CN111323587B - 一种用于早期贲门腺癌筛查的自身抗体联合检测elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于早期贲门腺癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，该试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL组成。进一步地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液和洗涤液。本发明的ELISA试剂盒可以有效检测贲门腺癌，尤其是早期贲门腺癌，其检测灵敏度高达86%，特异度也高达到88%，可用于贲门腺癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状高危人群筛查和早期发现。

Description

一种用于早期贲门腺癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试 剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种用于早期贲门腺癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。

背景技术

贲门位于食管胃交界处的下方与胃最相邻的部位，即从鳞状上皮-柱状上皮交界处向下延伸约2cm。Stein等将食管胃交界腺癌(adenocarcinoma of the eso phagogastric junction,AEG)分为三型,Ⅰ型AEG为源于特殊肠化的远端食管腺癌；Ⅱ型为真正的贲门腺癌，源于贲门上皮或食管胃交界处肠化的短片段；Ⅲ型为亚贲门腺癌，累及食管胃交界和远端食管。我国以Ⅱ型为主，本专利中的所述的贲门腺癌均为Ⅱ型贲门腺癌。

在我国的北部尤其是河南省林州市(原林县)及其相邻的辉县，贲门腺癌的死亡率和发病率在各类恶性肿瘤中位居前列，林州市人民医院每年实施手术治疗的原发性食管癌与贲门腺癌患者的构成比中，食管癌约为60％，贲门腺癌约为40％。而其引起的死亡达居民总死亡原因的20％。由于缺乏特异度临床症状，超过90％的贲门腺癌患者都在中晚期才就医，此时的5年生存率仅为10％左右，而早期贲门腺癌的5年生存率可达80％-90％以上，因此及时诊断直接影响到贲门腺癌患者的生存率。目前，对无症状人群进行胃镜普查，是发现早期贲门腺癌的主要技术手段，尽管胃镜逐渐普及，但其用于贲门腺癌普查时，需要消耗大量的人力、物力资源，且患者接受度低。因此在早期用非侵入性的方法，对于早期贲门腺癌的诊断和预后有重要意义。近年的研究发现了一系列恶性肿瘤的相关抗原，其中一些已经应用于临床辅助诊断，比如甲胎蛋白已作为肝癌诊断的一项生物学指标、CA125已应用于卵巢癌的普查和筛选，癌胚抗原(CEA)己作为早期诊断肠道腺癌特异度标志物。然而尚无贲门腺癌特异相关抗原。因此，寻找高效、特异的贲门腺癌分子标志物越来越受到国内外的重视。

肿瘤相关抗原(Tumor-associated Antigen，TAA)是与病理生理过程相关的可测量的变化。申请号为201910471686.5的发明专利公开了一种用于贲门腺癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，该试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由Dock10、IVL、CDH1和P53组成，可用于早期贲门腺癌的筛查，其检测灵敏度虽然达到了87.5％，但检测的特异度较低，仅有75％；因此，非贲门腺癌患者采用该试剂盒进行检测时，误诊率较高。本研究团队在前期利用全基因组关联分析、全基因组测序和全基因组外显子测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，应用自身抗体芯片技术筛选出6种TAA，分别为P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL，并且发现在贲门粘膜上皮发生癌变之前就能够检测到上述6种TAA的自身抗体存在，这些自身抗体对于贲门腺癌和癌前病变患者具有较高的特异度和敏感性。且与单个自身抗体检测方法相比，用多个肿瘤相关抗原来联合检查患者体内自身抗体的表达情况，有利于提高针对某一肿瘤的检出率。然而，应用P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL这6种TAA来检测贲门腺癌患者血清中相应自身抗体的表达并未见报道。

因此，本研究提出一种可用于早期贲门腺癌诊断的ELISA试剂盒，这将会推动我国贲门腺癌的诊治水平，也为将来对贲门腺癌的进一步研究提供思路。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明旨在提供一种用于早期贲门腺癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

肿瘤相关抗原P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL的组合在制备用于筛查早期贲门腺癌的自身抗体联合检测ELISA试剂盒中的应用。

一种用于早期贲门腺癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL组成。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。更加优选地，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为2mol/L的浓硫酸；所述洗涤液为含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体带有可检测的标记物。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体为RecA蛋白。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。更加优选地，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的贲门腺癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平均为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。大量研究已明确表明P53抗原在贲门腺癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用，并且P53抗体在贲门腺癌患者血清中具有较高的表达。本发明选择P53抗体阳性血清作为阳性对照，P53抗体阴性血清作为阴性对照，阳性对照血清和阴性对照血清是经过精心筛选出来的血清，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述固相载体为酶标板。更加优选地，所述酶标板为48孔酶标板(共6行8列)，所述48孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图1)包被P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL这6种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于7个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入该48孔酶标板的一列，可同时检测出该血清样品中6种抗TAA抗体表达水平，可进行大规模的样品检测。所述48孔酶标板第8列中设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被P53抗原。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述自身抗体联合检测ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次将P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL这6种TAA作为一个组合，联合检测人血清中上述6种TAA的抗体表达水平，可以有效检测贲门腺癌，尤其是早期贲门腺癌，其检测灵敏度高达86％(即早期贲门腺癌患者中应用这6个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确的诊断为早期贲门腺癌的比率为86％)，特异度达到了88％(即非贲门腺癌患者用这6种肿瘤相关抗原联合检测时，被确定为未患贲门腺癌者的比率为88％)，因此，本发明的试剂盒在保证检测灵敏度的基础上，极大地提高了检测的特异度，保证低漏诊率的同时大大降低了误诊率，在最大程度上筛查出早期贲门腺癌，又能极好地避免误诊给病人带来身心痛苦、给国家带来医疗资源的浪费，为有效判断早期贲门腺癌提供了更加精准、平衡性强的科学依据。

(2)本发明的ELISA试剂盒具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期贲门腺癌的检出率，可用于贲门腺癌高发区无症状人群的大规模筛查，而且，本发明试剂盒对贲门腺癌的检出率远高于现有临床内镜筛查贲门腺癌的检出率，有利于无症状贲门腺癌高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了贲门腺癌患者的死亡率，为贲门腺癌患者和家庭带来极大的福祉。

(3)本发明制备的ELISA试剂盒可同时检测血清样品中6种TAA抗体的表达水平，与6种TAA抗体的单独检测相比，6种TAA抗体联合检测，检出成功率高，技术重现性好，耗材少，成本低，操作简单，使用方便、快捷，极大地提高了临床贲门腺癌的检测效率和诊断效率，能够在普通实验室推广使用，有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明ELISA试剂盒中48孔酶标板的抗原包被布局图(其中，抗原名称代表了该孔包被了此抗原，加入的是待测血清，用来检测待测血清中相应抗体的表达水平；“+”代表阳性对照孔，加入的是阳性对照血清；“-”代表阴性对照孔，加入的是阴性对照血清；“空白”代表空白对照孔，该孔加入不含血清的样本稀释液，其它操作均相同，该空白对照用于反应实验过程中的背景值)。

图2为间接酶联免疫吸附实验原理图。

图3为6种TAA自身抗体在贲门腺癌血清中的分布图。

图4为6种TAA自身抗体在对照组血清中的分布图。

图5为6种TAA自身抗体在贲门腺癌组和对照组中的阳性率结果图。

图6为6种TAA自身抗体检测早期贲门腺癌的ROC曲线图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。

下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：肿瘤相关抗原的制备

通过使用原核表达系统，原核表达和纯化6种肿瘤相关抗原(P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL)，以便为下步实验做准备。具体抗原制备过程如下：

(1)使用基因克隆技术构建6种肿瘤相关抗原蛋白(P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL)的重组原核表达质粒；

(2)表达目的蛋白：将构建的重组原核表达质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中使用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导目的蛋白表达；

(3)纯化目的蛋白：根据目的蛋白所携带的标签，采用传统的相应纯化方案对目的蛋白进行纯化；

(4)使用Bradford法测定蛋白浓度，使用Western Blot法对纯化蛋白的免疫学活性进行鉴定。

鉴于原核表达系统纯化重组蛋白技术已比较成熟，具体过程不再详述，通过以上制备步骤，成功获取6种有活性的目的蛋白，即肿瘤相关抗原，为后续实验做准备。

实施例2：试剂盒的制备

本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种用于早期贲门腺癌筛查和诊断的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量(参见图2)。

1.实验材料及试剂：

(1)6种肿瘤相关抗原蛋白(P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL)；

(2)48孔酶标板：购自Corning公司；

(3)包被液：50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；

(4)封闭液：含2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(5)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(6)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(7)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(8)洗涤液：含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

(9)阳性对照血清：P53阳性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的贲门腺癌患者血清；

(10)阴性对照血清：P53阴性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清；

(11)显色液A：0.02％(W/V)TMB，配制：取甲基联苯胺(TMB)0.005g，溶解于25ml去离子水中；

(12)显色液B：0.006％(W/V)过氧化脲，配制：取柠檬酸4.665g、Na₂HPO₄18.40g，充分溶解于400ml去离子水中，加0.75％过氧化氢脲素3.2ml，调整pH值至5.0-5.5，加去离子水定容至终体积500ml，混匀4℃保存；

(13)终止液：2mol/L的硫酸；

(14)酶标仪：Star Fax 2100(Awareness.美国)。

2.制备抗原包被的酶标板：

(1)制备6种肿瘤相关抗原溶液：

将6种肿瘤相关抗原蛋白分别溶解于包被液中，充分混匀，配制成浓度均为0.75μg/μL的6种抗原溶液。

(2)包被酶标板：

将制备好的6种肿瘤相关抗原溶液按照图1所示的布局分别加入到48孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔；阳性对照孔和阴性对照孔中加入p53抗原溶液，空白对照孔加入包被液，37℃恒温培养箱孵育1h，4℃过夜后去除包被液，然后用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

(3)封闭：

向包被后的48孔酶标板的点样孔中加入封闭液(加样量为300μl/孔)，室温孵育2小时，然后除去封闭液。

(4)干燥、包装：

将封闭处理后的48孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到抗原包被的48孔酶标板，4℃保存备用。

3.本发明试剂盒的组成如下：

(1)步骤2制备的抗原包被的48孔酶标板；

(2)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(3)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(5)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％(W/V)TMB，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀；

(6)终止液：2mol/L的硫酸；

(7)洗涤液：含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

(8)阳性对照血清：P53阳性对照血清；

(9)阴性对照血清：P53阴性对照血清。

试剂(2)-(9)分别包装后与抗原包被的48孔酶标板构成试剂盒。

实施例3：试剂盒的使用方法

1.血清样本孵育：

将待检测的血清样本用样品稀释液按1：100的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被抗原的48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤5次，每次洗涤3min。

2.酶标二抗孵育：

将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用第二抗体稀释液按1：80000的比例进行稀释，然后将稀释后的辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白加入48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤5次。

3.显色及终止反应：

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃避光反应15min，然后向每个反应孔中再加入50μl终止液，终止显色反应，用自动酶标仪在450nm(检测波长)和595nm(参比波长)处读取OD值，并用空白对照孔调零。

4.结果判定：

以阴性对照孔所测OD值得平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值)，反应孔中OD值读数大于等于截断值的判断为阳性，反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。

实施例4：本发明试剂盒的诊断价值分析

用本发明实施例2所述的试剂盒的检测早期贲门腺癌患者和正常人的血清样本，以评估和分析本发明试剂盒用于早期贲门腺癌筛查和诊断的价值。

1.样本来源

根据流行病学分析，本研究收集了来自郑州大学第一附属医院河南省贲门腺癌重点开放实验室180份血清样本，其中正常人血清90份(对照组)，早期贲门腺癌患者血清90份(早期贲门腺癌组)。90例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的健康体检人群，无任何肿瘤相关的证据。90例正常人中，男性53例，女性37例，平均年龄59.9±6.8岁，年龄范围40-80岁。90份早期贲门腺癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)贲门腺癌患者，均未接受放疗或化疗治疗，被诊断的时间为2012年1月至2017年12月。90例贲门腺癌患者中，男性55例，女性35例，平均年龄58.8±7.1岁，年龄范围45-78岁。

2.血清制备

抽取空腹静脉血5ml至离心管中，室温中静置30分钟，离心(2000转/min)，吸取上层血清分装，每管100μl，-80℃冰箱储存。

3.实验方法

采用本发明的实施例2制备的试剂盒和实施例3所述的试剂盒的使用方法对90例正常人群血清(对照组)和90例早期贲门腺癌患者血清(贲门腺癌组)中6种TAA自身抗体的含量进行检测。应用MedCalc软件绘制6种肿瘤相关抗原自身抗体在贲门腺癌组和对照组中的平均表达水平分布图(结果见图3和图4)；以实施例3步骤4中的结果判断标准为标准，分别计算贲门腺癌组和对照组中6种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)，并应用Excel软件绘制6种肿瘤相关抗原自身抗体在早期贲门腺癌组和对照组中阳性率的柱形图(结果见图5)；应用SPSS22.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较贲门腺癌组和对照组抗体阳性率，检验水准α＝0.05，当P＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测贲门腺癌的诊断价值(结果参见表1和图6)。

4.结果分析

图3为6种肿瘤相关抗原自身抗体在90例贲门腺癌组血清中的分布图，从该图中可以看出，这6种肿瘤相关抗原自身抗体在早期贲门腺癌组中平均表达水平比较高，平均OD值在0.4附近浮动，并且OD值大于0.8的血清也比较多。图4为6种肿瘤相关抗原自身抗体在90例对照组血清中的分布图，从该图中可以看出，这6种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组中平均表达水平比较低，平均OD值在0.02附近浮动，最高的仅为0.09，远远低于0.4。由图3和图4可知，早期贲门腺癌组患者血清中6种TAA平均水平均明显高于对照组，提示6种TAA自身抗体可以用于早期贲门腺癌的筛查。

图5为6种肿瘤相关抗原自身抗体在贲门腺癌组和对照组中的阳性率结果，由图可知，早期贲门腺癌组患者血清中这6种TAA自身抗体阳性率在55％～70％范围内，而在对照组中的阳性率仅为8％～10％。经统计学检验，这6种TAA自身抗体在贲门腺癌组中的阳性率均高于对照组。由此证明，这6种TAA自身抗体可以作为早期贲门腺癌诊断检测指标，用于早期贲门腺癌的筛查。

表1不同肿瘤相关抗原自身抗体组合联合检测结果

由表1可知，随抗原组合数目的增加，早期贲门腺癌诊断的灵敏度整体呈增加趋势；尽管“P53+CDH1”这一抗原组合时，早期贲门腺癌诊断的灵敏度已经高达84％，但其特异度仅有32％，因此，该抗原组合的特异度太低，不能作为早期贲门腺癌筛查的联合指标；当6种肿瘤相关抗原组合时，灵敏度达到了86％(即早期贲门腺癌患者中应用这6个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确诊断为早期贲门腺癌的比率为86％)；而且，在保证高灵敏度的前提下，6种肿瘤相关抗原组合时，早期贲门腺癌诊断的特异度高达88％(即非贲门腺癌患者采用6种肿瘤相关抗原联合检测时，被正确的诊断为未患贲门腺癌的百分比为88％)。因此，使用P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL这6种肿瘤相关抗原组合进行早期贲门腺癌诊断，可以在保证诊断灵敏度的前提下大幅度的提高诊断的特异度。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0～1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着抗原组合数目的增加，约登指数逐渐增大，当6种肿瘤相关抗原组合时，约登指数明显趋向于1，表明其用于诊断和筛查早期贲门腺癌的方法具有较好的诊断价值。所以，采用P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL这6种肿瘤相关抗原的自身抗原联合检测待测血清中相应自身抗体表达水平的方法，既能保持较高的灵敏度又能提高诊断的特异度，对评估待测对象患贲门腺癌的风险具有很好的诊断和应用价值，是较为理想的早期贲门腺癌的筛查手段和方法。

由图6可知，应用6种肿瘤相关抗原联合检测早期贲门腺癌患者血清中的自身抗体时，随着抗原组合数目的增加，ROC曲线下面积由0.580升至0.870，说明使用该ELISA试剂盒和检测方法对早期贲门腺癌的诊断具有较高的判定正确性和诊断价值，进一步证明了该试剂盒可以作为较理想的早期贲门腺癌的筛查手段和方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.肿瘤相关抗原P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL的组合在制备用于贲门腺癌筛查的试剂盒中的应用。

2.一种用于早期贲门腺癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由P53、CDH1、NRG1、MDM2、RHOA和IVL组成。

3.根据权利要求2所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。

4.根据权利要求3所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体带有可检测的标记物。

5.根据权利要求4所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。

6.根据权利要求3～5任一所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体为RecA蛋白。

7.根据权利要求6所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。

8. 根据权利要求7所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的贲门腺癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。

9.根据权利要求8所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板。

10.根据权利要求9所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述自身抗体联合检测ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。

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