CN112304889A - 一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原性谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法。关键步骤与原理为：乙烯基三乙氧基硅烷（VTEO）使毛细管内壁硅烷化，硅烷化后的内壁可润湿性降低；还原型谷胱甘肽（GSH）与VTEO在光引发剂及紫外光照下发生点击反应，GSH附着于毛细管内使内壁可润湿性升高；由于可润湿性变化，水在毛细管内壁的附着力也发生变化，毛细管内通过毛细现象上升的水柱高度将随之变化；利用毛细管内水柱高度的变化可定量GSH的浓度。本方法是一种全新的可视化定量检测法，它将有机反应和毛细现象同时应用于分析检测，该方法无需复杂仪器，操作简单、成本低廉，能实现在10‑1000μM GSH的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及化学传感器技术领域，尤其是涉及一种基于毛细管内壁点击反应检测还原性谷胱甘肽的方法。
背景技术
还原型谷胱甘肽（GSH）在生物体内有很多作用，它可保护体内蛋白和酶等生物分子不被自由基氧化，它参与三羧酸循环和糖代谢，人体内GSH的含量对于预测或诊断人体疾病有很大帮助。目前，还原型谷胱甘肽的检测方法有表面增强拉曼光谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学法、荧光法。而上述的这些方法，有的需要合成信号探针，有的需要制备纳米材料，有的需要昂贵的仪器，还有的需要专业的工程技术员。
毛细现象是自然界中常见的物理现象。水柱在毛细管中的运动可以用Jurin定律描述。结合Young-Laplace方程，毛细管中水柱的上升高度（H）可表示为
。其中γ是水的表面张力；θ是水在毛细管内壁的接触角；
，g和R分别是水的密度，重力加速度和毛细管半径。可以看出，在一定温度下（水的表面张力仅与温度有关），半径固定的毛细管中水柱的上升高度（H）与接触角θ（的余弦值）正相关。通常，我们通过接触角来反映固体表面的可润湿性。而固体表面的可润湿性与表面的化学组成密切相关。当表面主要被亲水性分子覆盖时，它具有良好的可润湿性，并且水在表面上形成较小的静态接触角。当固体表面被疏水性分子覆盖时，该表面的可润湿性较差，水在表面上形成较大的静态接触角。基于以上分析，我们设计了一种以毛细管为检测工具的新型可视化定量传感策略，通过改变毛细管内壁的可润湿性来达到检测目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单有效、低成本的还原型谷胱甘肽的检测方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案：一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）毛细管的清洗
将毛细管分别用乙醇和超纯水超声清洗，将清洗后的毛细管放入真空干燥后备用；
（2）毛细管硅烷化
将毛细管倾斜吸满盛有浓度为0.05~2.0 %的乙烯基三乙氧基硅烷溶液并平放在表面皿中，用保鲜膜密封反应，然后将毛细管依次用有机溶剂、乙醇和水超声清洗，然后将硅烷化的毛细管真空干燥；
（3）毛细管的筛选
将毛细管一端垂直置于水面下，毛细管内水柱不断上升，直至液面不变，测量上升液面的高度，选择水柱高度一致的硅烷化毛细管，记录数值后用高纯氮气吹干毛细管；
（4）点击反应与标准曲线的绘制
在离心管中依次加入光引发剂、乙醇和水、不同浓度的GSH标准溶液，混匀，配得点击反应液；将硅烷化毛细管吸入点击反应液，在紫外光下照射反应后用乙醇和超纯水分别超声清洗毛细管，然后用氮气吹干；将干燥的毛细管一端垂直放入水中，测量上升液面的高度，绘制GSH标准浓度与点击反应前后水柱变化高度的标准曲线;
（5）血样中GSH的检测
在离心管中依次加入光引发剂、乙醇和水、血样，混匀，制得样品混合液；将硅烷化毛细管吸入样品混合液，紫外光照下点击反应，用乙醇和超纯水分别超声清洗毛细管，然后用氮气吹干；将干燥的毛细管一端垂直放入水中，测量上升液面的高度，根据标准曲线，计算可得血样中GSH的含量。
步骤（1）的毛细管长度为10cm，内径为0.1~0.4mm。
步骤（1）和（2）中的毛细管需放入真空干燥箱干燥，温度为50~80℃，时间为30~90min。
步骤（2）中所述反应时间为1~3 h。
步骤（2）中所述的乙烯基三乙氧基硅烷溶液中的溶剂为甲苯、或甲醇、或甲苯和甲醇的混合溶液。
步骤（3）中所述筛选的毛细管上升液面优选为3.4~3.6 cm。
步骤（4）、（5）中所述毛细管测量液面上升高度时将毛细管伸至在水的液面下方2~5mm。
步骤（4）、（5）中所述光引发剂为2,4,6-三甲基苯甲酰-二苯基氧化膦（TPO）、过氧化二异丙苯（DCP）、过氧化苯甲酸叔丁酯（TBPB）或2,2-二羟甲基丙酸（DMPA）；光引发剂的浓度为0.5~2.5 mg/mL；紫外灯的功率在5~30 W；引发波长为250~380 nm，照射距离为5~10cm，照射时间为20~40 min；点击反应液中的溶剂为乙醇与水，比例为1:0.2~1。
本发明检测方法的原理为：乙烯基三乙氧基硅烷（VTEO）硅烷化毛细管内壁，使内壁可润湿性降低；还原型谷胱甘肽（GSH）与VTEO在光引发剂及紫外光照下发生点击反应，GSH附着于毛细管内又使内壁可润湿性升高；由于可润湿性变化，水在毛细管内壁的附着力也发生变化，毛细管内通过毛细现象上升的水柱高度将随之变化；通过分别测量点击反应前后水柱高度，构建谷胱甘肽浓度与毛细管内水柱变化高度的正相关性，利用此关系检测血液中的谷胱甘肽。
与现有的方法相比，本发明提供了一种全新的可视化定量检测法，它无需复杂仪器，用肉眼能分辨结果，操作简单，成本低廉，能快速的对还原型谷胱甘肽的浓度进行检测。
附图说明
图1为本发明中玻片表面接触角变化。
图2为本发明中与不同浓度谷胱甘肽反应后的毛细管液面高度。
图3为本发明中谷胱甘肽浓度与毛细管液面变化高度（△H）的关系。
图4为本发明中谷胱甘肽和其他干扰物质与毛细管液面变化高度（△H）的关系。
具体实施方式
下面是本发明的具体实施例，以下实施例旨在进一步详细说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
（1）毛细管的清洗
将内径0.3 mm毛细管分别用乙醇和超纯水中先后超声清洗两次，每次10 min，然后将清洗后的毛细管放入80℃的真空干燥箱干燥90 min后取出备用；
（2）毛细管硅烷化
将（1）中所得干净的毛细管倾斜吸满有0.1%乙烯基三乙氧基硅烷（VTEO）的甲苯溶液并放在的表面皿中，用保鲜膜密封好，室温放置2 h。然后将毛细管依次用甲苯、乙醇和水超声清洗两次，每次5 min，再放入80℃的真空干燥箱干燥90 min；
（3）毛细管的筛选
将干燥的毛细管一端竖直方向放在水的液面下方3 mm处，毛细管内通过毛细现象水柱高度不断上升，直至液面不再移动，测量液面上升高度为H1；选取高度一致的毛细管，用高纯氮气吹出毛细管内的水；
（4）点击反应与标准曲线的绘制
在离心管中依次加入30 μL乙醇、8.8 μL水、1.2 μL200 mg/mL的TPO、10 μL不同浓度的GSH标准溶液，加入后混匀，即为点击反应液；将（3）中的硅烷化毛细管吸满点击反应液，在距离为10 cm、光强为20 W的紫外灯下照射20 min，用乙醇和去离子水超声清洗两遍，用氮气吹干后，测量液面水柱高度H2，即可得到液面变化高度△H=(H2-H1)，根据GSH标准溶液的浓度与△H的正相关性，做出标准曲线；
（5）血样中GSH的检测
在离心管中依次加入30 μL乙醇、8.8 μL水、1.2 μL200 mg/mL的TPO、10 μL 已处理的血液样品水溶液，混匀；将（3）中的毛细管吸满样品反应液，在距离为10 cm、光强为20 W的紫外灯下照射20 min，用乙醇和去离子水超声清洗两遍，用氮气吹干后，测量液面高度H3，即可得到液面高度变化△H1=(H3-H1)，利用标准曲线方程即可求得血样中GSH的浓度。
表1为血样中谷胱甘肽的检测及比较。
通过本发明方法和商用试剂盒对实际样品的谷胱甘肽的浓度进行检测比较，在可允许误差范围内，获得较为一致的结果。
根据图1可知：乙烯基硅烷化之前的玻片表面富含羟基，表面是可润湿的，接触角较小；用VTEO处理后，表面被疏水性乙烯基硅烷分子覆盖，可润湿性降低，接触角增大；当目标分子GSH通过硫醇-烯点击反应固定在玻片的表面后，玻片表面的可润湿性又增加，接触角减小。
根据图2可知：随着谷胱甘肽浓度的增加，液面上升增高。未硅烷化的毛细管在点击反应前后液面高度不变，表明GSH不改变未硅烷化的毛细管内壁的可润湿性。
根据图3可知：液面变化高度与GSH浓度呈对数关系。
根据图4可知：本发明中，其它小分子物质不干扰GSH的检测。
实施例2
（1）毛细管的清洗
将内径0.2 mm毛细管分别用乙醇和超纯水先后超声清洗两次，每次15 min，然后将清洗后的毛细管放入70℃的真空干燥箱干燥60 min后取出备用；
（2）毛细管硅烷化
将（1）中所得干净的毛细管倾斜吸满有1.5 %乙烯基三乙氧基硅烷VTEO的甲醇溶液并放在的表面皿中，用保鲜膜密封好，室温放置1.0 h。然后将毛细管分别用甲醇、乙醇和水超声清洗两次，每次5 min，再放入70℃的真空干燥箱干燥60 min；
（3）同实施例1（3）；
（4）点击反应与标准曲线的绘制
在离心管中依次加入35 μL乙醇、14 μL水、1 μL200 mg/mL的TBPB、10 μL不同浓度的GSH标准溶液，加入后混匀，即为点击反应液；将（3）中的硅烷化毛细管吸满点击反应液，在距离为8 cm、光强为20 W的紫外光下照射30 min，用乙醇和去离子水超声清洗两遍，氮气吹干后，测量液面高度H2，即可得到液面高度变化△H=(H2-H1)，根据GSH标准溶液的浓度与△H的正相关性，做出标准曲线；
（5）血样中GSH的检测
在离心管中依次加入35 μL乙醇、14 μL水、1 μL200 mg/mL的TBPB、10 μL 已处理的血液样品水溶液，混匀；将（3）中的硅烷化毛细管吸满点击反应液，在距离为8 cm、光强为20 W的紫外光下照射30 min，用乙醇和去离子水超声清洗两遍，氮气吹干后，测量液面高度H3，液面高度变化△H1=(H3-H1)，利用标准曲线方程即可求得血样中GSH的浓度。
实施例3
（1）毛细管的清洗
将内径0.3 mm毛细管分别用乙醇和超纯水先后超声清洗两次，每次10 min，然后将清洗后的毛细管放入60℃的真空干燥箱干燥90 min后取出备用；
（2）毛细管硅烷化
将（1）中的毛细管倾斜吸满有1.5%乙烯基三乙氧基硅烷VTEO的甲苯和甲醇的混合溶液（甲苯：甲醇=2:1）并放在的表面皿中，用保鲜膜密封好，室温放置2 h。然后将毛细管分别用甲苯和甲醇的混合液、乙醇和水超声清洗两次，每次5 min，再放入60℃的真空干燥箱干燥90 min；
（3）同实施例1（3）；
（4）点击反应与标准曲线的绘制
在离心管中依次加入34.5 μL乙醇、24μL水、1.5 μL200 mg/mL的DMPA、10 μL不同浓度的GSH标准溶液，加入后混匀，即为点击反应液；将（3）中的毛细管吸满点击反应液，在距离为8 cm、光强为30 W的紫外光照下反应20 min，用乙醇和去离子水超声清洗两遍，氮气吹干后，测量液面高度H2，即可得到液面高度变化△H=(H2-H1)，根据GSH标准溶液的浓度与△H的正相关性，做出标准曲线；
（5）血样中GSH的检测
在离心管中依次加入34.5 μL乙醇、24 μL水、1.5 μL 200 mg/mL的DMPA、10 μL 已处理的血液样品水溶液，混匀；将（3）中的毛细管吸满点击反应液，在距离为8 cm、光强为30 W的紫外光照下反应20 min，用乙醇和去离子水超声清洗两遍，氮气吹干后，测量液面高度H3，液面高度变化△H1=(H3-H1)，利用标准曲线方程即可求得血样中GSH的浓度。
Claims (8)
1.一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）毛细管的清洗
将毛细管分别用乙醇和超纯水超声清洗，将清洗后的毛细管放入真空干燥后备用；
（2）毛细管硅烷化
将毛细管倾斜吸满盛有浓度为0.05~2.0 %的乙烯基三乙氧基硅烷溶液并平放在表面皿中，用保鲜膜密封反应，然后将毛细管依次用有机溶剂、乙醇和水超声清洗，然后将硅烷化的毛细管真空干燥；
（3）毛细管的筛选
将毛细管一端垂直置于水面下，毛细管内水柱不断上升，直至液面不变，测量上升液面的高度，选择水柱高度一致的硅烷化毛细管，记录数值后用高纯氮气吹干毛细管；
（4）点击反应与标准曲线的绘制
在离心管中依次加入光引发剂、乙醇和水、不同浓度的GSH标准溶液，混匀，配得点击反应液；将硅烷化毛细管吸入点击反应液，在紫外光下照射反应后用乙醇和超纯水分别超声清洗毛细管，然后用氮气吹干；将干燥的毛细管一端垂直放入水中，测量上升液面的高度，绘制GSH标准浓度与点击反应前后水柱变化高度的标准曲线;
（5）血样中GSH的检测
在离心管中依次加入光引发剂、乙醇和水、血样，混匀，制得样品混合液；将硅烷化毛细管吸入样品混合液，紫外光照下点击反应，用乙醇和超纯水分别超声清洗毛细管，然后用氮气吹干；将干燥的毛细管一端垂直放入水中，测量上升液面的高度，根据标准曲线，计算可得血样中GSH的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤（1）的毛细管长度为10cm，内径为0.1~0.4mm。
3.根据权利要求1所述的一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中的毛细管需放入真空干燥箱干燥，温度为50~80℃，时间为30~90 min。
4.根据权利要求1所述的一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤（2）中所述反应时间为1~3 h。
5.根据权利要求1所述的一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的乙烯基三乙氧基硅烷溶液中的溶剂为甲苯、或甲醇、或甲苯和甲醇的混合溶液。
6.根据权利要求1或3所述的一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤（3）中所述筛选的毛细管上升液面优选为3.4~3.6 cm。
7.根据权利要求6所述的一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤（4）、（5）中所述毛细管测量液面上升高度时将毛细管伸至在水的液面下方2~5mm。
8.根据权利要求1或3所述的一种基于毛细管内壁点击反应检测血液中还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤（4）、（5）中所述光引发剂为2,4,6-三甲基苯甲酰-二苯基氧化膦（TPO）、过氧化二异丙苯（DCP）、过氧化苯甲酸叔丁酯（TBPB）或2,2-二羟甲基丙酸（DMPA）；光引发剂的浓度为0.5~2.5 mg/mL；紫外灯的功率在5~30 W；引发波长为250~380 nm，照射距离为5~10 cm，照射时间为20~40 min；点击反应液中的溶剂为乙醇与水，比例为1:0.2~1。
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| CN113484475B (zh) * | 2021-07-08 | 2023-08-29 | 湖南科技大学 | 一种基于毛细现象的毛细管传感器的制备方法及其应用 |
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