KR20120010222A

KR20120010222A - 고병원성 조류 인플루엔자 ｈ5ｎ1 아형 바이러스의 검출 키트

Info

Publication number: KR20120010222A
Application number: KR1020117017415A
Authority: KR
Inventors: 타카아키 나카야; 아나리와 두; 유스케 시바이; 다이스케 이토; 히사히코 이와모토
Original assignee: 오사카 유니버시티; 다나카 기킨조쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2009-03-12
Filing date: 2009-10-01
Publication date: 2012-02-02
Also published as: WO2010103583A1; JPWO2010103583A1; US20120028246A1; JP2011257138A; JP5597190B2

Abstract

본 발명은, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 신속하고 간편하게 특이적으로 검출하기 위한 면역 측정 키트 및 면역 측정 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 H5N1 아형 바이러스를 신속하고 간편하게 고감도로 특이적으로 검출하기 위한 면역 크로마트그래피법에 의한 검출 키트 및 검출 방법을 제공한다. 본 발명자들은 H5N1 아형 바이러스를 면역원으로 하여 제작한 단클론 항체 4G6가 H5N2 아형 또는 H5N3 아형 바이러스와는 반응하지 않고 H5N1 아형 바이러스에만 특이적으로 결합하는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 단클론 항체 4G6를 이용한 면역 측정법에 의해 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형만을 특이적으로 검출할 수 있음을 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은 면역 크로마트그래피법을 이용한 전개액에 비이온성 계면활성제 및 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 첨가하는 것에 의해 검출의 감도를 높일 수 있다는 것도 발견하였다.

Description

고병원성 조류 인플루엔자 Ｈ5Ｎ1 아형 바이러스의 검출 키트{KIT FOR DETECTING HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA VIRUS SUBTYPE Ｈ5Ｎ1}

본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 H5N1 아형 바이러스를 검출하기 위한 키트 및 당해 키트를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

인플루엔자는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염증으로 비인두, 인후, 기관지 등을 표적 장기로 하여 38 ℃ 이상의 발열, 두통, 관절통, 근육통 등에 더하여, 인두통, 콧물, 기침 등의 증상이 갑자기 발병하는 것으로 알려져 있다. 일본에서 인플루엔자는 매년 11월 하순부터 12월 상순경에 발생이 시작되어, 다음해의 1?3월 무렵 그 수가 증가, 4?5월에 걸쳐 감소해가는 패턴을 볼 수 있다. 매년 사람 사이에 유행하는 인플루엔자 바이러스는 사람에 완전하게 적응하여 공존에 가까운 관계를 유지하고 있어, 기초 질환의 존재나 고령인 것 등의 요인이 없으면 감염자의 다수를 사망에 이르게 할 정도의 높은 병원성은 없다.

인플루엔자 바이러스는 바이러스 입자 내의 핵단백 복합체의 항원성 차이로부터 A?B?C의 3형으로 분류된다. A형의 인플루엔자 바이러스는 물새, 특히 오리가 기원인 것으로 생각되고 있다. A형 바이러스 입자 표면에는 헤마글루티닌(HA; hemagglutinin)과 뉴라미니다제(NA; neuraminidase)라고 하는 당단백질이 있어, HA에는 16개의 아형이, NA에는 9개의 아형이 존재한다. 오리에서는 HA 아형의 H1형으로부터 H16형까지, NA 아형의 N1형으로부터 N9형까지 모든 조합의 바이러스(144 종류)가 검출되고 있다. 이러한 바이러스가 다른 물새나 집에서 기르는 새, 가축, 야생 동물, 그리고 사람에 감염하여 그 동물 종 사이에 감염을 계속 일으키는 것에 의해, 각각의 종에 적응하여 이들 종 고유의 인플루엔자 바이러스가 되고 있다. 현재, 사람 사이에 유행하고 있는 인플루엔자 바이러스(A/소련형(H1N1) 바이러스, A/홍콩형(H3N2) 바이러스, B형 바이러스)도 모두 물새로부터 사람에 적응한 바이러스로 생각되고 있다.

통상의 사람 인플루엔자 바이러스에 대해서는 매년의 유행에 의해 많은 사람이 면역을 갖고 있기 때문에, 감염되어 증상이 나타났다 하더라도 발열은 며칠 계속되지만 많은 경우 아무 일도 없이 회복된다. 그러나, 조류로부터 사람에 적합화된 신형 인플루엔자 바이러스가 출현하여 유행하는 경우에는, 그 바이러스에 면역을 갖고 있지 않아 전 세계에서 막대한 수의 이환자 발생과 이에 따른 중증자 또는 사망자의 증가도 볼 수 있을 것으로 예상되고 있다.

특히, A형 조류 인플루엔자 바이러스 중에서도 H5N1 아형은, 본래의 숙주인 오리에서는 병원성을 나타내지 않지만, 집에서 기르는 가금류에 감염되었을 경우에는 사망에 이르게 할 정도의 높은 병원성을 나타내는 것이 알려져, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스로 불리고 있다. 게다가 근래에는 가금류에 있어서의 H5N1 아형 바이러스 감염에 의한 인플루엔자의 발생으로부터, 사람에의 감염 사례가 연달아 보고되고 있다. 이러한 상황으로부터, H5N1 아형 조류 인플루엔자 바이러스가 사람에서 사람으로 효율적으로 감염될 수 있도록 변이하여 신형 인플루엔자 바이러스가 되는 것이 염려되고 있다. 따라서, 고병원성인 H5N1 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 가금류, 야생 조류에의 감염 및 조류로부터 사람에의 감염을 조기에 발견하여 적절히 대응하는 것이, 신형 인플루엔자의 발생을 미리 막는 데 있어서 매우 중요한 과제가 되고 있다.

현재, H5N1 아형 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 검사 진단은, 검사대상 물체의 인두?비인두 세척액 또는 배설강 세척액(cloacal swab)으로부터, 바이러스를 분리하여 RT-PCR로서 H5의 유전자를 확인하는 것에 의해 행해지고 있다. 그러나, 이러한 검사 방법에는 특별한 기기 및 기술이 요구되기 때문에, 바이러스 감염이 의심되는 양계장 또는 야외에서 신속하고 간편하게 실시할 수는 없다. 통상의 사람 인플루엔자 바이러스의 감염에 대해서는, 발생 초기에 인플루엔자 바이러스 항원을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피법에 따른 신속 진단 키트가 벌써 보급되어 있다. 그러나, 이러한 키트는 인플루엔자 바이러스의 감염을 다른 바이러스 또는 세균 감염과 식별하기 위한 것으로, 인플루엔자 바이러스가 갖는 단백질 중에서도 비교적 변이가 적은 핵단백질 등을 항원으로서 검출하는 것이다. 이 때문에, 인플루엔자 바이러스의 A형 또는 B형의 식별은 가능하지만, 동일한 아형 내에서 자주 그 항원성을 변화시키는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)에 기초한 아형의 식별은 할 수 없다.

A형 인플루엔자 바이러스의 아형을 식별하기 위해, H5 아형 바이러스의 HA에 대한 단클론 항체를 제작하고 면역 크로마토그래피법에 근거하여 측정을 실시하는 일도 제안되고 있다(특허문헌 1 및 2). 그러나, 이러한 측정에 이용되는 단클론 항체는, H5형 서브타입의 HA를 갖는 H5 아형 바이러스를 광범위하게 인식한다. 또한, H5N1 아형 인플루엔자 바이러스에 대한 단클론 항체로서 2004년에 교토에서 까마귀로부터 분리된 H5N1 아형 바이러스를 면역원으로서 제작된 것도 보고되어 있다(특허문헌 3 및 비특허문헌 1). 그러나, 이러한 단클론 항체의 몇 개는(3C11, 4C12, 3H12 및 3H4) H5N1 아형을 포함한 H5형 서브타입의 HA를 광범위하게 인식하는 것이었다(특허 문헌 3). 그 때문에, 이러한 항체를 이용한 면역 측정 키트는 H5N1 아형뿐 아니라, H5N2 아형, H5N3 아형 등의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스도 검출하여, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형만을 특이적으로 검출할 수 있는 신속 진단 키트는 제공되어 있지 않았다. H5N1 아형 바이러스는 병원성도 높고 치사율도 큰 것이므로, H5N1 아형 바이러스만을 특이적으로 검출하는 신속 진단 키트를 개발하는 것이 강하게 요망되고 있다.

특허문헌 1: 일본 특허공개 2007-261988호 공보 특허문헌 2: 일본 특허공개 2008-196967호 공보 특허문헌 3: 일본 특허공개 2008-104450호 공보

비특허문헌 1: Bioche Biophys Res Commun. 2009 Jan 9;378(2):197-202

본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 신속하고 간편하게 특이적으로 검출하기 위한 면역 측정 키트 및 면역 측정 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 H5N1 아형 바이러스를 신속하고 간편하게 고감도로 특이적으로 검출하기 위한 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 키트 및 검출 방법을 제공한다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, H5N1 아형 바이러스를 면역원으로서 제작한 단클론 항체 4G6는 H5N2 아형 또는 H5N3 아형 바이러스와는 반응하지 않고, H5N1 아형 바이러스에만 특이적으로 결합하는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, 단클론 항체 4G6를 이용한 면역 측정법에 의해 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형만을 특이적으로 검출할 수 있는 것을 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은 면역 크로마토그래피법에서 이용하는 전개액에 비이온성 계면활성제 및 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 첨가하는 것에 의해 검출의 감도를 높일 수 있다는 것도 발견하였다.

즉, 본 발명은 인플루엔자 H5N1 아형 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 면역 측정 키트 및 면역 측정 방법에 관련된다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 H5N1 아형 바이러스를 고감도로 특이적으로 검출할 수 있는 면역 크로마토그래피법에 따른 검출 키트 및 검출 방법에 관련된다.

본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

(1) 제 1 시약을 판정 부위에 갖는 크로마토그래피 매체, 제 2 시약과 표지 물질이 결합한 표지시약 및 전개액을 함유하고, 면역 크로마토그래피법에 따라 시료 중의 피검물질을 검출하기 위한 키트로서, 제 1 시약 및 제 2 시약의 양쪽 모두 또는 어느 하나가 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체인, A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형의 검출 키트.

(2) 제 1 시약이 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체인, (1)에 기재된 검출 키트.

(3) A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체가 H5N1 아형 바이러스의 헤마글루티닌의 59번째 아미노산인 아스파라긴산을 포함하는 입체 구조적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체인, (1) 또는 (2)에 기재된 검출 키트.

(4) H5N1 아형 바이러스의 헤마글루티닌의 59번째 아미노산인 아스파라긴산을 포함하는 입체 구조적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체가 마우스-마우스 하이브리도마 4G6(기탁번호 FERM BP-11130)에 의해서 생산되는 단클론 항체인, (3)에 기재된 검출 키트.

(5) 다른 쪽의 제 1 시약 또는 제 2 시약이 H5N1 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 HA1 도메인의 273-342aa 영역에 존재하는 연속적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체인, (1) 내지 (4)의 어느 하나에 기재된 검출 키트.

(6) H5N1 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 HA1 도메인의 273-342aa 영역에 존재하는 연속적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체가 마우스-마우스 하이브리도마 3H4(기탁번호 FERM BP-11173) 또는 마우스-마우스 하이브리도마 3H12(기탁번호 FERM BP-11174)에 의해서 생산되는 단클론 항체인, (5)에 기재된 검출 키트.

(7) 전개액이 HLB 치가 13?18인 비이온성 계면활성제를 함유하는 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (6)의 어느 하나에 기재된 검출 키트.

(8) 비이온성 계면활성제의 농도가 0.1?1.0%인, (7)에 기재된 검출 키트.

(9) 전개액이 추가로 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 함유하는 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (8)의 어느 하나에 기재된 검출 키트.

(10) 비닐계 수용성 폴리머의 농도가 0.5?2.0%인, (9)에 기재된 검출 키트.

(11) 비닐계 수용성 폴리머가 폴리비닐피롤리돈인, (9) 또는 (10)에 기재된 검출 키트.

(12) 표지 물질이 불용성 담체인, (7) 내지 (11)의 어느 하나에 기재된 검출 키트.

(13) 불용성 담체가 콜로이드상 금 입자인, (12)에 기재된 검출 키트.

(14) 시료를 크로마토그래피 매체에 접촉시키는 공정, 표지시약을 시료와 동시에 또는 시료에 이어서 크로마토그래피 매체에 접촉시키는 공정, 및 전개액에 의해 시료 및 표지시약을 전개하는 공정을 포함하는, (1) 내지 (13)의 어느 하나에 기재된 검출 키트를 이용한, 시료 중의 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 검출하는 방법.

본 발명의 면역 측정 키트는, 저병원성인 H5N2 아형 또는 H5N3 아형과는 교차 반응을 나타내지 않고, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형만을 신속하고 간편하게 특이적으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역 크로마토그래피법에 따른 검출 키트는, H5N1 아형 바이러스를 신속하고 간편하게 실용에 충분한 측정 감도로 특이적으로 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명의 검출 키트를 이용한 2 ng/mL 농도의 H5N1 아형 바이러스의 HA 재조합 단백질(ABR사)의 면역 크로마토그래피법에 의한 검출에 있어서 조성을 변화시킨 전개액을 이용한 경우, 판정 부위에서 면역 크로마토리더에 의해 측정되는 발색 강도를 비교한 그래프이다. 전개액 A 내지 H의 조성은 표 5에 나타낸다. 면역 크로마토리더(하마마츠허트닉스사 제)의 측정치가 20.0 이상인 경우 육안으로도 명확하게 발색을 확인할 수 있다.
도 2는 본 발명의 검출 키트를 이용하여 H5N1 아형 바이러스, H5N2 아형 바이러스, H5N3 아형 바이러스 및 H1N1 아형 바이러스를 검출한 경우, 판정 부위에서 얻어지는 발색 강도를 나타낸 그래프이다. 전개액의 조성은 표 5에 나타낸다. H5N1 아형 바이러스는 10⁴ pfu/mL의 농도에서도 田中귀금속공업사 제 면역 크로마토리더에 의한 측정에서 육안 판정의 기준으로 여겨지는 15.0 이상의 측정치를 나타내었다. 한편, H5N2 아형 바이러스, H5N3 아형 바이러스 또는 H1N1 아형 바이러스는 10⁶ pfu/mL의 농도에서 측정치는 15.0 이하이며, 육안으로는 발색을 확인할 수 없었다.
도 3은, 본 발명의 검출 키트를 이용하여 다양한 헤마글루티닌(HA) 아형 및 뉴라미니다제(NA) 아형을 갖는 인플루엔자 바이러스주를 검출한 경우, 판정 부위에서 얻어지는 발색 강도를 나타낸 그래프이다. 본 발명의 검출 키트에서는 10⁵ pfu/mL의 농도에서 H5N1 아형 바이러스 이외의 바이러스주에서는 교차 반응에 의한 발색을 확인할 수 없었다.

본 발명의 검출 키트는 제 1 시약을 판정 부위에 갖는 크로마토그래피 매체, 제 2 시약과 표지 물질이 결합한 표지시약 및 전개액으로 구성된다. 본 발명의 검출 키트는 항원과 이에 대한 항체에 의한 특이적인 결합 반응을 이용하여 피검물질을 검출하는 면역 크로마토그래피법의 측정 원리에 근거하여, 시료 중 피검물질인 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1(이하, AIV H5N1라고 한다.)을 특이적으로 검출하는 것이다.

본 발명의 크로마토그래피 매체는 모세관 현상을 나타내는 미세 다공성 물질로 이루어지는 불활성의 것으로, 표지시약, 피검물질 등과 반응하지 않는 것이라면 특히 그 소재가 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 폴리불화비닐리덴, 나일론, 니트로셀룰로스 또는 초산셀룰로스 등의 셀룰로스 유도체 등으로 구성되는 섬유상 또는 부직섬유상 매트릭스, 막, 여과지, 유리 섬유 여과지, 옷감, 면 등을 들 수 있다. 바람직한 것은 셀룰로스 유도체나 나일론의 막, 여과지, 유리 섬유 여과지 등이며, 보다 바람직한 것은 니트로셀룰로스 막, 혼합 니트로셀룰로스에스테르(니트로셀룰로스와 초산셀룰로스의 혼합물) 막, 나일론 막, 여과지이다.

크로마토그래피 매체의 형태 및 크기는 특히 제한되는 것이 아니고, 실제의 조작 포인트 및 결과의 관찰 포인트에 대해 적절하면 좋다. 조작을 보다 간편하게 하기 위하여, 판정 부위가 표면에 형성되어 있는 크로마토그래피 매체의 이면에, 플라스틱 등으로 이루어지는 지지체를 마련할 수도 있다. 이 지지체의 성질과 상태는 특히 제한되는 것은 아니지만, 육안 판정에 의해 측정 결과의 관찰을 행하는 경우, 지지체는 표지 물질에 의해 초래되는 색채와 유사하지 않은 색채를 갖는 것이 바람직하고, 통상, 무색 또는 백색인 것이 바람직하다.

크로마토그래피 매체에는, 임의로 피검물질을 포함한 시료를 첨가하기 위한 시료 첨가 부위(샘플 패드 등), 시료 중의 고형 성분을 제거하는 부위(고형 성분 분리 부위 등), 전개액을 첨가하기 위한 전개액 첨가 부위, 판정 부위에 포착되지 않았던 표지시약이나 전개액을 빨아 들이는 흡수 부위(흡수 패드 등), 측정이 정상적으로 행해진 것을 나타내 보이는 대조 부위 등을 집어넣어도 좋다. 이들 부위의 재료는, 모세관 현상에 의해 시료 용액이나 전개액이 이동할 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 일반적으로는 니트로셀룰로스 막, 여과지, 유리 섬유 여과지 등의 복수의 다공성 물질로부터 그 목적에 따른 것을 선택하여 이용하고, 제 1 시약이 고정화된 크로마토그래피 매체와 모세관으로 연결되도록 배치한다.

본 발명에서는, 크로마토그래피 매체에 제 1 시약을 고정화하여 판정 부위를 형성한다. 제 1 시약을 크로마토그래피 매체에 고정화하는 방법으로서는, 제 1 시약을 크로마토그래피 매체에 물리적 또는 화학적 수단에 의해 직접 고정화하는 방법과, 제 1 시약을 라텍스 입자 등의 미립자에 물리적 또는 화학적으로 결합하고, 이 미립자를 크로마토그래피 매체에 포착해 고정화하는 간접 고정화 방법이 있다.

직접적으로 고정화하는 방법으로는, 물리 흡착을 이용할 수도 있고, 공유결합에 의할 수도 있다. 일반적으로 크로마토그래피 매체가 니트로셀룰로스 막 또는 혼합 니트로셀룰로스에스테르 막인 경우 물리 흡착을 실시할 수 있다. 공유결합에서 크로마토그래피 매체의 활성화에는 일반적으로 브롬화시안, 글루타르알데히드, 카보디이미드 등이 이용되지만, 어느 방법이라도 이용할 수 있다. 간접적으로 고정화하는 방법으로는, 불용성 미립자에 제 1 시약을 결합한 후, 크로마토그래피 매체에 고정화하는 방법이 있다. 불용성 미립자의 입경은 크로마토그래피 매체에 포착되지만 이동할 수 없는 크기의 것을 선택할 수 있으며, 바람직하게는 평균입경 10 ㎛ 정도 이하의 미립자이다. 이러한 입자로서 항원 항체 반응에 사용되는 것이 여러 가지 알려져 있다. 본 발명에 있어서는, 감도 조정의 용이함 등으로 인해 직접 고정화가 바람직하다. 또한, 크로마토그래피 매체로의 제 1 시약의 고정화에는 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마이크로시린지, 조절 펌프 펜, 잉크 분사 인쇄 등 여러 가지 기술이 사용 가능하다. 판정 부위의 형태로서는 특히 한정되지 않지만, 원형의 스포트, 크로마토그래피 매체의 전개 방향으로 수직 연장되는 라인, 숫자, 문자나 ＋, － 등의 기호 등으로 고정화할 수도 있다.

또한, 필요에 따라 제 1 시약을 고정화한 후의 크로마토그래피 매체에 블로킹 처리를 실시할 수도 있다. 블로킹 처리에 이용할 수 있는 블로킹제로서는, 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 젤라틴 등의 단백질 외, Blocking Peptide Fragment(TOYOBO)나 친수성 고분자 폴리머 등의 시판 블로킹제를 들 수 있다.

본 발명의 표지시약은, 표지 물질에 제 2 시약을 결합하여 구성한다. 표지 물질로는 효소 또는 불용성 담체를 이용할 수 있다. 효소로서는 알칼리포스파타제, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스옥시다제 등이 있고, 각각의 효소에 대응하는 공지의 발색 기질과 함께 사용할 수 있다. 불용성 담체로서는 금, 은, 백금과 같은 콜로이드상 금속 입자, 산화철과 같은 콜로이드상 금속산화물 입자, 유황 등의 콜로이드상 비금속 입자 및 합성 고분자로 이루어지는 라텍스 입자, 그 밖의 것을 이용할 수 있다. 콜로이드상 금속 입자 및 콜로이드상 금속산화물 입자에는, 예를 들면, 콜로이드상 금 입자, 콜로이드상 은 입자, 콜로이드상 백금 입자, 콜로이드상 산화철 입자, 콜로이드상 수산화알루미늄 입자 등을 들 수 있다. 특히, 콜로이드상 금 입자와 콜로이드상 은 입자가 적당한 입경에서 콜로이드상 금 입자는 적색, 콜로이드상 은 입자는 황색을 나타내는 점에서 바람직하다. 이러한 콜로이드상 금속 입자의 평균 입경은 1 ㎚?500 ㎚, 특히 강한 색조를 얻을 수 있는 10 ㎚?150 ㎚인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 40 ㎚?100 ㎚의 범위 내이다. 라텍스 입자로는, 예를 들어 스티렌과 메타크릴산의 공중합체, 스티렌과 이타콘산의 공중합체 등을 들 수 있다. 이러한 라텍스 입자의 평균 입경은 50 ㎚?500 ㎚의 범위 내인 것이 바람직하다. 본 발명의 표지시약에 사용되는 표지 물질로는 불용성 담체가 바람직하고, 또한 콜로이드상 금속 입자가 바람직하고, 특히 콜로이드상 금 입자가 바람직하다.

콜로이드상 금속 입자로서, 예를 들어 콜로이드상 금 입자를 이용하는 경우에는 시판되는 것을 이용할 수 있다. 또는, 상법, 예를 들어 염화금산을 구연산나트륨으로 환원하는 방법에 의해 콜로이드상 금 입자를 조제할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 제 2 시약을 표지 물질로 표지화하는 방법으로는, 물리 흡착이나 화학 결합 등의 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 제 2 시약을 콜로이드상 금 입자로 표지화하는 경우, 금 입자가 콜로이드상으로 분산된 용액에 제 2 시약인 항체를 가하여 물리 흡착시킨 후, 우혈청 알부민 용액이나 전술의 시판 블로킹제 등을 첨가하여 항체기 미결합된 입자 표면을 블로킹하는 것에 의해 조제한다.

본 발명의 제 1 시약 또는 제 2 시약으로 이용할 수 있는 항체는, 피검물질인 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형과 결합하는 항체이다. 이와 같은 항체라면, 다클론 항체 또는 단클론 항체 어느 것이나 이용할 수 있지만, 제 1 시약 또는 제 2 시약의 어느 하나, 보다 바람직하게는 양쪽 모두 단클론 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 이들 항체는 크로마토그래피 매체로의 고정화 또는 표지 물질과의 결합에 있어서, Fab 또는 F(ab')₂ 등의 결합성이 있는 단편으로서 이용할 수도 있다. 본 발명의 제 1 시약 또는 제 2 시약으로서 이용하는 항체가 AIV H5N1에 결합 가능하다면, 크로마토그래피 매체의 판정 부위에 있어서 AIV H5N1의 존재를 검출할 수 있다. 그러나, 저병원성인 H5N2 아형 또는 H5N3 아형 등의 다른 아형 바이러스와는 교차 반응을 나타내지 않고, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형만을 특이적으로 검출하기 위해서는, 제 1 시약 및 제 2 시약의 어느 하나 또는 양쪽 모두에 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하는 것이 바람직하다.

A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체란, 면역 형광 분석(IFA), 웨스턴 블로팅 등의 수법에 의해, AIV H5N1, AIV H5N1가 감염된 세포 또는 AIV H5N1의 헤마글루티닌 단백질 등의 AIV H5N1 항원에는 반응하지만, AIV H5N2 또는 AIV H5N3 등의 다른 아형 바이러스 항원과는 반응성을 나타내지 않는 항체이다. AIV H5N1 항원과의 결합성과 다른 아형 바이러스로의 결합성을 비교한 실험에서, 보다 저농도의 AIV H5N1에만 특이적인 반응성을 나타내는 항체라면 본 발명의 항체로서 매우 적합하게 이용할 수 있다. 보다 바람직하게는, AIV H5N1에서만 발견할 수 있는 연속적인 아미노산 배열로 이루어지는 에피토프 또는 입체 구조적인 에피토프를 인식하는 항체를 이용할 수 있다. AIV H5N1에만 특이적으로 존재하는 것이 확인된 에피토프로서는, AIV H5N1의 표면 단백질인 헤마글루티닌의 59번째 아미노산인 아스파라긴산을 포함한 입체 구조적인 에피토프를 들 수 있다. HA의 59번째 Asp는 2003년부터 현재에 이르기까지 유행하고 있는 AIV H5N1주의 사이에서 고도로 보존되고 있다(1813주/1870주). 한편, AIV H5N2 및 AIV H5N3에서는 HA의 59위에 Asp를 가지는 바이러스주는 알려지지 않았다. 이처럼 AIV H5N1에 특이적으로 존재하는 것이 확인된 에피토프를 인식하는 항체가 본원 발명의 항체로서 바람직하고, 구체적인 예로서는, 마우스-마우스 하이브리도마 4G6(기탁번호 FERM BP-11130)가 생산하는 단클론 항체 4G6를 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 AIV H5N1에 특이적인 항체는, AIV H5N1 항원을 특이적으로 인식하는 한에 있어서는, 항체의 공급원, 또는 그것이 제작되는 양식에 대하여 한정하는 것은 의도하지 않는다. 또한, AIV H5N1에 특이적인 에피토프에 대해서 특이적인 반응성을 가지는 한, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 Fv 등의 단편(fragment)도 이용할 수 있어, 항체의 가변 영역의 CDR 부분과 FR 부분의 유래가 다를 수도 있다.

본 발명에서 이용되는 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체는, 파라포름알데히드 등으로 비활성화시킨 AIV H5N1, AIV H5N1가 감염된 MDCK 세포 등의 세포, 또는 AIV H5N1에서 유래하는 HA 유전자를 발현시킨 형질전환 세포, 또는 AIV H5N1로부터 정제된 HA 단백질 또는 재조합 단백질 등을 면역원으로서 마우스, 토끼 등 공지의 면역 동물에 투여하는 것에 의해 제작할 수 있다. 본 발명의 항체로서 매우 적합한 AIV H5N1에서 유래하는 HA의 59번째의 아미노산인 아스파라긴산을 포함하는 입체 구조적인 에피토프를 인식하는 항체를 제작하는 경우에는, 상기 면역원 외에 H5N1 HA의 Asp 59를 포함하는 H5N1 HA와 다른 아형 바이러스에서 유래하는 HA로 이루어지는 키메라 HA를 발현하는 형질전환 세포 또는 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 H5N1 HA를 발현하는 형질전환 세포 등도 면역원으로서 이용할 수 있다. 또한, 파아지 디스플레이 등에 의한 시판 펩티드 라이브러리 키트를 항체 4G6로 스크리닝하는 것에 의해 4G6의 에피토프를 모방하는 펩티드를 얻을 수 있으므로, 이것을 면역원으로서 이용할 수도 있다.

항체를 단클론 항체로 얻는 경우에는, 면역원을 투여한 면역 동물로부터 비장 세포를 채취하고 공지의 표준적인 수법을 이용해서 골수종(myeloma) 세포와 융합하여 항체 생산 하이브리도마를 제작한다. 또는, 항체 유전자의 라이브러리를 AIV H5N1 항원으로 스크리닝하는 것에 의해, 하이브리도마를 제작하지 않고 단클론 항체를 얻을 수도 있다. 단클론 항체의 취득에 이용되는 라이브러리로는, 항체 단백질과 이를 코딩하는 유전자가 디스플레이 기술에 의해 1 대 1로 대응할 수 있어, 목적으로 하는 항원에 대해서 스크리닝하는 것에 의해 즉시 원하는 항체의 유전자를 취득할 수 있다. 디스플레이 기술로서는, 파아지 디스플레이가 대표적인 것이고, 이스트 디스플레이, 박테리아 디스플레이 등의 세포를 이용하는 방법 외에도 cDNA 디스플레이, mRNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이 등의 무세포 번역계를 이용하는 방법도 알려져 있다.

A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체를 스크리닝하는 방법으로는, AIV H5N1, AIV H5N1가 감염된 세포 또는 AIV H5N1의 HA 등을 항원으로 이용한 면역 형광 분석(IFA), 웨스턴 블롯팅 등에 의해 다른 아형 바이러스와 비교하여 AIV H5N1 항원에 의해 강한 반응성을 나타내는 항체를 선택하는 방법을 들 수 있다. 특히, H5N1 HA의 Asp 59를 포함하는 입체 구조적인 에피토프를 인식하는 항체를 스크리닝하기 위해서는, AIV H5N1 또는 AIV H5N1가 감염된 세포 등의 HA 단백질의 입체 구조를 보관 유지하고 있는 것을 항원으로 이용하여, 하이브리도마의 배양 상등액 또는 라이브러리의 멤버가 항체 4G6와 항원의 결합을 저해하는 활성을 지표로서 항체를 선택할 수 있다. 다른 스크리닝 방법으로는, H5N1에서 유래하는 HA를 발현하는 형질전환 세포와, 당해 HA의 Asp 59를 다른 아미노산으로 치환한 H5N1 HA 변이체를 발현하는 형질전환 세포를 이용하여, Asp 59를 갖는 H5N1 HA를 발현하는 세포에의 특이적인 반응성을 지표로 하여 항체를 스크리닝할 수도 있다.

AIV H5N1에 특이적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체의 하나인 항체 4G6는 다음과 같이 제작하였다. A/crow/Kyoto/53/2004 H5N1 바이러스를 20% 수크로스 쿠션과 함께 초원심분리법(25,000 rpm, 1시간)으로 정제하고 4% 파라포름알데히드로 고정한 것을 항원으로서, 프로인트 완전 보조제(adjuvant)와 함께 BALB/c 암컷 마우스에 투여하여 최초의 면역을 실시하였다(2×10⁷ TCI D₅₀/마우스). 2주일 후, 보조제를 포함하지 않는 비활성화 비리온으로 마우스를 부스터 면역시켰다. 2번째의 부스터 면역으로부터 3일 후, 면역시킨 마우스로부터 비장 세포를 채취하여 공지의 표준적인 수법을 이용해서 PAI 골수종 세포와 융합하였다. 10?15일 후, 항체 생산 하이브리도마 클론을, AIV H5N1가 감염된 MDCK 세포를 항원으로 이용한 면역 형광 분석(IFA)에 의해서 선택하였다. 항체 4G6는 H5N1 바이러스가 감염된 MDCK 세포를 인식하였으나, H5N2 바이러스 또는 H5N3 바이러스가 감염된 MDCK 세포는 인식하지 않았다. 또한, 항체 4G6가 H5N1 아형 바이러스에서 유래하는 HA 단백질을 인식하는 것을 확인하기 위하여, 클레이드 2.5(A/crow/Kyoto/53/2004) 뿐만 아니라 클레이드 1(A/Thailand/Kan353/2004)의 H5N1 바이러스로부터 PCR로 증폭한 HA 유전자를 pPolI 플라스미드에 클로닝하고, 발현 플라스미드 pCAGGS에 클로닝한 PB2, PB1, PA 및 NP 유전자와 함께 293T 세포에 형질감염시켜 H5N1-HA 발현 세포를 제작하였다. 항체 4G6는 어떠한 H5N1-HA 발현 293T 세포라도 인식하였다.

항체 4G6의 인식 에피토프를 상세하게 해석하기 위해, H5N1-HA 및 H5N3-HA 유래의 6 개 키메라 pPolI-HA 플라스미드를, H5N1-HA 및 H5N3-HA의 1-86 aa, 1-194 aa 또는 1-340 aa의 도메인을 교환하는 것으로 구축하였다. 일련의 pPolI-키메라 HA 플라스미드를 pCAGGS-PB2, -PB1, -PA 및 ?NP와 함께 293T 세포에 형질감염시키고 세포를 고정하여 IFA의 항원으로서 이용하였다. 항체 4G6는 H5N1-HA (1-86 aa) -H5N3-HA (87-567 aa) 키메라 HA, H5N1-HA (1-194 aa) -H5N3-HA (195-567 aa) 키메라 HA 및 H5N1-HA (1-340 aa) -H5N3-HA (341-567 aa) 키메라 HA를 발현하는 293T 세포를 인식하였으나, H5N3-HA (1-86 aa) -H5N1-HA (87-567 aa) 키메라 HA, H5N3-HA (1-194 aa) -H5N1-HA(195-567 aa) 키메라 HA 및 H5N3-HA (1-340 aa) -H5N1-HA (341-567 aa) 키메라 HA를 발현하는 293T 세포는 인식하지 않았다. 즉, 항체 4G6는, H5N1에서 유래하는 HA의 1-86 aa 영역의 입체 구조적인 에피토프와 결합하였다. A/crow/Kyoto/53/2004(H5N1), A/Thailand/Kan353/2004(H5N1), A/Duck/Hong Kong/342/78(H5N2) 및 A/Duck/Hong Kong/820/80(H5N3) 각각의 HA의 1-86 aa 영역에 있어서 추정 아미노산 서열의 얼라인먼트(alignment)를 실시하여, H5N1 HA에 있어서 H5N2 HA 및 H5N3 HA와는 아미노산이 다른 부위가 3개 발견되었다(51, 59 및 61 위치). 여기에서, 이들 부위의 H5N1 아형의 아미노산을 각각 H5N2 아형 또는 H5N3 아형의 대응하는 아미노산과 동일하게 되도록 치환한, 1 아미노산 치환 변이 HA 단백질(K51R, D59S 또는 D61N)을 제작하여 293T 세포로 발현시켰다. 이 발현 세포에 대하여 IFA를 실시한 결과, 항체 4G6는 H5N1 HA의 51 위치의 Lys를 Arg로 치환한 변이체 및 61 위치의 Asp를 Asn로 치환한 변이체를 인식하였지만, H5N1 HA의 59 위치의 Asp를 Ser로 치환한 변이체는 인식하지 않았다. 이로부터, 항체 4G6는 H5N1 아형 바이러스의 HA의 59번째 아미노산인 아스파라긴산을 포함한 입체 구조적인 에피토프를 인식하는 항체인 것으로 나타났다.

단클론 항체 4G6를 생산하는 마우스-마우스 하이브리도마 4G6는 일본 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1 초메 1 번지 1 중앙 제6(우편번호 305-8566)의 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁일 2009년 5월 21일, 기탁번호 FERM BP-11130으로 기탁되어 있다.

A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체는 AIV H5N1를 특이적으로 검출하는 응집법, 방사 면역 측정법, 효소 면역 측정법 및 면역 크로마토그래피법 등의 공지의 면역 측정법에 이용할 수 있다. 특히, 면역 크로마토그래피법에 있어서는 크로마토그래피 매체의 판정 부위를 형성하는 제 1 시약으로서, 또는 표지시약을 구성하는 제 2 시약으로서 양쪽 또는 어느 한쪽에 매우 적합하게 이용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 크로마토그래피 매체의 판정 부위에서 피검물질인 AIV H5N1를 효율적으로 포착하기 위하여 AIV H5N1를 특이적으로 인식하는 항체를 제 1 시약으로 이용할 수 있다.

AIV H5N1를 특이적으로 인식하는 항체를 면역 크로마토그래피법의 제 1 시약 또는 제 2 시약으로 이용하는 경우, 다른 쪽의 제 1 시약 또는 제 2 시약은 AIV H5N1와 결합할 수 있는 항체라면 어느 것이라도 이용할 수 있고, 이들 항체는 다른 아형 바이러스와 반응성을 나타내는 항체일 수도 있다. 바람직한 항체로서는 피검물질의 AIV H5N1와 이것을 특이적으로 인식하는 항체와의 결합을 저해하지 않는 항체를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 AIV H5N1에 특이적인 항체가 인식하는 에피토프와 다른 에피토프를 인식하는 항체일 수 있다. 이러한 항체로서는, 예를 들어 AIV H5N1 헤마글루티닌의 HA1 도메인의 273-342 aa 영역에 존재하는 연속적인 아미노산 서열을 인식하는 항체 등을 들 수 있다.

AIV H5N1에 결합하는 항체는, H5 아형 서브타입을 갖는 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 감염 세포 등을 면역원으로 하여 공지의 표준적인 방법으로 제작할 수 있다. 또한, AIV H5N1 헤마글루티닌의 HA1 도메인의 273-342 aa 영역에 존재하는 연속적인 서열을 인식하는 항체는, 마우스-마우스 하이브리도마 3C11, 4C12, 3H4 및 3H12가 생산하는 항체로서 얻을 수도 있다(특허문헌 3). 이들 하이브리도마 중에 3C11과 4C12는 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 각각 기탁번호 FERM P-21027, FERM P-21028로 기탁되어있다. 또한, 3H4와 3H12는 일본 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1 초메 1 번지 1 중앙 제6(우편번호 305-8566)에 있는 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁일 2006년 9월 20일, 기탁번호 각각 FERM P-21029, FERM P-21030으로 기탁된 후, 2009년 8월 20일자로 각각 기탁번호 FERM BP-11173, FERM BP-11174로서 국제 기탁에 이관되어 있다.

본 발명의 전개액은 면역 크로마토그래피법에 있어서 이동상을 구성한다. 면역 크로마토그래피법에서는 크로마토그래피의 원리를 응용하여, 피검물질과 결합한 표지시약과 미결합의 표지시약을, 피검물질을 포착 가능한 고정상과 이에 접하여 연속적으로 흐르는 이동상으로 이루어지는 계를 이용하여 분리한다. 전개액은 모세관 현상을 나타내는 미세 다공성 물질로 이루어지는 크로마토그래프 매체 중에 피검물질 및 표지시약을 이동(전개)시키기 위하여 이용된다.

본 발명의 전개액은 통상 물을 용매로 하여 인산염, 트리스하이드록시메틸아미노메탄 염산염, HEPES, 굿 등의 완충제, 염화나트륨 등의 무기염을 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 필요에 따라, 소혈청 알부민(BSA) 등의 단백질 성분(함유량은 통상 0.01 중량%?10 중량%), 방부제 등을 포함할 수도 있다. 본 발명에서 이용되는 전개액은 추가로 비이온성 계면활성제를 함유하고, 보다 바람직하게는 추가로 폴리비닐피롤리돈을 대표로 하는 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 함유한다.

전개액에 첨가하는 비이온성 계면활성제로서, 바람직하게는 HLB 값이 10?18, 한층 더 바람직하게는 HLB 값이 13?18의 폴리옥시에틸렌계 계면활성제를 이용할 수 있다. 바람직한 폴리옥시에틸렌계 계면활성제의 예로서는, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(상품명 「Tween」 시리즈), 폴리옥시에틸렌 p-t-옥틸페닐 에테르(상품명 「Triton」 시리즈), 폴리옥시에틸렌 p-t-노닐페닐 에테르(상품명 「Triton N」 시리즈) 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 「Tween」 시리즈에서는 특히 Tween 20(상품명)(HLB 값 16.7), Tween 40(상품명)(HLB 값 15.6), Tween 60(상품명)(HLB 값 15.0), Tween 80(상품명)(HLB 값 14.9), 「Triton」 시리즈에서는 특히 Triton X-100(상품명)(HLB 값 13.5), Nonidet P-40(상품명)(HLB 값 13.1), Triton X-102(상품명)(HLB 값 14.6), Triton X-165(상품명)(HLB 값 15.8), Triton X-405(상품명)(HLB 값 17.9), 「Triton N」 시리즈에서는 특히 Triton N-101(상품명)(HLB 값 13.5), Triton N-111(상품명)(HLB 값 13.8), Triton N-150(상품명)(HLB 값 15.0) 등을 들 수 있다. 이들 비이온성 계면활성제는 단독으로도 2종 이상을 혼합하여 이용할 수도 있다. 상기 비이온성 계면활성제의 함유량은 특히 한정되지는 않지만, 전개액 전체 중량에 대하여 0.01?10.0 중량%의 범위이며, 바람직하게는 0.1?5.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.1?1.0 중량%, 한층 더 바람직하게는 0.3?1.0 중량%의 범위이다.

전개액에 추가로 첨가하는 비닐계 수용성 폴리머로서는, 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머가 바람직하고, 비닐알코올, 비닐메틸에테르, (메타)아크릴산, 히드록시알킬(메타)아크릴레이트, (메타)아크릴아미드, 디메틸(메타)아크릴아미드, 비닐피롤리돈 등의 산소 원자 함유 극성기를 갖는 수용성 비닐계 모노머의 이중 결합이 개열된 구조 단위를 갖는 폴리머를 들 수 있다. 보다 바람직하게는 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 수용성 비닐계 모노머, 한층 더 바람직하게는 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비이온성 수용성 비닐계 모노머 및 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비이온성 수용성 비닐계 모노머의 이중 결합이 개열된 구조 단위를 갖는 폴리머를 들 수 있다. 특히 바람직한 것으로서는, 비닐피롤리돈의 이중 결합이 개열된 구조 단위를 가지는 폴리머를 들 수 있다.

이들 비닐계 수용성 폴리머는 본 발명의 효과가 손상되지 않는 정도로, 초산비닐, 알킬(메타)아크릴레이트 등의 다른 비닐계 모노머가, 예를 들어 50 몰% 이하, 바람직하게는 30 몰% 이하, 특히 바람직하게는 15 몰% 이하의 비율로 공중합 된 것일 수도 있다.

바람직한 구체예로서는, 폴리비닐피롤리돈(이하, PVP라고도 한다.), 디메틸아크릴아미드/비닐피롤리돈 공중합체(디메틸아크릴아미드의 공중합 비율이 50 몰% 이하의 것), 비닐알코올/비닐피롤리돈 공중합체(비닐알코올의 공중합 비율이 50 몰% 이하의 것), 초산비닐/비닐피롤리돈 공중합체(초산비닐의 공중합 비율이 20 몰% 이하의 것)등을 들 수 있다.

이들 비닐계 수용성 폴리머의 분자량은 통상 1만?100만, 특히 10만?100만인 것이 바람직하고, 20만?50만인 것이 보다 바람직하다. 또한, 비닐계 수용성 폴리머의 농도는, 전개액 전체의 중량에 대해서 0.01?5.0 중량%인 것이 바람직하고, 0.1?3.0 중량%, 또는 0.5?2.0 중량%인 것이 보다 바람직하다.

선 출원(일본 특허출원 2008-182630호)에서는, 면역 크로마토그래피법의 전개액의 조성과 측정 감도의 관계가 상세하게 검토되어 있다. 이 출원 전체의 내용을 참고 문헌으로서 본원의 명세서에 도입한다.

선 출원의 명세서 중에서는, 피검물질로서 인플루엔자 바이러스 핵단백질 또는 사람 헤모글로빈 단백질을 검출하는 면역 크로마토그래피법에서 검토가 행하여졌다. 비이온성 계면활성제인 Tween 20를 전개액에 첨가하면 측정 감도가 상승하고, 또한 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머인 PVP를 전개액에 첨가하면 그 효과가 증강되었다. 한편, 이온성 계면활성제인 콜산나트륨을 전개액에 첨가한 경우 유의적인 측정 감도의 상승은 볼 수 없었다. 또한, 수용성 폴리머로서 카복시메틸셀룰로오스 나트륨(CMC?Na) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용한 경우에는 피검물질을 포함하지 않는 음성 시료에 대해 현저한 비특이적 반응이 있었다. 전개액에 첨가된 비이온성 계면활성제 및 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머가 발휘하는 효과는, 피검물질이 사람 헤모글로빈 단백질인 면역 크로마토그래피법의 경우에도 마찬가지로 발휘된다. 전개액에 비이온성 계면활성제 및 PVP로 대표되는 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 첨가한 것에서, 피검물질을 포함하는 양성 시료를 측정한 경우 판정 부위에서의 발색 강도(시그널)는 증강하지만, 피검물질을 포함하지 않은 음성 시료를 측정한 경우의 발색 강도(노이즈)는 억제되어, 양호한 시그널/노이즈 비를 얻을 수 있었다. 전개액 중의 비닐계 수용성 폴리머의 농도는, 비이온성 계면활성제의 존재하(예를 들어 0.05 중량% Tween 20 및 0.3 중량% Triton X-100)에, 0.3 중량%로 유의적인 감도의 상승이 관찰되고, 0.6 중량% 및 1.5 중량%로 이용한 경우에는 그 효과가 현저하였다. 이러한 결과를 정리해 다음의 표 1에 나타낸다.

수용성 고분자	계면활성제	핵단백농도（ng/mL）				S/N
수용성 고분자	계면활성제	0	5	10	50	S/N
ＰＶＰ	Ｔｗｅｅｎ　２０	－	＋	＋	＋＋＋	＋＋＋
ＰＶＰ	없음	－	－	±	＋＋	＋＋
없음	Ｔｗｅｅｎ　２０	－	－	±	＋＋	＋＋
없음	없음	－	－	－	＋	＋
ＣＭＣ?Ｎａ	Ｔｗｅｅｎ　２０	＋＋	＋＋	＋＋	＋＋＋	＋
ＰＶＰ	Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００	－	＋	＋	＋＋＋	＋＋＋
ＰＥＧ	Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００	＋＋	＋＋	＋＋	＋＋＋	＋
ＰＶＰ	콜산 Na	－	－	±	＋	＋
ＰＶＰ	Ｔｗｅｅｎ　２０　＋　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００	－	＋	＋＋	＋＋＋	＋＋＋

이와 같은 비이온성 계면활성제나 비닐계 수용성 폴리머에 의한 시그널/노이즈 비의 향상에 대한 상세한 이유는 분명하지는 않지만, 다음과 같은 이유를 생각할 수 있다.

면역 크로마토그래피법의 표지시약에 표지 물질로서 라텍스 입자 또는 콜로이드상 금속 입자 등의 불용성 담체가 이용되는 경우, 이들 입자의 표면은 음으로 하전되어 있는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 일본 특개평5-133956호 공보 참조). 예를 들어, 콜로이드상 금속 입자에서는, 그 제조 과정에서 첨가되는 환원제 유래의 음이온이 그 표면에 흡착하고 있어 상호의 응집이 방해되어 분산된 상태를 유지하고 있다. 그리고, 이 상태의 콜로이드상 금속 입자에 표면 전하를 중화시키지 않는 정도의 저농도의 계면활성제를 첨가하면, 입자가 사슬상으로 몇 개 정도 응집하는 것이 알려져 있다(일본 특개2006-58781호 공보). 본 발명에서 이용되는 전개액은 비이온성 계면활성제에 더하여, 입자의 분산제로도 알려진 비닐계 수용성 폴리머를 함유한다. 그리고, 양자의 효과의 밸런스에 의해, 크로마토그래피 매체 상의 판정 부위에 있어서 간접적으로 포착된 불용성 담체가 몇 개 정도 응집하는 것에 의해, 판정 부위에서 관찰되는 양성 시그널의 증폭이 일어나는 것은 아닌가 생각할 수 있다. 특히, 콜로이드상 금속 입자에 있어서, 응집에 의하여 판정 부위에 축적되는 입자의 수가 증가하는 것에 의해 육안 판정되는 발색 강도가 증강할 뿐만 아니라, 입자의 광흡수 스펙트럼 특성이 변화하는 것에 의해 판정 부위에 있어서 보다 명료한 양성 시그널을 얻을 수 있다고 생각되고 있다.

본 발명의 검출 키트는, 시료 중에 피검물질인 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형이 포함되는 경우, 특이적으로 이를 검출할 수 있다. 본 발명의 검출 키트에 적용할 수 있는 시료로서는, H5N1 아형 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 것이면 특히 제한되지 않는다. 사람, 돼지, 말 등의 포유류에서는 인플루엔자 바이러스가 주로 기도에 감염하지만, 조류에 있어서는 기도 및 장관(대장)에의 감염이 인정된다. 따라서, 바람직한 시료로서는 상기도의 바이러스 감염의 진단에 적절한 비강 세척액, 인후 세척액, 기도 세척액 이외에, 조류로부터 채취되는 경우, 총배설구 세척액(cloacal swab) 및 배설물 등을 들 수 있다. 또한, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 사망한 것으로 의심되는 동물에 대해 시험하는 경우에는, 상기의 시료 이외에 뇌, 비장, 심장, 폐, 췌장, 간장, 신장을 포함하는 대표적인 내장 기관 및 해당 동물의 음료수 등도 매우 적합한 시료로서 이용된다. 바이러스 감염의 진단을 위하여 검출 키트에 적용되는 시료는 인플루엔자의 임상 증상 발현 후 3일 이내에 채취된 것이 바람직하다.

시료가 액체인 경우에는 크로마토그래피 매체에 직접 적용할 수도 있지만, 통상적으로 시료는 전개액에 현탁 또는 희석하여 크로마토그래피 매체에 접촉시킨다.

본 발명의 검출 키트를 이용하여 피검물질을 검출하는 방법으로서는, 예를 들어 이하와 같은 조작을 한다.

본 발명의 일 태양으로서, 피검물질을 포함하는 시료 용액을 미리 표지시약과 혼합하여 액상 중에서 피검물질-표지시약 복합체를 형성한 후, 크로마토그래피 매체와 접촉시킨다. 시료 용액과 함께 또는 나중에, 전개액을 크로마토그래피 매체와 접촉시킨다. 전개액은 이동상을 구성하여 피검물질-표지시약 복합체와 함께 이동(전개)한다. 피검물질-표지시약 복합체가, 크로마토그래피 매체의 판정 부위를 이동할 때, 고정화된 제 1 시약이 이것을 포착하고, 표지시약이 간접적으로 판정 부위에 결합하게 된다. 판정 부위에 존재하는 표지시약을, 표지 물질이 불용성 담체인 경우에는 직접, 표지 물질이 효소인 경우에는 기질을 작용시켜 반응 산물에 대하여 육안 또는 농도계 등에 의해 발색 강도의 확인을 시행하는 것에 의해 검출 또는 정량할 수 있다.

본 발명의 다른 태양에서는, 표지시약을 크로마토그래피 매체에 있어서의 이동상의 전개 이동 경로상, 즉 전개액이 적용되는 단부와 판정 부위와의 사이의 영역에 존재시킬 수도 있다. 크로마토그래피 매체에 표지시약을 존재시키는 경우, 표지시약이 전개액에 신속하게 용해하여 모세관 작용에 의해서 자유롭게 이동할 수 있도록 표지시약을 지지시키는 것이 바람직하다. 지지시키는 부위에는, 이들 시약의 재용해성을 양호하게 하기 위해 사카로스, 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스 등의 당류, 만니톨 등의 당 알코올을 첨가하여 도포하거나, 이들 물질을 미리 코팅하거나 할 수도 있다. 표지시약을 도포하고 건조하는 것에 의해 크로마토그래피 매체에 존재시키는 경우에는, 크로마토그래피 매체에 직접 실시할 수도 있고, 다른 다공성 물질, 예를 들어 셀룰로스 여과지, 유리 섬유 여과지, 나일론 부직포에 도포, 건조하여 표지시약 보관 유지 부재를 형성한 후, 제 1 시약이 고정화된 크로마토그래피 매체와 모세관으로 연결되도록 배치할 수도 있다.

본 발명자 등은, 본 발명의 검출 키트의 일례로서 단클론 항체 3H4, 3H12 및 4G6를 제 1 시약 또는 제 2 시약으로 이용하여 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형의 검출을 행하였다. 전개액으로는 비이온성 계면활성제를 함유하는 전개액(전개액 A, 표 5 참조)을 이용하였다. 시료의 첨가 후 15 분의 시점에서 육안 판정한 결과를 다음의 표 2?4에 나타낸다.

H5N1 아형 바이러스（10⁶pfu/mL）
		제 1 시약
		3H4	3H12	4G6	Pab
제 2 시약	3H4	±	±	＋	±
	3H12	±	±	＋	－
	4G6	＋	＋	－	－
	Pab	－	－	－	＋＋

H5N1 아형 바이러스（10⁴pfu/mL）
		제 1 시약
		3H4	3H12	4G6	Pab
제 2 시약	3H4	－	－	－	－
	3H12	－	－	－	－
	4G6	－	－	－	－
	Pab	－	－	－	＋

H1N1 아형 바이러스（10⁶pfu/mL）
		제 1 시약
		3H4	3H12	4G6	Pab
제 2 시약	3H4	－	－	－	－
	3H12	－	－	－	－
	4G6	－	－	－	－
	Pab	－	－	－	＋

본 발명의 검출 키트는 10⁶ pfu/mL 농도의 H5N1 아형 바이러스를 검출할 수 있는 한편, 10⁶ pfu/mL 농도의 H1N1 아형 바이러스는 검출하지 않았다. 이와 같이, 제 1 시약 또는 제 2 시약에 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 인식하는 항체를 이용하는 경우에는 H5N1 아형 바이러스를 검출하는 것이 가능하게 되고, 특히 제 1 시약 또는 제 2 시약으로서 항체 4G6를 이용하는 경우에는 현저한 특이성이 인정되었다. 게다가 본 발명의 검출 키트는, 10⁶ pfu/mL 농도의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N2 아형 및 H5N3 아형에도 교차 반응성을 나타내지 않았다(도 2 참조). 한편, 비교 대조로서 제 1 시약 및 제 2 시약에 AIV H5N1를 면역원으로서 제작한 다클론 항체(Pab)를 이용하는 경우, H5N1 아형 바이러스 뿐만 아니라, H1N1 아형 바이러스도 검출되어 AIV H5N1만을 특이적으로 검출할 수 없었다. 이와 같이, 제 1 시약 및/또는 제 2 시약에 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하는 본 발명의 검출 키트, 바람직하게는 제 1 시약 및/또는 제 2 시약으로 항체 4G6를 이용하는 본 발명의 검출 키트는, AIV H5N1를 특이적으로 검출 가능했다.

또한, 본 발명자 등은 검출 키트의 측정 감도를 향상시키기 위해 검출 키트를 구성하는 전개액에 주목하고, 전개액의 조성에 대하여 검토를 행하였다. 본 발명의 검출 키트에서는, 측정 대상을 10⁶ pfu/mL 농도의 AIV H5N1로부터, 200 ng/mL 농도의 H5N1 아형 바이러스의 HA 재조합 단백질(ABR사)에 대해서도, 동일한 특이적인 검출 결과를 얻을 수 있는 것으로 밝혀졌으므로, 전개액의 검토에 대해서는 피검물질로서 H5N1 아형 바이러스 대신 2 ng/mL 농도(10⁴ pfu/mL 농도의 AIV H5N1 상당)의 H5N1 형 서브타입의 HA 재조합 단백질을 이용하였다. 또한, 제 1 시약 및 제 2 시약의 조합의 대표적인 것으로서, 제 1 시약에 항체 4G6를, 제 2 시약에 항체 3H4를 선택하였다.

앞서의 검토에서는, 비이온성 계면활성제를 포함한 전개액으로서 120 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl에 0. 7 중량% 소혈청 알부민(BSA), 0.3 중량% TritonX-100, 0.1 중량% Tween 20을 가한 것(전개액 A)를 이용하였다. 이 전개액에, 새로운 첨가제로서 폴리비닐피롤리돈을 이용하는 것을 검토하였다. 결과를 표 5 및 도 1에 나타낸다.

이러한 결과로부터도 명확한 바와 같이, 전개액을 조정하는 것에 의해 현재 시판되고 있는 사람 인플루엔자 감염의 신속 진단 키트의 측정 감도인, 시료 첨가 후 15 분의 시점에서 10⁴ pfu/mL 농도의 바이러스를 육안 판정할 수 있다는 감도에서, H5N1 아형 바이러스의 검출도 가능해지는 것을 알았다. 한편, 전개액의 조성을 바꾸어도 10⁶ pfu/mL 농도의 H5N2 아형 바이러스 또는 H5N3 아형 바이러스는 검출되지 않았다.

전개액		A	B	C	D	E	F	G	H
조성	NaCl	120mM	120mM	120mM	120mM	120mM	120mM	120mM	120mM
	Tris-HCl, H8.0	50 mM	50 mM	50 mM	50 mM	50 mM	50 mM	50 mM	50 mM
	BSA	0.7%	0.7%	0.7%	0.7%	0.7%	0.7%	0.7%	0.7%
	TritonX-100	0.3%	0.3%	0.3%	0.3%	0.3%	0.2%	0.2%	0.2%
	Tween20	0.1%	0.1%	0.1%	0.1%	0.2%	0.3%	0.3%	0.3%
	PVP	0.00%	0.30%	0.65%	0.70%	0.70%	0.70%	0.80%	0.90%
발색강도		3.1	15.1	24.2	27.1	29.7	36.2	40.1	46.2

비이온성 계면활성제를 포함하는 전개액에, 추가로 0.3 중량%, 0.65 중량% 또는 0.7 중량%의 농도로 PVP를 첨가한 결과, PVP의 농도 의존적으로 면역 크로마토 매체의 판정 부위에 있어서 발색 강도가 증강하였다(전개액 B-D). 판정 부위에 간접적으로 결합한 콜로이드상 금 입자에 의한 발색에 대하여, 육안에 따른 판정 및 면역 크로마토리더(하마마츠허트닉스사 제)에 의한 측정을 행하였다. 면역 크로마토리더(하마마츠허트닉스사 제)의 측정치가 20.0 이상인 경우, 육안에 의하여 명확하게 발색을 확인할 수 있다. 비이온성 계면활성제를 함유하는 전개액에 추가로 PVP를 첨가하는 것에 의해 발색 강도의 증강을 볼 수 있으며, 0.65 중량% 이상의 농도로 PVP를 첨가한 경우에는 보다 명확한 양성 반응을 얻을 수 있었다. 다음에, PVP의 첨가에 의한 발색 강도의 증강 효과가 비이온성 계면활성제의 농도에 의해 영향을 받는지를 검토하였다. 0.7 중량% PVP의 존재 하에 비이온성 계면활성제의 농도를 증가시켜, 새로운 발색 강도의 증강을 볼 수 있었다(전개액 D-F). 더욱이, 0.3 중량% Tween 20 및 0.2 중량% Triton X-100의 조건 하에 PVP의 농도를 0.7 중량%로부터 0.9 중량%까지 증가시키면, 판정 부위에 있어서의 발색 강도가 더욱 한층 증강하였다(전개액 F-H). 이와 같이, 본 발명의 전개액에 비이온성 계면활성제 및 PVP를 첨가하는 것에 의해 판정 부위에 있어서의 발색 강도의 증강을 볼 수 있다. 이러한 효과는, 일본 특허출원 2008-182630호의 명세서에서 상세하게 검토된 것과 일치하였다.

전개액의 조성을 변경하는 것에 의해 본 발명의 검출 키트에 대한 고감도화가 가능하다는 것이 분명해졌으므로, 실제로, 비이온성 계면활성제 및 PVP를 첨가한 전개액을 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스의 측정을 행하였다. H5N1 아형 바이러스로서, 항체의 제작에 이용한 A/crow/Kyoto/53/2004(H5N1) 주 외에, 2007년에 이집트에서 닭으로부터 분리된 A/chicken/Egypt/CL-61/2007(H5N1) 주를 이용하였다. 대조군으로는, 사람으로부터 분리된 H1N1 아형 바이러스 (A/Puertorico/8/34), 오리로부터 분리된 H5N2 아형 바이러스 (A/duck/HongKong/342/78) 및 H5N3 아형 바이러스(A/duck/HongKong/820/80)를 이용하였다. 판정 부위에서의 발색에 대해서는, 육안에 의한 판정 및 면역 크로마토리더(田中귀금속공업사 제)에 의한 측정을 실시하였다. 면역 크로마토리더(田中귀금속공업사 제)의 경우, 측정치가 15.0 이상에서 육안에 의해 명확하게 발색을 확인할 수 있다. 각종 전개액을 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스를 측정한 경우의 발색 강도를 표 6 및 도 2에 나타낸다.

			전개액
			A	C	F	H
시료 (pfu/mL)	H5N1/Kyoto	10^6	30.2	285.7	334.0	270.0
		10^5	21.5	214.0	225.0	267.3
		10^4	4.5	42.0	41.7	64.3
		10^3	0.0	1.3	2.0	1.7
	H5N1/Egypt	10^6	24.5	259.0	285.0	278.7
		10^5	7.2	69.0	96.0	122.3
		10^4	0.2	6.0	10.0	17.7
		10^3	0.0	0.0	0.3	0.0
	H5N2	10^6	0.5	7.0	1.7	10.0
	H5N3	10^6	0.0	2.3	0.0	0.0
	H1N1	10^6	0.0	0.0	0.0	0.0

비이온성 계면활성제 및 PVP를 첨가한 전개액을 이용하여, 목표로 하는 10⁴ pfu/mL 농도의 H5N1 아형 바이러스의 검출이 가능해졌다(intensity≥15에서, 육안 판정 ＋). 한편, H5N2 아형 바이러스 및 H5N3 아형 바이러스는 10⁶ pfu/mL의 고농도로 측정하여도 판정 부위에서의 발색은 육안으로 인정받지 못하였다. 전개액에 비이온성 계면활성제 및 PVP를 추가하는 것에 의해, 피검물질인 AIV H5N1를 포함하는 양성 시료를 측정하는 경우 판정 부위에서의 발색 강도(시그널)를 증강할 수 있는 한편, AIV H5N1를 포함하지 않는 음성 시료를 측정하는 경우의 발색 강도(노이즈)를 억제할 수 있다. 면역 크로마토그래피법의 전개액에 추가되는 첨가제에는, 증감제로서 시그널의 강도를 높이는 효과를 갖는 것이 몇 개인가 알려져 있으나, 동시에 노이즈의 강도도 증강해 버리기 때문에 음성 시료를 측정하는 경우 의양성 반응을 일으켜 버리는 것도 적지 않다. 그러나, 비이온성 계면활성제 및 PVP를 함유하는 전개액을 이용하는 경우에는 시그널의 강도를 높일 수 있기 때문에, 저농도의 H5N1 아형 바이러스라도 감도 좋게 측정할 수 있는 한편, H5N1 아형 이외의 바이러스(H5N2 아형 바이러스 또는 H5N3 아형 바이러스 등)를 측정하는 경우에 생기는 노이즈의 발생은 억제되어, H5N1 아형 바이러스를 고감도로 특이적으로 검출하는 것이 가능하다. 이와 같은 전개액에 의한 측정 감도의 상승 효과는, 제 2 시약에 항체 3H12를 이용해도 동등하게 발휘된다. 또한, 제 1 시약 및 제 2 시약에 이용하는 단클론 항체를 교환하여도 마찬가지이다.

더욱이, 본 발명의 검출 키트가 H5N1 아형 바이러스만을 특이적으로 검출하는 것이 가능한지 상세하게 확인하기 위해, 다양한 헤마글루티닌(HA) 아형 및 뉴라미니다제(NA) 아형을 갖는 인플루엔자 바이러스주를 이용하여 교차 반응성 시험을 실시하였다. 결과를 표 7 및 도 3에 나타낸다.

이와 같이, 본 발명의 검출 키트에 의하면 H5N1 아형의 인플루엔자 바이러스를 고감도에 검출할 수 있는 한편, H5N1 아형 이외의 바이러스는 육안으로 전혀 검출할 수 없다. 즉, 본 발명의 검출 키트는 높은 특이성을 가지고 H5N1 아형 인플루엔자 바이러스를 검출 가능하다는 것이 명백하다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1. 크로마토그래피 매체 상에서의 판정 부위의 제작

25×2.5 ㎝의 니트로셀룰로스 막(밀리포아사 제: HF120)에, 항체 도포기 (BioDot사 제)를 이용하여 5 중량%의 이소프로필알코올을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4)에 1.3 ㎎/mL의 농도가 되도록 희석한 항고병원성 인플루엔자 바이러스 A(H5N1) 단클론 항체 3H4, 3H12 또는 4G6의 어느 쪽(제 1 시약)을 도포하고, 42 ℃로 60분간 건조시켜 크로마토그래피 매체 상에 판정 부위를 제작하였다.

2. 표지시약 용액의 제작

금 콜로이드 현탁액(田中귀금속공업사 제: 평균 입경 60 ㎚) 0. 5 mL에 0.1 mL의 50 mM 인산 완충액(pH 7.4)를 넣고 혼화하여, 5 mM 인산 완충액(pH 7.4)으로 희석한 항고병원성 인플루엔자 바이러스 A(H5N1) 단클론 항체 3H4, 3H12 또는 4G6의 어느 쪽(제 2 시약)을 0.1 mL 넣고 실온에서 10분간 정치하였다. 그 다음에, 10 mM 인산 완충액으로 희석한 10 중량%의 소혈청 알부민(BSA)을 0.1 mL 넣고 충분히 교반한 후, 8000×g로 15분간 원심분리를 행하였다. 상등액을 제거한 후, pH 7.4의 10 mM 인산 완충액을 1 mL 넣었다. 초음파 파쇄기를 이용하여 콜로이드상의 표지시약을 잘 분산시킨 후, 8000×g로 15분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 상기 인산 완충액을 넣어 초음파 파쇄기로 잘 분산시켜 표지시약 용액으로 하였다.

3. 크로마토그래피 매체의 제작

상기 제작한 표지시약 용액을 16×100 ㎜의 유리섬유제 패드(밀리포아사 제: GFCP203000)에 균일하게 첨가한 후 진공 건조기에서 건조시켜 표지시약 보관 유지 부재로 하였다. 다음에, 지지 시트로 이루어지는 기재에, 상기 판정 부위를 제작한 니트로셀룰로스막, 표지시약 보관 유지 부재, 시료를 첨가하는 부분에 이용하는 유리 섬유제 샘플 패드(폴사 제: 8000006801), 및 전개한 시료나 표지시약 등을 흡수하기 위한 흡수 패드를 접합하였다. 마지막으로, 재단기로 폭이 5 ㎜가 되도록 재단하여 크로마토그래피 매체를 제작하였다.

4. 측정

상기 3에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 피검물질인 고병원성 인플루엔자 바이러스 A/crow/Kyoto/53(H5N1)를 포함하는 시료를 이용하여 그 존재 유무를 측정하였다. 즉, 0.3 중량% Triton X-100(등록상표, HLB치 13.5), 0.1 중량% Tween 20(등록상표, HLB치 16.7), 0.7 중량% 우혈청 알부민과 120 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 트리스-염산 완충용액(pH 8.0)으로 이루어지는 액을 전개액(전개액 A, 표 5 참조)으로 하고, 여기에 pH 7.4의 10 mM 인산 완충 생리식염수로 희석된 각종 인플루엔자 바이러스를 넣어 120 μL로 한 것을 검체로 하였다. 즉, 10⁶ pfu/mL(표 2) 또는 10⁴ pfu/mL(표 3)의 고병원성 인플루엔자 바이러스 A/crow/Kyoto/53(H5N1)를 양성 검체, 10⁶ pfu/mL의 인플루엔자 바이러스 A/Puertorico/8/34(H1N1)(표 4)를 음성 검체로 하여 크로마토그래피 매체의 샘플 패드 위에 적재하여 전개시키고, 15 분 후에 육안 판정을 하였다. 판정 부위에 있어서 테스트 라인의 적색 선을 확인할 수 있는 것을 「＋」, 적색 선은 확인할 수 있지만 특히 색이 옅은 것을 「±」, 적색 선을 확인할 수 없는 것을 「?」로 하였다. 표 2?4에 결과를 나타낸다.

비교예 1

제 1 시약 및 제 2 시약 모두 항고병원성 인플루엔자 바이러스 A(H5N1) 다클론 항체를 이용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 2?4에 결과를 나타낸다.

실시예 2

제 1 시약에 항체 4G6를, 제 2 시약에 항체 3H4를 이용하고, 표 5에 기재된 각종 조성의 전개액을 사용하고, 피검물질로서 2 ng/mL의 H5N1 HA 재조합 단백질(ABR사)을 이용하여 면역 크로마토리더(하마마츠허트닉스사 제)에 의한 발색 강도 측정을 행하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 5 및 도 1에 결과를 나타낸다.

실시예 3

제 1 시약에 항체 4G6를, 제 2 시약에 항체 3H4를 이용하고, 표 5에 기재된 전개액 A, C, F 및 H를 사용하고, 피검물질인 각종 인플루엔자 바이러스, 즉 10⁶ pfu/mL, 10⁵ pfu/mL, 10⁴ pfu/mL 또는 10³ pfu/mL의 고병원성 인플루엔자 바이러스 A/crow/Kyoto/53/2004(H5N1), 10⁶ pfu/mL, 10⁵ pfu/mL, 10⁴ pfu/mL 또는 10³ pfu/mL의 고병원성 인플루엔자 바이러스 A/chicken/Egypt/CL-61/2007(H5N1), 10⁶ pfu/mL의 인플루엔자 바이러스 A/duck/HongKong/342/78(H5N2), 10⁶ pfu/mL의 인플루엔자 바이러스 A/duck/HongKong/820/80(H5N3) 또는 인플루엔자 바이러스 A/Puertorico/8/34(H1N1)를 이용하여 면역 크로마토리더(田中귀금속공업사 제)에 의한 발색 강도 측정을 행하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 6 및 도 2에 결과를 나타낸다.

실시예 4

제 1 시약에 항체 4G6를, 제 2 시약에 항체 3H4를 이용하고, 표 5에 기재된 전개액 H를 사용하고, 10⁵ pfu/mL의 표 7에 기재된 각종 인플루엔자 바이러스를 이용하여 육안 판정과 함께 면역 크로마토리더(田中귀금속공업사 제)에 의한 발색 강도 측정을 행하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 7 및 도 3에 결과를 나타낸다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명의 검출 키트는 실용에 충분한 측정 감도를 갖고 특이적으로 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 검출할 수 있으므로, H5N1 아형 바이러스에 의한 인플루엔자 감염을 신속하고 간편하게 검사할 수 있다는 산업상의 이용 가능성을 갖는다.

Claims

제 1 시약을 판정 부위에 갖는 크로마토그래피 매체, 제 2 시약과 표지 물질이 결합한 표지시약 및 전개액을 함유하는, 면역 크로마토그래피법에 따라 시료 중의 피검물질을 검출하기 위한 키트에 있어서, 제 1 시약 및 제 2 시약의 양쪽 모두 또는 어느 하나가 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체인, A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형의 검출 키트.
제 1 항에 있어서, 제 1 시약이 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체인 검출 키트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 특이적으로 인식하는 항체가, H5N1 아형 바이러스의 헤마글루티닌의 59번째 아미노산인 아스파라긴산을 포함하는 입체 구조적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체인 검출 키트.
제 3 항에 있어서, H5N1 아형 바이러스의 헤마글루티닌의 59번째 아미노산인 아스파라긴산을 포함하는 입체 구조적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체가, 마우스-마우스 하이브리도마 4G6(기탁번호 FERM BP-11130)에 의하여 생산되는 단클론 항체인 검출 키트.
제 1 항 내지 제 4 항의 어느 한 항에 있어서, 다른 쪽의 제 1 시약 또는 제 2 시약이 H5N1 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 HA1 도메인의 273-342aa 영역에 존재하는 연속적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체인 검출 키트.
제 5 항에 있어서, H5N1 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 HA1 도메인의 273-342aa 영역에 존재하는 연속적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체가 마우스-마우스 하이브리도마 3H4(기탁번호 FERM BP-11173) 또는 마우스-마우스 하이브리도마 3H12(기탁번호 FERM BP-11174)에 의해서 생산되는 단클론 항체인 검출 키트.
제 1 항 내지 제 6 항의 어느 한 항에 있어서, 전개액이 HLB 치가 13?18인 비이온성 계면활성제를 함유하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
제 7 항에 있어서, 비이온성 계면활성제의 농도가 0.1?1.0%인 검출 키트.
제 1 항 내지 제 8 항의 어느 한 항에 있어서, 전개액이 추가로 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 함유하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
제 9 항에 있어서, 비닐계 수용성 폴리머의 농도가 0.5?2.0%인 검출 키트.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 비닐계 수용성 폴리머가 폴리비닐피롤리돈인 검출 키트.
제 7 항 내지 제 11 항의 어느 한 항에 있어서, 표지 물질이 불용성 담체인 검출 키트.
제 12 항에 있어서, 불용성 담체가 콜로이드상 금 입자인 검출 키트.
시료를 크로마토그래피 매체에 접촉시키는 공정, 표지시약을 시료와 동시에 또는 시료에 이어서 크로마토그래프 매체에 접촉시키는 공정, 및 전개액에 의해 시료 및 표지시약을 전개하는 공정을 포함하는, 제 1 항 내지 제 13 항의 어느 한 항에 따른 검출 키트를 이용한, 시료 중의 A형 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형을 검출하는 방법.