CN116087509A - 化学发光竞争elisa在o型fmdv抗体检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及预防兽医学技术领域，具体为化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用，以鼠整联蛋白为抗原捕获试剂，O型口蹄疫病毒抗原为包被抗原，酶标单抗为竞争抗体，鲁米诺为化学发光检测试剂，首次建立一种高特异性、高灵敏性、准确快速的基于鼠整联蛋白的O型口蹄疫病毒抗体化学发光竞争ELISA，且该方法可广泛用于临床血清样品的O型FMDV抗体检测。

Description

化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用
技术领域
本发明涉及预防兽医学技术领域，具体为化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的猪、牛、羊等偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病，给畜牧业带来了严重的危害和经济损失，FMDV分为7个血清(O型、A型、亚洲Ⅰ型、C型、南非Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型),其中流行最广泛的为O型血清型，FMDV可以通过多种途径感染动物，是动物及家畜产品国际贸易最大的羁绊；
准确检测FMDV的血清型和隐性带毒动物是防控该病的首要环节；同时，使用FMD灭活疫苗防控该病的主要手段，因此可以通过建立检测FMDV抗体的方法来评价FMD疫苗的免疫状态、血清流行病学调查和非免疫地区的疫情监测，FMDV属于核糖核酸科、口蹄疫病毒属，是单股正链的RNA病毒，编码四个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)组成衣壳以及10个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D、3AB、3ABC、L)参与宿主的识别与病毒的复制，FMDV结构蛋白VP1有一个高度保守的RGD氨基酸序列，可与细胞表面的整联蛋白特异结合，目前，病毒中和实验(VNT)、液相阻断ELISA和固相竞争ELISA是WOAH推荐的口蹄疫抗体的检测方法，VNT由于操作繁琐且需要在特定的生物实验室进行，因此ELISA方法在临床检测中更为实用；
但传统的ELISA操作时间较长，难以满足在临床中的大量快速准确的检测，化学发光ELISA是基于免疫反应的原理与化学发光检测技术相结合的一种新技术，与普通ELISA相比，化学发光ELISA具有特异性强、检测线性范围宽、检测效率高、操作简便、反应时间短、可实现高通量和自动化检测等优点，为了进一步提高O型FMDV抗体检测的敏感性、特异性，同时简化反应步骤，缩短反应时间，本研究以鼠整联蛋白αvβ6作为捕获试剂，O型FMDV146s作为包被抗原，O型特异性的单克隆抗体作为竞争抗体，鲁米诺作为发光底物，结合化学发光ELISA技术，建立一种高特异性、高灵敏性、准确快速的基于鼠整联蛋白的O型口蹄疫病毒抗体化学发光竞争ELISA，且该方法可广泛用于临床血清样品的O型FMDV抗体检测。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用，具备高特异性、高灵敏性、准确快速的优点，来解决上述问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：检测化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用；包括以下步骤：S1、确定鼠整联蛋白最佳包被浓度；S2、确定最佳反应条件；S3、判断标准的确定。
优选的，所述S1为确定鼠整联蛋白最佳包被浓度，当鼠整联蛋白αvβ6的浓度为0.125ug/ml时，N/P值最大，确定其为最佳包被浓度。
优选的，所述S2为确定最佳反应条件，当血清和酶标单抗的稀释液为2％BSA时，N/P值最大；当抗原的稀释度为1:30时，N/P值最大，因此确定O型FMDV146S抗原的最佳稀释度为1:30；抗原在室温和37℃条件下孵育15、30、45和60min阳性抑制率(PI)差距不大，为了确定最短的抗原孵育时间，继续筛选室温条件下5、10和15min，结果显示室温条件下孵育5、10和15min阳性PI差距不大，综合考虑选择抗原孵育条件为室温下孵育10min；当酶标单抗的浓度为0.125ug/ml，血清样品稀释倍数为1:20时，N/P值最大；血清与酶标单抗在室温和37℃条件下孵育10、20、30和60min阳性抑制率(PI)差距不大，为了确定最短的血清与酶标单抗作用时间，继续筛选室温条件下5、10、15和30min，结果显示，血清与酶标单抗在室温条件下反应5、10、15和30min阳性PI差距不大，综合考虑选择血清与酶标单抗反应条件为室温下孵育10min。
优选的，所述S3为判断标准的确定，利用medcalc软件绘制ROC曲线和背景交互点图来确定本研究建立的方法检测牛、猪以及羊血清的cut-off值、诊断敏感性和诊断特异性，在检测牛血清时，当PI为48.8％时，诊断敏感性为98.88％，诊断特异性为98.31％。
一种基于鼠整联蛋白的O型口蹄疫病毒抗体化学发光竞争ELISA，包括抗原捕获试剂、包被抗原、竞争抗体、化学发光检测试剂。
优选的，所述抗原捕获试剂为鼠整联蛋白。
优选的，所述包被抗原为O型口蹄疫病毒抗原。
优选的，所述竞争抗体为酶标单抗。
优选的，所述化学发光检测试剂为鲁米诺。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用，具备以下有益效果：
以鼠整联蛋白为抗原捕获试剂，O型口蹄疫病毒抗原为包被抗原，酶标单抗为竞争抗体，鲁米诺为化学发光检测试剂，首次建立一种高特异性、高灵敏性、准确快速的基于鼠整联蛋白的O型口蹄疫病毒抗体化学发光竞争ELISA，且该方法可广泛用于临床血清样品的O型FMDV抗体检测。
附图说明
图1为整联蛋白包被浓度的筛选结果的示意图。
图2为封闭条件的筛选结果的示意图。
图3为抗原孵育条件的筛选结果的示意图，(a)抗原在室温和37℃条件下孵育15、30、45和60min的阳性抑制率；(b)抗原孵育5、10和15min的阳性、阴性抑制率。
图4为酶标单抗及血清浓度的筛选结果的示意图，A.酶标单抗浓度的确定；B.血清浓度的确定。
图5为抗原孵育条件的筛选结果的示意图，(a)血清与酶标单抗在室温和37℃条件下孵育10、20、30和60min的阳性抑制率；(b)血清与酶标单抗在室温条件下孵育5、10、15和30min的阳性、阴性抑制率。
图6为ROC曲线及背景交互点图的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
检测化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用；包括以下步骤：S1、确定鼠整联蛋白最佳包被浓度；S2、确定最佳反应条件；S3、判断标准的确定。
一种基于鼠整联蛋白的O型口蹄疫病毒抗体化学发光竞争ELISA，其特征在于，包括抗原捕获试剂、包被抗原、竞争抗体、化学发光检测试剂，其中，抗原捕获试剂为鼠整联蛋白，包被抗原为O型口蹄疫病毒抗原，竞争抗体为酶标单抗，化学发光检测试剂为鲁米诺。
如图1所示，当鼠整联蛋白αvβ6的浓度为0.125ug/ml时，N/P值最大，确定其为最佳包被浓度。
如图2所示，当血清和酶标单抗的稀释液为2％ BSA时，N/P值最大；当抗原的稀释度为1:30时，N/P值最大，因此确定O型FMDV 146S抗原的最佳稀释度为1:30；如图3a所示，抗原在室温和37℃条件下孵育15、30、45和60min阳性抑制率(PI)差距不大，如图3b所示，为了确定最短的抗原孵育时间，继续筛选室温条件下5、10和15min，结果显示室温条件下孵育5、10和15min阳性PI差距不大，综合考虑选择抗原孵育条件为室温下孵育10min；如图4所示，当酶标单抗的浓度为0.125ug/ml，血清样品稀释倍数为1:20时，N/P值最大；如图5a所示，血清与酶标单抗在室温和37℃条件下孵育10、20、30和60min阳性抑制率(PI)差距不大，为了确定最短的血清与酶标单抗作用时间，继续筛选室温条件下5、10、15和30min，图5b所示，血清与酶标单抗在室温条件下反应5、10、15和30min阳性PI差距不大，综合考虑选择血清与酶标单抗反应条件为室温下孵育10min。
如图6所示，利用medcalc软件绘制ROC曲线和背景交互点图来确定本研究建立的方法检测牛、猪以及羊血清的cut-off值、诊断敏感性和诊断特异性，在检测牛血清时，当PI为48.8％时，诊断敏感性为98.88％，诊断特异性为98.31％。
综上所述，在本发明中以鼠整联蛋白为抗原捕获试剂，O型口蹄疫病毒抗原为包被抗原，酶标单抗为竞争抗体，鲁米诺为化学发光检测试剂，首次建立一种高特异性、高灵敏性、准确快速的基于鼠整联蛋白的O型口蹄疫病毒抗体化学发光竞争ELISA，且该方法可广泛用于临床血清样品的O型FMDV抗体检测。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.检测化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1、确定鼠整联蛋白最佳包被浓度；S2、确定最佳反应条件；S3、判断标准的确定。
2.一种基于鼠整联蛋白的O型口蹄疫病毒抗体化学发光竞争ELISA，其特征在于，包括抗原捕获试剂、包被抗原、竞争抗体、化学发光检测试剂。
3.根据权利要求2所述的化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用，其特征在于，所述抗原捕获试剂为鼠整联蛋白。
4.根据权利要求2所述的化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用，其特征在于，所述包被抗原为O型口蹄疫病毒抗原。
5.根据权利要求2所述的化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用，其特征在于，所述竞争抗体为酶标单抗。
6.根据权利要求2所述的化学发光竞争ELISA在O型FMDV抗体检测中的应用，其特征在于，所述化学发光检测试剂为鲁米诺。
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