CN101672788A - 微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法，分析单个血红细胞中半胱氨酸、谷胱甘肽和血红蛋白的含量。采用微流控芯片电泳化学发光检测系统，高压电源有五个电源输出端分别连接着微流控芯片的缓冲液池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R及缓冲废液池BW，微流控芯片置于化学发光检测器的物镜上，化学发光检测器是组合有光电倍增管的倒置显微镜，光电倍增管电连接着数据采集器，数据采集器与计算机电连接。该方法可以通过测定单个血红细胞中谷胱甘肽和半胱氨酸浓度的增加程度，对病变的发生进行早期诊断，分析速度快，灵敏度和分辨率高。适宜于对人体进行健康检查和对病变进行早期诊断，可作为预防医学的有效手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是通过微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞中血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量的方法。
背景技术
单细胞分析对于理解许多生理、病理过程以及疾病早期诊断和治疗疾病等具有重要意义。由于细胞的直径一般为微米级，体积极小，细胞内组分含量非常低(fmol-zmol)且极为复杂，因此检测细胞内超痕量的组分，具有很大难度。
微流控芯片电泳(MCE)是继毛细管电泳后发展起来的新分离技术，以其独特的优势被广泛应用于化学、生物学、医学和环境监测等领域中。微流控芯片具有多通道网络结构，且通道大小一般为10-100μm，可以进样、反应、分离等操作集成，正因如此，它特别适合于单细胞分析的要求。微流控芯片电泳具有传统毛细管电泳技术无法比拟的优势，主要包括分离速度快、分析时间短、可集成化和自动化程度高，容易实现高通量分析。化学发光(CL)是一种高灵敏的检测技术，已经在化学发光免疫分析，流动注射分析，高效液相色谱和毛细管电泳中广泛应用，它不需要光源，避免了背景光及瑞利散射等杂散光的干扰，具有仪器结构简单、操作方便、可与LIF比拟的灵敏度、线性范围宽、分析速度快等优点。正因如此，化学发光被认为是微流控芯片分析系统最具有潜力的检测技术之一，有利于实现集成化和智能化，能实现真正意义上的微型化。近年来，MCE-CL联用技术已经应用氨基酸、金属离子、蛋白质以及免疫测定等分析中，但用于实现单个人血红细胞内物质的分离分析还未见专利和相关文献报道。
目前的研究常采用分析血清中某些蛋白质类标记物来辅助探寻病变，主要基于免疫化学的方法，一次只能分析一种标记物，操作繁琐耗时长。另外传统的分析细胞中标记物方法以大量细胞为前提，获取某一标记物含量的总值，并将该值与细胞数量的比值外推至单细胞内该标记物的含量。对于性质相对均一的细胞群来说，此方法可以接受，但在另外一些场合下，比如某些重大疾病的早期阶段，仅有个别细胞的组分发生变化，这时，传统方法将会平均掉该特异变化。因此，传统方法不适于病变的早期诊断。
对正常的健康人来说，单个血红细胞中的谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量很低，差异较小，分布在一个较窄的范围。当人体的某一部分发生病变时，导致单个血红细胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)急剧增加。因此，可以通过单个血红细胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)浓度的增加程度，对病变的发生进行早期诊断。
发明内容
为了克服目前传统方法分析仪操作繁琐，耗时长，不能进行单细胞分析的不足，本发明提出了一种微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法，分析单个血红细胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量。该方法可以通过单个血红细胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)浓度的增加程度，对病变的发生进行早期诊断，而且分析速度快，灵敏度和分辨率高。适宜于对人体进行健康检查和对病变进行早期诊断，可作为预防医学的有效手段。
本发明提供的微流控芯片化学发光测定人单血红细胞内物质的方法，所采用仪器为微流控芯片电泳化学发光检测系统，高压电源有五个电源输出端分别连接着微流控芯片的缓冲液池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R及缓冲废液池BW，微流控芯片置于化学发光检测器的物镜上，化学发光检测器是组合有光电倍增管的倒置显微镜，光电倍增管电连接着数据采集器，数据采集器与计算机电连接。
所述的微流控芯片采用Y型化学发光检测池的十字型微流控芯片，芯片为一块面积为9.5×2.5cm的玻璃/聚二甲基硅氧烷(PDMS)复合薄片，底片为玻璃，盖片为聚二甲基硅氧烷片，底片刻制有分离通道，盖片设置有缓冲液池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R及缓冲废液池BW，盖片设置的缓冲液池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R及缓冲废液池BW与底片刻制的分离通道相连通，所有通道深度均为15～30μm，通道截面为弧形，有效分离通道长为5.0～8.0cm，缓冲液池B、样品池S及废液池SW至十字交叉点的距离均为0.5cm，发光试剂池R到Y型交叉点的距离为1.5cm，Y型交叉点到缓冲废液池BW的距离为1.5cm，Y型交叉点至缓冲液池B、样品池S及废液池SW的通道宽度为40～75μm，Y型交叉点至发光试剂池R、缓冲废液池BW的通道宽度为100～350μm，Y型交叉点至发光试剂池R的通道为折向通道，从发光试剂池R出发的一段通道的中心线与缓冲液池B至缓冲废液池BW的通道的中心线平行，这段通道的长度是折向通道总长的三分之二，折向后另外一段至Y型交叉点的通道的中心线与缓冲液池B至缓冲废液池BW的通道的中心线成45°角。
微流控芯片的优选尺寸是所有通道深度均为25μm，有效分离通道长为6.5cm，Y型交叉点至缓冲液池B、样品池S及废液池SW的通道宽度为60μm，Y型交叉点至发光试剂池R、缓冲废液池BW的通道宽度为300μm。
为了确保光电倍增管的工作稳定性，化学发光检测器上的光电倍增管电连接着光电倍增管稳压电源。
本发明的微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法的测定具体步骤为：
A.微流控芯片的预处理：微流控芯片的通道依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液，超纯水和电泳缓冲溶液各冲洗10min，然后用显微镜观察，在芯片通道中充满电泳缓冲溶液且无细小颗粒和气泡产生；电泳缓冲溶液为含有3.0mmol/L鲁米诺(luminol)的20mmol/L硼砂溶液，其pH＝10.2；
B.标准血红蛋白、谷胱甘肽和半胱氨酸混合溶液的分析：在微流控芯片上的样品池S中加满混合溶液，其余各个储液池中均加满电泳缓冲液，然后将微流控芯片固定在化学发光检测器的倒置显微镜的载物台上，目镜放大倍数为200～400倍，采用夹流方式进样，在样品池S上加500～700V电压，废液池SW接地，同时在缓冲液池B和缓冲废液池BW上分别加150～320V和250～500V电压，发光试剂池R悬浮，进样时间为20s；之后在缓冲液池B中加2200～2800V电压，缓冲废液池BW接地，同时在样品池S和废液池SW都加1200～1800V电压，发光试剂池R中施加350～600V电压；目镜置于Y型交叉点；然后通过色谱工作站由计算机记录并显示电泳图；
C.人单个血红细胞内物质的分析：在微流控芯片的通道和贮液池都装满电泳缓冲溶液，然后将微流控芯片固定在化学发光检测器的倒置显微镜的载物台上，目镜放大倍数为200～400倍，将样品池S抽空，然后取细胞悬浮液10μL，用电泳缓冲液稀释至1.5mL后，用微量注射器吸取稀释后的细胞悬浮液于样品池S中；将各个贮存池中的液体高度调节为HS＞HB＝HBW＞＞HSW，在显微镜下观察，当单个细胞由样品池S即将运动到十字交叉点时，立刻将废液池SW加满缓冲溶液；然后在缓冲液池B中施加80～150V电压，废液池SW和样品池S中都施加50～80V电压，缓冲废液池BW接地，而发光试剂池R保持悬浮，且将此组电压在1s后切断，并重复3-6次；在显微镜下观察，至细胞降沉并贴壁；此后，将发光试剂池R中的电泳缓冲溶液以氧化试剂溶液代替，并在缓冲液池B和缓冲废液池BW之间施加2000～3000V电压，并在1s内切断，重复3-5次；立刻在缓冲液池B中加2200～2800V电压，缓冲废液池BW接地，同时在样品池S和废液池SW都加1200～1800V电压，发光试剂池R中施加350～600V电压；目镜置于Y型交叉点；然后通过色谱工作站由计算机记录并显示电泳图；柱后氧化试剂溶液为含有30mmol/L Na2S2O8的40mmol/L硼砂溶液，其pH＝11.5。
上述步骤中的最佳条件是：在步骤B中，目镜放大倍数为400倍，进样时在样品池S上加700V电压，同时在缓冲液池B和缓冲废液池BW上分别加280V和450V电压；进样之后在缓冲液池B中加2500V电压，同时在样品池S和废液池SW都加1500V电压，发光试剂池R中施加550V电压；在步骤C中，目镜放大倍数为400倍，在显微镜下观察到单个细胞由样品池S即将运动到十字交叉点时并立刻将废液池SW加满缓冲溶液后，在缓冲液池B中施加150V电压，废液池SW和样品池S中都施加70V电压，在将发光试剂池R中的电泳缓冲溶液以氧化试剂溶液代替后，在缓冲液池B和缓冲废液池BW之间施加2500V电压，并在1s内切断，重复3-5次；立刻在缓冲液池B中加2500V电压，缓冲废液池BW接地，同时在样品池S和废液池SW都加1500V电压，发光试剂池R中施加550V电压。
本发明提供的微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法，包括在一套带有倒置显微镜的微流控芯片化学发光检测系统上，实现了直接同时定量测定人单个红细胞中血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)的分析方法。单细胞的进样，溶膜，分离与检测胞内物质都在一块Y型化学发光检测池的十字型微流控芯片上实现。基于微流控芯片的网络结构以及芯片毛细管电泳高效分离的特点，通过静压力结合直流电场技术进行细胞快速溶膜。基于在碱性条件下，血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)对luminol-S2O8 2-化学发光体系有强烈的增敏作用，不需要任何衍生步骤即可对血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)进行直接测定。
由于微流控芯片网络结构和微米级的通道，以及芯片毛细管电泳高效分离的特点，可以使单细胞的进样、溶膜以及胞内物质的分离分析在一块微流控芯片上实现，当人体的某一部分发生病变时，导致单个血红细胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)急剧增加。因此本发明选用微流控芯片进行单个人血红细胞内血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)的分离分析，通过对单个血红细胞的电泳图和胞内谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)浓度的比较，对病变的发生进行早期快速诊断。由于在微流控芯片上单细胞进样简单、快速，芯片毛细管电泳分离效率高，因此分析速度快，灵敏度和分辨率高，有利于人单个细胞内物质如血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)的快速分离检测，为临床实践提供了一种简单快速的方法。整个分离检测可在10min内完成。
实际应用中，在正式进行人单个血红细胞的分析之前，需要先进行血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)混合标准溶液的微流控芯片电泳化学发光检测，作为对照标准将血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)给予定性。
必须注意的是，本发明的方法可对单个血红细胞中的血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)进行直接的快速的测定，而且灵敏度和分辨率高，但是测定的结果并不能作为诊断疾病的唯一证据。人体发生了病变，其单血红细胞中的血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)的浓度就会发生改变，但是这些数据的改变不能反过来确认病变就一定发生了，而只能间接地看作有这种可能性。
附图说明
图1：微流控芯片电泳化学发光检测系统图；
图2：Y型化学发光检测池的十字型微流控芯片示意图；
图3：血红蛋白、谷胱甘肽和半胱氨酸混合标准溶液的分离电泳图；
图4：正常人的单个血红细胞的分离电泳图；
图5：良性肿瘤患者单个血红细胞的分离电泳图；
图6：恶性肿瘤患者单个血红细胞的分离电泳图；
图7：其它疾病患者单个血红细胞的分离电泳图。
具体实施方式
实施例1：
(1)血红细胞悬浮液制备：
取正常人新鲜静脉血样3mL于一微量离心管中，然后加入3倍体积的PBS溶液，将其轻轻混合均匀后，在4℃离心10min(1000r/min)。重复以上步骤四次，使细胞上层溶液澄清，最后将3mL PBS溶液加入离心管中，并将细胞轻轻吹散为悬浮液。此悬浮液用于单细胞分析。
(2)血红蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)混合标准溶液的微流控芯片电泳化学发光检测
开始前，芯片通道依次用0.1mol/L氢氧化钠，超纯水和电泳缓冲(含有3.0mmol/L鲁米诺的20mmol/L硼砂溶液，pH 10.2)各冲洗10min，然后在显微镜观察下，在芯片通道中充满缓冲溶液且无细小颗粒和气泡产生。在微流控芯片上的样品池S中加满混合溶液，其余各个储液池中均加满电泳缓冲液，然后将微流控芯片固定在化学发光检测器的倒置显微镜的载物台上，目镜放大倍数为400倍，采用夹流方式进样，在样品池S上加700V电压，废液池SW接地，同时在缓冲液池B和缓冲废液池BW上分别加280V和450V电压，发光试剂池R悬浮，进样时间为20s；分离时，在缓冲液池B中加2500V电压，缓冲废液池BW接地，同时在样品池S和废液池SW都加1500V电压，发光试剂池R中施加550V电压；样品组分在分离通道中迁移至Y型交叉点与发光试剂混合发光，发光通过目镜收集(目镜置于Y型交叉点)并传至光电倍增管(PMT)，然后通过数据采集器(也称色谱工作站)传给计算机记录并显示电泳图。在图3中，峰1是半胱氨酸，峰2是谷胱甘肽，峰3是血红蛋白。
(3)正常人单个血红细胞的分析
开始前，芯片通道依次用0.1mol/L氢氧化钠，超纯水和电泳缓冲(含有3.0mmol/L鲁米诺的20mmol/L硼砂溶液，pH 10.2)各冲洗10min，然后在显微镜观察下，在芯片通道中充满缓冲溶液且无细小颗粒和气泡产生。
在微流控芯片的通道和贮液池都装满电泳缓冲溶液，然后将微流控芯片固定在带有化学发光检测器的倒置显微镜的载物台上，目镜放大倍数为400倍，将样品池S抽空，然后取细胞悬浮液10μL，用电泳缓冲液稀释至1.5mL后，用微量注射器吸取稀释后的细胞悬浮液于样品池S中；将各个贮存池中的液体高度调节为HS＞HB＝HBW＞＞HSW，在显微镜下观察，细胞在静压力作用下沿着进样通道内向十字交叉点缓慢运动，当单个细胞由样品池S即将运动到十字交叉点时，立刻将废液池SW加满缓冲溶液，这样便导入了单个细胞。然后在缓冲液池B中施加150V电压，废液池SW和样品池S中都施加70V电压，缓冲废液池BW接地，而发光试剂池R保持悬浮，且将此组电压在1s后切断，并重复4次；在显微镜下观察，细胞在小电压作用下降沉并贴壁。至细胞降沉并贴壁后，将发光试剂池R中的电泳缓冲溶液以氧化试剂溶液代替，并在缓冲液池B和缓冲废液池BW之间施加2500V电压，并在1s内切断，重复4次。由于缓冲溶液的强碱性作用和直流电压作用，细胞边缘出现模糊、溶解。此后，立刻在缓冲液池B中加2500V电压，缓冲废液池BW接地，同时在样品池S和废液池SW都加1500V电压，发光试剂池R中施加550V电压；样品在分离通道中迁移至Y型交叉点与发光试剂混合发光，发光通过目镜收集(目镜置于Y型交叉点)并传至光电倍增管(PMT)，然后通过数据采集器(也称色谱工作站)传给计算机记录并显示电泳图。其电泳谱图如图4所示。图中对应峰1为血红蛋白(Hb)。
实施例2
良性肿瘤患者单个血红细胞的测定。
用良性肿瘤患者新鲜静脉血样代替正常人血样，按实施例1的步骤进行分离检测，实验条件同实施例1。图5所示为：(A)良性甲状腺瘤患者单个血红细胞的电泳谱图；(B)良性乳腺肿瘤患者单个血红细胞的电泳谱图；(C)良性胃肿瘤患者单个血红细胞的电泳谱图。图中对应峰分别为：峰1是谷胱甘肽(GSH)，峰2是血红蛋白(Hb)。
实施例3
恶性肿瘤患者单个血红细胞的测定。
用恶性肿瘤患者新鲜静脉血样代替正常人血样，按实施例1的步骤进行分离检测，实验条件同实施例1。图6所示为：(A)肝癌患者单个血红细胞的电泳谱图；(B)甲状腺癌患者单个血红细胞的电泳谱图；(C)乳腺癌患者单个血红细胞的电泳谱图。图中对应峰分别为：峰1是半胱氨酸(Cys)，峰2是谷胱甘肽(GSH)，峰3是血红蛋白(Hb)。
实施例4
其它疾病患者单个血红细胞的测定。
用其它疾病患者新鲜静脉血样代替正常人血样，按实施例1的步骤进行分离检测，实验条件同实施例1。图7所示为：(A)乙型肝炎患者单个血红细胞的电泳谱图；(B)甲状腺炎患者单个血红细胞的电泳谱图。图中对应峰分别为：峰1是谷胱甘肽(GSH)，峰2是血红蛋白(Hb)。
Claims (6)
1、微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法，其特征在于：所采用仪器为微流控芯片电泳化学发光检测系统，高压电源有五个电源输出端分别连接着微流控芯片的缓冲液池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R及缓冲废液池B W，微流控芯片置于化学发光检测器的物镜上，化学发光检测器是组合有光电倍增管的倒置显微镜，光电倍增管电连接着数据采集器，数据采集器与计算机电连接。
2、根据权利要求1所述的微流控芯片化学发光测定人单血红细胞内物质的方法，其特征在于：微流控芯片采用Y型化学发光检测池的十字型微流控芯片，芯片为一块面积为9.5×2.5cm的玻璃/聚二甲基硅氧烷复合薄片，底片为玻璃，盖片为聚二甲基硅氧烷片，底片刻制有分离通道，盖片设置有缓冲液池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R及缓冲废液池B W，盖片设置的缓冲液池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R及缓冲废液池B W与底片刻制的分离通道相连通，所有通道深度均为15～30μm，通道截面为弧形，有效分离通道长为5.0～8.0cm，缓冲液池B、样品池S及废液池SW至十字交叉点的距离均为0.5cm，发光试剂池R到Y型交叉点的距离为1.5cm，Y型交叉点到缓冲废液池BW的距离为1.5cm，Y型交叉点至缓冲液池B、样品池S及废液池SW的通道宽度为40～75μm，Y型交叉点至发光试剂池R、缓冲废液池BW的通道宽度为100～350μm，Y型交叉点至发光试剂池R的通道为折向通道，从发光试剂池R出发的一段通道的中心线与缓冲液池B至缓冲废液池BW的通道的中心线平行，这段通道的长度是折向通道总长的三分之二，折向后另外一段至Y型交叉点的通道的中心线与缓冲液池B至缓冲废液池BW的通道的中心线成45°角。
3、根据权利要求2所述的微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法，其特征在于：微流控芯片所有通道深度均为25μm，有效分离通道长为6.5cm，Y型交叉点至缓冲液池B、样品池S及废液池SW的通道宽度为60μm，Y型交叉点至发光试剂池R、缓冲废液池BW的通道宽度为300μm。
4、根据权利要求1所述的微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法，其特征在于：化学发光检测器上的光电倍增管电连接着光电倍增管稳压电源。
5、根据权利要求1所述的微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法，其特征在于：测定具体步骤为：
A.微流控芯片的预处理：微流控芯片的通道依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液，超纯水和电泳缓冲溶液各冲洗10min，然后用显微镜观察，在芯片通道中充满电泳缓冲溶液且无细小颗粒和气泡产生；电泳缓冲溶液为含有3.0mmol/L鲁米诺的20mmol/L硼砂溶液，其pH＝10.2；
B.标准血红蛋白、谷胱甘肽和半胱氨酸混合溶液的分析：在微流控芯片上的样品池S中加满混合溶液，其余各个储液池中均加满电泳缓冲液，然后将微流控芯片固定在化学发光检测器的倒置显微镜的载物台上，目镜放大倍数为200～400倍，采用夹流方式进样，在样品池S上加500～700V电压，废液池SW接地，同时在缓冲液池B和缓冲废液池BW上分别加150～320V和250～500V电压，发光试剂池R悬浮，进样时间为20s；之后在缓冲液池B中加2200～2800V电压，缓冲废液池BW接地，同时在样品池S和废液池SW都加1200～1800V电压，发光试剂池R中施加350～600V电压；目镜置于Y型交叉点；然后通过色谱工作站由计算机记录并显示电泳图；
C.人单个血红细胞内物质的分析：在微流控芯片的通道和贮液池都装满电泳缓冲溶液，然后将微流控芯片固定在化学发光检测器的倒置显微镜的载物台上，目镜放大倍数为200～400倍，将样品池S抽空，然后取细胞悬浮液10μL，用电泳缓冲液稀释至1.5mL后，用微量注射器吸取稀释后的细胞悬浮液于样品池S中；将各个贮存池中的液体高度调节为HS＞HB＝HBW＞＞HSW，在显微镜下观察，当单个细胞由样品池S即将运动到十字交叉点时，立刻将废液池SW加满缓冲溶液；然后在缓冲液池B中施加80～150V电压，废液池SW和样品池S中都施加50～80V电压，缓冲废液池BW接地，而发光试剂池R保持悬浮，且将此组电压在1s后切断，并重复3-6次；在显微镜下观察，至细胞降沉并贴壁；此后，将发光试剂池R中的电泳缓冲溶液以氧化试剂溶液代替，并在缓冲液池B和缓冲废液池BW之间施加2000～3000V电压，并在1s内切断，重复3-5次；立刻在缓冲液池B中加2200～2800V电压，缓冲废液池BW接地，同时在样品池S和废液池SW都加1200～1800V电压，发光试剂池R中施加350～600V电压；目镜置于Y型交叉点；然后通过色谱工作站由计算机记录并显示电泳图；柱后氧化试剂溶液为含有30mmol/L Na2S2O8的40mmol/L硼砂溶液，其pH＝11.5。
6、根据权利要求5所述微流控芯片化学发光测定人单血红细胞内物质的方法，其特征是：
在步骤B中，目镜放大倍数为400倍，进样时在样品池S上加700V电压，同时在缓冲液池B和缓冲废液池BW上分别加280V和450V电压；进样之后在缓冲液池B中加2500V电压，同时在样品池S和废液池SW都加1500V电压，发光试剂池R中施加550V电压；
在步骤C中，目镜放大倍数为400倍，在显微镜下观察到单个细胞由样品池S即将运动到十字交叉点时并立刻将废液池SW加满缓冲溶液后，在缓冲液池B中施加150V电压，废液池SW和样品池S中都施加70V电压，在将发光试剂池R中的电泳缓冲溶液以氧化试剂溶液代替后，在缓冲液池B和缓冲废液池BW之间施加2500V电压，并在1s内切断，重复3-5次；立刻在缓冲液池B中加2500V电压，缓冲废液池BW接地，同时在样品池S和废液池SW都加1500V电压，发光试剂池R中施加550V电压。
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