JP4625485B2 - 高病原性トリインフルエンザウイルスに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
日本で2004年に分離された高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスは、同年4月に京都で分離されたH5N1ウイルスであり、トリインフルエンザウイルスA/crow/Kyoto/53/2004と命名されている。
このような高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスが鳥類に感染し、その感染症が蔓延すると甚大な損害を及ぼすと共に、ヒトへの感染も危惧される。
したがって、高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスの鳥類への侵入・蔓延を早期に防止するため、該ウイルスの検出法や該ウイルス感染症の診断法の確立が強く要請されている。
本発明の他の目的は、高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスを迅速かつ簡便に検出することができるモノクローナル抗体、該抗体を用いた高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスの検出方法、検出試薬および検出キットを提供する点にある。
[1] 抗原を当該抗原の高次構造を保持したまま不活化し、得られた不活化抗原を非ヒト哺乳動物に免疫し、免疫された動物の脾臓から脾臓細胞を単離し、得られた脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマの産生する抗体と前記抗原との反応性の有無を指標として前記抗原に対するモノクローナル抗体を選択することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法、
[2] 不活化を、抗原をパラホルムアルデヒドで処理することにより行うことを特徴とする前記[1]記載の製造方法、
[3] 不活化抗原を免疫したのち、さらに不活化していない抗原で追加免疫することを特徴とする前記[1]または[2]に記載の製造方法、
[4] ハイブリドーマの産生する抗体と抗原との反応性の有無を蛍光抗体法(IFA)で検出することを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法、
[5] 抗原がウイルスまたは癌マーカーである前記[1]〜[4]のいずれかに記載の製造方法、
[6] 抗原が高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスである前記[1]〜[4]のいずれかに記載の製造方法、
[7] 高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスが2004年4月に京都府で分離されたトリインフルエンザウイルスA/crow/Kyoto/53/2004である前記[6]に記載のモノクローナル抗体の製造方法、および
[8] 前記[1]〜[7]のいずれかに記載の方法により製造されたモノクローナル抗体、
に関する。
また、本発明は
[9] 高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスおよび低病原性トリインフルエンザH5N2ウイルスに対し特異的に反応するモノクローナル抗体、
[10] 蛍光抗体法(IFA)による反応が陽性である前記[9]に記載のモノクローナル抗体、
[11] さらに、H5N1ウイルスに対して赤血球凝結法による反応が陽性である前記[10]に記載のモノクローナル抗体、
[12] H5N1ウイルスに対して蛍光抗体法(IFA)による反応が陽性であり、かつH5N2ウイルスに対して赤血球凝集法による反応が陽性である前記[9]に記載のモノクローナル抗体、
[13] さらに中和活性を示す前記[9]に記載のモノクローナル抗体、
[14] さらに中和活性を示す前記[10]に記載のモノクローナル抗体、
[15] さらに中和活性を示す前記[11]に記載のモノクローナル抗体、
[16] さらに中和活性を示す前記[12]に記載のモノクローナル抗体、
[17] 病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスが2004年4月に京都府で分離されたトリインフルエンザウイルスA/crow/Kyoto/53/2004である前記[9]〜[16]のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
[18] モノクローナル抗体が、マウス−マウス ハイブリドーマ3H12(FERM BP−11174)、マウス−マウス ハイブリドーマ3C11(FERM P−21027)、マウス−マウス ハイブリドーマ4C12(FERM P−21028)又はマウス−マウス ハイブリドーマ3H4(FERM BP−11173)で示されるハイブリドーマにより産生される抗体である前記[9]に記載のモノクローナル抗体、
[19] 前記[9]〜[18]のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いる免疫測定法からなる高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスの検出法、
[20] 前記[9]〜[18]のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有してなる高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスの検出試薬、および
[21] 前記[9]〜[18]のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有してなる高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスの検出用キット、
に関する。
ついで、該ハイブリドーマの産生する抗体と抗原との反応性の有無を指標として抗原に対するモノクローナル抗体を選択する。反応性の有無は蛍光抗体法(IFA)で行うのが好ましい。この場合、第二次抗体として、蛍光ラベルした抗マウスIgG抗体が好適に使用することができる。このようなスクリーニング操作を繰り返し(2次スクリーニング)て所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
すなわち、本発明の新規モノクローナル抗体は、高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスおよび低病原性トリインフルエンザH5N2ウイルスに対して特異的に反応性を示す。かかるモノクローナル抗体は、次のようにして作製することができる。
抗原となる高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスとして、2004年4月に京都府で分離されたトリインフルエンザウイルスA/crow/Kyoto/53/2004を用いた。このウイルスを例えばパラホルムアルデヒド水溶液で処理して該ウイルスの高次構造を保持したまま不活化する。この不活化により感染性ウイルスは不活性化して感染性がなくなる。得られた不活化ウイルス(すなわち、不活性化ウイルス)を用いてマウスを免疫し、続いて感染性を保持したウイルスを用いてマウスを追加免疫する。感染性ウイルスをナイーブなマウス(すなわち、不活化ウイルスで免疫していないマウス)に感染させるとマウスは死亡すると想定されるが、あらかじめ不活化したウイルスで免疫してあるマウスでは、その後感染性ウイルスで免疫しても死亡することがない。
ハイブリドーマのうち、H5N1ウイルスに対して反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、蛍光抗体法(IFA)で行うことができる。すなわち、イヌ腎臓由来細胞(MDCK)にH5N1ウイルスを感染させたのち、感染した細胞を常法により、例えば4%パラホルムアルデヒド液−1%Triton−X100液により固定・不活性化する。この不活性化された感染細胞に前記で作製されたハイブリドーマの培養上清を加え、ついで蛍光ラベルした抗マウスIgG抗体(例えば、Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG; Invitrogen Ltd. USA)と反応させ、倒立蛍光顕微鏡を用いてH5N1蛋白質に対して特異的に反応するハイブリドーマを選択する。この操作を繰り返してH5Hウイルスに対しするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
1)マウスの免疫
BALB/Cマウス(4週齢、雌、4匹)に高病原性鳥インフルエンザH5N1ウイルス(A/crow/Kyoto/53/2004)を免疫した。ウイルスは発育鶏卵の小尿液より回収し、SW28ローターにて25,000rpm、1時間の超遠心を行い、濃縮精製した。その結果、1010/mlのウイルス粒子を得た。ウイルスは(最終免疫以外は)4%パラホルムアルデヒド液および1%Triton−X100を加えて不活性化し、その後リン酸緩衝液(PBS)にて透析した。マウスへの免疫は合計3回行った。一回目の免疫はウイルス液0.5mlに等量のフロインドアジュバンドを加えて乳化させ、各0.25mlを腹腔注射した。初回の免疫2週間後に二回目の(追加)免疫を行った。この場合はアジュバンドを添加せずに0.25ml不活化ウイルスのみを腹部免疫した。最終免疫は追加免疫の2週間後に行った。感染性ウイルスを含むウイルス液0.25mlを腹腔に接種した。H5N1ウイルスはマウスに対して致死的に感染するため、感染性を有するウイルスをナイーブなマウスに感染させるとマウスが死亡することが想定されるが、本試験ではその前に不活化ウイルスを免疫しているため、致死性のウイルス感染に対しても明確な感染症状を示すことなく、マウスがウイルスに免疫されたと考えられる。
最終免疫から3日後にマウスより脾臓を摘出し、無血清培地で2回すすいで夾雑物を除去し、メッシュ濾過にて単細胞に分離した後、ミエローマ細胞(PAI細胞)と細胞融合を行った。融合にはポリエチレングリコール(PEG)を用い、37℃に保温していたPEG溶液0.5mlを30秒毎に1滴を滴下し、5対1の割合で調整した脾細胞とミエローマ細胞をピペットの先で細胞の塊をほぐすように撹拌して融合させた。その後、融合細胞にHAT培地を加えて96ウェルプレートに播種し、37℃で培養した。
培養後10日から12日間で細胞のコロニーが十分成育したことを確認した。そこでイヌ腎臓由来細胞(MDCK)に感染したH5N1ウイルスを抗原として抗体スクリーニング(1次)を行い、H5N1ウイルスを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選抜した。MDCKにH5N1ウイルスが1対1になるように感染させ、感染翌日に細胞を4%パラホルムアルデヒド液−1%Triton−X100液を加えて固定・不活化した。感染細胞にハイブリドーマ(抗体産生細胞)の培養上清を加え1時間静置した後、PBSで洗浄し、蛍光ラベルした抗マウスIgG抗体(Alexa Fluor 488 ビツジ・抗マウスIgG;Invitrogen Ltd.USA)を反応させ、倒立蛍光顕微鏡を用いてH5N1ウイルス特異的抗体を産生するハイブリドーマを選抜した。こうして選抜したハイブリドーマをさらに1〜10細胞/ウェルになるように希釈して再度96ウェルプレートに播種し、同様のスクリーニング操作を繰り返し(2次スクリーニング)抗体産生細胞が単細胞から派生していることを確認した。
蛍光抗体法(IFA)試験:上記した方法に準じる。なお、H5N2(A/Duck/Hong Kong/342/78)ウイルスおよびH1N1(A/PR8/34)ウイルスをH5N1ウイルス以外に用いたため、H5N2に感受性の高いニワトリ胎児由来繊維芽細胞(CEF)を感染細胞として用いた。
すなわち、H5N1ウイルスで感染させたイヌ腎臓由来細胞(MDCK/H5N1)、H5N2で感染させたニワトリ胎児由来繊維芽細胞(CEF/H5N2)およびH1N1で感染させたニワトリ胎児由来繊維芽細胞(CEF/H1N1)を調製し、これにハイブリドーマの培養上清を作用させたのち、蛍光ラベルした抗マウスIgG抗体を反応させ、倒立蛍光顕微鏡を用いて抗原・抗体反応の有無を調べた。
MDCK感染細胞を用いたIFA試験によるスクリーニングにおいて、H5N1ウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体11クローン(3H12,3B2,3H4,3C11,4C12,5G1,3D3,2D7,4G8,3D11,4D1)を得た。この中で8クローン(3H12,3B2,3C11,4C12,5G1,3D3,3D11,4D1)はH5N2ウイルスも認識することが判明した。また、3H4および3C11は、H5N2ウイルスあるいはH5N1ウイルスに対するHI活性を有することが明らかとなった。さらに4クローン(3H12,3H4,3C11,4C12)は、H5N1ウイルスのMDCKおよびCEF細胞に対する感染を阻害する中和活性を有することが判明した。5クローン(3H12,3B2,3H4,3C11,4C12)のサブタイプはIgG1型であり、残りの6クローン(5G1,3D3,2D7,4G8,3D11,4D1)はIgM型であった。
上記結果をまとめると、下記表1の通りである。
高病原性トリインフルエンザウイルスH5N1に感染した患者から分離された臨床分離株A/Tailand/Kan353/2004株のヘマグルチニン(HA)遺伝子(登録番号EF541411)の塩基配列に基づきcDNAを合成し、これをベクターpCAGGSに組み込みリポフェクション法によりヒト咽頭癌由来のHEp2細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をMEM培地中、37℃で12時間培養してヘマグルチニン(HA)蛋白質を発現させ、これにマウス−マウス ハイブリドーマ3H12(FERM BP−11174)、マウス−マウス ハイブリドーマ3C11(FERM P−21027)、マウス−マウス ハイブリドーマ4C12(FERM P−21028)又はマウス−マウス ハイブリドーマ3H4(FERM BP−11173)で示されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ハイブリドーマの培養上清)を加え、37℃で30分間静置した。ついで、PBSで洗浄し、蛍光ラベルした抗マウスIgG抗体(Alexa Fluor 488 ビツジ・抗マウスIgG;Invitrogen Ltd.USA)を反応させ、倒立蛍光顕微鏡を用いて抗原・抗体反応の有無を調べた。
その結果、いずれのモノクローナル抗体も抗原・抗体反応が陽性であった。このことから、本発明の新規モノクローナル抗体はヒトに感染した高病原性トリインフルエンザウイルスの検出にも有用であることが分かる。
Claims (6)
- 高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスおよび低病原性トリインフルエンザH5N2ウイルスに対し特異的に反応するモノクローナル抗体であって、
当該モノクローナル抗体が、マウス−マウス ハイブリドーマ3H12(FERM BP−11174)、マウス−マウス ハイブリドーマ3C11(FERM P−21027)、マウス−マウス ハイブリドーマ4C12(FERM P−21028)又はマウス−マウス ハイブリドーマ3H4(FERM BP−11173)で示されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。 - 高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスおよび低病原性トリインフルエンザH5N2ウイルスに対し特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する、
マウス−マウス ハイブリドーマ3H12(FERM BP−11174)、マウス−マウス ハイブリドーマ3C11(FERM P−21027)、マウス−マウス ハイブリドーマ4C12(FERM P−21028)又はマウス−マウス ハイブリドーマ3H4(FERM BP−11173)で示されるハイブリドーマ。 - 請求項1に記載のモノクローナル抗体を用いる免疫測定法からなる高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスの検出法。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を含有してなる高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスの検出試薬。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を含有してなる高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルスの検出用キット。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む、高病原性トリインフルエンザH5N1ウイルス用医薬組成物。
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