CN109475642B - 赖氨酸缀合的免疫球蛋白 - Google Patents
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Abstract
本文提供了缀合的免疫球蛋白及使用微生物转谷氨酰胺酶产生缀合的免疫球蛋白的方法。
Description
相关申请
本申请要求于2016年6月10日提交的美国临时专利申请No.62/348,410的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
序列表
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技术领域
本文提供了赖氨酸缀合的免疫球蛋白和产生该赖氨酸缀合的免疫球蛋白的方法。
背景技术
单克隆抗体的功用从基础研究扩展到治疗和诊断应用。将抗体与功能剂缀合的能力甚至进一步扩展其功能。缀合抗体的制造通常涉及将接头、药物或其他功能剂缀合至单克隆抗体(mAb)的重(HC)和轻(LC)链上的反应性赖氨酸半胱氨酸残基。参见Deonarain等人,“Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates”,ExpertOpinion in Drug Discovery(2015),10(5):463-481。赖氨酸缀合通常通过基于琥珀酰亚胺(NHS)或基于异硫氰酸酯的化学来介导。基于半胱氨酸的缀合需要抗体的部分还原以破坏一些链间二硫键，从而产生游离硫醇侧链。硫醇反应性功能剂然后可以与抗体上的游离硫醇基团反应以产生抗体-药物缀合物(ADC)。这两种方法均导致多个赖氨酸或半胱氨酸的修饰，导致具有药物-抗体(DAR)比率的分布和随机位置处的药物修饰的非均质ADC混合物。
近来利用位点特异性缀合技术作为产生具有限定的DAR的均质ADC产物的方式的进展已经产生了几种方法，包括工程化未配对的半胱氨酸、引入非天然氨基酸和位点特异性酶促修饰。虽然这些方法产生均质产物，但它们各有缺点。基于半胱氨酸的缀合需要另外的步骤从未配对的半胱氨酸去除封端半胱氨酸、谷胱甘肽或甚至轻链。参见例如Junutula等人,“Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody ImprovesTherapeutic Index”,Nature Biotechnology,(2008)26:925-932；Chen等人,“Charge-based Analysis of Antibodies with Engineered Cysteines”,MAbs(2009)1(6):563-571；Gomez等人,“Effect of temperature,pH,dissolved oxygen,and hydrolysate onthe formation of triple light chain antibodies in cell culture”BiotechnolProgress(2010),26:1438-1445。此外，目前用于基于半胱氨酸的缀合物的基于马来酰亚胺的化学的血清不稳定性已被证明引起对效力丧失或脱靶毒性的担忧。Alley等人,“Contribution of Linker Stability to the Activities of AnticancerImmunoconjugates”,Bioconjugate Chemistry(2008)19(3):759-765；Shen等人,“Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity ofantibody-drug conjugates”,Nature Biotechnology(2012)30:184-189。引入非天然氨基酸需要在基于遗传修饰细胞的或无细胞的体系中的表达。Hallam等人,“Unnatural AminoAcids in Novel Antibody Conjugates”,Future Med.Chem.(2014)6(11):1309-1324。此外，非天然氨基酸的存在可能引发患者的免疫原性应答。然而，位点特异性的酶促修饰可潜在地利用抗体序列中天然的野生型氨基酸，从而使免疫原性的可能性最小化。此外，通常由蛋白质修饰酶形成的翻译后键非常稳定。
已经使用称为转谷氨酰胺酶的蛋白质家族研究了蛋白质的位点特异性酶促修饰，该酶催化在谷氨酰胺的γ-羧酰胺基团(酰基供体)与赖氨酸的ε-氨基(酰基受体)之间形成稳定的异肽键(参见图1)(参见，例如，Yokoyama等人,“Properties and Applications ofMicrobial Transglutaminase”,Appl.Microbiol.Biotech.(2004)64:47-454；Strop,“Versatility of Microbial Transglutaminase”,Bioconjugate Chemistry,(2014)25(5):855-862；Kieliszek等人,“Microbial Transglutaminase and its Application inthe Food Industry”,Folia Microbiol(2014)59:241-250)。最近，几个团队已经探索利用转谷氨酰胺酶作为产生ADC的手段(参见例如Josten等人,“Use of MicrobialTransglutaminase for the Enzymatic Biotinylation of Antibodies”,J.ImmunolMethods,(2000)240:47-54；Mindt等人,“Modification of Different IgG1Antibodiesvia Glutamine and Lysine Using Bacterial and Human Tissue Transglutaminase”,Bioconjugate Chemistry(2008)19(1):271-278)；Jeger等人,“Site-specific andstoichiometric modification of antibodies by bacterial transglutaminase”Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(2010)49:9995-9997；Strop等人,“Location Matters:Site ofConjugation Modulates Stability and Pharmacokinetics of Antibody DrugConjugates”,Chem Biol(2013)20(2):161-167；Dennler等人,“Transglutaminase-BasedChemo-Enzymatic Conjugation Approach Yields Homogeneous Antibody-DrugConjugates”,Bioconjugate Chemistry(2014)25(3):569-578；Siegmund等人,“Locked byDesign:A Conformationally Constrained Transglutaminase Tag Enables EfficientSite-Specific Conjugation”,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(2015)54(45):13420-13424)。转谷氨酰胺酶存在于从细菌到人类的生物体中，其在结构和功能上相关，但每个都参与特定的细胞过程。从细菌茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)分离出的微生物转谷氨酰胺酶(微生物谷氨酰胺转移酶)已广泛用于整个食品工业中以将蛋白质交联在一起用于各种应用。除了其低制造成本之外，由于其能够在广泛的pH、盐和温度条件下发挥功能，因此它是一种有吸引力的缀合技术。
尽管经过超过二十年的研究，但微生物转谷氨酰胺酶的底物特异性尚未明确定义。通常，暴露的环上具有疏水性或带正电荷的相邻残基的谷氨酰胺或赖氨酸往往是优选的。参见Taguchi等人,“Substrate specificity analysis of microbialtransglutaminase using proteinaceous protease inhibitors as natural modelsubstrates”,J.Biochem.(2000)128:415-425；Sugimura等人,“Identification ofpreferred substrate sequences of microbial transglutaminase from Streptomycesmobaraensis using a phage-displayed peptide library”,Arch.Biochem.Biophys.(2008)477:379-383；Tagami等人,“Substrate specificity of microbialtransglutaminase as revealed by three-dimensional docking simulation andmutagenesis”,Protein Eng.Des.Sel.(2009)22:747-752。已经发现酰基供体谷氨酰胺的情况比酰基受体赖氨酸更重要。参见例如Ohtsuka等人,“Substrate specificities ofmicrobial transglutaminase for primary amines”,J.Agric.Food Chem.(2000)48:6230-6233；Ohtsuka等人,“Comparison of substrate specificities oftransglutaminases using synthetic peptides as acyl donors”,Biosci.Biotechnol.Biochem.(2000)64:2608-2613；Gundersen等人,“Microbialtransglutaminase displays broad acyl-acceptor substrate specificity”,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2013)98:219-230。事实上，最小酰基供体底物需要N-末端N-羧苄氧基(CBZ)，接着谷氨酰胺和C-末端甘氨酸(CBZ-L-谷氨酰胺酰基甘氨酸或Z-Gln-Gly)，而最小酰基受体是氨。
由于微生物转谷氨酰胺酶对酰基受体胺的特异性较低，因此迄今为止的研究主要集中于抗体谷氨酰胺残基的转酰胺基化。参见Josten等人,Mindt等人,Jeger等人,Strop等人,Dennler等人和Siegmund等人，上文引用。与描述使用酰基受体底物的mTGase-介导的抗体生物素化的较早报告(Josten等人2000)相反，几种基团最近证明很少或没有通过相同或类似底物的野生型抗体的mTGase修饰。这些数据证实，尽管存在着丰富的溶剂暴露的谷氨酰胺，但没有一个处于通过mTGase转酰胺化(transamidated)的适当情况中(Mindt等人2008；Jeger等人2010；Strop等人2013)。
也已经推测，由于IgG表面上的多个反应性赖氨酸，利用基于胺供体的底物对赖氨酸转酰胺可以产生异质的ADC产物(Josten等人2000；Jeger等人2010)。人IgG包含平均80个赖氨酸，其中80-90％被预测为是溶剂暴露的(Gautier等人,“Lysine ConjugatedProperties in Human IgGs Studied by Integrating High-Resolution Native MassSpectrometry and Bottom-Up Proteomics”,Proteomics(2015)15(16):2756-2765；数据未示出)，并且IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的C-末端密码子是赖氨酸(Ellison等人,DNA(1981)1:11-18；Ellison等人(“Ellison等人2”),Proc.Nat.Acad.Sci.USA,(1982)79:1984-1988；Ellison等人,Nucleic Acid Res.(1982)10:4071-4079)。然而，血清来源的IgG缺乏该赖氨酸(Wang等人,J.Immunol.(1980)125:1048-1054；Edelman等人,Proc Natl Acad.Sci.USA(1969)63:78-85；Frangione等人,Biochemistry(1980)19:4304-4308；Pink等人,Biochem.J.(1970)117:33-47)。对IgD已经观察到相同的情况(White等人,Science(1985)228:733-737；Lin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1981)78:504-508；Shinoda等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:785-789)。IgG1在HEK293和CHO细胞中的重组表达也导致缺乏C-末端Lys447的蛋白质(Ellison等人；Harris等人,Eur.J.Biochem.(1990)194:611-620；Harris,J.Chromatogr.A(1995)705:129-134；Dick等人,Biotechnol.Bioeng.(2008)100:1132-1143)。
迄今为止，本领域普通技术人员认为，由于IgG表面上的反应性赖氨酸过多，利用基于胺供体的底物以使赖氨酸转酰胺化可产生非均质ADC产物(Josten等和Jeger等)，且因此使用基于胺供体的底物以使免疫球蛋白上的赖氨酸残基转酰胺化已被放弃。
因此，需要免疫球蛋白的位点特异性酶促修饰以产生具有可预测的缀合速率的缀合物。这将允许创建具有相对均质的DAR的ADC。
引用列表
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发明内容
问题解决方案
本发明出人意料地发现，尽管没有观察到野生型免疫球蛋白赖氨酸通过微生物转谷氨酰胺酶的修饰，但当工程化赖氨酸残基引入免疫球蛋白或其抗原结合部分中时，微生物转谷氨酰胺酶能够利用工程化赖氨酸残基作为酰基受体。令人惊异地，工程化赖氨酸残基使用微生物转谷氨酰胺酶的缀合导致缀合的功能剂的位点特异性的和可预测的并入。此外，使赖氨酸残基工程化到恒定区中具有对于任何免疫球蛋白或其抗原结合部分的广泛适用性，而无论其可变区和结合特异性。
在一个方面，本文公开了产生缀合的免疫球蛋白的方法，该方法包括使免疫球蛋白或其抗原结合部分与微生物转谷氨酰胺酶和包含酰基供体底物的功能剂接触，且其中免疫球蛋白或其抗原结合部分包含工程化赖氨酸残基，其中该工程化赖氨酸残基是赖氨酸残基插入或天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，其中酰基供体底物包含谷氨酰胺残基，且其中功能剂是治疗剂或诊断剂，其中微生物转谷氨酰胺酶将免疫球蛋白或其抗原结合部分的工程化赖氨酸残基缀合于功能剂上的酰基供体底物的谷氨酰胺残基，从而产生缀合的免疫球蛋白。
在另一个方面，本文公开了产生缀合的免疫球蛋白的方法，该方法包括i)使免疫球蛋白或其抗原结合部分与微生物转谷氨酰胺酶和酰基供体底物接触，其中免疫球蛋白或其抗原结合部分包含工程化赖氨酸残基和其中工程化赖氨酸残基是赖氨酸残基插入或天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，且其中酰基供体底物包含谷氨酰胺残基和反应性基团，其中微生物转谷氨酰胺酶将免疫球蛋白或其抗原结合部分的工程化赖氨酸残基与酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合，和ii)将功能剂与酰基供体底物的反应性基团缀合，其中功能剂是治疗剂或诊断剂，从而产生缀合的免疫球蛋白。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于重链中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于重链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于轻链中。在另一实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于轻链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于κ轻链中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于κ轻链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于λ轻链中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于λ轻链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于可变区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基不存在于可变区中。
在一个实施方式中，酰基供体底物的反应性基团通过点击化学与功能剂缀合。
在一个实施方式中，突变成赖氨酸残基的天然氨基酸残基选自：免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)、丝氨酸136(S136K)、亮氨酸193(L193K)、天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、甲硫氨酸252(M252K)、天冬酰胺297(N297K)或脯氨酸445(P445K)，免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)或丝氨酸202(S202K)或者免疫球蛋白或其抗原结合部分的λ轻链上的谷氨酸213(E213K)。在一个实施方式中，重链(在突变前)包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在另一实施方式中，κ轻链(在突变前)包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在另一实施方式中，λ轻链(在突变前)包含SEQ ID NO:20所示的序列。
在一个实施方式中，重链还包含在位置448处添加到其C-末端的氨基酸残基，且其中所述氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。在进一步的实施方式中，在位置448处添加到C-末端的氨基酸残基是亮氨酸。
在一个实施方式中，赖氨酸残基插入是插入在免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上丝氨酸191和丝氨酸192之间或丝氨酸192和亮氨酸193之间的赖氨酸残基。
在一个实施方式中，免疫球蛋白是抗原结合片段(fragment-antigen binding)(Fab')，且其中突变成赖氨酸残基的天然氨基酸残基选自：免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、脯氨酸228(P228K)、脯氨酸230(P230K)和谷氨酸233(E233K)。在另一实施方式中，Fab'包含完整铰链区。在另一实施方式中，Fab'包含截短的铰链区。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含第二工程化赖氨酸残基，其中第二工程化赖氨酸残基是第二赖氨酸残基插入或第二天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，且其中微生物转谷氨酰胺酶将免疫球蛋白或其抗原结合部分的第二工程化赖氨酸残基与酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合。在另一实施方式中，突变成工程化赖氨酸残基的天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，且突变成第二工程化赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。在另一实施方式中，突变成工程化赖氨酸残基的天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135，且突变成第二工程化赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)。在再另一实施方式中，突变成工程化赖氨酸残基的天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)，且突变成第二工程化赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。在进一步的实施方式中，重链还包含在位置448处添加到其C-末端的氨基酸残基，且其中所述氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。在一个另外的方面，在位置448处添加到C-末端的氨基酸残基是亮氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白还包含第三工程化赖氨酸残基，其中第三工程化赖氨酸残基是第三赖氨酸残基插入或第三天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，且其中微生物转谷氨酰胺酶将免疫球蛋白或其抗原结合部分的第三工程化赖氨酸残基与酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合。在一个实施方式中，突变成工程化赖氨酸残基的第一天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，突变成第二工程化赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬酰胺297(N297K)，和突变成第三工程化赖氨酸残基的第三天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含第四工程化赖氨酸残基，其中第四工程化赖氨酸残基是第四赖氨酸残基插入或第四天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，且其中微生物转谷氨酰胺酶将免疫球蛋白或其抗原结合部分的第四工程化赖氨酸残基与酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合。在另一实施方式中，突变成工程化赖氨酸残基的第一天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，突变成第二工程化赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬酰胺297(N297K)，突变成第三工程化赖氨酸残基的第三天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)，和突变成第四工程化赖氨酸残基的第四天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的脯氨酸445(P445K)。
在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基之后的氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。在另一实施方式中，工程化赖氨酸残基之前的氨基酸残基不是酸性氨基酸残基。在另一实施方式中，将工程化赖氨酸残基之后的氨基酸残基突变成除脯氨酸或酸性氨基酸残基之外的任何氨基酸和将工程化赖氨酸残基之前的氨基酸残基突变成除酸性氨基酸残基之外的任何氨基酸提供了工程化酰基受体赖氨酸位点的最佳序列。
在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基之前的氨基酸残基是非酸性氨基酸残基插入或天然酸性氨基酸残基突变成非酸性氨基酸残基。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基之后的氨基酸残基是氨基酸残基插入(其中该氨基酸残基插入是非酸性氨基酸残基插入和非脯氨酸残基插入)或者天然酸性氨基酸残基或天然脯氨酸残基突变成非酸性氨基酸残基和非脯氨酸残基。在一个实施方式中，非酸性氨基酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在一个实施方式中，非酸性氨基酸残基插入是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸插入。在一个实施方式中，非酸性氨基酸和非脯氨酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在一个实施方式中，天然酸性氨基酸残基是天冬氨酸或谷氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含还含有在位置448处添加到其C-末端的至少一个氨基酸残基的重链，且其中所述至少一个氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。在进一步的实施方式中，在位置448处添加到C-末端的至少一个氨基酸残基是亮氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含含有在半胱氨酸214之后的一至四个另外的氨基酸的插入的轻链，其中赖氨酸残基插入是在该一至四个另外的氨基酸之后插入的赖氨酸残基，且其中亮氨酸残基在该赖氨酸残基之后插入。在进一步的实施方式中，半胱氨酸214之后一至四个另外的氨基酸的插入、在该一至四个另外的氨基酸之后插入的赖氨酸残基及在该赖氨酸残基之后插入的亮氨酸残基构成选自以下的序列：GKL、GGKL、GGSKL和GGSGKL。在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含含有在半胱氨酸214之后序列GGSGKL的插入的轻链。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)或(II)：
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；和Y是功能剂。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)，并且其中Z是CBZ基团；其中L为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且其中n是0、1、2或3。在一个实施方式中，L是聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，L包含一个或多个氨基酸和聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)，其中Z是CBZ基团，并且其中L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly；m是1；并且n是1。在另一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是2、3或4；并且至少一个L是Gly；并且至少一个L是PEG部分。在另一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是4；一个L是Gly并且其余三个L基团各自是PEG部分。在另一实施方式中，功能剂Y是阿里他汀F。
在一个实施方式中，酰基供体底物具有式(III)或(IV):
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；和X是反应性基团。
在一个实施方式中，L是聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，当n是2-5时，至少一个L包含一个或多个氨基酸，且另一个L是聚乙二醇(PEG)部分。在一个实施方式中，酰基供体底物具有式(III)，并且其中Z是CBZ基团；其中L为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且其中n是0、1、2或3。在另一个实施方式中，酰基供体底物具有式(III)，其中Z是CBZ基团，并且其中L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly；n是1；并且m是1。在另一个实施方式中，酰基供体底物具有式(IV)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。
在另一个实施方式中，X是选自(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)，
[Chem.1]
(二苯并环辛炔；DBCO)，反式环辛烯(TCO)，叠氮基(N3)，炔烃，四嗪甲基环丙烯，降冰片烯，酰肼/肼和醛的反应性基团。
在一个实施方式中，治疗剂是抗体或其抗原结合部分、化疗剂、药物剂、放射性剂、细胞毒性剂、抗生素、小分子、核酸或多肽。在另一个实施方式中，诊断剂是荧光团、荧光染料、放射性核素或酶。
在一个实施方式中，微生物转谷氨酰胺酶来自茂源链霉菌(Streptomycesmobarensis)。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgG1免疫球蛋白或其抗原结合部分。在另一实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白或其抗原结合部分。在一个实施方式中，免疫球蛋白是IgA1、IgA2或IgM免疫球蛋白。在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgD或IgE免疫球蛋白或其抗原结合部分。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是人免疫球蛋白或其抗原结合部分或者人源化免疫球蛋白或其抗原结合部分。在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是嵌合免疫球蛋白或非人免疫球蛋白或其抗原结合部分。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含两条重链和两条轻链。在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分的两条重链之间不存在分子内交联，即没有二硫键。
在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白或其抗原结合部分的比率是1:1-200:1或1:1-100:1。
在另一个方面，本文描述了包含免疫球蛋白或其抗原结合部分和功能剂的缀合的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白包含工程化赖氨酸残基且其中工程化赖氨酸残基是赖氨酸残基插入或天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，功能剂包含酰基供体底物，其中酰基供体底物包含谷氨酰胺残基，且功能剂是治疗剂或诊断剂，其中免疫球蛋白或其抗原结合部分的工程化赖氨酸残基缀合于功能剂的酰基供体底物的谷氨酰胺残基。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于重链中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于重链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于轻链中。在另一实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于轻链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于κ轻链中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于κ轻链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于λ轻链中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于λ轻链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于可变区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基不存在于可变区中。
在另一个方面，本文描述了包含免疫球蛋白或其抗原结合部分和功能剂的缀合的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白或其抗原结合部分包含工程化赖氨酸残基且其中工程化赖氨酸残基是赖氨酸残基插入或天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，工程化赖氨酸残基缀合于酰基供体底物上的谷氨酰胺残基，其中酰基供体底物还包含反应性基团，该反应性基团缀合于功能剂，其中功能剂是治疗剂或诊断剂。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于重链中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于重链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于轻链中。在另一实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于轻链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于κ轻链中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于κ轻链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于λ轻链中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于λ轻链恒定区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基存在于可变区中。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基不存在于可变区中。
在一个实施方式中，突变成赖氨酸残基的天然氨基酸残基选自：免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)、丝氨酸136(S136K)、亮氨酸193(L193K)、天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、甲硫氨酸252(M252K)、天冬酰胺297(N297K)或脯氨酸445(P445K)，免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)或丝氨酸202(S202K)或者免疫球蛋白或其抗原结合部分的λ轻链上的谷氨酸213(E213K)。在一个实施方式中，重链(在突变前)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一个实施方式中，κ轻链(在突变前)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一个实施方式中，λ轻链(在突变前)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在一个实施方式中，重链还包含在位置448处添加到其C-末端的氨基酸残基，且其中所述氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。在进一步的实施方式中，在位置448处添加到C-末端的至少一个氨基酸残基是亮氨酸。
在另一实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含含有在位置214之后添加到C-末端的至少一个氨基酸残基的轻链，其中该至少一个氨基酸残基是GGSGKL(甘氨酸甘氨酸丝氨酸甘氨酸赖氨酸亮氨酸)。在另一实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含还含有在位置214之后添加到C-末端的至少一个氨基酸残基的轻链，其中该至少一个氨基酸残基是GGSGKL。在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含含有在半胱氨酸214之后序列GGSGKL的插入的轻链。
在一个实施方式中，赖氨酸残基插入是插入在免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上丝氨酸191和丝氨酸192之间或丝氨酸192和亮氨酸193之间的赖氨酸残基。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是抗原结合片段(Fab)，且其中突变成赖氨酸残基的天然氨基酸残基选自：免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、脯氨酸228(P228K)、脯氨酸230(P230K)和谷氨酸233(E233K)。在另一实施方式中，Fab包含完整铰链区。在另一实施方式中，Fab包含截短的铰链区。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含突变成第二赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基，且其中微生物转谷氨酰胺酶将免疫球蛋白或其抗原结合部分的第二赖氨酸残基与酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合。在另一实施方式中，突变成赖氨酸残基的第一天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，和突变成第二赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是丝氨酸202(S202K)。在另一实施方式中，突变成工程化赖氨酸残基的天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)，和突变成第二工程化赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)。在再另一实施方式中，突变成工程化赖氨酸残基的天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)，和突变成第二工程化赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。
在进一步的实施方式中，重链还包含在位置448处添加到其C-末端的至少一个氨基酸残基，且其中该至少一个氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。在一个实施方式中，在位置448处添加到C-末端的至少一个氨基酸残基是亮氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白还包含突变成第三赖氨酸残基的第三天然氨基酸残基，且其中微生物转谷氨酰胺酶将免疫球蛋白或其抗原结合部分的第三赖氨酸残基与酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合。在另一实施方式中，突变成赖氨酸残基的第一天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，突变成第二赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬酰胺297(N297K)，和突变成第三赖氨酸残基的第三天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含突变成第四赖氨酸残基的第四天然氨基酸残基，且其中微生物转谷氨酰胺酶将免疫球蛋白或其抗原结合部分的第四赖氨酸残基与酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合。在另一实施方式中，突变成赖氨酸残基的第一天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，突变成第二赖氨酸残基的第二天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬酰胺297(N297K)，突变成第三赖氨酸残基的第三天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)，和突变成第四赖氨酸残基的第四天然氨基酸残基是免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的脯氨酸445(P445K)。
在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基之后的氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。在另一实施方式中，工程化赖氨酸残基之前的氨基酸残基不是酸性氨基酸残基。在另一实施方式中，将工程化赖氨酸残基之后的氨基酸残基突变成除脯氨酸或酸性氨基酸残基之外的任何氨基酸和将工程化赖氨酸残基之前的氨基酸残基突变成除酸性氨基酸残基之外的任何氨基酸提供工程化酰基受体赖氨酸位点的最佳序列。
在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基之前的氨基酸残基是非酸性氨基酸残基插入或天然酸性氨基酸残基突变成非酸性氨基酸残基。在一个实施方式中，工程化赖氨酸残基之后的氨基酸残基是氨基酸残基插入(其中该氨基酸残基插入是非酸性氨基酸残基和非脯氨酸残基插入)或者天然酸性氨基酸残基或天然脯氨酸残基突变成非酸性氨基酸残基和非脯氨酸残基。在进一步的实施方式中，非酸性氨基酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在另一个进一步实施方式中，非酸性氨基酸残基插入是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸插入。在再另一进一步实施方式中，非酸性氨基酸和非脯氨酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在再另一进一步实施方式中，天然酸性氨基酸残基是天冬氨酸或谷氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含还含有在位置448处添加到其C-末端的至少一个氨基酸残基的重链，且其中该至少一个氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。在进一步的实施方式中，在位置448处添加到C-末端的至少一个氨基酸残基是亮氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含含有半胱氨酸214之后一至四个另外的氨基酸的插入的轻链，其中赖氨酸残基插入是在该一至四个另外的氨基酸之后插入的赖氨酸残基，且其中亮氨酸残基在该赖氨酸残基之后插入。在进一步的实施方式中，半胱氨酸214之后一至四个另外的氨基酸的插入、在一至四个另外的氨基酸之后插入的赖氨酸残基和在该赖氨酸残基之后插入的亮氨酸残基构成选自以下的序列：GKL、GGKL、GGSKL和GGSGKL。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)或(II)：
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；和Y是功能剂。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)，并且其中Z是CBZ基团；其中L为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且其中n是0、1、2或3。在另一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)，其中Z是CBZ基团，并且其中L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly；m是1；并且n是1。在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。在一个实施方式中，L是聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，L包含一个或多个氨基酸和聚乙二醇部分(PEG)。在另一实施方式中，功能剂Y是阿里他汀F。
在一个实施方式中，酰基供体底物具有式(III)或(IV)：
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；且X是反应性基团。
在一个实施方式中，酰基供体底物具有式(III)，并且其中Z是CBZ基团；其中L为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且其中n是0、1、2或3。在另一个实施方式中，酰基供体底物具有式(III)，其中Z是CBZ基团，并且其中L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly；m是1；并且n是1。在另一个实施方式中，酰基供体底物具有式(IV)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。在一个实施方式中，L是聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，当n是2-5时，则至少一个L包含一个或多个氨基酸，并且一个或多个L包含聚乙二醇部分(PEG)。
在一个实施方式中，X是选自(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)、
[Chem.2]
(二苯并环辛炔；DBCO)、反式环辛烯(TCO)、叠氮基(N3)、炔烃、四嗪甲基环丙烯、降冰片烯、酰肼/肼和醛的反应性基团。
在一个实施方式中，治疗剂是抗体或其抗原结合部分、化疗剂、药物剂、放射性剂、细胞毒性剂、抗生素、小分子、核酸或多肽。在另一个实施方式中，诊断剂是荧光团、荧光染料、放射性核素或酶。
在一个实施方式中，微生物转谷氨酰胺酶来自茂源链霉菌。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgG1免疫球蛋白或其抗原结合部分。在另一实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白或其抗原结合部分。在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgA1、IgA2或IgM免疫球蛋白或其抗原结合部分。在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgD或IgE免疫球蛋白或其抗原结合部分。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是人免疫球蛋白或其抗原结合部分或者人源化免疫球蛋白或其抗原结合部分。在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分是嵌合免疫球蛋白或非人免疫球蛋白或其抗原结合部分。
在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分包含两条重链和两条轻链。在一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分的两条重链之间不存在分子内交联。
在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白或其抗原结合部分的比率是1:1-200:1或1:1-100:1。
在一个实施方式中，功能剂是抗体或其抗原结合部分，且其中免疫球蛋白或其抗原结合部分和功能剂结合相同的抗原或结合不同的抗原。
在另一个方面，本文描述了编码可缀合免疫球蛋白的核酸。另一方面，本文描述了包含核酸的质粒。在另一个实施方式中，本文描述了包含质粒的分离的细胞。
在另一个方面，本文描述了包含缀合免疫球蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一个方面，本文描述了通过本文所述的任何方法产生的缀合免疫球蛋白。在一个实施方式中，所述方法进一步包括在将功能剂缀合于酰基供体底物的反应性基团之前，纯化与酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合的免疫球蛋白的步骤。在一个实施方式中，纯化步骤包括基于大小的方法，如色谱或渗滤。在另一个实施方式中，纯化步骤包括基于电荷的分离，例如阴离子交换或阳离子交换色谱。在另一个实施方式中，纯化步骤包括基于亲和力的步骤，例如蛋白A或蛋白G色谱和疏水相互作用色谱(HIC)。
当结合附图阅读时，进一步理解发明内容以及以下详细描述。为了说明所公开的方法和缀合免疫球蛋白的目的，在附图中示出了示例性实施方式；然而，所述方法和缀合免疫球蛋白不限于所公开的具体实施方式。附图中：
附图说明
[fig.1]图1显示转谷氨酰胺酶反应，其中转谷氨酰胺酶催化在酰基供体谷氨酰胺和酰基受体赖氨酸之间形成异肽键并释放氨分子。
[fig.2]图2显示示例性Z-Gln-Gly酰基供体底物的结构。
[fig.3]图3显示合成示例性Z-Gln-Gly酰基供体底物的可能路线。
[fig.4]图4A、4B和4C显示人IgG1Fab和Fc晶体结构中溶剂暴露的赖氨酸(棒示意图)；(图4A)Fab VH-CH1和Vκ-Cκ，(图4B)Fab VH-CH1和Vλ-Cλ及(图4C)Fc CH2和CH3使用具有1.4埃探针半径的Discovery Studio 4.5确定。
[fig.5]图5A、5B、5C、5D、5E和5F显示与酰基供体和微生物转谷氨酰胺酶接触的抗体的ESI-MS分析。将抗体与50倍摩尔过量的Z-Gln-Gly-CAD-生物素和1U/mL微生物转谷氨酰胺酶在37℃下接触过夜。在IdeS消化和还原之后，通过ESI-MS确定LC、Fd和Fc质量。
[fig.6]图6显示人IgG1，κ和λ恒定域的序列。基于晶体结构1FC1(Fcγ)、4F3F(CH1和Cκ)和4HK0(Cλ)的溶剂暴露的恒定域赖氨酸为黑体；环内的赖氨酸加下划线。恒定域按照EU编号系统编号。
[fig.7-1]图7-1和图7-2显示通过将mTGase与Z-Gln-Gly-CAD-生物素在37℃下孵育过夜对于转酰胺进行筛选的纯化CH1和铰链突变体mAb的缀合水平。生物素化的mAb通过ELISA检测，如在材料和方法部分中详述的，并分析相对荧光单位(RFUs)。HC和LC的质量通过ESI-MS进行分析(数据未显示)并确定缀合的百分比。
[fig.7-2]图7-1和图7-2显示通过将mTGase与Z-Gln-Gly-CAD-生物素在37℃下孵育过夜对于转酰胺进行筛选的纯化CH1和铰链突变体mAb的缀合水平。生物素化的mAb通过ELISA检测，如在材料和方法部分中详述的，并且分析相对荧光单位(RFUs)。HC和LC的质量通过ESI-MS进行分析(数据未显示)并确定缀合的百分比。
[fig.8]图8显示之前鉴定为具有最高缀合效率的CH1、CH2、CH3和铰链突变体mAb的缀合水平。MAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和mTGase在37℃下孵育过夜。样品用IdeS消化，还原和通过ESI-MS进行分析，并确定对于Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Δ质量＝631Da)的百分缀合。DAR通过将Δ质量除以Z-Gln-Gly-CAD-生物素的质量确定。
[fig.9]图9显示具有多个酰基受体位点(cytes)的mAb与各种酰基供体的缀合效率。MAb与Z-Gln-Gly-N3、Z-Gln-Gly-PEG2-BCN或Z-Gln-Gly-PEG2-AuF和mTGase在37℃下孵育过夜。还原的LC的质量通过LC-MS分析(数据未显示)，并确定对于Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Δ质量＝631Da)的百分缀合。
[fig.10]图10显示IgG Fc亚型的比对。人IgG1、2、3和4Fc的初级氨基酸序列进行比对且差异突出显示。IgG1残基Met252、Asn297和Pro445通过X指示。
[fig.11]图11显示具有酰基受体的Fab与mAb突变体中的Q295和/或Q297酰基供体位点缀合。抗体01-N297Q与Fab'的赖氨酸突变体和mTGase在37℃下孵育过夜。样品还原并使用4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE进行分析。FabCH1-HC二聚体的质量为大约75kDa且FabCH1-HC-FabCH1三聚体为大约100kDa。
[fig.12]图12说明位于整个mAb中的工程化酰基受体位点。用酰基受体位点工程化的残基的位置在(A)Fab(4F3F)HC和LC及(B)Fc(1FC1)中突出显示。
具体实施方式
详细说明
所公开的方法和缀合免疫球蛋白可以通过参考以下结合形成本公开的一部分的附图的详细描述而更容易地理解。应该理解，所公开的方法和缀合免疫球蛋白不限于本文描述和/或显示的具体实施方式，并且本文使用的术语仅用于通过举例描述具体实施方式的目的，并且不旨在限制所要求保护的方法或缀合免疫球蛋白。
除非另有明确说明，否则关于可能的作用机制或模式或改善理由的任何描述仅意在说明，并且所公开的方法和缀合免疫球蛋白不受任何这样提议的作用机制或模式或改善理由的正确性或不正确性约束。
在整个这个文本中，描述涉及缀合免疫球蛋白及其产生方法。在本公开描述或要求保护与缀合免疫球蛋白相关的特征或实施方式的情况下，这样的特征或实施方式同样适用于产生该缀合免疫球蛋白的方法。类似地，在本公开描述或要求保护与产生缀合免疫球蛋白的方法相关的特征或实施方式的情况下，这样的特征或实施方式同样适用于缀合免疫球蛋白。
除非上下文另有明确规定，否则对特定数值的提及至少包括该特定值。当表达值的范围时，另一个实施方式包括从一个特定值和/或到另一个特定值。此外，对范围中所述值的提及包括该范围内的各个值和每个值。所有的范围都包含端点并是可组合的。
当通过使用前语“约”将值表示为近似值时，将理解该特定值形成另一个实施方式。
应当理解，为了清楚起见，本文在分开的实施方式的上下文中描述的所公开的方法和缀合免疫球蛋白的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的所公开的方法和缀合免疫球蛋白的各种特征也可以分开提供或以任何亚组合形式提供。
如本文所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数形式。
涉及说明书的方方面面的各种术语在说明书和权利要求全文使用。除非另有说明，否则这样的术语将被赋予其在本领域中的普通含义。其他具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式来解释。
当关于数值范围使用术语“约”时，截止值或具体值被用于指示所记载的值可以与列出的值相差至多多达10％。因此，术语“约”用于包含与规定值相差±10％或更小的变化，±5％或更小的变化，±1％或更小的变化，±0.5％或更小的变化，或±0.1％或更小的变化。
一般地，术语"工程化"是指核酸或多肽分子通过合成方式(例如，通过重组技术，体外肽合成，通过肽的酶促或化学偶联或通过本领域中通常使用的其它方法)的操作。
如本文中使用的，术语"工程化氨基酸残基"在序列的情况中是指非天然存在的氨基酸残基。如本文中使用的，术语"工程化核酸残基"在序列的情况中是指非天然存在的核酸残基。这些术语包括，例如，相对于相应的天然存在的多肽序列或核酸序列包含一个或多个氨基酸或核苷酸变化(包括添加、删除或置换)的多肽序列或核酸序列，其中这样的变化通过重组DNA技术引入。例如，当比对野生型和工程化形式的序列时，"工程化赖氨酸残基"是不存在于相应的天然存在的或野生型多肽序列中而是被引入多肽中(通过突变现有的氨基酸残基或通过插入赖氨酸残基)的赖氨酸残基。工程化氨基酸残基不是合成氨基酸残基。例如，工程化赖氨酸残基不是合成赖氨酸残基。
在一个实施方式中，"工程化氨基酸残基"是氨基酸残基插入。例如，一个或多个氨基酸残基可以插入两个天然存在的氨基酸残基之间。在另一实施方式中，"工程化氨基酸残基"是突变成不同氨基酸残基的天然存在的氨基酸残基。例如，工程化赖氨酸残基可以是例如使用重组DNA技术突变成赖氨酸残基的天然存在的氨基酸残基(例如，组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或酪氨酸)。本领域技术人员可以容易地产生根据本发明的这一方面可用的工程化多肽序列。工程化多肽序列可以通过任何方式产生，包括例如肽、多肽或蛋白质合成。
如本文中使用的，术语"插入"或"添加"是指与天然存在的分子(例如，野生型序列)相比，分别导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸的添加的氨基酸或核苷酸序列的变化。一个或多个氨基酸残基的插入或添加可以在内部氨基酸残基之间发生。或者，插入可以在氨基酸序列的N-末端发生。或者，插入可以在氨基酸序列的C-末端发生。
术语"天然氨基酸"、"天然氨基酸残基"、"天然存在的氨基酸"或"天然存在的氨基酸残基"是指通常存在于野生型多肽序列的情况内的天然存在的氨基酸。换句话说，"天然氨基酸"未以任何方式突变或变化以与母序列(例如，天然存在的序列)中存在的氨基酸残基不同。"天然氨基酸"包括在多肽序列内的任何位置处的氨基酸(例如，内部氨基酸残基)以及在多肽序列的N-末端或C-末端处的任何氨基酸。
术语“酰基供体底物”是指其上具有末端酰基的基团。优选地，“酰基供体底物”包含谷氨酰胺残基。酰基供体底物可以任选地含有另外的反应性基团。在第一实施方式中，酰基供体底物与功能剂共价连接。在第二实施方式中，酰基供体底物不与功能剂连接。在一个实施方式中，酰基供体底物包含谷氨酰胺残基和反应性基团。在另一个实施方式中，如本文进一步描述的，酰基供体底物包含一个或多个接头。在任何上述实施方式中，任选地存在酰基供体底物与功能剂之间或酰基供体底物与反应性基团之间的接头。
如本文所用，术语“抗体”广泛地指由4条多肽链，即2条重链(H)链和2条轻链(L)链组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子。如本文所用，术语“抗体”还指免疫球蛋白分子的任何抗原结合部分、突变体、变体或衍生物，其保留Ig分子的必要表位结合特征。这样的突变体、变体或衍生物抗体形式在本领域中是已知的，并且本文中讨论了其非限制性实施方式。在一个实施方式中，抗体是人源化抗体。在另一个实施方式中，抗体是人抗体。在另一个实施方式中，抗体是嵌合抗体。在另一个实施方式中，抗体是非人抗体。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的、称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。这样的抗体实施方式也可以是双特异性、双重特异性或多特异性形式；特异性结合两种或更多种不同的抗原。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)Fab'片段，经由温和还原或通过突变或删除半胱氨酸而包含未通过二硫键连接的铰链区的Fab；(iii)F(ab')2片段，即包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(vi)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546,Winter等人,PCT公布WO 90/05144 A1，通过引用并入本文)，其包含单个可变结构域；和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过使得它们能够制成单一蛋白质链(其中VL和VH区配对以形成单价分子)的合成接头连接(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意图包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。其他形式的单链抗体，例如双抗体，也包括在内。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2:1121-1123)。这样的抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dubeleds.,AntibodyEngineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5))。
"酸性氨基酸"是指在生理pH下呈现负电荷的氨基酸。遗传编码的酸性氨基酸包括天冬氨酸(Asp；D)和谷氨酸(Glu；E)。
"非酸性氨基酸"是指不是酸性氨基酸的氨基酸。非酸性氨基酸包括精氨酸(Arg；R)、组氨酸(His；H)、赖氨酸(Lys；K)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、天冬酰胺(Asn；N)、谷氨酰胺(Gln；Q)、半胱氨酸(Cys；C)、甘氨酸(Gly；G)、脯氨酸(Pro；P)、丙氨酸(Ala；A)、缬氨酸(Val；V)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、酪氨酸(Tyr；Y)和色氨酸(Trp；W)。
"碱性氨基酸"是指在生理pH下呈现正电荷的氨基酸。遗传编码的碱性氨基酸包括组氨酸(His；H)、赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg；R)。
如本文中使用的，术语"生物样品"是指从受试者获得的样品，包括体内或体外获得的生物组织或流体来源的样品。这样的样品可以是但不限于从哺乳动物(包括人)分离的体液(例如血液，血浆，血清，乳汁，脊髓液，腹水或尿液)，器官，组织，部分和细胞。生物样品还可以包括生物样品(包括组织)的切片(例如器官或组织的切片部分)。生物样品还可以包括来自生物样品的提取物，例如来自生物流体(例如血液或尿液)的抗原。
术语“点击化学”是指用于高产量、高选择性、可靠和清洁的蛋白质合成和/或缀合的特定反应。参见例如King等人,“Developments in the Field of Bioorthagonal BondForming Reactions–Past and Present Trends”,Bioconjug.Chem.,(2014)25(5):825-839；McKay等人,“Click Chemistry in Complex Mixtures:BioorthagonalBioconjugation”,Chem.Biol.,(2014)21(9):1075-1101。
术语“经嵌合的”，“嵌合的”，“嵌合抗体”等术语是指包含来自一个来源或物种的重链可变区和轻链可变区(即抗原结合区)，以及来源于不同来源或物种的重链恒定区和轻链恒定区的至少一部分的免疫球蛋白。这些部分可以通过常规技术(例如合成的)化学连接在一起，或者使用基因工程技术(例如编码嵌合抗体的蛋白质部分的DNA可以被表达以产生连续的多肽链)作为连续多肽制备。本公开涵盖的其他形式的“嵌合免疫球蛋白”是其中类别或亚类已经从原始免疫球蛋白的类别或亚类改动或改变的那些(也称为“类别转换免疫球蛋白”)。在本公开全文中，嵌合免疫球蛋白被称为“xi”。在此，“嵌合免疫球蛋白”等术语是指免疫球蛋白的序列，而不是用于产生抗体的方法。
如本文所用，“功能剂”是指具有治疗性、诊断性或其他功能特性的试剂。在一个实施方式中，功能剂可以是治疗剂。在另一个实施方式中，功能剂可以是诊断剂。功能剂可以是大分子或小分子。大分子功能剂包括但不限于抗体及其抗原结合部分。小分子功能剂包括但不限于化学治疗剂、细胞毒性剂、抗生素、可以调节生物过程的其他有机化合物(例如药物)和多肽。
术语“人源化的”、“人源化免疫球蛋白”等术语是指免疫球蛋白，其中框架或“互补决定区”(CDR)已被修饰以包含具有与母体免疫球蛋白相比不同的特异性的免疫球蛋白的CDR。大多数情况下，人源化免疫球蛋白是人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)，其中来自该受体的高变区的残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔或具有期望特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物)(供体免疫球蛋白)的高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替换。此外，人源化免疫球蛋白可以包含在受体免疫球蛋白或供体免疫球蛋白中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化免疫球蛋白性能。通常，人源化免疫球蛋白将包含基本上全部的至少一个和通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部FR是具有人免疫球蛋白序列的那些。人源化免疫球蛋白还可以任选地包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。参见例如Riechmann,L.等人,Nature 332(1988)323-327；和Neuberger,M.S.等人,Nature 314(1985)268-270。在本文中，“人源化免疫球蛋白”和类似术语是指免疫球蛋白的序列，而不是用于产生免疫球蛋白的方法。
术语“诊断剂”是指可用于体内成像研究如CT、MRI和X射线和/或体外成像研究的化合物。诊断剂的非限制性实例包括荧光团、荧光染料、放射性核素和酶。
术语“供体免疫球蛋白”是指将其可变区、CDR或其他功能片段或类似物的氨基酸序列贡献给人源化免疫球蛋白，并从而为人源化免疫球蛋白提供供体免疫球蛋白特征性的抗原特异性和中和活性的非人免疫球蛋白。
术语“受体免疫球蛋白”是指与供体免疫球蛋白异源的免疫球蛋白，其向人源化免疫球蛋白提供其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列。受体免疫球蛋白可以来自任何哺乳动物。在优选的实施方式中，受体免疫球蛋白在人中是非免疫原性的。优选受体免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
“人源化”是指产生人源化免疫球蛋白的过程，并且包括用于产生具有以上特征的人源化免疫球蛋白的任何过程，包括但不限于计算机模拟人源化，工程化物种/宿主CDR至人免疫球蛋白中，置换嵌合免疫球蛋白的框架区残基以匹配相应的人框架区，等等。
如本文所用，“免疫球蛋白”是指由基本上由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白质，包括κ轻链和λ轻链以及α、γ、δ、ε和μ重链。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)在NH2-末端(约110个氨基酸)由可变区基因和在COOH-末端由κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其他上述恒定区基因之一例如γ(编码约330个氨基酸)编码。“免疫球蛋白”包括：(a)免疫球蛋白多肽，即含有特异性结合特定抗原的抗原结合位点的免疫球蛋白家族的多肽，包括所有免疫球蛋白同种型(IgG，IgA，IgE，IgM，IgD和IgY)，类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2)，亚类，以及每个同种型的各种单体和聚合形式，除非另有规定；和(b)免疫特异性结合抗原的这样的免疫球蛋白多肽的保守置换变体。免疫球蛋白一般地描述于例如Harlow&Lane，Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，1988)中。
术语"微生物转谷氨酰胺酶"是指催化酰基转移反应的转移酶的类型。优选的实施方式包括使用微生物转谷氨酰胺酶催化包含谷氨酰胺残基的第一部分(酰基供体)和包含伯氨基的第二部分(酰基受体)之间的酰基转移反应。优选的是反应性谷氨酰胺残基是溶剂暴露的。
本文公开的免疫球蛋白的一种形式构成抗体的基本结构单元。例如，抗体可以包含四聚体并且由两个相同的免疫球蛋白链对组成，每对具有一条轻链和一条重链。通常，在每对中，轻链和重链可变区一起负责与抗原结合，并且恒定区负责抗体效应子功能。
除了抗体之外，免疫球蛋白可以以多种其他形式存在，包括例如：全长免疫球蛋白的抗原结合片段或部分，如Fv、Fab、(Fab')2和Fv片段；和替代性抗体形式，例如，举例来说，单链免疫球蛋白(scFV和scFab)、双抗、三抗、四抗、线性抗体和多特异性抗体。参见例如James D.Marks,Antibody Engineering,Chapter 2,Oxford University Press(1995)(Carl K.Borrebaeck,Ed.)。
在一个实施方式中，免疫球蛋白可以包含Fab片段。在另一个实施方式中，免疫球蛋白可以包含CH3结构域。在另一个实施方式中，免疫球蛋白可以包含重链。
如本文所用，术语“免疫特异性地”是指免疫球蛋白特异性结合针对其产生该免疫球蛋白的抗原并且不特异性结合其他肽或蛋白质的能力。免疫球蛋白(其免疫特异性结合针对其产生该免疫球蛋白的抗原)可以不结合其他多肽或蛋白质，或可以以低于针对其产生该免疫球蛋白的抗原的结合亲和力结合其他多肽或蛋白质，如通过例如免疫测定、BIAcore或本领域已知的其他试验测定的。当如使用实验技术例如但不限于放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的，免疫球蛋白以高于任何交叉反应性抗原的结合亲和力结合针对其产生该免疫球蛋白的抗原时，免疫球蛋白免疫特异性地结合抗原(参见例如Paul,ed.,Fundamental Immunology,2nd ed.,Raven Press,New York,332-336页(1989)，关于抗体特异性的讨论)。
如本文所用，“接头”是指用于将免疫球蛋白(通过酰基供体底物)连接至功能剂或反应性基团的间隔物，其可以是直链或支链。这样的接头可以是可切割的(例如酸不稳定的或蛋白酶可切割的)或不可切割的。在一个实施方式中，接头是聚乙二醇(PEG)部分。在另一个实施方式中，接头包含一个或多个氨基酸和聚乙二醇部分(PEG)。
术语“单克隆抗体”是指来源于单细胞克隆的抗体，包括任何真核或原核细胞克隆，或噬菌体克隆，而不是指其产生方法。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。
“天然”指来自免疫球蛋白所来源的物种的野生型免疫球蛋白序列。
如本文所用，“同一性百分比”和类似术语用于描述两种或更多种核酸、多核苷酸、蛋白质或多肽之间的序列关系，并且在该术语的上下文中且结合该术语理解为包括：(a)参考序列，(b)比较窗口，(c)序列同一性和(d)序列同一性的百分比。
(a)“参考序列”是用作序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是规定序列的子集或全部；例如，全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的示例性长度包括至少约16个氨基酸，至少约20个氨基酸，至少约25个氨基酸，至少约35个氨基酸，至少约50个氨基酸或至少约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的示例性长度包括至少约50个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约75个核苷酸，至少约100个核苷酸或至少约300个核苷酸，或其附近或其间的任何整数。
(b)“比较窗口”包括指多核苷酸或多肽序列的连续和指定区段，其中多核苷酸或多肽序列可以与参考序列进行比较，并且其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含与参考序列(其不包含添加、置换或缺失)相比较的添加、置换或缺失(即空位)而用于两个序列的最佳比对。示例性的比较窗口可以是至少20个连续的核苷酸或氨基酸长度，并且任选地可以是30、40、50、100或更长。本领域技术人员理解，为避免由于在多核苷酸或多肽序列中包含缺口而导致的与参考序列的误导性地高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数中减去。
(c)用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981的局部同源性算法进行；通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970的同源性比对算法进行；通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8:2444,1988的相似性检索方法进行；通过这些算法的计算机化实施进行，包括但不限于：Intelligenetics,Mountain View,Calif.的PC/Gene程序中的CLUSTAL，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),7Science Dr.,Madison,Wis.,USA中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA；CLUSTAL程序由Higgins和Sharp,Gene,73:237-244,1988；Corpet等人,Nucleic AcidsResearch,16:881-90,1988；Huang等人.,Computer Applications in the Biosciences,8:1-6,1992；和Pearson等人,Methods in Molecular Biology,24:7-331,1994充分描述。可用于数据库相似性检索的BLAST程序家族包括：针对核苷酸数据库序列的用于核苷酸查询序列的BLASTN；针对蛋白质数据库序列的用于核苷酸查询序列的BLASTX；针对蛋白质数据库序列的用于蛋白质查询序列的BLASTP；针对核苷酸数据库序列的用于蛋白质查询序列的TBLASTN；和针对核苷酸数据库序列的用于核苷酸查询序列的TBLASTX。参见CurrentProtocols in Molecular Biology,Chapter 19,Ausubel等人,Eds.,Greene Publishingand Wiley-Interscience,New York,1995。上述程序的新版本或新的程序总体将无疑在未来变得可用，并且可以用于本公开。
(d)“同一性百分比”意指通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中比较窗口中多核苷酸或多肽序列的部分可包含与参考序列(其不包含添加、置换或缺失)相比较的添加、置换或缺失(即空位)而用于两个序列的最佳比对。该百分比通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的总位置数量并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比来计算。
“药物有效量”是指治疗受试者的免疫球蛋白的量。
“药学上可接受的载体”是指用于施用于受试者的如本文所述的免疫球蛋白的药物制剂的组分。例如，药学上可接受的载体可以是基于脂质体、基于脂质和/或基于纳米颗粒的。
如本文使用的术语“反应性基团”是指可以与其他化合物如功能剂反应以形成至少一个共价键的化学官能团。在一个实施方式中，反应性基团在点击化学偶联反应中是反应性的。反应性基团的非限制性实例包括(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)，
[Chem.3]
(二苯并环辛炔；DBCO)，反式环辛烯(TCO)，叠氮基(N3)，炔烃，四嗪甲基环丙烯，降冰片烯，酰肼/肼和醛。
如本文所用的术语“受试者”是指人或非人生物体。因此，本文所述的方法、免疫球蛋白和缀合免疫球蛋白均适用于人类和兽医疾病和病症两者。受试者可以是“患者”，即正在接受疾病或病症的医疗护理的活人或非人生物体，或正在被调查特定病症的病理迹象或特定病症的存在/不存在的具有未确定疾病的人或非人生物体。
“置换”是指将一个氨基酸残基替换为另一个氨基酸残基。“置换”包括例如编码氨基酸残基的一个或多个DNA碱基对中的错义突变或工程化蛋白质以交换一个氨基酸与另一个氨基酸。
如本文所用，“治疗”等术语是指降低疾病症状的严重程度和/或频率，消除疾病症状和/或所述症状的基础原因，降低疾病症状和/或其基础原因的频率或可能性，以及改善或补救由疾病直接或间接造成的损害。
术语“治疗剂”意指可以施用于有需要的受试者以治疗病症的大分子或小分子。可以施用治疗剂以治疗或预防发作，减缓发展，或改善患有该病症的受试者的医学病症的一种或多种症状。治疗剂包括但不限于抗体或其抗原结合部分、化学治疗剂、放射性剂、细胞毒性剂、抗生素等。在一个实施方式中，治疗剂是小分子。在另一个实施方式中，治疗剂是多肽。
如本文所用，“与……90％相同”包括与参考项目(例如，生物序列)至少90％相同，91％相同，92％相同，93％相同，94％相同，95％相同，96％相同，97％相同，98％相同，99％相同或100％相同。
在本公开全文中使用以下缩写：抗体药物缀合物(ADC)；药物与抗体比率(DAR)；框架区(FWR)；互补决定区(CDR)；阿里他汀F(auristatin F，AuF)；可变重区(VH)；可变轻区(VL)；可变κ(Vκ)；γ恒定区(Cγ)；κ恒定区(Cκ)；单克隆抗体(mAb)；如使用EU编号系统编号的免疫球蛋白重链的氨基酸位置447处的赖氨酸(Lys447)。
缀合免疫球蛋白的产生
本文公开了用于产生缀合免疫球蛋白的方法，所述方法包括：使免疫球蛋白或其抗原结合部分与微生物转谷氨酰胺酶和包含酰基供体底物的功能剂接触，a)其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含工程化赖氨酸残基，其中工程化赖氨酸残基是赖氨酸残基插入或天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，b)其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基，和c)其中所述功能剂为治疗剂或诊断剂，其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的所述工程化赖氨酸残基缀合至所述功能剂上的所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基，从而产生所述缀合免疫球蛋白。
本文还公开了用于产生缀合免疫球蛋白的方法，所述方法包括：i)使免疫球蛋白或其抗原结合部分与微生物转谷氨酰胺酶和酰基供体底物接触，a)其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含工程化赖氨酸残基，其中工程化赖氨酸残基是赖氨酸残基插入或天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，b)其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基和反应性基团，其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的所述工程化赖氨酸残基缀合至所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基，和ii)将功能剂缀合至所述酰基供体底物的所述反应性基团，其中所述功能剂是治疗剂或诊断剂，从而产生所述缀合免疫球蛋白。
缀合可以通过将包含酰基供体底物的功能剂溶解在溶解溶液中并将溶解的功能剂与免疫球蛋白或其抗原结合部分和微生物转谷氨酰胺酶在缀合缓冲液中接触来进行。缀合也可以通过将酰基供体底物溶解在溶解溶液中并且将酰基供体底物与免疫球蛋白或其抗原结合部分和微生物转谷氨酰胺酶在缀合缓冲液中接触来进行。
对于水不溶性功能剂和酰基供体底物，合适的溶解溶液包括有机的水混溶性溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)。对于水溶性功能剂和酰基供体底物，合适的溶解溶液包括但不限于水或缓冲水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，pH 7.2(1×PBS)或DPBS。
功能剂或酰基供体底物的合适浓度包括约10μM至约800mM，约10mM至约100mM，约25mM至约100mM，约40mM至约100mM，约55mM至约100mM，约70mM至约100mM，约10mM至约90mM，约10mM至约75mM，约10mM至约60mM，约10mM至约50mM，约10mM至约40mM，或约10mM至约30mM。
在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约10μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约25μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约50μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约100μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约250μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约500μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约750μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约1mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约10mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约20mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约30mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约40mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约50mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约60mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约70mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约80mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约90mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约100mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约150mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约200mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约250mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约300mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约350mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约400mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约450mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约500mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约550mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约600mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约650mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约700mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约750mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约800mM。
免疫球蛋白的合适浓度包括约0.1mg/ml至约100mg/ml，约0.5mg/ml至约20mg/ml，约1mg/ml至约20mg/ml，约5mg/ml至约20mg/ml，约10mg/ml至约20mg/ml，约0.1mg/ml至约15mg/ml，约0.1mg/ml至约12mg/ml，约0.1mg/ml至约10mg/ml，约0.1mg/ml至约5mg/ml或约0.1mg/ml至约2mg/ml，约10mg/ml至约30mg/ml，约20mg/ml至约45mg/ml，约35mg/ml至约50mg/ml，约45mg/ml至约60mg/ml，约50mg/ml至约75mg/ml，约60mg/ml至约85mg/ml或约80mg/ml至约100mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约0.1mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约0.5mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约1mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约2mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约5mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约10mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约15mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约20mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约25mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约30mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约35mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约40mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约45mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约50mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约55mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约60mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约65mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约70mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约75mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约80mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约85mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约90mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约95mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约100mg/ml。
功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的合适比率包括约1:1至100:1。在一个实施方式中，功能剂与酰基供体底物:免疫球蛋白的比率为约25:1至约75:1。在另一个实施方式中，功能剂与酰基供体底物:免疫球蛋白的比率为约40:1至约60:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是1:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是2:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是3:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是4:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是5:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是6:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是7:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是8:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是9:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是10:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是11:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是12:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是13:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是14:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是15:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是16:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是17:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是18:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是19:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是20:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是25:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是30:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是35:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是40:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是45:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是50:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是60:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是70:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是80:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是90:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是100:1。
接触可以在许多合适的缀合缓冲液中进行，仅举几例，包括例如DPBS，1×PBS，pH7.2，磷酸钠，磷酸钾，硼酸钠，Tris和HEPES。缀合缓冲液的浓度包括约5mM至约2M，约5mM至约1M，约5mM至约500mM，约5mM至约100mM，约10mM至约100mM，约20mM至约100mM，约30mM至约100mM，约45mM至约100mM，约60mM至约100mM，约75mM至约100mM，约10mM至约90mM，约10mM至约75mM，约10mM至约60mM，约10mM至约45mM或约10mM至约30mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约10mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约20mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约30mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约40mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约50mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约60mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约70mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约80mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约90mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约100mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约250mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约500mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约750mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约1M。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约1.25M。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约1.5M。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约1.75M。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约2M。
缀合缓冲液可以进一步包括氯化钠。氯化钠的合适浓度包括约0mM至约2M，约0mM至约1M，约1M至约2M，约500mM至约1.5M，约25mM至约500mM，约50mM至约500mM，约75mM至约500mM，约100mM至约500mM，约150mM至约500mM，约200mM至约500mM，约250mM约500mM，约300mM至约500mM，约350mM至约500mM，约400mM至约500mM，约0mM至约400mM，约0mM至约350mM，约0mM至约300mM，约0mM至约250mM，约0mM至约200mM，约0mM至约150mM，约0mM至约100mM，约0mM至约50mM，或约0mM至约25mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约25mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约50mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约75mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约100mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约150mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约200mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约250mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约300mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约350mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约400mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约500mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约750mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约1M。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约1.25M。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约1.5M。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约1.75M。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约2M。
缀合缓冲液的pH可以为约4至约9。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以为约5至约8。在另一个实施方式中，缀合缓冲液的pH可以为约6至约7。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约4。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约4.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约5.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.0。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.6。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.7。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.8。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.9。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.0。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.1。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.2。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.3。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.4。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以为约7.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.6。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.7。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.8。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.9。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.0。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.1。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.2。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.3。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.4。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约9。
为促进功能剂或酰基供体底物在缀合缓冲液中的溶解性，缀合缓冲液中有机的水混溶性溶剂的最终浓度可为约0％至约20％，约2％至约20％，约5％至约20％，约8％至约20％，约11％至约20％，约16％至约20％，约0％至约18％，约0％至约15％，约0％至约12％，约0％至约10％，约0％至约8％，约0％至约6％，或约0％至约2％。
缀合缓冲液可以进一步包含丙二醇以促进巯基反应性化合物在缀合缓冲液中的溶解性。丙二醇的合适浓度包括约1％至约50％，约20％至约50％，约30％至约50％，约40％至约50％，约10％至约40％，约10％至约30％或约10％至约20％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以为约1％或约5％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约10％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约20％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约30％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约40％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约50％。
缀合缓冲液可以进一步包含非离子型去垢剂以促进缀合免疫球蛋白在缀合缓冲液中的溶解性。示例性的非离子型去垢剂包括但不限于聚山梨酯-20或聚山梨酯-80。非离子型去垢剂的合适浓度包括约0％至约1％，约0.1％至约1％，约0.3％至约1％，约0.5％至约1％，约0.7％至约1％，约0％至约0.8％，约0％至约0.6％，约0％至约0.4％或约0％至约0.2％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以是约0.1％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以是约0.2％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以是约0.3％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以是约0.4％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以是约0.5％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以是约0.6％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以为约0.7％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以是约0.8％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以是约0.9％。在一些实施方式中，非离子型去垢剂的浓度可以是约1.0％。
接触可以进行约30分钟至约48小时，约1小时至约48小时，约2小时至约24小时，约24小时至约48小时，约30小时至约48小时，约36小时至约48小时，约42小时至约48小时，约2小时至约42小时，约2小时至约36小时，约2小时至约30小时，约2小时至约24小时，约2小时至约18小时，约2小时至约12小时，约30分钟至约1小时，约30分钟至约2小时或约2小时至约6小时。在一些实施方式中，接触可以进行约30分钟。在一些实施方式中，接触可以进行约1小时。在一些实施方式中，接触可以进行约1.5小时。在一些实施方式中，接触可以进行2小时。在一些实施方式中，接触可以进行6小时。在一些实施方式中，接触可以进行12小时。在一些实施方式中，接触可以进行18小时。在一些实施方式中，接触可以进行24小时。在一些实施方式中，接触可以进行30小时。在一些实施方式中，接触可以进行36小时。在一些实施方式中，接触可以进行42小时。在一些实施方式中，接触可以进行48小时。
接触的温度可以为约4℃至约50℃，约18℃至约37℃，约20℃至约37℃，约22℃至约37℃，约24℃至约37℃，约26℃至约37℃，约28℃至约37℃，约30℃至约37℃，约32℃至约37℃，约34℃至约37℃，约18℃至约34℃，约18℃至约32℃，约18℃至约30℃约18℃至约28℃，约18℃至约26℃或约18℃至约24℃。在一些实施方式中，接触可以在4℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在18℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在20℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在22℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在24℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在26℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在28℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在30℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在32℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在34℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在37℃下进行。在一些实施方式中，接触可以在50℃下进行。
未引入的功能剂或酰基供体底物可以通过使用许多合适的树脂(包括但不限于G-25树脂，G-50树脂，Biogel P10或其他树脂)通过脱盐色谱法与缀合免疫球蛋白分离，具有范围为5,000-10,000Da的排阻限度。取决于规模，色谱可以以柱形式或旋转柱形式进行。用于脱盐的合适缓冲液包括例如DPBS，1×PBS，磷酸钠，磷酸钾，硼酸钠，Tris，或者HEPES基缓冲液可以代替1×PBS。
在第一实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂包含通过酰基供体底物与工程化赖氨酸残基缀合的谷氨酰胺残基。在该第一实施方式中，通过使酰基供体底物上的反应性基团与功能剂反应，在与免疫球蛋白缀合之前，将功能剂与酰基供体底物组合。在第二实施方式中，首先将包含谷氨酰胺残基和反应性基团的酰基供体底物缀合至免疫球蛋白，然后将反应性基团连接至功能剂。
酰基供体底物可以包含接头“L”。接头可以是不可切割的接头或可切割的接头。示例性的接头包括，例如，含二硫键的接头、基于缩醛的接头和基于缩酮的接头。在一些方面，接头可以是不可切割的接头。合适的不可切割接头包括但不限于一个或多个氨基酸、聚乙二醇(PEG)或烷基。在一些实施方式中，接头可以包含PEG。在一些方面，接头可以是可切割的接头。合适的可切割接头包括例如缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基。在一些方面，接头可以是含二硫键的接头。在一些方面，接头可以是基于缩醛的接头。在一些方面，接头可以是基于缩酮的接头。接头还可以是单独或与另外的接头例如一个或多个PEG基团组合的一个或多个氨基酸。
包含谷氨酰胺残基的酰基供体底物可以存在于功能剂中、是功能剂的部分或附着于功能剂。合适的功能剂包括例如荧光团、荧光染料、多肽、免疫球蛋白、抗生素、核酸、放射性核素、化学接头、小分子、螯合剂、脂质、核酸(如DNA或RNA)和药物。在一些方面，功能剂可以包含荧光团。在一些方面，功能剂可以包含荧光染料。在一些方面，功能剂可以包含多肽。在一些方面，功能剂可以包含免疫球蛋白。在一些方面，功能剂可以包含抗生素。在一些方面，功能剂可以包含核酸(例如DNA或RNA)。在一些方面，功能剂可以包含放射性核素。在一些方面，功能剂可以包含小分子。在一些方面，功能剂可以包含螯合剂(例如，DOTA，CHX-A”-DTPA，NOTA等)。在一些方面，功能剂可以包含脂质。在一些方面，功能剂可以包含药物。在一些方面，功能剂可以包含任何上文列出的功能剂的组合。
酰基供体底物(即，第一酰基供体底物)可以与第二酰基供体底物或接头结合，第二酰基供体底物或接头与具有第二重链可变区和第二轻链可变区的第二免疫球蛋白结合，第二重链可变区具有工程化赖氨酸残基。例如，第一酰基供体底物和第二酰基供体底物可分别具有第一和第二化学接头作为第一和第二功能剂。第一和第二化学接头可以通过多种合适的方式彼此结合，包括例如通过点击化学。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)或(II)之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；和Y是功能剂。
在另一实施方式中，酰基供体底物具有式(III)或(IV)之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
其中
Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；和X是反应性基团。
在一个实施方式中，Z是CBZ基团。在另一实施方式中，Z是氨基酸残基。
在一个实施方式中，L是氨基酸残基。在一个实施方式中，n是2-5，并且每个L独立地是氨基酸残基。在另一个实施方式中，L是具有1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳和氮原子可以任选地被取代。在另一个实施方式中，L是聚乙二醇(PEG)部分。在另一个实施方式中，n是2-5，并且一个或多个L包含一个或多个氨基酸，并且一个或多个另外的L基团包含聚乙二醇部分(PEG)。
在一个实施方式中，m为0。在另一个实施方式中，m为1。在另一个实施方式中，m为2。在另一个实施方式中，m为3。在另一个实施方式中，m为4。在另一个实施方式中，m为5。
在一个实施方式中，n为0。在另一个实施方式中，n为1。在另一个实施方式中，n为2。在另一个实施方式中，n为3。在另一个实施方式中，n为4。在另一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，X是(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)。在另一个实施方式中，X是
[Chem.4]
(二苯并环辛炔；DBCO)。在另一个实施方式中，X是反式环辛烯(TCO)。在另一个实施方式中，X是叠氮基(N3)。在另一个实施方式中，X是炔烃。在另一个实施方式中，X是四嗪甲基环丙烯。在另一个实施方式中，X是降冰片烯。在另一个实施方式中，X是酰肼/肼。在另一个实施方式中，X是醛。
在一个实施方式中，对于根据式(I)的酰基供体底物，Z是CBZ基团；L是聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且n是0、1、2或3。
在另一个实施方式中，酰基供体底物具有式(I)，其中Z是CBZ基团，并且L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly。在该实施方式的一个方面中，m是1，并且n是1。
在一个实施方式中，酰基供体底物具有式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。
在另一实施方式中，功能剂Y是阿里他汀F。
在一个实施方式中，对于根据式(III)的酰基供体底物，Z是CBZ基团；L是聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且n是0、1、2或3。
在另一个实施方式中，酰基供体底物具有式(III)，其中Z是CBZ基团，并且L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly。在该实施方式的一个方面中，m是1，并且n是1。
在一个实施方式中，酰基供体底物具有式(IV)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。在另一实施方式中，功能剂Y是阿里他汀F。
所公开的方法可以对人源化免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。因此，在一些实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分可以是人源化免疫球蛋白或其抗原结合部分。
所公开的方法可以对人免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。因此，在一些实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分可以是人免疫球蛋白或其抗原结合部分。在另一个实施方式中，免疫球蛋白或其抗原结合部分可以是非人免疫球蛋白或其抗原结合部分。
在一个实施方式中，所公开的方法可以对IgG1，IgG2，IgG3或IgG4免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，该方法对IgG1免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，该方法对IgG2免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，该方法对IgG3免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，该方法对IgG4免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。
在一个实施方式中，所公开的方法可以对IgA1、IgA2或IgM免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，该方法对IgA1免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，该方法对IgA2免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，该方法对IgM免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，IgA或IgM免疫球蛋白或其抗原结合部分具有尾部附加物(tail piece)。在另一个实施方式中，IgA或IgM免疫球蛋白或其抗原结合部分除去尾部附加物。
在一个实施方式中，该方法对IgD或IgE免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，该方法对IgD免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。在一个实施方式中，该方法对IgE免疫球蛋白或其抗原结合部分进行。
对于本文所述的方法，在一个实施方式中，微生物转谷氨酰胺酶来自马杜拉放线菌种T-2、环状芽孢杆菌BL32、枯草芽孢杆菌孢子、产氨棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、肠杆菌种C2361、普罗维登斯菌种C1112、茂原链轮丝菌(也称为茂源链霉菌)、平板链霉菌M5218、吸水链霉菌、变铅青链霉菌、变铅青链霉菌JT46/pAE053、利迪链霉菌、平板链霉菌、Streptomyces sioyansis、灰肉色链轮丝菌(Streptoverticillium griseocarneum)、拉达卡链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum)NRRL-3191、轮枝链霉菌种s-8112或猪链球菌。在一个实施方式中，微生物转谷氨酰胺酶来自茂源链霉菌。
对于本文所述的方法，在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶从选自紫花苜蓿、甜菜、向日葵、玉米、大豆、拟南芥、烟草、莱茵衣藻、杜氏盐藻、水稻和迷迭香的植物分离。
对于本文所述的方法，在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶是哺乳动物的，并且从转谷氨酰胺酶1至7和因子XIII分离。
在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶与本文描述的微生物转谷氨酰胺酶至少75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶与来自茂源链霉菌的微生物转谷氨酰胺酶至少75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。转谷氨酰胺酶可以从
或Zedira(产品号T001)购买。在另一个实施方式中，转谷氨酰胺酶被纯化。在另一个实施方式中，转谷氨酰胺酶被重组表达并随后使用本领域普通技术人员已知的方法纯化。
在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约0.1单位/mL至约250单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约1单位/mL至约25单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约1单位/mL至约25单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约0.1单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约0.5单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约1单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约5单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约10单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约15单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约20单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约25单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约50单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约75单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约100单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约150单位/mL，200单位/mL或250单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。
对于本文提供的方法，在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约200:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约100:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约25:1.在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约20:1.在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约15:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约10:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约9:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约8:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约7:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约6:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约5:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约4:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约3:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约2:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约10:1至约100:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约50:1至约200:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约50:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约100:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约150:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约50:1至约100:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约100:1至约200:1。
在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约20:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率是已知的并且通过遵循本文公开的方法可一致地再现。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约1:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约2:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约3:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约4:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约5:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约6:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约7:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约8:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约9:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约10:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约11:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约12:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约13:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约14:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约15:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约16:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约17:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约18:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约19:1。在一些实施方式中，功能剂:免疫球蛋白的比率为约20:1。如本文所用，功能剂与免疫球蛋白的比率是基于组合物中功能剂与抗体池中免疫球蛋白的缀合比率的平均值计算。
在本发明的实施方式中，酰基受体位点在免疫球蛋白或其抗原结合部分中通过两个天然氨基酸残基之间赖氨酸的插入或通过天然氨基酸被赖氨酸置换来工程化。工程化赖氨酸残基可以位于整个免疫球蛋白序列的一个或多个位置处。酰基受体位点的最佳情况不仅是位置依赖性的，而且需要的是与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的氨基酸残基不是酸性氨基酸残基；且与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的氨基酸残基不是酸性氨基酸残基或脯氨酸残基。MTGase缀合技术可以利用这些工程化位点以缀合多种含酰基供体的功能剂用于制备抗体药物缀合物(ADCs)、双特异性抗体、免疫毒素或其它mAb-蛋白复合物。在另一实施方式中，组合多个工程化酰基受体位点，理论药物-抗体比率(DAR)对于各工程化酰基受体位点提高。提高ADC的DAR导致每单克隆抗体更多功能剂递送到受试者中，其允许限定的DARs、更好的产物均质性和较低的患者用药。
在本文提供的其中存在至少两个另外的工程化赖氨酸残基的实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率基于另外的工程化赖氨酸残基的数量增加。例如，其中存在两个工程化赖氨酸残基，导致具有四个转酰胺基位点的抗体，并且功能剂与免疫球蛋白的比率为约2:1至约4:1。作为另一个实例，其中存在三个工程化赖氨酸残基，导致具有六个转酰胺基位点的抗体，并且功能剂与免疫球蛋白的比率为约2:1至约6:1。
缀合免疫球蛋白
本文还公开了包含本文公开的任何免疫球蛋白或其抗原结合部分的缀合免疫球蛋白，其中工程化赖氨酸残基是赖氨酸残基插入或天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，并且与包含酰基供体底物的功能剂缀合，其中酰基供体底物包含谷氨酰胺残基。另外的实施方式包括包含本文公开的任何免疫球蛋白或其抗原结合部分的缀合免疫球蛋白，其中工程化赖氨酸残基是赖氨酸残基插入或天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，并与酰基供体底物缀合，其中酰基供体底物包含谷氨酰胺残基和反应性基团，其中反应性基团可在酰基供体底物与免疫球蛋白或其抗原结合部分缀合后与功能剂反应。
在一个实施方式中，工程化赖氨酸侧翼的氨基酸残基也被工程化，例如，突变，以优化免疫球蛋白上的工程化酰基受体赖氨酸位点的序列。例如，与工程化赖氨酸残基相邻且紧接在工程化赖氨酸残基之后的氨基酸残基(例如，氨基酸位置+1)可以突变成脯氨酸或酸性氨基酸残基之外的任何氨基酸残基。与工程化赖氨酸残基相邻且紧接在工程化赖氨酸残基之前的氨基酸残基(例如，氨基酸位置-1)可以突变成酸性氨基酸残基之外的任何氨基酸残基。
在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的氨基酸残基(例如，氨基酸位置+1)可以突变成赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是甘氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是赖氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是丙氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是缬氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是亮氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是异亮氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是甲硫氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是苯丙氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是酪氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是色氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是丝氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是苏氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是半胱氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是天冬酰胺。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是谷氨酰胺。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是组氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)是精氨酸。在一个实施方式中，其中与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之后的突变氨基酸残基(氨基酸位置+1)不是脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的氨基酸残基(例如，氨基酸位置-1)可以突变成赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是甘氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是赖氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是丙氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是缬氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是亮氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是异亮氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是甲硫氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是苯丙氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是酪氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是色氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是丝氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是苏氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是半胱氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是天冬酰胺。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是谷氨酰胺。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是组氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是脯氨酸。在一个实施方式中，与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的突变氨基酸残基(氨基酸位置-1)是精氨酸。在一个实施方式中，其中与工程化赖氨酸相邻且紧接在工程化赖氨酸之前的氨基酸残基(氨基酸位置+1)不是天冬氨酸或谷氨酸。
在一些实施方式中，免疫球蛋白可以是人源化的。在其他实施方式中，免疫球蛋白是人的。在另一个实施方式中，免疫球蛋白是嵌合的。
包含谷氨酰胺残基和反应性基团的酰基供体底物还可以包含接头“L”。同样，含有包含谷氨酰胺残基的酰基供体底物的功能剂可以在功能剂和该分子的酰基供体底物部分之间具有接头。接头可以是不可切割的接头或可切割的接头。示例性的接头包括，例如，含二硫键的接头、基于缩醛的接头和基于缩酮的接头。在一些方面，接头可以是不可切割的接头。合适的不可切割接头包括但不限于聚乙二醇(PEG)或烷基。在一些实施方式中，接头可以包含PEG。在一些方面，接头可以是可切割的接头。合适的可切割接头包括例如缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基。在一些方面，接头可以是含二硫键的接头。在一些方面，接头可以是基于缩醛的接头。在一些方面，接头可以是基于缩酮的接头。
本发明的缀合免疫球蛋白包含功能剂。合适的功能剂包括例如治疗剂或诊断剂。合适的功能剂包括例如荧光团、荧光染料、多肽、免疫球蛋白、抗生素、核酸、放射性核素、化学连接剂、小分子、螯合剂、脂质和药物。在一些方面，功能剂可以包含荧光团。在一些方面，功能剂可以包含荧光染料。在一些方面，功能剂可以包含多肽。在一些方面，功能剂可以包含免疫球蛋白。在一些方面，功能剂可以包含抗生素。在一些方面，功能剂可以包含核酸(例如DNA或RNA)。在一些方面，功能剂可以包含放射性核素。在一些方面，功能剂可以包含小分子。在一些方面，功能剂可包含螯合剂(例如，DOTA，CHX-A”-DTPA，NOTA等)。在一些方面，功能剂可以包含脂质。在一些方面，功能剂可以包含药物。在一些方面，功能剂可以包含任何上述所列功能剂的组合。
因此，所公开的缀合免疫球蛋白包括但不限于免疫球蛋白-荧光团缀合物、免疫球蛋白-荧光染料缀合物、免疫球蛋白-多肽缀合物、免疫球蛋白-免疫球蛋白缀合物、免疫球蛋白-抗生素缀合物、免疫球蛋白-核酸缀合物、免疫球蛋白-放射性核素缀合物、免疫球蛋白-化学接头缀合物、免疫球蛋白-小分子缀合物、免疫球蛋白-螯合剂缀合物、免疫球蛋白-脂质缀合物和免疫球蛋白-药物缀合物。
本文公开的任何免疫球蛋白可以与本文公开的任何功能剂缀合。例如，缀合免疫球蛋白可包含荧光团、荧光染料、多肽、免疫球蛋白、抗生素、核酸、放射性核素、化学接头、小分子、螯合剂、脂质或药物。
在一些实施方式中，免疫球蛋白可以缀合至小分子抗肿瘤剂，例如阿里他汀。在一些方面，功能剂可以是阿里他汀F(AuF)。因此，所公开的缀合免疫球蛋白包括与阿里他汀F缀合的任何上述公开的缀合免疫球蛋白(AuF-T135K缀合物)。
药物组合物
本文还提供了药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物可以包含本文公开的任何免疫球蛋白。在一些实施方式中，药物组合物可以包含本文公开的任何缀合免疫球蛋白。在一个实施方式中，药物组合物包含缀合免疫球蛋白和药学上可接受的载体。
编码可缀合免疫球蛋白的核酸分子和包含该核酸分子的宿主细胞
本文还提供了编码本文公开的任何可缀合免疫球蛋白或其抗原结合部分的核酸分子。作为实例，在一个实施方式中，核酸分子编码包含重链可变区和轻链可变区的可缀合免疫球蛋白，且其中编码的可缀合免疫球蛋白包含工程化赖氨酸残基，且其中工程化赖氨酸残基是赖氨酸残基插入或天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基。免疫球蛋白或其抗原结合部分的工程化赖氨酸残基与酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合，从而产生缀合的免疫球蛋白。
还公开了包含编码可缀合免疫球蛋白或其抗原结合部分的任何公开的核酸分子或质粒的宿主细胞。合适的宿主细胞包括但不限于，举例来说，哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞。
提供以下实施例以进一步描述本文公开的一些实施方式。这些实施例旨在说明而不是限制所公开的实施方式。
实施例
实施例1
材料和方法
定点诱变
根据制造商的方案使用Stratagene的QuikChange XL产生突变。所需的突变通过DNA测序来确认。
删除诱变
用于Fab表达的HC片段通过PCR扩增HC前导序列至铰链(其终止于各种3'密码子)来制备。PCR片段使用In-Fusion HD克隆试剂盒按照制造商的方案(CLONTECH)克隆到pcDNA3.1-基哺乳动物表达质粒中。
转染和稳定细胞系的产生
对于每毫升要用ExpiFectamine转染的细胞，将333.3ng HC质粒和333.3ng LC质粒在50μL Opti-MEM(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)中接触5-10分钟。同样地，将2.67μL ExpiFectamine在50μL Opti-MEM中接触。将ExpiFectamine溶液加入到DNA混合物中，并在室温下孵育20-30分钟。将DNA:ExpiFectamine混合物加入到细胞中，同时旋转并在37℃，8％CO2下以125rpm振荡孵育。第二天，将每毫升细胞5μL增强子1和50μL增强子2加入到转染中，继续孵育另外7-10天。
转染后1至3天，在含有5μg/mL杀稻瘟菌素和400μg/mL博莱霉素(Invivogen,SanDiego,CA)的T75烧瓶中，通过将1mL转染体加入到14mL DMEM中来选择表达抗体的稳定池。耐药细胞生长至汇合后，培养基用FreeStyle 293表达培养基替换24至48小时。通过轻敲烧瓶(胰蛋白酶化导致低活力，数据未显示)使细胞物理移位，然后以6×105个细胞/mL接种在125mL摇瓶中的30mL FreeStyle 293表达培养基中。将培养物在37℃，8％CO2下以125rpm振荡进行孵育。
mAb和Fab产生
在FreeStyle 293表达培养基中以0.6至1×106个细胞/mL接种稳定转染的细胞系池。细胞在37℃，8％CO2下孵育，以125rpm振荡。培养物达到1×106个细胞/mL的密度两天后，将终浓度为10g/L Select Soytone(BD Biosciences,San Jose,CA)，5mM戊酸(SigmaAldrich,St.Louis,MO)和1:100CD脂质浓缩物(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)进料至培养物。当细胞活力小于50％时(7-10天)，将培养物在Beckman JLA8.1000转子中以8000rpm离心1小时。然后将上清液通过0.2μm PES过滤器过滤并在4℃或-20℃下储存直至纯化。
mAb和Fab纯化
使用两种方法之一纯化mAb。对于小于10mL的mAb和Fab上清液，分别使用蛋白A树脂或抗-κ树脂的批纯化方法进行亲和色谱。分别使用预填充蛋白A或抗-κ柱纯化大于25mL的mAb和Fab上清液。
批纯化
将Prosep-vA高容量蛋白A树脂(Millipore,Billerica,MA)用DPBS平衡，并将100μL加入3至6mL的样品中。在4℃下孵育1小时至过夜后，用1mL DPBS洗涤树脂三次并以18,000×g离心30秒。通过加入400μL 0.1M甘氨酸，pH 2.9，然后以18,000×g离心30秒，从树脂洗脱样品。样品用40μL 1M Tris，pH 8.0中和。使用0.5mL Amicon Ultra，10k截止滤器(Millipore,Billerica,MA)，通过以18,000×g离心3-5分钟将样品浓缩至约100μL，进行缓冲液交换。浓缩的样品用400μL DPBS稀释，然后离心。该过程总共重复四次。
柱纯化
蛋白A或HiTrap KappaSelect柱(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)用10柱体积(CV)的20mM磷酸钠，10mM EDTA，pH 7.2平衡。然后装载样品，随后用10CV平衡缓冲液洗涤未结合的材料。使用5CV的0.1M甘氨酸，pH 2.9洗脱样品。合并含有mAb的级分，并使用MWCO20K Slide-A-Lyzer(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)在DPBS中透析。
Z-Gln-Gly底物合成
Z-Gln-Gly购自Bachem，和Z-Gln-Gly-CAD-生物素购自ZEDIRA(图2)。
Z-Gln-Gly-五氟苯基酯(Z-Gln-Gly-PFP)
合成如Pasternack(Pasternack等，1997)所述，具有改进(图3)。Z-Gln-Gly(328.8mg，0.975mmol)和五氟苯酚(Sigma，183.3mg，0.996mmol)溶解在10mL N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)中。然后加入EDAC-HCl(Sigma，201mg，1.04mmol)并将反应在室温下在N2下孵育2小时。向反应中加入100mL冷乙醚并在-80℃下沉淀过夜。通过离心收集粗产物，并从20mL 60℃甲醇中重结晶。最终产物用冷乙醚冲洗并在N2流上干燥。最终产率为219.04mg(44.7％)。电喷雾电离-质谱(ESI-MS)(在0.1％甲酸的50％乙腈中直接输注)m/z504.0([M+H]，86％)，526.0([M+Na]，100％)，542.0([M+K]，22％)。
Z-Gln-Gly-丙基叠氮化物(Z-Gln-Gly-N3)
将Z-Gln-Gly-PFP(21.24mg，4.22×10-5mol)和叠氮基丙胺(Click ChemistryTools，42.2μL的DMF中0.91M储备溶液，3.84×10-5mol)溶于0.42mL终体积的DMF中。在N2下，将反应在室温下搅拌过夜。使用在H2O中的0.1％甲酸/乙腈中的0.1％甲酸流动相中，通过HPLC纯化产物。将产物真空干燥。最终产率为10.7mg(60.4％)。ESI-MS(梯度纯化)m/z420.2([M+H],100％),442.1([M+Na],32％)。
Z-Gln-Gly-PEG2-双环壬炔(Z-Gln-Gly-PEG2-BCN)
Z-Gln-Gly-PFP(18.4mg，3.66×10-5mol)和N-[(1R,8S,9s)-双环[6,1,0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷(Sigma Aldrich)溶于0.37mL最终体积的DMF中。在N2下，将反应在室温下搅拌过夜。产物使用在H2O中的0.1％甲酸/乙腈中的0.1％甲酸流动相通过HPLC纯化。将产物真空干燥。最终产率为0.6mg(2％)。ESI-MS(梯度纯化)m/z688.2([M+H],100％),710.2([M+Na],69％)。
Z-Gln-Gly-PEG2-阿里他汀F(Z-Gln-Gly-PEG2-AuF)
将Z-Gln-Gly-PFP(22.2mg，4.37×10-5mol)溶于0.85mL DMF中，并加入1,2-乙二胺(2.3×10-5L，3.5×10-4mol)和混合。在N2下，将反应在室温下搅拌过夜。使用H2O中的0.1％甲酸/乙腈中的0.1％甲酸流动相，通过HPLC纯化产物。将产物真空干燥。Z-Gln-Gly-NH2的最终产率为3.8mg(23％)。ESI-MS(梯度纯化)m/z 380.1([M+H]，100％)。将Z-Gln-Gly-NH2(3.8mg，1.01×10-5mol)和NHS-PEG2-AuF(10.3mg，1.03×10-5mol)溶于0.2mL DMF中。加入三乙胺(14μL，1×10-4mol)并将反应在N2下在室温下孵育过夜。使用H2O中的0.1％甲酸/乙腈中的0.1％甲酸流动相，通过HPLC纯化一半的反应物。将产物真空干燥。CBZ-Gln-Gly-PEG2-AuF的最终产率为3.8mg(60％)。ESI-MS(梯度纯化)m/z 634.0([M+H]2+，100％)，645.1([M+Na]2+，45％)。1267.0([M+H]，16％)。
微生物转谷氨酰胺酶反应
100μg/mL至2.5mg/mL浓度范围的mAb与785μM的Z-Gln-Gly-生物素(Zedira,Darmstadt,Germany)、Z-Gln-Gly-N3、Z-Gln-Gly-PEG2-BCN或Z-Gln-Gly-PEG2-AuF及1U/mL微生物转谷氨酰胺酶(Zedira,Darmstadt,Germany)在DPBS中在37℃下接触至少16小时。
高通量mTGase分析
浓度范围500ng/mL-10μg/mL的mAb与60μM Z-Gln-Gly-生物素和0.1U/mL mTGase(Zedira)在DPBS中37℃下孵育至少16h。在4℃下96-孔板用1μg/mL山羊-抗人IgG FcγmAb(Jackson ImmunoResesearch)涂覆过夜。在洗涤平板后，过夜mTGase反应在50μL DPBS中1:10稀释，添加到平板并在22℃下孵育1h。平板然后洗涤，且0.1μg/mL的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)(Jackson ImmunoResesearch)添加到孔中。平板再次洗涤，且链霉亲和素-HRP-结合的生物素化样品根据制造商的方案使用QuantaBlue底物(Thermo)以相对荧光单位(RFUs)量化。
mAb缀合的超高效液相色谱(UPLC)/ESI-MS分析
将纯化的抗体在DPBS中稀释至1mg/mL(如果低于1.0mg/mL，则使样品保持在原始浓度)。使用Zeba旋转脱盐柱将含有二甲基亚砜(DMSO)的反应脱盐。然后使用PNGase F(NEB)使mAb去糖基化或通过IdeS(Promega)消化成Fab'2和Fc片段。为了使mAb去糖基化，将G7缓冲液(5或10μL)和PNGase F(1或2μL)加入到mAb(50或100μL)中。将反应在Discover微波(CEM)中孵育2个周期：1)微波功率10W，37℃，10分钟，然后等待3-5分钟；2)微波功率2W，37℃，10分钟。通过加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为20mM，然后在60℃孵育3分钟，使一部分去糖基化样品还原。为了产生Fab'2和Fc片段，将50U/μL的IdeS加入到0.5mg/mL的mAb中并在37℃孵育0.5-1小时。IdeS样品被还原或没有还原。
然后使用Waters Acquity UPLC和Q-Tof Premier质谱仪分析样品。将样品(各0.5-2μg)注射到65℃的MassPrep微量脱盐柱上，以0.05mL/min在95％流动相A中平衡5分钟，10分钟梯度(5-90％B)，和在95％流动相A中再平衡10分钟从柱洗脱。流动相A为在水中的0.1％甲酸。流动相B是乙腈中的0.1％甲酸。Q-Tof质谱仪运行在正离子，V模式下，检测是在500-4000m/z范围中。源参数如下：毛细管电压，2.25kV(完整抗体)-2.50kV(还原抗体)；取样锥电压，65.0V(完整抗体)或50.0V(还原抗体)；源温度，100℃；去溶剂化温度，250℃；去溶剂化气流，550升/小时。使用MassLynx MaxEnt1函数将蛋白质峰解卷积。
反相液相色谱(LC)-MS
样品使用反相液相色谱进行分析。包含1-2mg/mL浓度的100μL ADC的样品在60℃下用20mM DTT还原3分钟。样品使用具有SQD和PDA检测器的Waters Alliance HPLC分析。将各样品在65℃下注射到Proteomix RP-1000柱(5μ,4.6X50mM，Sepax)上。对于LC和HC突变体，LC和HC的分离在1mL/min流速下，采用75％流动相A(在水中的0.1％TFA)中3.0分钟平衡，和27分钟的梯度(25-55％流动相B(在水中的0.1％TFA))发生。
SQD质谱仪以正离子，V模式运行，在200-2000m/z范围中检测。源参数如下：毛细管电压，3.20kV；采样锥电压，40℃；源温度，150℃；去溶剂化温度，250℃；去溶剂化气流，700L/hr。扫描时间，1秒。蛋白质峰通过MassLynx MaxEnt 1函数解卷积。PDA检测器在280nm。
DAR基于未缀合和缀合的LC及未缀合和缀合的HC的相对信号强度计算。总DAR使用以下公式计算：总DAR＝(DAR LC+DAR HC)x 2。
实施例2
IgG抗体上溶剂暴露的赖氨酸的分析
为了进一步研究IgG抗体上溶剂暴露赖氨酸的可用性，检测了IgG1-κFab(4F3F)、IgG1-λFab(4HK0)和IgG1Fc(1FC1)的晶体结构的潜在酰基受体位点。由于mTGase倾向有利于溶剂暴露的底物谷氨酰胺和环内的赖氨酸(Spolaore等，2012)，使用具有1.4埃探针半径的Discovery Studio v4.5突出显示溶剂暴露的赖氨酸(图4)。在抗体01VH中有7个溶剂暴露的赖氨酸，3个在转角或环中。由于利用不同的种系可变区家族和体细胞超变导致赖氨酸的数量可以在mAb之间变化，还基于4F3F结构中残基的类似位置分析了5种其他抗体的VH区中赖氨酸的溶剂暴露。这些VH区潜在地包含1-5个溶剂暴露的赖氨酸，1或2个存在于转角或环中。在抗体01Vκ中有6个溶剂暴露的赖氨酸，4个在环或转角中。来自四种其他抗体的VK区可能含有3-5个溶剂暴露的赖氨酸，2个在环或转角中。抗体05利用λ链，并且基于轻链的序列相似性使用4HK0的晶体结构确定赖氨酸的溶剂暴露。抗体05在Vλ结构域中可能具有2个溶剂暴露的赖氨酸，只有1个在环中。IgG1恒定结构域具有23个溶剂暴露的赖氨酸，13个在环或转角中(图6)。κ恒定区具有8个赖氨酸，5个在转角或环中。λ具有6个溶剂暴露的赖氨酸，半数在环或转角中。总体而言，所分析的抗体的范围为每mAb 42至50个环或转角中的溶剂暴露的赖氨酸。
为了确定微生物转谷氨酰胺酶是否可以使IgG抗体上的天然赖氨酸残基转酰胺，将抗体与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和mTGase在37℃下孵育过夜。用IdeS消化样品并用DTT还原，并通过质谱法分析LC、Fd和Fc片段的质量。对于每个Fc观察到对应于G0F(+1445Da)和G1F(+1608Da)糖型的两个质量峰。抗体04在VH中也含有N-连接的糖基化位点，且观察到两种聚糖种类，G2FS和G2FS2聚糖。所有样品缺乏C-末端赖氨酸(128Da)，如通过Fc的观察质量与理论质量之间-130至-132Da的差异所证明的。虽然不同抗体中有42-50个潜在的酰基受体赖氨酸，但出人意料地HC和LC都不被酰基供体底物修饰(图7，表1)。
[表1]
表1-与酰基供体和微生物转谷氨酰胺酶接触的抗体的ESI-MS分析
ZQG-CAD-生物素：+631Da
表1：LC、Fd和Fc的质量通过ESI-MS测定。各片段的理论质量通过氨基酸序列确定，从观察的质量减去以确定质量的变化(Δ质量)。-128Da的Δ质量是由于Lys447的切割。Fc用一个或两个寡糖糖基化。G0F或G1F。
实施例3
天然氨基酸残基至赖氨酸的突变以形成酰基受体位点
由于在IgG1mAbs中没有酰基受体位点，在抗体01上进行赖氨酸扫描诱变以鉴定可以工程化以引入酰基受体位点的区域。为了增加鉴定新的酰基受体位点的机会，诱变限于人IgG1HC及κ和λLC的恒定区的环或转角内的溶剂暴露残基(图6)。突变体mAb最初通过将突变体与mTGase和Z-Gln-Gly-CAD-生物素在37℃下孵育过夜使用ELISA-基分析筛选转酰胺作用。mAb捕获在抗-Fcγ涂覆的平板上且生物素化的mAb通过HRP-偶联的链霉亲和素检测。野生型抗体01和抗体01-L(其在Lys447处转酰胺)分别包括作为阴性和阳性对照。阳性对照抗体01-L的信号大于12,000RFU且突变体mAb的信号范围为～1100RFU至～11,000RFU(图7)。
所有CH1和上铰链突变体至Z-Gln-Gly的转酰胺作用通过ESI-MS分析以确定缀合的百分比是否与ELISA分析中观察到的RFU信号相关。样品与mTGase和Z-Gln-Gly在37℃下孵育过夜，且其质量通过ESI-MS分析。来自ELISA的RFU信号大多与ESI-MS数据相关，其中大于7000的RFU对应于突变体S136K、D221K、T223K和H224K的>70％缀合(图7)。T135K和T225K的RFU信号低于7000，但那些突变体分别是80.4％和100％缀合的。相反，突变体G137K具有8616的RFU，但仅38.9％缀合。因此，尽管>7000的RFU信号对应于高的转酰胺百分比，但存在一些假阳性和假阴性。与进行其余突变体的低通量ESI-MS筛选相反，>4000RFU的截止值用于选取CH2和CH3样品进行分析。由于仅两个κ样品和没有λ样品大于4000RFU，也分析了大于3000RFU的样品。
转酰胺反应通过将Z-Gln-Gly-CAD-生物素和TGase在37℃下与CH2突变体M252K、E283K、A287K和N297K；CH3突变体P343K、G385K、G420K、H433K、L443K、S444K和P445K；κ突变体D151K、L201K、S202K和E213K；及λ突变体V147K、Q187K和E213K孵育过夜来进行；且随后通过ESI-MS进行分析(图7)。三种另外的CH1突变体S191K、S192K和L193K通过ESI-MS进行分析，但不包括在初始ELISA筛选中。在这些突变体中，CH1突变体L193K、CH2突变体M252K、CH3突变体P445K、κ突变体L201K和S202K及λ突变体E213K是超过70％缀合的(图7)。CH2突变体N297K的结果由于非常低的信号而是不确定的。
鉴定为具有最高缀合效率的突变体使用Z-Gln-Gly-CAD-生物素底物在单一试验中重新分析。缀合的区域通过在ESI-MS分析之前用IdeS消化样品和还原以产生Fd(CH1和铰链)、Fc(CH2和CH3)及LC片段来确认。与N297K的缀合由于低Fc信号是不确定的，尽管具有高的Fd和LC信号。样品的转酰胺全部与包含赖氨酸突变的结构域相关。T135K和P445K突变体以100％缀合，且与M252K的缀合接近100％(图8)。S136K和S221K突变是高于80％缀合的。其它三个铰链突变体具有低于50％的缀合效率。两个LC突变体都是高于80％缀合的。
实施例4
插入赖氨酸残基以形成酰基受体位点
残基Ser190至Thr195形成连接β链E和F的β转角。整个这一暴露区域的赖氨酸扫描显示仅一个位点-位置193-是可接受的酰基供体位点。该区域形成α螺旋，且可能的是这一二级结构防止这一区域中的转酰胺作用。为潜在地破坏这一区域中的结构，赖氨酸插入在Ser191和Ser192，Ser192和Leu193或Leu193和Gly194之间。样品与mTGase和Z-Gln-Gly-CAD-生物素在37℃下孵育过夜，且其质量通过ESI-MS进行分析。在Ser191和Ser192或者Ser192和Leu193之间的赖氨酸插入是100％转酰胺的，但当插入在Leu193和Gly194之间时不是(表2)。
[表2]
表2-赖氨酸插入的转酰胺作用
Z-Gln-Gly-CAD-生物素：+631Da
mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和mTGase在37℃下孵育过夜。非还原mAb的质量通过ESI-MS进行分析(数据未显示)，且如上测定与Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Δ质量＝631Da)的百分缀合。DAR通过将Δ质量除以Z-Gln-Gly-CAD-生物素的质量确定。
实施例5
由赖氨酸添加到LC C-末端导致的转酰胺作用
之前证明，当Lys447的切割通过在位置448处附加的C-末端残基阻断时，HC C-末端Lys447残基是转酰胺位点，参见2015年12月18日提交的U.S.临时申请No.62/269,138和2016年12月16日提交的PCT/US2016/067165，其各自的整个内容明确地通过引用并入。赖氨酸工程化到LC的C-末端以确定是否单一C-末端赖氨酸延伸足以用作酰基受体位点。与HC中的原始C-末端赖氨酸相反，LC上的C-末端赖氨酸不被羧肽酶切割(表3)。但是，这一工程化赖氨酸不是酰基受体位点。附加的亮氨酸工程化到工程化赖氨酸的C-末端(LC-KL)，因为HC的C-末端处的Lys-Leu基序高效地转酰胺。但是，LC-KL不转酰胺。LC中的原始C-末端半胱氨酸(Cys214)与HC形成链间二硫键，且这一区域包埋在这一区域的晶体结构中(数据未显示)。可能的是立体位阻或缺乏溶剂暴露阻止转酰胺作用。单一亮氨酸添加在Cys214和该赖氨酸之间以试图使得赖氨酸更易被MTGase接近。再次，对于C-末端赖氨酸没有观察到切割，且对于LK基序没有观察到转酰胺作用。但是，9.1％的具有LKL基序的LC被转酰胺。为使赖氨酸从LC-HC界面进一步延伸出，Gly-Ser接头插入在Cys214和该赖氨酸之间。这一延伸导致C-末端赖氨酸的切割(GGSGK)。通过添加C-末端亮氨酸(GGSGKL)保护赖氨酸的切割导致LC被77.8％转酰胺。
[表3]
表3-LC的C-末端赖氨酸添加的转酰胺作用
Z-Gln-Gly-CAD-生物素：+631Da
mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和mTGase在37℃下孵育过夜。还原的LC的质量通过ESI-MS进行分析，且如(表1)中测定Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Δ质量＝631Da)的百分缀合。
实施例6
另外的酰基供体的分析
与mAb上的酰基受体缀合的一种功用是用于制造位点特异性ADC。功能剂与mAb的缀合可以通过两种方法中的一种来实现。首先，两步方法需要mTGase将赖氨酸缀合至用反应性基团如BCN、DBCO、TCO、叠氮基(N3)、炔烃、四嗪或马来酰亚胺合成的酰基供体。第二步涉及使用例如无铜点击化学或硫醇反应性化学将功能剂缀合至反应性基团。Z-Gln-Gly-N3不是可商购的；因此，如方法部分详述的，将氨丙基-N3添加到Z-Gln-Gly的羟基基团。如上所述将具有HC或LC中的赖氨酸突变的抗体01与Z-Gln-Gly-N3或Z-Gln-Gly-PEG2-BCN和mTGase一起孵育。将样品脱盐并通过LC-MS分析以确定底物添加到mAb上。对于大多数赖氨酸置换，Z-Gln-Gly-N3有效地添加(>75％缀合或DAR 1.5)(表4)。大多数允许的转酰胺位点是HC-S135K、HC-L193K、HC-D221K、HC-M252K、HC-N297K、HC-P445K和LC-L201K。突变体HC-T136K、HC-T223K、HC-T225K、LC-S202K和LC-GGSGKL使用Z-Gln-Gly-CAD-生物素全部以>75％转酰胺(图7)，但使用Z-Gln-Gly-N3不是。不是所有的酰基供体同等地转酰胺相同的酰基受体位点。这也通过Z-Gln-Gly-PEG2-BCN证明，其中没有酰基受体位点被有效地转酰胺(表4)。与Z-Gln-Gly-N3相反，通过Z-Gln-Gly-PEG2-BCN的转酰胺百分比在酰基受体位点之间没有广泛变化。例如，T135K和S136K通过Z-Gln-Gly-N3的转酰胺存在32％的差异，但使用Z-Gln-Gly-PEG2-BCN仅具有4％差异。
[表4]
表4-各种酰基供体的转酰胺作用
mAb与Z-Gln-Gly-N3、Z-Gln-Gly-PEG2-BCN或Z-Gln-Gly-PEG2-AuF和mTGase在37℃下孵育过夜。还原的mAb的质量通过LC-MS进行分析(数据未显示)，且如(表1)中测定与Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Δ质量＝631Da)的百分缀合。
有趣的是，与D221K和N297K的缀合导致HC中的多个缀合位点。D221K突变与Lys222相邻，其通常不是酰基受体位点。也许相邻赖氨酸的存在有助于Lys222的低水平转酰胺。值得注意的是，仅Z-Gln-Gly-N3底物在D221K突变体中的多于一个位点处缀合。Z-Gln-Gly-N3的结构小于测试的其它底物(图2)，且很可能第二缀合位点的立体位阻阻断其被其它底物转酰胺。
N297K突变移除Asn297处的糖基化位点。去糖基化的mAb采取与糖基化形式不同的结构。N297Q突变也导致去糖基化mAb且以使得Gln295然后被多种酰基受体底物转酰胺的方式扰乱其结构(Mindt,T.L.等,2008,Modification of different IgG1antibodies viaglutamine and lysine using bacterial and human tissue transglutaminase,Bioconjug.Chem 19:271-278；Jeger,S.等,2010,Site-specific and stoichiometricmodification of antibodies by bacterial transglutaminase,Angew.Chem Int EdEngl 49:9995-9997；Dennler,P.等,2014,Transglu taminase-based chemo-enzymaticconjugation approach yields homogeneous antibody-drug conjugates,Bioconjug.Chem 25:569-578)。N297K很可能改变CH2区域的构象，导致原始赖氨酸现在变成用于Z-Gln-Gly-N3的酰基受体位点。
第二缀合方法涉及单一缀合步骤，由此功能剂用酰基供体基团合成。该方法通过将Z-Gln-Gly基团合成到PEG2-阿里他汀F上(Z-Gln-Gly-PEG2-AuF)来测试。将Z-Gln-Gly-PEG2-AuF与抗体01HC和LC赖氨酸突变体及mTGase在37℃下孵育过夜。将样品脱盐并通过LC-MS分析以确定底物添加到mAb上。所有测试的HC突变体表现出各种不同的缀合量(表4)。在特定位点处的缀合效率不对应于用Z-Gln-Gly-N3观察到的缀合效率。与Z-Gln-Gly-PEG2-AuF的缀合对于T135K、L193K和D221K是低的，但对于Z-Gln-Gly-N3是高的。L201K是最有效的，92％的LC与Z-Gln-Gly-PEG2-AuF缀合。N297K再次显示多个缀合位点，但效率没有用Z-Gln-Gly-N3那么高。
实施例7
在单一抗体上产生多个酰基受体位点
具有一个工程化酰基受体位点的突变体mAb产生2的理论DAR。通过组合多个工程化酰基受体位点，理论DAR对于各位点增加2。提高ADC的载药量导致每mAb递送更多的细胞毒性药物到靶细胞中，这可以允许较低的患者用药。为确定是否多个酰基受体位点可以产生具有大于2的功能剂-免疫球蛋白比率的mAb，mAb经工程化以包括与CH1突变T135K或S136K、CH1-CH2突变S136K-N297K、CH1-CH2-CH3突变S136K-N297K-P445K或CH1-CH3突变T135K-L448组合的LC突变体L201K或S202K以产生分别具有4、6、8或6个酰基受体位点的mAb。
基于T135K的样品与mTGase和Z-Gln-Gly-CAD-生物素在37℃下孵育过夜，且它们的质量在反应后通过LC-MS分析。在所有样品中L201K LC是100％缀合的(表5)。单一T135KHC突变体中的S202K LC具有超过双重T135K-L448HC突变体两倍的效率(69.8％对31.8％)。T135K在与仅L201KLC突变组合时是100％缀合的，导致4.0的DAR。与S202KLC突变组合，缀合降低到88.7％，具有3.17的平均DAR。将T135K与L448HC突变组合导致对于mAb的100％缀合。但是，DAR是异质的，77.1％包含每HC 2个生物素和22.9％仅包含1个生物素，从而产生3.54的平均DAR。当双重HC突变与LC突变组合时，对于HC的缀合效率下降。DAR 1种类的量超过翻倍且DAR 2种类降低2.3-至6.5-倍。尽管这两种mAb具有6的潜在DAR，平均DAR小于4。
[表5]
表5-组合赖氨酸突变导致单一mAb上的多个酰基受体位点
mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和mTGase在37℃下孵育过夜。还原的T135K突变体的质量通过LC-MS进行分析，且如上测定与Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Δ质量＝631Da)的百分缀合。S136K突变体mAb用IdeS消化，还原并通过ESI-MS进行分析。来自Fc片段的信号太低而不能分析。
包含S136KHC突变的样品与mTGase和Z-Gln-Gly-CAD-生物素在37℃下孵育过夜，且它们的质量在IdeS消化和还原后通过ESI-MS分析。所有样品的CH1和轻链被转酰胺(表5)。对于所有样品，S136K是84.5％-88.1％缀合的。S202K转酰胺在单一S136K突变体中相对于双重和三重突变体更高(72.5％对56％或59.7％)。S136KHC/S202KLC的DAR是4个潜在位点中的3.16。对于包含N297K突变的Fc片段的ESI-MS信号是非常低的，且不能确定缀合效率。因此对于双重和三重HC突变体的DAR是至少2.95和2.8。
检查通过其它酰基供体底物对多个位点的转酰胺。基于T135K的突变体与Z-Gln-Gly-N3、Z-Gln-Gly-PEG2-BCN或Z-Gln-Gly-PEG2-AuF和mTGase在37℃下孵育过夜。通过每种底物与LC L201K和S202K位点的缀合在这些多突变mAb和表4中显示的单一L201K和S202K突变之间是相似的，除了没有观察到Z-Gln-Gly-PEG2-BCN与LC突变的缀合(图11)。包含单一T135K突变加单一LC突变的两种突变体对于所有酰基供体底物显示与表4中的单一T135K相似的对于T135K的缀合效率。添加第二突变L448突变导致在HC上具有DAR 1和DAR 2的样品的混合物。最高效地转酰胺的样品是T135KHC/L201KLC+Z-Gln-Gly-N3(4个中的DAR3.57)、T135K-L448HC+Z-Gln-Gly-N3(4个中的DAR 3.1)和T135K-L448HC/L201KLC+Z-Gln-Gly-N3(6个中的DAR 5.04)。
实施例8
其它IgG同种型中赖氨酸置换的分析
IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc是89.2％相同的(图10，序列比对)，因此可能的是IgG2、IgG3和IgG4中类似于IgG1的位置处的赖氨酸插入或置换可以是用于mTGase的工程化酰基受体位点。首先，分析野生型IgG2、IgG3和IgG4以确定是否存在对于这些同种型特异性的任何原始酰基受体位点。mAb与mTGase和Z-Gln-Gly-CAD-生物素在37℃下孵育过夜。样品用IdeS消化且Fc的质量通过ESI-MS分析。与IgG1一样，没有野生型IgG2、IgG3或IgG4的转酰胺(表6)。
[表6]
表6-IgG2、IgG3和IgG4没有酰基受体位点。
Z-Gln-Gly-CAD-生物素：+631Da
mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和mTGase在37℃下孵育过夜，接着用IdeS消化以产生F(ab’)2和Fc片段。IdeS生成的Fc片段的质量如上通过ESI-MS进行分析，且如本文公开的测定与Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Δ质量＝631Da)的百分缀合。
赖氨酸置换在类似于IgG1的位置处(M252、N297和P445)进行。除了编码位置445处的亮氨酸的IgG4，在同种型之间这些残基处没有差异(图10)。突变体mAb与mTGase和Z-Gln-Gly-CAD-生物素在37℃下孵育过夜。样品用IdeS消化且Fc的质量通过ESI-MS分析。突变体N297K和M252K与N297K突变体一起高效地转酰胺，从而产生每HC超过一个缀合位点，如同IgG1(表7)。IgG2-N297K和IgG4-N297K包含2个酰基受体位点而IgG3包含3个。突变体P445K仅对于IgG2同种型高效转酰胺。P445K转酰胺对于IgG3和IgG4分别为仅62.6％和50.6。
[表7]
表7-IgG1Fc中的工程化酰基受体位点也是IgG2、IgG3和IgG4中的受体位点。
ZQG-CAD-生物素＝631Da
mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和mTGase在37℃下孵育过夜，接着用IdeS消化以产生F(ab’)2和Fc片段。IdeS生成的Fc片段的质量如上通过ESI-MS进行分析，且如本文公开的测定与Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Δ质量＝631Da)的百分缀合。
实施例9
Fab’区域中的转酰胺位点
IgG的铰链是CH1和CH2之间的柔性接头，且因此可能的是这种灵活性允许这一区域中的酰基受体的转酰胺作用。Zhang等,3D Structural Fluctuation of IgG1AntibodyRevealed by Individual Particle Electron Tomography,Sci Rep,(2015)5:9803。事实上，上铰链突变体D221K、T223K、H224K和T225K有效地转酰胺；但是，没有中间或下铰链突变体的转酰胺。这种转酰胺的缺乏可能是分别由于链间二硫键的结构约束和与CH2的接近。为确定是否这些残基可以在解除任何结构约束时被转酰胺，赖氨酸突变在包含完整铰链区及突变成丙氨酸的Cys226和Cys229的Fab'(DTHTAPPAPAPELL)的情况中进行。
突变体Fab'的转酰胺使用Z-Gln-Gly-CAD-生物素作为酰基供体如上通过ESI-MS确定。除突变体L235K外，预测Fab'的HC部分的质量。这一突变导致被切割(很可能是由于羧肽酶B)的C-末端赖氨酸残基，如同全长IgG。Harris等,Structural characterization ofa recombinant CD4-IgG hybrid molecule,Eur J Biochem,(1990)194:611-620；Harris,Processing of C-terminal lysine and arginine residues of proteins isolatedfrom mammalian cell culture,J Chromatogr.A,(1995)705:129-134；Dick,Jr.等,C-terminal lysine variants in fully human monoclonal antibodies:investigationof test methods and possible causes,Biotechnol.Bioeng.,(2008)100:1132-1143。尽管没有观察到全长IgG的转酰胺，少量的转酰胺(4.7％)在野生型Fab'中观察到，可能是在Lys222处(图9)。扫描Fab'的赖氨酸诱变显示了位置D221、T223、H224、T225、P230和E233处的几个酰基受体位点的诱变。这些Fab'被1或2个生物素转酰胺，一个在工程化赖氨酸上和第二个在原始赖氨酸上。
由于二级结构在确定是否赖氨酸被转酰胺方面发挥很大作用，且在Fab'突变体之间铰链二级结构不太可能显著变化，不能预测到原始Lys222及突变体C226K、P227K、C229K、A231K、P232K、L234K和L235K不被转酰胺。分析了赖氨酸突变周围的初级序列。之前证明，酰基受体的C-末端(+1)的残基影响转酰胺；特别地+1酸性或脯氨酸残基导致很少或没有转酰胺，参见例如，2015年12月18日提交的U.S.临时No.62/269,138和2016年12月16日提交的PCT/US2016/067165，其各自的整个内容明确地通过引用并入。突变体C226K、P227K、C229K和A231K全部具有+1脯氨酸且P232K具有+1谷氨酸。另外，Lys222和L234K具有-1酸性残基。可能的是，酰基受体侧翼的任何酸性残基抑制转酰胺。因此，进行丙氨酸突变以突变-1或+1酸性残基或者+1脯氨酸。事实上，突变该酸性或脯氨酸残基导致赖氨酸置换的有效转酰胺(表8)。D221A突变从5％至66％提高转酰胺。类似地，突变P232K,E233A和E233A,L234K Fab'中的-1或+1酸性残基分别导致转酰胺从46％增加至93％和从62％增加至86％。+1脯氨酸的突变对于赖氨酸突变体C226K(52％至71％)、P227K(57％至81％)、C229K(33％至91％)和A231K(22％至93％)具有相似的结果。
铰链长度对突变体T223K、H224K、T225K、P228K、P230K和E233K的转酰胺的作用通过删除除相邻的+1残基之外的所有残基来分析。除去C-末端铰链残基对于突变体T223K、H224K和T225K的工程化酰基受体位点的转酰胺没有负面影响，且增加突变体P228K、P230K和E233K的转酰胺(表8)。
[表8]
表8-Fab’而非mAb中的铰链赖氨酸突变是酰基受体。
％缀合
纯化的突变铰链突变体Fab’通过将mTGase与Z-Gln-Gly-CAD-生物素在37℃下孵育过夜来筛选转酰胺作用。HC的质量通过ESI-MS进行分析并测定缀合的百分比。
实施例10
二聚体抗体分子的产生
除了介导小分子酰基供体和大分子酰基受体之间的转酰胺的mTGase之外，分析了突变体Fab与包含酰基供体的mAb的转酰胺作用。mAb突变体N297Q包含位置295和297处的两个酰基供体位点。Jeger等,Site-specific and stoichiometric modification ofantibodies by bacterial transglutaminase,Angew.Chem Int Ed Engl,(2010)49:9995-9997。Fab'突变体D221K、H224K、T225K、P228K、P230K和E233K与N297Q和mTGase在37℃下孵育过夜，样品被还原和通过SDS-PAGE分析。未缀合的mAb和Fab'产生23kDa(LC)、25kDa(Fab-Vh-CH1)、38kDa(mTGase)和49kDa(HC)处的条带。单mAb-Fab'缀合导致73kDa处的条带且两个Fab'与mAb的缀合导致98kDa处的条带。事实上，所有样品包含～75和～100kDa两者处的条带(图11)。
实施例的结论
已知抗体内暴露的环和转角中原始赖氨酸的数目，出人意料的是在任何测试的抗体上没有发现合适的酰基受体。这些结果与本领域中之前的见解完全相反，包括Mindt等,2008报告的那些，据称他们证明平均0.3个分子的荧光染料与抗体chCE7上的天然赖氨酸残基缀合。也据称Mindt报告了酰基受体底物对于相同抗体chCE7的低水平(0.1分子/抗体)的转酰胺。但是，多项较晚的公开文献不能重复Mindt的发现(参见Strop等,2013；Jeger等,2010；和Siegmund等,2015)。特别地，Jeger注意到"对于任何底物没有观察到原始chCE7或RTX的修饰"(参见Jeger等,2010)。因此，Mindt中公开的发现很可能是由于分析的背景荧光或特别地由于酰基受体或供体位于chCE7的可变区中。
尽管在野生型单克隆抗体上没有发现酰基受体，单氨基酸赖氨酸置换出人意料地揭示在整个抗体上可以被工程化为酰基受体的几个位置。至少一个位点在HC和LC的各恒定区结构域中鉴定(图12)。在溶剂暴露的环或转角中的其位置之外，没有围绕酰基受体位点的明确共有序列。转酰胺超过70％的位点的序列实例是KSK135SG、STK136GG、SSK193GT、TLK252IS、QYK297ST、LSK445G*、QGK201SS、GLK202SP、PTK213CS。类似的序列在未转酰胺的赖氨酸周围发现，如在CH1(SSK133ST)、CH3(LTK360NQ)和κ(QLK126SG,LSK183AD)中。
赖氨酸侧翼的酸性或脯氨酸残基确实阻碍转酰胺效率，如通过Fab的铰链中的突变证明的。除了将残基突变为赖氨酸外，酰基受体位点可以通过突变现有赖氨酸侧翼的残基来工程化。基于Fab突变体D221A中Lys222的转酰胺，在整个mAb上天然赖氨酸侧翼的其它脯氨酸或酸性残基的突变是可能的。例如，IgG1赖氨酸PK246P、PK248D、TK290P、GK317E和DK414S，κ赖氨酸SK169D和EK188H，及λ赖氨酸EK207T侧邻酸性和脯氨酸残基，且突变为酸性或脯氨酸残基之外的一些残基可能在该特定赖氨酸处形成酰基受体位点。此外，有可能的是一些位点由于突变体赖氨酸与酸性或脯氨酸残基相邻(如几种Fab铰链突变体的情况)而在赖氨酸扫描诱变中遗漏。
残基周围的结构也显示为影响转酰胺。通过在Fab片段的产生中释放由CH2和/或链间二硫键造成的任何结构的核心和低铰链区，在mAb的情况中未转酰胺的赖氨酸在Fab中被转酰胺。在具有半胱氨酸226和229处的链间二硫键的全长mAb的情况中，P230K和E233K未转酰胺。但是，在Fab片段和没有链间二硫键的情况中，这些残基被转酰胺。侧邻其本身中的酰基受体位点的二硫键不阻碍转酰胺，如λ突变体E213K中的+1位置是链间二硫键，且该突变体被转酰胺。因此，通过移除链间二硫键和/或移除附近CH2结构域的可能的空间约束来改变铰链区的三维结构允许在这些位点处赖氨酸的转酰胺。
MTGase之前通过两种方法之一作为通过mAb工程化转酰胺谷氨酰胺的手段来进行研究。Josten等,Use of microbial transglutaminase for the enzymaticbiotinylation of antibodies,J Immunol.Methods,(2000)240:47-54；Mindt等,Modification of different IgG1antibodies via glutamine and lysine usingbacterial and human tissue transglutaminase,Bioconjug.Chem,(2008)19:271-278；Jeger等,Site-specific and stoichiometric modification of antibodies bybacterial transglutaminase,Angew.Chem Int Ed Engl,(2010)49:9995-9997；Strop等,Location matters:site of conjugation modulates stability and pharmacokineticsof antibody drug conjugate,Chem Biol,(2013)20:161-167。尽管有效地在mAb上缀合基于胺的底物，两种方法均具有劣势。第一方法需要酶促或通过诱变的mAb脱糖基化。Mindt等,Modification of different IgG1antibodies via glutamine and lysine usingbacterial and human tissue transglutaminase,Bioconjug.Chem,(2008)19:271-278；Jeger等,Site-specific and stoichiometric modification of antibodies bybacterial transglutaminase,Angew.Chem Int Ed Engl,(2010)49:9995-9997。去糖基化mAb经历构象变化，其降低热稳定性，提高蛋白酶易感性和提高聚集率。Mimura等,Theinfluence of glycosylation on the thermal stability and effector functionexpression of human IgG1-Fc:properties of a series of truncated glycoforms,Mol Immunol.,(2000)37:697-706；Kwon等,Effect of glycosylation on the stabilityof alpha1-antitrypsin toward urea denaturation and thermal deactivation,Biochim.Biophys.Acta,(1997)1335:265-272；Wang等,pH dependent effect ofglycosylation on protein stability,Eur J Pharm Sci,(2008)33:120-127；Yamaguchi等,Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of humanimmonoglobin G1as revealed by NMR spectroscopy,Biochim.Biophys.Acta,(2006)1760:693-700；Arnold等,The impact of glycosylation on the biological functionand structure of human immunoglobulins,Annu Rev Immunol.,(2007)25:21-50；Zheng等,The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation andstability,MAbs.,(2011)3:568-576。N297K置换产生转酰胺位点，且利用这一位点也具有与N297Q突变相同的劣势。
第二方法涉及在mAb的任一末端处或在溶剂暴露的区域内4-氨基酸LLQG谷氨酰胺标签的工程化。Strop等,Location matters:site of conjugation modulates stabilityand pharmacokinetics of antibody drug conjugate,Chem Biol,(2013)20:161-167。添加4个氨基酸提高了患者中免疫原性反应的可能性，这将降低ADC的功效。相反，本文所述的修饰利用单氨基酸置换或单氨基酸(例如，赖氨酸)插入作为缀合位点，从而降低在患者中诱发免疫反应的可能。此外，如果发现一个位点赋予mAb不希望的性质如增加的聚集或免疫原性，可以使用在整个IgG、κ和λ恒定域中的多个位点。
总之，酰基受体位点可以在抗体或抗原结合片段中通过将赖氨酸插入在两个天然残基之间或通过在整个IgG1-4、κ或λ的各个位置的赖氨酸置换工程化。酰基受体位点的最佳情况不仅是位置依赖性的，而且不需要-1或+1位置处的酸性残基或者不需要+1位置处的脯氨酸。微生物转谷氨酰胺酶缀合技术可利用这些工程化位点以缀合多种含酰基供体功能剂用于制备ADC、双特异性抗体、免疫毒素或其它mAb-蛋白质复合物。
本领域技术人员将认识到，可以对本发明的优选实施方式进行许多改变和修改，并且可以在不脱离本发明的精神的情况下做出这样的改变和修改。因此，意图是所附权利要求覆盖落入本发明的真实精神和范围内的所有这样的等同变化。
非正式序列表
[表9-1]
[表9-2]
[表9-3]
[表9-4]
[表9-5]
[表9-6]
[表9-7]
[表9-8]
[表9-9]
[表9-10]
[表9-11]
[表9-12]
[表9-13]
[表9-14]
[表9-15]
[表9-16]
[表9-17]
[表9-18]
[表9-19]
[表9-20]
[表9-21]
[表9-22]
[表9-23]
[表9-24]
[表9-25]
[表9-26]
[表9-27]
[表9-28]
[表9-29]
[表9-30]
[表9-31]
[表9-32]
[表9-33]
[表9-34]
[表9-35]
[表9-36]
[表9-37]
[表9-38]
[表9-39]
[表9-40]
[表9-41]
[表9-42]
[表9-43]
Claims (123)
1.一种产生缀合的免疫球蛋白的方法，该方法包括：
使免疫球蛋白或其抗原结合部分与微生物转谷氨酰胺酶和包含酰基供体底物的功能剂接触，
a)其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含工程化赖氨酸残基，其中所述工程化赖氨酸残基是天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，
其中突变成赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基选自：
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)、丝氨酸136(S136K)、亮氨酸193(L193K)、天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、甲硫氨酸252(M252K)、天冬酰胺297(N297K)或脯氨酸445(P445K)，
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)或丝氨酸202(S202K)，或
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的λ轻链上的谷氨酸213(E213K)；
b)其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基，和
c)其中所述包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)或(II)：
(Z)m-Gln-(L)n-(Y)(I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m(II)
其中
Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；
Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；
每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中所述碳原子中的一个或多个可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；
m是0至5的整数；
n是0至5的整数；和
Y是治疗剂或诊断剂，
其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的所述工程化赖氨酸残基与所述功能剂上的酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合，从而产生所述缀合的免疫球蛋白。
2.一种产生缀合的免疫球蛋白的方法，该方法包括：
i)使免疫球蛋白或其抗原结合部分与微生物转谷氨酰胺酶和酰基供体底物接触，
a)其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含工程化赖氨酸残基，其中所述工程化赖氨酸残基是天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，
其中突变成赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基选自：
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)、丝氨酸136(S136K)、亮氨酸193(L193K)、天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、甲硫氨酸252(M252K)、天冬酰胺297(N297K)或脯氨酸445(P445K)，
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)或丝氨酸202(S202K)，或
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的λ轻链上的谷氨酸213(E213K)；和
b)其中所述酰基供体底物具有式(III)或(IV)：
(Z)m-Gln-(L)n-(X)(III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m(IV)
其中
Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；
Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；
每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中所述碳原子中的一个或多个可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；
m是0至5的整数；
n是0至5的整数；和
X是反应性基团，
其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的所述工程化赖氨酸残基与所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合，且
ii)将功能剂与所述酰基供体底物的反应性基团缀合，其中所述功能剂是治疗剂或诊断剂，从而产生所述缀合的免疫球蛋白。
3.如权利要求2的方法，其中所述酰基供体底物的反应性基团通过点击化学缀合于所述功能剂。
4.如权利要求1或2的方法，其中所述重链还包含在位置448处添加到其C-末端的氨基酸残基，且其中所述氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。
5.如权利要求4的方法，其中所述在位置448处添加到C-末端的氨基酸残基是亮氨酸。
6.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是抗原结合片段(Fab)，且其中所述突变成赖氨酸残基的天然氨基酸残基选自：所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、脯氨酸228(P228K)、脯氨酸230(P230K)和谷氨酸233(E233K)。
7.如权利要求6的方法，其中所述Fab包含完整铰链区。
8.如权利要求6的方法，其中所述Fab包含截短的铰链区。
9.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含第二工程化赖氨酸残基，其中所述第二工程化赖氨酸残基是第二赖氨酸残基插入或第二天然氨基酸残基突变成第二赖氨酸残基，且其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的所述第二工程化赖氨酸残基与所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合。
10.如权利要求9的方法，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，且突变成所述第二工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。
11.如权利要求9的方法，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)，且突变成所述第二工程化赖氨酸残基的所述第二天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)。
12.如权利要求9的方法，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)，且突变成所述第二工程化赖氨酸残基的所述第二天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。
13.如权利要求11或12的方法，其中所述重链还包含在位置448处添加到其C-末端的氨基酸残基，且其中所述氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。
14.如权利要求13的方法，其中所述在位置448处添加到C-末端的氨基酸残基是亮氨酸。
15.如权利要求9的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含第三工程化赖氨酸残基，其中所述第三工程化赖氨酸残基是第三赖氨酸残基插入或第三天然氨基酸残基突变成第三赖氨酸残基，且其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的所述第三工程化赖氨酸残基与所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合。
16.如权利要求15的方法，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，突变成所述第二工程化赖氨酸残基的所述第二天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬酰胺297(N297K)，和突变成所述第三工程化赖氨酸残基的所述第三天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。
17.如权利要求15的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含第四工程化赖氨酸残基，其中所述第四工程化赖氨酸残基是第四赖氨酸残基插入或第四天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，且其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的所述第四工程化赖氨酸残基与所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合。
18.如权利要求17的方法，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，突变成所述第二工程化赖氨酸残基的所述第二天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬酰胺297(N297K)，突变成所述第三工程化赖氨酸残基的所述第三天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)，和突变成所述第四工程化赖氨酸残基的所述第四天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的脯氨酸445(P445K)。
19.如权利要求1或2的方法，其中所述工程化赖氨酸残基之后的氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。
20.如权利要求1或2的方法，其中所述工程化赖氨酸残基之前的氨基酸残基不是酸性氨基酸残基。
21.如权利要求1或2的方法，其中所述工程化赖氨酸残基之前的氨基酸残基是
非酸性氨基酸残基插入，或
天然酸性氨基酸残基突变成非酸性氨基酸残基。
22.如权利要求1或2的方法，其中所述工程化赖氨酸残基之后的氨基酸残基是
氨基酸残基插入，其中所述氨基酸残基插入是非酸性氨基酸残基插入和非脯氨酸残基插入，或者
天然酸性氨基酸残基或天然脯氨酸残基突变成非酸性氨基酸残基和非脯氨酸残基。
23.如权利要求21的方法，其中所述非酸性氨基酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。
24.如权利要求21的方法，其中所述非酸性氨基酸残基插入是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸插入。
25.如权利要求22的方法，其中所述非酸性氨基酸残基插入是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸插入。
26.如权利要求22的方法，其中所述非酸性氨基酸和非脯氨酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸,甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。
27.如权利要求21的方法，其中所述天然酸性氨基酸残基是天冬氨酸或谷氨酸。
28.如权利要求22的方法，其中所述天然酸性氨基酸残基是天冬氨酸或谷氨酸。
29.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含重链，该重链还包含在位置448处添加到其C-末端的至少一个氨基酸残基，且其中所述至少一个氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。
30.如权利要求29的方法，其中所述在位置448处添加到C-末端的至少一个氨基酸残基是亮氨酸。
31.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含轻链，该轻链包含半胱氨酸214之后一至四个另外的氨基酸的插入，其中所述赖氨酸残基插入是在该一至四个另外的氨基酸之后插入的赖氨酸残基，且其中亮氨酸残基在该赖氨酸残基之后插入。
32.如权利要求31的方法，其中所述半胱氨酸214之后一至四个另外的氨基酸的插入、所述在该一至四个另外的氨基酸之后插入的赖氨酸残基及所述在该赖氨酸残基之后插入的亮氨酸残基构成选自以下的序列：GKL、GGKL、GGSKL和GGSGKL。
33.如权利要求1的方法，其中所述包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)，且其中Z是CBZ基团；其中每个L独立地为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且其中n是0、1、2、3、4或5。
34.如权利要求1的方法，其中所述包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)，其中Z是CBZ基团，且L是氨基酸。
35.如权利要求34的方法，其中L是Gly；m是1；和n是0。
36.如权利要求34的方法，其中L是Gly；m是1；和n是1。
37.如权利要求1的方法，其中所述包含酰基供体底物的功能剂具有式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；和至少一个L是Gly。
38.如权利要求1的方法，其中Y是阿里他汀F。
39.如权利要求2的方法，其中所述酰基供体底物具有式(III)，且其中Z是CBZ基团；其中每个L独立地是聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；且其中n是0、1、2、3、4或5。
40.如权利要求2的方法，其中所述酰基供体底物具有式(III)，其中Z是CBZ基团，且其中一个或多个L是氨基酸。
41.如权利要求40的方法，其中L是Gly；m是1；和n是1。
42.如权利要求40的方法，其中m是1；和n是0。
43.如权利要求2的方法，其中所述酰基供体底物具有式(IV)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；且至少一个L是Gly。
44.如权利要求2的方法，其中X是选自以下的反应性基团：
(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)，
45.如权利要求1或2的方法，其中所述治疗剂是放射性剂、细胞毒性剂、小分子、核酸或多肽。
46.如权利要求45的方法，其中所述多肽是抗体或其抗原结合部分。
47.如权利要求45的方法，其中所述细胞毒性剂是化疗剂。
48.如权利要求45的方法，其中所述小分子是抗生素。
49.如权利要求1或2的方法，其中所述诊断剂是荧光团、荧光染料、放射性核素或酶。
50.如权利要求1或2的方法，其中所述微生物转谷氨酰胺酶是茂源链霉菌微生物转谷氨酰胺酶。
51.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgG1免疫球蛋白或其抗原结合部分。
52.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白或其抗原结合部分。
53.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgA1、IgA2或IgM免疫球蛋白或其抗原结合部分。
54.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgD或IgE免疫球蛋白或其抗原结合部分。
55.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是抗原结合片段(Fab)。
56.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是人免疫球蛋白或其抗原结合部分或者人源化免疫球蛋白或其抗原结合部分。
57.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是嵌合免疫球蛋白或其抗原结合部分或者非人免疫球蛋白或其抗原结合部分。
58.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含两条重链和两条轻链。
59.如权利要求1或2的方法，其中所述功能剂与免疫球蛋白或其抗原结合部分的比率是1:1-200:1。
60.如权利要求59的方法，其中所述功能剂与免疫球蛋白或其抗原结合部分的比率是1:1-100:1。
61.一种包含免疫球蛋白或其抗原结合部分和功能剂的缀合的免疫球蛋白，其中
a)所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含工程化赖氨酸残基，其中所述工程化赖氨酸残基是天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，
其中突变成赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基选自：
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)、丝氨酸136(S136K)、亮氨酸193(L193K)、天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、甲硫氨酸252(M252K)、天冬酰胺297(N297K)或脯氨酸445(P445K)，
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)或丝氨酸202(S202K)，或
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的λ轻链上的谷氨酸213(E213K)；
b)所述功能剂包含酰基供体底物，其中包含酰基供体底物的所述功能剂具有式(I)或(II)：
(Z)m-Gln-(L)n-(Y)(I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m(II)
其中
Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；
Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；
每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中所述碳原子中的一个或多个可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；
m是0至5的整数；
n是0至5的整数；和
Y是治疗剂或诊断剂，
其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的所述工程化赖氨酸残基与所述功能剂的酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合。
62.一种包含免疫球蛋白或其抗原结合部分和功能剂的缀合的免疫球蛋白，其中
a)所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含工程化赖氨酸残基，其中所述工程化赖氨酸残基是天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，
其中突变成赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基选自：
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)、丝氨酸136(S136K)、亮氨酸193(L193K)、天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、甲硫氨酸252(M252K)、天冬酰胺297(N297K)或脯氨酸445(P445K)，
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)或丝氨酸202(S202K)，或
所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的λ轻链上的谷氨酸213(E213K)；
b)所述工程化赖氨酸残基与酰基供体底物上的谷氨酰胺残基缀合，其中所述酰基供体底物具有式(III)或(IV)：
(Z)m-Gln-(L)n-(X)(III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m(IV)
其中
Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；
Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；
每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中所述碳原子中的一个或多个可以任选地和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选地和独立地为氨基酸残基；
m是0至5的整数；
n是0至5的整数；和
X是反应性基团，
c)所述反应性基团与功能剂缀合，其中所述功能剂是治疗剂或诊断剂。
63.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述重链还包含在位置448处添加到其C-末端的氨基酸残基，且其中所述氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。
64.如权利要求63的缀合的免疫球蛋白，其中所述在位置448处添加到C-末端的至少一个氨基酸残基是亮氨酸。
65.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是抗原结合片段(Fab)，且其中突变成赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基选自：所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬氨酸221(D221K)、苏氨酸223(T223K)、组氨酸224(H224K)、苏氨酸225(T225K)、脯氨酸228(P228K)、脯氨酸230(P230K)和谷氨酸233(E233K)。
66.如权利要求65的缀合的免疫球蛋白，其中所述Fab包含完整铰链区。
67.如权利要求65的缀合的免疫球蛋白，其中所述Fab包含截短的铰链区。
68.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含第二工程化赖氨酸残基，其中所述第二工程化赖氨酸残基是第二赖氨酸残基插入或第二天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，且其中所述第二工程化赖氨酸残基与所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合。
69.如权利要求68的缀合的免疫球蛋白，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，和突变成第二工程化赖氨酸残基的所述第二天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。
70.如权利要求68的缀合的免疫球蛋白，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)，和突变成第二工程化赖氨酸残基的所述第二天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的亮氨酸201(L201K)。
71.如权利要求68的缀合的免疫球蛋白，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的苏氨酸135(T135K)，和突变成第二工程化赖氨酸残基的所述第二天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。
72.如权利要求70的缀合的免疫球蛋白，其中所述重链还包含在位置448处添加到其C-末端的至少一个氨基酸残基，且其中所述至少一个氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。
73.如权利要求71的缀合的免疫球蛋白，其中所述重链还包含在位置448处添加到其C-末端的至少一个氨基酸残基，且其中所述至少一个氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。
74.如权利要求72的缀合的免疫球蛋白，其中所述在位置448处添加到C-末端的至少一个氨基酸残基是亮氨酸。
75.如权利要求73的缀合的免疫球蛋白，其中所述在位置448处添加到C-末端的至少一个氨基酸残基是亮氨酸。
76.如权利要求69的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含第三工程化赖氨酸残基，其中所述第三工程化赖氨酸残基是第三赖氨酸残基插入或第三天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，且其中所述第三工程化赖氨酸残基与所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合。
77.如权利要求76的缀合的免疫球蛋白，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，突变成第二工程化赖氨酸残基的所述第二天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬酰胺297(N297K)，和突变成第三工程化赖氨酸残基的所述第三天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)。
78.如权利要求76的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分还包含第四工程化赖氨酸残基，其中所述第四工程化赖氨酸残基是第四赖氨酸残基插入或第四天然氨基酸残基突变成赖氨酸残基，且其中所述第四工程化赖氨酸残基与所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合。
79.如权利要求78的缀合的免疫球蛋白，其中突变成工程化赖氨酸残基的所述天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的丝氨酸136(S136K)，突变成第二工程化赖氨酸残基的所述第二天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的天冬酰胺297(N297K)，突变成第三工程化赖氨酸残基的所述第三天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的κ轻链上的丝氨酸202(S202K)，和突变成第四工程化赖氨酸残基的所述第四天然氨基酸残基是所述免疫球蛋白或其抗原结合部分的重链上的脯氨酸445(P445K)。
80.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述工程化赖氨酸残基之后的所述氨基酸残基不是脯氨酸残基或酸性氨基酸残基。
81.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述工程化赖氨酸残基之前的所述氨基酸残基不是酸性氨基酸残基。
82.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述工程化赖氨酸残基之前的所述氨基酸残基是
非酸性氨基酸残基插入，或者
天然酸性氨基酸残基突变成非酸性氨基酸残基。
83.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述工程化赖氨酸残基之后的所述氨基酸残基是
氨基酸残基插入，其中所述氨基酸残基插入是非酸性氨基酸残基和非脯氨酸残基插入，或者
天然酸性氨基酸残基或天然脯氨酸残基突变成非酸性氨基酸残基和非脯氨酸残基。
84.如权利要求82的缀合的免疫球蛋白，其中所述非酸性氨基酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。
85.如权利要求82的缀合的免疫球蛋白，其中所述非酸性氨基酸残基插入是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸插入。
86.如权利要求83的缀合的免疫球蛋白，其中所述非酸性氨基酸和非脯氨酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。
87.如权利要求82的缀合的免疫球蛋白，其中所述天然酸性氨基酸残基是天冬氨酸或谷氨酸。
88.如权利要求83的缀合的免疫球蛋白，其中所述天然酸性氨基酸残基是天冬氨酸或谷氨酸。
89.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含重链，该重链还包含在位置448处添加到其C-末端的至少一个氨基酸残基，且其中该至少一个氨基酸残基不是脯氨酸或酸性氨基酸残基。
90.如权利要求89的缀合的免疫球蛋白，其中所述在位置448处添加到C-末端的氨基酸残基是亮氨酸。
91.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含轻链，该轻链包含半胱氨酸214之后一至四个另外的氨基酸的插入，其中所述赖氨酸残基插入是在该一至四个另外的氨基酸之后插入的赖氨酸残基，且其中亮氨酸残基在该赖氨酸残基之后插入。
92.如权利要求91的缀合的免疫球蛋白，其中所述半胱氨酸214之后一至四个另外的氨基酸的插入、所述在该一至四个另外的氨基酸之后插入的赖氨酸残基和所述在该赖氨酸残基之后插入的亮氨酸残基构成选自以下的序列：GKL、GGKL、GGSKL和GGSGKL。
93.如权利要求61的缀合的免疫球蛋白，其中所述包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)，且其中Z是CBZ基团；其中每个L独立地为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；和其中n是0、1、2、3、4或5。
94.如权利要求61的缀合的免疫球蛋白，其中所述包含酰基供体底物的功能剂具有式(I)，其中Z是CBZ基团，和L是氨基酸。
95.如权利要求94的缀合的免疫球蛋白，其中L是Gly；m是1；和n是0。
96.如权利要求94的缀合的免疫球蛋白，其中L是Gly；m是1；和n是1。
97.如权利要求61的缀合的免疫球蛋白，其中所述包含酰基供体底物的功能剂具有式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；和至少一个L是Gly。
98.如权利要求61的缀合的免疫球蛋白，其中所述功能剂Y是阿里他汀F。
99.如权利要求62的缀合的免疫球蛋白，其中所述酰基供体底物具有式(III)，且其中Z是CBZ基团；其中每个L独立地为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)、乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；且其中n是0、1、2、3、4或5。
100.如权利要求62的缀合的免疫球蛋白，其中所述酰基供体底物具有式(III)，其中Z是CBZ基团；且其中一个或多个L是氨基酸。
101.如权利要求100的缀合的免疫球蛋白，其中L是Gly；m是1；和n是1。
102.如权利要求100的缀合的免疫球蛋白，其中m是1；和n是0。
103.如权利要求62的缀合的免疫球蛋白，其中所述酰基供体底物具有式(IV)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；和至少一个L是Gly。
104.如权利要求62的缀合的免疫球蛋白，其中X是选自以下的反应性基团：
(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)，
105.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述治疗剂是放射性剂、细胞毒性剂、小分子、核酸或多肽。
106.如权利要求105的缀合的免疫球蛋白，其中所述多肽是抗体或其抗原结合部分。
107.如权利要求105的缀合的免疫球蛋白，其中所述细胞毒性剂是化疗剂。
108.如权利要求105的缀合的免疫球蛋白，其中所述小分子是抗生素。
109.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述诊断剂是荧光团、荧光染料、放射性核素或酶。
110.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgG1免疫球蛋白或其抗原结合部分。
111.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白或其抗原结合部分。
112.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgA1、IgA2或IgM免疫球蛋白或其抗原结合部分。
113.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是IgD或IgE免疫球蛋白或其抗原结合部分。
114.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是抗原结合片段(Fab)。
115.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是人免疫球蛋白或其抗原结合部分或者人源化免疫球蛋白或其抗原结合部分。
116.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分是嵌合免疫球蛋白或其抗原结合部分或者非人免疫球蛋白或其抗原结合部分。
117.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分包含两条重链和两条轻链。
118.如权利要求61或62的缀合的免疫球蛋白，其中所述功能剂与免疫球蛋白或其抗原结合部分的比率是1:1-200:1。
119.如权利要求118的缀合的免疫球蛋白，其中所述功能剂与免疫球蛋白或其抗原结合部分的比率是1:1-100:1。
120.如权利要求62的缀合的免疫球蛋白，其中所述功能剂是抗体或其抗原结合部分，且其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分和所述功能剂结合相同的抗原或结合不同的抗原。
121.如权利要求61的缀合的免疫球蛋白，其中Y是抗体或其抗原结合部分，且其中所述免疫球蛋白或其抗原结合部分和所述抗体或其抗原结合部分结合相同的抗原或结合不同的抗原。
122.一种包含如权利要求61-121任一项的缀合免疫球蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
123.一种通过如权利要求1-60任一项的方法产生的缀合的免疫球蛋白。
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