CN103344631A - 非水电泳分离和过氧草酸酯类化学发光检测的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及非水电泳分离和过氧草酸酯类化学发光检测的微流控芯片。目前毛细管电泳分离与过氧草酸酯类化学发光检测联用效果不好。本发明中进样通道两端分别接样品储液池和样品废液池；缓冲液储液池通道一端接缓冲液储液池，有效分离通道和缓冲液储液池通道与进样通道连通，有效分离通道内设多孔塞。过氧草酸酯池通道一端接过氧草酸酯储液池，过氧化氢储液池通道一端接过氧化氢储液池，另一端均接化学发光试剂混合通道。检测通道接废液池，缓冲液废液池通道接缓冲液废液池；有效分离通道、化学发光试剂混合通道、检测通道和缓冲液废液池通道的另一端相接。光电倍增管直接置于检测通道下方。本发明检测灵敏度高，电泳分离稳定性和结果重现性好。

Description

非水电泳分离和过氧草酸酯类化学发光检测的微流控芯片

技术领域

本发明属于微全分析系统技术领域，涉及一种集成非水芯片毛细管电泳分离和过氧草酸酯类化学发光的微流控芯片。

背景技术

芯片毛细管电泳是20世纪90年代初由Manz等首次实现的一种以毛细管电泳为核心技术，以微流控芯片为操作平台的电泳分离技术。近年来，它已经广泛的应用于生物和生物医学领域。与传统的分离技术相比，芯片毛细管电泳具有分离效率高、分析时间短（数秒至数十秒）、试剂和样品消耗少（微升至皮纳升级）、高度微型化和集成化等优点。但是，低进样量对高灵敏检测提出了挑战。化学发光检测无需光源、仪器设备简单、背景噪声低、灵敏度高，芯片毛细管电泳的理想检测器之一。过氧草酸酯类化学发光检测系统是目前发现的发光量子效率最高的非酶催化的发光体系，其最大量子效率达34%。过氧草酸酯类化学发光检测系统具有的高灵敏度、高通用性以及干扰相对较少等特点使之非常适用于芯片毛细管电泳中。

Tsukagoshi等和刘等采用十字通道微流控芯片和电动夹流方式进样，柱端过氧草酸酯类化学发光检测法实现单酰化氨基酸、癌症标记物和手性氨基酸的检测。该系统简单、易于实现。但是，由于检测池同时作为废液池，化学发光反应产生的废液不断积累，这将影响检测灵敏度和重现性。为改善重现性，苏等在玻璃芯片上设计了一个流通的Y-型检测池。在这个系统中，化学发光试剂通过一个微型泵传送，并与电渗流驱动的样品在检测池反应。但是压力流和电渗流必须精确匹配，否则会造成分离失败。

综上所述，文献报道的芯片毛细管电泳分离-过氧草酸酯类化学发光检测方法主要有以下缺点：第一，灵敏度较低，主要是由于电动夹流进样的体积有限，同时发光试剂与待测物的混合效率较低，此外，单点检测方式的检测区域太小；第二，重现性较差，主要是因为化学发光反应的反应废液在检测池积累或者压力流与电渗流的不匹配；第三，稳定性不好，主要是发光试剂（如H₂O₂等）在高电场下易分解产生气泡从而降低甚至中断电渗流。另外，过氧草酸酯，如双[2,4,6-三氯苯基]草酰酯（TCPO）和过氧化氢反应必须在非水大环境中进行，少量水的存在会加速过氧草酸酯的分解，影响发光强度和检测稳定性，而文献中芯片毛细管电泳分离部分都采用了水溶液缓冲体系，这与过氧草酸酯类化学发光检测的非水环境反应相冲突。

发明专利200910154432.7中，提出了一种集成芯片毛细管电泳分离和化学发光检测的微流控分析芯片，该芯片已成功的应用于铬、锰、钴、铜、镍、锌、金、铂、铅等重金属的芯片毛细管电泳分离和鲁米诺-过氧化氢化学发光检测的高效连用。但是，将该芯片应用到过氧草酸酯类化学发光检测时，发现在过氧草酸酯与过氧化氢溶液交界处有很明显的层流现象，虽然经过螺旋形通道后，界面很快消失，但随着反应的进行，发现过氧草酸酯与过氧化氢液流速度越来越慢，不利于反应的进行。这可能是样品在电渗流驱动下至汇流处，预先与两相交界处（过氧草酸酯与过氧化氢反应界面上）过氧草酸酯与过氧化氢反应的中间体反应，反应产生的产物在界面处不利于顺利流出至废液池W，而越积越多，影响了液流流动。另外，如果将接地电极放在过氧草酸酯池，一段时间后，会出现黑色沉淀，进一步阻碍液流流动。

由于这些原因，芯片毛细管电泳分离与过氧草酸酯类化学发光检测并未实现很好的联用。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供了一种结构简单、操作方便的非水电泳和过氧草酸酯类化学发光检测的微流控芯片。

本发明包括基片，缓冲液储液池、样品储液池、样品废液池、缓冲液废液池、过氧草酸酯储液池、过氧化氢储液池和废液池设置在基片上。

直线形的进样通道的一端与样品储液池连通，另一端与样品废液池连通；缓冲液储液池通道与有效分离通道相接构成直线型的分离通道，缓冲液储液池通道的一端与缓冲液储液池连通，有效分离通道的一端以及缓冲液储液池通道的另一端与进样通道连通，分离通道与进样通道垂直，构成十字相交通道；有效分离通道内设置有多孔塞。

直线形的过氧草酸酯池通道的一端与过氧草酸酯储液池连通，直线形的过氧化氢储液池通道的一端与过氧化氢储液池连通，过氧草酸酯池通道的另一端和过氧化氢储液池通道的另一端均与螺旋形的化学发光试剂混合通道的一个端口相接，形成三通道互通结构。

检测通道包括连通的螺旋形段和直线形段，直线形段的端口接废液池；直线形的缓冲液废液池通道的一个端口接缓冲液废液池；有效分离通道的另一端、化学发光试剂混合通道的另一个端口、检测通道的螺旋形段的端口、缓冲液废液池通道的另一个端口相接，形成四通道互通结构。

光电倍增管直接置于检测通道下方，用于检测过氧草酸酯类化学发光反应发出的光强度。

本发明提供的集成非水芯片毛细管电泳分离和过氧草酸酯类化学发光检测的微流控分析芯片，在有效分离通道中制作多孔塞。多孔塞对压力流的阻力很大，而不影响电渗流通过。被分析的样品可以在电渗流的驱动下，进入分离通道实现电泳分离；同时可以防止在压力差驱动下发光试剂倒流进入分离通道，影响电泳分离。为了尽量避免分析物质与多孔塞的相互作用，影响其分析性能，分析极性物质时，选择非极性多孔塞；分析非极性物质时，选择极性多孔塞。

本发明中化学发光混合通道和检测通道均涉及为螺旋形，以增强多种物质间的混合效果，提高检测灵敏度。

本发明的微流控芯片用于非水毛细管电泳分离和过氧草酸酯类化学发光检测分析方法中，分析操作由进样和分离两个阶段组成，在整个分析过程中，过氧草酸酯和过氧化氢通过螺旋形通道混合后形成中间体进入检测通道，当非水芯片毛细管电泳分离后的待分析物质与中间体在在分离通道和检测通道的连接点相遇后，在检测通道内混合并发生发光反应。在分离通道中有多孔塞，可以防止在压力差驱动下的发光试剂和缓冲液废液倒流进入分离通道，影响电泳分离。非水毛细管电泳分离和过氧草酸酯化学发光检测互不干扰，保证了非水毛细管电泳的分离效率和过氧草酸酯类化学发光的高灵敏度。具有分离效率高、检测灵敏度高、结构简单、体积小、重量轻、操作方便等优点，是制作便携式微全分离检测系统理想的微流控分析芯片。

本发明的微流控分析芯片中，毛细管电泳分离和化学发光检测均在非水的大环境中进行，且非水电泳分离电场不仅不经过化学发光检测通道，也不经过化学发光试剂混合通道。此外，化学发光试剂过氧草酸酯和过氧化氢首先经过一个螺旋形化学发光试剂混合通道混合后生成中间体，中间体与非水毛细管电泳分离的待分析物质相遇后，在螺旋形检测通道内混合并发生发光反应。因此，电泳分离的稳定性和结果的重现性好。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图中1-基片，2-缓冲液储液池，3-样品储液池，4-样品废液池，5-缓冲液废液池，6-过氧草酸酯储液池，7-过氧化氢储液池，8-废液池，9-进样通道，10-缓冲液储液池通道，11-有效分离通道，12-过氧草酸酯储液池通道，13-过氧化氢储液池通道，14-化学发光试剂混合通道，15-检测通道，16-缓冲液废液池通道，17-多孔塞。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步描述，但本发明保护范围并不仅限于此。

如图1所示，一种非水电泳分离和过氧草酸酯类化学发光检测的微流控芯片包括基片1，缓冲液储液池2、样品储液池3、样品废液池4、缓冲液废液池5、过氧草酸酯储液池6、过氧化氢储液池7和废液池8设置在基片1上。

直线形的进样通道9的一端与样品储液池3连通，另一端与样品废液池4连通；缓冲液储液池通道10与有效分离通道11相接构成直线型的分离通道，缓冲液储液池通道10的一端与缓冲液储液池2连通，有效分离通道11的一端以及缓冲液储液池通道10的另一端与进样通道9连通，分离通道与进样通道9垂直，构成十字相交通道；有效分离通道11内设置有多孔塞17。

在有效分离通道11中设置的多孔塞17，使被分析的样品可以在电渗流的驱动下，进入有效分离通道11实现电泳分离；而压力差驱动的化学发光试剂不会倒流进入有效分离通道11；要根据分析物质的性质选择合适的多孔塞，分析极性物质时，选择非极性多孔塞，分析非极性物质时，选择极性多孔塞。

直线形的过氧草酸酯池通道12的一端与过氧草酸酯储液池6连通，直线形的过氧化氢储液池通道13的一端与过氧化氢储液池7连通，过氧草酸酯池通道12的另一端和过氧化氢储液池通道13的另一端均与螺旋形的化学发光试剂混合通道14的一个端口相接，形成三通道互通结构。

检测通道15包括连通的螺旋形段和直线形段，直线形段的端口接废液池8；直线形的缓冲液废液池通道16的一个端口接缓冲液废液池5；有效分离通道11的另一端、化学发光试剂混合通道14的另一个端口、检测通道15的螺旋形段的端口、缓冲液废液池通道16的另一个端口相接，形成四通道互通结构。

光电倍增管直接置于检测通道15下方，用于检测过氧草酸酯类化学发光反应发出的光强度。

工作过程如图1所示，其中实线箭头表示非水电泳的进样阶段，微流控芯片上各通道中液流流动方向；虚线箭头表示非水电泳的分离阶段，微流控芯片上各通道中液流流动方向。

在微流控芯片上的样品储液池3中加入样品溶液，在缓冲液储液池2、样品废液池4和缓冲液废液池5加入非水电泳缓冲液，在过氧草酸酯储液池6加入非水的过氧草酸酯溶液，在过氧化氢储液池7加入经非水溶剂稀释的过氧化氢溶液，废液池8用于接收废液。除了过氧化氢储液池7中含有痕量的水，其他储液池中的溶液均为非水溶液。

在整个分析过程中，通过在废液池8施加负压力抽取或在5、6、7储液池上施加正压力可以使化学发光试剂混合通道14中的中间体和缓冲液废液池通道16中的缓冲液经过检测通道达到废液池8。分析操作由进样和分离两个阶段组成，在进样阶段，通过电动进样或压力进样准确控制纳升级样品进入有效分离通道11；在分离阶段，在缓冲液储液池2和缓冲液废液池5中施加分离电压，待分析物质在非水电泳分离后与过氧草酸酯类化学发光反应中间体在检测通道15内相遇后，发生化学发光反应，从而得到相应的电泳峰。

该微流控分析芯片的耗材为石英、玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯，聚碳酸酯和聚二甲基硅氧烷等聚合物材料。

该微流控芯片用于非水毛细管电泳分离和过氧草酸酯类化学发光检测分析方法中，通过提高化学发光试剂混合通道和缓冲液废液池通道内液体的流速，以减少样品在检测通道的停留时间和电泳峰的宽度。

该微流控芯片用于非水毛细管电泳分离和化学发光检测分析方法中，毛细管电泳分离和化学发光检测均在非水的大环境中进行。由于商品化的过氧化氢是含量为30%的水溶液，经有机溶剂稀释至一定浓度后，过氧化氢储液池中虽仍含有痕量的水，但其他储液池中的溶液均为非水溶液，只要过氧化氢浓度适宜，不会对化学发光反应产生影响。一般来说，化学发光试剂混合后，过氧化氢浓度增加，发生化学反应时的发光强度也会增加，但过氧化氢浓度过高，不仅会使噪声增加，而且过氧草酸酯遇水分解的速度也会加快，这将导致发光试剂强度的减弱，因此以过氧化氢浓度不超过150 mmol/L为宜。

Claims (1)

1. 非水电泳分离和过氧草酸酯类化学发光检测的微流控芯片，包括基片，缓冲液储液池、样品储液池、样品废液池、缓冲液废液池、过氧草酸酯储液池、过氧化氢储液池和废液池设置在基片上，其特征在于：

直线形的进样通道的一端与样品储液池连通，另一端与样品废液池连通；缓冲液储液池通道与有效分离通道相接构成直线型的分离通道，缓冲液储液池通道的一端与缓冲液储液池连通，有效分离通道的一端以及缓冲液储液池通道的另一端与进样通道连通，分离通道与进样通道垂直，构成十字相交通道；有效分离通道内设置有多孔塞；

直线形的过氧草酸酯池通道的一端与过氧草酸酯储液池连通，直线形的过氧化氢储液池通道的一端与过氧化氢储液池连通，过氧草酸酯池通道的另一端和过氧化氢储液池通道的另一端均与螺旋形的化学发光试剂混合通道的一个端口相接，形成三通道互通结构；

检测通道包括连通的螺旋形段和直线形段，直线形段的端口接废液池；直线形的缓冲液废液池通道的一个端口接缓冲液废液池；有效分离通道的另一端、化学发光试剂混合通道的另一个端口、检测通道的螺旋形段的端口、缓冲液废液池通道的另一个端口相接，形成四通道互通结构；

光电倍增管直接置于检测通道下方，用于检测过氧草酸酯类化学发光反应发出的光强度。

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