WO2023248624A1

WO2023248624A1 - タンパク質の検出および定量のための方法、装置及びプログラム

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Publication number: WO2023248624A1
Application number: PCT/JP2023/016945
Authority: WO
Inventors: 典彦直野; 修坂本; 弘泰武居
Original assignee: アイポア株式会社
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2023-12-28
Also published as: JP2024002665A

Abstract

抗原／抗体を含む生体試料を阻止サイズｍを有するフィルタで濾過した濾過済試料と、抗原／抗体に結合する抗体／抗原をその表面に付着させた粒子径ｄを有する修飾粒子と、第１の電解液とを混合して計測対象試料を作成し、穴径Ｄの細孔を有する隔壁によって隔てられた2つのチャンバのうちの一方に前記計測対象試料を充填し、第２の電解液を他方のチャンバに充填して前記細孔を通じて前記２つのチャンバを電気的に導通させ、前記２つのチャンバが各々有する２つの電極の間に前記細孔を経由してイオン電流を流した状態で、前記修飾粒子が前記細孔を通過するたびに生じる前記イオン電流の過渡変化をパルス波形群として計測し、前記パルス波形群に基づいて前記生体試料中における抗原／抗体の有無若しくは濃度を推定する。ここで、前記阻止サイズｍは抗原／抗体のサイズに応じて定まる下限値以上かつ穴径Ｄの１／２以下であり、かつ、修飾粒子の径ｄは穴径Ｄの１／５以上かつＤ未満である。

Description

タンパク質の検出および定量のための方法、装置及びプログラム

本発明は、試料中に含まれるタンパク質の検出および定量を行うための方法、装置、及びプログラムに関する。

タンパク質は生体を構成する基本要素であるため、その検出や定量は、生体に係る研究の基本的な手段である。また、各種タンパク質の検出や定量は様々な疾病の臨床検査に広く用いられている。特に、悪性腫瘍、脳神経疾患、膠原病などのさまざまな疾患の極微量マーカーを簡便、低コストかつ頻回で検査することができれば、早期発見による重症化の防止や患者のクオリティ・オブ・ライフの向上に大きな効果を発揮する。

微量タンパク質の検出や定量には、抗体や抗原を化学発光物質で標識して吸光度や発光を計測するＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓｅｙ）、ＣＬＥＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などが広く使われている。

このような化学発光物質を利用する方法を発展させ、ナノサイズのウェルと抗体修飾ビーズを組み合わせて高感度化を実現する、所謂デジタルＥＬＩＳＡ等の高感度イムノアッセイ技術が提案されている（特許文献１）。しかしこのような方法は、計測のためのプロトコルが複雑で、また大型かつ精密な光学計測系を必要とするため、計測装置が高額である。このため、低コストで簡便な頻回の臨床検査の手段として広く使われていない。

上記のような従来の技術の課題は、その計測手順の複雑さとかかる時間である。たとえばＥＬＩＳＡの場合、抗体固相化、ブロッキング、インキュベーションなど、処理の度に洗浄を繰り返す必要がある。１次抗体固相化の際の吸着、目的タンパク質の抗体以外への吸着、検出用抗体の抗原以外への吸着や基質への抗体／抗原残りなどがすべて、吸光度計測時のノイズとなり、対象抗原の検出や定量における、感度・特異度や定量の直線性に大きな悪影響を及ぼす。これを防ぐためには、度重なる洗浄が不可欠であり、これが検査時間の短縮やコスト低減を阻んでいる。

一方、ナノサイズのウェルと光学系を使わずに、直接タンパク質を１つずつ観察する技術が提案されている（非特許文献１）。ここでは、電解液中のナノサイズの粒子を電気泳動で駆動し、かかる粒子の大きさに近い細孔を通過する際の、電気抵抗の過渡変化を観測する、所謂細孔電気抵抗法（特許文献２）が用いられる。しかし、生体試料にはタンパク質、細胞やその破片、場合によってはウイルスや細菌などの病原体などが無数に含まれている。このため、対象抗原の細孔通過により計測されるパルス波形は、上記のような計測対象としない微粒子によるものがほとんど、という状況になる。上記ＥＬＩＳＡの場合は、固相化した抗原または抗体に対する特異的な結合を利用して、それ以外のノイズ源となる微粒子をすべて洗い流すことで、ノイズの問題を回避していた。また、上記細孔電気抵抗法にあっては、計測後のデータ処理において、パルス波形毎に確率的な演算を施すことで、ノイズ源となる微粒子を解析対象データより除外する試みも報告されている（特許文献３）。

米国特許第８２３６５７４号明細書米国特許第９７２６６３６号明細書特許第６９８５６８７号公報

Yusko, Erik C., et al. "Real-time shape approximation and fingerprinting of single proteins using a nanopore." Nature nanotechnology 12.4 (2017): 360-367.

しかし、細孔電気抵抗法によるタンパク質の検出では、フィルタを用いて濾過したとしても、対象のタンパク質と同程度の大きさの他のタンパク質や夾雑微粒子はフィルタを通過するため、対象のタンパク質のみを選択的に細孔電気抵抗法における細孔通過の対象として選別する方法はない。また、タンパク質の細孔通過によるパルス波形は極めて微小であり、これを計測後のデータ処理によってノイズパルスと分離することは困難である。

ＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイと化学発光を利用した従来の技術であっても、細孔電気抵抗法を用いた技術であっても、実用的に意味のあるタンパク質検出や定量の高感度化の成否は、検出や定量の対象となるタンパク質以外に由来するノイズ信号を、簡便かつ低コストで効率よく除去することは、従来技術では実現できていなかった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、夾雑物を完全に除去することなく、夾雑物の多い臨床検査に必要とされるタンパク質（又は抗体若しくは抗原）の高感度、安価、迅速かつ簡便な検出や定量を実現する。すなわち本発明では下記の態様を提供できる。

態様1.
生体から採取した生体試料中における検出対象である抗原若しくは抗体の有無若しくは濃度を推定するための方法であって、
前記生体試料を、阻止サイズｍを有するフィルタで濾過して濾過済試料を作成し、
前記抗原に結合する抗体をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗体修飾粒子、又は前記抗体に結合する抗原をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗原修飾粒子と、
前記濾過済試料と、
第１の電解液と
を混合して計測対象試料を作成し、
穴径Ｄの細孔を有する隔壁によって隔てられた2つのチャンバが前記細孔を通じて疎通し、かつ前記2つのチャンバの各々の中に電極を有する構造のセンサの、前記2つのチャンバのうちの一方に前記計測対象試料を充填し、
第２の電解液を前記センサの有する前記２つのチャンバの他方に充填して前記細孔を通じて前記２つのチャンバを電気的に導通させ、
前記２つのチャンバが各々有する２つの電極の間に電圧を印加して、前記２つの電極の間に前記細孔を経由してイオン電流を流した状態で、前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子が前記細孔を通過するたびに生じる前記イオン電流の過渡変化を、複数のパルス波形から成るパルス波形群として計測し、
前記パルス波形群を解析することによって、前記生体試料中における検出対象の抗原若しくは抗体の有無若しくは濃度を推定する
ことを含み、
前記阻止サイズｍは検出対象である抗原若しくは抗体のサイズに応じて定まる下限値以上かつ前記穴径Ｄの１／２以下であり、かつ、
前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄは前記穴径Ｄの１／５以上かつＤ未満である
ことを特徴とする方法。

態様2.
前記阻止サイズｍは２ｎｍ以上かつ前記穴径Ｄの１／１０以下であり、かつ、
前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄ₁は前記穴径Ｄの１／５以上かつＤ未満である
ことを特徴とする、態様１に記載の方法。

態様3.
前記イオン電流の過渡変化を、複数のパルス波形から成るパルス波形群として計測することによって、前記生体試料中における前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の凝集状態を計測することを特徴とする、態様1又は２に記載の方法。

態様4.
さらに
前記パルス波形群の中から、除外閾値以上のピーク電流を有する選択パルス波形を抽出し、
前記選択パルス波形群を解析することによって、前記生体試料中における検出対象の抗原若しくは抗体の有無の検出又は濃度の推定値を計算すること
を含み、
前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄは前記穴径Ｄ未満であり、かつ前記阻止サイズｍは前記径ｄの１／２以下であることを特徴とする、態様１に記載の方法。

態様5.
さらに
前記除外閾値を、前記濃度推定値が生体試料中に含まれる検出対象の抗原若しくは抗体の真値と近くなるように再帰的に求めること
を含む、態様４記載の方法。

態様6.
前記第１の電解液と前記第２の電解液は、その組成が異なることを特徴とする態様１～５のいずれかに記載の方法。

態様7.
前記第１の電解液と前記第２の電解液は、その組成が同じであることを特徴とする態様１～５のいずれかに記載の方法。

態様8.
生体から採取した生体試料中における検出対象である抗原若しくは抗体の有無若しくは濃度を推定するための装置であって、
　阻止サイズｍを有するフィルタと、
　穴径Ｄの細孔を有する隔壁によって隔てられた2つのチャンバが前記細孔を通じて疎通し、かつ前記2つのチャンバの各々の中に電極を有する構造のセンサと、
　ネットワークを介してコンピュータに接続するインターフェイスと
を含み、
前記抗原に結合する抗体をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗体修飾粒子、又は前記抗体に結合する抗原をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗原修飾粒子と、
前記フィルタによって濾過された濾過済試料と、
第１の電解液と
を混合して作成される計測対象試料を、前記2つのチャンバのうちの一方に前記計測対象試料を充填するように構成され、
第２の電解液を前記センサの有する前記２つのチャンバの他方に充填して前記細孔を通じて前記２つのチャンバを電気的に導通させるように構成され、
前記２つのチャンバが各々有する２つの電極の間に電圧を印加して、前記２つの電極の間に前記細孔を経由してイオン電流を流した状態で、前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子が前記細孔を通過するたびに生じる前記イオン電流の過渡変化を、複数のパルス波形から成るパルス波形群として計測してデータを取得し、前記インターフェイスを介して前記データをコンピュータに送信するように構成され、
前記阻止サイズｍは、検出対象である抗原若しくは抗体のサイズに応じて定まる下限値以上かつ前記穴径Ｄの１／２以下であり、かつ前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄは、前記穴径Ｄの１／５以上かつ前記穴径Ｄ未満である
ことを特徴とする、装置。

態様9.
前記阻止サイズｍは、前記穴径Ｄの１／１０以下である、態様８に記載の装置。

態様10.
隔壁によって隔てられた2つのチャンバが細孔を通じて疎通し、前記2つのチャンバの各々の中に電極を有する構造のセンサとネットワークを介して接続されるように構成されたプロセッサを有するコンピュータにおいて、前記プロセッサが実行することで下記工程を実施するように構成されたコンピュータ可読命令を含むプログラムであって、
生体試料を、阻止サイズｍを有するフィルタで濾過して濾過済試料を作成する工程と、
抗原に結合する抗体をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗体修飾粒子、又は前記抗体に結合する抗原をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗原修飾粒子と、
前記濾過済試料と、
第１の電解液と
を混合して計測対象試料を作成する工程と、
穴径Ｄの細孔を有する隔壁によって隔てられた2つのチャンバが前記細孔を通じて疎通し、かつ前記2つのチャンバの各々の中に電極を有する構造のセンサの、前記2つのチャンバのうちの一方に前記計測対象試料を充填する工程と、
第２の電解液を前記センサの有する前記２つのチャンバの他方に充填して前記細孔を通じて前記２つのチャンバを電気的に導通させる工程と、
前記２つのチャンバが各々有する２つの電極の間に電圧を印加して、前記２つの電極の間に前記細孔を経由してイオン電流を流した状態で、前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子が前記細孔を通過するたびに生じる前記イオン電流の過渡変化を、複数のパルス波形から成るパルス波形群として計測する工程と、
前記パルス波形群を解析することによって、前記生体試料中における検出対象の抗原若しくは抗体の有無若しくは濃度を推定する工程
とを実施し、
前記阻止サイズｍは、検出対象である抗原若しくは抗体のサイズに応じて定まる下限値以上かつ前記穴径Ｄの１／２以下であり、かつ前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄは、前記穴径Ｄの１／５以上かつ前記穴径Ｄ未満である
ことを特徴とする、プログラム。

本発明により、タンパク質（又は抗体若しくは抗原）の高感度、安価、迅速かつ簡便な検出や定量が可能になるという効果が得られる。

本発明において利用するセンサの、デバイス構造の一例を示す。パルス波形の計測に用いる細孔の電子顕微鏡画像を示す。イオン電流の過渡変化の例を示す。本発明の或る実施形態に基づいた、生体試料中の抗原を検出または定量する原理と手順の概要を説明するチャートである。抗体修飾粒子作成処理手順の例を示すチャートである。計測対象試料でチャンバを充填した状態を模式的に表す。各濃度での計測について、パルス波形のピーク電流ごとのパルス数のヒストグラムを示す。ピーク電流０．７ｎＡ以上のパルス波形を、対象抗原を介した抗体修飾粒子凝集塊として、そのパルス数の全パルスに占める割合を示す。センサの細孔に様々な粒径のポリスチレン標準ビーズを通過させたときの、平均パルス高さを示す。電気抵抗細孔法の従来の方法により生体試料を計測した場合のパルス波形を、従来技術に係る方法と本発明に係る方法とで比較したものである。インフルエンザA型（Ｎ１Ｈ１　Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）のＭＤＣＫ細胞による培養上清を用い、インフルエンザA型のNタンパク質を対象抗原として計測する方法を説明する図である。本発明に係る計測前処理の手順を説明するチャートである。インフルエンザA型のＭＤＣＫ細胞による培養上清を、インフルエンザA型のNタンパク質を対象抗原として抽出、１００ｋＤａフィルタにより濾過した後、８０ｎｍの抗体修飾粒子を混和、インキュベートするという手順で計測前処理を実施し、さらに３０５ｎｍの直径の細孔を有するセンサで計測した結果を示す。培養インフルエンザウイルス試料に計測前処理を施した後に、計測を行ったときのピーク電流の分布である。抗体修飾粒子に抗原が結合した状態のパルス波形の別の例を示す。本発明における阻止サイズの定量方法を説明する図である。

本発明は、生体試料中の抗原の検出や定量を行うことができる。また生体試料中の抗体の検出や定量を行うこともできる。前者の場合は、検出や定量の対象となる抗原（以下「対象抗原」という）と特異的に結合する抗体でその表面を修飾した抗体修飾粒子を用いる。後者の場合は検出や定量の対象となる抗体（以下「対象抗体」という）と特異的に結合する抗原でその表面を修飾した抗原修飾粒子を用いる。抗体修飾粒子を用いて対象抗原の検出または定量を行う場合、抗原修飾粒子を用いて対象抗体の検出または定量を行う場合、ともに本発明の手続きと原理は同様である。以下では記載を徒に長くしないようにするため、前者、すなわち抗体修飾粒子を使って対象抗原の検出または定量する例について説明する。

また本発明の別の実施形態では、生体試料中の抗体の検出や定量を行うこともできる。すなわち、前段の説明の抗原を抗体、また抗体を抗原と読み替えることによって、この別の実施形態を理解することができるであろう。以下都度説明は繰り返さないが、本明細書中の各記載は、矛盾しないかぎりにおいて適宜上述の読み替えが可能であることに留意されたい。

本発明では、検出や定量の対象となるタンパク質（以下、「対象抗原」または略して単に「抗原」ともいう）に特異的に結合する抗体でその表面を修飾した抗体修飾粒子が、対象抗原を介して結合する凝集状態、抗体修飾粒子への抗原の付着、または抗体修飾粒子への抗原を介した２次抗体の付着状態等を、従来のような光学的方法によらず、図１に示すようなセンサを用いて計測する。

図1（ａ）に、本発明において利用するセンサの断面の一例を示す。センサ１００は２つのチャンバ１１０および１２０が、隔壁１４１によって隔てられ、かつ隔壁１４１に設けられた細孔１４０を経由して接続される断面構造を有している。２つのチャンバには各々電極１１２および１２２が設置される。導入口１１１より電解液に懸濁した粒子を含む試料を、チャンバ１１０に、導入口１２１より電解液をチャンバ１２０に導入し、電圧源１５２によって前記２つの電極に電圧を印加する。たとえば、電極１１２と電極１２２の間に電圧を印加すると、細孔を経由してイオン電流が流れる。なお本明細書においては、「チャンバ」とは試料液（電解液）を格納できる部分を指すものとする。また本明細書において電極は、チャンバ中の試料液が触れる（すなわち通電可能な）場所にあれば、「チャンバの中にある」と定義するものとする。また本明細書においてチャンバへの「充填」とは、必ずしもチャンバの容積を全て埋めるようにすることは意味せず、センサが機能する限りにおいて空隙が残るようにしてもよい。すなわち本明細書では「充填」を「注入」又は「導入」と互換して考えてもよい。なお本明細書では、試料自体が液体である場合、それを一種の電解液と考えてもよい。図１（ｂ）には、以下の実験でパルス波形の計測に用いた細孔１４０の電子顕微鏡画像を示す。細孔の直径は、計測対象である抗体修飾粒子の直径よりも大きいものを選択する。

図１（ａ）のようにチャンバ１１０に存在する粒子が細孔１４０を通過する際に、イオン電流が一時的に妨げられ、粒子がチャンバ１２０に通過した後はもとに戻る。このため、粒子１個が細孔１４０を通過するたびに、図１の電極間に流れるイオン電流は図２に例示するようなパルス状の過渡変化を呈する。これを電流計１５１で計測する。図２に示す例では、パルス波形は時刻２０１ごとの電流値２０２の一例である。別の実施形態では、縦軸２０２は電圧値であってもよい。以下パルス波形やその分布の解析対象として例示したのは、ピーク電流値２０８である。ベースラインノイズ２０９は、パルスがない時のノイズ幅である。

図３には、本発明の或る実施形態に基づき、生体試料中の抗原を検出または定量する原理と手順の概要を説明するチャートを示す。本発明では、未知生体試料の前に、図３（ａ）のように対象抗原の有無や濃度が既知である既知試料を計測し、対象抗原の有無や濃度と、本発明による方法で得られるパルス波形の形状またはその分布の特徴との相関をモデル化する。あるいは、パルス波形の形状またはその分布の特徴を教師データとしてＡＩを訓練し、訓練済ＡＩを作成する。その後、図３（ｂ）のように、対象抗原の有無や濃度が不明な未知生体試料を計測して、前記モデルと比較することで、生体試料中の対象抗原の検出や定量を行う。あるいは、未知試料のパルス波形の形状またはその分布の特徴を訓練済ＡＩに入力して、対象抗原の検出や定量の推定を行ってもよい。本明細書において、生体から採取した生体試料から、図１のようなセンサのチャンバに注入する試料（以下、計測対象試料という）を作成するまでの手続きを、「計測前処理」という。計測前処理については本発明の要諦であるため、図３で概要を説明した後、図１１で詳しく説明する。なお本明細書では、既知の抗原濃度の対象抗原を含む既知試料と、当該対象抗原に特異的に結合する抗体で表面を修飾した抗体修飾粒子とを含むものを「既知計測対象試料」と呼ぶことがある。また未知の抗原濃度の対象抗原を含む未知試料と、当該対象抗原に特異的に結合する抗体で表面を修飾した抗体修飾粒子とを含むものを「未知計測対象試料」と呼ぶことがある。これらの計測対象試料は、対象抗原と抗体の反応効率に応じて配合、調製可能である。これらの計測対象試料が、チャンバ間を電気的に導通させるための電解液を含むと解釈してもよい。両チャンバに注入される電解液はそれぞれ異なる組成であってもよいし、同じ組成であってもよい。なお電解液としては、本発明の適用の形態に応じて、当該技術分野で知られる任意のものを使用できる。

図３（ａ）に示す方法ではまず、対象抗原と特異的に結合する抗体を、検出用粒子に修飾した抗体修飾粒子を作成する（ステップS３０１）。次に、対象抗原の有無や濃度が既知である生体試料に対して、図１１で説明する計測前処理を行い、既知計測対象試料を作成する（ステップS３０２）。既知計測対象試料は第１の電解液を含む。次に既知計測対象試料でセンサ１００の片方のチャンバを充填し、第２の電解液で他方のチャンバを充填することで、電極１１２および電極１２２の間を電気的に導通させる（ステップＳ３０３）。なお第１の電解液と第２の電解液は、その組成が同一であってもよいし、異なっていてもよい。

その後センサの電極間に電圧を印加して、粒子通過によるパルス波形を計測する（ステップＳ３０４）。そして既知である対象抗原の有無や濃度と、上記ステップＳ３０４で得られたパルス波形個々の形状やその分布との相関をモデル化する。このモデル化は解析的な手法によってもよく、あるいはＡＩモデルを訓練することで実行してもよい。ＡＩモデルの訓練は、パルス波形そのもの、個々のパルス波形の特徴を表すパルス特徴量、１計測で得られるパルス波形群の特徴の分布の特徴を表す分布特徴量などを教師データとして、また既知である対象抗原の有無や濃度を教師ラベルとしてＡＩモデルを訓練する。ＡＩモデルを利用する場合、そのアルゴリズムはたとえば、サポートベクターマシン、線形識別変換、ｋ近傍法、決定木やこれらのアンサンブル学習、あるいは各種の深層学習、再帰型アルゴリズムなど、どのようなアルゴリズムを利用してもよい。あるいは強化学習のように、学習結果によってモデル自身が動的に変化するアルゴリズムであってよい。図３（ｂ）に示す方法で生体試料中に対象抗原が含まれるか否かを調べる場合は、有無を出力とする分類アルゴリズム等を用いてもよい。また図３（ｂ）に示す方法で対象抗原の定量を行う場合は、連続量を出力とする回帰アルゴリズム等を用いてもよい。

上記モデル化（または訓練済ＡＩの作成）の後、図３（ｂ）に例示するように対象抗原の有無や濃度が未知である生体試料の計測結果を前記モデル（または訓練済ＡＩ）と照らして、対象抗原の有無や濃度を推定する。ステップＳ３１１乃至Ｓ３１２の処理は図３（ａ）と同様であるので説明を省略する。ステップＳ３０１とＳ３１１では同じ抗体修飾粒子を使用する必要がある。

ステップS３０１およびS３１１における抗体修飾粒子作成処理の一例を図４に示す。図４では、疎水性相互作用を利用したポリスチレン粒子への物理吸着を利用して、抗体修飾粒子を作成したが、これは本発明におけるプロトコルの一例に過ぎず、たとえばカルボジイミド結合のように、どのような原理、方法によって抗体修飾粒子を作成してもよい。この処理によって、修飾の基材となる計測用粒子は、高分子ポリマー、金属など材質を問わない。また、修飾する抗体の種類も、モノクローナルでもポリクローナルでも、またリコンビナント抗体でも、対象抗原に特異的に結合するものであれば何でもよい。

次に、本発明における対象抗原の検出または定量の基本原理を説明する。図５（ａ）乃至（ｃ）は、計測対象試料でチャンバ１１０を充填した状態を模式的に表したものである。生体試料に対象抗原が含まれていない場合は図５（ａ）のように、計測対象試料に対象抗体と結合した対象抗原は存在しない。この状態で電極１１２および１２２間に電圧を印加すると、計測対象試料中の抗体修飾粒子は、図５（ａ）のように、ほとんどが単独で細孔１４０を通過する。図５（ａ）の一例では、抗体修飾粒子５１１、５１２および５１３が細孔１４０を通過したパルス波形が各々５２１、５２２および５２３である。生体試料に対象抗原が含まれない場合、対象抗原を介して抗体修飾粒子が結合することはない。このため、多くの抗体修飾粒子は単独で細孔を通過する。しかし、たとえば粒子５１９のように、一部は対象抗原を介しない非特異結合をすることがあり、結合した状態で細孔を通過する抗体修飾粒子が観測されることもある。

生体試料中に対象抗原が存在する場合は、たとえば、図５（ｂ）および図５（ｃ）のように対象抗原が抗体修飾粒子に結合した状態で、チャンバ１１０に充填される。図５（ｂ）は、抗原が希薄な場合であり、抗体修飾粒子に対象抗原が結合しているものの、対象抗原を介した抗体修飾粒子同士の凝集はほとんど発生していない。

図５（ｃ）に示すように対象抗原の濃度が高い場合、抗体修飾粒子同士が対象抗原を介して凝集塊を形成する。従来技術である比濁法、吸光度法、イムノクロマトグラフィーなどはこの凝集現象を利用する。本発明では、凝集塊が細孔を通過したときに生じるパルス波形の波形は、抗体修飾粒子が単独で細孔を通過したときのパルス波形よりも、そのピーク電流値が大きくなる。大きな粒子が細孔を通過する際には、小さな粒子の通過時にくらべて、細孔を流れるイオン電流がより大きく妨げられるためである。たとえば図５（ｃ）において、凝集塊５５１、粒子５５２および凝集塊５５３の細孔１４０通過のパルス波形は各々５６１、５６２および５６３である。パルス波形のピーク電流値が、単独粒子５５２のそれより凝集塊５５１のそれの方が大きく、さらにこれらより凝集塊５５３のそれが大きいのはこのためである。一方、図５（ｂ）の状態では、凝集塊が形成されないため、パルス波形５４１乃至５４３のピーク電流値は図５（ａ）の状態とほとんど変わらないが、抗体修飾粒子への抗原の結合によって電荷が変化することによりパルス波形に変化が生じる結果、本発明においては図５（ｂ）の状態であっても対象抗原の検出や定量が可能である。

本発明では、パルス波形の形状を統計的に解析することにより、図５（ｂ）に示した抗体修飾ビーズへの対象抗原の付着の程度や、図５（ｃ）に示した対象抗原を介した抗体修飾粒子同士の凝集の程度を推定する。これによって、計測対象試料内の対象抗原の検出や定量を行う。

本発明の有効性を示すため、本発明者らはまず生体試料ではなく、A型インフルエンザウイルスのリコンビナントNタンパク質試料を、２μｇ／ｍＬから２ｐｇ／ｍＬまでの１０倍ごとの希釈系列を作成した上で、Nタンパク質を対象抗原として、図１に例示したセンサを用いてパルス波形の計測を行った。細孔の穴径は約３０５ｎｍ、抗体修飾粒子の直径は約８０ｎｍであった。図６は、各濃度での計測について、パルス波形のピーク電流６０１ごとのパルス数６０２のヒストグラムを図示したものである。パルス波形のピーク電流は図２の２０８である。ＮＴＣは、対象抗原を含まない計測対象試料である。従って、ヒストグラム６１１のパルス計測結果はおおむね、図５（ａ）に示した状態の抗体修飾粒子単体が、細孔１４０を通過したパルス波形の分布であると考えられる。図６には、対象抗原濃度２ｐｇ／ｍＬ、２０ｐｇ／ｍＬ、２００ｐｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬの各試料のパルス波形のピーク電流について、各々のヒストグラム６１２乃至６１８が示されている。２ｐｇ／ｍＬおよび２０ｐｇ／ｍＬのヒストグラムの形状は、ＮＴＣのそれとほとんど変化がなく、これらは図５（ｂ）の状態であると考えられる。一方、対象抗原濃度が２００ｐｇ／ｍＬでは、凝集塊によると思われる、ピーク電流が大きな、たとえばパルス６４１や６４２のようなパルス波形が観測され、それらは対象抗原濃度が高くなるにつれて大きくなっている。

ピーク電流０．７ｎＡ以上６０３のパルス波形を、対象抗原を介した抗体修飾粒子凝集塊として、そのパルス数の全パルスに占める割合を図７として示す。横軸７０１は対象抗原濃度、縦軸７０２は全パルスに占める０．７ｎＡ以上のパルスの比率である。図７中の７１２乃至７１８が各々、図６の６１２乃至６１８に対応する。この計測結果の一例では、おおよそ２０ｐｇ／ｍＬ７１３から２００ｐｇ／ｍＬ７１４より抗体修飾粒子の凝集が進んでいることから、これ以上の抗原濃度域では、図５（ｃ）の状態であることがわかる。また２ｐｇ／ｍＬから２０ｐｇ／ｍＬ以下の領域では、抗体修飾粒子に抗原が徐々に付着している図５（ｂ）の状態と考えられる。本発明では、パルス波形の特徴およびその分布の特徴から、図５（ｂ）の状態にあっては抗体修飾粒子への抗原付着の程度を、また図５（ｃ）の状態にあっては抗体修飾粒子の凝集状態を推定することで、対象抗原の検出または定量が可能になった。

以上、図５を参照して本発明の基本原理を説明した。また、図６および図７を参照して、Ａ型インフルエンザウイルスのリコンビナントＮタンパク質の希釈系列でその原理を実証した。しかし図６および図７の実験は、夾雑物がほとんど含まれない純系試料を使っている。このため得られるパルス波形はほとんどが、単体または凝集した抗体修飾粒子であり、対象抗原の有無や濃度とパルス波形の特徴やその分布の特徴との相関をモデル化すること（ステップS３０５）は容易であった。

しかし、臨床応用を想定した生体試料には、多くの夾雑物が含まれている。たとえば臨床検体としてよく用いられる血液や尿には血球類などの細胞やその破片が数多く含まれている。また、感染症検査における検体として用いられる唾液や鼻咽頭液などの場合、血球類は少ないが、数百ｎｍ程度のエクソソームが大量に含まれている。これらμｍからｎｍオーダの粒子をソートすることは現実的ではないため、図５に示した基本原理による対象抗原検出や定量を実現するためには、対象とする抗体修飾粒子以外の夾雑物由来のパルス波形を効率的に排除する技術が必須である。

本発明者らは、以下に述べるフィルタリングと細孔の特性を利用した、本発明による計測前処理技術によって、計測対象となる抗体修飾粒子の細孔通過以外のパルス波形を概ね排除し、対象抗原を高い精度で検出または定量できることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち本発明によれば、粒子通過時の電流過渡変化を計測する際に用いるセンサ細孔の穴径をD、以降で詳細に説明する計測前処理にて用いるフィルタの阻止サイズをｍ、かつ作成する抗体修飾粒子の粒径をｄとすると、次の（A）式および（B）式の両方を満たす。

ここでM_minは、計測対象となる抗原のサイズに応じて定められる下限値である。或る実施形態ではM_minは例えば一般的なタンパク質のサイズである2nmとすることができる。すなわち計測対象となる抗原がフィルタに阻止されて30%以上失われてしまうことになると、その後の抗原抗体反応を阻害する（つまり測定の感度が下がる）ので、これ以上小さくしないことが望ましいことを技術常識に照らして理解できる。別の実施形態では、M_minを別の抗原のサイズに合わせた値としてもよい。

以下では、この本発明の原理と実験による検証結果についてさらに詳しく説明する。

本発明の原理の基礎となる、図１のようなセンサの特性について、図８を使って説明する。図８には、図６および図７に例示したデータの計測時に利用した直径Ｄが約３０５ｎｍである細孔に、６０ｎｍ径から３００ｎｍ径の、様々な粒径８０１のポリスチレン標準ビーズを通過させたときの、平均パルス高さ８０２を示す。粒子が小さいほど、平均パルスピーク電流は小さくなる。これは、粒子径が小さいほど、細孔に占める通過粒子の割合が小さくなる結果、細孔を流れるイオン電流のブロックも小さくなり、粒子通過による抵抗値の変化が小さくなるためである。図８の例では、パルス高さが３０ｎＡ程度８３０以下になると、ベースラインノイズに埋もれてパルスは観測できなくなる。ここで言うベースラインノイズとは図２の２０９として例示したようなパルス波形以外の常在ノイズである。

次に図９を使い、本発明による夾雑粒子除外の原理を説明する。図９（ａ）は、電気抵抗細孔法の従来の方法により生体試料を計測した場合のパルス波形である。生体試料９１０中のウイルス粒子９１１を計測することを目的とした場合、生体試料９１０中に含まれるウイルス粒子以外の夾雑物のパルスが多く観測される。たとえば、図９（ａ）において、細孔を通過する粒子９１２乃至９１５のうちウイルス粒子は９１２のみである。しかし、計測においては９２２乃至９２５のようにパルス波形が計測され、どれがウイルスによるパルスかは区別がつかない。

図９（ｂ）は、本発明による方法の概念図である。本発明では、夾雑物を多く含む試料９３０において、まず計測対象のウイルスから、かかるウイルスに特異的なタンパク質を対象抗原９３１として抽出する。その後ウイルスやウイルスと同程度の大きさの夾雑物をフィルタで除去した後、抗体修飾粒子９３２を混和した試料９３７を計測する。試料９３７中には対象抗原だけでなく、同程度の大きさの夾雑粒子が多数含まれている。しかし図８よりわかるとおり、たとえば穴径Ｄ８４０の１／１０以下の粒子はパルスとして観察されない。このため、細孔を通過する粒子９３３乃至９３５は、各々パルス９４３乃至９４５のようになり、計測対象とする抗体修飾粒子のみがパルスとして計測される。

（実施形態１）
図１０および図１１により、本発明の一実施形態を、インフルエンザA型（Ｎ１Ｈ１　Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）のＭＤＣＫ細胞による培養上清を用い、インフルエンザA型のNタンパク質を対象抗原として本発明による方法で計測する方法を例として説明する。図９のように微生物を計測する場合には、まず、検出や定量対象の微生物に特有のタンパク質の抽出処理を行う（ステップＳ１１１１およびＳ１１１２）。この一例では第１の電解液として、ＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）と界面活性剤をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）で希釈したものを使用した。この一例ではインフルエンザウイルス内部の対象抗体であるNタンパク質を抽出するために、ステップS１１１１およびS１１１２を実行したが、生体試料や対象抗原の種類によって、これ処理を適切に選択する。また、生体試料内ですでに対象抗原が抗体修飾粒子と反応可能な状態である場合、このような抽出処理は不要であり、ＰＢＳのような電解液で希釈するのみであってもよい。

この処理後には、対象抗原が存在していない抽出済試料１０１１、存在している抽出済試料１０２１ともに、ともに多くの夾雑粒子と対象抗原が混在している。これをそのままセンサで計測すると、図９（ａ）のように夾雑粒子によるノイズパルスが計測されてしまうことになる。そこで、細孔穴径の１／１０以下の阻止サイズを持つフィルタで濾過を行う（ステップＳ１１１３）。この一例では、１００ｋＤａのメンブレンフィルタを用いて、１００００Gで３分間遠心濾過を行った。ここで遠心濾過のG、時間は一例であり、生体試料である生体試料や抽出処理によって最適な値を選択してよい。この結果、濾過済試料１０１２および１０２２のように、夾雑粒子あるいは検出／定量対象の微生物ともに、フィルタの阻止サイズ以上の粒子が概ね除去された状態となる。ここで本明細書においては、試料中の粒子が３０％以上除去される上限の粒子サイズを、フィルタの「阻止サイズ」と定義する。たとえば、１００ｎｍ以上の粒子を３０％以上阻止するが、１００ｎｍ以下の粒子は３０％の阻止ができない（すなわち、その粒子の３０％以上が通過することになる）フィルタを、阻止サイズ１００ｎｍのフィルタという。ステップS１０１３で利用するフィルタは繊維を通過する粒子サイズを制御したもの、ポーラス穴径を利用したものなど、その種類は問わない。なお本明細書において「阻止サイズ」を「３０％以上」阻止するものと定義しているのは、一般に繊維からなるフィルタでは完全な阻止は現実的ではないこと、および、３０％以上の阻止を行うことで実用上そのフィルタの性能を表現できることを本発明者が発見したことに因る。阻止サイズの定量方法についてはさらに後述する。

なお、図１１の例では、ステップＳ１１１１において第１の電解液として微生物からの対象抗原となるＮタンパク質の抽出機能を有する電解液で希釈した。計測対象試料には第１の電解液が含まれている必要があるが、電解液で希釈する処理はステップＳ１１１１に限定されず、Ｓ１１１１乃至Ｓ１１１５のどこで、どのような手順で行われてもよい。

本発明では図１のようなセンサで、細孔を通じてイオン電流を流すために、チャンバ１１０、１２０ともに電解液で充填されている必要がある。この一例では、チャンバ１１０を充填する試料にステップＳ３０２（Ｓ１１１１）で第１の電解液を混和し、またチャンバ１２０は第２の電解液で充填した。この方法においては、第１の電解液としては、効率よく図５（ｂ）または（ｃ）の状態を生成し維持するために必要な成分を有するものとし、かつ第２の電解液は安定した導通が実現されるだけでよい。たとえば第１の電解液として抗原抗体反応を促進するＰＥＧなどの成分を含み、一方第２の電解液は、抗原や抗体の機能に影響を与えるような成分、たとえば高濃度の界面活性剤などを含まないものなどであってよい。チャンバ１２０はイオン電流の導通を担うのみであるため、チャンバ１１０のような機能は不要でありまた制限もない。たとえば第２の電解液は、安定導通のため任意の濃度の界面活性剤を含んでいて良い。すなわちこの実施形態では、第１の電解液と第２の電解液は組成が異なっていてよい。別の実施形態では、第１の電解液と第２の電解液は組成同一であってもよい。

ここで示す一例では、計測には穴径３０５ｎｍの細孔を利用した。対象抗原の大きさは仮に分子量を６０ｋＤａとするとおおよそ２．７ｎｍ程度であるから、対象抗原は当該穴径の１／１０以下の阻止サイズを持つフィルタ（すなわち、阻止サイズ３０．５ｎｍ以下のフィルタ）は通過するが、当該穴径の１／５以上の粒径である６１ｎｍ以上のサイズを持つ夾雑粒子はおおむね除去される（すなわち、それらの夾雑粒子のうち３０％以上はフィルタに阻止され除去される）ことになる。次にこの濾過済試料１０１２または１０２２に、Ｓ３０１またはＳ３１１で作成した細孔１４０の穴径の１／５以上の粒径を有する抗体修飾粒子を混和（ステップS１１１４）する。さらに抗原抗体反応のためのインキュベーション（ステップS１１１５）を行う。これにより、計測対象試料１０１３または１０２３が完成し、図３のステップS３０３またはS３１３へと進む。

ここで例示する第一の実施形態では、ステップS３０４またはS３１４で利用するセンサ細孔１４０の穴径をD、ステップS１１１３で利用するフィルタの阻止サイズをｍ₁、そしてステップS１１１４で作成する抗体修飾粒子の粒径をｄ₁とすると次の（１）式および（２）式の両方を満たす条件にて計測を行う。一例として、M_minは２ｎｍであってよい。

この実施形態において、式（１）および（２）の条件を満たすことによって、夾雑物の多い生体試料中の対象抗原の検出または定量が、高精度で実現する理由を説明する。図１１のステップS１１１３の処理によって、（２）に示す粒径ｍ₁以上の粒子は、おおむね試料より除去される。一方、生体試料から対象抗原の大きさに近い夾雑粒子を選択的に排除する方法はないため、ステップS１１１３の処理後の濾過済試料１０１２および１０２２は、濾過をしてもなお、大量の夾雑粒子に一部対象抗原が存在する状態である。ただし（２）式を満たす濾過であれば、この試料の夾雑粒子および対象抗原ともに計測してもパルスは計測されない。さらに（１）式を満たす抗体修飾粒子を混和、およびインキュベーションした試料１０１３および１０２３は、計測対象とする抗体修飾粒子またはその凝集体のみのパルスが計測できる。

このようにして本発明では、図１０における抗体修飾粒子１０１０や１０２０の対象抗原結合の有無や、対象抗原による抗体修飾粒子同士の凝集状態の違いを、ノイズパルスなしで計測することができる。このことで、大量の夾雑物が含まれる生体試料についても、対象抗原のみが含まれる純系試料と同様の性能をもって、対象抗原の検出や定量が行えるようになった。なお、濾過Ｓ１１１３で用いるフィルタが繊維状のものである場合、阻止サイズ以上の粒子がフィルタを通過して濾過済試料に残存することは避けられない。このため本実施形態では、図８に示すとおり、（２）式の阻止サイズ８４１を、（１）式の抗体修飾粒子の粒径下限８４２よりさらに小さく設定している。（１）式と（２）式は阻止サイズ以上の粒子をある程度通過させてしまうメンブレンフィルタを使うことを想定して、抗体修飾粒子径ｄ₁よりもさらに小さいｍ₁とすることが好ましい。本発明における阻止サイズと抗体修飾粒子径の選択は、図１のようなセンサでの計測において、パルスが検出できる限界の粒径よりｍ₁を小さく、かつｄ₁を大きくすればよい。

次に図１２を用いて、前記インフルエンザＡ型培養上清の計測結果について、本発明の方法の効果を検討する。図１２では、インフルエンザA型のＭＤＣＫ細胞による培養上清を、インフルエンザA型のNタンパク質を対象抗原として抽出、阻止サイズ３０ｎｍのフィルタにより濾過した後、８０ｎｍの抗体修飾粒子を混和、インキュベートするという手順で計測前処理を実施し、さらに３０５ｎｍの直径の細孔を有するセンサで計測した結果を示す。上記フィルタの阻止サイズは、細孔穴径Ｄ＝３０５ｎｍに対して（２）式を十分に満たしている。かつ、本計測で利用した８０ｎｍ径の抗体修飾粒子は（１）を満たしている。これらより、この計測前処理を実施した生体試料は、図１０における１０１３または１０２３の状態となっている。

図１２の横軸１２００は、１０分あたりのパルス数である。パルス数１２０１は、対象抗原を有する培養上清の抽出済試料１０２１のパルス波形の計測を行った結果である。３０５ｎｍの細孔では対象抗原であるインフルエンザＮタンパクはパルスとして観測されないので、このパルスはすべて夾雑粒子による。また、パルス数１２０２は、ステップＳ１１１４で混和した抗体修飾粒子保存液のパルス計測を行った結果である。これらを混和およびインキュベートした試料１０２３のパルス計測結果が、パルス数１２０３である。パルス数はおおむね１２０１と１２０２の和となるが、夾雑粒子由来のパルスが多く、抗体修飾粒子表面への抗原付着といった、小さな違いをモデル化することは困難である。

これに対してパルス数１２１１は、ステップＳ１１１３での濾過後試料１０２２のパルス計測結果であり、ほとんどパルスが計測されない。したがって、これに抗体修飾粒子を混和、インキュベーションを行った試料１０２３のパルス計測結果は、１２１０のようになり、ほぼすべてのパルスが抗体修飾粒子によるものとなる。このことから、本発明によれば、臨床検体のような夾雑物を多く含む生体試料であっても、図６や図７のような純系と同様に対象抗原の検出や定量が行えることがわかる。

図１３は、培養インフルエンザウイルス試料に（１）式および（２）式の条件で図１１の計測前処理を施した後に、本発明の方法による計測を行ったときのピーク電流の分布である。ＮＴＣは、インフルエンザウイルスが含まれていない培養上清、以下分布１３１１乃至１３１３は各々、ＰＣＲコピー数が１０²、１０⁴および１０⁶コピー／μＬの結果である。図１１に示した計測前処理により、純系で計測した図６と同様にこのヒストグラムのパルスはほとんどが抗体修飾粒子によるものである。その結果を見ると図６と同様に、インフルエンザウイルスを含まないＮＴＣ１３１０と比較して、試料中のウイルス濃度が上昇する毎にピーク電流の大きなパルスが現れる。図１３（ｂ）は、この分布の標準偏差を表している。このようなパルス波形の分布と対象抗原であるインフルエンザＡのＮタンパク質との相関関係をモデル化すれば、生体試料である上記培養上清中のインフルエンザウイルス濃度を推定することができる。

以上、夾雑粒子を大量に含む生体粒子中の、微生物から特異的なタンパク質を抽出して、それを抗原として本発明の方法で定量を行った。本発明の方法では、微生物内に限らず、抗原となるタンパク質が生体試料中に含まれていればその効果を発揮する。

（実施形態２）
上記実施形態１では、濾過後の試料からはほとんどパルスが計測されないように、細孔径D、粒子径ｄ₁および阻止サイズｍ₁を選択した。図１２のパルス数１２１１はその例である。一方、本発明の他の実施形態として、濾過後の試料からパルスが計測されるように細孔径、粒子径および阻止サイズを選択した上、除外閾値よりピーク電流が小さなパルス波形を解析対象から除外してもよい。

この実施形態の一例では、以下（３）式および（４）式を満たすように、図８における阻止サイズｍ₂（８６１）と抗体修飾粒子径ｄ₂（８６２）を選択して計測する。

いま一例として、図１４のとおりD＝３０５ｎｍ、ｄ₂＝２２０ｎｍ、ｍ₂＝１００ｎｍ、M_min＝２ｎｍとすると、図１４のとおり、計測データには抗体修飾粒子と夾雑粒子が混合した状態となる。図１４の一例では、粒子１４１１乃至１４１３の細孔通過にともなって、パルス波形１４２１乃至１４２３のパルス波形が各々計測される。この一例の場合、阻止サイズｍ₂以下の粒子１４１３であっても、パルスが波形１３２３として計測されてしまう。本実施形態においては、除外閾値１４００を設定し、たとえばパルス波形１４２３のように、ピーク電流が除外閾値１４００を下回るパルス波形を、ステップS３０５またはS３１５のモデル化や推定の対象から除外する。除外閾値はたとえば、図８の範囲８３９内で決めてよいが、たとえばステップS３０５の相関モデル化の評価関数の成績が最善になるように、回帰的に選択することもできる。またたとえば、このステップS３０５でＡＩモデルの訓練を行う場合、訓練済ＡＩモデルの出力がもっとも良く既知試料の抗原の有無や抗原濃度を再現するように、除外閾値１４００を決めてよい。

この実施形態における濾過後の試料の計測結果は、抗体修飾粒子由来および夾雑粒子由来のパルスが混合する状態になる。しかし（３）式および（４）式を満たす限り、夾雑物由来のパルス波形のピーク電流は、抗体修飾粒子のそれに比べて有意に小さいため、これらを除外することで、抗体修飾粒子のみを解析対象とすることができる。たとえば、阻止サイズの小さなフィルタが高価である、高価な遠心装置を要する、あるいは濾過時間が長いなどの問題がある場合には、（１）式および（２）式に従うことが困難である場合がある。このような場合、この実施形態２による方法が有効である。

以上の実施形態１、実施形態２の説明において、図９、図１０および図１４で、抗体修飾粒子に抗原が結合した状態、すなわち図５（ｂ）の状態の検出を例にとった。本発明では、対象抗原により抗体修飾粒子同士が凝集した図５（ｃ）の状態の検出にも利用できる。

上述したフィルタの阻止サイズは、粒子のサイズが既知である標準ビーズを使い、上述したような手法でパルス波形を計測することで評価できる。図１５は、粒径が既知であるＮＩＳＴ（アメリカ国立標準技術研究所）準拠の標準ビーズを用いて、上述したセンサ１００などのセンサでパルス波形を計測し、そのピーク電流の分布をヒストグラムとして表示したものである。分布１５１１乃至１５１４は各々、３０５ｎｍの穴径の細孔を持つ図１に例示したようなセンサで、１００ｎｍ、２００ｎｍ、２７０ｎｍおよび３００ｎｍの標準ビーズを計測した結果であり、粒径ごとにその分布が明らかに異なる。評価対象のフィルタで、各々の粒径の標準ビーズを濾過した試料を計測し、フィルタで濾過しない計測結果のパルス数と比較すると、各々の粒径毎の阻止率を見積もることができる。その阻止率が３０％以上になる粒径を、阻止サイズとして定める。

さらに以上は、対象抗原に特異的に結合する抗体修飾粒子を計測対象とし、夾雑物の多い生体粒子中の対象抗原の検出または定量を行う例で本発明を説明した。これらに限定されず、本発明では検出または定量対象の抗体に結合する抗原をその表面に修飾した抗原修飾粒子を計測対象とし、夾雑物の多い生体粒子中の対象抗体の検出または定量を行うこともできる。その場合は上記の説明の抗体と抗原を逆に読み替えればよい。

一般に、抗原または抗体の検出や定量にかかる従来の技術にあっては、抗原抗体反応の有する特異性を利用して抗体または抗原を捕捉した後に、それ以外を洗浄等によって可能な限り除去する必要があり、不要物の除去に多くの手間を要する問題があった。本発明がユニークな点は、対象試料から夾雑物を除去するのではなく、対象試料に夾雑物が大量に含まれていたとしても、これらが解析結果に影響を与えない条件を与えることで、夾雑物除去に要する手間やコストを削減することに成功した点にある。

また、以上説明してきた本発明に係る方法は、プロセッサ（単数のプロセッサでもマルチコアプロセッサでもよく、またマイクロプロセッサも含んでよい）を有するコンピュータ装置・端末により実施可能である。そうしたコンピュータ装置は、図１のセンサ１００等のセンサと一体化した装置であってもよい。あるいは、そうしたセンサとネットワーク（有線、無線を問わず、例えばインターネット、専用閉域網、ＬＡＮ等であってよい）を介して動作可能に接続するコンピュータ装置であってもよい。

本発明に関して使用できるコンピュータ装置の形態は任意であり、例えばワークステーション、タブレット、スマートフォン等であってよい。

本発明の或る実施形態においては、コンピュータにより可読であるプログラムおよび当該プログラムを格納する媒体を提供でき、当該プログラムをプロセッサが実行することで、上述した方法が含む任意の工程を実施するようにできる。

本発明に係る或る実施形態では、上述した方法を実施し、抗原若しくは抗体の有無若しくは濃度を推定するための装置も提供できる。すなわち当該装置は、上述したような阻止サイズｍを有するフィルタと、穴径Ｄの細孔を有する隔壁によって隔てられた2つのチャンバが前記細孔を通じて疎通し、かつ前記2つのチャンバの各々の中に電極を有する構造のセンサと、ネットワークを介してコンピュータに接続するインターフェイスとを含んでよい。当該装置が有するインターフェイスは、抗体修飾粒子が細孔を通過するたびに生じるイオン電流の過渡変化を、複数のパルス波形から成るパルス波形群として計測することで取得されたデータを、コンピュータに送信するように構成されるものであってよい。当該コンピュータはプロセッサを有する任意の形態であってよく、上記装置と一体化したものであってもよいし、あるいは何らかのネットワークを介して上記装置と接続する外部コンピュータであってもよい。

Claims

生体から採取した生体試料中における検出対象である抗原若しくは抗体の有無若しくは濃度を推定するための方法であって、
前記生体試料を、阻止サイズｍを有するフィルタで濾過して濾過済試料を作成し、
前記抗原に結合する抗体をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗体修飾粒子、又は前記抗体に結合する抗原をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗原修飾粒子と、
前記濾過済試料と、
第１の電解液と
を混合して計測対象試料を作成し、
穴径Ｄの細孔を有する隔壁によって隔てられた2つのチャンバが前記細孔を通じて疎通し、かつ前記2つのチャンバの各々の中に電極を有する構造のセンサの、前記2つのチャンバのうちの一方に前記計測対象試料を充填し、
第２の電解液を前記センサの有する前記２つのチャンバの他方に充填して前記細孔を通じて前記２つのチャンバを電気的に導通させ、
前記２つのチャンバが各々有する２つの電極の間に電圧を印加して、前記２つの電極の間に前記細孔を経由してイオン電流を流した状態で、前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子が前記細孔を通過するたびに生じる前記イオン電流の過渡変化を、複数のパルス波形から成るパルス波形群として計測し、
前記パルス波形群を解析することによって、前記生体試料中における検出対象の抗原若しくは抗体の有無若しくは濃度を推定する
ことを含み、
前記阻止サイズｍは検出対象である抗原若しくは抗体のサイズに応じて定まる下限値以上かつ前記穴径Ｄの１／２以下であり、かつ、
前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄは前記穴径Ｄの１／５以上かつＤ未満である
ことを特徴とする方法。
前記阻止サイズｍは２ｎｍ以上かつ前記穴径Ｄの１／１０以下であり、かつ、
前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄ₁は前記穴径Ｄの１／５以上かつＤ未満である
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記イオン電流の過渡変化を、複数のパルス波形から成るパルス波形群として計測することによって、前記生体試料中における前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の凝集状態を計測することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
さらに
前記パルス波形群の中から、除外閾値以上のピーク電流を有する選択パルス波形を抽出し、
前記選択パルス波形群を解析することによって、前記生体試料中における検出対象の抗原若しくは抗体の有無の検出又は濃度の推定値を計算すること
を含み、
前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄは前記穴径Ｄ未満であり、かつ前記阻止サイズｍは前記径ｄの１／２以下であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
さらに
前記除外閾値を、前記濃度推定値が生体試料中に含まれる検出対象の抗原若しくは抗体の真値と近くなるように再帰的に求めること
を含む、請求項４記載の方法。
前記第１の電解液と前記第２の電解液は、その組成が異なることを特徴とする請求項１、２、又は４のいずれかに記載の方法。
前記第１の電解液と前記第２の電解液は、その組成が同じであることを特徴とする請求項１、２、又は４のいずれかに記載の方法。
生体から採取した生体試料中における検出対象である抗原若しくは抗体の有無若しくは濃度を推定するための装置であって、
　阻止サイズｍを有するフィルタと、
　穴径Ｄの細孔を有する隔壁によって隔てられた2つのチャンバが前記細孔を通じて疎通し、かつ前記2つのチャンバの各々の中に電極を有する構造のセンサと、
　ネットワークを介してコンピュータに接続するインターフェイスと
を含み、
前記抗原に結合する抗体をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗体修飾粒子、又は前記抗体に結合する抗原をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗原修飾粒子と、
前記フィルタによって濾過された濾過済試料と、
第１の電解液と
を混合して作成される計測対象試料を、前記2つのチャンバのうちの一方に前記計測対象試料を充填するように構成され、
第２の電解液を前記センサの有する前記２つのチャンバの他方に充填して前記細孔を通じて前記２つのチャンバを電気的に導通させるように構成され、
前記２つのチャンバが各々有する２つの電極の間に電圧を印加して、前記２つの電極の間に前記細孔を経由してイオン電流を流した状態で、前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子が前記細孔を通過するたびに生じる前記イオン電流の過渡変化を、複数のパルス波形から成るパルス波形群として計測してデータを取得し、前記インターフェイスを介して前記データをコンピュータに送信するように構成され、
前記阻止サイズｍは、検出対象である抗原若しくは抗体のサイズに応じて定まる下限値以上かつ前記穴径Ｄの１／２以下であり、かつ前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄは、前記穴径Ｄの１／５以上かつ前記穴径Ｄ未満である
ことを特徴とする、装置。
前記阻止サイズｍは、前記穴径Ｄの１／１０以下である、請求項８に記載の装置。
隔壁によって隔てられた2つのチャンバが細孔を通じて疎通し、前記2つのチャンバの各々の中に電極を有する構造のセンサとネットワークを介して接続されるように構成されたプロセッサを有するコンピュータにおいて、前記プロセッサが実行することで下記工程を実施するように構成されたコンピュータ可読命令を含むプログラムであって、
生体試料を、阻止サイズｍを有するフィルタで濾過して濾過済試料を作成する工程と、
抗原に結合する抗体をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗体修飾粒子、又は前記抗体に結合する抗原をその表面に付着させた粒子径ｄを有する抗原修飾粒子と、
前記濾過済試料と、
第１の電解液と
を混合して計測対象試料を作成する工程と、
穴径Ｄの細孔を有する隔壁によって隔てられた2つのチャンバが前記細孔を通じて疎通し、かつ前記2つのチャンバの各々の中に電極を有する構造のセンサの、前記2つのチャンバのうちの一方に前記計測対象試料を充填する工程と、
第２の電解液を前記センサの有する前記２つのチャンバの他方に充填して前記細孔を通じて前記２つのチャンバを電気的に導通させる工程と、
前記２つのチャンバが各々有する２つの電極の間に電圧を印加して、前記２つの電極の間に前記細孔を経由してイオン電流を流した状態で、前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子が前記細孔を通過するたびに生じる前記イオン電流の過渡変化を、複数のパルス波形から成るパルス波形群として計測する工程と、
前記パルス波形群を解析することによって、前記生体試料中における検出対象の抗原若しくは抗体の有無若しくは濃度を推定する工程
とを実施し、
前記阻止サイズｍは、検出対象である抗原若しくは抗体のサイズに応じて定まる下限値以上かつ前記穴径Ｄの１／２以下であり、かつ前記抗体修飾粒子若しくは前記抗原修飾粒子の径ｄは、前記穴径Ｄの１／５以上かつ前記穴径Ｄ未満である
ことを特徴とする、プログラム。