CN116125068B - 侧流层析免疫检测试剂盒及其应用 - Google Patents

侧流层析免疫检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及侧流层析免疫检测试剂盒及其制备方法。本公开涉及一种侧流免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：试剂条，所述试纸条包括信号叠色垫；第一信号叠色试剂，其包括过氧化氢；和，第二信号叠色试剂，其包括酪酰胺，其中，所述信号叠色垫设置在样品垫和反应结合垫上；其中，所述信号叠色垫包被有用于偶联酪酰胺的物质。本公开还涉及使用本公开的试剂盒进行检测的方法。

Description

侧流层析免疫检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，尤其涉及侧流层析免疫检测试剂盒及其应用。
背景技术
免疫层析是一种即时诊断技术，由于该技术的简便、快速以及低制造成本，在全世界具有广泛的使用。例如，用于妊娠检测的免疫层析是典型的非处方检测方法，在20世纪80年代就被商业化应用。经过20多年的发展，免疫层析已经在临床、农业、生物防疫和环境检测等领域被广泛使用，涉及到的项目从最初的妊娠，扩展到传染病、毒品、食品安全等多领域的抗原或抗体的检测。
免疫层析的原理主要基于抗原抗体的特异性结合和显色。以硝酸纤维膜为载体，将特异性抗原与胶体金结合并固定在结合垫上，当检测样品中有目标抗体或抗原时，目标抗体或抗原与试纸条中的标记抗原或抗体结合，产生抗原抗体复合物，试纸条硝酸纤维膜上预留的特异性抗体会捕获这种带有显色标志的抗原抗体复合物，试纸条显色，表明检测样品呈阳性；若待测样品中不含目标抗体，试纸条则不显色，表明检测样品呈阴性。该技术检测样品可采用静脉全血、血清或血浆、唾液等形式，具有便捷、成本低、适用于居家自测等优势。
然而，现有的免疫层析技术仍然存在灵敏度低、特异性差等缺点。免疫层析技术虽然简便实惠，但是其检出能力上相较于核酸检测仍然存在很大的差距。目前，有很多的研究者均对免疫层析技术进行过改良优化，以提高该技术的检测灵敏度，较为常见的方法包括银离子增强，金离子增强以及纳米金花技术，但均由于这些技术稳定性差和可重复性低等缺点无法得到普及。
因此，需要新的方案来提高免疫层析技术的灵敏度与特异性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本公开提供了一种基于酪酰胺(tyramine)化学叠色的信号叠色免疫层析检测新方法。本公开利用酪酰胺化学增强反应，对免疫层析试纸条的显色区域进行叠色，从而实现检测信号的放大。另外，本公开还进一步结合新型层析方式，最终实现在保持原有层析技术简便性的同时，大幅提升其检测灵敏度和检测线性范围。
根据本公开的一个方面，提供了一种侧流免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括：试剂条，所述试纸条包括信号叠色垫；第一信号叠色试剂，其包括过氧化氢；和，第二信号叠色试剂，其包括酪酰胺，其中，所述信号叠色垫设置在样品垫和反应结合垫上；所述叠色垫包被有用于偶联酪酰胺的物质。
在一些实施方式中，所述第一信号叠色试剂可以包括0.00196％～0.0021％(体积比)的过氧化氢(即，每100mL添加5.6～6μL 35％过氧化氢)。在一些实施方式中，所述第一信号叠色试剂还可以包括约10～15mg/mL的Tris、5～10mg/mL的氯化钠，0.5mg/mL的叠氮化钠，1～2％(体积比)的吐温20，和/或5～10mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方式中，所述第一信号叠色试剂可以包括约10～15mg/mL的Tris、5～10mg/mL的氯化钠，0.5mg/mL的叠氮化钠，1～2％(体积比)的吐温20，5～10mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮，和0.00196％～0.0021％(体积比)的过氧化氢。在一些实施方式中，所述第一信号叠色试剂可以包括约12.1mg/mL的Tris。在一些实施方式中，所述第一信号叠色试剂可以包括约0.5mg/mL的叠氮化钠。在一些实施方式中，所述第一信号叠色试剂的pH可以为8.2～8.6。
在一些实施方式中，所述第二信号叠色试剂可以包括与生物素/链霉亲和素、受体/配体偶联的酪酰胺。在一些实施方式中，所述第二信号叠色试剂可以包括生物素基酪酰胺。在一些实施方式中，所述第二信号叠色试剂可以包括0.01～0.02mg/mL的生物素基酪酰胺。在一些实施方式中，所述第二信号叠色试剂还可以包括10～15mg/mL的Tris，5～10mg/mL的氯化钠，0.1～1mg/mL的叠氮化钠，1～2％(体积比)吐温20，和/或5～10mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方式中，所述第二信号叠色试剂可以包括10～15mg/mL的Tris，5～10mg/mL的氯化钠，0.1～1mg/mL的叠氮化钠，1～2％(体积比)吐温20，5～10mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮，和0.01～0.02mg/mL的生物素基酪酰胺。在一些实施方式中，所述第二信号叠色试剂可以包括12.1mg/mL的Tris。在一些实施方式中，所述第二信号叠色试剂可以包括0.5mg/mL的叠氮化钠。在一些实施方式中，所述第二信号叠色试剂pH可以为8.2～8.6。
在一些实施方式中，所述试剂盒还可以包括样本裂解液，其包括10～15mg/mL的Tris，5～10mg/mL的氯化钠，0.1～1mg/mL的叠氮化钠，1～2％(体积比)曲拉通X-100，和/或0.5～1％(体积比)的吐温20。在一些实施方式中，所述样本裂解液可以包括12.1mg/mL的Tris。在一些实施方式中，所述样本裂解液可以包括0.5mg/mL的叠氮化钠。在一些实施方式中，所述样本裂解液的pH可以为8.2～8.6。
在一些实施方式中，所述试剂盒还可以包括上样缓冲液，其包括10～15mg/mL的Tris，5～10mg/mL的氯化钠，3～5mg/mL的氯化钾，0.1～1mg/mL的叠氮化钠，0.5～1％(体积比)的吐温20，5～10mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮，和/或5～10mg/mL的酪蛋白。在一些实施方式中，所述上样缓冲液可以包括12.1mg/mL的Tris。在一些实施方式中，所述上样缓冲液可以包括0.5mg/mL的叠氮化钠。在一些实施方式中，所述上样缓冲液的pH可以为8.2～8.6。
在一些实施方式中，所述信号叠色垫包被的用于偶联酪酰胺的物质可以包括链霉亲和素/生物素、配体/受体。在一些实施方式中，所述信号叠色垫可以包被有链霉亲和素。在一些实施方式中，所述链霉亲和素可以结合在第一标记物上。在一些实施方式中，所述第一标记物可以选自胶体金、乳胶微球、量子点、荧光染料、时间分辨荧光微球、上转换发光微球、磁性微球。在优选的实施方式中，所述第一标记物选自乳胶微球或胶体金。
在一些实施方式中，所述样本垫和/或所述信号叠色垫可以经预处理缓冲液包被。在一些实施方式中，所述预处理缓冲液可以包括有50～150mM的Tris、5～10mg/mL的NaCl、0.1％～1％的Tween-20(体积比)和5～20mg/mL的酪蛋白。在一些实施方式中，所述预处理缓冲液可以包括有100mM的Tris。
在一些实施方式中，所述反应结合垫可以包被有辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体或抗原。在一些实施方式中，所述HRP标记的抗体或抗原可以结合在第二标记物上。在一些实施方式中，所述第二标记物选自胶体金、乳胶微球、量子点、荧光染料、时间分辨荧光微球、上转换发光微球、磁性微球。在优选的实施方式中，所述第二标记物选自乳胶微球或胶体金。
在一些实施方式中，所述试纸条包括支持物，以及交叠设置在所述支持物上的样本垫、反应结合垫、信号叠色垫、层析膜、吸水垫。在一些实施方式中，所述信号叠色垫与层析膜重叠，层析膜上设置有检测线和质控线。在一些实施方式中，所述检测线上包被有捕获抗体或抗原。在一些实施方式中，所述质控线上包被有二抗或抗原。
在一些实施方式中，所述层析膜可以为硝酸纤维素膜。在一些实施方式中，所述层析膜上设置有检测线和质控线。在一些实施方式中，所述检测线上可以包被有捕获抗体或抗原。在一些实施方式中，所述质控线上可以包被有二抗。
在一些实施方式中，所述试纸条中的相邻各部件之间的重叠长度为1～2mm。在具体的实施方式中，所述信号叠色垫贴合在所述样本垫和所述反应结合垫上，且与所述层析膜重叠。例如，所述信号叠色垫与所述层析膜重叠1～2mm。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原为用于结合或竞争待测物，所述待测物为微生物、生物标记物、环境污染物、毒品、药品或化学品残留物。
根据本公开的另一方面，提供了一种使用本公开的试剂盒进行检测的方法，所述方法包括：1)将样本加载到所述样本垫上；2)将所述第一信号叠色试剂和所述第二信号叠色试剂加载到所述样本垫上；3)将上样缓冲液加载到所述叠色垫上。
在一些实施方式中，所述方法包括，先将样本加载到所述样本垫上孵育一段时间，然后将所述第一信号叠色试剂和所述第二信号叠色试剂加载到所述样本垫上。
在一些实施方式中，步骤1)中，将样本加载到所述样本垫上之后，加载上样缓冲液。在一些实施方式中，步骤1)中，可以在将样本加载到所述样本垫上之后2～20分钟，优选5～20分钟，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟之后，再加载上样缓冲液。
在一些实施方式中，步骤1)中在样本加载到样本垫之前，还包括用样本裂解液处理样本的步骤。
在一些实施方式中，步骤2)中，将所述第一信号叠色试剂和所述第二信号叠色试剂加载到所述样本垫上之后，加载上样缓冲液至所述样本垫。在一些实施方式中，步骤2)中，可以在将所述第一信号叠色试剂和所述第二信号叠色试剂加载到所述样本垫上之后2～20分钟，优选5～20分钟，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟之后，再加载上样缓冲液至所述样本垫。
在一些实施方式中，所述第一信号叠色试剂和所述第二信号叠色试剂可以按照1:1的比例加载到所述样本垫上。
在一些实施方式中，步骤3)中，将所述的上样缓冲液加载到所述叠色垫。在一些实施方式中，在步骤3)之后，可以等待一段时间来读取结果。当检测线不显色时，结果为阴性。当检测线显色时，结果为阳性。如果质控线不显色时，则层析结果无效。
本公开的检测方法可以用于非疾病诊断的目的。
在一些实施方式中，本公开的试剂盒和检测方法可以用于检测待测物，例如微生物、生物标记物、环境污染物、毒品、药品或化学品残留物。
在一些实施方式中，本公开的试剂盒和检测方法可以用于检测细菌、真菌、放线菌、螺旋体、衣原体、病毒、支原体等。
在一些实施方式中，本公开的试剂盒和检测方法可以用于检测，例如，但并不限于大肠杆菌(E.coli)、布鲁氏菌(Brucella spp)、肠沙门菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺菌属(Shigella spp)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、链球菌(Streptococcusspp)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、SARS冠状病毒(SARS-associated coronavirus(SARS-CoV))、类天花病毒(Alastrim virus)、猿疱疹病毒(Herpesvirus simia)、猴痘病毒(Monkeypoxvirus)、天花病毒(Variola virus)、副流感病毒(Parainfluenza virus)、流行性感冒病毒(Influenza virus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)等。
在一些实施方式中，本公开的试剂盒和检测方法可以用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。在一些实施方式中，本公开的试剂盒和检测方法可以用于检测Wuhan毒株、alpha毒株、Beta毒株、Gamma毒株、Delta毒株或Omicron毒株。
在一些实施方式中，本公开的试剂盒和检测方法用于检测生物标记物，所述的生物标记物包括用于监控器官或内分泌功能的标记物、区分疾病是否发生的诊断标记物、用于判断疾病严重程度的病程监测标志物、用于评价疗效、和/或监控疾病进展或控制的预后标志物等；例如，包括但不限于性激素分泌、甲状腺功能、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、心血管、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、食道癌、头颈癌、子宫颈癌，子宫癌，卵巢癌、肾癌，甲状腺癌、结肠癌或直肠癌、黑色素瘤等生物标记物。
在一些实施方式中，本公开的试剂盒和检测方法运用免疫学检测原理。例如，可以用双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法。
在一些实施方式中，本公开的试剂盒和检测方法采用双重放大的系统，例如采用生物素/链霉亲和素，配体/受体等放大系统，例如第二信号叠色试剂包括生物素基酪酰胺，叠色垫包被链霉亲和素；或第二信号叠色试剂包括偶联配体或受体的酪酰胺，叠色垫包括与配体或受体偶联的受体或配体用于结合酪酰胺。
根据本公开的又一方面，提供了一种制备本公开的侧流免疫检测试剂盒的方法。在一些实施方式中，所述方法包括：用预处理缓冲液涂敷样本垫；用HRP标记抗体或抗原，得到经HRP标记的抗体或抗原；将经HRP标记的抗体或抗原包被在反应结合垫上；用预处理缓冲液涂敷信号叠色垫，烘干后涂敷链霉亲和素，得到经包被的信号叠色垫；在层析膜上分别喷划捕获抗体或抗原作为检测线，喷划二抗作为质控线；将所述层析膜、所述反应结合垫、所述样本垫盒所述吸水纸依次设置在所述支持物上；所述信号叠色垫设置在样本垫和反应结合垫上，同时与层析膜重叠。
在一些实施方式中，所述样本垫可以通过以下步骤来制备：将所述预处理缓冲液涂敷到玻璃纤维膜上，烘干得到所述样本垫。在一些实施方式中，所述烘干可以在35～56℃，优选35～40℃，特别是37℃的条件下进行。在一些实施方式中，所述烘干可以持续12～24小时。
在一些实施方式中，所述预处理缓冲液可以包括有50～150mM的Tris、5～10mg/mL的NaCl、0.1％～1％(体积比)的Tween-20和5～20mg/mL的酪蛋白。
在一些实施方式中，所述信号叠色垫可以通过以下步骤来制备：将所述预处理液涂敷在玻璃纤维膜上，烘干；然后，将链霉亲和素涂敷在处理过的玻璃纤维膜上，烘干后得到所述信号叠色垫。在一些实施方式中，所述链霉亲和素可以间隔一定距离地喷涂在所述玻璃纤维膜上。这样，可以在信号叠色垫上形成多个间隔开的线条。在一些实施方式中，所述链霉亲和素可以结合在乳胶微球或者胶体金上。
本公开提供一种新型试纸条和层析方式，进行两步反应，第一步先按照传统免疫层析的方式在样品垫上加入样本进行层析，结合垫中待测物捕获物质与待测物结合形成抗原抗体复合物，形成的带有显色标志物的抗原抗体复合物层析至层析膜T线被T线上的捕获，形成条状色带，以指示待测物存在与否，加入上样缓冲液，以冲洗未结合的标记物，降低背景信号；第二步，利用酪酰胺化学增强反应，对免疫层析试纸条的显色区域的信号进行特异性的叠色，从而实现检测信号进一步放大。实现了在保持原有层析技术简便性的同时，大幅降低了背景信号、提升其检测灵敏度和检测线性范围。
附图说明
图1示例性示出了根据本公开一个实施方式的检测试纸条的斜视拆解图。“1”表示试纸条PVC背板，“2”表示样本垫，“3”表示反应结合垫，“4”表示硝酸纤维膜，“5”表示信号叠色垫，“6”表示吸水垫。
图2示出了根据本公开一个实施方式的HRP标记抗体标记验证结果。
图3示出了根据公开的一个实施方式的HRP标记抗体的活性验证结果。
图4示出了根据本公开一个实施方式的试纸条检测(乳胶微球法)的灵敏度测试结果。“对照”表示某普通试纸条竞品，“测试试纸条”表示根据本公开一个实施方式的乳胶微球试纸条。
图5示出了根据本公开一个实施方式的试纸条检测(乳胶微球法)的特异性测试结果。“H3N2”指甲型H3N2流感病毒，“H1N1”指H1N1型流感病毒，“RSV”指呼吸道合胞病毒，“野生型”、“Alpha”、“Beta”、“Gamma”、“Delta”、“Omicron BA1”和“Omicron BA2”分别表示七种不同的新型冠状病毒变异株。
图6示出了利用酪酰胺显色技术的灵敏度测试结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
图1示例性示出了根据本公开一个实施方式的检测试纸条的斜视拆解图。“1”表示试纸条PVC背板，“2”表示样本垫，“3”表示反应结合垫，“4”表示硝酸纤维膜，“5”表示信号叠色垫，“6”表示吸水垫。
在具体的实施方式中，本公开的试剂盒可以用于检测新型冠状病毒的抗原或抗体。
在具体的实施方式中，所述样本裂解液可以按照如下步骤配制：将1.21g Tris，1g氯化钠，0.05g叠氮化钠，1mL曲拉通X-100，1mL吐温20，加入适量水溶解后，调节pH至8.2～8.6后定容至100mL。
在具体的实施方式中，所述第一信号叠色试剂可以按照如下步骤配制：将1.21gTris，1g氯化钠，0.05g叠氮化钠，1mL吐温20，1g聚乙烯吡咯烷酮，6μL 35％过氧化氢，加入适量水溶解后，调节pH至8.2～8.6后定容至100mL。
在具体的实施方式中，所述第二信号叠色试剂可以按照如下步骤配制：将1.21gTris，1g氯化钠，0.05g叠氮化钠，1mL吐温20，1g聚乙烯吡咯烷酮，1mg生物素基酪酰胺，加入适量水溶解后，调节pH至8.2～8.6后定容至100mL。
在具体的实施方式中，所述上样缓冲液可以按照如下步骤配制：将1.21g Tris，1g氯化钠，0.3g氯化钾，0.05g叠氮化钠，1mL吐温20，0.5g聚乙烯吡咯烷酮，0.5g酪蛋白，加入适量水溶解后，调节H至8.2～8.6后定容至100mL。
在具体的实施方式中，本公开的试剂盒可以用于检测新型冠状病毒的抗原或抗体。
在具体的实施方式中，所述试纸条可以通过如下步骤组装：以PVC板作为支持物，依次粘贴层析膜、反应结合垫、样本垫和吸水纸，相邻各附件之间的重叠长度约1～2mm，其中在平齐反应结合垫与层析膜结合处，粘贴样本垫和反应结合垫；将信号叠色垫粘贴到样本垫和反应结合垫上，同时与层析膜重叠1～2mm。
定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
实施例1：超灵敏试纸条(乳胶微球法)的制备
HRP标记抗体制备：称取适量的活化HRP干粉，加入适量的去离子水复溶成10mg/mL的活化HRP溶液。将新型冠状病毒检测抗体OV19-PS-MAb1单克隆抗体(菲鹏生物)稀释至2mg/mL，并向抗体溶液中加入1/10体积的标记缓冲液(0.15M Na2CO3，0.35M NaHCO3，pH9.6)，充分混匀后，加入等抗体质量的活化HRP到抗体溶液中，充分摇匀后，在37℃条件下避光反应2小时。将反应终止液干粉(NaBH4)中加入1mL的去离子水，配置成反应终止液(2.5mg/mL)。向反应溶液中加入1/10体积的反应终止液，充分混匀后，室温放置1小时。终止完成后，使用100K的超滤管浓缩洗涤三次，复溶至适当浓度后，加入等体积的标记保存液，充分混匀后置于-20℃条件下备用保存。通过SDS-PAGE电泳法检测产物，结果如图2所示。从图2的结果表明，HRP成功标记到新型冠状病毒检测抗体上。活性检测结果如图3所示，从图3结果表明，HRP抗体标记物具有HRP反应活性。
乳胶微球结合物制备：取1mg乳胶微球，分别加入1μL和10μL的10mg/mL的EDC(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化反应半小时。用硼酸缓冲液离心洗涤三次后复溶至500μL，加入20μg新型冠状病毒HRP检测标记抗体室温反应1小时。随后加入500μL含2％ BSA的缓冲液封闭2小时。用PBS缓冲液离心洗涤三次后复溶，4℃保存备用。
反应结合垫制备：将制备好的乳胶微球HRP标记抗体结合物，喷涂到玻璃纤维膜上，于37℃条件下烘干12～24小时。由此获得结合垫，放置于干燥环境中室温保存。
叠色垫制备：取适量的样本垫预处理液(成分含有100mM Tris、10mg/mL NaCl、1％Tween-20、5mg/mL酪蛋白等)，每25cm×30cm涂布20～25mL样本预处理液涂布在玻璃纤维膜上。充分涂抹后上，置于37℃条件下烘干12～24小时。进一步的，将乳胶微球链霉亲和素结合物，每间隔1.5cm，喷涂在处理过的玻璃纤维膜上，于37℃条件下烘干12～24小时，放置于干燥环境中室温保存。
层析膜制备：用磷酸缓冲液将新型冠状病毒捕获抗体稀释至浓度为1mg/mL喷划在硝酸纤维膜上，作为检测线。将羊抗鼠抗体稀释至0.5mg/mL喷划在硝酸纤维膜上，作为质控线。进一步的，将喷划完毕的硝酸纤维膜置于37℃条件下干燥6～12h，保存在干燥室温条件下。
试纸条的组装(如图1所示)：以PVC板为背板1，依次粘贴层析膜4、反应结合垫3、样本垫2和吸水垫6，相邻各组分之间叠合长度为1～2mm。用防水双面胶平齐反应结合垫3与层析膜4结合处，粘贴于样本垫2和反应结合垫3，长1.5cm。将信号叠色垫5粘贴到样本垫2和反应结合垫3上，同时与层析膜4叠合1～2mm。进一步使用透明胶带将信号叠色垫5和层析膜4贴合。即得酪酰胺信号叠色的新型冠状病毒抗原检测超灵敏试纸条(乳胶微球法)。
实施例2：超灵敏试纸条(胶体金法)的制备
与实施例1不同的是：
反应结合垫制备是将制备好的胶体金HRP标记抗体结合物，喷涂到玻璃纤维膜上，于37℃条件下烘干12～24小时。放置于干燥环境中室温保存。
其中胶体金HRP标记抗体结合物的制备：
取10mL的0.04％胶体金溶液，加入8～10μL的0.2M碳酸钾溶液。充分混匀后加入20μg HRP标记抗体。室温旋转反应10分钟后，加入20μL含有10％ BSA的封闭液，充分混匀室温反应5分钟。离心收集后，用500μL Tris缓冲液重悬，保存至4℃条件备用。
叠色垫的制备是将制备好的SA胶体金结合物，喷涂到用每25cm×30cm涂布20～25mL样本预处理液预处理过的玻璃纤维膜上，于37℃条件下烘干12～24小时。放置于干燥环境中室温保存。
其中链霉亲和素(SA)胶体金结合物的制备：
取10mL的0.04％胶体金溶液，加入10-12μl的0.2M碳酸钾溶液。充分混匀后加入25μg SA。室温旋转反应10分钟后，加入20μL含有10％ BSA的封闭液，充分混匀室温反应5分钟。离心收集后，用500μL Tris缓冲液重悬，保存至4℃条件备用。
实施例3：利用实施例1和实施例2的试纸条进行检测的方法
将咽鼻拭子样本，浸入到200～300μL样本裂解液中，充分混匀后制备成样本液。滴加约80～100μL样本液至样本垫上。待15分钟后，向样本垫上继续滴加50μL的上样缓冲液，继续等待15分钟后。将第一信号叠色试剂和第二信号叠色试剂按体积比1：1混合，混合液滴加至样本垫上。继续等待15分钟后，在叠色垫上，滴加50μL上样缓冲液，继续等待15分钟后读取结果。当检测线不显色时，则判断检测结果为阴性(即，不含新型冠状病毒)；当检测线显色时，则判断检测结果为阳性(即，含新型冠状病毒)；当质控线不显色时，则该检测结果无效。
实施例4：利用酪酰胺化学叠色的信号叠色技术的试纸条检测(乳胶微球法)灵敏度测试
将新型冠状病毒N蛋白标准品倍半稀释成0、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000pg/mL浓度梯度。分别使用上述实施例1中制备的试纸条与普通试纸条测试新型冠状病毒核衣壳(N)蛋白标准品，获得直观的检测结果。利用灰度分析对检测结果进行定量，定量结果使用四参数拟合法进行拟合比对。
结果如图4所示，一种利用酪酰胺信号叠色的新型冠状病毒超灵敏试纸条相较于普通的试纸条其检测性能明显提高，灵敏度约提升16倍，最低检出限提升至7.8pg/mL。
实施例5：一种利用酪酰胺化学叠色的信号叠色技术新型冠状病毒超灵敏试纸条检测(乳胶微球法)特异性测试
将六种不同的呼吸道疾病病毒灭活物(B型流感V系病毒、B型流感Y系病毒、副流感病毒2、禽流感H3N2、禽流感H1N1、呼吸道合胞病毒RSV)以及七种新型冠状病毒灭活物分别稀释5TCID50/mL。用上述实施例1中制备的试剂条测试以上的样本。利用灰度分析对检测结果进行定量，定量结果使用四参数拟合法进行拟合比对。
结果如图5所示，利用酪酰胺化学叠色的信号叠色技术的新型冠状病毒超灵敏试纸条能够特异性的检测新型冠状病毒其具有明显的特异性，对于七种不同的新冠变异株均能检出，而对于其余六种流感病毒没有信号反应。
实施例6：一种利用酪酰胺显色技术的新型冠状病毒超灵敏试纸条方案及其灵敏度测试
与实施例1不同的是，该实施例中方案不再利用酪酰胺叠色技术，而是将酪酰胺直接作为显色试剂。其中反应结合垫制备：将HRP标记抗体结合物浓度为5～10μg/mL，喷涂到玻璃纤维膜上，于37℃条件下烘干12～24小时。由此获得无乳胶微球标记的白金结合垫，放置于干燥环境中室温保存。
其中其余组分与实施例1中相同，以及其组装方式和使用方法均相同。
其中灵敏度测试，将新型冠状病毒N蛋白标准品倍半稀释成0、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000、2000pg/mL浓度梯度。结果如图6所示，其灵敏度相较于实施例1和实施例3的灵敏度明显较差，其灵敏度仅能达到62.5pg/mL。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种侧流免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
试剂条，所述试剂条包括支持物，以及交叠设置在所述支持物上的样本垫、反应结合垫、信号叠色垫、层析膜、吸水垫，且所述信号叠色垫与层析膜重叠，层析膜上设置有检测线和质控线；
第一信号叠色试剂，其包括过氧化氢；和，
第二信号叠色试剂，其包括生物素基酪酰胺；
其中，所述信号叠色垫设置在样本垫和反应结合垫上；
其中，所述信号叠色垫包被有链霉亲和素，所述链霉亲和素结合在第一标记物上；
其中，所述反应结合垫包被有辣根过氧化物酶HRP标记的抗体或抗原；
其中，所述HRP标记的抗体或抗原结合在第二标记物上；
其中，所述第一标记物和所述第二标记物相同，选自胶体金或乳胶微球；
所述试剂盒采用双抗体夹心法或双抗原夹心法。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一信号叠色试剂包括体积比为0.00196％～0.0021％的过氧化氢。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一信号叠色试剂还包括10～15mg/mL的Tris、5～10mg/mL的氯化钠，0.5mg/mL的叠氮化钠，体积比为1～2％的吐温20，和/或5～10mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二信号叠色试剂包括0.01～0.02mg/mL的生物素基酪酰胺。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第二信号叠色试剂还包括10～15mg/mL的Tris，5～10mg/mL的氯化钠，0.1～1mg/mL的叠氮化钠，1～2％的吐温20，和/或5～10mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本裂解液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述样本裂解液包括10～15mg/mL的Tris，5～10mg/mL的氯化钠，0.1～1mg/mL的叠氮化钠，体积比为1～2％的曲拉通X-100，和/或体积比为0.5～1％的吐温20。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括上样缓冲液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述上样缓冲液包括10～15mg/mL的Tris，5～10mg/mL的氯化钠，3～5mg/mL的氯化钾，0.1～1mg/mL的叠氮化钠，体积比为0.1～0.2％的曲拉通X-100，5～10mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮，和/或5～10mg/mL的酪蛋白。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测线上包被有捕获抗体或抗原；所述质控线上包被有二抗或抗原。
11.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HRP标记的抗体或抗原用于结合待测物，所述待测物为微生物、生物标记物、环境污染物、毒品、药品或化学品残留物。
12.一种使用权利要求1至11中任一项所述的试剂盒进行检测的方法，所述检测方法用于非疾病诊断目的，其特征在于，所述方法包括：
1)将样本加载到所述样本垫上；和
2)将所述第一信号叠色试剂和所述第二信号叠色试剂加载到所述样本垫上；和
3)将上样缓冲液加载到所述信号叠色垫上。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，将样本加载到所述样本垫上之后加载上样缓冲液。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，在将样本加载到所述样本垫上之后2～20分钟，加载上样缓冲液。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，将所述第一信号叠色试剂和所述第二信号叠色试剂加载到所述样本垫上之后加载上样缓冲液至所述样本垫。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，将所述第一信号叠色试剂和所述第二信号叠色试剂加载到所述样本垫上之后2～20分钟，加载上样缓冲液至所述样本垫。
17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一信号叠色试剂和所述第二信号叠色试剂按照1:1的比例加载。
18.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，将所述上样缓冲液加载到所述信号叠色垫之后读取结果。
19.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，将所述上样缓冲液加载到所述信号叠色垫之后2～20分钟，读取结果。
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