
(ｉ) 治療抗体は、各腫瘍型が各機構により誘導されるため、ＨＥＲ３活性化の一機構(すなわちリガンド依存性またはリガンド非依存性)を標的とする抗体よりも広域の腫瘍に臨床的有用性を有する。
(ii) 治療抗体は、ＨＲ３活性化の両機構が同時に関与する腫瘍型に有用である。ＨＥＲ３活性化の一機構(すなわちリガンド依存性またはリガンド非依存性)を標的とする抗体はこれらの腫瘍型にほとんど効果がないかまったく効果がない。
(iii) リガンド結合を妨げることなくＨＥＲ３のリガンド依存性活性化を阻害する抗体の効果は、リガンドの濃度増加に悪影響を与える可能性が低い。これは、極めて高濃度のＨＥＲ３リガンドにより駆動される腫瘍型における効果の上昇または耐性がＨＥＲ３リガンドの上方制御により仲介されるときの薬物耐性傾向の減少に反映される。
(iv) 不活性形態の安定化によりＨＥＲ３活性化を阻害する抗体は、ＨＥＲ３活性化の代替機構により駆動される薬物耐性の傾向が低い。
結果として、本発明の抗体は、既存の治療抗体が臨床的に無力である状態の処置に使用し得る。
操作および修飾抗体
本発明の抗体は、さらに、ここに示すＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上を有する抗体を出発物質として使用して、修飾抗体を設計し、その修飾抗体は出発抗体から変更された特性を有し得る。抗体は、可変領域の一方または両方(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば１個以上のＣＤＲ領域および／または１個以上のフレームワーク領域内の１個以上の残基の修飾により操作し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基の修飾により操作してよい。
実施できる可変領域操作の一つのタイプはＣＤＲ移植である。抗体は、標的抗原と主に６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基を介して相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ以外の配列よりも抗体毎により多様性である。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原相互作用を担うため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植した特異的天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターの構築により、特異的な天然に存在する抗体の特性を模倣する組み換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327;Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033；Winterの米国特許番号５,２２５,５３９およびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
したがって、本発明の他の態様は、それぞれ配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、２８２、３０２、３２２、３４２、３６２、３８２、４０２、４２２、４４２、４６２、４８２、５０２および５２２から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、２０３、２２３、２４３、２６３、２８３、３０３、３２３、３４３、３６３、３８３、４０３、４２３、４４３、４６３、４８３、５０３および５２３から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、２８４、３０４、３２４、３４４、３６４、３８４、４０４、４２４、４４４、４６４、４８４、５０４および５２４から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；およびそれぞれ配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、２８８、３０８、３２８、３４８、３６８、３８８、４０８、４２８、４４８、４６８、４８８、５０８および５２８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９、１６９、１８９、２０９、２２９、２４９、２６９、２８９、３０９、３２９、３４９、３６９、３８９、４０９、４２９、４４９、４６９、４８９、５０９および５２９から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、３５０、３７０、３９０、４１０、４３０、４５０、４７０、４９０、５１０および５３０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域単離を含むＨＥＲ３モノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。それゆえに、このような抗体はモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体と異なるフレームワーク配列もなお含み得る。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公表された刊行物から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は“Vase”ヒト生殖系列配列データベース(インターネットのwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseから入手可能)、ならびにKabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; およびAl-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948; Tomlinson et al., (1992) J. fol. Biol. 227:776-798; およびCox et al., (1994) Eur. J Immunol. 24:827-836に見ることができ；これらの内容は、本明細書に引用により明示的に包含させる。
本発明の抗体で使用するためのフレームワーク配列の例は、選択した本発明の抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列をフレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるものと同一配列を有するフレームワーク領域に移植できまたはＣＤＲ配列を生殖系列配列と比較して１個以上の変異を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある場合には抗体の抗原結合能力の維持または亢進のためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有利であることが判明している(例えば、Queen et alの米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
他のタイプの可変領域修飾は、“親和性成熟”として知られる、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それにより目的の抗体の１個以上の結合特性(例えば、親和性)を改善させることである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ仲介突然変異誘発を変異の導入のために行ってよく、目的の抗体結合または他の機能的特性に対する影響をここに記載するおよび実施例に提供するインビトロまたはインビボアッセイで評価できる。保存的修飾(上記のとおり)を導入できる。変異はアミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的にＣＤＲ領域内の１個、２個、３個、４個または５個を超えない残基を変更する。
したがって、他の態様において、本発明は、配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、２８２、３０２、３２２、３４２、３６２、３８２、４０２、４２２、４４２、４６２、４８２、５０２および５２２から成る群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、２８２、３０２、３２２、３４２、３６２、３８２、４０２、４２２、４４２、４６２、４８２、５０２および５２２と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成るＶＨ ＣＤＲ１領域；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、２０３、２２３、２４３、２６３、２８３、３０３、３２３、３４３、３６３、３８３、４０３、４２３、４４３、４６３、４８３、５０３および５２３から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域または配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、２０３、２２３、２４３、２６３、２８３、３０３、３２３、３４３、３６３、３８３、４０３、４２３、４４３、４６３、４８３、５０３および５２３と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列；配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、２８４、３０４、３２４、３４４、３６４、３８４、４０４、４２４、４４４、４６４、４８４、５０４および５２４から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域または配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、２８４、３０４、３２４、３４４、３６４、３８４、４０４、４２４、４４４、４６４、４８４、５０４および５２４と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列；配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、２８８、３０８、３２８、３４８、３６８、３８８、４０８、４２８、４４８、４６８、４８８、５０８および５２８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域または配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、２８８、３０８、３２８、３４８、３６８、３８８、４０８、４２８、４４８、４６８、４８８、５０８および５２８と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列；配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９、１６９、１８９、２０９、２２９、２４９、２６９、２８９、３０９、３２９、３４９、３６９、３８９、４０９、４２９、４４９、４６９、４８９、５０９および５２９から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域または配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９、１６９、１８９、２０９、２２９、２４９、２６９、２８９、３０９、３２９、３４９、３６９、３８９、４０９、４２９、４４９、４６９、４８９、５０９および５２９と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列；および配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、３５０、３７０、３９０、４１０、４３０、４５０、４７０、４９０、５１０および５３０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域または配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、３５０、３７０、３９０、４１０、４３０、４５０、４７０、４９０、５１０および５３０と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域から成る、単離ＨＥＲ３モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。
抗体フラグメントの代替的フレームワークまたはスキャフォールドへの移植
得られたポリペチドがＨＥＲ３と特異的に結合する少なくとも１個の結合領域を含む限り、多種多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドを用いることができる。このようなフレームワークまたはスキャフォールドはヒト免疫グロブリンの５個の主用なイディオタイプまたはそのフラグメントを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。新規フレームワーク、スキャフォールドおよびフラグメントは当業者により発見および開発され続けている。
一つの面において、本発明は、本発明のＣＤＲが移植できる非免疫グロブリンスキャフォールドを使用する非免疫グロブリンに基づく抗体の製造方法に関する。現在または将来的に知られる非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドを、標的ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)に特異的な結合領域を含む限り、用い得る。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドは、フィブロネクチン(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd., Cambridge, MAおよびAblynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小モジュラー免疫薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、プロテインＡ(Affibody AG, Sweden)およびアフィリン(ガンマ結晶またはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含むが、これらに限定されない。
フィブロネクチンスキャフォールドはフィブロネクチンIII型ドメイン(例えば、フィブロネクチンIII型の第１０モジュール(１０Ｆｎ３ドメイン))に基づく。フィブロネクチンIII型ドメインは、７個または８個のベータ鎖を有し、これは２個のベータシートに分散し、これ自体互いに包装されて、タンパク質のコアを形成し、さらにループ(ＣＤＲに類似)を含み、これはベータ鎖を互いに連結し、溶媒に晒される。ベータシートサンドイッチの各端に少なくとも３個のこのようなループがあり、ここで、該端はベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である(ＵＳ６,８１８,４１８参照)。これらのフィブロネクチンに基づくスキャフォールドは免疫グロブリンではないが、全体的折り畳みは、ラクダおよびラマＩｇＧにおける全抗原認識単位を含む重鎖の可変領域である、最小機能的抗体フラグメントのものと密接に関連する。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、自然に近い抗原結合特性および抗体の親和性を模倣する。これらのスキャフォールドは、インビボの抗体親和性成熟の過程に類似するインビトロでのループ無作為化およびシャフリング方法に使用できる。これらのフィブロネクチンに基づく分子をスキャフォールドとして使用でき、そこで、分子のループ領域を標準的クローニング技術を使用して本発明のＣＤＲに置き換えることができる。
アンキリン方法は、アンキリン由来反復モジュールを有するタンパク質を、異なる標的への結合に使用できる可変領域を担持するスキャフォールドとして使用することに基づく。アンキリン反復モジュールは、２個の逆平行α螺旋およびβターンから成る３３アミノ酸ポリペチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用してほとんど最適化される。
アビマーは天然Ａドメイン含有タンパク質、例えばＨＥＲ３由来である。これらのドメインは、本来タンパク質−タンパク質相互作用に使用され、ヒトに置いて２５０を超えるタンパク質が構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して結合する多くの異なる“Ａドメイン”モノマー(２−１０)から成る。アビマーは、例えば、米国特許出願公開２００４０１７５７５６；２００５００５３９７３；２００５００４８５１２；および２００６０００８８４４に記載する方法を使用して、標的抗原に結合できるように創製できる。
アフィボディ親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１個のスキャフォールドに基づく３螺旋束から成る小さく、単純なタンパク質である。プロテインＡは黄色ブドウ球菌である細菌由来の表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは５８アミノ酸から成り、そのうち１３個は無作為化されて、多数のリガンド変異体と共にアフィボディライブラリーを産生する(例えば、ＵＳ５,８３１,０１２参照)。アフィボディ分子は抗体を模倣し、１５０kDaである抗体の分子量と比較して、６kDaの分子量を有する。サイズが小さいにも係らず、アフィボディ分子の結合部位は抗体のものに類似する。
アンチカリンはPieris ProteoLab AG社により開発された製品である。リポカリンに由来し、通常化学的に感受性のまたは不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵する、小さく、堅牢なタンパク質のどこにでもある群である。数種の天然リポカリンはヒト組織または体液に生じる。タンパク質構造は免疫グロブリンを暗示し、強固なフレームワークの頂上に超可変ループがある。しかしながら、抗体またはそれらの組み換えフラグメントとは対照的に、リポカリンは、１６０〜１８０アミノ酸残基の一ポリペチド鎖から成り、一免疫グロブリンドメインよりほんのわずかだけ大きい。結合ポケットを形成する４個のループの組は明白な構造的可塑性を示し、多様な側鎖を許容する。結合部位は、それゆえに、高親和性および特異性で異なる形の処方標的分子を認識するために、独自の工程で再形成され得る。リポカリンファミリーの１タンパク質であるPieris Brassicaeのビリン結合タンパク質(ＢＢＰ)は、４個のループの組の突然変異誘発によりアンチカリンを開発するために使用されている。アンチカリンを記載する特許の一例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１９９９１６８７３である。
アフィリン分子は、タンパク質および小分子に対する特異的親和性のために設計された小非免疫グロブリンタンパク質である。新規アフィリン分子を２個のライブラリーから極めて迅速に選択でき、その各々は異なるヒト由来スキャフォールドタンパク質に基づく。アフィリン分子は免疫グロブリンタンパク質に対する構造的相同性を示さない。現在、２種のアフィリンスキャフォールドが用いられ、その一方はヒト構造的眼水晶体タンパク質であるガンマ結晶であり、他方は“ユビキチン”スーファーファミリータンパク質である。両ヒトスキャフォールドとも極めて小さく、高温安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほとんど耐性である。この高安定性は主にタンパク質のベータシート構造の伸長による。ガンマ結晶由来タンパク質の例はＷＯ２００１０４１４４に記載させ、“ユビキチン様”タンパク質の例はＷＯ２００４１０６３６８に記載される。
タンパク質エピトープ模倣物(ＰＥＭ)は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する主二次構造であるタンパク質のベータハルピン二次構造を模倣する中程度のサイズの、環状、ペプチド様分子(ＭＷ １〜２kDa)である。
ある態様において、Ｆｃ領域を変えることにより、ＦａｂｓをサイレントＩｇＧ１形式に変換する。例えば、表１の抗体をＩｇＧ形式に変えることができる。
ヒトまたはヒト化抗体
本発明は、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザル／マウス／ラットＨＥＲ３)に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラまたはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントは、ヒト対象に投与したとき、抗原性がさらに低減されている。
ヒトＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントは当分野で知られている方法を使用して産生できる。例えば、ヒューマニアリング方法が非ヒト抗体の改変ヒト抗体への変換に使用されている。米国特許公開２００５０００８６２５は、非ヒト抗体と比較して同じまたは良好な結合特徴を維持しながら、抗体において非ヒト抗体可変領域をヒト可変領域と置き換えるインビボ方法を記載する。本方法は、非ヒト参照抗体の完全ヒト抗体への可変領域のエピトープ誘導置換に依存する。得られたヒト抗体は、一般的に参照非ヒト抗体と構造的に関連しないが、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。要約すると、連続的エピトープ誘導相補性置換手法が、抗原の試験抗体への結合に応答するレポーターシステムの存在下、限定的量の抗原に対する結合について、細胞を“コンペティター”と参照抗体の多様なハイブリッドのライブラリー(“試験抗体”)の間で競合させることにより可能となる。コンペティターは参照抗体またはその誘導体、例えば一本鎖Ｆｖフラグメントであり得る。コンペティターはまた参照抗体と同じエピトープに結合する抗原の天然または人工リガンドであり得る。コンペティターに対する唯一の条件は、参照抗体と同じエピトープに結合することおよび抗原結合について参照抗体と競合することである。試験抗体は、非ヒト参照抗体由来の抗原結合Ｖ領域を共通しておよび多様な源、例えばヒト抗体のレパートリーライブラリーから無作為に選択された他のＶ領域を有する。参照抗体からの共通Ｖ領域は、選択が参照抗体に対する最高抗原結合忠実度に偏向されるようにガイドとして働き、試験抗体を抗原上の同じエピトープに同じ方向に配置する。
多くのタイプのレポーターシステムを使用して、試験抗体と抗原の所望の相互作用を決定できる。例えば、フラグメント相補性によるレポーター活性化が、試験抗体が抗原と結合したときしか起こらないように、相補レポーターフラグメントをそれぞれ抗原および試験抗体と関連させ得る。試験抗体−および抗原−レポーターフラグメント融合体がコンペティターと共発現されたとき、レポーター活性化は、コンペティターと競合する試験抗体の能力に依存性となり、これは、該抗原に対する試験抗体の親和性と比例する。使用できる他のレポーターシステムは、米国特許出願１０／２０８,７３０(公開番号２００３０１９８９７１)に開示された自己阻害レポーター再活性化系(ＲＡＩＲ)のリアクティベーターまたは米国特許出願１０／０７６,８４５(公開番号２００３０１５７５７９)に開示された競合的活性化システムを含む。
連続的エピトープ誘導相補性置換システムで、コンペティター、抗原およびレポーター成分と共に一試験抗体を発現する細胞を同定するために選択する。これらの細胞において、各試験抗体は、限定的量の抗原への結合について一対一でコンペティターと競合する。レポーターの活性は試験抗体に結合した抗原の量に比例し、これは試験抗体の抗原に対する親和性および試験抗体の安定性に比例する。試験抗体を、最初に、試験抗体として発現されたとき参照抗体に対する活性に基づき選択する。第一回目の選択の結果は、一連の“ハイブリッド”抗体であり、その各々は参照抗体由来の同じ非ヒトＶ領域およびライブラリー由来のヒトＶ領域から成り、その各々は抗原の参照抗体と同じエピトープに結合する。第一回目で選択した１個以上のハイブリッド抗体は、抗原に対して参照抗体と同等または高い親和性を有する。
第二Ｖ領域置換工程において、第一工程で選択したヒトＶ領域を、残りの非ヒト参照抗体Ｖ領域について同族ヒトＶ領域の多様なライブラリーでのヒト置換の選択のためのガイドとして使用する。第一回目で選択されたハイブリッド抗体はまた第二回目の選択のコンペティターとして使用できる。第二回目の選択の結果は、参照抗体と構造的に異なるが、同じ抗原への結合について参照抗体と競合する一連の完全ヒト抗体である。選択したヒト抗体のいくつかは、同じ抗原上の参照抗体と同じエピトープに結合する。これらの選択したヒト抗体の中で、１個以上が、参照抗体と同等または高い親和性で同じエピトープに結合する。
上に参照抗体として記載したマウスまたはキメラＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントの一つを使用して、この方法を使用して、同じ結合特異性および同じまたは良好な結合親和性でヒトＨＥＲ３と結合するヒト抗体を容易に産生できる。さらに、このようなヒトＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントはまたヒト抗体を慣習的に製造する会社、例えば、KaloBios, Inc. (Mountain View, CA)から商業的に得ることもできる。
ラクダ科抗体
新世界メンバー、例えばラマ種(Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna)を含むラクダおよびヒトコブラクダ(Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius)ファミリーのメンバーから得た抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性およびヒト対象への抗原性について特徴づけされている。哺乳動物のこのファミリー由来のある種のＩｇＧ抗体は生来軽鎖を欠き、それゆえに、他の動物由来の抗体の２個の重鎖および２個の軽鎖の典型的４鎖四次構造と構造的に区別されることが判明している。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４(１９９４年３月３日公開のＷＯ９４／０４６７８)参照。
ＶＨＨとして同定される小さな一可変ドメインであるラクダ科抗体の領域は、標的に対して高親和性を有する小タンパク質を産生するために遺伝子操作することにより得ることができ、“ラクダ科ナノボディ”として知られる低分子量抗体由来タンパク質をもたらす。１９９８年６月２日発行の米国特許番号５,７５９,８０８参照；またStijlemans et al., (2004) J Biol Chem 279:1256-1261; Dumoulin et al., (2003) Nature 424:783-788; Pleschberger et al., (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo et al., (2002) Int J Cancer 89:456-62; およびLauwereys et al., (1998) EMBO J 17:3512-3520も参照。ラクダ科抗体および抗体フラグメントの操作されたライブラリーは、例えば、Ablynx、Ghent、Belgium(例えば、ＵＳ２００６０１１５４７０；Domantis(ＵＳ２００７００６５４４０、ＵＳ２００９０１４８４３４)から商業的に入手可能である。非ヒト起源の他の抗体と同様、ラクダ科抗体のアミノ酸配列を組み換えにより変更して、ヒト配列をより密接に模倣する配列を得ることができ、すなわち、ナノボディを“ヒト化”できる。こうして、ラクダ科抗体のヒトに対する天然の低抗原性をさらに減らすことができる。
ラクダ科ナノボディは、ヒトＩｇＧ分子の１／１０の分子量であり、タンパク質はわずか数ナノメートルの物理的直径を有する。サイズが小さいことによる一つの結果は、ラクダ科ナノボディが大型抗体タンパク質で機能的に探知されない抗原性部位に結合する能力であり、すなわち、ラクダ科ナノボディは古典的免疫学的技術を使用して他の場合には隠れている抗原を検出する試薬としておよび可能な治療剤として有用である。それゆえに、サイズが小さいことによる別の結果は、ラクダ科ナノボディが標的タンパク質の溝または狭い隙間における特異的部位への結合の結果阻害でき、それゆえに古典的抗体よりも古典的低分子量剤の機能をより模倣した能力において役立ち得ることである。
低分子量および小型サイズにより、さらに、ラクダ科ナノボディは極めて熱安定であり、厳しいｐＨおよびタンパク分解消化に安定であり、抗原性が低い。他の結果は、ラクダ科ナノボディが循環系から組織に容易に移動し、血液脳関門すら通過し、神経組織に影響する障害を処置できることである。ナノボディはさらに血液脳関門を通過する薬物輸送を促進できる。２００４年８月１９日公開の米国特許出願２００４０１６１７３８参照。これらの特性は、ヒトへの低抗原性と組み合わさって、大きな治療可能性を示す。さらに、これらの分子は原核細胞、例えば大腸菌で完全に発現でき、バクテリオファージと融合タンパク質で発現され、機能的である。
従って、本発明の特性は、ＨＥＲ３に対する高親和性を有するラクダ科抗体またはナノボディである。ここでのある種の態様において、ラクダ科抗体またはナノボディはラクダ科動物で天然に産生され、すなわち、ラクダ科でここで他の抗体について記載した技術を使用したＨＥＲ３またはそのペプチドフラグメントでの免疫化後に産生される。あるいは、ＨＥＲ３結合ラクダ科ナノボディは改変され、すなわち、例えば、ここでの実施例に記載するとおりＨＥＲ３を標的として用いるパニング法を使用した、突然変異誘発したラクダ科ナノボディタンパク質を適当に示すファージのライブラリーからの選択により製造する。改変ナノボディは、さらにレシピエント対象における４５分〜２週間の半減期を有するように遺伝子操作によりカスタマイズできる。具体的態様において、ラクダ科抗体またはナノボディは、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、例えばＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４に記載のとおり、ナノボディまたは一ドメイン抗体フレームワーク配列に移植することにより得る。一つの態様において、ラクダ科抗体またはナノボディは、少なくともアミノ酸２６５〜２７７および３１５から選択されるＨＥＲ３のドメイン２のアミノ酸残基に結合する態様において、ラクダ科抗体またはナノボディは、ＨＥＲ３のドメイン２の少なくともアミノ酸残基Ｌｙｓ２６８と結合する。
二重特異性分子および多価抗体
他の面において、本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２内のエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントを含む、二重パラトープ、二重特異性または多特異的分子に関する。抗体またはそのフラグメントを誘導体化または他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、他の抗体または受容体に対するリガンド)と結合して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を産生できる。抗体またはそのフラグメントは、実際、誘導体化または１個を超える他の機能的分子と結合して、２個を超える異なる結合部位および／または標的分子と結合する二重パラトープまたは多特異的分子を産生できる；このような二重パラトープまたは多特異的分子。二重特異性分子を製造するために、抗体またはそのフラグメントを、二重特異性分子が得られるように、１個以上の他の結合分子、例えば他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物と機能的に結合(例えば、化学カップリング、遺伝的融合、非共有結合的結合またはその他)できる。
さらに臨床的利益が、１抗体への２個以上の抗原の結合により提供され得る(Coloma et al., (1997); Merchant et al., (1998); Alt et al., (1999); Zuo et al., (2000); Lu et al., (2004); Lu et al., (2005); Marvin et al., (2005); Marvin et al., (2006); Shen et al., (2007); Wu et al., (2007); Dimasi et al., (2009); Michaelson et al., (2009)). (Morrison et al., (1997) Nature Biotech. 15:159-163; Alt et al. (1999) FEBS Letters 454:90-94; Zuo et al., (2000) Protein Engineering 13:361-367; Lu et al., (2004) JBC 279:2856-2865; Lu et al., (2005) JBC 280:19665-19672; Marvin et al., (2005) Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658; Marvin et al., (2006) Curr Opin Drug Disc Develop 9:184-193; Shen et al., (2007) J Immun Methods 218:65-74; Wu et al., (2007) Nat Biotechnol. 11:1290-1297; Dimasi et al., (2009) J Mol Biol. 393:672-692; およびMichaelson et al., (2009) mAbs 1:128-141)。
二重特異性分子は、構成要素結合特異性を、当分野で知られる方法を使用してコンジュゲートすることにより製造できる。例えば、二重特異性分子の各結合毒異性を別々に産生し、次いで互いにコンジュゲートし、例えば、多様なカップリングまたは架橋剤を共有結合的コンジュゲーションに使用できる。架橋剤の例はプロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)(例えば、Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。他の方法は Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78:118-132; Brennan et al., (1985) Science 229:81-83)およびGlennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375参照)に記載のものを含む。コンジュゲーション剤(Conjugating agent)はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもPierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
抗体で、２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートできる。具体的態様において、ヒンジ領域を、コンジュゲーション前に奇数、例えば１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾する。
あるいは、両結合特異性を同じベクターでコード化させ、発現させ、同じ宿主細胞で集合させ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１個の一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２個の結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２個の一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子の製造方法は、例えば米国特許番号５,２６０,２０３；米国特許番号５,４５５,０３０；米国特許番号４,８８１,１７５；米国特許番号５,１３２,４０５；米国特許番号５,０９１,５１３；米国特許番号５,４７６,７８６；米国特許番号５,０１３,６５３；米国特許番号５,２５８,４９８；および米国特許番号５,４８２,８５８に記載されている。
二重特異性分子のその特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫アッセイ(ＲＥＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)またはウェスタンブロットアッセイにより確認できる。これらのアッセイの各々は、一般的に特に興味深いタンパク質−抗体複合体の存在を、目的の複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体)を用いて検出する。
他の面において、本発明は、ＨＥＲ３に結合する抗体の少なくとも２個の同一または異なるフラグメントを含む多価化合物を提供する。抗体フラグメントは、タンパク質融合または共有結合または非共有結合的結合を介して互いに結合できる。四価化合物は、例えば、本発明の抗体の抗体と本発明の抗体の定常領域と結合する抗体、例えばＦｃまたはヒンジ領域の架橋により得ることができる。三量体形成ドメインは、例えばBoreanの特許ＥＰ１０１２２８０Ｂ１に記載されている。五量体形成モジュールは例えばＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７に記載されている。
一つの態様において、二重パラトープ／二重特異性は、ＨＥＲ３のドメイン２内のアミノ酸残基と結合する。
他の態様において、本発明は、一モノクローナル抗体が抗原結合部位が１個を超える抗原と結合するように修飾された二重機能抗体、例えばＨＥＲ３と他の抗原(例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４)のいずれにも結合する二重機能抗体に関する。他の態様において、本発明は、同じ立体構造を有する抗原、例えば“閉”または“不活性”状態のＨＥＲ３と同じ立体構造を有する抗原を標的とする二重機能抗体を提供する。“閉”または“不活性”状態のＨＥＲ３と同じ立体構造を有する抗原の例は、ＨＥＲ１およびＨＥＲ４を含むが、これらに限定されない。それゆえに、二重機能抗体はＨＥＲ３とＨＥＲ１、ＨＥＲ３とＨＥＲ４またはＨＥＲ１とＨＥＲ４に結合し得る。二重機能抗体の二重結合特異性は、さらに二重の活性または活性阻害に反映され得る(例えば、Jenny Bostrom et al., (2009) Science:323;1610-1614参照)。
半減期が延長した抗体
本発明は、インビボでの半減期が延長した、ＨＥＲ３のドメイン２におけるエピトープと特異的に結合する抗体を提供する。
多くの因子がインビボでのタンパク質の半減期に影響し得る。例は、腎臓濾過、肝臓での代謝、タンパク分解酵素(プロテアーゼ類)での分解および免疫原性応答(例えば、抗体によるタンパク質中和およびマクロファージおよび樹状細胞による取り込み)である。多様な戦略が本発明の抗体の半減期を伸ばすために使用できる。例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体スキャフォールド、ポリシアル酸(ＰＳＡ)、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)、アルブミン結合リガンドおよび炭水化物シールドへの化学結合；血清タンパク質に結合するタンパク質、例えばアルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎおよび移行への遺伝子融合；血清タンパク質に結合する他の結合部分、例えばナノボディ、Ｆａｂｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、アビマー、アフィボディおよびアンチカリンへのカップリング(遺伝的または化学的)；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質およびＦｃへの遺伝子融合；またはナノ担体、徐放性製剤または医療デバイスへの取り込み。
インビボでの抗体の血清循環を延長するために、不活性ポリマー分子、例えば高分子量ＰＥＧを、ＰＥＧの抗体のＮ末端またはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションまたはリシン残基に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多機能的リンカーと共にまたは伴わず、抗体またはそのフラグメントに結合できる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントは、典型的にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１個以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントと結合する条件下で反応させる。ペグ化は反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施できる。ここで使用する、用語“ポリエチレングリコール”は、他のタンパク質の誘導体化に使用されているあらゆる形態のＰＥＧ、例えばモノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを包含することを意図する。ある態様において、ペグ化する抗体は非グリコシル化抗体である。生物学的活性の最小限の喪失となる直鎖または分枝鎖ポリマー誘導体化を有する。コンジュゲーション程度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマススペクトロメトリーにより厳しくモニターし、抗体へのＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを確実にする。未反応ＰＥＧを、分子ふるいまたはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離できる。ＰＥＧ誘導体化抗体を、当業者に周知の方法を使用して、例えば、ここに記載した免疫アッセイにより結合活性ならびにインビボ有効性について試験できる。タンパク質のペグ化方法は当分野で知られ、本発明の抗体に適用できる。例えば、Nishimura et al. のＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.のＥＰ０４０１３８４参照。
他の修飾ペグ化方法は、再構成化学的直交操作技術(ReCODE PEG)であり、これは、化学的に特定の側鎖を生合成タンパク質に、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成システムを介して取り込む。この方法は、３０を超える新アミノ酸の大腸菌、酵母および哺乳動物細胞における生合成タンパク質への取り込みを可能にする。ｔＲＮＡは非天然アミノ酸を、アンバーコドンが位置する任意の場所に取り込み、アンバーを停止コドンから化学的に特定のアミノ酸の取り込みのシグナルとなるものに変換する。
組み換えペグ化方法(ｒＰＥＧ)も血清半減期延長に使用できる。この方法は、３００〜６００アミノ酸の不定形タンパク質尾部に既存の医薬タンパク質を遺伝的融合させることを含む。このような不定形タンパク質鎖の見かけの分子量がその実際の分子量の約１５倍大きくなるため、タンパク質の血清半減期は、大きくのびる。化学コンジュゲーションおよび再精製を必要とする伝統的ペグ化と比較して、製造工程は極めて単純であり、産物は均質である。
ポリシアル化は他の方法であり、これは、治療ペプチドおよびタンパク質の活性寿命を延長し、安定性を改善するのに天然ポリマーポリシアル酸(ＰＳＡ)を使用する。ＰＳＡは、シアル酸(糖)のポリマーである。タンパク質および治療ペプチド薬物送達にしようしたとき、ポリシアル酸はコンジュゲーションに保護的微小環境を提供する。これが循環中の治療タンパク質の活性寿命を延ばし、免疫系により認識されるのを妨げる。ＰＳＡポリマーはヒト体内で天然に見られる。何百万年もの間、壁をこれで覆うように進化したある種の細菌により導入された。これらの天然にポリシアル化された細菌は、次いで、分子模写により、体内の防御系から逃れることに成功した。ＰＳＡは、天然の最終的な隠蔽方法であり、このような細菌により大量に、予定された物理的特徴で産生できる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内でのＰＳＡと化学的同一である限り、タンパク質とカップリングしたときでさえ完全に非免疫原性である。
他の方法は、抗体に結合したヒドロキシエチルデンプン(“ＨＥＳ”)誘導体である。ＨＥＳは、蝋状トウモロコシ澱粉由来の修飾天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝され得る。ＨＥＳ溶液を、通常血液量不足を補い、血液のレオロジー的特性を改善するために投与する。抗体のヘシル化(hesylation)は、分子の安定性の増加ならびに腎クリアランス減少により循環半減期の延長を可能にし、生物学的活性を高める。種々のパラメータ、例えばＨＥＳの分子量を変えることにより、広範なＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズできる。
インビボで長い半減期を有する抗体はまたＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合フラグメント(好ましくはＦｃまたはヒンジＦｃドメインフラグメント)への１個以上のアミノ酸修飾(すなわち、置換、挿入または欠失)の導入によっても産生できる。例えば、国際公開番号ＷＯ９８／２３２８９；国際公開番号ＷＯ９７／３４６３１；および米国特許番号６,２７７,３７５参照。
さらに、抗体または抗体フラグメントをインビボでより安定にし、またはインビボで半減期を長くするために、抗体をアルブミンとコンジュゲートできる。本技術は当分野で周知であり、例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＷＯ０１／７７１３７；および欧州特許番号ＥＰ４１３,６２２を参照のこと。
ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントはまた１個以上のヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)ポリペチドまたはその一部と融合させ得る。成熟形態で５８５アミノ酸のタンパク質であるＨＳＡは、血清浸透圧の相当な割合を担い、また内因性および外因性リガンドの担体として機能する。アルブミンの担体分子としての役割およびその不活性性質は、インビボでのポリペチドの担体および輸送体として使用するために望ましい特性である。種々のタンパク質の担体としてアルブミン融合タンパク質の成分としてアルブミンを使用することは、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＥＰ４１３６２２に示唆されている。ポリペチドへの融合のためのＨＳＡのＮ末端フラグメントの使用も提唱されている(ＥＰ３９９６６６)。従って、抗体またはそのフラグメントのアルブミンへの遺伝的または化学的融合またはコンジュゲートにより、インビトロおよび／またはインビボで溶液で安定化でき、貯蔵寿命を延ばしおよび／または分子の活性を長時間維持できる。
アルブミンの他のタンパク質への融合は、ＨＳＡまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡが該タンパク質をコードするＤＮＡと連結するような遺伝子操作により達成できる。次いで適切な宿主を融合ヌクレオチド配列で形質転換または形質移入し、融合ポリペチドが発現されるように適切なプラスミド上に配置させる。発現は、インビトロで、例えば、原核または真核細胞からまたはインビボで例えばトランスジェニック生物から行い得る。ＨＳＡ融合に関連するさらなる方法は、例えば、ＷＯ２００１０７７１３７およびＷＯ２００３０６００７に見ることができ、本明細書に引用により包含させる。具体的態様において、融合タンパク質の発現を哺乳動物細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞株で行う。低または高ｐＨでの抗体の受容体に対する変えられた示差的結合も本発明の範囲内で考慮される。例えば、抗体の親和性を、その受容体に低ｐＨ、例えば、リソソーム(lyzozome)内での低ｐＨで結合し続けるように、抗体をさらなるアミノ酸、例えばヒスチジン(histine)を抗体のＣＤＲに含むように修飾することにより、修飾してよい(例えば、Tomoyuki Igawa et al. (2010) Nature Biotechnology;28, 1203-1207参照)。
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を産生するために異種タンパク質またはポリペチド(またはそのフラグメント、好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸のポリペチド)と組み換え的融合または化学的結合(共有結合および非共有結合の両者を含む)したＨＥＲ３に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。特に、本発明は、ここに記載する抗体フラグメント(例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ(ａｂ)２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ ＣＤＲ)および異種タンパク質、ポリペチドまたはペプチドを含む融合タンパク質を提供する。タンパク質、ポリペチドまたはペプチドを抗体または抗体フラグメントと融合または結合する方法は当分野で知られている。例えば、米国特許５,３３６,６０３、５,６２２,９２９、５,３５９,０４６、５,３４９,０５３、５,４４７,８５１および５,１１２,９４６；欧州特許番号ＥＰ３０７,４３４およびＥＰ３６７,１６６；国際公開番号ＷＯ９６／０４３８８およびＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zheng et al., (1995) J. Immunol. 154:5590-5600; およびVil et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341参照)。
さらなる融合タンパク質を、遺伝子混合、モチーフ混合、エクソン混合および／またはコドン混合(ここでは纏めて“ＤＮＡ混合”と呼ぶ)の技術を介して産生し得る。ＤＮＡ混合は、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性改変に使用し得る(例えば、高親和性および低解離速度の抗体またはそのフラグメント)。一般的に、米国特許５,６０５,７９３、５,８１１,２３８、５,８３０,７２１、５,８３４,２５２および５,８３７,４５８；Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; およびLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308- 313参照(これら特許および刊行物の各々は、引用によりその全体を本明細書に包含させる)。抗体またはそのフラグメントまたはコードする抗体またはそのフラグメントは、組換え前にエラープローンＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法による無作為突然変異誘発に付すことにより変え得る。ＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを１個以上の異種分子の１個以上の成分、モチーフ、セクション、パーツ、ドメイン、フラグメントなどと組み換えし得る。
さらに、抗体またはそのフラグメントは、マーカー配列、例えば精製を容易にするためのペプチドと融合し得る。好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えばとりわけｐＱＥベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)で提供されるタグであり、その多くが市販されている。Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のとおり、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製のために提供される。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素(“ＨＡ”)タグ(Wilson et al., (1984) Cell 37:767)および“フラッグ”タグを含むが、これらに限定されない。
他の態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは診断剤または検出可能剤とオン樹ゲートできる。このような抗体は、臨床的試験法の一部として疾患または障害の発症、進展、進行および／または重症度のモニタリングまたは予後診断、例えば特定の治療の有効性の決定に有用であり得る。このような診断および検出は、例えば、オースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されない種々の酵素；例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンであるがこれらに限定されない接合団；例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンであるが、これらに限定されない蛍光物質；例えば、ルミノールであるが、これに限定されない発光物質；例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンであるが、これらに限定されない生物発光物質；例えば、ヨウ素(１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉおよび１２１Ｉ)、炭素(１４Ｃ)、硫黄(３５Ｓ)、トリチウム(３Ｈ)、インジウム(１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎおよび１１１Ｉｎ)、テクネチウム(９９Ｔｃ)、タリウム(２０１Ｔｉ)、ガリウム(６８Ｇａ、６７Ｇａ)、パラジウム(１０３Ｐｄ)、モリブデン(９９Ｍｏ)、キセノン(１３３Ｘｅ)、フッ素(１８Ｆ)、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎおよび１１７Ｔｉｎであるが、これらに限定されない放射性物質；および種々の陽電子放出断層撮影および非放射性常磁性金属イオンを使用する陽電子放出金属を含むが、これらに限定されない検出可能物質に抗体をカップリングさせることにより達成できる。
本発明は、さらに治療部分とコンジュゲートした抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。抗体またはそのフラグメントは治療部分、例えば細胞毒、例えば、細胞増殖抑制または細胞破壊的薬剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ−エミッターとコンジュゲートし得る。細胞毒または細胞毒性剤は細胞に有害な薬剤を含む。
さらに、抗体またはそのフラグメントを、ある生物学的応答を修飾する治療部分または薬物部分とコンジュゲートし得る。治療部分または薬物部分は古典的化学治療剤に限定されると解釈してはならない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペチドであり得る。このようなタンパク質は、例えば、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素；タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管形成剤；または生物学的応答修飾剤、例えば、例えば、リンホカインを含み得る。一つの態様において、ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントは治療部分、例えば細胞毒、薬物(例えば、免疫抑制剤)または放射性毒素とコンジュゲートする。このようなコンジュゲートはここでは“免疫コンジュゲート”と呼ぶ。１個以上の細胞毒を含む免疫コンジュゲートは“免疫毒素”と呼ぶ。細胞毒または細胞毒性剤は、細胞に有害(例えば、殺す)薬剤を含む。例はタクソン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ.コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンおよびそのアナログまたはホモログを含む。治療剤はまた、例えば、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン)、切除剤(例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(ＢＳＮＵ)およびロムスチン(ＣＣＮＵ)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金(II)(ＤＤＰ)シスプラチン、アントラサイクリン類(例えば、ダウノルビシン(旧ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(ＡＭＣ))および抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)を含む(例えば、Seattle Genetics ＵＳ２００９０３０４７２１参照)。
本発明の抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートできる治療細胞毒の他の例は、デュオカルマイシン類、カリチアマイシン類、マイタンシン類およびオーリスタチンおよびその誘導体を含む。カリチアマイシン抗体コンジュゲートの例は市販品である(MylotargTm;Wyeth-Ayerst)。
細胞毒を、当分野で利用可能なリンカー方法を使用して本発明の抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートできる。細胞毒を抗体とコンジュゲートするのに使用されているリンカータイプの例は、ヒドラゾン類、チオエーテル類、エステル類、ジスルフィド類およびペプチド含有リンカーを含むが、これらに限定されない。例えば、リソソーム区画内の低ｐＨに感受性であるようにまたはプロテアーゼ類、例えば腫瘍組織で優先的に発現されるプロテアーゼ類、例えばカテプシン類(例えば、カテプシン類Ｂ、Ｃ、Ｄ)での分解に感受性であるようにリンカーを選択できる。
細胞毒のタイプ、リンカーおよび治療剤を抗体とコンジュゲートするための方法についてのさらなる記載は、Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264もまた参照のこと。
本発明の抗体またはそのフラグメントはまた放射性同位体とコンジュゲートして、放射免疫コンジュゲートとも呼ぶ細胞毒性放射性医薬を産生し得る。診断的または治療的に使用するための抗体とコンジュゲートできる放射性同位体の例は、ヨウ素ｌ３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７を含むが、これらに限定されない。放射免疫コンジュゲートの製造方法は当分野で確立されている。放射免疫コンジュゲートの例は、ZevalinＴＭ(DEC Pharmaceuticals)およびBexxarＴＭ(Corixa Pharmaceuticals)を含む市販品であり、類似方法を、本発明の抗体を使用する放射免疫コンジュゲートの製造に使用でいる。ある態様において、大環状キレート剤は１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ,Ｎ’,Ｎ”,Ｎ”’−四酢酸(ＤＯＴＡ)であり、これはリンカー分子を介して抗体に結合できる。このようなリンカー分子は通常当分野で知られ、Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; およびZimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載され、各々その全体を引用により本明細書に包含させる。
治療部分を抗体にコンジュゲートさせる技術は周知であり、例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)およびThorpe et al., (1982) Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。
抗体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である固体支持体とも結合し得る。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロライドまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定されない。
抗体組み合わせ
他の面において、本発明は、他の治療剤、例えば他の抗体、小分子阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはＰＩ３キナーゼ阻害剤と使用する本発明のＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントに関する。例は、次のものを含むが、これらに限定されない：
ＨＥＲ１阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＨＥＲ１阻害剤と共に使用でき、これは、マツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ(Imclone)、ベクティビックス(登録商標)／パニツムマブ(Amgen)、mAb 806およびニモツズマブ(TheraCIM)、イレッサ(登録商標)／ゲフィチニブ(Astrazeneca)；CI-1033(PD183805)(Pfizer)、ラパチニブ(GW-572016)(GlaxoSmithKline)、タイケルブ(登録商標)／トシル酸ラパチニブ(SmithKlineBeecham)、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)(OSI Pharma)およびPKI-166(Novartis)およびＮ−[４−[(３−クロロ−４−フルオロフェニル)アミノ]−７−[[(３”Ｓ”)−テトラヒドロ−３−フラニル]オキシ]−６−キナゾリニル]−４(ジメチルアミノ)−２−ブテンアミド(商品名Tovok(登録商標)でBoehringer Ingelheimが販売)を含むが、これらに限定されない。
ＨＥＲ２阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＨＥＲ２阻害剤と共に使用でき、これは、ペルツズマブ(商品名Omnitarg(登録商標)でGenentechが販売)、トラスツマブ(商品名Herceptin(登録商標)でGenentech／Rocheが販売)、MM-111、ネラチニブ(別名HKI-272、(２Ｅ)−Ｎ−[４−[[３−クロロ−４−[(ピリジン−２−イル)メトキシ]フェニル]アミノ]−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル]−４−(ジメチルアミノ)ブト−２−エナミドおよびＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０２８４４３に記載)、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ(商品名タイケルブ(登録商標)でGlaxoSmithKlineが販売)を含むが、これらに限定されない。
ＨＥＲ３阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＨＥＲ３阻害剤と共に使用でき、これは、MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)およびＨＥＲ３を阻害する小分子を含むが、これらに限定されない。
ＨＥＲ４阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＨＥＲ４阻害剤と共に使用できる。
ＰＩ３Ｋ阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをＰＩ３キナーゼ阻害剤と共に使用でき、これは、４−[２−(１Ｈ−インダゾール−４−イル)−６−[[４−(メチルスルホニル)ピペラジン−１−イル]メチル]チエノ[３,２−ｄ]ピリミジン−４−イル]モルホリン(別名GDC 0941およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／０３６０８２およびＷＯ０９／０５５７３０に記載)、２−メチル−２−[４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロイミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル]プロピオニトリル(別名BEZ 235またはNVP-BEZ 235およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／１２２８０６に記載)、BMK120およびBYL719を含むが、これらに限定されない。
ｍＴＯＲ阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントをｍＴＯＲ阻害剤と共に使用でき、これは、テムシロリムス(商品名トーリセル(登録商標)でPfizerが販売)、リダフォロリムス(旧名称デフォロリムス、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−」[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、別名デフォロリムス、AP23573およびMK8669(Ariad Pharm.)およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０６４３８３に記載)、エベロリムス(RAD001)(商品名Afinitor(登録商標)でNovartisが販売)を含むが、これらに限定されない。１種以上の治療剤を、本発明のＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントの投与と同時に前にまたは後に投与し得る。
本発明の抗体の製造方法
(ｉ) 抗体をコードする核酸
本発明 上記ＨＥＲ３抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペチドをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、ＨＥＲ３抗体重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および／または軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的態様において、核酸分子は表１に同定したものである。ある別の本発明の核酸分子は、表１に同定したヌクレオチド配列と実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％)なヌクレオチド配列である。適当な発現ベクターから発現されたとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペチドはＨＥＲ３抗原結合能力を示すことができる。
また本発明で提供されるのは、上記抗体またはそのフラグメントの重鎖または軽鎖の少なくとも１個のＣＤＲ領域および通常全３個のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの他のポリヌクレオチドは、上記抗体またはそのフラグメントの重鎖および／または軽鎖の全てまたは実質的に全ての可変領域配列をコードする。コード縮重のため、多様な核酸配列が免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードする。
本発明の核酸分子は抗体の可変領域および定常領域のいずれもコードし得る。本発明の核酸配列のいくつかは、表１に示すＨＥＲ３抗体の成熟重鎖可変領域配列と実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％)な成熟重鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドである。いくつかの他の核酸配列は、表１または表２に示すＨＥＲ３抗体の成熟軽鎖可変領域配列と実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％)な成熟軽鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドである。
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成または抗体またはそのフラグメントをコードする既存配列のＰＣＲ突然変異誘発により製造できる。核酸の直接化学合成は当分野で知られる方法、例えばNarang et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル方法；Brown et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:109のホスホジエステル方法；Beaucage et al., (1981) Tetra. Lett., 22:1859のジエチルホスホロアミデート方法；および米国特許番号４,４５８,０６６の固体支持方法により達成できる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:967; およびEckert et al., (1991) PCR Methods and Applications 1:17に記載のとおり達成できる。
また本発明で提供されるのは、抗体またはそのフラグメントの製造のための発現ベクターおよび宿主細胞である。種々の発現ベクターを、ＨＥＲ３抗体鎖またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドの発現に使用できる。ウイルスベースおよび非ウイルス発現ベクターの両方とも、哺乳動物宿主細胞での抗体の産生に使用できる。非ウイルスベクターおよびシステムは、プラスミド、典型的にタンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを伴うエピソームベクターおよびヒト人工的染色体を含む(例えば、Harrington et al., (1997) Nat Genet 15:345参照)。例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)細胞でのＨＥＲ３ポリヌクレオチドおよびポリペチド発現に有用な非ウイルスベクターは、pThioHis A、BおよびC、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、BおよびC(Invitrogen, San Diego, CA)、ＭＰＳＶベクターおよび他のタンパク質を発現することが当分野で知られる多数の他のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０を使用したベクター、乳頭腫ウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ)に基づくベクターを含む。Brent et al., (1995) supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807; およびRosenfeld et al., (1992) Cell 68:143参照。
発現ベクターの選択は、ベクターを発現する意図する宿主細胞による。典型的に、発現ベクターは、抗体鎖またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに操作可能に結合したプロモータおよび他の調節配列(例えば、エンハンサ)を含む。ある態様において、誘導性プロモータを使用して、誘導条件下以外での挿入配列の発現を阻止する。誘導性プロモータは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモータまたはヒートショックプロモータを含む。形質転換生物培養を、発現産物が宿主細胞に十分に耐容性であるコーディング配列に対して集団を偏向させることなく、非誘導条件下で伸長できる。プロモータに加えて、他の調節要素が抗体鎖またはそのフラグメントの効率的発現のために必要であるかまたは望ましいことがある。これらの要素は、典型的にＡＴＧ開始コドンおよび隣接リボゾーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現効率は、使用する細胞系への適当なエンハンサの導入により高められ得る(例えば、Scharf et al., (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125; およびBittner et al., (1987) Meth. Enzymol., 153:516参照)。例えば、ＳＶ４０エンハンサまたはＣＭＶエンハンサを、哺乳動物宿主細胞における発現増加に使用し得る。
発現ベクターはまた挿入された抗体配列またはそのフラグメントによりコードされるポリペチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置を提供し得る。大抵、挿入された０抗体配列またはそのフラグメントは、ベクターへの挿入前にシグナル配列と結合する。ＨＥＲ３結合抗体軽および重鎖可変ドメインをコードする配列を受け入れるために使用するベクターは、しばしば定常領域またはその一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能にし、それにより、インタクト抗体またはそのフラグメントの産生に至る。典型的に、このような定常領域はヒトのである。
抗体鎖またはそのフラグメントの担持および発現用の宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な原核宿主の一つである。使用に適する他の微生物宿主は、桿菌、例えばバチルス・スブチリスおよび他の腸内細菌科、例えばサルモネラ、セラチアおよび種々のシュードモナス種を含む。これらの原核宿主において、典型的に宿主細胞に適合性の制御配列(例えば、複製開始点)を含む発現ベクターも製造できる。さらに、任意の数の多様な周知のプロモータ、例えばラクトースプロモータシステム、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモータシステム、ベータ−ラクタマーゼプロモータシステムまたはファージラムダのプロモータシステムが存在し得る。プロモータは、典型的に発現を、所望によりオペレータ配列と共に制御し、転写および翻訳の開始および完了のためのリボゾーム結合部位配列などを含む。他の微生物、例えば酵母も抗体またはそのフラグメントの発現に使用できる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用できる。
ある好ましい態様において、哺乳類宿主細胞を抗体またはそのフラグメントの発現および産生に使用する。例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株でも、外因性発現ベクターを担持する哺乳類細胞株でもよい。これらは、任意の正常致死または正常または異常不死動物またはヒト細胞を含む。例えば、インタクト免疫グロブリンを分泌できる多くの適切な宿主細胞株が開発されており、ＣＨＯ細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含む。ポリペチド発現のための哺乳動物組織細胞培養の使用は、一般的に、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987に記載されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製開始点、プロモータおよびエンハンサ(例えば、Queen et al., (1986) Immunol. Rev. 89:49-68参照)および必要な処理情報部位、例えばリボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネータ配列を含み得る。これらの発現ベクター通常は、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルス由来のプロモータを含む。適切なプロモータは構成的、細胞型特異的、段階特異的および／または調節可能または制御可能であり得る。有用なプロモータは、メタロチオネインプロモータ、構成的アデノウイルス主要後期プロモータ、デキサメサゾン−誘導性ＭＭＴＶプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、MRP polIIIプロモータ、構成的ＭＰＳＶプロモータ、テトラサイクリン−誘導性ＣＭＶプロモータ(例えばヒト最初期ＣＭＶプロモータ)、構成的ＣＭＶプロモータおよび当分野で知られるプロモータ−エンハンサ組み合わせを含むが、これら限定されない。
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターの挿入方法は細胞性宿主のタイプによる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞で通常利用され、一方リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが他の細胞性宿主で使用され得る(一般的にSambrook, et al., supra参照)。他の方法は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム仲介形質転換、注入および微量注入、弾道的方法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工的ウイルス粒子、ヘルペスウイルス構造的タンパク質ＶＰ２２への融合(Elliot and O'Hare, (1997) Cell 88:223)、ＤＮＡ取り込みの薬剤による亢進およびエクスビボ形質導入を含む。組み換えタンパク質の長期、高収率産生のために、安定な発現がしばしば望まれる。例えば、抗体鎖またはフラグメントを安定に発現する細胞株を、ウイルス複製開始点または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを使用して製造できる。ベクター導入後、細胞を１〜２日間富化培地で増殖させ、選択培地に移す。選択可能マーカーの目的は選択への耐性の付与であり、その存在により、選択培地中の導入配列の完全発現を成功させた細胞の増殖を可能にする。耐性の、安定形質移入細胞を、細胞型に適当な組織培養技術を使用して増殖できる。
(ii) 本発明のモノクローナル抗体の産生
モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)を、慣用のモノクローナル抗体方法論、例えば、Kohler and Milstein, (1975) Nature 256:495の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む多様な技術により製造できる。モノクローナル抗体製造のための多くの技術は、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換を使用し得る。
ハイブリドーマ製造のための動物系はマウス系である。マウスで産生されるハイブリドーマは確立された方法である。免疫化プロトコルおよび融合のための免疫化脾細胞の単離のための技術は当分野で知られている。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合法も知られている。
本発明のキメラまたはヒト化抗体を、上記のとおり製造したマウスモノクローナル抗体の配列に基づき製造できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを目的のマウスハイブリドーマから得て、標準的分子生物学技術を使用して非マウス(例えばヒト)免疫グロブリン配列を含むように改変できる。例えば、キメラ抗体を製造するために、マウス可変領域を、当分野で知られた方法を使用してヒト定常領域と結合できる(例えば、Cabilly et al.の米国特許番号４,８１６,５６７参照)。ヒト化抗体を賛成するために、マウスＣＤＲ領域を、当分野で知られた方法を使用してヒトフレームワークに挿入できる。例えば、Winterの米国特許番号５２２５５３９およびQueen et alの米国特許５５３０１０１；５５８５０８９；５６９３７６２および６１８０３７０参照。
ある態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＨＥＲ３に対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックまたは染色体転移マウスを使用して産生できる。これらのトランスジェニックおよび染色体転移マウスは、ここではそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼び、ここでは纏めて“ヒトＩｇマウス”と呼ぶ。
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、非再配列ヒト重(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子微小遺伝子座を、不活性化内因性μおよびκ鎖座である標的変異と共に含む(例えば、Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474):856-859参照)。従って、マウスはマウスＩｇＭまたはκの発現が低く、免疫化に応答して、導入したヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラス転換および体細胞変異に付され、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを産生する(Lonberg et al., (1994) supra; reviewed in Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol.13:65-93およびHarding and Lonberg, (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546参照)。ＨｕＭＡｂマウスの産生および使用およびこのようなマウスで行うゲノム修飾は、さらにTaylor et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et al., (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al., (1994) International Immunology 579-591; およびFishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記載され、その内容全体を引用によりその全体を特に本明細書に包含させる。さらに、米国特許５,５４５,８０６；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,８７７,３９７；５,６６１,０１６；５,８１４,３１８；５,８７４,２９９；および５,７７０,４２９；全てLonbergおよびKay；Surani et al.の米国特許番号５,５４５,８０７；全てLonbergおよびKayのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２；およびKorman et alのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４も参照のこと。
他の態様において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスを使用して惹起できる。このようなマウスは“ＫＭマウス”と呼び、Ishida et alのＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳述されている。
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が当分野で利用可能であり、本発明のＨＥＲ３抗体の惹起に使用できる。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と呼ぶ代替トランスジェニック系を使用できる。このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et alの米国特許５,９３９,５９８；６,０７５,１８１；６,１１４,５９８；６、１５０,５８４および６,１６２,９６３に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替染色体転移動物系が当分野で利用可能であり、本発明のＨＥＲ３抗体の惹起に使用できる。例えば、“ＴＣマウス”と呼ぶヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両者を担持するマウスを使用でき、このようなマウスはTomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが文献に記載されており(Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、本発明のＨＥＲ３抗体の惹起に使用できる。
ヒト本発明のモノクローナル抗体はまたヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用しても製造できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ方法は当分野で確立され、下記実施例に記載する。例えば：Ladner et al.の米国特許５,２２３,４０９；５,４０３,４８４；および５,５７１,６９８；Dower et al.の米国特許５,４２７,９０８および５,５８０,７１７；McCafferty et al.の米国特許５,９６９,１０８および６,１７２,１９７；およびGriffiths et al.の米国特許５,８８５,７９３；６,５２１,４０４；６,５４４,７３１；６,５５５,３１３；６,５８２,９１５および６,５９３,０８１参照。
ヒト本発明のモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫細胞が、ヒト抗体応答が免疫化により産生されるように再構成されているＳＣＩＤマウスを使用しても製造できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許５,４７６,９９６および５,６９８,７６７に記載されている。
(iii) フレームワークまたはＦｃ操作
改変された本発明の抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾されているものを含む。典型的にこのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減らすために行う。例えば、一つの手法は、１個以上のフレームワーク残基の対応する生殖系列配列への“復帰突然変異”である。より具体的に、体細胞変異に付された抗体は、抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列と抗体が由来する生殖系列配列の比較により同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列配置に戻すために、体細胞変異を、例えば、部位特異的突然変異誘発により生殖系列配列に“復帰突然変異”させる。このような“復帰突然変異”抗体もまた本発明に包含されることを意図する。
他のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的免疫原性を減らすために、フレームワーク領域または１個以上のＣＤＲ領域内でさえ１個以上の残基を突然変異させることを含む。この技法は“脱免疫原性化”と呼ばれ、Carr et al.の米国特許公開２００３０１５３０４３にさらに詳述される。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で成される修飾に加えてまたはそれとは別に、本発明の抗体は、典型的に抗体の１個以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞毒性を変えるために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように改変し得る。さらに、本発明の抗体は、同様に抗体の１個以上の機能的特性を変えるために化学的修飾(例えば、１個以上の化学部分を抗体に結合できる)できまたはそのグリコシル化を変えるように修飾し得る。これらの態様の各々を下に詳述する。Ｆｃ領域の残基の番号付けは、KabatのＥＵ指数である。
一つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域を、ヒンジ領域におけるシステイン残基数が変わるように、例えば、増えるまたは得るように修飾する。この技法はさらにBodmer et al.の米国特許番号５,６７７,４２５に記載される。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基数を、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進するまたは抗体の安定性を上昇または減少させるために変える。
他の態様において、抗体のＦｃヒンジ領域を、抗体の生物学的半減期を減らすように変異する。より具体的に、１個以上のアミノ酸変異を、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインｐＡ結合に対してブドウ球菌性プロテインＡ(ＳｐＡ)結合が障害されるように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この技法はさらにWard et al.の米国特許番号６,１６５,７４５に詳述される。
さらに別の態様において、Ｆｃ領域を、抗体のエフェクター機能を変えるために少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより変える。例えば、１個以上のアミノ酸を、抗体のエフェクターリガンドに対する親和性が変わるが、親抗体の抗原結合能力を維持するように異なるアミノ酸残基で置換する。親和性が変えられるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。この技法は、Winter et al.の米国特許５,６２４,８２１および５,６４８,２６０にさらに詳述される。
他の態様において、アミノ酸残基から選択された１個以上のアミノ酸を、抗体のＣ１ｑ結合が変えられおよび／または補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)が減らされるかまたはなくなるように異なるアミノ酸残基で置換する。この技法は、Idusogie et al.の米国特許６,１９４,５５１にさらに詳述される。
他の態様において、１個以上のアミノ酸残基を変え、それにより、抗体が補体を固定する能力を変える。この技法はBodmer et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに詳述される。
さらに他の態様において、Ｆｃ領域を、１個以上のアミノ酸修飾により、抗体が抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を仲介する能力を高めるおよび／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性を高めるように修飾する。この技法はPrestaのＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２にさらに詳述される。さらに、ヒトＩｇＧ１のＦｃγＲｌ、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎに対する結合部位は位置づけられており、結合が改善された変異体が記載されている(Shields et al., (2001) J. Biol. Chen. 276:6591-6604参照)。
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化抗体(すなわち、グリコシル化を欠く抗体)を製造できる。グリコシル化は、例えば、抗体の“抗原”への親和性を高めるために変え得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１箇所以上のグリコシル化部位を変えることにより達成できる。例えば、１個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除き、それによりその部位でのグリコシル化を無くすような１個以上のアミノ酸置換を行う。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高める。このような手法は、Co et al.の米国特許５,７１４,３５０および６,３５０,８６１にさらに詳述される。
これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、グリコシル化のタイプが変わるように修飾でき、例えばフコシル残基の量が少ない低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が多い抗体である。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が変更された宿主細胞での抗体の発現により達成できる。グリコシル化機構が変えられた細胞は文献に記載され、組み換え本発明の抗体を発現し、それによりグリコシル化が変えられた抗体を産生する宿主細胞として使用できる。例えば、Hang et al.のＥＰ１,１７６,１９５は、細胞株で発現された抗体が低フコシル化であるような、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載する。PrestaのＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ(２９７)結合炭水化物に結合させる能力が減少し、また宿主細胞で発現された抗体が低フコシル化である変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞を記載する(またShields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740参照)。Umana et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、改変細胞株で発現された抗体で二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加されるように糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ類(例えば、ベータ(１,４)−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))が改変された細胞株を記載し、これは抗体のＡＤＣＣ活性を高める(またUmana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180参照)。
他の態様において、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。種々の手法が可能である。例えば、Wardの米国特許番号６,２７７,３７５に記載のとおり次の変異の１個以上を導入できる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を延長するために、Presta et al.の米国特許５,８６９,０４６および６,１２１,０２２に記載のとおり、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で修飾して、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２ループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように変更できる。
(iv) 改変抗体の製造方法
ここに示すＶＨおよびＶＬ配列または完全長重および軽鎖配列を有する本発明のＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントを使用して、完全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨ および／またはＶＬ配列またはそれに結合する定常領域の修飾により新規ＨＥＲ３抗体を創製できる。それにより、本発明の他の面において、ＨＥＲ３抗体またはそのフラグメントの構造的特性を使用して、ヒトＨＥＲ３の結合およびまたＨＥＲ３の１個以上の機能的特性の阻害のような本発明の抗体の少なくとも１個の機能的特性を保持する構造的に関連するＨＥＲ３抗体を創製する。例えば、本発明の抗体の１個以上のＣＤＲ領域またはその変異体を既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合え的に組み合わせて、さらなる組み換え操作された、上記のＨＥＲ３抗体を創製できる。他のタイプの修飾は先のセクションに記載したものを含む。製造方法のための出発物質は、ここに提供するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上または１個以上のそのＣＤＲ領域である。改変抗体を製造するために、実際ここに提供するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上または１個以上のそのＣＤＲ領域を有する抗体の製造(すなわち、タンパク質としての発現)が必要である。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用して、元の配列由来の“第二世代”配列を製造し、次いで“第二世代”配列を製造し、タンパク質として発現させる。
したがって、他の態様において、本発明は、配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、２８２、３０２、３２２、３４２、３６２、３８２、４０２、４２２、４４２、４６２、４８２、５０２および５２２から成る群から選択されるＣＤＲ１配列；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、２０３、２２３、２４３、２６３、２８３、３０３、３２３、３４３、３６３、３８３、４０３、４２３、４４３、４６３、４８３、５０３および５２３から成る群から選択されるＣＤＲ２配列；およびから選択されるＣＤＲ２配列；および／または配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、２８４、３０４、３２４、３４４、３６４、３８４、４０４、４２４、４４４、４６４、４８４、５０４および５２４から成る群から選択されるＣＤＲ３配列；および配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、２８８、３０８、３２８、３４８、３６８、３８８、４０８、４２８、４４８、４６８、４８８、５０８および５２８から成る群から選択されるＣＤＲ１配列；配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９、１６９、１８９、２０９、２２９、２４９、２６９、２８９、３０９、３２９、３４９、３６９、３８９、４０９、４２９、４４９、４６９、４８９、５０９および５２９から成る群から選択されるＣＤＲ２配列；および／または配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、３５０、３７０、３９０、４１０、４３０、４５０、４７０、４９０、５１０および５３０から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列から成る抗体の製造方法であって、重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を少なくとも１個の変更された抗体配列を作るように変更し、変更された抗体配列をタンパク質として発現させることを含む、方法を提供する。変更された抗体配列はまたＵＳ２００５０２５５５５２に記載のとおり固定されたＣＤＲ３配列または最小必須結合決定基およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列の多様性を有する抗体ライブラリーのスクリーニングにより製造できる。スクリーニングは、抗体を抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適当なスクリーニング方法、例えばファージディスプレイ方法により実施できる。
標準的分子生物学技術を使用して、変更された抗体配列を製造および発現できる。変更された抗体配列によりコードされる抗体は、ここに記載する抗体またはフラグメントの機能的特性の１個、いくつかまたは全てを維持し、該機能的特性は、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３への特異的結合を含み；該抗体はＨＥＲ３と結合し、ホスホ−ＨＥＲアッセイにおいてＨＥＲシグナル伝達活性阻害によりＨＥＲ３生物学的活性を阻害する。
変更された抗体の機能的特性は、当分野で利用可能なおよび／またはここに記載する、例えば実施例に示す標準的アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡ)を使用して評価できる。
本発明の抗体の製造方法のある種の態様において、変異を無作為にまたは選択的に抗体またはそのフラグメントのコーディング配列の全てまたは一部に導入でき、得られた修飾ＨＥＲ３抗体を、ここに記載するとおり結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングできる。変異的方法は文献に記載されている。例えば、ShortのＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはこれらの組み合わせを使用する抗体変異の創製およびスクリーニング方法を記載する。あるいは、Lazar et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９は、抗体の生理化学特性を最適化するためのコンピュータ利用スクリーニング方法を記載する。
本発明の抗体の特徴づけ
本発明の抗体は、種々の機能的アッセイにより特徴づけできる。例えば、ここに記載するホスホ−ＨＥＲアッセイにおけるＨＥＲシグナル伝達阻害により生物学的活性を阻害する能力、ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３)への親和性、エピトープビンニング、タンパク質分解に対する抵抗性およびＨＥＲ３下流シグナル伝達を遮断する能力により特徴づけできる。種々の方法を使用して、ＨＥＲ３仲介シグナル伝達を測定できる。例えば、ＨＥＲシグナル伝達経路は(ｉ)ホスホ−ＨＥＲ３測定；(ii)ＨＥＲ３または他の下流シグナル伝達タンパク質(例えばＡｋｔ)のリン酸化測定、(iii)ここに記載するリガンド遮断アッセイ、(iv)ヘテロ二量体形成、(ｖ)ＨＥＲ３依存性遺伝子発現特徴、(vi)受容体内部移行および(vii)ＨＥＲ３駆動細胞表現型(例えば増殖)によりモニタできる。
抗体がＨＥＲ３に結合する能力は、目的の抗体をラベリングすることにより直接的にまたは該抗体はラベリングされてなくてよく、結合を間接的に当分野で知られる種々のサンドイッチアッセイ形式で検出できる。
ある態様において、ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３への参照ＨＥＲ３抗体の結合を遮断または競合する。これらはまた完全ヒト上記ＨＥＲ３抗体であり得る。これらはまた参照抗体と同じエピトープに結合する他のマウス、キメラまたはヒト化ＨＥＲ３抗体であり得る。参照抗体結合を遮断または競合する能力は、試験下のＨＥＲ３抗体が参照抗体で規定されるのと同じまたは類似のエピトープまたは参照ＨＥＲ３抗体が結合するエピトープと十分に近位のエピトープに結合することを示す。このような抗体は、特に参照抗体で同定された有益な特性を共有する可能性が高い。参照抗体を遮断または競合する能力は、例えば、競合結合アッセイにより決定できる。競合結合アッセイで、試験下の抗体を、共通抗原、例えばＨＥＲ３ポリペチドまたはタンパク質への参照抗体の特異的結合を阻害する能力について試験する。試験抗体は、過剰の試験抗体が実質的に参照抗体の結合を阻害するならば、抗原への特異的結合に対して参照抗体と競合する。実質的阻害は、試験抗体が参照抗体の特異的結合を通常少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または９０％減らすことを意味する。
ＨＥＲ３への結合についてＨＥＲ３抗体と参照ＨＥＲ３抗体の競合を評価するために使用できる多くの既知の競合結合アッセイがある。これらは、例えば、固相直接または間接放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、固相直接または間接酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619参照)；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイHarlow & Lane, supra参照)；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., (1990) Virology 176:546-552)；および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82)を含む。典型的に、このようなアッセイは、これらの非標識試験ＨＥＲ３結合抗体および標識参照抗体のいずれかを担持する固体表面または細胞への精製抗原の結合の使用を含む。競合的阻害は、試験抗体存在下での固体表面または細胞に結合した標識の量の決定により測定する。通常試験抗体は過剰に存在する。競合アッセイ(競争抗体)で同定した抗体は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体および立体障害が起きるのに参照抗体が結合したエピトープと十分に近位の隣接エピトープに結合する抗体を含む。
選択したＨＥＲ３モノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するか否かを決定するために、各抗体を、市販の試薬(例えば、Pierce, Rockford, ILの試薬)を使用してビオチニル化し得る。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合試験を、ＨＥＲ３ポリペチド被覆ＥＬＩＳＡプレートを使用して行い得る。ビオチニル化ＭＡｂ結合をストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出できる。精製ＨＥＲ３抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを１μg／mlの抗ヒトＩｇＧで、一夜、４℃で被覆し得る。１％ＢＳＡで遮断後、プレートを１μg／ml以下のモノクローナルＨＥＲ３結合抗体または精製アイソタイプコントロールと、環境温度で１〜２時間反応させる。次いでウェルをヒトＩｇＧｌまたはヒトＩｇＭ−特異的アルカリホスファターゼ−コンジュゲートプローブと反応させる。次いでプレートを発色させ、精製抗体のアイソタイプが決定できるように分析する。
モノクローナルＨＥＲ３抗体のＨＥＲ３ポリペチドを発現する生存細胞への結合を証明するために、フローサイトメトリーを使用できる。要約すると、ＨＥＲ３発現細胞株(標準的増殖条件下で増殖)を種々の濃度のＨＥＲ３結合抗体と、０.１％ＢＳＡおよび１０％ウシ胎児血清含有ＰＢＳ中で混合し、４℃で１時間インキュベートし得る。洗浄後、細胞をフルオレセイン−標識抗ヒトＩｇＧ抗体と、一次抗体染色と同じ条件下で反応させる。サンプルを、一細胞上で開閉される光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ装置により分析できる。蛍光顕微鏡を使用する別のアッセイをフローサイトメトリーアッセイに加えてまたは変わりに使用できる。細胞をまさに長期のように染色し、蛍光顕微鏡で試験できる。この方法は個々の細胞の可視化を可能にするが、抗原密度により感受性が低下し得る。
本発明の抗体またはそのフラグメントを、ウェスタンブロッティングによりＨＥＲ３ポリペチドまたは抗原性フラグメントとの反応性についてさらに試験し得る。要約すると、精製ＨＥＲ３ポリペチドまたは融合タンパク質またはＨＥＲ３発現細胞から抽出した細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎児血清で遮断し、試験するモノクローナル抗体でプローブする。ヒトＩｇＧ結合を、ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)で発色できる。
多くの読み出し情報を、リガンド誘発ヘテロ二量体形成の細胞ベースのアッセイにおけるＨＥＲ３抗体の有効性および特異性の評価に使用できる。活性を次の１個以上により評価できる：
(ｉ) 標的細胞株、例えばMCF-7乳癌細胞中の他のＥＧＦファミリーメンバーでのＨＥＲ２のリガンド誘発ヘテロ二量体化の阻害。細胞ライセートからのＨＥＲ２複合体の免疫沈殿を、他のＥＧＦ受容体の非存在下／存在下で受容体−特異的抗体と共に実施でき、複合体内のそれらの生物学的に関連するリガンドを他のＥＧＦ受容体に対する抗体のプロービングによる電気泳動／ウェスタン伝達後に分析できる。
(ii) リガンド活性化ヘテロ二量体によるシグナル伝達経路活性化の阻害。ＨＥＲ３との結合は、受容体のＥＧＦファミリーの他のメンバーがリガンド結合後に最大細胞性応答を誘発するためのキーであるように見える。キナーゼ欠損ＨＥＲ３の場合、ＨＥＲ２は、後の増殖因子リガンドの結合が起こるようにシグナル伝達を可能にするために機能的チロシンキナーゼドメインを提供する。それゆえに、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を共発現する細胞をリガンド、例えばヘレグリンで、阻害剤非存在下および存在下に処理し、ＨＥＲ３チロシンリン酸化に対する影響を処置細胞ライセートからのＨＥＲ３の免疫沈殿および続く抗ホスホチロシン抗体を使用するウェスタンブロッティングを含む多くの方法によりモニターできる(詳細はAgus op. cit. 参照)。あるいは、Waddleton et al., (2002) Anal. Biochem. 309:150-157に記載のとおり、ハイスループットアッセイを、ＨＥＲ３を可溶化ライセートを抗ＨＥＲ３受容体抗体で被覆した９６ウェルプレートのウェルに捕捉し、チロシンリン酸化を、例えば、ユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体を使用して測定することにより開発できる。
この手法の拡大版として、活性化受容体ヘテロ二量体の下流を活性化することが知られるエフェクター分子、例えばマイトージェン−活性タンパク質キナーゼ群 (ＭＡＰＫ)およびＡｋｔを直接、処置ライセートから免疫沈殿し、これらのタンパク質の活性化形態を検出する抗体とブロッティングするかまたはこれらのタンパク質が特異的基質を修飾／活性化する能力を分析することにより分析してよい。
(iii) リガンド誘発細胞性増殖の阻害。多様な細胞株、例えば多くの乳房および前立腺癌細胞株は、ＥｒｂＢ受容体の組み合わせを共発現することが知られている。アッセイを２４／４８／９６ウェル形式で、ＤＮＡ合成(トリチウム標識チミジン取り込み)、細胞数増加(クリスタルバイオレット染色)などに基づく読み出し情報で実施できる。
多くの読み出し情報を使用して、リガンド非依存性ホモおよびヘテロ二量体形成の細胞ベースのアッセイにおけるＨＥＲ３抗体の有効性および特異性を評価できる。例えば、ＨＥＲ２過発現は、自発性二量体形成の結果としてキナーゼドメインのリガンド非依存性活性化を誘発する。過発現したＨＥＲ２は、他のＨＥＲ分子、例えばＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４とホモまたはヘテロ二量体を形成する。
抗体またはそのフラグメントが、腫瘍原性表現型がＨＥＲ３ヘテロ二量体細胞シグナル伝達のリガンド活性化に少なくとも一部依存性であることが知られるヒト腫瘍細胞株、例えばBxPC3膵癌細胞などの腫瘍異種移植片のインビボ増殖を阻止する能力。これは、免疫不全マウスを単独でまたは当該細胞株に適当な細胞毒性剤と組み合わせて用いて評価できる。機能的アッセイの例は下記実施例セクションにも記載する。
予防および治療使用
本発明は、有効量の本発明の抗体またはそのフラグメントを処置を必要とする対象に投与することによる、ＨＥＲ３シグナル伝達経路と関連する疾患または障害の処置方法を提供する。具体的態様において、本発明は、有効量の本発明の抗体を処置を必要とする対象に投与することによる、癌(例えば、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、胃癌、膵癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症)の処置方法を提供する。ある態様において、本発明は、有効量の本発明の抗体またはそのフラグメントを処置を必要とする対象に投与することによる、ＨＥＲ３シグナル伝達経路と関連する癌の処置または予防方法を提供する。
具体的態様において、本発明は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、胃癌、膵癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍シュワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症を含むが、これらに限定されないＨＥＲ３シグナル伝達経路と関連する癌の処置方法を提供する。
本発明の抗体またはそのフラグメントは呼吸器疾患、骨粗鬆症、骨関節症、多嚢胞性腎臓疾患、糖尿病、統合失調症、血管疾患、心臓疾患、非発癌性増殖性疾患、線維症および神経変性疾患、例えばアルツハイマー病を含むが、これらに限定されない他の異常または欠損ＨＥＲ３シグナル伝達と関連する障害の処置または予防にも使用できる。
ＨＥＲ３抗体との組み合わせ処置に適切な薬剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を調節できることが知られる標準治療剤を含む。ＨＥＲ２の標準治療剤の適切な例は、Herceptinおよびタイケルブを含むが、これらに限定されない。ＥＧＦＲの標準治療剤の適切な例は、上記イレッサ、タルセバ、アービタックスおよびベクティビックスを含むが、これらに限定されない。ＨＥＲ３抗体との組み合わせ処置に適切な他の薬剤は、受容体チロシンキナーゼ群、Ｇ−タンパク質共役受容体、増殖／生存シグナル伝達経路、核ホルモン受容体、アポトーシス経路、細胞周期および血管形成を調節するものを含み得るが、これらに限定されない。
診断的使用
一つの面において、本発明は、生物学的サンプル(例えば、血液、血清、細胞、組織)または癌を有するまたは癌を発症するリスクのある個体の状況においてＨＥＲ３タンパク質および／または核酸発現ならびにＨＥＲ３機能を決定する診断的アッセイを包含する。
診断的アッセイ、例えば競合的アッセイは、共通結合パートナーの限られた数の結合部位について標識アナログ(“トレーサー”)が試験サンプル検体と競合する能力に基づく。結合パートナーは、一般的に競合の前または後に不溶化され、次いで、結合パートナーに結合したトレーサーおよび検体を非結合トレーサーおよび検体と分離する。この分離は傾捨(結合パートナーが予め不溶化されているとき)または遠心分離(結合パートナーが競合的反応後沈殿するとき)により達成される。試験サンプル検体の量は、マーカー物質の量により測定した結合トレーサー量と反比例する。試験サンプルに存在する検体の量を定量的に決定するために、既知の量の検体での用量−応答曲線を調製し、試験結果と比較する。これらのアッセイは、酵素を検出可能マーカーとして使用するときＥＬＩＳＡシステムと呼ばれる。この形態のアッセイにおいて、抗体とＨＥＲ３抗体の競合的結合が、血清サンプル中の抗体、最も具体的に、血清サンプル中の阻害抗体の指標である、結合ＨＥＲ３、好ましくは本発明のＨＥＲ３エピトープをもたらす。
本アッセイの顕著な利点は、測定が抗体を直接阻害することである(すなわち、ＨＥＲ３、具体的に、エピトープの結合を妨害するもの)。このようなアッセイ、特にＥＬＩＳＡ試験の形態は臨床環境および日常的血液スクリーニングで広く適用されている。
本発明の他の面は、個体におけるＨＥＲ３核酸発現またはＨＥＲ３活性を決定し、それにより該個体に適当な治療または予防剤を選択する方法を提供する(ここでは“薬理ゲノミクス”と呼ぶ)。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型(例えば、個体が特定の薬剤に応答する能力を決定するために試験した個体の遺伝子型)に基づく個体の治療または予防処置のための薬剤(例えば、薬物)の選択を可能にする。
本発明のさらに別の面は、治験におけるＨＥＲ３の発現または活性に対する薬剤(例えば、薬物)の影響のモニタリングに関する。
医薬組成物
抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物を製造するために、抗体またはそのフラグメントを薬学的に許容される担体または添加物と混合する。組成物は、癌(乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、胃癌、膵癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍シュワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症)の処置または予防に適切な１種以上の他の治療剤をさらに含み得る。
治療および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローションまたは懸濁液の形で、生理学的に許容される担体、添加物または安定化剤との混合により製造できる(例えば、Hardman et al., (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.参照)。
治療のための投与レジメンの選択は、該物体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、物体の免疫原性および生物学的マトリクスにおける標的細胞の接近性を含む、数種の因子による。ある態様において、投与レジメンは、許容されるレベルの副作用に一致して、患者に送達される治療の量を最大化する。従って、送達される生物剤の量は、一部、特定の物質および処置する状態の重症度による。適当な投与量の抗体、サイトカインおよび小分子の選択のための指標は利用可能である(例えば、Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Baert et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al., (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al., (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al., (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al., (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602参照)。
適当な投与量の決定は、例えば、当分野で処置に影響することが知られたまたは処置に影響することが予測されるパラメータまたは因子を使用して、臨床医が行う。一般的に、最適投与量より幾分少ない量で投与を開始し、その後、何らかの負の副作用に対して所望のまたは最適効果が得られるまで少しずつ増加させる。重要な診断的指標は、例えば、炎症の症状、または産生される炎症性サイトカインレベルである。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与方法で所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために、変わり得る。選択した投与量は、用いる特定の本発明の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、他の薬物、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的状態および薬歴などの医学分野で知られた因子を含む、多様な薬物動態因子による。
本発明の抗体またはそのフラグメントを含む組成物は、連続的注入でまたは、例えば、１日、１週間または週１〜７回の間隔での投与により提供され得る。静脈内、皮下、局所的、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内または吸入により投与され得る。特異的投与プロトコルは、顕著な望ましくない副作用を避ける最大投与量または投与頻度を含む。総週投与量は少なくとも０.０５μg／kg体重、少なくとも０.２μg／kg、少なくとも０.５μg／kg、少なくとも１μg／kg、少なくとも１０μg／kg、少なくとも１００μg／kg、少なくとも０.２mg／kg、少なくとも１.０mg／kg、少なくとも２.０mg／kg、少なくとも１０mg／kg、少なくとも２５mg／kgまたは少なくとも５０mg／kgである(例えば、Yang et al., (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al., (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu et al., (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144参照)。抗体またはそのフラグメントの所望の投与量は、モル濃度／kg体重ベースの抗体またはポリペチドとほぼ同じである。抗体またはそのフラグメントの所望の血漿濃度は、モル濃度／kg体重でおおよそである。投与量は少なくとも１５μg、少なくとも２０μg、少なくとも２５μg、少なくとも３０μg、少なくとも３５μg、少なくとも４０μg、少なくとも４５μg、少なくとも５０μg、少なくとも５５μg、少なくとも６０μg、少なくとも６５μg、少なくとも７０μg、少なくとも７５μg、少なくとも８０μg、少なくとも８５μg、少なくとも９０μg、少なくとも９５μgまたは少なくとも１００μgであり得る。対象への投与は少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回または１２回またはそれ以上の回数であり得る。
本発明の抗体またはそのフラグメントについて、患者に投与される投与量は、０.０００１mg／kg〜１００mg／kg患者体重であり得る。投与量は０.０００１mg／kgおよび２０mg／kg、０.０００１mg／kgおよび１０mg／kg、０.０００１mg／kgおよび５mg／kg、０.０００１および２mg／kg、０.０００１および１mg／kg、０.０００１mg／kgおよび０.７５mg／kg、０.０００１mg／kgおよび０.５mg／kg、０.０００１mg／kg〜０.２５mg／kg、０.０００１〜０.１５mg／kg、０.０００１〜０.１０mg／kg、０.００１〜０.５mg／kg、０.０１〜０.２５mg／kgまたは０.０１〜０.１０mg／kg患者体重であり得る。
発明の抗体またはそのフラグメントの投与量は、患者の体重キログラム(kg)をmg／kgで投与すべき投与量に掛けて計算する。本発明の抗体またはそのフラグメントの投与量は患者体重で１５０μg／kg以下、１２５μg／kg以下、１００μg／kg以下、９５μg／kg以下、９０μg／kg以下、８５μg／kg以下、８０μg／kg以下、７５μg／kg以下、７０μg／kg以下、６５μg／kg以下、６０μg／kg以下、５５μg／kg以下、５０μg／kg以下、４５μg／kg以下、４０μg／kg以下、３５μg／kg以下、３０μg／kg以下、２５μg／kg以下、２０μg／kg以下、１５μg／kg以下、１０μg／kg以下、５μg／kg以下、２.５μg／kg以下、２μg／kg以下、１.５μg／kg以下、１μg／kg以下、０.５μg／kg以下または０.５μg／kg以下であり得る。
本発明の抗体またはそのフラグメントの単位投与量は０.１mg〜２０mg、０.１mg〜１５mg、０.１mg〜１２mg、０.１mg〜１０mg、０.１mg〜８mg、０.１mg〜７mg、０.１mg〜５mg、０.１〜２.５mg、０.２５mg〜２０mg、０.２５〜１５mg、０.２５〜１２mg、０.２５〜１０mg、０.２５〜８mg、０.２５mg〜７mg、０.２５mg〜５mg、０.５mg〜２.５mg、１mg〜２０mg、１mg〜１５mg、１mg〜１２mg、１mg〜１０mg、１mg〜８mg、１mg〜７mg、１mg〜５mgまたは１mg〜２.５mgであり得る。
本発明の抗体またはそのフラグメントの投与量は、対象において少なくとも０.１μg／ml、少なくとも０.５μg／ml、少なくとも１μg／ml、少なくとも２μg／ml、少なくとも５μg／ml、少なくとも６μg／ml、少なくとも１０μg／ml、少なくとも１５μg／ml、少なくとも２０μg／ml、少なくとも２５μg／ml、少なくとも５０μg／ml、少なくとも１００μg／ml、少なくとも１２５μg／ml、少なくとも１５０μg／ml、少なくとも１７５μg／ml、少なくとも２００μg／ml、少なくとも２２５μg／ml、少なくとも２５０μg／ml、少なくとも２７５μg／ml、少なくとも３００μg／ml、少なくとも３２５μg／ml、少なくとも３５０μg／ml、少なくとも３７５μg／mlまたは少なくとも４００μg／mlの血清力価を達成し得る。あるいは、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与量は、対象において少なくとも０.１μg／ml、少なくとも０.５μg／ml、少なくとも１μg／ml、少なくとも、２μg／ml、少なくとも５μg／ml、少なくとも６μg／ml、少なくとも１０μg／ml、少なくとも１５μg／ml、少なくとも２０.ｍｕ.ｇ／ml、少なくとも２５μg／ml、少なくとも５０μg／ml、少なくとも１００μg／ml、少なくとも１２５μg／ml、少なくとも１５０μg／ml、少なくとも１７５μg／ml、少なくとも２００μg／ml、少なくとも２２５μg／ml、少なくとも２５０μg／ml、少なくとも２７５μg／ml、少なくとも３００μg／ml、少なくとも３２５μg／ml、少なくとも３５０μg／ml、少なくとも３７５μg／mlまたは少なくとも４００μg／mlの血清力価を達成し得る。
本発明の抗体またはそのフラグメントの投与を繰り返してよく、投与を少なくとも１日、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、３０日間、４５日間、２ヶ月間、７５日間、３ヶ月間または少なくとも６ヶ月間離してよい。
特定の患者への有効量は、例えば、処置する状態、患者の全体的健康、投与方法、経路および投与量ならびに副作用の重症度の因子により変わり得る(例えば、Maynard et al., (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK参照)。
投与経路は、例えば、局所または皮膚適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内への注射または注入または徐放系またはインプラントにより得る(例えば、Sidman et al., (1983) Biopolymers 22:547-556; Langer et al., (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; 米国特許６,３５０,４６６および６,３１６,０２４参照)。必要であれば、組成物はまた注射部位の疼痛を軽減するために可溶化剤および局所麻酔剤、例えばリドカインも含み得る。さらに、肺投与を、また、例えば吸入器またはネブライザーおよびエアロゾル化剤を用いる製剤の使用により行い得る。例えば、米国特許６,０１９,９６８、５,９８５,３２０、５,９８５,３０９、５,９３４,２７２、５,８７４,０６４、５,８５５,９１３、５,２９０,５４０および４,８８０,０７８；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３参照、その各々は引用によりその全体を本明細書に包含させる。
本発明の組成物は、多様な当分野で知られる方法の１種以上を使用して１個以上の投与経路で投与してもよい。当業者には当然であるが、投与経路および／または投与方法は所望の結果により変わる。本発明の抗体またはそのフラグメントのための選択した投与経路は、例えば、注射または注入による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。非経腸投与は、経腸および局所投与以外の投与経路を意味しえて、通常注射により、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。あるいは、本発明の組成物は、非経腸以外の経路、例えば局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的に投与できる。一つの態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントを注入により投与する。他の態様において、本発明の多特異的エピトープ結合タンパク質を皮下に投与する。
本発明の抗体またはそのフラグメントを制御放出または徐放系で投与するとき、制御放出または徐放系を達成するためにポンプを使用してよい(Langer, supra; Sefton, (1987) CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., (1980), Surgery 88:507; Saudek et al., (1989) N. Engl. J. Med. 321:574参照)。重合物質を使用して、本発明の治療剤の制御放出または徐放系を達成を達成できる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., (1985) Science 228:190; During et al., (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., (1989) J. Neurosurg. 7 1:105；米国特許番号５,６７９,３７７；米国特許番号５,９１６,５９７；米国特許番号５,９１２,０１５；米国特許番号５,９８９,４６３；米国特許番号５,１２８,３２６；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１５１５４；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２０２５３参照)。徐放性製剤に使用するポリマーの例は、ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン−コ−ビニルアセテート)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(ＰＬＧ)、ポリ無水物、ポリ(Ｎ−ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(ＰＬＡ)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧＡ)およびポリオルトエステルを含むが、これらに限定されない。一つの態様において、徐放性製剤に使用するポリマーは不活性であり、溶出可能不純物がなく、貯蔵に安定であり、無菌および生分解性である。制御放出または徐放系は、予防または治療標的の近接に設置でき、それゆえに、全身投与量の一部しか必要ではない(例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照)。
制御放出系はLanger, (1990), Science 249:1527-1533)のレビューに記載されている。当業者に知られるあらゆる技術を、１個以上の本発明の抗体またはそのフラグメントを含むの徐放性製剤に使用できる。例えば、米国特許番号４,５２６,９３８、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ning et al., (1996), Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., (1995) PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., (1997) Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., (1997) Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760参照、その各々は引用によりその全体を本明細書に包含させる。
本発明の抗体またはそのフラグメンを局所的に投与するならば、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンまたは当業者に周知の他の形態に製剤できる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)参照。非スプレー可能局所投与形態について、担体または１個以上の添加物を含む半固体または固体形態への粘性は、局所適用に適用し、ある場合、水より大きい動的粘性を典型的に用いる。適切な製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤、軟膏(salves)などを含むが、これらに限定されず、所望であれば、滅菌しまたは補助剤(例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液または塩類)と混合して、種々の特性、例えば、例えば、浸透圧を変える。他の適切な局所投与形態は、スプレー可能エアロゾル製剤を含み、ここで、ある場合、固体または液体不活性担体と組み合わせた活性成分は、加圧揮発物(例えば、ガス状噴射剤、例えばフレオン)と混合物であるかまたは圧搾ビンに入れられている。加湿剤または湿潤剤も、所望であれば、医薬組成物および投与形態に添加してよい。このようなさらなる成分の例は当分野で周知である。
抗体またはそのフラグメントを含む組成物を鼻腔内投与するならば、エアロゾル形態、スプレー、ミストまたは液滴の形態に製剤できる。特に、本発明に従い使用するための予防または治療剤は、適切な噴射剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス)を使用して、エアロゾルスプレーの形で送達するのが好都合であり得る。加圧エアロゾルの場合、投与量単位を、定量を送達するためのバルブを備えることにより規定し得る。吸入器または吹き入れ器(insufflator)で使用するためのカプセルおよびカートリッジ(例えば、ゼラチンから成る)を、化合物および適切な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンを含んで製剤してよい。
第二治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質または放射線と共投与または処置するための方法は当分野で知られている(例えば、Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.参照)。有効量の治療剤は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも約３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％症状を軽減し得る。
本発明の抗体またはそのフラグメントと組み合わせて投与し得る他の治療剤(例えば、予防または治療剤)は本発明の抗体またはそのフラグメントから５分未満離れて、３０分未満離れて、１時間未満離れて、約１時間離れて、約１〜約２時間離れて、約２時間〜約３時間離れて、約３時間〜約４時間離れて、約４時間〜約５時間離れて、約５時間〜約６時間離れて、約６時間〜約７時間離れて、約７時間〜約８時間離れて、約８時間〜約９時間離れて、約９時間〜約１０時間離れて、約１０時間〜約１１時間離れて、約１１時間〜約１２時間離れて、約１２時間〜１８時間離れて、１８時間〜２４時間離れて、２４時間〜３６時間離れて、３６時間〜４８時間離れて、４８時間〜５２時間離れて、５２時間〜６０時間離れて、６０時間〜７２時間離れて、７２時間〜８４時間離れて、８４時間〜９６時間離れてまたは９６時間〜１２０時間離れて投与してよい。２個以上の治療剤を、同じ患者の来院時に投与してよい。
本発明の抗体またはそのフラグメントおよび他の治療剤を、周期的投与してよい。周期治療は、一定期間の第一治療(例えば、第一予防または治療剤)の投与、続く一定期間の第二治療(例えば、第二予防または治療剤の投与、所望により、続く一定期間の第三治療(例えば、予防または治療剤)の投与などを含み、この連続的投与を繰り返し、すなわち、治療剤の一つに対する耐性の発生を減らすために、治療剤の一つの副作用を減らすまたは避けるためにおよび／または治療剤の有効性を改善するために周期とする。
ある態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、インビボでの適切な分配を確実にするために製剤できる。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために(望むならば)、例えば、リポソームに製剤できる。リポソームの製造方法について、例えば、米国特許４,５２２,８１１；５,３７４,５４８；および５,３９９,３３１参照のこと。リポソームは、特異的細胞または臓器に選択的に輸送される１個以上の部分を含み、それゆえに、標的薬物送達を促進し得る(例えば、Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685)。ターゲティング部分の例は、フォレートまたはビオチン(例えば、Low et alの米国特許番号５,４１６,０１６参照)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)であり、またK. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273参照のこと。
本発明は、処置を必要とする対象への、本発明の抗体またはそのフラグメントを単独またはでまたは他の治療剤と組み合わせて含む医薬組成物の投与のプロトコルを提供する。本発明の組み合わせ治療剤の治療剤(例えば、予防または治療剤)は、対象に同時にまたは連続的に投与してよい。本発明の組み合わせ治療剤の治療(例えば、予防または治療剤)はまた周期的投与してよい。周期治療、一定期間の第一治療(例えば、第一予防または治療剤)の投与、続く一定期間の第二治療(例えば、第二予防または治療剤の投与を含み、この連続的投与を繰り返し、すなわち、治療剤の一つに対する耐性の発生を減らすために、治療剤の一つの副作用を減らすまたは避けるためにおよび／または治療剤の有効性を改善するために周期とする。
本発明の組み合わせ治療剤の治療剤(例えば、予防または治療剤)は、対象に同時に投与してよい。用語“同時”は、正確に同じ時間の治療剤(例えば、予防または治療剤)の投与に限定されず、むしろ本発明の抗体が、他の治療と、他の方法で投与されたよりも大きな利益を提供できるような時間間隔内で、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物を対象に連続的に投与することを意味する。例えば、各治療を、対象に同時にまたは連続的に、異なる時点に任意の順番で投与してよい；しかしながら、同時に投与しないならば、所望の治療または予防効果を提供するために十分に近い時間に投与しなければならない。各治療を対象に別々に任意の適当な形態および任意の適切な経路で投与できる。種々の態様において、治療剤(例えば、予防または治療剤)を、対象に、１５分未満離れて、３０分未満離れて、１時間未満離れて、約１時間離れて、約１時間〜約２時間離れて、約２時間〜約３時間離れて、約３時間〜約４時間離れて、約４時間〜約５時間離れて、約５時間〜約６時間離れて、約６時間〜約７時間離れて、約７時間〜約８時間離れて、約８時間〜約９時間離れて、約９時間〜約１０時間離れて、約１０時間〜約１１時間離れて、約１１時間〜約１２時間離れて、２４時間離れて、４８時間離れて、７２時間離れてまたは１週間離れて投与してよい。他の態様において、２個以上の治療剤(例えば、予防または治療剤)を、同じ患者の来院時に投与してよい。
組み合わせ治療剤の予防または治療剤を、対象に同じ医薬組成物で投与できる。あるいは、組み合わせ治療剤の予防または治療剤を、対象に同時に別々の医薬組成物で投与できる。予防または治療剤を対象に同一または異なる投与経路で投与できる。
本発明を十分に記載しているが、次の実施例および特許請求の範囲によりさらに説明し、これらは説明的でありさらに限定することを意図しない。
実施例１：抗体のための方法、材料およびスクリーニング
(ｉ) 細胞株
SK-Br-3、BT-474およびMCF-7細胞株をATCCから購入し、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)添加増殖培地で一般的に増殖させた。
(ii) 組み換えヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＨＥＲ３ベクター
マウスＨＥＲ３細胞外ドメイをマウス脳ｃＤＮＡ(Clontech)からＰＣＲ増幅し、配列をRefseq NM_010153との比較により確認した。ラットHER3 ECDをRat-2細胞ｍＲＮＡから逆転写させ、配列をNM_017218との比較により確認した。カニクイザルHER3 cDNA鋳型を、種々のカニクイザル組織(Zyagen Laboratories)のＲＮＡを使用して製造し、ＲＴ−ＰＣＲ産物をpCR(登録商標)-TOPO-XL(Invitrogen)にクローン化し、両鎖を配列決定した。ヒトＨＥＲ３は、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー(Source)由来であり、配列をNM_001982との比較により確認した。
タグ付け組み換えタンパク質を産生するために、ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＨＥＲ３をPwo Taqポリメラーゼ(Roche Diagnostics)を使用してＰＣＲ増幅した。増幅ＰＣＲ産物をゲル精製し、フレーム内Ｎ末端ＣＤ３３リーダー配列およびＣ末端タグ、例えば、フラッグタグを含むように予め修飾されたpDonR201(Invitrogen)gatewayエントリーベクターにクローン化した。ＴＡＧは、抗ＴＡＧモノクローナル抗体を介する単量体タンパク質の精製を可能にする。標的遺伝子をＡｔｔＢ１およびＡｔｔＢ２と隣接させ、Gateway(登録商標)クローニング方法(Invitrogen)を使用して、Gateway適応専売目的地ベクター(例えば、pcDNA3.1)に組換えした。組換え反応を、ＣＭＶプロモータを含む専売目的地ベクターとGateway LR反応を用いて行い、タグ発現ベクターを創製したが、任意の市販ベクターを使用できる。
さらに、HER3 ECDを、Ｃ末端因子Ｘ開裂部位上流およびヒトＩｇＧヒンジおよびＦｃドメインを融合する組み換えＨＥＲ３タンパク質を産生し、Ｆｃタグ付タンパク質を創製した。これを達成するために、種々のHER3 ECDをＰＣＲ増幅し、因子Ｘ部位ヒンジ−ｈＦｃのフレーム内Ｃ末端融合を含むように修飾したベクター(例えば、ｐｃＤＮＡ３.１)にクローン化した。産生したオープンリーディングフレームを、Gateway(登録商標)組み換えクローニング方法(Invitrogen)を用いてさらにクローニングするためにＡｔｔＢ１およびＡｔｔＢ２部位に隣接させた。LR Gateway反応を使用して、HER3-FcをＣＭＶプロモータ含有目的地発現構築物に伝達した。ＨＥＲ３点変異発現構築物を、標準的部位特異的突然変異誘発プロトコルを使用して産生し、得られたベクター配列を確認した。
(iii) 組み換えＨＥＲ３タンパク質発現
所望のＨＥＲ３組み換えタンパク質を、予め懸濁液培養に適用させ、Novartis専売無血清培地で培養したＨＥＫ２９３由来細胞株で発現させた。小規模発現検証を、リポフェクションに基づき、一過性６ウェルプレートトランスフェクションアッセイで行った。一過性トランスフェクションを介する大規模タンパク質産生を１０〜２０Ｌ規模でWaveTM bioreactorシステム(Wave Biotech)で行った。ＤＮＡポリエチレンイミン(Polysciences)をプラスミド担体として、１：３(ｗ：ｗ)比で使用した。細胞培養上清をトランスフェクション７〜１０日後に回収し、精製前にクロスフロー濾過およびダイアフィルトレーションにより濃縮した。
(iv) タグ付タンパク質精製
組み換えタグ付ＨＥＲ３タンパク質(例えば、ＴＡＧ−ＨＥＲ３)を、細胞培養上清を回収し、１０kDaカットオフフィルター(Fresenius)でクロスフロー濾過することにより１０倍濃縮して精製した。抗ＴＡＧカラムを、抗ＴＡＧモノクローナル抗体のＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂへの、最終比１０mg抗体／樹脂mLでのカップリングにより調製した。濃縮上清を、３５ml抗Ｔａｇカラムに流速１〜２mL／分で適用した。ＰＢＳでのベースライン洗浄後、結合物質を１００mM グリシン(ｐＨ２.７)で溶出し、中和し、濾過滅菌した。タンパク質濃度を２８０nmの吸光度測定により決定し、理論的計数０.６６ＡＵ／mgを使用して返還した。精製タンパク質を最後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端配列決定およびＬＣ−ＭＳにより特徴づけした。
(ｖ) Ｆｃタグ精製
濃縮細胞培養上清を５０mlプロテインＡセファロースFast Ｆlowカラムに流速１ml／分で適用した。ＰＢＳでのベースライン洗浄後、カラムを１０カラム体積の１０mM ＮａＨ２ＰＯ４／３０％(ｖ／ｖ)イソプロパノール、ｐＨ７.３、続いて５カラム体積のＰＢＳで洗浄した。最後に、結合物質を５０mMシトレート／１４０mM ＮａＣｌ(ｐＨ２.７)で溶出し、中和し、濾過滅菌した。
(vi) HuCAL Platinum(登録商標)パニング
ヒトＨＥＲ３を認識する抗体を選択するために、複数パニング戦略を用いた。ヒトＨＥＲ３タンパク質に対する治療抗体を、抗体変異体タンパク質源として市販のファージディスプレイライブラリー、MorphoSys HuCAL Platinum (登録商標)ライブラリーを使用して、高結合親和性を有するクローンの選択により産生した。ファージミドライブラリーはHuCAL(登録商標)コンセプト(Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86)に基づき、ファージ表面へのＦａｂ提示にＣｙｓディスプレイ(登録商標)方法を使用する(LohningのＷＯ０１／０５９５０)。
抗ＨＥＲ３抗体単離のために、標準的ならびにＲａpMＡＴパニング戦略を固相、溶液、全細胞および示差全細胞パニング手法を使用して実施した。
(vii) 固相パニング
抗ＨＥＲ３抗体を同定するために、多様な固相パニング戦略を種々の組み換えＨＥＲ３タンパク質を使用して行った。各回の固相パニングを行うために、Maxisorpプレート(Nunc)をＨＥＲ３タンパク質でコートした。タグ付タンパク質を、抗Ｆｃ(ヤギまたはマウス抗ヒトＩｇＧ、Jackson Immuno Research)、抗Ｔａｇ抗体で予めコートしたプレートまたは受動的吸着を介して捕捉した。被覆プレートをＰＢＳで洗浄し、遮断した。被覆プレートをＰＢＳで２回添加し、HuCAL Platinum (登録商標)ファージ−抗体を、２時間、室温でシェーカーで添加した。結合ファージを溶出し、大腸菌ＴＧ−１に添加し、ファージ感染のためにインキュベートした。続いて感染細菌を単離し、寒天プレートで平板培養した。コロニーをプレートからかきとり、ファージをレスキューし、増幅した。各ＨＥＲ３パニング戦略は個々のパニングから成り、特有の抗原、抗原濃度および洗浄強度を含む。
(viii) 溶液相パニング
各回の溶液相パニングを、ニューレグリン１−β１(R&D Systems)存在下または非存在下で種々のビオチニル化組み換えＨＥＲ３タンパク質を使用して行った。タンパク質をＥＺ−結合スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチニル化キット(Pierce)を、製造者の指示に従い使用して、ビオチニル化した。８００μlのストレプトアビジン結合磁気ビーズ(Dynabeads, Dynal)をＰＢＳで１回洗浄し、一夜、Chemiblocker(Chemicon)で遮断した。HuCAL Platinum (登録商標)ファージ−抗体および適当なビオチニル化ＨＥＲ３を反応チューブでインキュベートした。ストレプトアビジン磁気ビーズを２０分添加し、磁気粒子分離機(Dynal)で回収した。結合ファージは、ＤＴＴ含有緩衝液の各チューブへの添加によりDynabeadsから溶出し、大腸菌ＴＧ−１に添加した。ファージ感染を固相パニングで記載したのと同じ方法で行った。各ＨＥＲ３パニング戦略は個々のパニングから成り、特有の抗原、抗原濃度および洗浄強度を含む。特異的エピトープを標的とする抗体を単離するために、競合パニングを実施した。これらのパニング戦略において、ＨＥＲ３をインキュベートし、参照抗体で予め遮断し、HuCAL Platinum(登録商標)ファージ抗体を添加した。別の戦略として、参照抗体を使用して、ＨＥＲ３と複合体化するファージ抗体を特異的に溶出した。
(ix) 細胞ベースのパニング
細胞パニングのために、HuCAL Platinum(登録商標)ファージ−抗体を、約１０７細胞でローテータ上で２時間、室温でインキュベートし、続いて遠心分離した。細胞ペレットを単離し、ファージを細胞から溶出した。上清を回収し、大腸菌ＴＧ−１に添加し、培養を上記の方法で続けた。２細胞ベースの戦略を抗ＨＥＲ３抗体同定に使用した：
ａ) 全細胞パニング：この戦略において、多様なインタクト細胞株を抗原として使用した。
ｂ) 示差全細胞パニング：この戦略において、抗原は、連続的に細胞および組み換えＨＥＲ３タンパク質から成った。細胞ベースのパニングを上記のとおり行い、組み換えタンパク質を抗原として用いるとき固相パニングプロトコルを使用した。洗浄はＰＢＳ(２−３Ｘ)およびＰＢＳＴ(２−３Ｘ)を使用して行った。
(x) RapMATＴＭライブラリー産生およびパニング
ライブラリー多様性を維持しながら抗体結合親和性を増やすために、溶液および固相パニング両者の第二ラウンドアウトプットを、RapMATＴＭプロセスに入れ、一方全細胞および示差全細胞パニング戦略の第三ラウンドアウトプットを入れた(Prassler et al., (2009) Immunotherapy; 1: 571-583)。RapMATＴＭライブラリーを、ディスプレイベクターpMORPH(登録商標)25_bla_LHCへのパニングにより選択したファージのＦａｂコード化インサートのサブクローニングにより産生し、さらにH-CDR2 RapMATTＭライブラリーおよびL-CDR3 RapMATＴＭライブラリーを産生するために、特異的制限酵素を使用して消化した。インサートを、プール組成物に従いH-CDR2またはL-CDR3についてＴＲＩＭ成熟カセット(Virnekas et al., (1994) Nucleic Acids Research 22:5600- 5607)で置き換えた。ライブラリーサイズは８×１０６〜１×１０８クローンの範囲と概算された。RapMAT抗体−ファージを産生し、さらに先に記載の実験法を使用する２回の溶液、固相または細胞ベースパニングに付した。
ライブラリー設計の反復精練を含むこの広範なパニング戦略は、スクリーニングを、リガンド−遮断抗体を含むことにより、純粋リガンド競合抗体をパニングから直接スクリーニングして偏向するために開発された。第二に、ＦＡＢからＩｇＧへの変換工程は、候補クローンの回収を最大化することに適し、全選択的結合剤が機能的アッセイでプロファイルされることを確実にした。ｘクローンから産生された４４初期パニングについて、３群のファミリーが所望のリガンド依存性および非依存性シグナル伝達の両者の遮断特性を有した。Ｈｅｒ３の単離ドメイン１−２および２と結合するファミリーＡ。単離ドメイン３−４と結合するが、４単独では結合しないファミリーＢ；およびドメイン３と結合するファミリーＣ。
実施例２：抗ＨＥＲ３ ＩｇＧの一過性発現
懸濁液適応HEK293-6E細胞をBioWave20で培養した。細胞を、関連無菌ＤＮＡ：PEI-MIXで一過性に形質移入し、さらに培養した。トランスフェクション後、細胞をFreseniusフィルターを使用してクロスフロー濾過した。無細胞物質を、カットオフフィルター(Fresenius)を使用するクロスフロー濾過で濃縮し、濃縮物をステリカップフィルターで濾過滅菌した。無菌上清を４℃で貯蔵した。
実施例３：抗ＨＥＲ３ ＩｇＧの精製
ＩｇＧの精製を、AEKTA 100explorer Airクロマトグラフィーシステムで、冷却キャビネットで、ＸＫ１６／２０カラムと２５mLの自己充填MabSelect SuRe樹脂(全GE Healthcare)を使用して行った。全流速は、充填以外、５バールの圧力限界で３.５mL／分であった。カラムをＰＢＳで平衡化し、濾過発酵上清で充填した。カラムをＰＢＳで洗浄した。ＩｇＧを、シトレート／ＮａＣｌ(ｐＨ４.５)で開始し、シトレート／ＮａＣｌ(ｐＨ２.５)まで直線的に低下するｐＨ勾配、続いて同じｐＨ２.５緩衝液で定常工程で溶出した。ＩｇＧ含有フラクションをプールし、直ちに中和し、濾過滅菌(Millipore Steriflip、０.２２μm)した。ＯＤ２８０を測定し、タンパク質濃度を配列データに基づき計算した。プールを、凝集(ＳＥＣ−ＭＡＬＳ)および純度(ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＳ)について別々に試験した。
実施例４：大腸菌中のHuCAL(登録商標)−Ｆａｂ抗体の発現および精製
ＴＧ−１細胞中のpMORPH(登録商標)X9_Fab_MHによりコードされるＦａｂフラグメントの発現を、シェーカーフラスコ培養で、クロラムフェニコール添加ＹＴ培地で行った。培養をＯＤ６００nmが０.５に達するまで振盪した。ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド)添加により、発現を誘発した。細胞をリゾチームを使用して破壊した。Ｈｉｓ６タグ付ＦａｂフラグメントをＩＭＡＣ(Bio-Rad)により単離した。１×ダルベッコＰＢＳ(ｐＨ７.２)への緩衝液交換をＰＤ１０カラムを使用して行った。サンプルを濾過滅菌(０.２μm)した。タンパク質濃度をＵＶ分光光度法で決定した。サンプルの純度を変性、還元１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。Ｆａｂ調製物の均一性を天然状態で、分子ふるいクロマトグラフィー(ＨＰ−ＳＥＣ)により検量標準と共に決定した。
実施例５：溶液平衡タイトレーション(ＳＥＴ)によるＨＥＲ３抗体親和性(ＫＤ)測定
溶液での親和性決定を、本質的に先に記載のとおり行った(Friguet et al., (1985) J Immunol Methods 77:305-19)。ＳＥＴ方法の感受性および精度を改善するために、古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの方法に変えた(Haenel et al., (2005) Anal biochem 339:182-84)。
先に記載した非標識ＨＥＲ３タグ(ヒト、ラット、マウスまたはカニクイザル)を、ＳＥＴによる親和性決定に使用した。
データを、カスタマイズしたフィッティングモデルを適用するXLfitソフトウェア(ID Business Solutions)で評価した。各ＩｇＧのＫＤ決定について、下記モデルを使用した(Piehler, et al (Piehler et al., (1997) J Immunol Methods 201:189-206)に基づき変更)。
[ＩｇＧ]：適用した総ＩｇＧ濃度
ｘ：適用した総可溶性抗原濃度(結合部位)
Ｂｍａｘ：抗原なしのＩｇＧの最大シグナル
ＫＤ：親和性
実施例６：ＦＡＣＳによる抗体細胞結合決定
ヒト癌細胞で発現する内因性ヒト抗原に対する抗体の結合をＦＡＣＳで評価した。抗体ＥＣ５０価を決定するために、SK-Br-3細胞をaccutaseを用いて回収し、１×１０６細胞／mLにＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ／３％ＦＢＳ／０.２％ＮａＮ３)で希釈した。１×１０５細胞／ウェルを９６ウェルプレート(Nunc)の各ウェルに添加し、２１０ｇで５分、４℃で遠心分離し、上清を取った。試験抗体の連続的希釈物(ＦＡＣＳ緩衝液で１：４希釈工程で希釈)をペレット化細胞に添加し、１時間、氷上でインキュベートした。１００μL ＦＡＣＳ緩衝液で３回細胞を洗浄し、ペレット化した。ＦＡＣＳ緩衝液で１／２００希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch)を細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。さらなる洗浄工程を１００μL ＦＡＣＳ緩衝液で３回行い、続いて２１０ｇで５分、４℃で遠心分離した。最後に、細胞を２００μL ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、蛍光価をFACSArray(BD Biosciences)で測定した。細胞表面結合抗ＨＥＲ３抗体の量を、平均チャネル蛍光の測定により評価した。
実施例７：ＨＥＲ３ドメインおよび変異結合
９６ウェルMaxisorpプレート(Nunc)を、２００ngの適当な組み換えヒトタンパク質(HER3タグ、Ｄ１−２タグ、Ｄ２タグ、Ｄ３−４タグ、Ｄ４タグ、HER3 K267Aタグ、HER3 L268Aタグ、HER3 K267A/L268Aおよびタグ付無関係対照)で一夜コートした。全ウェルをＰＢＳ／０.１％Tween-20で洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.１％Tween-20で遮断し、ＰＢＳ／０.１％Tween-20で洗浄した。抗ＨＥＲ３抗体を適切なウェルに最終濃度１０μg／mLまで添加し、室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／０.１％Tween-20で洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.１％Tween-20で１／１００００希釈した適当なペルオキシダーゼ結合検出抗体を添加した。用した検出抗体はヤギ抗マウス(Pierce、３１４３２)、ウサギ抗ヤギ(Pierce、３１４０２)およびヤギ抗ヒト(Pierce、３１４１２)であった。プレートを室温でインキュベートし、ＰＢＳ／０.１％Tween-20で洗浄した。１００μｌ ＴＭＢ(３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン)基質溶液(BioFx)を全ウェルに添加し、反応を２.５％Ｈ２ＳＯ４停止させた。各組み換えタンパク質へのＨＥＲ３抗体の結合の程度を、SpectraMaxプレートリーダー(Molecular Devices)を使用してＯＤ４５０を測定して決定した。適当なとき、用量応答曲線をGraphpad Prismを使用して分析した。
実施例８：ＥＬＩＳＡによる抗体交差競合
抗体Ａを、定量でMaxisorpプレートに被覆し、溶液中抗体Ｂの量を増加させながらＨＥＲ３への結合の競合を試験した。Maxisorpプレートを２４ng／ウェル抗体ＡでＰＢＳ中遮断し、一夜４℃でインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した。プレートを３％ＢＳＡ／ＰＢＳで、１時間、室温で遮断した。抗体Ｂを１：３工程でタイトレーションし、モル過剰でビオチニル化ＨＥＲ３タグと１時間、室温で溶液中インキュベートした。ＨＥＲ３／抗体Ｂ複合体を、次いで抗体Ａ被覆プレートに３０分添加し、結合複合体を、ビオチニル化ＨＥＲ３タグの定量により測定した。遮断プレートを続いてＰＢＳＴで洗浄し、予め形成したＨＥＲ３／抗体Ｂ複合体を天下し、３０分で室温穏やかに振盪しながら拡販した。プレートを続いて過剰のＰＢＳＴで洗浄し、１時間、１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで１：５０００希釈したストレプトアビジン−ＡＰとインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、AttoPhos溶液(Ｈ２Ｏで１：５希釈)を添加し、４３０nmでの励起後５３５nmの蛍光シグナルを測定した。
抗体ＡがＨＥＲ３への結合について抗体Ｂと競合しないならば、高レベルのＨＥＲ３が検出された。対照的に、競合的抗体またはエピトープが一部重複する抗体で、ＩｇＧ対照と比較したとき、ＨＥＲ３シグナルは有意に減少した。
実施例９：ホスホ−ＨＥＲ３インビトロ細胞アッセイ
MCF-7細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５mM ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳ、BT474をＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳおよびSK-Br-3をマッコイ５ａ、１０％ＦＢＳ、１.５mM Ｌ−グルタミン中で一般的に維持した。サブコンフルエント細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、５×１０５細胞／mLに希釈した。１００μLの細胞懸濁液を次いで９６ウェル平底プレート(Nunc)の各ウェルに添加し、最終密度５×１０４細胞／ウェルとした。MCF7細胞を約３時間付着させ、培地を０.５％ＦＢＳ含有飢餓培地に交換した。全プレートを次いで一夜、３７℃でインキュベートし、適当な濃度のＨＥＲ３抗体で８０分、３７℃で処理した。MCF7細胞をＨＥＲ３およびＡＫＴリン酸化刺激のために最終２０分５０ng／mL ＮＲＧ１で刺激したが、BT474／SK-Br-3細胞はさらなる刺激を必要としなかった。全培地を穏やかに吸引し、細胞を１mM ＣａＣｌ２および０.５mM ＭｇＣｌ２(Gibco)含有氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を５０μL 氷冷溶解緩衝液(２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)／１３７mM ＮａＣｌ／１０％グリセロール／２mM ＥＤＴＡ／１％ＮＰ−４０／１mM オルトバナジン酸ナトリウム、アプロチニン(１０μg／mL)／ロイペプチン(１０μg／mL))で洗浄し、氷上で振盪しながら３０分インキュベートした。ライセートを次いで回収し、１８００ｇで１５分、４℃で遠心して、細胞細片を除去した。２０μLのライセートを予め調製した捕捉プレートに添加した。
ＨＥＲ３捕捉プレートを、炭素プレート(Mesoscale Discovery)を使用して、一夜、４℃で２０μLのＰＢＳで希釈した４μg／mL MAB3481捕捉抗体(R&D Systems)でコーティングし、続いて３％ウシ血清アルブミンの１×Ｔｒｉｓ緩衝液(Mesoscale Discovery)／０.１％Tween-20で遮断することにより調製した。ＨＥＲ３を、適当な量のライセートを添加し、プレートを室温で１時間振盪し、ライセートを吸引し、ウェルを１×Ｔｒｉｓ緩衝液(Mesoscale Discovery)／０.１％Tween-20で洗浄することによりライセートから捕捉した。リン酸化ＨＥＲ３振盪しながら室温で１時間インキュベートすることにより、３％ミルク／１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20中に調製した１：８０００ 抗ｐＹ１１９７抗体(Cell Signaling)を使用して検出した。ウェルを１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で４回洗浄し、リン酸化タンパク質を３％遮断緩衝液中のＳタグ標識ヤギ抗ウサギＡｂ(#R32AB)と１時間、室温でインキュベートすることにより検出した。各ウェルを吸引し、１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で４回洗浄し、２０μLのRead緩衝液Ｔと海面活性剤(Mesoscale Discovery)を添加して、シグナルをMesoscale Sector Imagerを使用して定量した。
実施例１０：ホスホ−Ａｋｔ(Ｓ４７３)インビトロ細胞アッセイ
サブコンフルエントMCF7、SK-Br-3およびBT-474細胞を完全培地で増殖させ、accutase(PAA Laboratories)で回収し、適当な増殖培地に最終濃度５×１０５細胞／で再懸濁した。１００μLの細胞懸濁液を、次いで９６ウェル平底プレート(Nunc)の各ウェルに添加し、最終密度５×１０４細胞／ウェルとした。MCF7細胞を約３時間付着させ、培地を０.５％ＦＢＳ含有飢餓培地に交換した。全プレートを次いで一夜、３７℃でインキュベートし、適当な濃度のＨＥＲ３抗体で８０分、３７℃で処理した。MCF7細胞をＨＥＲ３およびＡＫＴリン酸化刺激のために最終２０分５０ng／mL ＮＲＧ１で刺激したが、SK-Br-3細胞はさらなる刺激を必要としなかった。全培地を穏やかに吸引し、細胞を１mM ＣａＣｌ２および０.５mM ＭｇＣｌ２(Gibco)含有氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を５０μL 氷冷溶解緩衝液(２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)／１３７mM ＮａＣｌ／１０％グリセロール／２mM ＥＤＴＡ／１％ＮＰ−４０／１mM オルトバナジン酸ナトリウム／アプロチニン(１０μg／mL)／ロイペプチン(１０μg／mL))の添加により溶解し、氷上で振盪しながら３０分インキュベートした細胞を５０μL 氷冷溶解緩衝液(２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)／１３７mM ＮａＣｌ／１０％グリセロール／２mM ＥＤＴＡ／１％ＮＰ−４０／１mM オルトバナジン酸ナトリウム／アプロチニン(１０μg／mL)／ロイペプチン(１０μg／mL))の添加により溶解し、氷上で振盪しながら３０分インキュベートしたライセートを次いで回収し、１８００ｇで１５分、４℃で遠心して、細胞細片を除去した。２０μLのライセートを予め調製した捕捉プレートに添加した。
２０μLのライセートを、３％ＢＳＡ／１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で予め遮断した多スポット３８４ウェルホスホ−Ａｋｔ炭素プレート(Mesoscale Discovery)に添加した。プレートを室温で２時間、振盪しながらインキュベートし、ライセートを吸引し、ウェルを１×Ｔｒｉｓ緩衝液(Mesoscale Discovery)／０.１％Tween-20で４回洗浄した。リン酸化Ａｋｔを、１％ＢＳＡ／１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で５０倍希釈した２０μLのスルホタグ抗ホスホ−Ａｋｔ(Ｓ４７３)抗体(Mesoscale Discovery)で、振盪しながら室温で２時間インキュベートすることにより検出した。ウェルを１×Ｔｒｉｓ／０.１％Tween-20で４回洗浄し、２０μLのRead緩衝液Ｔと海面活性剤(Mesoscale Discovery)を添加して、シグナルをMesoscale Sector Imagerを使用して定量した。
実施例１１：細胞株増殖アッセイ
SK-Br-3細胞を、修飾され、１０％ウシ胎児血清を添加したマッコイ５Ａ培地で一般的に培養し、BT-474細胞を１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで培養した。サブコンフルエント細胞をトリプンシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、増殖培地で５×１０４細胞／mLに希釈し、９６ウェル透明底黒色プレート(Costar 3904)に５０００細胞／ウェルの密度で添加した。細胞を一夜、３７℃でインキュベートし、適当な濃度のＨＥＲ３抗体(典型的最終濃度１０または１μg／mL)を添加した。プレートを６日間インキュベーターに戻し、CellTiter-Gloを使用して細胞生存能を評価した。１００μLのCellTiter-Glo溶液を各ウェルに添加し、穏やかに撹拌しながら室温で１０分インキュベートした。発光の量をSpectraMaxプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して決定した。各抗体で得られた増殖阻害の程度を各ＨＥＲ３抗体で得られた発光価を標準的アイソタイプコントロール抗体と比較することにより計算した。
増殖アッセイのために、MCF-7細胞を、４mM Ｌ−グルタミン／１５mM ＨＥＰＥＳ／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２(１：１)で一般的に洗浄した。サブコンフルエント細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、４mM Ｌ−グルタミン／１５mM ＨＥＰＥＳ／１０μg／mL ヒトトランスフェリン／０.２％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２(１：１)で１×１０５細胞／mLに希釈した。細胞を９６ウェル透明底黒色プレート(Costar)に５０００細胞／ウェル密度で平板培養した。適当な濃度のＨＥＲ３抗体(典型的最終濃度１０または１μg／mL)を次いで添加した。１０ng／mLのＮＲＧ１−β１ ＥＧＦドメイン(R&D Systems)を適当なウェルに添加して、細胞増殖を刺激した。プレートを６日間インキュベーターに戻し、CellTiter-Gloを使用して細胞生存能を評価した。各抗体で得られた増殖阻害の程度を背景(ニューレグリンなし)発光価を減産し、各抗ＨＥＲ３抗体で得られた価を標準的アイソタイプ対照抗体と比較することにより計算した。
実施例１２：インビボBxPC3有効性試験
BxPC3細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で、インプラント時まで抗生物質無しで培養した。
雌無胸腺nu/nu Balb/Cマウス(Harlan Laboratories)に、１０×１０６細胞で５０％リン酸緩衝化食塩水と５０％マトリゲルの混合物中でインプラントした。懸濁液での細胞を含む総注入体積は２００μLであった。腫瘍が約２００mm３の大きさになったら、動物を有効性試験に参加させた。一般に、１群あたり計１０匹動物を有効性試験に参加させた。異常な腫瘍増殖特徴を示すならば、動物を除外した。
動物に、側方尾静脈注射を介して静脈内投与した。動物は試験期間中、２０mg／kg週に２回投与のスケジュールであった。腫瘍体積およびＴ／Ｃ価をBT-474で詳述するとおり計算した。
実施例１３：インビボBT-474有効性試験
BT-474細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで、インプラント時まで抗生物質無しで培養した。
細胞接種１日前、雌無胸腺nu/nu Balb/Cマウス(Harlan Laboratories)に、皮下的に徐放性１７β−エストラジオールペレット(Innovative Research of America)をインプラントし、血清エストロゲンレベルを維持した。１７β−エストラジオールペレットインプラント１日後、５×１０６細胞を同所性に、第四乳房脂肪パッドに、ハンクス平衡塩溶液中５０％無フェノールレッドマトリゲル(BD Biosciences)を含む懸濁液として注射した。懸濁液での細胞を含む総注入体積は２００μLであった。懸濁液での細胞を含む総注入体積は２００μLであった。細胞インプラント２０日後、腫瘍体積約２００mm３の動物を有効性試験に参加させた。一般に、１群あたり計１０匹動物を有効性試験に参加させた。
単剤試験のために、動物に、対照ＩｇＧまたはMOR13759を側方尾静脈注射により、静脈内に投与した。動物は、試験期間中、２０mg／kg週に２回投与のスケジュールであった。試験期間について、腫瘍体積を、週に２回ノギス測定することにより測定した。処置／対照(Ｔ／Ｃ)価パーセントを次の式を使用して計算した：
ΔＴ＞０であるならば、％Ｔ／Ｃ＝１００×ΔＴ／ΔＣ
式中、
Ｔ＝試験最終日の薬剤処置群の平均腫瘍体積
ΔＴ＝試験最終日の薬剤処置群の平均腫瘍体積−投与開始日の薬剤処置群の平均腫瘍体積；
Ｃ＝試験最終日の対照群の平均腫瘍体積；および
ΔＣ＝試験最終日の対照群の平均腫瘍体積−薬剤処置群の投与開始日の対照群の平均腫瘍体積。
体重を週に２回測定し、投与量を体重で調節した。体重変化％を(ＢＷ現在−ＢＷ初期)／(ＢＷ初期)×１００で計算した。データを、処置開始日からの体重変化パーセントとして示す。
全データは、平均±平均の標準誤差(ＳＥＭ)で示した。デルタ腫瘍体積および体重を統計学的分析に使用した。群間比較を、一方向ＡＮＯＶＡと、続く事後Ｔｕｋｅｙにより行った。全統計学的評価について、レベルの有意性をｐ＜０.０５と設定した。媒体対照群と比較した有意性を報告する。
結果および考察
まとめると、これらの結果は、ドメイン２内のアミノ酸残基と結合する一群の抗体を示す。これらの抗体の結合はリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも阻害する。
(ｉ) 親和性決定
抗体親和性を、上記のとおり溶液平衡タイトレーション(ＳＥＴ)により決定した。結果を表３に要約し、MOR12616およびMOR12925のタイトレーション曲線の例を図１に示す。データは、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスＨＥＲ３と密接に結合する多くの抗体が同定されたことを示す。
(ii) SK-Br-3細胞ＥＣ５０決定
同定した抗体がＨＥＲ３発現細胞と結合する能力を、ＨＥＲ２増幅細胞株SK-Br-3の結合についてのＥＣ５０価計算により決定した(図２および表４参照)。
(iii) ＨＥＲ３ドメイン結合
抗ＨＥＲ３抗体のサブセットを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒトＨＥＲ３の多様な細胞外ドメインと結合する能力について特徴づけした。これを達成するために、ＨＥＲ３の細胞外ドメインをその４個の構成的ドメインに分割し、これらのドメインの種々の組み合わせを上記のとおりクローン化し、発現し、非依存性タンパク質として精製した。この戦略を使用して、下記ドメインは可溶性タンパク質としての産生に成功した：ドメイン１および２(Ｄ１−２)、ドメイン２(Ｄ２)、ドメイン３および４(Ｄ３−４)およびドメイン４(Ｄ４)。各単離ドメインの完全さを、一群の内部産生した抗体をポジティブコントロールとして使用して予め確認した。
図３に示すとおり、MOR12616およびMOR12925はいずれもＨＥＲ３細胞外ドメイン、単離Ｄ１−２および単離Ｄ２タンパク質に結合することが観察された。Ｄ３−４またはＤ４タンパク質との結合は観察されなかった。この結合データは、この抗体のファミリーが、主にドメイン２内に含まれるエピトープを認識することを確認する。さらにエピトープを確認するために、我々は抗体結合に対するＤ２内の残基変異の影響を観察した。結合ＥＬＩＳＡ(図４)およびＳＥＴ(表５)の両者で確認されるとおり、リシン２６８のアルギニンへの偏向は抗体結合を重度に阻害し、それゆえに、結合エピトープがドメイン２内に含まれることを確認した。
ｖ) エピトープ競合ＥＬＩＳＡ
抗ＨＥＲ３抗体のこのクラスのエピトープをさらに精査するために、我々は、抗体のサブセット対多くのエピトープが予め特徴付けされている多くの専有抗ＨＥＲ３抗体上でエピトープ競合を試験した。エピトープ競合実験は、プレートに固定化した抗体Ａ(例えばMOR12925またはMOR12616)から成り、その溶液からのＨＥＲ３／抗体Ｂ複合体の捕捉能力を試験する。抗体ＡがＨＥＲ３の結合について抗体Ｂと競合しないならば、ＨＥＲ３複合体は溶液から捕捉される。対照的に、抗体Ａが抗体Ｂと同一または重複するエピトープを有するならば、ＨＥＲ３複合体は捕捉され得ない。この方法を使用して、アロステリックコンペティターも同定し得る。この場合、抗体ＢのＨＥＲ３への結合は立体構造的変化を誘発し、これは抗体Ａエピトープを遮蔽する。それゆえに、抗体Ａおよび抗体Ｂは、そのＨＥＲ３結合残基が互いに末端であってさえも、直接的に競合し得る。
MOR12925およびMOR12616のエピトープ競合データ例を図５に示す。データに見られるとおり、MOR12925およびMOR12616のいずれも、ＨＥＲ３への結合について交差競合し、それゆえに、これらの高度に関連する抗体がおそらく同じＨＥＲ３エピトープに結合することを証明する。交差競合はまたエピトープがドメイン２および４内に含まれる残基に予め位置づけられた抗体(Ｄ２／４)でも観察された。興味深いことに、単離ＨＥＲ３ドメイン４と結合する抗体(Ｄ４)との競合は観察されなかった。このデータは、MOR12925およびMOR12616のいずれもドメイン２内に含まれるエピトープと結合することを示唆し、これは、我々の先のドメイン結合ＥＬＩＳＡと一致した。抗体Ｄ２／４がＨＥＲ３のドメイン２内のアミノ酸残基２６５〜２７７、３１５と相互作用することが示されているため、これらの残基のいくつかがMOR12925およびMOR12616結合に重要であると推測される。
(vi) 細胞シグナル伝達の阻害
抗ＨＥＲ３抗体のリガンド依存性ＨＥＲ３活性に対する効果を確認するために、MCF7細胞をＩｇＧとインキュベートし、ニューレグリンで刺激した。阻害曲線の例を図６に記載し、表６に要約する。抗ＨＥＲ３抗体のＨＥＲ２仲介ＨＥＲ３活性化に対する効果もＨＥＲ２増幅細胞株SK-Br-3およびBT474を使用して試験した(図７および表６)。
ＨＥＲ３活性阻害が下流細胞シグナル伝達に影響を与えるか否かを決定するために、Ａｋｔ、リン酸化もまた抗ＨＥＲ３抗体での処置後ＮＲＧ刺激MCF7細胞およびＨＥＲ２増幅SK-Br-3／BT474細胞で測定した(図６、図７および表７参照)。
要約するとMOR12509、MOR12510、MOR12616、MOR12923、MOR12924、MOR12925、MOR13750、MOR13752、MOR13754、MOR13755、MOR13756、MOR13758、MOR13759、MOR13761、MOR13762、MOR13763、MOR13765、MOR13766、MOR13767、MOR13768、MOR13867、MOR13868、MOR13869、MOR13870、MOR13871、MOR14535およびMOR14536は、細胞性ＨＥＲ３活性をガンド依存性およびリガンド非依存性方法の両者で阻害できる。
(vii) 増殖阻害
MOR12509、MOR12510、MOR12616、MOR12923、MOR12924、MOR12925、MOR13750、MOR13752、MOR13754、MOR13755、MOR13756、MOR13758、MOR13759、MOR13761、MOR13762、MOR13763、MOR13765、MOR13766、MOR13767、MOR13768、MOR13867、MOR13868、MOR13869、MOR13870、MOR13871、MOR14535およびMOR14536がＨＥＲ３活性および下流シグナル伝達を阻害するため、インビトロのリガンド依存性および非依存性細胞増殖を阻害する能力を試験した(データ例は図８に示し、表８に要約する)。試験した抗ＨＥＲ３抗体は細胞増殖の有効な阻害剤であり、リガンド依存性および非依存性ＨＥＲ３由来表現型の阻害を確認した。
(viii) インビボでの腫瘍増殖阻害
記載した抗ＨＥＲ３抗体のインビボ活性を決定するために、MOR13759をBxPC3およびBT-474腫瘍モデルの両者で試験した。反復MOR13759処置はBxPC3モデルで２９.１％退縮をもたらした(図９Ａ)。BT474モデルのMOR13759での処置は、腫瘍増殖の４５％阻害(Ｔ／Ｃ)をもたらした(図９Ｂ)。
引用による取り込み
ここに引用した全ての参照文献は、特許、特許出願、論文、教科書などおよびそれらの中の引用文献を含み、それらがまだ存在しない限り、その全体を引用により本明細書に包含させる。
等価物
上の明細書は当業者が本発明を実施するのに十分であると考える。上の記載および実施例は、本発明のある種の好ましい態様を詳述し、発明者らにより最良の態様と考慮されるものを記載する。しかしながら、いかに詳細な記載が上に記載されていたとしても、本発明は多くの方法で実施でき、本発明は添付する特許請求の範囲およびその均等物に従い解釈されるべきであることは認識される。

Claims (36)

  1. ＨＥＲ３受容体のエピトープを認識する単離抗体またはそのフラグメントであって、該エピトープはＨＥＲ３受容体のドメイン２のアミノ酸残基２０８〜３２８から成り、ここで、抗体またはそのフラグメントはドメイン２内の少なくともアミノ酸残基２６８を認識し、ここで、該抗体またはそのフラグメントはリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、単離抗体またはそのフラグメント。
  2. エピトープが線形エピトープ、非線形エピトープ、および立体構造的エピトープから成る群から選択される、請求項１に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  3. 抗体またはそのフラグメントが不活性状態のＨＥＲ３受容体と結合する、請求項１に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  4. リガンド結合部位へのＨＥＲ３リガンド結合がＨＥＲ３シグナル伝達活性化を失敗させる、請求項１に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  5. ＨＥＲ３リガンドがＨＥＲ３受容体上のリガンド結合部位と同時に結合できる、請求項１に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  6. ＨＥＲ３リガンドがニューレグリン(ＮＲＧ)１、ニューレグリン２、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮増殖因子およびエピレギュリンから成る群から選択される、請求項５に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  7. 少なくともアミノ酸残基２６８(ドメイン２内)がドメイン２における結合に影響し、それにより抗体または抗体フラグメント結合を遮断する、請求項１に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  8. 分解に感受性とする、細胞表面ＨＥＲ３の下方制御を加速する、他のＨＥＲ受容体との二量体化を阻害するおよびタンパク質分解に感受性であるまたは他の受容体チロシンキナーゼ類と二量体できない非天然ＨＥＲ３二量体を産生するようにＥＲ３を脱安定化することから成る群から選択される特徴を有する、単離抗体またはそのフラグメント。
  9. ＨＥＲ３リガンド存在下の抗体またはそのフラグメントのＨＥＲ３受容体への結合がＨＥＲ２およびＨＥＲ３を発現する細胞におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体のリガンド非依存性形成を減少させる、請求項１に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  10. ＨＥＲ３受容体がＨＥＲ２受容体と二量体化してＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成することに失敗する、請求項９に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  11. ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体形成の失敗がシグナル伝達の活性化を妨げる、請求項１０に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  12. 抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３リガンド非依存性リン酸化アッセイで測定して、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する、請求項９に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  13. ＨＥＲ３リガンド非依存性リン酸化アッセイがＨＥＲ２増幅細胞を使用し、ここで、ＨＥＲ２増幅細胞がSK-Br-3細胞およびBT-474である、請求項１２に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  14. ＨＥＲ３リガンド存在下の抗体またはそのフラグメントのＨＥＲ３受容体への結合がＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現細胞におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体のリガンド依存性形成を減少させる、請求項１に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  15. ＨＥＲ３リガンドの存在下ＨＥＲ３受容体がＨＥＲ２受容体と二量体化してＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成することに失敗する、請求項１２に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  16. ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体形成失敗がシグナル伝達の活性化を妨げる、請求項１３に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  17. ＨＥＲ３リガンド依存性リン酸化アッセイで評価して抗体またはそのフラグメントがＨＥＲ３のリン酸化を阻害する、請求項１４に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  18. ＨＥＲ３リガンド依存性リン酸化アッセイがニューレグリン(ＮＲＧ)存在下の刺激MCF7細胞を使用する、請求項１７に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  19. 抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および合成抗体から成る群から選択される、請求項１に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  20. ＨＥＲ３受容体のドメイン２内のエピトープを認識し、ここで、エピトープがＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２０８〜３２８を認識し、ここで、抗体またはそのフラグメントはドメイン２内の少なくともアミノ酸残基２６８を認識し、そして該抗体またはそのフラグメントは少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１の解離(ＫＤ)を有し、ここで、該抗体またはそのフラグメントはリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、単離抗体またはそのフラグメント。
  21. 抗体またはそのフラグメントがホスホ−ＨＥＲ３およびホスホ−Ａｋｔから成る群から選択されるインビトロリン酸化アッセイで測定してＨＥＲ３のリン酸化を阻害する、請求項２０に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  22. 抗体またはそのフラグメントが表１に記載した抗体と同じエピトープに結合する、請求項２０に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  23. 単離抗体またはそのフラグメントが表１に記載する抗体と交差競合する、請求項２０に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  24. 抗体のフラグメントがＦａｂ、Ｆ(ａｂ２)’、Ｆ(ａｂ)２’、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂｓから成る群から選択される、請求項２０に記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  25. 抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、該抗体またはそのフラグメントｂはＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２０８〜３２８を含むＨＥＲ３受容体と結合し、ここで、抗体またはそのフラグメントはドメイン２内の少なくともアミノ酸残基２６８を認識し、ここで、該抗体またはそのフラグメントはリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、医薬組成物。
  26. さらに別の治療剤を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. 別の治療剤がＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 別の治療剤がマツズマブ(EMD72000)、アービタックス(登録商標)／セツキシマブ、ベクティビックス(登録商標)／パニツムマブ、mAb 806、ニモツズマブ、イレッサ(登録商標)／ゲフィチニブ、CI-1033(PD183805)、ラパチニブ(GW-572016)、タイケルブ(登録商標)／トシル酸ラパチニブ、タルセバ(登録商標)／エルロチニブＨＣｌ(OSI-774)、PKI-166およびTovok(登録商標)から成る群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツマブ、MM-111、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ(登録商標)から選択されるＨＥＲ２阻害剤；MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3 Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)およびＨＥＲ３を阻害する小分子から成る群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；およびＨＥＲ４阻害剤である、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 別の治療剤がテムシロリムス／トーリセル(登録商標)、リダフォロリムス／デフォロリムス、AP23573、MK8669、エベロリムス／アフィニトール(登録商標)から成る群から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である、請求項２７に記載の医薬組成物。
  30. 別の治療剤がGDC 0941、BEZ235、BMK120およびBYL719から成る群から選択されるＰＩ３キナーゼ阻害剤である、請求項２７に記載の医薬組成物。
  31. ＨＥＲ３を発現する癌を有する対象を選択し、対象に表１に開示する抗体またはそのフラグメントを含む組成物の有効量を投与することを含む癌の処置方法であって、ここで、抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２０８〜３２８を含むＨＥＲ３受容体のエピトープを認識し、ここで、抗体またはそのフラグメントはドメイン２内の少なくともアミノ酸残基２６８を認識し、ここで、該抗体またはそのフラグメントはリガンド依存性シグナル伝達およびリガンド非依存性シグナル伝達のいずれも遮断する、処置方法。
  32. 対象がヒトであり、癌が乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、胃癌、膵癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症から成る群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 癌が乳癌である、請求項３１に記載の方法。
  34. ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル伝達またはリガンド非依存性シグナル伝達経路により仲介される癌の処置に使用する、請求項１〜３０のいずれかに記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  35. 医薬として使用する、請求項１〜３０のいずれかに記載の単離抗体またはそのフラグメント。
  36. 乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、胃癌、膵癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥大(ＢＰＨ)、女性化乳房および子宮内膜症から成る群から選択されるＨＥＲ３リガンド依存性シグナル伝達またはリガンド非依存性シグナル伝達経路により仲介される癌の処置用医薬の製造における、請求項１〜３０のいずれかに記載の単離抗体またはそのフラグメントの使用。
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