CN111273035A - 定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒及其检测方法 - Google Patents

定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。所述试剂盒含有包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗、抗原标准品、破乳剂、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液；所述的包被有3ABC多抗的化学发光板为白色可拆卸的聚苯乙烯96孔板；所述酶标单抗为识别3B蛋白的酶标单抗9E2‑HRP；所述抗原标准品为含有10 ng/ml的3ABC，质量分数为0.2%的BSA和体积分数为0.05% prolin300；所述的破乳剂为正戊醇或正丁醇。本发明所述的试剂盒灵敏度高，能够对口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白进行快速定量。

Description

定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂 盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体，涉及定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒及其检测方法。
背景技术
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的，以感染猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病。FMDV是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，基因组大小为8400bp，编码4种结构蛋白(SPs：VP4，VP2，VP3和VP1)和8种非结构蛋白(NSPs：L，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D)，以及存在一些未裂解的前体，如3ABC。我国口蹄疫防控主要采取疫苗免疫、扑杀感染和可疑动物以及血清监测的综合性防控措施来控制口蹄疫的流行。理论上来说只有感染FMDV的动物，体内才存在NSPs抗体，而免疫动物体内不存在NSPs抗体。所以区分口蹄疫感染与免疫主要依赖于检测NSPs抗体。但由于抗原纯化工艺的问题，灭活疫苗抗原中仍会残留少量的NSPs。因此在疫苗免疫地区进行NSPs检测时，NSPs抗体不仅能在口蹄疫感染动物中检测到，而且也能在一些多次疫苗免疫的动物体内检测到。但国内目前还没有一种能够定量检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs的方法，因此急需一种定量检测方法来评价口蹄疫灭活疫苗中NSPs的残留。
为了控制口蹄疫的传播，世界动物卫生组织(OIE)规定在口蹄疫发生国家或疫苗免疫国家要想恢复口蹄疫无疫状态，必须通过检测动物体内无口蹄疫NSPs抗体来证明该国无口蹄疫循环。因此OIE对口蹄疫灭活疫苗的纯净度制定了准则，该准则需要口蹄疫生产厂家证明疫苗中缺乏NSPs的免疫原性，并推荐评价疫苗纯净度的方法。该评价方法具体是：至少用8头牛免疫两次，首免后21-30天后进行第二次免疫，第二次免疫后的30-60天检测牛体内非结构蛋白抗体。其中有一头检测为NSPs抗体阳性是可以接受的；若超过两头检测为NSPs抗体阳性，则这批疫苗是不合格；若两头检测为NSPs抗体阳性，厂家有权要求进行复检。然而，动物实验即费钱又费时，如果有一批疫苗不能满足纯度要求，厂家必须将整批苗弃掉。目前国内口蹄疫灭活疫苗的保存期多为1年，仅这一项NSPs残留评价就需2-3月，这给生产厂家带来很大负担。因此目前亟待一种定量检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs的试剂盒，为口蹄疫生产厂家和第三方检测机构对成品疫苗中NSPs含量进行检查，并获得疫苗中NSPs含量的证明。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒，目的二在于提供利用所述化学发光试剂盒进行口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的定量检测方法。本发明通过从众多破乳方法中筛选出能够用于免疫学检测的最佳破乳方法，并利用这些最佳破乳方法建立一种能够定量检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs残留的化学发光法。该方法灵敏度高，能够对口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白进行快速定量。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
定量检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs残留的化学发光试剂盒，包括包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗、抗原标准品、破乳剂、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液；
所述酶标抗体为偶联HRP的识别3B蛋白的单抗；
所述抗原标准品中含有10ng/ml的3ABC，质量分数为0.2％的BSA和体积分数为0.05％prolin300；
所述破乳剂为正戊醇或正丁醇；
所述血清稀释液为含有质量分数为1％酪蛋白、体积分数为0.05％Tween-20、体积分数为0.1％proclin-300、质量分数为2％蔗糖的磷酸盐缓冲液；
所述20×PBST为含有体积分数为1％Tween-20的0.2M磷酸盐缓冲液；
所述化学发光液包括A液和B液；所述A液中含有0.1mM的鲁米诺和0.07M发光增强剂IPP，所述B液为3mM的H2O2溶液。
进一步地，所述的包被有3ABC多抗的化学发光板为白色可拆卸的聚苯乙烯96孔板，每孔包被3ABC多抗，具体包被方法为：用磷酸盐缓冲液将3ABC多抗稀释为0.5μg/ml，100μl/孔，4℃过夜包被；PBST洗涤，向每孔中加入200μl封闭液进行封闭，37℃封闭2h；甩掉拍干后，于37℃干燥2h，装袋真空封闭，4℃保存。
更进一步地，所述封闭液为含有体积分数为0.05％Tween-20、质量分数为5％蔗糖、质量分数为1％鱼明胶、体积分数为0.1％proclin-300的磷酸盐缓冲液。
本发明还提供利用所述化学发光试剂盒定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的方法，具体步骤如下：
步骤一、标准品的稀释：用PBST将10ng/ml的抗原标准品稀释为若干个稀释度，PBST作为空白对照，用以建立标准曲线；
步骤二、破乳：将待检灭活疫苗进行破乳，得到待检样品；
步骤三、样品稀释：将待检样品用PBST 1:4稀释获得稀释样品；
步骤四、加样：将稀释后的抗原标准品、空白对照、待检样品以及稀释样品分别加入到化学发光板中，然后将化学发光板置于37℃反应30min，弃掉反应液，洗涤液洗板；
步骤五、加入检测抗体：用血清稀释液将酶标抗体做10,000倍稀释，然后向每孔中加入100μl，37℃反应30min，弃掉反应液，洗涤液洗板；
步骤六、检测：将化学发光液的A液和B液按照1:1的体积比混匀，每孔加入100μl，室温反应5min后用化学发光检测仪检测化学发光值；
步骤七、检测结果的判定：
首先计算抗原标准品若干个稀释度的平均值和空白对照的平均值，以稀释度作为X轴，所测得的化学发光值为Y轴，建立标准曲线和线性回归方程；
通过步骤六得出待检样品和稀释样品的CLIA值，待检样品中NSPs含量的计算方法有以下三种情况：
a、若待检样品和稀释样品的CLIA值均<10,000，那么待检样品中NSPs残留低于本试剂盒的检测限；
b、若待检样品和稀释样品的CLIA值均>10,000，那么将稀释样品的CLIA值乘以4后代入线性回归方程计算出待检样品中NSPs的含量；
c、若待检样品的CLIA值>10,000，而稀释样品的CLIA值<10,000，那么将待检样品的CLIA值代入线性回归方程计算出待检样品中NSPs的含量。
进一步地，步骤二所述破乳采用正戊醇破乳法、正丁醇破乳法或水浴破乳法。
更进一步地，所述正戊醇破乳法，即取待检灭活疫苗放入离心管中，然后按待检灭活疫苗和正戊醇的体积比为9.5:0.5-9:1的比例将正戊醇加入到待检灭活疫苗中，漩涡震荡30s，然后于4℃静置1-3h；然后以8000g离心10min，吸取下层水相，并将水相以8000g离心10min，作为待检样品。
更进一步地，所述正丁醇破乳法，即取待检灭活疫苗放入离心管中，然后按待检灭活疫苗和正丁醇的体积比为9.5:0.5的比例将正丁醇加入到待检灭活疫苗中，漩涡震荡30s，然后于4℃静置3h；然后以8000g离心10min，吸取下层水相，并将水相以8000g离心10min，作为待检样品。
更进一步地，所述水浴破乳法：取待检灭活疫苗放入离心管中，将所述离心管置于预设60℃水浴锅中0.5h，然后于4℃静置0.5h；然后以8000g离心10min，吸取下层水相，并将水相以8000g离心10min，作为待检样品。
有益效果：
1、本发明通过多方位试验筛选出能够用于口蹄疫灭活疫苗的最佳破乳方法，所述的破乳方法可以实现完全破乳，同时又对抗原抗体反应影响较小，能够较好地贴合所述化学发光试剂盒对口蹄疫灭活疫苗定量检测的要求，然后利用3ABC多抗作为捕获抗体，识别3B的单抗作为检测抗体，实现对口蹄疫灭活疫苗中NSPs残留的定量检测，针对性强，准确度高。
2、本发明所述试剂盒灵敏度高，检测限为0.02ng/ml，线性范围为0.1-10ng/ml，同时给出了更直观的结果判定的方法，使结果更精确。
3、由于本发明是用3ABC多抗作为捕获抗体，识别3B的单克隆抗体9E2-HRP作为检测抗体，因此检测疫苗中NSPs的量是3B、3AB以及3ABC之和。
附图说明
图1是以3ABC浓度为10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0ng/ml作为X轴，所测得的化学发光值为Y轴，建立的标准曲线图；
图2是用正戊醇破乳法、60℃水浴破乳法和沸水破乳法对三种乳化的抗原进行破乳的对比图；
图3是用正戊醇破乳法、正丁醇破乳法和60℃水浴破乳法对12种成品疫苗进行破乳的结果图；其中，Ⅰ为正戊醇破乳法，Ⅱ为正丁醇破乳法；Ⅲ为60℃水浴破乳法。具体实施方式
定量检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs残留的化学发光试剂盒，包括包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗(9E2-HRP)、抗原标准品、破乳剂、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液(A液和B液)。
所述的包被有3ABC多抗的化学发光板为白色可拆卸的聚苯乙烯96孔板，每孔包被3ABC多抗。具体是用磷酸盐缓冲液(CBS，pH 9.6)将3ABC多抗稀释为0.5μg/ml，100μl/孔，4℃过夜包被；PBST洗三次后，向每孔中加入200μl封闭液进行封闭，37℃封闭2h。甩掉拍干后，于37℃干燥2h，装袋真空封闭，4℃保存。
所述的封闭液为含有体积分数为0.05％Tween-20、质量分数为5％蔗糖、质量分数为1％鱼明胶、体积分数为0.1％proclin-300的磷酸盐缓冲液。
所述酶标单抗为9E2-HRP，该单抗识别3B蛋白。
所述的破乳剂为正戊醇和正丁醇，采用的破乳方法为正戊醇破乳法、正丁醇破乳法和60℃水浴破乳法。疫苗与正戊醇最适破乳比为9.5:0.5-9:1，最佳破乳时间为1-3h；疫苗与正丁醇的最适破乳比为9.5:0.5，最佳破乳时间为3h；水浴法最佳破乳温度为60℃，最佳破乳时间为0.5h。
所述的抗原标准品为含有10ng/ml的3ABC，质量分数为0.2％的BSA和体积分数为0.05％prolin300。
所述血清稀释液为含有质量分数为1％酪蛋白、体积分数为0.05％Tween-20、体积分数为0.1％proclin-300、质量分数为2％蔗糖的磷酸盐缓冲液；所述20×PBST为含有体积分数为1％Tween-20的0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)，经0.22μm滤膜除菌；所述化学发光A液含有0.1mM的鲁米诺和0.07M发光增强剂IPP，化学发光B液为3mM的H2O2溶液。
本发明方法的操作步骤为：
1、室温平衡：从4℃取出试剂盒，恢复到室温备用。
2、洗涤液准备：将20×PBST用去离子水或蒸馏水做20倍稀释即可。
3、标准品的稀释：在U型稀释板中，用PBST将10ng/ml的抗原标准品稀释为10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1ng/ml七个稀释度，PBST作为空白对照，即0ng/ml。
4、样品稀释：将待检疫苗样品先进行破乳，具体方法为：①正戊醇破乳法，即取适量疫苗放入离心管中，然后按疫苗：正戊醇为9.5:0.5-9:1的比例将正戊醇加入到疫苗中，漩涡震荡30s，然后于4℃静置1-3h。之后以8000g离心10min，用注射器小心吸取下层水相，并将水相以8000g离心10min，作为待检样品；②正丁醇破乳法，即取适量疫苗放入离心管中，然后按疫苗：正丁醇为9.5:0.5的比例将正丁醇加入到疫苗中，漩涡震荡30s，然后于4℃静置3h。之后以8000g离心10min，用注射器小心吸取下层水相，并将水相以8000g离心10min，作为待检样品；③水浴破乳法：取适量疫苗放入离心管中，将其置于预设60℃水浴锅中0.5h，然后于4℃静置0.5h，然后以8000g离心10min，用注射器小心吸取下层水相，并将水相以8000g离心10min，作为待检样品。将疫苗破乳后的待检样品直接向化学发光板中加入原液以及用PBST 1:4稀释后的样品(75μl PBST+25μl原液)，也可在稀释板上稀释后再取100μl加入到化学发光板中。
5、加样：将稀释后的抗原标准品、空白对照、待测样本以及1:4稀释的待检样本加入到化学发光板中，然后将化学发光板置于37℃反应30min。
6、洗板：弃掉反应液，每孔加入300μl的稀释后的洗涤液，洗涤5次，中间一次震荡洗涤30-60s，最后一次拍干。
7、加入检测抗体：用血清稀释液将9E2-HRP做10,000倍稀释，然后向每孔中加入100μl，37℃反应30min。
8、洗板：同步骤6。
9、检测：将化学发光A液和B液1:1混匀，每孔加入100μl，室温反应5min后用化学发光检测仪检测化学发光值。
检测结果的判定：
首先计算抗原标准品七个稀释度的平均值和空白对照的平均值，以10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0ng/ml作为X轴，所测得的化学发光值为Y轴，建立标准曲线和线性回归方程。
1、若原液和1:4稀释后的CLIA值均<10,000，那么待检样品中NSPs残留低于本方法的检测限；
2、若原液和1:4稀释后的CLIA值均>10,000，那么将1:4稀释后的CLIA值乘以4后代入回归方程计算出疫苗中NSPs的含量；
3、若原液的CLIA值>10,000，而1:4稀释后的CLIA值<10,000，那么将原液的CLIA值代入回归方程计算出疫苗中NSPs的含量。
本发明是检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs，首先需要对疫苗进行破乳，从化学破乳法(甲醇、正戊醇、正丁醇、异丙醇、三氯甲烷以及丙酮沉淀法)和物理破乳法(水浴法：40℃、50℃、55℃、60℃、70℃和沸水、冻融法)中筛选出能用于免疫学检测的最佳破乳方法，能够对疫苗中NSPs的残留进行定量检测，从而为第三方检测机构提供检测成品疫苗中NSPs的方法。由于该方法是用3ABC多抗作为捕获抗体，识别3B的单克隆抗体9E2-HRP作为检测抗体，因此检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs的量是3B、3AB以及3ABC之和。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1标准曲线的建立
将3ABC多抗稀释为0.5μg/ml包被板子作为捕获抗体，加入用PBST稀释为500，250，100，50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0ng/ml的NSP3ABC 100μl，37℃反应30min。用PBST洗涤5次后加入用血清稀释液10,000倍稀释的9E2-HRP，37℃反应30min。再用PBST洗涤5次，然后加入化学发光底物，5min后用化学发光分析检测仪器检测化学发光值，并建立标准曲线。如图1所示，当3ABC浓度为0.1-10ng/ml时，所测的化学发光强度与3ABC浓度呈线性关系，线性方程为：Y＝8252238X–67290。通过公式DL＝3.3SD/S计算最低检测限(其中SD为PBST对照的标准差，S为标准曲线的斜率)，检测限为0.02ng/ml。
实施例2对破乳方法的初步筛选
疫苗破乳是检测疫苗中NSPs的前提和关键步骤，选择的破乳方法必须能对疫苗进行完全破乳，并且对抗原抗体反应没有影响或影响较小。破乳方法分为化学破乳法和物理破乳法，其中化学破乳法是通过用不同比例的化学试剂(如甲醇、正戊醇、正丁醇、异丙醇、三氯甲烷以及丙酮等)对疫苗进行破乳，物理破乳法是通过用物理方法(如水浴法、冻融法)对疫苗进行破乳。破乳后利用上述检测NSPs方法筛选出最佳破乳方法、最佳破乳比例以及最佳破乳时间。
(1)试验1
将B、C、M抗原按1:1比例与佐剂Montanide ISA 206 VG使用乳化仪进行乳化，乳化后4℃过夜确保没有分层，然后加入破乳剂(正戊醇或正丁醇)进行破乳，具体破乳程序为：将破乳剂按一定比例加入疫苗中，漩涡震荡30s，然后于4℃静置1-3h。破乳完全后以8000g离心10min，吸取下层水相，再以8000g离心10min，作为待检样品。将未乳化的B、C、M抗原作为对照组，将乳化后再用正戊醇和正丁醇破乳的B、C、M作为实验组。各取100μl加入化学发光板中，重复3孔，后续步骤同实施例1。
实验结果见表1和表2，由表1和表2可知，正戊醇的最佳破乳比例为9.5:0.5-9:1，最佳破乳时间为1-3h。正丁醇的最佳破乳比例为9.5:0.5，最佳破乳时间为3h。
表1用不同比例的正戊醇和正丁醇破乳后所测的化学发光值
Figure BDA0002401986490000071
表2用正戊醇破乳1-5h、正丁醇破乳1h所测的化学发光值
Figure BDA0002401986490000072
(2)试验2
试验方法同上，所用抗原为D、E，按1:1比例与佐剂Montanide ISA 206 VG进行乳化后，加入正戊醇(9.5:0.5，9:1)、正丁醇(9:1)、甲醇(9:1，7:3)、异丙醇(9:1，8:2)进行破乳，破乳后于4℃静置2h。
实验结果表明：疫苗与甲醇比为9:1和7:3均不能完全破乳；疫苗与异丙醇比为9:1和8:2时可以对疫苗进行破乳，但对抗原抗体反应影响比较大(表3)。
表3用不同比例的正戊醇、正丁醇、异丙醇破乳后的化学发光值
Figure BDA0002401986490000081
(3)试验3
试验方法同上，将成品疫苗B、D、J用水浴法(40℃、50℃、55℃、60℃、70℃)、冻融法、丙酮沉淀法以及用三氯甲烷进行破乳。其中水浴法的破乳程序为：取适量疫苗放入离心管中，然后将其置于预设水浴锅中，破乳完全后将其于4℃静置0.5h，然后以8000g离心10min，观察破乳情况，确定最佳破乳温度以及破乳时间。冻融法的破乳程序为：将适量疫苗置于-80℃冰箱，冷冻3h后取出，室温下融化后再冷冻3h，共冻融3次。最后一次融化后，以8000g离心10min，观察破乳情况。丙酮沉淀法的破乳程序为：按丙酮与疫苗比为9:1加入离心管中，漩涡震荡后置于室温15min，然后以10000g离心10min，弃上清，沉淀用预冷丙酮洗两次，室温干燥5min后，加入疫苗量一半的ddH20溶解沉淀。上述破乳法破乳后，水相位于下层。因此破乳后用注射器吸取下层水相，再以8000g离心10min，作为待检样品。三氯甲烷破乳后水相位于上层，其破乳程序为：将三氯甲烷和疫苗样品以1:1混合，漩涡震荡后以8000g离心10min，取上层水相作为待检样品。
实验结果表明：50℃及50℃以下破乳不完全；55℃破乳最低需要1h，但下层水相比较浑浊，破乳不完全；60℃30min就能实现完全破乳；70℃15min就能实现完全破乳。冻融3次疫苗破乳不完全。三氯甲烷可以对疫苗进行破乳，但对抗原抗体反应影响比较大(表4)。
表4用不同比例的正戊醇和正丁醇破乳后的化学发光值
Figure BDA0002401986490000082
综上表明，甲醇、三氯甲烷、丙酮沉淀破乳法、冻融法以及55℃和55℃以下水浴法不能破乳或破乳后对免疫学反应有影响。最终确定最佳破乳方法有正戊醇破乳法、正丁醇破乳法以及水浴破乳法(60℃)。其中正戊醇的最佳破乳比例为9.5:0.5-9:1，最佳破乳时间为1-3h；正丁醇的最佳破乳比例为9.5:0.5，最佳破乳时间为3h；水浴破乳最佳破乳温度为60℃，最佳破乳时间为30min。
实施例3最佳破乳方法以及最佳稀释倍数的确定
由于口蹄疫灭活抗原中含有一些成分以及破乳剂的残留都会影响抗原抗体反应，因此将待检样品按1:1比例与佐剂Montanide ISA 206 VG进行乳化后，再用60℃水浴破乳法、沸水破乳法、正戊醇破乳法(疫苗：正戊醇＝9.5:0.5)进行破乳，破乳后吸取下层水相作为待检样本。将疫苗破乳后的待检样本1:1，1:2，1:4，1:8梯度稀释后所测的CLIA值与抗原梯度稀释后所测的CLIA值进行对比，从而确定最佳稀释度。
用60℃水浴破乳法、沸水破乳法、正戊醇破乳法将乳化的抗原进行破乳后，下层水相的体积基本一样(图2)。通过将破乳后的待检样本梯度稀释后所测的CLIA值与抗原梯度稀释后所测的CLIA值进行对比，最终确定最佳破乳方法为60℃水浴破乳法和正戊醇破乳法，最佳稀释倍数为1:4。尽管使用最佳破乳方法，但对疫苗破乳后所测的CLIA值仍比相应抗原的CLIA小，并且降低不成固定比例(降低1.5倍-3.5倍)。但总体上可以看出抗原中NSPs含量高，相应的疫苗破乳后NSPs也高(表5)。
表5最佳破乳方法以及最佳稀释倍数的确定
Figure BDA0002401986490000091
实施例4检测口蹄疫成品疫苗中NSPs的实施
将五家公司的成品疫苗(A-F、G-H、I、J、K)用正戊醇破乳法、正丁醇破乳法和60℃水浴破乳法破乳后的待测样本、1:4稀释的待检样本和稀释后的抗原标准品加入到包被有3ABC多抗的化学发光板中，然后将化学发光板置于37℃反应30min。用PBST洗涤5次后加入用血清稀释液10,000倍稀释的9E2-HRP，37℃反应30min。再用PBST洗涤5次，然后加入化学发光底物，5min后用化学发光分析检测仪器检测化学发光值。计算口蹄疫成品疫苗中NSPs的含量(表6)。
成品疫苗用正戊醇和正丁醇破乳后，下层水相的体积基本相同，而用60℃水浴法破乳后，个别疫苗的下层水相体积比较少(图3)。但最终检测NSPs的含量基本一致。因此，综合破乳情况以及检测破乳后NSPs的含量，最终确定最佳破乳方法为正戊醇破乳法、正丁醇破乳法和水浴破乳法。
表6用三种破乳法检测12种成品疫苗中NSPs的残留
Figure BDA0002401986490000101
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒，其特征在于：包括包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗、抗原标准品、破乳剂、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液；
所述酶标抗体为标记HRP的识别3B蛋白的单抗；
所述抗原标准品中含有10 ng/ml的3ABC，质量分数为0.2%的BSA和体积分数为0.05%prolin300；
所述破乳剂为正戊醇或正丁醇；
所述血清稀释液为含有质量分数为1%酪蛋白、体积分数为0.05% Tween-20、体积分数为0.1% proclin-300、质量分数为2%蔗糖的磷酸盐缓冲液；
所述20×PBST为含有体积分数为1% Tween-20的0.2M 磷酸盐缓冲液；
所述化学发光液包括A液和B液；所述A液中含有0.1 mM的鲁米诺和0.07 M发光增强剂IPP，所述B液为3 mM的H2O2溶液。
2.根据权利要求1所述的定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒，其特征在于：所述的包被有3ABC多抗的化学发光板为白色可拆卸的聚苯乙烯96孔板，每孔包被3ABC多抗，具体包被方法为：用磷酸盐缓冲液将3ABC多抗稀释为0.5 μg/ml，100 μl/孔，4℃过夜包被；PBST洗涤，向每孔中加入200μl封闭液进行封闭，37℃封闭2 h；甩掉拍干后，于37℃干燥2 h，装袋真空封闭，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含有体积分数为0.05% Tween-20、质量分数为5%蔗糖、质量分数为1% 鱼明胶、体积分数为0.1% proclin-300的磷酸盐缓冲液。
4.利用权利要求1-3任意一种所述的化学发光试剂盒定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一、标准品的稀释：在U型稀释板中，用PBST将10 ng/ml的抗原标准品稀释为若干个稀释度，PBST作为空白对照，用以建立标准曲线；
步骤二、破乳：将待检灭活疫苗进行破乳，得到待检样品；
步骤三、样品稀释：将待检样品用PBST 1:4稀释获得稀释样品；
步骤四、加样：将稀释后的抗原标准品、空白对照、待检样品以及稀释样品分别加入到化学发光板中，然后将化学发光板置于37℃反应30 min，弃掉反应液，洗涤液洗板；
步骤五、加入检测抗体：用血清稀释液将酶标抗体做10,000倍稀释，然后向每孔中加入100 μl，37℃反应30 min，弃掉反应液，洗涤液洗板；
步骤六、检测：将化学发光液的A液和B液按照1:1的体积比混匀，每孔加入100 μl，室温反应5 min后用化学发光检测仪检测化学发光值；
步骤七、检测结果的判定：
首先计算抗原标准品若干个稀释度的平均值和空白对照的平均值，以稀释度作为X轴，所测得的化学发光值为Y轴，建立标准曲线和线性回归方程；
通过步骤六得出待检样品和稀释样品的CLIA值，待检样品中NSPs含量的计算方法有以下三种情况：
a、若待检样品和稀释样品的CLIA值均<10,000，那么待检样品中NSPs残留低于本试剂盒的检测限；
b、若待检样品和稀释样品的CLIA值均>10,000，那么将稀释样品的CLIA值乘以4后代入线性回归方程计算出待检样品中NSPs的含量；
c、若待检样品的CLIA值>10,000，而稀释样品的CLIA值<10,000，那么将待检样品的CLIA值代入线性回归方程计算出待检样品中NSPs的含量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤二所述破乳采用正戊醇破乳法、正丁醇破乳法或水浴破乳法。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述正戊醇破乳法，即取待检灭活疫苗放入离心管中，然后按待检灭活疫苗和正戊醇的体积比为9.5:0.5-9:1的比例将正戊醇加入到待检灭活疫苗中，漩涡震荡30s，然后于4℃静置1-3 h；然后以8000 g离心10 min，吸取下层水相，并将水相以8000 g离心10 min，作为待检样品。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述正丁醇破乳法，即取待检灭活疫苗放入离心管中，然后按待检灭活疫苗和正丁醇的体积比为9.5:0.5的比例将正丁醇加入到待检灭活疫苗中，漩涡震荡30s，然后于4℃静置3 h；然后以8000 g离心10 min，吸取下层水相，并将水相以8000 g离心10 min，作为待检样品。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述水浴破乳法：取待检灭活疫苗放入离心管中，将所述离心管置于预设60℃水浴锅中0.5 h，然后于4℃静置0.5 h；然后以8000 g离心10 min，吸取下层水相，并将水相以8000 g离心10 min，作为待检样品。
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