CN105548323A - 一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物分析领域，涉及一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法，步骤如下，(1)设计5’端偶联荧光染料的DNA，形成含有G‐四链体结构的DNA荧光探针；(2)将含G‐四链体结构的DNA荧光探针与凝血酶混合，经荧光毛细管电泳检测，计算峰面积比(Scomplex/STotal)，拟合得到峰面积比—浓度标准曲线，对照标准曲线计算待测样品中凝血酶浓度。采用上述技术方案提供的毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法，操作简单，可重复性高，能方便快捷的检测出样品中凝血酶的浓度，进一步拓展了DNA荧光探针在生物分析领域的应用。

Description

一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法
技术领域
本发明涉及生物分析领域，具体涉及一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法。
背景技术
检测凝血酶浓度的常用方法有发色底物法、荧光法和Raleigh光散射法等，但这些方法操作繁琐、耗费样品多，在微量样品的检测方面有很大的局限性。
荧光染料是一种可吸收紫外线或可见光并将其由短波长转化为较长波长的可见光并反射出来，可用肉眼看见其反射出来的明亮色彩。荧光染料由于其灵敏度高，操作方便，逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，其广泛应用于荧光探针，细胞染色，特异性DNA染色等。
近年来，一些研究小组已经开展了基于凝血酶的生物检测分析。Mc-Grown等将YOYO染料嵌入到15个碱基的凝血酶核酸适配体中，并考察其在凝血酶作用下荧光性质的改变。
另一方面，毛细管电泳作为一种高分辨率、高灵敏、高通量及低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。同时，通过将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管电泳的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：现有技术中尚无良好简单便捷检测凝血酶浓度的方法，提供了一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法。
为解决上述技术问题，本方法利用带有荧光染料的DNA序列FAM-F29形成G-四链体与凝血酶结合，通过毛细管电泳分析检测，并计算复合物的峰面积在毛细管电泳中所占的电泳峰面积之比，绘制峰面积之比与凝血酶浓度的曲线，从而实现凝血酶浓度的检测。
本发明所采用的技术方案为，一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法，其步骤如下：
(1)选取带有荧光染料的DNA序列FAM-F29；
(2)将步骤(1)所述的FAM-F29在一定浓度的Na+、K+盐溶液中反应24小时，得到G-四链体结构的DNA荧光探针溶液；
(3)将粉末状的凝血酶溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，稀释成不同浓度的凝血酶溶液；
(4)将步骤(2)所述的G-四链体结构的DNA荧光探针溶液与步骤(3)所述的凝血酶溶液混合，得到凝血酶与G-四链体结构的DNA荧光探针复合物；
(5)荧光毛细管电泳检测：将步骤(4)所述的复合物用荧光毛细管电泳检测，测定复合物通过检测通道的峰面积与总的DNA通过检测通道的峰面积之比，进行线性拟合，绘制峰面积比—浓度的标准曲线，对照标准曲线确定待测样品中凝血酶浓度。
进一步地，步骤(1)所述的荧光染料为6-FAM，5-FAM，TAMRA，ATTO-590中的一种。
更进一步地，步骤(1)所述荧光染料中DNA序列为5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTAGGGTGACT-3’
作为优选，步骤(2)所述的在形成G-四链体结构中所用的Na+、K+的浓度均为5mM。
采用上述的技术方案后，本发明所取得的有益效果是：本发明提供的一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法，操作简单，可重复性高，能方便快捷的检测出样品中凝血酶浓度，进一步拓展了荧光探针在生物分析领域的应用。
附图说明
图1：G-四链体结构的DNA荧光探针与不同浓度凝血酶电泳图(A：G-四链体结构的DNA荧光探针的峰、B：G-四链体结构的DNA荧光探针与凝血酶复合物的峰；a：G-四链体结构的DNA荧光探针、b-e：不同浓度比的G-四链体结构的DNA荧光探针与凝血酶的复合物)。
图2：G-四链体结构的DNA荧光探针与不同浓度的凝血酶在毛细管电泳检测通道的峰面积比的拟合曲线。
具体实施方式
本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
实施例1
1、G-四链体结构的形成
将FAM-F29先用8000rpm离心机离心2-3min，加入pH为7.4，浓度50mMTris-HCl缓冲溶液35μL，使其最终浓度为100μM，然后用TBE缓冲溶液稀释到所需的浓度，取2μL稀释后的FAM-F29溶液，加入等体积的NaCl溶液，反应12小时。随后在上述混合溶液中加入4μL的KCl溶液，反应12小时，确保G-四链体结构的DNA荧光探针的最终浓度为2μM，NaCl的最终浓度为5mM，KCl的最终浓度为5mM。
2、称取粉末状的凝血酶1.2mg，溶解于32μL，浓度为50mMTris-HCl(pH7.4)缓冲溶液中，得到浓度为10μM的凝血酶溶液，然后根据需要稀释成不同浓度。
3、取一定体积的上述G-四链体结构的DNA荧光探针溶液与等体积的不同浓度凝血酶混合，在37℃恒温水浴下混合不同时间，得到凝血酶与G-四链体结构的DNA荧光探针复合物。
4、荧光毛细管电泳检测
将上述不同浓度比的复合物用荧光毛细管电泳检测。在一定时间范围内，随着凝血酶浓度的增加，复合物的峰逐渐增加(图1)。计算复合物与总峰面积(Scomplex与STotal)，计算峰面积比(Scomplex/STotal)(图2)，进行拟合，得出标准曲线y＝0.468-0.488/(1+exp((x-3.05)/0.929)。
方程式中，x为凝血酶浓度，y为Scomplex/STotal；
5、将待测样品进行毛细管电泳检测，计算Scomplex/STotal的值为0.316，代入标准曲线，计算出凝血酶的浓度为3.787μM。
实施例2
将FAM-F29用TAMRA标记，其他步骤同实施例1。
计算Scomplex/STotal的值为0.309，代入标准曲线，计算出凝血酶的浓度为3.726μM。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。

Claims (3)

1.一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法，其特征在于，所述检测步骤如下：
(1)选取带有荧光染料的DNA序列FAM-F29；
(2)将步骤(1)所述的FAM-F29在5mM浓度的Na+、K+盐溶液下反应24小时，得到G‐四链体结构的DNA荧光探针溶液；
(3)将粉末状的凝血酶溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，稀释成不同浓度的凝血酶溶液；
(4)将步骤(2)所述的G-四链体结构的DNA荧光探针溶液与步骤(3)所述的凝血酶溶液混合，得到凝血酶与G-四链体结构的DNA荧光探针复合物；
(5)荧光毛细管电泳检测：将步骤(4)所述的复合物用荧光毛细管电泳检测，测定复合物通过检测通道峰面积与总的DNA通过检测通道的峰值面积之比，进行线性拟合，绘制峰面积比—浓度的标准曲线，对照标准曲线确定待测样品中凝血酶浓度。
2.如权利要求1所述的一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法，其特征在于，步骤(1)所述的荧光染料为6-FAM，5-FAM，TAMRA，ATTO-590中的一种。
3.如权利要求1所述的一种毛细管电泳检测凝血酶浓度的方法，其特征在于，步骤(1)所述荧光探针中DNA序列为5’‐AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTAGGGTGACT‐3’。
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