WO2022080385A1 - ペプチド、およびペプチドを用いる抗体の修飾 - Google Patents

ペプチド、およびペプチドを用いる抗体の修飾 Download PDF

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WO2022080385A1
WO2022080385A1 PCT/JP2021/037776 JP2021037776W WO2022080385A1 WO 2022080385 A1 WO2022080385 A1 WO 2022080385A1 JP 2021037776 W JP2021037776 W JP 2021037776W WO 2022080385 A1 WO2022080385 A1 WO 2022080385A1
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amino acid
group
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acid residue
peptide
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格 浜地
朋則 田村
大輝 後藤
良雄 林
共平 六車
茜 福田
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国立大学法人京都大学
学校法人東京薬科大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present disclosure relates to peptides and methods for modifying antibodies using peptides.
  • ADC antibody-drug conjugates
  • the ADC is a molecule in which an antibody and a small molecule drug are linked via a linker, and the drug is delivered by utilizing the antigen specificity of the antibody.
  • the antibody In order to make an ADC, the antibody must be chemically modified with a small molecule drug, and random modification to Lys or Cys residues in the antibody is known as the most common method for chemically modifying an antibody. ..
  • Modification to sites with low solvent contact may reduce the efficiency of linker cleavage and drug release.
  • ADCs with different numbers of binding agents are mixed, which can be affected by antibodies that are under- or over-modified. Since the inhomogeneous ADC produced based on the random modification of the drug as described above may not sufficiently exert the original drug effect, a method for strictly controlling the modification site and the number of antibodies is desired.
  • a method for introducing a free Cys residue (Engineered cysteine) (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2), a method for introducing an unnatural amino acid (Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5), etc.
  • An object of the present disclosure is to provide a method for modifying an antibody.
  • AGOX (affinity-guided oxime) chemistry is known as a new method for protein labeling (Non-Patent Document 6).
  • a highly nucleophilic pyridinium oxime (PyOx) is conjugated to a target protein-specific ligand, and this PyOx-binding ligand selectively binds to the target protein, and electrophilic N-acyl-on the protein surface.
  • Non-Patent Document 6 includes in vitro labeling of carbon dioxide dehydration enzyme II, labeling of endogenous membrane protein of human oral epidermal cancer cells, and ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole in brain tissue.
  • AMPA propionic acid
  • AMPAR type glutamate receptor
  • NASA N-acyl-N-alkylsulfonamide Protein: Target protein Pr: Probe Lg: Ligand Nu: Nucleophilic amino acid
  • Non-Patent Document 7 Patent Document 1
  • Patent Document 2 Patent Document 2
  • IgG preferably human IgG and / or rabbit IgG
  • the peptide has two Cys residues and forms a disulfide bond between the two Cys residues, or the sulfide group in the two Cys residues is the following formula (I) -3.
  • X 4 is absent or is any amino acid residue other than Cys when X 5 is present.
  • X 5 is absent or is any amino acid residue other than Cys.
  • X 6 is an amino acid residue selected from the group consisting of Cys, 2-aminobutanoic acid, and S-methylcysteine.
  • X 7 is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala and Thr.
  • X 8 is any aromatic amino acid residue
  • X 9 is a His residue
  • X 10 is Lys, Val, Leu, Arg, Ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid (Dbu), N6-acetyllysine, N5-acetylornithine, 2-amino-4-acetylaminobutanoic acid, 2,3-diamino From propionic acid (Dap), 2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid, 2-amino-4,4-dimethylpentanoic acid, 3-cyclohexylalanine and amino acid residues represented by the following formula (I) -1.
  • X 15 is a Trp residue
  • X 16 is an amino acid residue selected from the group consisting of Cys, 2-aminobutanoic acid and S-methylcysteine, where at least one of X 6 and X 16 is a Cys residue
  • X 17 is an amino acid residue that is absent or is selected from the group consisting of Thr, Ser, Val and 2-aminobutanoic acid
  • X 18 is an amino acid residue selected from the group consisting of Phe, His, Tyr, homocysteine (Hcy), 3-cyclohexylalanine and homophenylalanine when X 18 is absent or is present.
  • X 19 is absent, or when X 17-18 is present, His, Tyr, Ala, Phe, Trp, 3- ( 2-pyridyl) alanine, 3- (3-pyridyl) alanine and 3- ( 4-Pyridyl) An amino acid residue selected from the group consisting of alanine.
  • X 20 is absent or is any amino acid residue other than Cys when X 17 -X 19 are present. At least one (eg, 1-3, 1-2, 1) group below in one amino acid residue selected from X 1 to X 5 , X 7 to X 15 , and X 17 to X 20 .
  • R and a are synonymous with [1]] (Preferably ) Is conjugating] Contains (or consists of) the amino acid sequence represented by; 13. According to any one of [1] to [6], which has an amino acid length of 13 to 19 (preferably 13 to 17); and is preferably capable of binding to IgG (preferably human IgG and / or rabbit IgG). peptide.
  • X 8 is Tyr, Trp, 2-amino-3- (1-naphthyl) propionic acid, 2-amino-3- (2-naphthyl) propionic acid, 2-methylamino-3- (1H-indole-).
  • Equation (I) -2 At least one (eg, 1-3, 1-2, 1) group below in one amino acid residue selected from X 1 to X 5 , X 7 to X 15 , and X 17 to X 20 .
  • R and a are synonymous with [1]] (Preferably )
  • X 11 is an amino acid residue selected from the group consisting of Gly, D-Ile, D-Pro, D-Arg, D-Ser and D-Lys. At least one (eg, 1-3, 1-2, 1) group below in one amino acid residue selected from X 1 to X 5 , X 7 to X 15 , and X 17 to X 20 . : [In the formula, R and a are synonymous with [1]] (Preferably ) Is conjugating, The peptide according to [7] or [8].
  • [11] At least one (for example, 1-4, 1-3, 1-2, 1) in one amino acid residue selected from X 2 , X 4 , X 8 to X 10 , and X 20 .
  • the peptide according to any one of [7] to [10] to which the peptide is conjugated.
  • [12] At least one (for example, 1-4, 1-3, 1-2, 1) in one amino acid residue selected from X 2 , X 4 , X 10 , and X 20 .
  • the peptide according to any one of [7] to [11] to which the peptide is conjugated.
  • [15] A structure in which one amino acid residue (preferably X 10 ) selected from X 1 to X 5 , X 10 and X 20 is selected from the following: ) The peptide according to any one of [7] to [14].
  • One amino acid residue (preferably X 10 ) selected from X 1 to X 5 , X 10 and X 20 has the following structure: or The peptide according to any one of [7] to [15].
  • One amino acid residue (preferably X 10 ) selected from X 1 to X 5 , X 10 and X 20 has the following structure: or The peptide according to any one of [7] to [16].
  • One amino acid residue (preferably X 10 ) selected from X 2 , X 4 , X 10 and X 20 has the following structure: or The peptide according to any one of [7] to [17].
  • One amino acid residue selected from X 2 , X 4 , X 10 , and X 20 has the following structure: or The peptide according to any one of [7] to [18].
  • amino acid residue of X10 has the following structure: or The peptide according to any one of [7] to [19].
  • amino acid residue of X10 has the following structure: or The peptide according to any one of [7] to [20].
  • [22] A structure consisting of the amino acid sequence of X 1 X 2 X 3 X 4 DCAYHX 10 GELVWCTFHX 20 (SEQ ID NO: 34), in which the amino acid residue of X 10 is selected from the following: , More preferably ), The peptide according to any one of [7] to [21].
  • a structure consisting of the amino acid sequence of X 1 X 2 X 3 X 4 DCAYHX 10 GELVWCTFHX 20 (SEQ ID NO: 34), in which the amino acid residue of X 10 is selected from the following: Preferably ), The peptide according to any one of [7] to [22].
  • X 6 and X 16 are Cys residues, forming a disulfide bond between the Cys residues of X 6 and the Cys residues of X 16 or in the Cys residues of X 6 and X 16 .
  • [30] The following groups of at least 1 (for example, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 1) in a solvent: [In the formula, R and a are synonymous with [1]] (Preferably ) Contains the step of treating the antibody and / or fragments thereof with a payload-tethering N-acyl-N-alkyl sulfonamide in the presence of a peptide conjugated to (preferably capable of binding to the antibody). , How to modify the antibody.
  • a method for producing a conjugate of an antibody and a payload which comprises the method according to [30] or [31].
  • the N-acyl-N-alkylsulfonamide holding the payload is of formula (II) :.
  • L indicates a linker;
  • Pr indicates the payload;
  • R 1 is independently optionally substituted with 1 to 3 halos, C 1-3 alkyl, optionally substituted with 1 to 3 halos, C 1-3 alkoxy, halo, and. Selected from -NO 2 (preferably -NO 2 );
  • n is an integer selected from 0 to 5 (preferably 1 to 3)]
  • the method according to any one of [30] to [32].
  • the peptide is the peptide according to any one of [1] to [29];
  • the tethering N-acyl-N-alkylsulfonamide is the following formula (II) -a: [During the ceremony, L indicates a linker; Pr indicates payload] Have; The method according to any one of [30] to [33].
  • a peptide useful for modifying an antibody and a method for modifying an antibody are provided.
  • Test 1-2 Gel fluorescent labeling of labeled IgG using PyOx-IgG binding peptide UV-Vis spectral analysis of fractions of gel filtration chromatography by Nanodrop TM UV-Vis spectral analysis of labeled Herceptin Test
  • Example 1-3 HPLC analysis results of trypsin / Lys-C digested FL-labeled Herceptin MALDI-TOF-MS (ultraflex) analysis of peak 5 and peak 6 Crystal structure of 15L-lgBP-Herceptin complex
  • Test 2-2 Gel fluorescence labeling of labeled IgG using PyOx-IgG binding peptide C4: PyOx-C4-IgBPC2: PyOx-C2-IgBP Test
  • Example 2-3 HPLC analysis results of trypsin / Lys-C digested FL-labeled Herceptin
  • the present invention provides the following peptides as one embodiment.
  • the peptides of the present disclosure are: Equation (I): X 1 -X 2 -X 3 -X 4 -X 5 -X 6 -X 7 -X 8 -X 9 -X 10 -X 11 -X 12 -X 13 -X 14 -X 15 -X 16 -X 17 -X 18 -X 19 -X 20 (I) (SEQ ID NO: 1) [During the ceremony, X 1 is absent or is any amino acid residue other than Cys when X 2 to X 5 are present. X 2 is absent or is any amino acid residue other than Cys when X 3 to X 5 are present.
  • X 3 is absent or is any amino acid residue other than Cys when X 4 to X 5 are present.
  • X 4 is absent or is any amino acid residue other than Cys when X 5 is present.
  • X 5 is absent or is any amino acid residue other than Cys.
  • X 6 is an amino acid residue selected from the group consisting of Cys, 2-aminobutanoic acid, and S-methylcysteine.
  • X 7 is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala and Thr.
  • X 8 is any aromatic amino acid residue
  • X 9 is a His residue
  • X 10 is Lys, Val, Leu, Arg, Ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid (Dbu), N6-acetyllysine, N5-acetylornithine, 2-amino-4-acetylaminobutanoic acid, 2,3-diamino From propionic acid (Dap), 2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid, 2-amino-4,4-dimethylpentanoic acid, 3-cyclohexylalanine and amino acid residues represented by the following formula (I) -1.
  • X 15 is a Trp residue
  • X 16 is an amino acid residue selected from the group consisting of Cys, 2-aminobutanoic acid and S-methylcysteine, where at least one of X 6 and X 16 is a Cys residue
  • X 17 is an amino acid residue that is absent or is selected from the group consisting of Thr, Ser, Val and 2-aminobutanoic acid
  • X 18 is an amino acid residue selected from the group consisting of Phe, His, Tyr, homocysteine (Hcy), 3-cyclohexylalanine and homophenylalanine when X 18 is absent or is present.
  • X 19 is absent, or when X 17-18 is present, His, Tyr, Ala, Phe, Trp, 3- ( 2-pyridyl) alanine, 3- (3-pyridyl) alanine and 3- ( 4-Pyridyl) An amino acid residue selected from the group consisting of alanine.
  • X 20 is absent, or is any amino acid residue other than Cys when X 17 to X 19 are present. At least one (eg, 1-3, 1-2, 1) group below in one amino acid residue selected from X 1 to X 5 , X 7 to X 15 , and X 17 to X 20 .
  • the peptides of the present disclosure are capable of binding IgG (eg, human IgG, rabbit IgG).
  • IgG eg, human IgG, rabbit IgG.
  • the binding affinity of the peptide of the present disclosure to IgG is not particularly limited, but it is preferable that the peptide has an affinity that can function as a catalyst for promoting the acyl transfer reaction of the N-acyl-N-alkylsulfonamide acyl donor in AGOX chemistry. ..
  • the dissociation constant (K d ) for the binding of the peptides and IgG of the present disclosure can be determined by surface plasmon resonance spectral analysis (eg, using the BIACORE system), eg, 1 ⁇ 10 -10 M to 1 ⁇ 10 -4 M, More preferably, 1 ⁇ 10 -9 M to 1 ⁇ 10 -5 M, still more preferably 1 ⁇ 10 -9 M to 10 -7 M.
  • the peptides of the present disclosure have an IgG binding affinity of about 10-fold or more, preferably about 50-fold or more, as compared to other immunoglobulins (IgA, IgE, IgM). More preferably, it is about 200 times higher.
  • the peptides of the present disclosure are capable of binding to the Fc region of IgG.
  • the test for binding to the Fc region can be performed by a known method, for example, affinity measurement with Fc fragments by surface plasmon resonance method, X-ray crystal structure analysis, with existing Fc binding molecules such as protein A. For example, measurement of competition.
  • amino acid sequence described in the present specification is described in the direction from the N-terminal (amino-terminal) side to the C-terminal (carboxyl-terminal) side according to the convention.
  • amino acid residue means a portion of a peptide or protein molecule that corresponds to one unit of an amino acid constituting the peptide or protein. More specifically, it means a divalent group derived from an ⁇ -amino acid, which is expressed by the following formula: ..
  • R 0 is a side chain of an amino acid, for example, Gly is a hydrogen atom and Ala is a methyl group.
  • the "amino acid residue” is derived from a natural or unnatural ⁇ -amino acid, for example, Arg (R), Lys (K), Asp (D), Asn (N), Glu (E), and the like. Gln (Q), His (H), Pro (P), Tyr (Y), Trp (W), Ser (S), Thr (T), Gly (G), Ala (A), Met (M), Included are Cys (C), Phe (F), Leu (L), Val (V), and Ile (I), as well as amino acid residues derived from their analogs. When an optically active substance is possible, it may be either an L-form or a D-form, but an L-form is preferable.
  • the analog may be, for example, a derivative in which the side chains of the above 20 kinds of amino acid residues are substituted with arbitrary substituents, and for example, a halogenated derivative of the above 20 kinds of amino acid residues (for example, , 3-Chloroalanine), 2-aminobutyric acid, norleucine, norvaline, isovalin, 2-aminoisobutyric acid, homophenylalanine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,4-diaminobutanoic acid (Dbu), ornithine, 2-hydroxy Glycin, homoserine, hydroxylysine, hydroxyproline, 3,4-didehydroproline, homoproline, homocysteine, homomethionine, aspartic acid ester (eg, aspartic acid-methyl ester, aspartic acid-ethyl ester, aspartic acid-propyl ester, Aspartic acid-cyclohexyl ester, aspart
  • Ile is used to mean both (2R * , 3R * ) -2-amino-3-methylpentanoic acid and (2R * , 3S * ) -2-amino-3-methylpentanoic acid.
  • Thr is used to mean both (2R * , 3S * ) -2-amino-3-hydroxybutanoic acid and (2R * , 3R * ) -2-amino-3-hydroxybutanoic acid.
  • it is a natural diastereomer (ie, (2R * , 3R * ) -2-amino-3-methylpentanoic acid for Ile, (2R * , 3S * ) -2-amino-3 for Thr. -Hydroxybutanoic acid) is used.
  • the "arbitrary substituent" includes, for example, a halogen atom such as fluorine, chlorine, bromine, iodine, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkoxycarbonyl group, an acyloxy group, an acyl group, and the like.
  • each amino acid residue can be replaced with an amino acid residue having similar properties based on the difference in its side chain (conservative substitution).
  • the aliphatic hydrophobic amino acids Val, Leu, Ile, 2-aminobutyric acid (Abu), norleucine (Nle), norvaline (Nva), and isovaline (Iva) can be substituted with each other.
  • Gly, Ala and 2-aminoisobutyric acid (Aib), whose side chains are hydrogen atoms or methyl groups, can be replaced with each other.
  • the neutral polar amino acids Asn and Gln can be replaced with each other.
  • 2,4-Diaminobutanoic acid (Dbu), and ornithine (Orn) can be replaced with each other.
  • Pro and homoproline (homoPro) can be replaced with each other.
  • aromatic amino acid residues examples include Ph, Tyr, Trp, 2-amino-3- (1-naphthyl) propionic acid, 2-amino-3- (2-naphthyl) propionic acid, 2-methyl.
  • alkylene group having 1 to 4 carbon atoms in the definition of K 1 means a linear divalent saturated hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms.
  • alkylene include methylene, dimethylene, trimethylene and tetramethylene.
  • X 1 of the peptides of the present disclosure is absent, or is any amino acid residue (eg, Arg residue) other than Cys when X 2 to X 5 are present. In one embodiment of the invention, the peptide X 1 of the present disclosure is absent.
  • X 2 of the peptides of the present disclosure is absent, or any amino acid residue other than Cys (eg, Lys residue, Arg residue) when X 3 to X 5 are present. Basic). In one embodiment of the invention, the peptide X2 of the present disclosure is absent.
  • X 3 of the peptides of the present disclosure is absent, or any amino acid residue other than Cys when X 4-5 is present ( eg, Gly, Arg, Ser, etc.) Amino acid residue selected from the group consisting of Ala and 2-aminoisobutyric acid).
  • X4-5 of the peptides of the present disclosure where X3 is an amino acid residue selected from the group consisting of Gly, Arg, and Ser.
  • the peptide X3 of the present disclosure is absent.
  • X 4 of the peptides of the present disclosure is absent, or any amino acid residue other than Cys when X 5 is present (eg, Pro, Lys, homocysteine, Gly, Amino acid residues selected from the group consisting of Asp and homoproline residues, preferably Pro residues).
  • the peptide X5 of the present disclosure is present and the peptide X4 of the present disclosure is an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Lys, homocysteine, Gly, and Asp. be.
  • the peptide X4 of the present disclosure is absent.
  • the peptide X5 of the present disclosure is absent or any amino acid residue other than Cys (eg Asp, Asn, Arg, Glu, Ser, 2-aminobutanoic acid and 2).
  • -Amino acid residues selected from the group consisting of amino-3-sulfopropionic acid, preferably amino acid residues selected from the group consisting of Asp, Glu and 2-amino-3-sulfopropionic acid).
  • X5 of the peptide of the present disclosure is an Asp residue.
  • X6 of the peptide of the present disclosure is an amino acid residue selected from the group consisting of Cys, 2 -aminobutanoic acid, and S-methylcysteine. In one embodiment of the invention, X6 of the peptide of the present disclosure is a Cys residue.
  • the peptide X7 of the present disclosure is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala and Thr. In one embodiment of the invention, X7 of the peptide of the present disclosure is an Ala residue.
  • the peptide X8 of the present disclosure comprises any aromatic amino acid residue (eg, Tyr, Trp, 2-amino-3- (1-naphthyl) propionic acid, 2-amino-3).
  • -Amino acid selected from the group consisting of (2-naphthyl) propionic acid, 2-methylamino-3- (1H-indole-3-yl) propionic acid and amino acid residues represented by the following formula (I) -2.
  • Residue formula (I) -2: ).
  • the peptide X8 of the present disclosure is a Tyr or Trp residue.
  • X8 of the peptide of the present disclosure is a Tyr residue.
  • X 9 of the peptide of the present disclosure is a His residue.
  • the peptides X10 of the present disclosure are Lys, Val, Leu, Arg, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid (Dbu), N6-acetyllysine, N5-acetylornithin, 2-.
  • the peptide X10 of the present disclosure is selected from the group consisting of Lys, Leu, Arg, 2,4-diaminobutanoic acid (Dbu), 2,3-diaminopropionic acid (Dap). Amino acid residue.
  • the peptide X10 of the present disclosure is a Lys residue, 2,4-diaminobutanoic acid (Dbu), or 2,3-diaminopropionic acid (Dap) residue. In one embodiment of the invention, X10 of the peptide of the present disclosure is a Lys residue.
  • the peptide X11 of the present disclosure is any D-amino acid except Gly and Cys (eg, D-Ile, D-Pro, D-Arg, D-Ser and D-Lys). Amino acid residues selected from the group consisting of. In one embodiment of the invention, X 11 of the peptide of the present disclosure is a Gly residue.
  • the peptide X12 of the present disclosure is an amino acid residue selected from the group consisting of Glu, Gln and Asn. In one embodiment of the invention, X12 of the peptide of the present disclosure is a Glu residue.
  • X13 of the peptide of the present disclosure is a Leu residue.
  • X14 of the peptide of the present disclosure is an amino acid residue selected from the group consisting of Val and Ile. In one embodiment of the invention, X 14 is a Val residue.
  • X15 of the peptide of the present disclosure is a Trp residue.
  • the peptide X16 of the present disclosure is an amino acid residue selected from the group consisting of Cys, 2-aminobutanoic acid and S-methylcysteine.
  • X16 of the peptide of the present disclosure is a Cys residue.
  • the peptide X17 of the present disclosure is absent or is an amino acid residue selected from the group consisting of Thr, Ser, Val and 2-aminobutanoic acid. In one embodiment of the invention, X 17 of the peptide of the present disclosure is a Thr residue.
  • the peptide X 18 of the present disclosure is absent, or when X 17 is present, from Ph, His, Tyr, homocysteine (Hcy), 3-cyclohexylalanine and homophenylalanine. Amino acid residues selected from the group consisting of. In one embodiment of the invention, the peptide X18 of the present disclosure is absent. In one embodiment of the invention, the peptide X 17 of the present disclosure is present, X 18 is an amino acid residue selected from the group consisting of Phe, His, homocysteine (Hcy) and homophenylalanine. In one embodiment of the invention, the peptide X 17 of the present disclosure is present, where X 18 is a Phe residue.
  • the peptide X 19 of the present disclosure is absent, or His, Tyr, Ala, Ph, Trp, 3- (2-pyridyl) when X 17-18 are present.
  • An amino acid residue selected from the group consisting of alanine, 3- (3-pyridyl) alanine and 3- (4-pyridyl) alanine.
  • the peptides of the present disclosure, X 17 -X 18 are present, where X 19 is a His or Tyr residue.
  • the peptides of the present disclosure, X 17 -X 18 are present, where X 19 is a His residue.
  • the peptide X 20 of the present disclosure is absent or is any amino acid residue other than Cys (eg, Lys residue) when X 17 -X 19 are present. In one embodiment of the invention, X 20 is absent.
  • amino acid residues X 1 to X 20 are conjugated to the PyOx group.
  • the peptides of the present disclosure comprise (or consist of) an amino acid sequence selected from: At least one (eg, 1-4, 1-3, 1-2, 1) PyOx groups are conjugated in one amino acid residue (preferably X 10 ) other than the Cys residue. It is a peptide that is present.
  • the correspondence with the amino acid residue (X 1 to X 20 ) of SEQ ID NO: 1 is shown, and the blank may indicate the absence of the amino acid residue.
  • conjugated means that at least one (eg, 1-4, 1-3, 1-2, 1) PyOx groups are directly or via a linker. , Means that it is bound to an amino acid residue.
  • the PyOx group is conjugated to the N-terminus or C-terminus, or the side chain of an amino acid residue. In one embodiment, the PyOx group is conjugated to the side chain of an amino acid residue.
  • the peptide of the present disclosure comprises at least one PyOx group at one amino acid residue selected from X 2 , X 4 , X 8 to X 10 , and X 20 . I'm gated.
  • the peptides of the present disclosure are conjugated at least one of the PyOx groups at one amino acid residue selected from X 2 , X 4 , X 10 and X 20 . There is.
  • the peptides of the present disclosure have at least one PyOx group conjugated at one amino acid residue selected from X 8 to X 10 (preferably X 10 ). ..
  • the results of the Examples of the present application suggest that the modification of the antibody using the peptide of the present disclosure specifically modifies the 249th and 251st lysines of the heavy chain of Herceptin (SEQ ID NO: 36). .. According to the crystal structure of the complex of the antibody-binding peptide 15L- lgBP of FIG. 6 of the present application and Herceptin, the amino acid residue at the position corresponding to X8 to X10 of the peptide of the present disclosure is 249 in the tertiary structure.
  • the peptides of the present disclosure comprise (or consist of) an amino acid sequence selected from: X 10 is an amino acid residue conjugated with at least one (for example, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 1) PyOx group.
  • X 10 is an amino acid residue conjugated with at least one (for example, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 1) PyOx group.
  • the correspondence with the amino acid residue of SEQ ID NO: 1 (X 1 to X 20 ) is shown, and the blank may indicate the absence of the amino acid residue.
  • the structure of the "linker” is not particularly limited, and examples thereof include a linker containing a group derived from a commonly used peptide chemical conjugation method.
  • Examples of chemical conjugation methods include carbodiimide chemistry, reductive amination, cyanylation chemistry (eg CDAP chemistry), maleimide chemistry, hydrazide chemistry, ester chemistry, and N-hydroxysuccinimide chemistry, click chemistry, etc.
  • chemical conjugation methods include carbodiimide chemistry, reductive amination, cyanylation chemistry (eg CDAP chemistry), maleimide chemistry, hydrazide chemistry, ester chemistry, and N-hydroxysuccinimide chemistry, click chemistry, etc.
  • CDAP chemistry cyanylation chemistry
  • maleimide chemistry eg CDAP chemistry
  • hydrazide chemistry e.g., hydrazide chemistry
  • ester chemistry e.g N-hydroxysuccinimi
  • the "linker” is a substituted or unsubstituted alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkenylene group having 2 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkylene group having 2 to 20 carbon atoms.
  • one amino acid residue selected from the amino acid residues conjugated by the PyOx group eg, X 1 to X 5 , X 10 and X 20 ) (preferably X 10 ).
  • the structure selected from the following can be mentioned.
  • one amino acid residue selected from the amino acid residues conjugated by the PyOx group (eg, X 1 to X 5 , X 10 and X 20 ) (preferably X 10 ). )) Is the following structure. ).
  • one amino acid residue selected from the amino acid residues conjugated by the PyOx group eg, X 1 to X 5 , X 10 and X 20 ) (preferably X 10 ).
  • the structure selected from the following can be mentioned. ).
  • one amino acid residue selected from the amino acid residues conjugated by the PyOx group eg, X 1 to X 5 , X 10 and X 20 ) (preferably X 10 ).
  • Structure can be selected from the following: and ,(Preferably ).
  • the peptides X6 and X16 of the present disclosure are Cys residues.
  • X 6 and X 16 of the peptides of the present disclosure are Cys residues, forming a disulfide bond between the Cys residue of X 6 and the Cys residue of X 16 .
  • the sulfide groups in the Cys residues of X 6 and X 16 are linked by a divalent group represented by the following formula (I) -3.
  • the peptides of the present disclosure, X 6 and X 16 are Cys residues, forming a disulfide bond between the Cys residue of X 6 and the Cys residue of X 16 .
  • the peptides of the present disclosure are N-terminally acetylated, C-terminally amidated, or N-terminally acetylated and C-terminally amidated. .. In one embodiment of the invention, the peptides of the present disclosure are acetylated at the N-terminus and amidated at the C-terminus.
  • the method for producing the peptide of the present invention is not particularly limited, and the peptide can be produced according to a known method. For example, it can be produced by a known method according to the method of the embodiment of the present application.
  • the present invention comprises at least one (eg, 1-4, 1-3, 1-2, 1) group below in a solvent:
  • the modification method of the present disclosure can be carried out, for example, by mixing the antibody and the N-acyl-N-alkylsulfonamide in a solvent in the presence of the peptide.
  • the peptide binds to an antibody and promotes an acyl transfer reaction from the N-acyl-N-alkylsulfonamide to the nucleophilic amino acid of the antibody, and functions as a catalyst in AGOX chemistry. Can be done.
  • examples of “antibodies” include IgG, IgD, IgA, IgE, IgM, and may be fragments thereof containing a binding site (for example, Fc region) of the peptide.
  • a binding site for example, Fc region
  • the antibody can be modified in a controllable manner at the modification site and the number of modified molecules.
  • the "antibody” may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and is preferably a monoclonal antibody.
  • the "antibody” is rabbit, human, or humanized immunoglobulin G (IgG, eg, IgG1, IgG2 or IgG4).
  • IgG refers to mammals such as primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats, mice, and rabbits, domestic animals such as pigs, cows, horses, sheep, and goats, and dogs and animals. It may contain IgG of pet animals such as cats, preferably human IgG (IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4).
  • the IgG herein is more preferably human IgG1, IgG2, or IgG4, or rabbit IgG, and particularly preferably human IgG1, IgG2, or IgG4.
  • the antibody can be obtained by known means. For example, it can be obtained by immunizing an animal with a polypeptide as an antigen and collecting and purifying an antibody produced in vivo by using a method usually practiced in this field.
  • the origin of the antigen is not limited to humans, and it is also possible to immunize an animal with an antigen derived from a non-human animal such as a mouse or a rat.
  • the antibody applicable to human diseases can be selected by testing the crossing property between the obtained antibody that binds to the heterologous antigen and the human antigen.
  • the anti-HER2 antibody can be obtained by appropriately referring to the description of, for example, US Pat. No. 5,821,337, US Pat. No. 5,725,856.
  • the modification method of the present disclosure is an antibody modification method using the peptide of the present disclosure. Since the peptides of the present disclosure can bind to IgG (eg, the Fc region), the peptides of the present disclosure can be used to controlly modify the antibody at the modification site and the number of modified molecules.
  • IgG eg, the Fc region
  • the results of the Examples of the present application suggest that the 249th and 251st lysines of the heavy chain of Herceptin (SEQ ID NO: 36) are specifically modified by the antibody modification method using the peptide of the present disclosure. rice field.
  • the modification method of the present disclosure may be able to control the modification site and the number of modified molecules by using the peptide of the present disclosure.
  • the "payload” is not particularly limited and means a substance moiety to be conjugated to an antibody by the modification method of the present disclosure.
  • anticancer agents antiinflammatory agents, antifungal agents, antibacterial agents, antiparasitic agents, antiviral agents, anesthetics, biophysical probes, fluorophores, spin labels, infrared probes, affinity probes, chelating agents, spectroscopy.
  • Probes radioactive probes, lipid molecules, polyethylene glycols, polymers, spin labels, DNA, RNA, proteins, peptides, surfaces, antibodies, antibody fragments, nanoparticles, quantum dots, liposomes, PLGA particles, saccharides or polysaccharides, etc. ..
  • the payload can be retained in the N-acyl-N-alkylsulfonamide via a linker, but the method is not particularly limited and can be carried out using methods known in the art, eg, Tamura, T. et al. Song, Z .; Amaike, K .; Lee, S .; Yin, S .; Kiyonaka, S .; Hamachi, I. Affinity-Guided Oxime Chemistry for Selective Protein Acylation in Live Tissue Systems. J. Am. Chem. Soc.
  • the "solvent” is an aqueous solvent and is not particularly limited as long as it forms a bond between the antibody and the payload.
  • a buffer solution for example, HEPES buffer, Tris buffer
  • the pH of the solvent is not particularly limited as long as the bond between the antibody and the payload is formed, but the pH is preferably 6 to 8.5 from the viewpoint of good reaction rate and prevention of non-specific antibody modification. 5.5 to 8.2 are more preferable.
  • the reaction temperature of the modification method of the present disclosure is not particularly limited as long as it forms a bond between the antibody and the payload, but is, for example, 1 ° C to 45 ° C, preferably 4 ° C to 40 ° C, and more preferably 20 ° C to 20 ° C. It is 40 ° C., and even more preferably 25 ° C. to 37 ° C.
  • the mixing ratio of the peptide, the antibody, and the N-acyl-N-alkylsulfonamide is not particularly limited.
  • the antibody: the peptide 1: 0.01 to 1: 100 in molar ratio.
  • the antibody: the peptide 1: 0.1 to 1:10 in molar ratio.
  • the antibody: the N-acyl-N-alkylsulfonamide 1: 0.01 to 1: 1000 in molar ratio.
  • the antibody: the N-acyl-N-alkylsulfonamide 1: 0.1 to 1: 100 in molar ratio.
  • the reaction time is not limited as long as the binding between the antibody and the payload is formed, but can be 1 minute to 24 hours, preferably 10 minutes to 10 hours, and more preferably 30 minutes to 5 hours. ..
  • the modification method of the present disclosure is used for a method of producing a conjugate of an antibody and a payload.
  • the production method may further comprise, if necessary, purifying the resulting complex after treating the antibody with a tethering N-acyl-N-alkylsulfonamide.
  • the purification step can be performed by a method known in the art, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, and the like.
  • the tethering N-acyl-N-alkylsulfonamide is of formula (II) :.
  • L indicates a linker; Pr indicates the payload; R 1 is independently optionally substituted with 1 to 3 halos, C 1-3 alkyl, optionally substituted with 1 to 3 halos, C 1-3 alkoxy, halo, and. Selected from -NO 2 (preferably -NO 2 ); n is an integer selected from 0 to 5 (preferably 1 to 3)] Have.
  • the tethering N-acyl-N-alkylsulfonamide is of formula (II) -a :. [During the ceremony, L indicates a linker; Pr indicates payload] Have.
  • the linker of L is not particularly limited as long as it forms a bond between the antibody and Pr (payload), and includes the type of payload and the conjugate of the antibody and the payload obtained by the modification method of the present disclosure. It can be selected depending on the purpose of use.
  • the linker of L may be a substituted or unsubstituted alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkenylene group having 2 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkynylene group having 2 to 20 carbon atoms, or a substituted moiety.
  • an unsubstituted or unsubstituted cycloalkylene group having 3 to 10 carbon atoms a substituted or unsubstituted cycloalkenylene group having 3 to 10 carbon atoms, a substituted or unsubstituted arylene group having 6 to 14 carbon atoms, and a substituted or unsubstituted 5 member.
  • the method for producing the N-acyl-N-alkylsulfonamide that retains the payload is not particularly limited, and the N-acyl-N-alkylsulfonamide can be produced according to a known method. For example, it can be produced by a known method according to the method of the embodiment of the present application.
  • alkyl groups include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group and isopentyl group.
  • Neopentyl group 1,2-dimethylpropyl group, n-hexyl group, 1,3-dimethylbutyl group, 1-isopropylpropyl group, 1,2-dimethylbutyl group, n-heptyl group, 1,4-dimethylpentyl Group, 2-methyl-1-isopropylpropyl group, 1-ethyl-3-methylbutyl group, n-octyl group, 2-ethylhexyl group, 3-methyl-1-isopropylbutyl group, 2-methyl-1-isopropyl group, Examples thereof include 1-tert-butyl-2-methylpropyl group.
  • alkylene group examples include a divalent group as an example of the above alkyl group.
  • substituent of the alkylene group include -OH, halo, and C 1-3 alkoxy, and the number of the alkylene group is one or several (for example, 1). It can be substituted with ⁇ 3) substituents.
  • examples of the alkenyl group include a vinyl group, an allyl group, an isopropenyl group, a 1-butenyl group, a 2-butenyl group, a 2-methyl-2-propenyl group, a 1-methyl-2-propenyl group, and 2 -Methyl-1-propenyl group, pentenyl group, 1-hexenyl group, 3,3-dimethyl-1-butenyl group and the like can be mentioned.
  • Examples of the alkenylene group include a divalent group as an example of the alkenyl group.
  • substituted or unsubstituted alkenylene group having 2 to 20 carbon atoms examples include -OH, halo, and C1-3 alkoxy, and the number of alkenylene groups is one or several (for example, 1). It can be substituted with ⁇ 3) substituents.
  • examples of the alkynyl group include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, 3-methyl-1-propynyl group and 2-.
  • examples thereof include a methyl-3-propynyl group, a pentynyl group, a 1-hexynyl group, a 3-methyl-1-butynyl group, and a 3,3-dimethyl-1-butynyl group.
  • examples of the alkynylene group include a divalent group of the above-mentioned alkynyl group.
  • substituted or unsubstituted alkynylene group having 2 to 20 carbon atoms examples include -OH, halo, and C1-3 alkoxy, and the number of alkynylene groups is one or several (for example, 1). It can be substituted with ⁇ 3) substituents.
  • examples of the cycloalkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group and the like.
  • examples of the cycloalkylene group include a divalent group as the example of the cycloalkyl group.
  • examples of the substituent of the cycloalkylene group include -OH, halo, C 1-3 alkyl, and C 1-3 alkoxy, and cycloalkylene. The group can be substituted with one or several (eg 1-3) substituents.
  • examples of the cycloalkenyl group include a cyclopropenyl group, a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclopentadienyl group, a cyclohexenyl group, a cyclohexadienyl group, a cycloheptenyl group, a cyclooctenyl group and the like.
  • examples of the cycloalkenylene group include a divalent group as an example of the cycloalkenyl group.
  • examples of the substituent of the cycloalkenylene group include -OH, halo, C 1-3 alkyl, and C 1-3 alkoxy, and cycloalkenylene.
  • the group can be substituted with one or several (eg 1-3) substituents.
  • examples of the aryl group include a phenyl group, a 1-naphthyl group, a 2-naphthyl group, a 1-anthrasenyl group, a 2-anthrasenyl group, a 9-anthrasenyl group and the like.
  • examples of the arylene group include a divalent group as an example of the above aryl group.
  • substituted or unsubstituted arylene group having 6 to 14 carbon atoms examples include -OH, halo, C 1-3 alkyl, and C 1-3 alkoxy, and the arylene group is 1 Alternatively, it can be substituted with several (eg, 1 to 3) substituents.
  • the heteroaryl group has 1 to 6 heteroatoms selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom in addition to a carbon atom as atoms constituting the ring, and the atom constituting the ring. It is an aromatic heterocycle having a number of 3 to 14, and includes a monocyclic ring and a fused ring.
  • heteroaryl groups are 2-thienyl group, 4-pyridyl group, 3-pyridyl group, 2-pyridyl group, 1-pyridyl group, 2-furyl group, 2-pyrimidinyl group, 2-benzothiazolyl group, 1- Examples thereof include an imidazolyl group, a 1-pyrazolyl group, a benzotriazole-1-yl group, a 7-azabenzotriazole-1-yl group and the like.
  • heteroarylene group include a divalent group as an example of the above heteroaryl group.
  • substituted or unsubstituted 5- to 10-membered heteroarylene group examples include -OH, halo, C 1-3 alkyl, and C 1-3 alkoxy, and the hetero arylene is mentioned.
  • the group can be substituted with one or several (eg 1-3) substituents.
  • halo means fluoro, chloro, bromo or iodine.
  • C 1-3 alkyl means a linear or branched saturated hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms.
  • Examples of “C 1-3 alkyl” include methyl, ethyl, propyl and isopropyl.
  • C 1-3 alkoxy means a linear or branched-chain alkoxy having 1 to 3 carbon atoms.
  • Examples of “C 1-3 Alkoxy” include methoxy, ethoxy, propoxy and isopropoxy.
  • esters group examples include methyl ester, ethyl ester, 1-propyl ester, 2-propyl ester, pivaloyloxymethyl ester, acetyloxymethyl ester, cyclohexyl acetyloxymethyl ester, and 1-methylcyclohexyl.
  • examples thereof include carbonyloxymethyl ester, ethyloxycarbonyloxy-1-ethyl ester and cyclohexyloxycarbonyloxy-1-ethyl ester.
  • Test Example 1-1 Synthesis of IgG-binding peptide / PyOx-IgG-binding peptide 15L-IgBP (SEQ ID NO: 91) was synthesized as an IgG-binding peptide.
  • the following four types of PyOx-IgG-binding peptides (15L-XGP (SEQ ID NO: 92), 15L-NtX (SEQ ID NO: 93), 15L-CtX (SEQ ID NO: 94), and 15L-L6X (SEQ ID NO: 95) was synthesized. The sequence of each synthesized peptide is shown below.
  • Each peptide of SEQ ID NO: 91 to SEQ ID NO: 95 was synthesized by the Fmoc solid-phase synthesis method using an automatic peptide synthesizer Prelude TM . Specifically, the following method was followed for the PyOx-IgG-binding peptides of SEQ ID NOs: 92 to 95.
  • the Rink amide resin (40 ⁇ mol) was swollen with DMF and then treated with 20% piperidine / DMF twice for 10 minutes to deprotect the Fmoc group. The resin was washed with DMF and Fmoc-amino acid (5eq.) Was condensed with HATU (5eq.), HOAt (5eq.), DIPEA (10eq.).
  • the cycle of deprotection and condensation was repeated, and the peptide chain length was extended to the desired length.
  • the N-terminal was treated with acetic anhydride (3eq.) And DIEA (3eq.) For 15 minutes in a DMF solvent for acetyl capping.
  • Trifluoroacetic acid was volatilized by a nitrogen stream, and diethyl ether was added under ice-cooling to precipitate a crude peptide.
  • Test Example 1-2 In vitro Labeling of Herceptin An in vitro labeling experiment of an anti-Her2 humanized monoclonal antibody (Herceptin), which is a therapeutic drug for breast cancer, using four types of PyOx-IgG binding peptides of Test Example 1-1. Was done.
  • NASA acyl donor having the following structure is designated as Compound 1. As shown in the reaction formula below, this compound 1 is synthesized from 4-nitrobenzene sulfonamide via compound 1-1 (Compound 1-1) and compound 1-2 (Compound 1-2).
  • Herceptin (1 ⁇ M) was added to a 1.5 mL Eppendorf tube (with 15 L-lgBP (10 ⁇ M) in the case of inhibitory conditions) and preincubated in HEPES buffer (50 mM, pH 7.4) for 10 minutes. PyOx-IgG binding peptide (1 ⁇ M) was added, then acyl donor (NASA-FL) (10 ⁇ M) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 3 hours. SDS sample buffer (containing 250 mM DTT) was added 5 times and boiled at 95 ° C. for 5 minutes. The mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 2.5 hours, and then SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (detection 12.5% AA, 10 ⁇ L load, LAS4000) was performed. The results are shown in FIG.
  • Test Example 1-3 Modification site analysis of FL-modified Herceptin
  • modification site analysis of FL (Fluorescein) labeled antibody is performed by peptide mapping method. I did it.
  • HPLC Analysis and MALDI-TOF-MS Analysis 900 ⁇ L of enzymatic digest was analyzed by HPLC followed by MALDI-TOF-MS (ultraflex).
  • the peak area ratios (%) of each of peaks 1 to 6 were 7.78, 4.19, 10.7, 11.6, 22.1, and 43.7 (%), respectively. The ratio was calculated assuming that the sum of the peak areas of 1 to 6 was 100%. Table 1 shows the main peaks of fluorescent HPLC and their attribution.
  • the amino acid sequence of Herceptin is shown below.
  • T1-T30 Peptide sequences produced by tryptic cleavage of Herceptin: T1-T30 are shown below.
  • MS / MS analysis was performed to identify the modified site.
  • the classification of fragment peptides in MS / MS analysis is as follows.
  • MS / MS analysis identified a peptide fragment [226-251] with advanced FL modification to Lys249. All MS / MS peaks were detected in the y fragment except y1, and all b fragments were identified except b1 and b10.
  • peak 6 data for clearly determining the modification site could not be obtained by MS / MS analysis. This is because it is difficult to analyze fragments of molecules having a molecular weight exceeding 4000 due to the principle of MS analysis.
  • the peak attributed to y9 is also strong and highly reliable.
  • FIG. 6 shows the crystal structure of the 15L-lgBP-Herceptin complex. From the crystal structure, it was found that these two Lys249 and Lys251 were present in the vicinity of the antibody binding site of the peptide used as the ligand (18.8 and 6.8 ⁇ from the derivatization site, respectively). Since 44 Lys residues are present in Herceptin, it is suggested that the site specificity is extremely high. Further, the crystal structure has a sequence of 15L-lgBP. It is shown that the amino acid residue in the underlined portion is present in the vicinity of the 249th and 251st lysines in the tertiary structure.
  • Test Example 2-2 In vitro labeling of Herceptin ⁇ Method> A HEPES buffer (50 mM, pH 7.4) solution (80 ⁇ L) of Herceptin (1 ⁇ M) was added to a 1.5 mL Eppendorf tube (along with 15 L-lgBP (20 ⁇ M) under inhibitory conditions). PyOx-C4-IgBP (2 ⁇ M) or PyOx-C2-IgBP (2 ⁇ M) was added thereto, and then acyl donor (NASA-FL) (10 ⁇ M) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 3 hours. 20 ⁇ L of 5-fold concentrated SDS sample buffer (containing 250 mM DTT) was added, and the mixture was boiled at 95 ° C. for 5 minutes. After returning this to room temperature, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (detection 12.5% acrylamide gel, 10 ⁇ L load, LAS4000) was performed. The results are shown in FIG.
  • Dialysis A sample solution was placed in a dialysis membrane (Spectra / Por® 6 Pre-wetted Diarysis Tubing (MWCO: 10 kDa)) and immersed in a dialysate (50 mM NH 4 HCO 3 (pH 7.8)).
  • a dialysis membrane Spectra / Por® 6 Pre-wetted Diarysis Tubing (MWCO: 10 kDa)
  • a dialysate 50 mM NH 4 HCO 3 (pH 7.8)
  • HPLC conditions: 0.1% TFA-containing acetonitrile: 0.1% TFA-containing water 0: 100 ⁇ 60: 40 (120 minutes, linear gradient), flow velocity 0.5% / min, fluorescence excitation wavelength 490 nm, fluorescence detection Wavelength 520 nm The results are shown in FIG.
  • the peptides of the invention can be used for the modification of IgG as catalysts in AGOX chemistry.

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Abstract

本開示は、少なくとも１個の下記基：がコンジュゲートし、１３～１９アミノ酸長であるペプチド、および該ペプチドを用いる抗体の修飾方法に関する。

Description

ペプチド、およびペプチドを用いる抗体の修飾
　本開示は、ペプチド、およびペプチドを用いる抗体の修飾方法等に関する。
　近年、抗体薬物複合体（Antibody-drug conjugate, ＡＤＣ）と呼ばれるバイオ医薬品の開発研究が盛んに行われている。ＡＤＣは抗体と低分子薬をリンカーを介して連結した分子であり、抗体の抗原特異性を利用して薬剤送達を行う。ＡＤＣを作製するためには抗体に低分子薬を化学修飾しなければならず、抗体中のＬｙｓ残基またはＣｙｓ残基へのランダム修飾が抗体の化学修飾法として最も一般的な手法として知られる。しかしながら、ランダム修飾による抗体ラベル化では、導入する薬剤の修飾部位や個数の制御が困難であり、薬剤の結合部位によっては、例えば抗原認識部位への修飾によってＡＤＣの標的特異性が低下したり、溶媒接触度の低い部位への修飾によってリンカー切断と薬剤放出の効率が低下したりする可能性がある。加えて結合する薬剤の数の異なるＡＤＣが混在してしまうため、過少、あるいは過剰に薬剤修飾された抗体による影響が生じうる。このように薬剤のランダム修飾に基づいて作製された不均質なＡＤＣは本来の薬効を十分に発揮できない可能性があるため、抗体の修飾部位や個数を厳密に制御する手法が望まれている。遊離のＣｙｓ残基（Engineered cysteine）を導入する方法（非特許文献１、非特許文献２）や非天然アミノ酸を導入する方法（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）等、抗体を部位特異的に修飾する手法の開発が盛んに行われているものの、高い部位特異性と修飾効率、結合の安定性や操作の簡便さといった、ＡＤＣの臨床開発を行う上で求められる要素を全て満たすような手法は未だ存在せず、新たな抗体の修飾法が求められている。
ＷＯ２０１６／１８６２０６ ＷＯ２０１３／０２７７９６
Junutula, J. R. and Mallet, W. et. al. Nat. Biotechnol., 2008, 26, 925. Shen, B. Q. and Junutula, J. R. et. al. Nat. Biotechnol., 2012, 30, 184. Tian, T. and Sapra, P. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2014, 111, 1766. Zimmerman, E. S. et. al. Bioconjug. Chem., 2014, 25, 351. VanBrunt, M. P. et. al. Bioconjug. Chem., 2015, 26, 2249. Tamura, T. et. al. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 14181. DeLano, W. L., Ultsch, M. H., de Vos, A. M. & Wells, J. A. Convergent solutions to binding at a protein-protein interface. Science 287, 1279-1283 (2000).
　本明細書において引用する先行技術文献の開示は全て参照することにより、本明細書に援用される。
　本開示の課題は、抗体の修飾法を提供することである。
　タンパク質標識のための新しい方法としてＡＧＯＸ（affinity-guided oxime）化学が知られる（非特許文献６）。この方法では、高求核性ピリジニウムオキシム（ＰｙＯｘ）が標的タンパク質特異的リガンドとコンジュゲートしていて、このＰｙＯｘ結合リガンドが標的タンパク質に選択的に結合し、タンパク質表面で求電子性Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドアシルドナー（NASA acyl donor）のアシル転移反応を促進することにより、タンパク質標識を可能とする方法である。当該非特許文献６には、炭酸脱水酵素IIのin vitro標識、ヒト口腔類表皮癌細胞の内在性膜タンパク質の標識、脳組織におけるα－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡＲ）の標識について具体的記載があるものの、いずれもリガンドとしてペプチドを用いるものではない。
　以下にＡＧＯＸ化学によるタンパク質化学標識の例示として下記に概略図を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 ＮＡＳＡ：Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミド
Ｐｒｏｔｅｉｎ：標的タンパク質
Ｐｒ：プローブ
Ｌｇ：リガンド
Ｎｕ：求核性アミノ酸
　非特許文献７、特許文献１、特許文献２等、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するペプチドに関する報告がされている。
　本願発明者らは、ＩｇＧのＦｃ領域に結合することが知られるペプチドにリンカーを介してピリジニウムオキシム（ＰｙＯｘ）をコンジュゲートすることで、当該ＰｙＯｘ結合ＩｇＧ結合性ペプチドはＡＧＯＸ化学における触媒として機能し、ＩｇＧを部位特異的に化学修飾できることを見出し、本願発明に至った。
　以下に本開示の例示的な態様を詳説する。
〔１〕　少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 [式中、
　Ｒは、Ｃ１－３アルキル基（例えばメチル、エチル）、Ｃ１－３アルコキシ基（例えばメトキシ）、ハロ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、エステル基（例えばメチルエステル、エチルエステル、１－プロピルエステル、２－プロピルエステル、ピバロイルオキシメチルエステル、アセチルオキシメチルエステル、シクロヘキシルアセチルオキシメチルエステル、１－メチルシクロヘキシルカルボニルオキシメチルエステル、エチルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステル、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、および－ＮＯ２から独立して選択され；
　ａは０～４から選択される整数である]
（好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 ）
がコンジュゲートし、１３～１９（好ましくは１３～１７）アミノ酸長であって、好ましくはＩｇＧ（好ましくはヒトＩｇＧおよび／またはウサギＩｇＧ）と結合可能である、ペプチド。
〔２〕　該基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義である］
がコンジュゲートしたアミノ酸残基が下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 ）を有する、〔１〕に記載のペプチド。
〔３〕　該基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
がコンジュゲートしたアミノ酸残基が下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 ）
を有する、〔１〕または〔２〕に記載のペプチド。
〔４〕　該基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
がコンジュゲートしたアミノ酸残基が下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 および
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 を有する、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のペプチド。
〔５〕　該基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
がコンジュゲートしたアミノ酸残基が下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 および
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 ）
を有する、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のペプチド。
〔６〕　該ペプチドは２つのＣｙｓ残基を有し、該２つのＣｙｓ残基間でジスルフィド結合を形成している、または該２つのＣｙｓ残基中のスルフィド基が下記式（Ｉ）－３で表される２価の基により連結されている、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のペプチド。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
〔７〕　式（Ｉ）：
　Ｘ1－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１-Ｘ１２-Ｘ１３-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７-Ｘ１８-Ｘ１９-Ｘ２０　　（Ｉ）（配列番号１）
[式中、
　Ｘ１は不存在であるか、あるいはＸ２～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ２は不存在であるか、あるいはＸ３～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ３は不存在であるか、あるいはＸ４～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ４は不存在であるか、あるいはＸ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ５は不存在であるか、あるいはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ６はＣｙｓ、２－アミノブタン酸、およびＳ－メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ７はＡｌａおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ８は任意の芳香族アミノ酸残基であり、
　Ｘ９はＨｉｓ残基であり、
　Ｘ１０はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄｂｕ）、Ｎ６－アセチルリジン、Ｎ５－アセチルオルニチン、２－アミノ－４‐アセチルアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２－アミノ－３，３－ジメチルブタン酸、２－アミノ－４，４－ジメチルペンタン酸、３－シクロヘキシルアラニンおよび下記式（Ｉ）－１で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
式（Ｉ）－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041

（上記式（Ｉ）－１中、Ｋ１は、炭素数１～４のアルキレン基、－（ＮＨ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ－、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される２価の基）、
　Ｘ１１はＧｌｙ、およびＣｙｓを除く任意のＤ－アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１２はＧｌｕ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１３はＬｅｕ残基であり、
　Ｘ１４はＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１５はＴｒｐ残基であり、
　Ｘ１６はＣｙｓ、２－アミノブタン酸およびＳ－メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ただしＸ６およびＸ１６の少なくとも一方は、Ｃｙｓ残基であり、
　Ｘ１７は不存在であるか、あるいはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌおよび２－アミノブタン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１８は不存在であるか、あるいはＸ１７が存在するときＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ホモシステイン（Ｈｃｙ）、３－シクロヘキシルアラニンおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１９は不存在であるか、あるいはＸ１７～Ｘ１８が存在するときＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３－（２－ピリジル）アラニン、３－（３－ピリジル）アラニンおよび３－（４－ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ２０は不存在であるか、あるいはＸ１７～Ｘ１９が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ７～Ｘ１５、およびＸ１７～Ｘ２０から選択される１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個（例えば１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 ）
がコンジュゲートしている]
によって表されるアミノ酸配列を含み（またはからなり）；
１３～１９（好ましくは１３～１７）アミノ酸長であり；かつ
　好ましくは、ＩｇＧ（好ましくはヒトＩｇＧおよび／またはウサギＩｇＧ）と結合可能である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のペプチド。
〔８〕　Ｘ８がＴｙｒ、Ｔｒｐ、２－アミノ－３－（１－ナフチル）プロピオン酸、２－アミノ－３－（２－ナフチル）プロピオン酸、２－メチルアミノ－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロピオン酸および下記式（Ｉ）－２で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であって、
式（Ｉ）－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044

　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ７～Ｘ１５、およびＸ１７～Ｘ２０から選択される１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個（例えば１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 ）
がコンジュゲートしている、〔７〕に記載のペプチド。
〔９〕　Ｘ１１がＧｌｙ、Ｄ－Ｉｌｅ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ａｒｇ、Ｄ－ＳｅｒおよびＤ－Ｌｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ７～Ｘ１５、およびＸ１７～Ｘ２０から選択される１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個（例えば１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 ）
がコンジュゲートしている、
〔７〕または〔８〕に記載のペプチド。
〔１０〕　下記から選択されるアミノ酸配列を含み（またはからなり）：
　ＤＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号２）
　ＤＣＡＹＨ（Ｄｂｕ）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号３）
　ＫＧＰＤＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号４）
　ＫＤＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号５）
　ＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号６）
　ＤＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣＴＦＨＫ（配列番号７）
　Ｇ（Ｈｃｙ）ＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴ（Ｈｃｙ）Ｈ（配列番号８）
　ＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号９）
　ＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１０）
　ＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１１）
　ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号１２）
　ＲＲＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１３）
　ＤＣＴＹＨＲＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号１４）
　ＤＣＡＹＨＲＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号１５）
　ＤＣＴＷＨＲＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号１６）
　ＤＣＴＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１７）
　ＤＣＴＹＨＲＧＮＬＩＷＣＴ（配列番号１８）
　ＤＣＡＷＨＲＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号２０）
　ＲＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＳ（配列番号２１）
　ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号２２）
　ＧＰＲＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＳＦＨ（配列番号２４）
　ＳＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号２５）
　ＧＤＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号２６）
　ＧＰＳＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号２７）
　ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＳＦＨ（配列番号２８）
　ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＨＨ（配列番号２９）
　ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号３０）
　ＳＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号３１）
　ＳＤＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号３２）
　ＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号３３）；
　Ｃｙｓ残基以外の１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 ）
がコンジュゲートしている、〔７〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１１〕　Ｘ２、Ｘ４、Ｘ８～Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 ）
がコンジュゲートしている、〔７〕～〔１０〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１２〕　Ｘ２、Ｘ４、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 ）
がコンジュゲートしている、〔７〕～〔１１〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１３〕　Ｘ８～Ｘ１０（好ましくはＸ１０）のアミノ酸残基において、少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 ）
がコンジュゲートしている、〔７〕～〔１２〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１４〕　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０）が、下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 ）
を有する、〔７〕～〔１３〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１５〕　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０）が、下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 ）
を有する、〔７〕～〔１４〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１６〕　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０）が、下記構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 を有する、〔７〕～〔１５〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１７〕　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０）が、下記構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 を有する、〔７〕～〔１６〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１８〕　Ｘ２、Ｘ４、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０）が、下記構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 を有する、〔７〕～〔１７〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１９〕　Ｘ２、Ｘ４、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基が、下記構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 を有する、〔７〕～〔１８〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２０〕　Ｘ１０のアミノ酸残基が、下記構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 を有する、〔７〕～〔１９〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２１〕　Ｘ１０のアミノ酸残基が、下記構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 を有する、〔７〕～〔２０〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２２〕　Ｘ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＤＣＡＹＨＸ１０ＧＥＬＶＷＣＴＦＨＸ２０（配列番号３４）のアミノ酸配列からなり、Ｘ１０のアミノ酸残基が下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 、さらに好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 ）を有する、〔７〕～〔２１〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２３〕　Ｘ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＤＣＡＹＨＸ１０ＧＥＬＶＷＣＴＦＨＸ２０（配列番号３４）のアミノ酸配列からなり、Ｘ１０のアミノ酸残基が下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 ）を有する、〔７〕～〔２２〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２４〕　ＤＣＡＹＨＸ１０ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号３５）、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号６８～９０から選択されるのアミノ酸配列を含み（またはからなり）、Ｘ１０のアミノ酸残基が下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
 好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 ）を有する、〔７〕～〔２３〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２５〕　ＤＣＡＹＨＸ１０ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号３５）、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号６８～９０から選択されるアミノ酸配列を含み（またはからなり）、Ｘ１０のアミノ酸残基が下記から選択される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
 好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 ）を有する、〔７〕～〔２４〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２６〕Ｘ６とＸ１６がＣｙｓ残基である、〔７〕～〔２５〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２７〕　Ｘ６とＸ１６がＣｙｓ残基であり、Ｘ６のＣｙｓ残基およびＸ１６のＣｙｓ残基間でジスルフィド結合を形成している、またはＸ６およびＸ１６のＣｙｓ残基中のスルフィド基が下記式（Ｉ）－３で表される２価の基により連結されている、〔７〕～〔２６〕のいずれかに記載のペプチド。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
〔２８〕　Ｘ６とＸ１６がＣｙｓ残基であり、Ｘ６のＣｙｓ残基およびＸ１６のＣｙｓ残基間でジスルフィド結合を形成している、〔７〕～〔２７〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２９〕Ｎ末端でアセチル化されているか、Ｃ末端でアミド化されているか、またはＮ末端でアセチル化されていてかつＣ末端でアミド化されている、〔１〕～〔２８〕のいずれかに記載のペプチド。
〔３０〕　溶媒中、少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
 [式中、Ｒおよびａは〔１〕と同義］
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 ）
がコンジュゲートした、（好ましくは抗体と結合可能な）ペプチドの存在下、抗体および／またはそれらのフラグメントを、ペイロードを保持する（tethering）Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドで処理する工程を含む、抗体の修飾方法。
〔３１〕　該ペプチドが〔１〕～〔２９〕のいずれかに記載のペプチドである、〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕　〔３０〕または〔３１〕に記載の方法を含む、抗体とペイロードとの複合体（conjugate）の製造方法。
〔３３〕　該ペイロードを保持する（tethering）Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドが式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
 [式中、
　Ｌはリンカーを示し；
　Ｐｒはペイロードを示し；
　Ｒ１は独立して、１～３個のハロで適宜置換されていてもよいＣ１－３アルキル、１～３個のハロで適宜置換されていてもよいＣ１－３アルコキシ、ハロ、および－ＮＯ２（好ましくは－ＮＯ２）から選択され；
　ｎは０～５（好ましくは１～３）から選択される整数である]
を有する、〔３０〕～〔３２〕のいずれかに記載の方法。
〔３４〕　該ペプチドが〔１〕～〔２９〕のいずれかに記載のペプチドであり；
　該ペイロードを保持する（tethering）Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドが下式（ＩＩ）－ａ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 [式中、
　Ｌはリンカーを示し；
　Ｐｒはペイロードを示す]
を有する；
〔３０〕～〔３３〕のいずれかに記載の方法に記載の方法。
〔３５〕　該溶媒のｐＨが６～８．５（好ましくは６．５～８．２）である、〔３０〕～〔３４〕のいずれかに記載の方法に記載の方法。
　前記〔１〕から〔３５〕の各構成は、任意に２以上を選択して組み合わせることができる。
　本発明によれば、抗体の修飾に有用なペプチド、および抗体の修飾方法が提供される。
試験１－２　ＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドを用いた標識ＩｇＧのゲル蛍光標識 Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）によるゲル濾過クロマトグラフィーのフラクションのＵＶ－Ｖｉｓスペクトル解析 標識ハーセプチンのＵＶ－Ｖｉｓスペクトル解析 試験例１－３　トリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ消化ＦＬ標識ハーセプチンのＨＰＬＣ分析結果 ピーク５およびピーク６のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ　（ｕｌｔｒａｆｌｅｘ）分析 １５Ｌ－ｌｇＢＰ－ハーセプチン複合体の結晶構造 試験２－２　ＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドを用いた標識ＩｇＧのゲル蛍光標識Ｃ４：ＰｙＯｘ－Ｃ４－ＩｇＢＰＣ２：ＰｙＯｘ－Ｃ２－ＩｇＢＰ 試験例２－３　トリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ消化ＦＬ標識ハーセプチンのＨＰＬＣ分析結果
　以下、本発明の実施形態についてさらに詳細に説明する。
　本発明は、１つの態様として、下記のペプチドを提供する。
　少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
 [式中、
　Ｒは、Ｃ１－３アルキル基（例えばメチル、エチル）、Ｃ１－３アルコキシ基（例えばメトキシ）、ハロ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、エステル基（例えばメチルエステル、エチルエステル、１－プロピルエステル、２－プロピルエステル、ピバロイルオキシメチルエステル、アセチルオキシメチルエステル、シクロヘキシルアセチルオキシメチルエステル、１－メチルシクロヘキシルカルボニルオキシメチルエステル、エチルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステル、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、および－ＮＯ２から独立して選択され；
　ａは０～４から選択される整数である]
（以下、「ＰｙＯｘ基」と称することがある）
がコンジュゲートし、１３～１９（好ましくは１３～１７）アミノ酸長である、ペプチド（以下、「本開示のペプチド」と称することがある）。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドは、
　式（Ｉ）：
　Ｘ1－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１-Ｘ１２-Ｘ１３-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７-Ｘ１８-Ｘ１９-Ｘ２０　　（Ｉ）（配列番号１）
[式中、
　Ｘ１は不存在であるか、あるいはＸ２～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ２は不存在であるか、あるいはＸ３～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ３は不存在であるか、あるいはＸ４～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ４は不存在であるか、あるいはＸ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ５は不存在であるか、あるいはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ６はＣｙｓ、２－アミノブタン酸、およびＳ－メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ７はＡｌａおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ８は任意の芳香族アミノ酸残基であり、
　Ｘ９はＨｉｓ残基であり、
　Ｘ１０はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄｂｕ）、Ｎ６－アセチルリジン、Ｎ５－アセチルオルニチン、２－アミノ－４‐アセチルアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２－アミノ－３，３－ジメチルブタン酸、２－アミノ－４，４－ジメチルペンタン酸、３－シクロヘキシルアラニンおよび下記式（Ｉ）－１で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
式（Ｉ）－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
（上記式（Ｉ）－１中、Ｋ１は、炭素数１～４のアルキレン基、－（ＮＨ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ－、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される２価の基）、
　Ｘ１１はＧｌｙ、およびＣｙｓを除く任意のＤ－アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１２はＧｌｕ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１３はＬｅｕ残基であり、
　Ｘ１４はＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１５はＴｒｐ残基であり、
　Ｘ１６はＣｙｓ、２－アミノブタン酸およびＳ－メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ただしＸ６およびＸ１６の少なくとも一方は、Ｃｙｓ残基であり、
　Ｘ１７は不存在であるか、あるいはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌおよび２－アミノブタン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１８は不存在であるか、あるいはＸ１７が存在するときＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ホモシステイン（Ｈｃｙ）、３－シクロヘキシルアラニンおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ１９は不存在であるか、あるいはＸ１７～Ｘ１８が存在するときＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３－（２－ピリジル）アラニン、３－（３－ピリジル）アラニンおよび３－（４－ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
　Ｘ２０は不存在であるか、あるいはＸ１７～Ｘ１９が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ７～Ｘ１５、およびＸ１７～Ｘ２０から選択される１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個（例えば１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
 [式中、
　Ｒは、Ｃ１－３アルキル基（例えばメチル、エチル）、Ｃ１－３アルコキシ基（例えばメトキシ）、ハロ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、エステル基（例えばメチルエステル、エチルエステル、１－プロピルエステル、２－プロピルエステル、ピバロイルオキシメチルエステル、アセチルオキシメチルエステル、シクロヘキシルアセチルオキシメチルエステル、１－メチルシクロヘキシルカルボニルオキシメチルエステル、エチルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステル、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、および－ＮＯ２から独立して選択され；
　ａは０～４から選択される整数である]
（以下、「ＰｙＯｘ基」と称することがある）
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
 ）
がコンジュゲートしている]
によって表されるアミノ酸配列を含み（またはからなり）；
１３～１９（好ましくは１３～１７）アミノ酸長である、ペプチド（以下、「本開示のペプチド」と称することがある）。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドは、ＩｇＧ（例えばヒトＩｇＧ、ウサギＩｇＧ）と結合可能である。本開示のペプチドのＩｇＧへの結合親和性は特に限定されないが、ＡＧＯＸ化学におけるＮ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドアシルドナーのアシル転移反応を促進する触媒として機能しうる親和性を有することが好ましい。本開示のペプチドとＩｇＧとの結合に関する解離定数（Ｋｄ）は、表面プラズモン共鳴スペクトル解析（例えばＢＩＡＣＯＲＥシステム使用）により決定可能であり、例えば１×１０－１０Ｍ～１×１０－４Ｍ、より好ましくは１×１０－９Ｍ～１×１０－５Ｍ、さらに好ましくは１×１０－９Ｍ～１０－７Ｍが挙げられる。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドは、ＩｇＧとの結合親和性が、他の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）と比較して約１０倍以上、好ましくは約５０倍以上、より好ましくは約２００倍以上高い。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドは、ＩｇＧのＦｃ領域に結合可能である。Ｆｃ領域に結合可能かどうかの試験は公知の方法により行うことができ、例えば、表面プラズモン共鳴法によるＦｃフラグメントとの親和性測定、Ｘ線結晶構造解析、プロテインＡなど既存のＦｃ結合分子との競合の測定などが挙げられる。
　本明細書に記載のアミノ酸配列は、特に言及がない限り、慣例に従ってＮ末端（アミノ末端）側からＣ末端（カルボキシル末端）側への方向に表記される。
　本開示において、「アミノ酸残基」とは、ペプチドまたはタンパク質分子上で、ペプチドまたはタンパク質を構成しているアミノ酸の一単位に当たる部分を意味する。より具体的には、以下の式のように表される、α－アミノ酸から誘導される２価の基を意味する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
 。
　上記式中、Ｒ０はアミノ酸の側鎖であり、例えばＧｌｙであれば水素原子、Ａｌａであればメチル基である。
　本開示において、「アミノ酸残基」は、天然もしくは非天然のα－アミノ酸に由来し、例えば、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、およびＩｌｅ（Ｉ）、ならびにこれらの類縁体由来するアミノ酸残基が挙げられる。光学活性体があり得る場合、Ｌ体、Ｄ体の何れであってもよいが、Ｌ体が好ましい。
　上記の類縁体としては、例えば上記２０種のアミノ酸残基の側鎖が任意の置換基で置換された誘導体等であってもよく、例えば、上記２０種のアミノ酸残基のハロゲン化誘導体（例えば、３－クロロアラニン）、２－アミノ酪酸、ノルロイシン、ノルバリン、イソバリン、２－アミノイソ酪酸、ホモフェニルアラニン、２，３－ジアミノプロピオン酸、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄｂｕ）、オルニチン、２－ヒドロキシグリシン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、３，４－ジデヒドロプロリン、ホモプロリン、ホモシステイン、ホモメチオニン、アスパラギン酸エステル（例えば、アスパラギン酸－メチルエステル、アスパラギン酸－エチルエステル、アスパラギン酸－プロピルエステル、アスパラギン酸－シクロヘキシルエステル、アスパラギン酸－ベンジルエステルなど）、グルタミン酸エステル（グルタミン酸－シクロヘキシルエステル、グルタミン酸－エチルエステル、グルタミン酸－プロピルエステル、グルタミン酸－メチルエステル、グルタミン酸－ベンジルエステルなど）、ホルミルトリプトファン、２－シクロペンチルグリシン、２－シクロヘキシルグリシン、２－フェニルグリシン、２－ピリジルアラニン、３－シクロペンチルアラニン、３－シクロヘキシルアラニン、３－ピリジルアラニン、３－ピラゾリルアラニン、３－フラニルアラニン、３－チエニルアラニン、メトキシフェニルアラニン、３－ナフチルアラニン、４－ピリジルアラニン、２－アミノブタン酸、Ｓ－メチルシステイン、Ｎ６－アセチルリジン、Ｎ５－アセチルオルニチン、２－アミノ－４‐アセチルアミノブタン酸、２－アミノ－３，３－ジメチルブタン酸、２－アミノ－４，４－ジメチルペンタン酸、２－アミノ－３－（１－ナフチル）プロピオン酸、２－アミノ－３－（２－ナフチル）プロピオン酸、２－メチルアミノ－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロピオン酸等のアミノ酸に由来するアミノ酸残基が例示できるが、これらに制限されない。また、ＩｌｅやＴｈｒのように、側鎖に不斉炭素を有するジアステレオマーが存在するものについては、天然型（例えば、（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸、および（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸）および非天然型（例えば、（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸、および（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸）が特に区別なく使用され得る。すなわち、「Ｉｌｅ」は（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸および（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸の両方を含む意味として使用され、「Ｔｈｒ」は（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸および（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸の両方を含む意味として使用される。好ましくは、天然型ジアステレオマー（すなわち、Ｉｌｅであれば（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸、Ｔｈｒであれば（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸）が使用される。
　本開示において、「任意の置換基」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アシル基、アルキルスルファニル基、アリールスルファニル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ホルミル基、メルカプト基、スルホ基、スルフィン酸基、グアニジノ基、カルバモイル基、チオール基、チオエーテル基、メシル基、ｐ－トルエンスルホニル基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、トリメチルシリル基、ホスフィニコ基、ホスホノ基などが挙げられる。これらの置換基もまた、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基などによってさらに置換されていてもよい。ただし、置換された後の基が置換される前の基と同じ定義に含まれるような置換は考えないものとする。
　各アミノ酸残基は、その側鎖の相違に基づいて、類似の性質を有するアミノ酸残基と置換し得ることが本技術分野において知られている（保存的置換）。例えば、脂肪族疎水性アミノ酸であるＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、２－アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、およびイソバリン（Ｉｖａ）は相互に置換し得る。側鎖が水素原子またはメチル基であるＧｌｙ、Ａｌａおよび２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）は相互に置換し得る。中性極性アミノ酸であるＡｓｎおよびＧｌｎは相互に置換し得る。２，４－ジアミノブタン酸（Ｄｂｕ）、およびオルニチン（Ｏｒｎ）は相互に置換し得る。Ｐｒｏと、ホモプロリン（ｈｏｍｏＰｒｏ）とは、相互に置換し得る。
　本開示において、芳香族アミノ酸残基の例として、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、２－アミノ－３－（１－ナフチル）プロピオン酸、２－アミノ－３－（２－ナフチル）プロピオン酸、２－メチルアミノ－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロピオン酸のアミノ酸に由来するアミノ酸残基、および下式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095

で表されるアミノ酸残基が挙げられる。
　本開示において、Ｋ１の定義における「炭素数１～４のアルキレン基」は、炭素数１～４個を有する直鎖状の二価の飽和炭化水素基を意味する。該アルキレンの例として、メチレン、ジメチレン、トリメチレン、テトラメチレンが挙げられる。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１は不存在であるか、あるいはＸ２～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基（例えばＡｒｇ残基）である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１は不存在である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ２は不存在であるか、あるいはＸ３～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基（例えば、Ｌｙｓ残基、Ａｒｇ残基）である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ２は不存在である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ３は不存在であるか、あるいはＸ４～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基（例えば、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａおよび２－アミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸残基）である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ４～Ｘ５が存在し、Ｘ３はＧｌｙ、Ａｒｇ、およびＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ３は不存在である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ４は不存在であるか、あるいはＸ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基（例えば、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、ホモシステイン、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、およびホモプロリン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基、好ましくはＰｒｏ残基）である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ５が存在し、本開示のペプチドのＸ４はＰｒｏ、Ｌｙｓ、ホモシステイン、Ｇｌｙ、およびＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ４は不存在である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ５は不存在であるか、あるいはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基（例えばＡｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、２－アミノブタン酸および２－アミノ－３－スルホプロピオン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基、好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕおよび２－アミノ－３－スルホプロピオン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基）であり、
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ５はＡｓｐ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ６はＣｙｓ、２－アミノブタン酸、およびＳ－メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ６はＣｙｓ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ７はＡｌａおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ７はＡｌａ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ８は任意の芳香族アミノ酸残基（例えば、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、２－アミノ－３－（１－ナフチル）プロピオン酸、２－アミノ－３－（２－ナフチル）プロピオン酸、２－メチルアミノ－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロピオン酸および下記式（Ｉ）－２で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基
式（Ｉ）－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096

）である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ８はＴｙｒ残基またはＴｒｐ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ８はＴｙｒ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ９はＨｉｓ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１０はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄｂｕ）、Ｎ６－アセチルリジン、Ｎ５－アセチルオルニチン、２－アミノ－４‐アセチルアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２－アミノ－３，３－ジメチルブタン酸、２－アミノ－４，４－ジメチルペンタン酸、３－シクロヘキシルアラニンおよび下記式（Ｉ）－１で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基である
式（Ｉ）－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097

（上記式（Ｉ）－１中、Ｋ１は、炭素数１～４のアルキレン基、－（ＮＨ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ－およびこれらの組み合わせからなる２価の基から選択される）。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１０はＬｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄｂｕ）、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１０はＬｙｓ残基、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄｂｕ）、または２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１０はＬｙｓ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１１はＧｌｙ、およびＣｙｓを除く任意のＤ－アミノ酸（例えばＤ－Ｉｌｅ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ａｒｇ、Ｄ－ＳｅｒおよびＤ－Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１１はＧｌｙ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１２はＧｌｕ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１２はＧｌｕ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１３はＬｅｕ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１４はＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、Ｘ１４はＶａｌ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１５はＴｒｐ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１６はＣｙｓ、２－アミノブタン酸およびＳ－メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１６はＣｙｓ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１７は不存在であるか、あるいはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌおよび２－アミノブタン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１７はＴｈｒ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１８は不存在であるか、あるいはＸ１７が存在するときＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ホモシステイン（Ｈｃｙ）、３－シクロヘキシルアラニンおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１８は不存在である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１７が存在し、Ｘ１８はＰｈｅ、Ｈｉｓ、ホモシステイン（Ｈｃｙ）およびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１７が存在し、Ｘ１８はＰｈｅ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１９は不存在であるか、あるいはＸ１７～Ｘ１８が存在するときＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３－（２－ピリジル）アラニン、３－（３－ピリジル）アラニンおよび３－（４－ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１７～Ｘ１８が存在し、Ｘ１９はＨｉｓ残基またはＴｙｒ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ１７～Ｘ１８が存在し、Ｘ１９はＨｉｓ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ２０は不存在であるか、あるいはＸ１７～Ｘ１９が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基（例えばＬｙｓ残基）である。
　本発明の１つの実施形態において、Ｘ２０は不存在である。
　上記のＸ１～Ｘ２０のアミノ酸残基についての各実施形態において、Ｘ１～Ｘ５、Ｘ７～Ｘ１５、およびＸ１７～Ｘ２０のアミノ酸残基は該ＰｙＯｘ基がコンジュゲートしている構造を有しうる。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドは、下記から選択されるアミノ酸配列を含み（またはからなり）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000098
　Ｃｙｓ残基以外の１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０）において、少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の該ＰｙＯｘ基がコンジュゲートしているペプチドである。上記表中、配列番号１のアミノ酸残基（Ｘ１～Ｘ２０）との対応を示し、空欄はアミノ酸残基の不存在を示しうる。
　本開示のペプチドにおいて、「コンジュゲートしている」とは、少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の該ＰｙＯｘ基が直接またはリンカーを介して、アミノ酸残基に結合していることを意味する。
　１つの実施形態において、該ＰｙＯｘ基は、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはアミノ酸残基の側鎖にコンジュゲートしている。
　１つの実施形態において、該ＰｙＯｘ基は、アミノ酸残基の側鎖にコンジュゲートしている。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも１個の該ＰｙＯｘ基が、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ８～Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基においてコンジュゲートしている。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも１個の該ＰｙＯｘ基が、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基においてコンジュゲートしている。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドは、少なくとも１個の該ＰｙＯｘ基が、Ｘ８～Ｘ１０（好ましくはＸ１０）から選択される１つのアミノ酸残基においてコンジュゲートしている。
　本願実施例の結果によれば、本開示のペプチドを用いる抗体の修飾により、ハーセプチンの重鎖（配列番号３６）の２４９番目と２５１番目のリジンが特異的に修飾されていることが示唆された。本願図６の抗体結合性ペプチド１５Ｌ－ｌｇＢＰとハーセプチンとの複合体の結晶構造によれば、本開示のペプチドのＸ８～Ｘ１０に相当する位置のアミノ酸残基が、３次構造において当該２４９番目と２５１番目のリジンの近傍に存在する。Ｘ８～Ｘ１０のいずれかに該ＰｙＯｘ基が存在することは、当該リジンの効率的な修飾に好ましいと推測されるが、当該推測は本願発明を何ら制限するものではない。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドは、下記から選択されるアミノ酸配列を含み（またはからなり）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000099
　Ｘ１０は、少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の該ＰｙＯｘ基がコンジュゲートしたアミノ酸残基である。上記表中、配列番号１のアミノ酸残基（Ｘ１～Ｘ２０）との対応を示し、空欄はアミノ酸残基の不存在を示しうる。
　本開示のペプチドにおいて、「リンカー」の構造は特に限定されないが、例えば、通常用いられるペプチドの化学コンジュゲーション法に由来する基を含有するリンカーが挙げられる。化学コンジュゲーション法の例としては、カルボジイミド化学、還元アミノ化（reductive amination）、シアニル化化学（例えばＣＤＡＰ化学）、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、およびＮ－ヒドロキシコハク酸イミド化学、クリック化学などが挙げられるが、これらに限られない。本開示のペプチドにおいて、「リンカー」は、置換または非置換の炭素数１～２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数２～２０のアルケニレン基、置換または非置換の炭素数２～２０のアルキニレン基、置換または非置換の炭素数３～１０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３～１０のシクロアルケニレン基、置換または非置換の炭素数６～１４のアリーレン基、置換または非置換の５員～１０員のヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、ポリオキシアルキレン基、アミノ酸残基、ペプチド鎖、ポリエチレングリコール鎖およびこれらの組み合わせからなる群から選択される２価基を含んでいてもよい。
　本開示のペプチドの１つの実施形態において、該ＰｙＯｘ基がコンジュゲートしたアミノ酸残基（例えば、Ｘ１～Ｘ５、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０））の構造として下記から選択される構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
 ）
　本開示のペプチドの１つの実施形態において、該ＰｙＯｘ基がコンジュゲートしたアミノ酸残基（例えば、Ｘ１～Ｘ５、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０））の構造が下記構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
 ）。
　本開示のペプチドの１つの実施形態において、該ＰｙＯｘ基がコンジュゲートしたアミノ酸残基（例えば、Ｘ１～Ｘ５、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０））の構造として下記から選択される構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
 ）。
　本開示のペプチドの１つの実施形態において、該ＰｙＯｘ基がコンジュゲートしたアミノ酸残基（例えば、Ｘ１～Ｘ５、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基（好ましくはＸ１０））の構造として下記から選択される構造が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
 および
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
 、（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
 ）。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ６とＸ１６がＣｙｓ残基である。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ６とＸ１６がＣｙｓ残基であり、Ｘ６のＣｙｓ残基およびＸ１６のＣｙｓ残基間でジスルフィド結合を形成している、またはＸ６およびＸ１６のＣｙｓ残基中のスルフィド基が下記式（Ｉ）－３で表される２価の基により連結されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000107
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドのＸ６とＸ１６がＣｙｓ残基であり、Ｘ６のＣｙｓ残基およびＸ１６のＣｙｓ残基間でジスルフィド結合を形成している。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドはＮ末端でアセチル化されているか、Ｃ末端でアミド化されているか、またはＮ末端でアセチル化されていてかつＣ末端でアミド化されている。
　本発明の１つの実施形態において、本開示のペプチドはＮ末端でアセチル化されていてかつＣ末端でアミド化されている。
　本発明のペプチドの製造方法は特に限定されず、公知の方法に従って製造することができる。例えば、本願実施例の方法に従って、公知の方法により製造することができる。
　本発明は、１つの態様として、溶媒中、少なくとも１個（例えば１～４個、１～３個、１～２個、１個）の下記基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
 [式中、
　Ｒは、Ｃ１－３アルキル基（例えばメチル、エチル）、Ｃ１－３アルコキシ基（例えばメトキシ）、ハロ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、エステル基（例えばメチルエステル、エチルエステル、１－プロピルエステル、２－プロピルエステル、ピバロイルオキシメチルエステル、アセチルオキシメチルエステル、シクロヘキシルアセチルオキシメチルエステル、１－メチルシクロヘキシルカルボニルオキシメチルエステル、エチルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステル、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、および－ＮＯ２から独立して選択され；
　ａは０～４から選択される整数である]
（好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000109
 ）
がコンジュゲートした、（好ましくは抗体と結合可能な）ペプチドの存在下、抗体を、ペイロードを保持する（tethering）Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドで処理する工程を含む、抗体の修飾方法（以下、「本開示の修飾方法」と称することがある）を提供する。
　本開示の修飾方法は、例えば、溶媒中、該ペプチドの存在下、抗体と該Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドを混合することにより行うことができる。
　本開示の修飾方法において、該ペプチドは、抗体に結合して、該Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドから該抗体の求核性アミノ酸へのアシル転移反応を促進し、ＡＧＯＸ化学における触媒として機能しうる。
　本開示の修飾方法において、「抗体」の例にはＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭが挙げられ、該ペプチドの結合部位（例えばＦｃ領域）を含むこれらのフラグメントであってもよい。これらの抗体に特異的に結合するペプチドを用いることで、抗体は修飾部位と修飾分子数を制御可能に修飾されうる。本開示の修飾方法において、「抗体」はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれでもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。
　本開示の修飾方法の１つの実施形態において「抗体」は、ウサギ、ヒト、またはヒト化免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）である。
　本明細書において「ＩｇＧ」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のＩｇＧ、好ましくはヒトのＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）を含みうる。本明細書におけるＩｇＧは、さらに好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４、又はウサギＩｇＧであり、特に好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４である。
　抗体は、公知の手段によって取得することができる。例えば、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒト抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
　抗ＨＥＲ２抗体は、例えば米国特許第５８２１３３７号明細書、米国特許第５７２５８５６号明細書などの記載を適宜参照して得ることができる。
　本発明の１つの実施形態において、本開示の修飾方法は、本開示のペプチドを用いる、抗体の修飾方法である。本開示のペプチドはＩｇＧ（例えばＦｃ領域）に結合しうるため、本開示のペプチドを用いることで、抗体は修飾部位と修飾分子数を制御可能に修飾されうる。本願実施例の結果によれば、本開示のペプチドを用いる抗体の修飾方法により、ハーセプチンの重鎖（配列番号３６）の２４９番目と２５１番目のリジンが特異的に修飾されていることが示唆された。当該修飾部位の結果は本願発明を何ら制限するものではないが、本開示の修飾方法は、本開示のペプチドを用いることで、修飾部位と修飾分子数が制御可能でありうる。
　本開示の修飾方法において、「ペイロード」は特に限定されず、本開示の修飾方法により抗体にコンジュゲートされるべき物質部分を意味する。例えば抗癌剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、麻酔剤、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外プローブ、親和性プローブ、キレート剤、分光プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体断片、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、糖類もしくは多糖類などが挙げられる。
　ペイロードはリンカーを介してＮ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドに保持されうるが、その方法は特に限定されず、当技術分野において公知の方法を用いて行うことができ、例えば、Tamura, T.; Song, Z.; Amaike, K.; Lee, S.; Yin, S.; Kiyonaka, S.; Hamachi, I. Affinity-Guided Oxime Chemistry for Selective Protein Acylation in Live Tissue Systems. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139 (40), 14181-14191.、Tamura, T.; Ueda, T.; Goto, T.; Tsukidate, T.; Shapira, Y.; Nishikawa, Y.; Fujisawa, A.; Hamachi, I. Rapid Labelling and Covalent Inhibition of Intracellular Native Proteins Using Ligand-Directed N-Acyl-N-Alkyl Sulfonamide. Nat. Commun. 2018, 9 (1), 1-12等に記載の方法に基づいて行うことができる。
　本開示の修飾方法において、「溶媒」は水性溶媒であり、抗体とペイロードの結合が形成するものであれば、特に限定されない。例えば、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー）が挙げられる。
　溶媒のｐＨは、抗体とペイロードの結合が形成する範囲であれば、特に限定されないが、良好な反応速度および非特異的な抗体修飾防止の観点から、ｐＨは６～８．５が好ましく、６．５～８．２がさらに好ましい。
　本開示の修飾方法の反応温度は、抗体とペイロードの結合が形成するものであれば、特に限定されないが、例えば、１℃～４５℃、好ましくは４℃～４０℃、さらに好ましくは２０℃～４０℃、さらにより好ましくは２５℃～３７℃である。
　本開示の修飾方法において、該ペプチド、該抗体、該Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドの混合比率は特に限定されない。
　本開示の修飾方法の１つの実施形態において、モル比率で、該抗体：該ペプチド＝１：０．０１～１：１００である。
　本開示の修飾方法の１つの実施形態において、モル比率で、該抗体：該ペプチド＝１：０．１～１：１０である。
　本開示の修飾方法の１つの実施形態において、モル比率で、該抗体：該Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミド＝１：０．０１～１：１０００である。
　本開示の修飾方法の１つの実施形態において、モル比率で、該抗体：該Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミド＝１：０．１～１：１００である。
　本開示の修飾方法において、反応時間は抗体とペイロードの結合が形成する限り限定されないが、１分～２４時間、好ましくは１０分～１０時間、さらに好ましくは３０分～５時間とすることができる。
　本発明の１つの実施形態において、本開示の修飾方法は抗体とペイロードとの複合体（conjugate）の製造方法のために用いられる。該製造方法は、抗体を、ペイロードを保持する（tethering）Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドで処理する工程の後、必要に応じて、生じた複合体を精製する工程をさらに含んでよい。該精製工程は、本分野で公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、及びＨＰＬＣ等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
　本発明の１つの実施形態において、該ペイロードを保持する（tethering）Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドは式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000110
 [式中、
　Ｌはリンカーを示し；
　Ｐｒはペイロードを示し；
　Ｒ１は独立して、１～３個のハロで適宜置換されていてもよいＣ１－３アルキル、１～３個のハロで適宜置換されていてもよいＣ１－３アルコキシ、ハロ、および－ＮＯ２（好ましくは－ＮＯ２）から選択され；
　ｎは０～５（好ましくは１～３）から選択される整数である]
を有する。
　本発明の１つの実施形態において、該ペイロードを保持する（tethering）Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドは式（ＩＩ）－ａ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000111
 [式中、
　Ｌはリンカーを示し；
　Ｐｒはペイロードを示す]
を有する。
　Ｌのリンカーは、抗体とＰｒ（ペイロード）の結合が形成するものであれば、特に限定されず、ペイロードの種類や、本開示の修飾方法により得られる抗体とペイロードとの複合体（conjugate）と使用目的等により、選択されうる。
　例えば、Ｌのリンカーは、置換または非置換の炭素数１～２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数２～２０のアルケニレン基、置換または非置換の炭素数２～２０のアルキニレン基、置換または非置換の炭素数３～１０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３～１０のシクロアルケニレン基、置換または非置換の炭素数６～１４のアリーレン基、置換または非置換の５員～１０員のヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、ポリオキシアルキレン基、アミノ酸残基、ペプチド鎖、ポリエチレングリコールおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される２価基が挙げられる。
　該ペイロードを保持する（tethering）Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドの製造方法は特に限定されず、公知の方法に従って製造することができる。例えば、本願実施例の方法に従って、公知の方法により製造することができる。
　本開示において、アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、ｎ－ヘキシル基、１，３－ジメチルブチル基、１－イソプロピルプロピル基、１，２－ジメチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、１，４－ジメチルペンチル基、２－メチル－１－イソプロピルプロピル基、１－エチル－３－メチルブチル基、ｎ－オクチル基、２－エチルヘキシル基、３－メチル－１－イソプロピルブチル基、２－メチル－１－イソプロピル基、１－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルプロピル基などが挙げられる。
　アルキレン基の例としては上記アルキル基の例を２価とした基が挙げられる。
　「置換または非置換の炭素数１～２０のアルキレン基」において、アルキレン基の置換基の例として－ＯＨ、ハロ、およびＣ１－３アルコキシが挙げられ、アルキレン基は１または数個（例えば１～３個）の置換基で置換されうる。
　本開示において、アルケニル基の例としては、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、ペンテニル基、１－ヘキセニル基、３，３－ジメチル－１－ブテニル基などが挙げられる。
　アルケニレン基の例としては上記アルケニル基の例を２価とした基が挙げられる。
　「置換または非置換の炭素数２～２０のアルケニレン基」において、アルケニレン基の置換基の例として－ＯＨ、ハロ、およびＣ１－３アルコキシが挙げられ、アルケニレン基は１または数個（例えば１～３個）の置換基で置換されうる。
　本開示において、アルキニル基の例としては、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、１－ブチニル基、２－ブチニル基、３－ブチニル基、３－メチル－１－プロピニル基、２－メチル－３－プロピニル基、ペンチニル基、１－ヘキシニル基、３－メチル－１－ブチニル基、３，３－ジメチル－１－ブチニル基などが挙げられる。
　アルキニレン基の例としては上記アルキニル基の例を２価とした基が挙げられる。
　「置換または非置換の炭素数２～２０のアルキニレン基」において、アルキニレン基の置換基の例として－ＯＨ、ハロ、およびＣ１－３アルコキシが挙げられ、アルキニレン基は１または数個（例えば１～３個）の置換基で置換されうる。
　本開示において、シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基などが挙げられる。
　シクロアルキレン基の例としては上記シクロアルキル基の例を２価とした基が挙げられる。
　「置換または非置換の炭素数３～１０のシクロアルキレン基」において、シクロアルキレン基の置換基の例として－ＯＨ、ハロ、Ｃ１－３アルキル、およびＣ１－３アルコキシが挙げられ、シクロアルキレン基は１または数個（例えば１～３個）の置換基で置換されうる。
　本開示において、シクロアルケニル基の例としては、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサジエニル基、シクロヘプテニル基、シクロオクテニル基などが挙げられる。
　シクロアルケニレン基の例としては上記シクロアルケニル基の例を２価とした基が挙げられる。
　「置換または非置換の炭素数３～１０のシクロアルケニレン基」において、シクロアルケニレン基の置換基の例として－ＯＨ、ハロ、Ｃ１－３アルキル、およびＣ１－３アルコキシが挙げられ、シクロアルケニレン基は１または数個（例えば１～３個）の置換基で置換されうる。
　本明細書において、アリール基の例としては、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、１－アントラセニル基、２－アントラセニル基、９－アントラセニル基などが挙げられる。
　アリーレン基の例としては上記アリール基の例を２価とした基が挙げられる。
　「置換または非置換の炭素数６～１４のアリーレン基」において、アリーレン基の置換基の例として－ＯＨ、ハロ、Ｃ１－３アルキル、およびＣ１－３アルコキシが挙げられ、アリーレン基は１または数個（例えば１～３個）の置換基で置換されうる。
　本開示において、ヘテロアリール基は、環を構成する原子として、炭素原子の他に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる１乃至６個のヘテロ原子を有し、環を構成する原子の数が３乃至１４である芳香族複素環であり、単環及び縮合環を含む。ヘテロアリール基の例としては、２－チエニル基、４－ピリジル基、３－ピリジル基、２－ピリジル基、１－ピリジル基、２－フリル基、２－ピリミジニル基、２－ベンゾチアゾリル基、１－イミダゾリル基、１－ピラゾリル基、ベンゾトリアゾール－１－イル基、７－アザベンゾトリアゾール－１－イル基などが挙げられる。
　ヘテロアリーレン基の例としては上記ヘテロアリール基の例を２価とした基が挙げられる。
　「置換または非置換の５員～１０員のヘテロアリーレン基」において、ヘテロアリーレン基の置換基の例として－ＯＨ、ハロ、Ｃ１－３アルキル、およびＣ１－３アルコキシが挙げられ、ヘテロアリーレン基は１または数個（例えば１～３個）の置換基で置換されうる。
　本開示において、「ハロ」とはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
　本開示において、「Ｃ１－３アルキル」とは、炭素数１～３個の直鎖又は分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。「Ｃ１－３アルキル」の例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルが挙げられる
　本開示において、「Ｃ１－３アルコキシ」とは、炭素数１～３個の直鎖又は分枝鎖アルコキシを意味する。「Ｃ１－３アルコキシ」の例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシが挙げられる。
　本開示において、「エステル基」の例として、メチルエステル、エチルエステル、１－プロピルエステル、２－プロピルエステル、ピバロイルオキシメチルエステル、アセチルオキシメチルエステル、シクロヘキシルアセチルオキシメチルエステル、１－メチルシクロヘキシルカルボニルオキシメチルエステル、エチルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステル、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ－１－エチルエステルが挙げられる。
　本明細書において、範囲を示す「Ａ～Ｂ」は、特記しない限り、「Ａ以上Ｂ以下」を意味する。
　以下、試験例を挙げて、本願発明を説明するが、本願発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
　試験例におけるグリシン以外のアミノ酸は特段の記載がない限りＬ体を示す。
　試験例１
　試験例１－１　ＩｇＧ結合性ペプチド／ＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドの合成
　ＩｇＧ結合性ペプチドとして１５Ｌ－ＩｇＢＰ（配列番号９１）を合成した。また、ＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドとして以下４種類（１５Ｌ－ＸＧＰ（配列番号９２）、１５Ｌ－ＮｔＸ（配列番号９３）、１５Ｌ－ＣｔＸ（配列番号９４）、及び１５Ｌ－Ｌ６Ｘ（配列番号９５））を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000112

合成した各ペプチドの配列を以下に示す。
１５Ｌ－ＩｇＢＰ：Ａｃ－ＤＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＮＨ２（配列番号９１）
１５Ｌ－ＸＧＰ：Ａｃ－ＸＧＰＤＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＮＨ２（配列番号９２）
１５Ｌ－ＮｔＸ：Ａｃ－ＸＤＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＮＨ２（配列番号９３）
１５Ｌ－ＣｔＸ：Ａｃ－ＤＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣＴＦＨＸ－ＮＨ２（配列番号９４）
１５Ｌ－Ｌ６Ｘ（またはＰｙＯｘ－Ｃ４－ＩｇＢＰ）：Ａｃ－ＤＣＡＹＨＸＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＮＨ２（配列番号９５）
Ｘ＝
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000113
　自動ペプチド合成機Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成法により上記配列番号９１～配列番号９５の各ペプチドを合成した。配列番号９２～配列番号９５のＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドについては具体的には下記の方法に従った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000114
 　Ｒｉｎｋ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（４０μｍｏｌ）をＤＭＦで膨潤させたのち、２０％ピペリジン／ＤＭＦにより、１０分間２回処理することでＦｍｏｃ基を脱保護した。ＤＭＦで樹脂を洗浄し、ＨＡＴＵ（５ｅｑ．）、ＨＯＡｔ（５ｅｑ．）、ＤＩＰＥＡ（１０ｅｑ．）を用い、Ｆｍｏｃ－アミノ酸（５ｅｑ．）を縮合した。脱保護と縮合のサイクルを繰り返し、目的のペプチド鎖長まで伸長した。Ｎ末端は、ＤＭＦ溶媒中、無水酢酸（３ｅｑ．）とＤＩＥＡ（３ｅｑ．）にて１５分間処理することで、アセチルキャッピングを行った。得られた樹脂を乾燥後、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：１，３―ジメトキシベンゼン＝１００：１：２の溶液で３時間処理し、脱樹脂を行った。窒素気流によりトリフルオロ酢酸を揮発させ、氷冷下、ジエチルエーテルを加えることで、粗ペプチドを析出させた。エーテルで２回洗浄後、クルードを減圧乾燥し、逆相ＨＰＬＣにて精製することでチオールフリーのアジドペプチドを得た。このペプチドをアセトニトリル：酢酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ４．５）＝１：３に溶解し、Ｎｐｙｓ－ＯＭｅ（Methyl 3-nitro-2-pyridinesulfenate）（５ｅｑ．）を加え、一時間室温で撹拌することで、分子内ジスルフィド結合を形成した。この反応液を濃縮・凍結乾燥したのち、エーテルで洗浄し、得られた粗ペプチドを精製せずにクリック反応に用いた。クリック反応では、ペプチドをＤＭＦ／水＝１：１（１ｍＭ）に溶解し、アルキン－ＰｙＯｘ（１．１ｅｑ）、アスコルビン酸ナトリウム（６ｅｑ．）、ＴＢＴＡ（２ｅｑ）、テトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）ヘキサフルオロホスフェイト（２ｅｑ．）を加え、室温で一時間撹拌した後、逆相ＨＰＬＣで精製することでＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドを得た。
試験例１-２　ハーセプチンのＩｎ　ｖｉｔｒｏラベル化
　試験例１－１の４種類のＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドを用いて、乳癌治療薬である抗Ｈｅｒ２ヒト化モノクローナル抗体（ハーセプチン）の試験管内ラベル化実験を行なった。
＜ＮＡＳＡアシルドナーの合成＞
　下記構造のＮＡＳＡアシルドナー（ＮＡＳＡ－ＦＬ）を化合物１（Compound 1）とする。この化合物１は、下記反応式に示すように、４－ニトロベンゼンスルホンアミドから化合物１－１（Compound 1-1）、化合物１－２（Compound 1-2）を経て合成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000115
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000116
化合物１－１の合成
　４－ニトロベンゼンスルホンアミド（９９．６ｍｇ，０．４９０ｍｍｏｌ）を１ｍＬの塩化メチレンに溶解し、そこにＢｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯＯＨ（１５０ｍｇ，０．４１０ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１５７ｍｇ，０．８２０ｍｍｏｌ）と４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２５．０ｍｇ，０．２１０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で５時間撹拌した。反応生成物に５ｍＬの塩化メチレンを加え、１Ｍ　ＨＣｌで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１０：１）によって精製することで化合物１－１（１４３ｍｇ，０．２６０ｍｍｏｌ，５３％）を得た。
化合物１－２の合成
　化合物１－１（７９．５ｍｇ，０．１４５ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そこに４－ニトロベンジルブロミド（３７．５ｍｇ，０．１７４ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（５０μＬ，０．２８９ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で４８時間撹拌した。溶媒留去後、得られた残渣に４ｍＬの酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：２）によって精製することで化合物１－２（５６．７ｍｇ，０．０８２０ｍｍｏｌ，５７％）を得た。
化合物１の合成
　化合物１－２（６．９ｍｇ，１０μｍｏｌ）を０．５ｍＬの塩化メチレンに溶解し、そこに３０μＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えた。この混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒留去後、得られた残渣を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解し、そこに５－カルボキシフルオレセイン（４．５ｍｇ，１２μｍｏｌ）、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（３．３ｍｇ，１２μｍｏｌ）およびＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）（３．３μＬ，３０μｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で３０分撹拌した。溶媒留去後、得られた残渣を逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ含有水＝４０：６０-７０：３０のグラジエント溶出）にて精製し、化合物１（７．１ｍｇ，７．５μｍｏｌ，７５％）を得た。
＜方法＞
　ハーセプチン（１μＭ）を（阻害条件の場合は１５Ｌ－ｌｇＢＰ（１０μＭ）と共に）１．５ｍＬ容エッペンドルフ管に加え、ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で１０分間プレインキュベーションした。ＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチド（１μＭ）を加え、ついでアシルドナー（ＮＡＳＡ－ＦＬ）（１０μＭ）を加え、３７℃で３時間インキュベーションした。ＳＤＳサンプルバッファー（２５０ｍＭ　ＤＴＴ含有）を５回加え、９５℃で５分間煮沸した。４℃で２．５時間静置し、次いでＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（検出１２．５％　ＡＡ、１０μＬ　ｌｏａｄ、ＬＡＳ４０００）を行った。
　結果を図１に示す。
＜考察＞
　レーン２、４、６、および８から、ＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドの添加条件で抗体重鎖へ選択的なラベル化バンドが観測された。このラベル化をレーン１、３、５、７、９と比較するとＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチド非添加条件や競合阻害剤（１５Ｌ－ＩｇＢＰ）添加条件ではほとんど進行しないことから、抗体-ペプチド相互作用に基づくラベル化であることが確認された。
試験例１-３　ＦＬ修飾ハーセプチンの修飾部位解析
　ＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドによるラベル化が部位特異的に進行しているか確かめるために、ＦＬ（Fluorescein）ラベル化抗体の修飾部位解析をペプチドマッピング法によって行なった。
＜条件およびプロトコル＞
１．１５Ｌ－Ｌ６Ｘを用いるＩｇＧ標識
　ハーセプチン（１μＭ）（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４））１０ｍＬとアシルドナー（ＮＡＳＡ－ＦＬ）（１０μＭ）、１５Ｌ－Ｌ６Ｘ（２μＭ（２ｅｑ））混合して、３７℃で６時間インキュベーションした。
２．ゲル濾過クロマトグラフィー（分子ふるいクロマトグラフィー）
（１）溶液をＡｍｉｃｏｎ（商標）　Ｕｌｔｒａ－１５　１０Ｋフィルター装置で１．５ｍＬに濃縮し、４５００ｒｐｍで計１０分間遠心分離した。クロマトグラフィーカラムにＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＨＷ－Ｆ４０（１５ｍＬ）加え、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ　８．０）（４５ｍＬ）で洗浄し、反応溶液を加え、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で精製した。１ｍＬずつサンプルチューブに回収（ｘ９サンプル）した。
　Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）を用いて各フラクション（Ｎｏ．１－９）のＵＶ－Ｖｉｓスペクトル解析を行った。ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル解析結果を図２に示す。
（２）濃度及びラベル化率決定
　フラクションＮｏ．３、４および５は２８０ｎｍおよび４９０ｎｍに吸収スペクトルを有した。フラクションＮｏ．３－５を混合し、Ａｍｉｃｏｎ（商標）Ｕｌｔｒａ－４　１０Ｋフィルター装置で６５０～７００μＬにまで濃縮した。
（２）―ｉ　総ＩｇＧ濃度をＢＣＡアッセイで検出した。ＩｇＧは１０．８μＭ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０））であった。
（２）―ii　ＦＬ濃度をＵＶ－Ｖｉｓ　スペクトル解析で決定した。ＵＶ－Ｖｉｓ　スペクトル解析結果を図３に示す。
　　４９８ｎｍのＡｂｓ＝１．３４３１を用い、ＦＬの４９８ｎｍのモル吸光係数ε４９８（ｐＨ８．０）＝７５０００ｃｍ－１Ｍ－１として算出すると、［ＦＬ］＝１７．７μＭであった。
　（２）―ｉおよびｉｉよりラベル化率は１６４％と算出された。
３．透析
　透析膜Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）６　Ｐｒｅ－ｗｅｔｔｅｄ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｔｕｂｉｎｇ（ＭＷＣＯ：１０ｋＤ）を用いてＦＬラベル化抗体の溶解バッファーを５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）に置換した。
４．トリプシン／Ｌｙｓ－Ｃによるペプチド消化
　１．５ｍＬ容ＬｏＢｉｎｄ管中、上記３で得られた４００μＬのＦＬ標識ハーセプチン溶液（９．０１μＭ，１４８ｋＤａ，５３３．４μｇ）に２０μＬの１％　ＰｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ（商標）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）／５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３　ａｑ．を加え、４．２μＬの０．５Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）／５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３　ａｑ．を最終濃度５ｍＭまで加え、５６℃で、２０分インキュベーションし、１４．６μＬの０．４５Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＡ）／５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３　ａｑ．を最終濃度１５ｍＭまで加え、室温で１５分間暗所で保存し、６００μＬの５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３溶液を加えて、沈殿物を溶解した。１０μＬの１％ＰｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ（商標）および２０μＬの１μｇ／μＬ　トリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ　Ｍｉｘ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃ　Ｇｒａｄｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、３７℃で１６時間静置した。１６，０００　ｘ　ｇで２０秒間遠心分離して、粒子性の物質を除去した。１ｍＬの上清を別のサンプル管に移し、ＴＦＡを最終濃度０．５％まで加え、酵素を不活性化し、ＨＰＬＣ分析を行った。
５．　ＨＰＬＣ分析およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析
　９００μＬの酵素消化物をＨＰＬＣで分析し、続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ｕｌｔｒａｆｌｅｘ）で分析した。
　ＨＰＬＣ条件：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ含有水＝０：１００→６０：４０（１２０分，リニアグラジェント），流速０．５％／ｍｉｎ，吸収検出波長２２０ｎｍ、蛍光励起波長４９０ｎｍ，蛍光検出波長５２０ｎｍ
　結果を図４に示す。
　ピーク１～６それぞれのピーク面積比（％）は順に７．７８、４．１９、１０．７、１１．６、２２．１、４３．７（％）であった。
　割合は１～６のピーク面積の和を１００％として算出した．
　表１に蛍光ＨＰＬＣの主要ピークとその帰属を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000117
　ハーセプチンのアミノ酸配列を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000118

　ハーセプチンのトリプシン切断によって生じるペプチド配列：Ｔ１～Ｔ３０を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000119

　下表はトリプシン消化後の理論上のペプチド断片を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000120


Figure JPOXMLDOC01-appb-I000121

　ピーク５からは最小同位体ピーク＝３４５０．５ｍ／ｚのＭＳが得られたが、これはＬｙｓ２４９ラベル化ペプチド（すなわち、Ｔ１５＋ラベル（フルオレセイン））の分子量とよく一致する（［Ｍ＋Ｈ］＋のＥｘａｃｔ　ｍａｓｓ＝３４４９．６が最小同位体ピークの理論値）。
　ピーク６からは最小同位体ピーク＝４２６６．９ｍ／ｚのＭＳが得られたが、これはＬｙｓ２５１ラベル化ペプチド（すなわち、Ｔ１５＋Ｔ１６＋ラベル（フルオレセイン））の分子量とよく位置する（［Ｍ＋Ｈ］＋のＥｘａｃｔ　ｍａｓｓ＝４２６６．０５が最小同位体ピークの理論値）。
　このように、Ｌｙｓ２４９、Ｌｙｓ２５１へラベル化が進行したことが示唆された。
　ラベル価部位がＬｙｓ２４９およびＬｙｓ２５１であるかを厳密に示すにはＭＳ／ＭＳ解析を行わなければならないが、そもそも２２６－２５８のペプチドはＬｙｓ２５１へラベル価が進行しなければ観測されないため、こちらのラベル価部位はＬｙｓ２５１であると帰属できる。
　続いてＭＳ／ＭＳ解析を行い修飾部位を同定した。
　ＭＳ／ＭＳ解析におけるフラグメントペプチドの分類は下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000122
　ピーク５について、ＭＳ／ＭＳ解析によりＬｙｓ２４９へのＦＬ修飾が進行したペプチドフラグメント［２２６－２５１］であることが同定された。ｙフラグメントはｙ１を除いてすべてのＭＳ／ＭＳピークが検出され、ｂフラグメントについてもｂ１，ｂ１０を除いてすべて同定された。
　一方でピーク６に関してはＭＳ／ＭＳ解析によって修飾部位を明確に決定するデータは得られなかった。これは、ＭＳ解析の原理上、分子量が４０００を超える分子のフラグメント解析は困難であるためである。ただし、ｙ９＝ＲＳＩＭＬＴＤＫ＊Ｐ(m/z = 1685.743)が検出された結果は、Ｌｙｓ２５１への修飾体であることを直接的に支持している。ｙ９に帰属したピークは強度もあるため信頼性は高い。
　１）修飾部位がＬｙｓ２５１であることを直接的に示すｙ９フラグメントが検出
　２）そもそも４２６７ｍ／ｚのＭＳは「Ｌｙｓ２５１が化学修飾を受けたことでトリプシン消化を受けなくなった」場合にのみ観測されるＭＳピークである、という２つの根拠から、ピーク６のペプチドフラグメントはＬｙｓ２５１への修飾体であると同定した。
試験例１-４
　図６に１５Ｌ－ｌｇＢＰ－ハーセプチン複合体の結晶構造を示す。
　該結晶構造より、この２つのＬｙｓ２４９、Ｌｙｓ２５１はリガンドとして使用したペプチドの抗体結合部位近傍（それぞれ誘導化部位から１８．８、６．８Å）に存在していることがわかった。
　ハーセプチンにはＬｙｓ残基が４４個存在するため、部位特異性は極めて高いことが示唆された。
　さらに、該結晶構造は、１５Ｌ－ｌｇＢＰの配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000123

の下線部分のアミノ酸残基が３次構造において当該２４９番目と２５１番目のリジンの近傍に存在することを示す。
　修飾したハーセプチンをペプチド断片化し、ＨＰＬＣ分析を行なったところ、数多くのハーセプチン由来ペプチドフラグメントの中から、強いフルオレセイン蛍光を示す２本のピークが検出された。
　この２つのフラクションについてＭＳ／ＭＳ解析により修飾部位の同定を行ったところ、２４９番目と２５１番目のリジンが特異的に修飾されていることが明らかになった。結晶構造を見てみると、この２つのリジンはリガンドとして使用したペプチドの抗体結合部位近傍に存在していることがわかった。以上の結果から、本手法によるラベル化では、ハーセプチンに４４個も存在するリジン残基のうち、ペプチド結合部位近傍のリジンだけを部位特異的に修飾可能であることが示された。
　試験例２
　試験例２－１　ＰｙＯｘ－ＩｇＧ結合性ペプチドの合成
　下記ペプチドを試験例１と同様の方法で合成した。
　ＰｙＯｘ－Ｃ２－ＩｇＢＰ：Ａｃ－ＤＣＡＹＨＸＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＮＨ２（配列番号９６）
Ｘ＝
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000124
試験例２-２　ハーセプチンのＩｎ　ｖｉｔｒｏラベル化
＜方法＞
　ハーセプチン（１μＭ）のＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）溶液（８０μL）を（阻害条件の場合は１５Ｌ－ｌｇＢＰ（２０μＭ）と共に）１．５ｍＬ容エッペンドルフ管に加えた。そこにＰｙＯｘ－Ｃ４－ＩｇＢＰ（２μＭ）またはＰｙＯｘ－Ｃ２－ＩｇＢＰ（２μＭ）を加え、ついでアシルドナー（ＮＡＳＡ－ＦＬ）（１０μＭ）を加え、３７℃で３時間インキュベーションした。５倍濃縮ＳＤＳサンプルバッファー（２５０ｍＭ　ＤＴＴ含有）を２０μL加え、９５℃で５分間煮沸した。これを室温に戻した後、次いでＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（検出１２．５％　アクリルアミドゲル、１０μＬ　ｌｏａｄ、ＬＡＳ４０００）を行った。
　結果を図７に示す。
＜考察＞
　図７に示す通り、ＰｙＯｘ－Ｃ２－ＩｇＢＰを用いた場合においても、ハーセプチンのラベル化が確認された。
　ＰｙＯｘ－Ｃ４－ＩｇＢＰによるＩｇＧラベル化のラベル化率を１５６％とすると、バンド強度比からＰｙＯｘ－Ｃ２－ＩｇＢＰによるＩｇＧラベル化のラベル化率は８３．９％と算出された。
試験例２-３　ＦＬ修飾ハーセプチンの修飾部位解析
＜条件およびプロトコル＞
１．ＰｙＯｘ－Ｃ２－ＩｇＢＰを用いるＩｇＧ標識
　ハーセプチン（１μＭ）（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４））１０ｍＬとアシルドナー（ＮＡＳＡ－ＦＬ）（１０μＭ）、ＰｙＯｘ－Ｃ２－ＩｇＢＰ（２μＭ（２ｅｑ））混合して、３７℃で６時間インキュベーションした。
２．ゲル濾過クロマトグラフィー（分子ふるいクロマトグラフィー）
溶液をＡｍｉｃｏｎ（商標）　Ｕｌｔｒａ－１５　１０Ｋフィルター装置で１．５ｍＬに濃縮し、４５００ｒｐｍで計１０分間遠心分離した。クロマトグラフィーカラムにＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＨＷ－Ｆ４０（１５ｍＬ）を加え、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ　８．０）（４５ｍＬ）で洗浄し、反応溶液を加え、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で精製した。１ｍＬずつサンプルチューブに回収（ｘ９サンプル）した。
　Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）を用いて各フラクション（Ｎｏ．１－９）の吸収スペクトルを測定し、２８０ｎｍおよび４９０ｎｍに吸収スペクトルを有したフラクションＮｏ．３－５を混合し、Ａｍｉｃｏｎ（商標）Ｕｌｔｒａ－４　１０Ｋフィルター装置で６５０～７００μＬにまで濃縮した。
３．透析
　透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）　６　Ｐｒｅ－ｗｅｔｔｅｄ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｔｕｂｉｎｇ　（ＭＷＣＯ：１０ｋＤａ））にサンプル溶液を入れ、これを透析液（５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８））に浸した。
４．濃度及びラベル化率決定
（２）―ｉ　透析後の総ＩｇＧ濃度をＢＣＡアッセイで検出した。ＩｇＧは８．０μＭ（５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８））であった。
（２）―ｉｉ　ＦＬ濃度をＵＶ－Ｖｉｓスペクトル解析で決定した。４９８ｎｍのＡｂｓ＝０．５７３０を用い、ＦＬの４９８ｎｍのモル吸光係数ε４９８（ｐＨ７．８）＝７５０００ｃｍ－１Ｍ－１として算出すると、［ＦＬ］＝７．６４μＭであった。
　（２）―ｉおよびｉｉよりラベル化率は９５．５％と算出された。
４．トリプシン／Ｌｙｓ－Ｃによるペプチド消化
　１．５ｍＬ容ＬｏＢｉｎｄ管中、上記３で得られた１０００μＬのＦＬ標識ハーセプチン溶液（４．０μＭ，１４８ｋＤａ，５９２μｇ）に２０μＬの１％ＰｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ（商標）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）／５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３　ａｑ．を加え、０．５Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）／５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３　ａｑ．を最終濃度５ｍＭまで加え、５６℃で、２０分インキュベーションし、０．４５Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＡ）／５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３　ａｑ．を最終濃度１５ｍＭまで加え、室温で１５分間暗所で保存した。１０μＬの１％ＰｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ（商標）および２０μＬの１μｇ／μＬ　トリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ　Ｍｉｘ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃ　Ｇｒａｄｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、３７℃で終夜静置した。１６，０００　ｘ　ｇで２０秒間遠心分離して、粒子性の物質を除去した。１ｍＬの上清を別のサンプル管に移し、ＴＦＡを最終濃度０．５％まで加え、酵素を不活性化し、ＨＰＬＣ分析を行った。
５．　ＨＰＬＣ分析
　９００μＬの酵素消化物をＨＰＬＣで分析した。
　ＨＰＬＣ条件：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ含有水＝０：１００→６０：４０（１２０分，リニアグラジェント），流速０．５％／ｍｉｎ，蛍光励起波長４９０ｎｍ，蛍光検出波長５２０ｎｍ
　結果を図８に示す。
　図８においてｐｅａｋ１はＬｙｓ２４９へのラベル化ペプチド、ｐｅａｋ２はＬｙｓ２５１へのラベル化ペプチドに相当することがＭＳ／ＭＳ解析により示された。
　ただし、図４における同様のペプチドピーク（ｐｅａｋ５およびｐｅａｋ６）と比較するとピーク面積比がおよそ逆転した。すなわち、ＰｙＯｘ－Ｃ２－ＩｇＢＰを使用した場合、Ｌｙｓ２４９への反応がより効率的に進行した。
　本発明のペプチドはＡＧＯＸ化学における触媒としてＩｇＧの修飾のために使用されうる。

Claims (20)

  1. 　少なくとも１個の下記基：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     [式中、
    　Ｒは、Ｃ１－３アルキル基、Ｃ１－３アルコキシ基、ハロ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、エステル基、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、および－ＮＯ２から独立して選択され；
    　ａは０～４から選択される整数である]
    がコンジュゲートし、１３～１９アミノ酸長である、ペプチド。
  2. 　該基：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     [式中、Ｒおよびａは請求項１と同義である］がコンジュゲートしたアミノ酸残基が下記から選択される構造：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     を有する、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　該基：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     [式中、Ｒおよびａは請求項１と同義である］
    がコンジュゲートしたアミノ酸残基が下記から選択される構造：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     および
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     を有する、請求項１または２に記載のペプチド。
  4. 　式（Ｉ）：
    　Ｘ1－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１-Ｘ１２-Ｘ１３-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７-Ｘ１８-Ｘ１９-Ｘ２０　　（Ｉ）（配列番号１）
    [式中、
    　Ｘ１は不存在であるか、あるいはＸ２～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
    　Ｘ２は不存在であるか、あるいはＸ３～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
    　Ｘ３は不存在であるか、あるいはＸ４～Ｘ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
    　Ｘ４は不存在であるか、あるいはＸ５が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
    　Ｘ５は不存在であるか、あるいはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
    　Ｘ６はＣｙｓ、２－アミノブタン酸、およびＳ－メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    　Ｘ７はＡｌａおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    　Ｘ８は任意の芳香族アミノ酸残基であり、
    　Ｘ９はＨｉｓ残基であり、
    　Ｘ１０はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、Ｎ６－アセチルリジン、Ｎ５－アセチルオルニチン、２－アミノ－４‐アセチルアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、２－アミノ－３，３－ジメチルブタン酸、２－アミノ－４，４－ジメチルペンタン酸、３－シクロヘキシルアラニンおよび下記式（Ｉ）－１で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    式（Ｉ）－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    （上記式（Ｉ）－１中、Ｋ１は、炭素数１～４のアルキレン基、－（ＮＨ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ－、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される２価の基）、
    　Ｘ１１はＧｌｙ、およびＣｙｓを除く任意のＤ－アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    　Ｘ１２はＧｌｕ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    　Ｘ１３はＬｅｕ残基であり、
    　Ｘ１４はＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    　Ｘ１５はＴｒｐ残基であり、
    　Ｘ１６はＣｙｓ、２－アミノブタン酸およびＳ－メチルシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ただしＸ６およびＸ１６の少なくとも一方は、Ｃｙｓ残基であり、
    　Ｘ１７は不存在であるか、あるいはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌおよび２－アミノブタン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    　Ｘ１８は不存在であるか、あるいはＸ１７が存在するときＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ホモシステイン、３－シクロヘキシルアラニンおよびホモフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    　Ｘ１９は不存在であるか、あるいはＸ１７～Ｘ１８が存在するときＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、３－（２－ピリジル）アラニン、３－（３－ピリジル）アラニンおよび３－（４－ピリジル）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    　Ｘ２０は不存在であるか、あるいはＸ１７～Ｘ１９が存在するときＣｙｓ以外の任意のアミノ酸残基であり、
    　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ７～Ｘ１５、およびＸ１７～Ｘ２０から選択される１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個の下記基：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     [式中、Ｒおよびａは請求項１と同義である］
    がコンジュゲートしている]
    によって表されるアミノ酸配列を含み；
    １３～１９アミノ酸長である、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド。
  5. 　Ｘ８がＴｙｒ、Ｔｒｐ、２－アミノ－３－（１－ナフチル）プロピオン酸、２－アミノ－３－（２－ナフチル）プロピオン酸、２－メチルアミノ－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロピオン酸および下記式（Ｉ）－２で表されるアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であって、
    式（Ｉ）－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010

    　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ７～Ｘ１５、およびＸ１７～Ｘ２０から選択される１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個の下記基：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     [式中、Ｒおよびａは請求項１と同義である］
    がコンジュゲートしている、請求項４に記載のペプチド。
  6. 　Ｘ１１がＧｌｙ、Ｄ－Ｉｌｅ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ａｒｇ、Ｄ－ＳｅｒおよびＤ－Ｌｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ７～Ｘ１５、およびＸ１７～Ｘ２０から選択される１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個の下記基：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     [式中、Ｒおよびａは請求項１と同義である］
    がコンジュゲートしている、
    請求項４または５に記載のペプチド。
  7. 　下記から選択されるアミノ酸配列を含み：
    　配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３；
    　Ｃｙｓ残基以外の１つのアミノ酸残基において、少なくとも１個の下記基：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     [式中、Ｒおよびａは請求項１と同義である］
    がコンジュゲートしている、請求項４～６のいずれか一項に記載のペプチド。
  8. 　Ｘ１～Ｘ５、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基が、下記から選択される構造：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     を有する、請求項４～７のいずれか一項に記載のペプチド。
  9. 　Ｘ２、Ｘ４、Ｘ１０、およびＸ２０から選択される１つのアミノ酸残基が、下記構造：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     を有する、請求項４～８のいずれか一項に記載のペプチド。
  10. 　Ｘ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＤＣＡＹＨＸ１０ＧＥＬＶＷＣＴＦＨＸ２０（配列番号３４）のアミノ酸配列からなり、Ｘ１０のアミノ酸残基が下記から選択される構造：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     を有する、請求項４～９のいずれか一項に記載のペプチド。
  11. 　配列番号３５、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号６８～９０から選択されるのアミノ酸配列を含み、Ｘ１０のアミノ酸残基が下記から選択される構造：

    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     を有する、請求項４～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
  12. 　配列番号３５、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号６８～９０から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１０のアミノ酸残基が下記から選択される構造：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     を有する、請求項４～１１のいずれか一項に記載のペプチド。
  13. 　Ｘ６とＸ１６がＣｙｓ残基であり、Ｘ６のＣｙｓ残基およびＸ１６のＣｙｓ残基間でジスルフィド結合を形成している、またはＸ６およびＸ１６のＣｙｓ残基中のスルフィド基が下記式（Ｉ）－３で表される２価の基により連結されている、請求項４～１２のいずれか一項に記載のペプチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
  14. 　Ｎ末端でアセチル化されているか、Ｃ末端でアミド化されているか、またはＮ末端でアセチル化されていてかつＣ末端でアミド化されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチド。
  15. 　ＩｇＧと結合可能である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のペプチド。
  16. 　溶媒中、少なくとも１個の下記基：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     [式中、Ｒおよびａは請求項１と同義である］
    がコンジュゲートしたペプチドの存在下、抗体および／またはそれらのフラグメントを、ペイロードを保持するＮ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドで処理する工程を含む、抗体の修飾方法。
  17. 　該ペプチドが請求項１～１５のいずれかに記載のペプチドである、請求項１６に記載の方法。
  18. 　請求項１６または１７に記載の方法を含む、抗体とペイロードとの複合体（conjugate）の製造方法。
  19. 　該ペイロードを保持するＮ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドが式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     [式中、
    　Ｌはリンカーを示し；
    　Ｐｒはペイロードを示し；
    　Ｒ１は独立して、１～３個のハロで適宜置換されていてもよいＣ１－３アルキル、１～３個のハロで適宜置換されていてもよいＣ１－３アルコキシ、ハロ、および－ＮＯ２から選択され；
    　ｎは０～５から選択される整数である]
    を有する、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　該ペプチドが請求項１～１５のいずれか一項に記載のペプチドであり；
    　該ペイロードを保持するＮ－アシル－Ｎ－アルキルスルホンアミドが下式（ＩＩ）－ａ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     [式中、
    　Ｌはリンカーを示し；
    　Ｐｒはペイロードを示す]
    を有する；
    請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法に記載の方法。
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