CN1979168A - 一种检测肺炎球菌的免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肺炎球菌的免疫层析试纸及其制备方法。该试纸包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线含有肺炎球菌表面粘附素A，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体。本发明的免疫层析试纸具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。

Description

一种检测肺炎球菌的免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种肺炎球菌的检测试纸及其制备方法，别是涉及一种检测肺炎球菌的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，Sp)，也称肺炎球菌(pneumococcus)，广泛分布于自然界，常寄居于正常人的鼻咽腔中，儿童鼻咽部带菌率可达24-32％。肺炎球菌有90个血清型，近30个血清型对人有致病性为细菌性肺炎的主要病原体。临床上，通常将肺炎分为社区获得性肺炎(Community-acquired pneumonia，CAP)和医院获得性肺炎(Hospital-acquired pneumonia，HAP)。

CAP是世界范围内引起死亡的重要原因之一，在美国CAP居死因第六位，又是感染性疾病的首要病因，在日本CAP居死因第四位，据不完全统计，我国每年约有250万例CAP患者，死亡约12.5万。近年来，各国对CAP病原体的研究结果表明：20世纪80-90年代，CAP的病原体以肺炎球菌居第一位。多年来，国内研究人员一直认为肺炎球菌对青霉素高度敏感，并将青霉素用作治疗肺炎球菌感染的首选药物，但随着抗生素的广泛使用，肺炎球菌的耐药现象日益严重，且呈多重耐药。当肺炎球菌从感染的原发部位播散到循环系统、中枢神经系统或其它正常情况下的无菌部位时，会引起脑膜炎、菌血症等侵袭性疾病。因此，快速、准确的确定病原菌是控制肺炎的关键。

目前，我国尚未有肺炎球菌的血清检测诊断试剂盒。因此，研究肺炎球菌敏感、特异、快速、简便的检测方法和试剂非常必要。经典的肺炎球菌检测方法是通过接种培养试验等，但由于其操作较烦琐、耗时较长，不适合在临床使用。

肺炎球菌表面粘附素A(pneumococcal surface adhesion A，PsaA)为肺炎球菌表面结合脂蛋白，在肺炎球菌粘附呼吸道粘膜过程中起关键作用。PsaA是各型肺炎球菌共有的一种遗传保守的、种特异性的表面蛋白抗原，具有较好的免疫原性，且与毒力有关(De BK，Sampsom JS，Ade EW，et al.Purification and characterizationof Streptococcus pneumoniae palmitoylated pneumococcal surface adhesin Aexpressed in Escherichia coli[J].Vaccine 2000，18：1811-1821.)。PsaA基因的开放阅读框的长度为930bp，编码37kD的蛋白。

葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测肺炎球菌的免疫层析试纸(Immuno-ChromatographicAssay，ICA)。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种检测肺炎球菌的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线含有肺炎球菌表面粘附素A，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体。

所述肺炎球菌表面粘附素A可为野生型肺炎球菌表面粘附素A或经发酵表达的重组肺炎球菌表面粘附素A。所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体可购自pharmacia等生物试剂公司。所述检测线含有的肺炎球菌表面粘附素A的浓度可为2.0-4.0mg/mL，所述质控线含有的能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度可为2.0-4.0mg/mL。

所述吸水垫和样品垫均由吸水材料制备。

检测样品时可将上述检测肺炎球菌的免疫层析试纸的样品垫直接浸于样品中；为使使用更加方便，所述检测肺炎球菌的免疫层析试纸的背面还紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料、树脂或聚氯乙烯板(PVC板)等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测肺炎球菌的免疫层析试纸的方法。

本发明所提供的制备上述检测肺炎球菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)将肺炎球菌表面粘附素A溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述检测线的一端；

2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；

3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测肺炎球菌的免疫层析试纸。

上述检测肺炎球菌的免疫层析试纸的制备方法中，步骤1)中肺炎球菌表面粘附素A可为野生型肺炎球菌表面粘附素A或经发酵表达的重组肺炎球菌表面粘附素A；所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体可购自pharmacia等生物试剂公司；所述检测线含有的肺炎球菌表面粘附素A的浓度可为2.0-4.0mg/mL，所述质控线含有的能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度可为2.0-4.0mg/mL。此外，可将步骤1)中喷有肺炎球菌表面粘附素A溶液和金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体溶液的纤维素膜先在37℃下干燥2-4小时，再粘贴吸水垫。

为使金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针与玻璃纤维膜或聚脂膜更好地结合，可向步骤2)中的金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；为使金标垫更易与纤维素膜粘贴，可将金标垫在-20℃至-50℃冷冻5-8小时，并将其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴。

为了使用更加方便，所述检测肺炎球菌的免疫层析试纸的背面还可再紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料、树脂或聚氯乙烯板等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

所述重组肺炎球菌表面粘附素A的表达方法可为：构建5’端融合伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列的重组肺炎球菌表面粘附素A基因，再将该基因导入宿主细胞，培养宿主细胞使重组肺炎球菌表面粘附素A基因表达。

所述5’端融合伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列的重组肺炎球菌表面粘附素A基因可通过含有该融合基因的重组表达载体导入宿主细胞；用于构建所述重组表达载体的出发载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，如pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等，优选为pET-32a。

以pET-32a为出发载体，构建的含有肺炎球菌表面粘附素A基因的重组表达载体为pET32a-psaA。

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、E.coli BLR(DE3)或E.coli B834等。

上述重组表达载体和重组菌均可按照常规方法构建。

培养含有5’端融合伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列的重组肺炎球菌表面粘附素A基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.1-5mmol/L，优选为1mmol/L，诱导温度为33-40℃，优选为37℃，诱导时间为3-7小时，优选为5小时。

所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液的制备方法，可包括以下步骤：

1)将质量百分浓度为0.01％的氯化金(HAuCl₄)水溶液加热煮沸，并将每100mL0.01％HAuCl₄溶液进行如下操作：搅动下加入1.6-1.8mL质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，继续煮沸，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；

2)将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至6-6.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为8-12μg/mL的金黄色葡萄球菌蛋白A，搅拌20-30分钟，然后加入1-3mL10％PEG20000，继续搅拌20-30分钟，在9000-13000rpm下离心25-35分钟，弃上清，沉淀即为金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针；

3)将金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针保存于质量百分浓度0.25-0.4％的四硼酸钠溶液中，得到金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液。

在上述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针的制备方法中，步骤1)中加入1％的柠檬酸三钠水溶液后再继续煮沸10-15分钟即得到胶体金溶液；为弥补因加热蒸发损失的水分，可用水将胶体金溶液恢复至原体积。步骤2)中可用浓度为0.1-0.3M(优选为0.2M)的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值；向胶体金溶液中添加的金黄色葡萄球菌蛋白A的终浓度优选为10μg/mL，10％PEG20000的添加量优选为2mL。步骤3)中金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液中金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针的终浓度优选为10％。

在实际应用中，所述纤维素膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜，厚度控制在2-3mm为宜；所述吸水垫可为吸水纸，厚度可为1.5-3mm；所述金标垫的厚度可为30-70mm；所述样品垫可为玻璃纤维膜，厚度可为0.1-0.2mm。

本发明提供了一种检测肺炎球菌的免疫层析试纸及其制备方法。该试纸利用了免疫胶体金技术及双抗体夹心检测法，用其检测肺炎球菌或肺炎球菌抗原的基本原理是：将肺炎球菌PsaA蛋白包被纤维素膜，用于捕捉血清中肺炎球菌抗体，然后用标记了SPA的免疫胶体金探针检测；阳性血清样品的肺炎球菌抗体(IgG和IgM)的Fc端与胶体金颗粒上的SPA结合，Fab端与纤维素膜上的肺炎球菌PsaA蛋白结合，层析2分钟后可出现肉眼可见的沉淀线。本发明的免疫层析试纸具有以下优点：1)敏感性及特异性高；2)检测方法简单、快速：检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的肺炎球菌或肺炎球菌经过2分钟左右的纸层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为肺炎球菌病的治疗争取了时间，很适合突发事件现场和基层使用；3)制备方法简单，成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在肺炎球菌的检测及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为检测肺炎球菌的免疫层析试纸的正面和纵截面结构示意图

图2为PCR扩增的嵌合基因psaA的1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为携带有psaA基因的原核表达载体pET32a-psaA及pET32a空载体的BamH I和Hind III双酶切鉴定结果

图4为用E.coli BL21/psaA小规模诱导表达的rPsaA的SDS-PAGE检测结果

图5为rPsaA抗原活性的Western blot鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。所用引物由上海生工生物工程公司合成，所述测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成。

实施例1、检测肺炎球菌的免疫层析试纸的制备

本发明检测肺炎球菌的免疫层析试纸的制备方法，可包括以下步骤：

一、重组肺炎球菌表面粘附素A的制备

1、5’端嵌合伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列的重组肺炎球菌表面粘附素A基因的克隆

根据文献(De BK，Sampsom JS，Ade EW，et al.Purification andcharacterization of Streptococcus pneumoniae palmitoylated pneumococcalsurface adhesin A expressed in Escherichia coli[J].Vaccine 2000，18：1811-1821.)中报道的肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)基因序列设计扩增5’端嵌合伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列(51bp)的重组肺炎球菌表面粘附素A嵌合基因的引物，在上游引物P1中引入限制性内切酶BamH I识别位点和OspA信号肽编码序列，在下游引物P2中引入限制性内切酶Hind III识别位点)，以将PsaA基因的先导序列(PsaA的信号肽为PsaA氨基酸残基序列中的前20个氨基酸残基)替换为伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列，引物序列如下：

P1(上游引物)：5’

-GG GGATCCATGAAAAAATATTTATTGGGAATAGGTCTAATATTAGCCTTAATAGCATGCGCTA

GCGGAAAAAAAGAT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点，黑体部分碱基为伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列)

P2(下游引物)：5’-GGG AAGCTTATTTTGCCAATCCTTC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)。

用加入5％脱纤维羊血(购自北京京顺动物养殖中心)的哥伦比亚琼脂培养基(购自bioMerieux公司)培养肺炎球菌010075株(购自军事医学科学院微生物菌种保藏中心)，用无菌生理盐水从培养斜面上洗下菌苔，收集菌液，离心集菌后，用细菌基因组提取试剂盒(TIANGEN公司)提取该株肺炎球菌的基因组DNA，于-20℃保存。以所提取的肺炎球菌010075株的基因组DNA为模板，以无菌水为阴性对照，在上、下游引物P1和P2的引导下PCR扩增嵌合基因psaA，PCR反应条件为：先94℃预变性2min；然后94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 90s，共30个循环；最后72℃延伸7min。反应结束后，取5μl PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道1为以肺炎球菌010075株的基因组DNA为模板的PCR扩增产物，泳道2为阴性对照的PCR扩增产物，泳道3为DL2000 DNA marker)，以肺炎球菌010075株的基因组DNA为模板经PCR扩增的DNA片段的长度约为921bp，与预期结果相符。用购自宝生物(大连)工程公司的DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化该目的片段，将其连接入到pMD18-T载体(Takara公司)中，再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(TIANGEN公司)，筛选阳性克隆，提质粒，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的5’端嵌合伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列的重组肺炎球菌表面粘附素A嵌合基因psaA。

2、psaA基因的原核表达载体的构建

将步骤1克隆的psaA基因用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pET32a(QIAGEN公司)用T₄DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞(TIANGEN公司)，将转化细胞接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上筛选阳性克隆，提质粒，用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示(泳道1为嵌合基因psaA扩增产物的BamH I和Hind III双酶切产物，泳道2为DL2000 DNA marker，泳道3为pET32a的BamH I和Hind III双酶切产物，泳道4为Surpercoiled DNA laddermarker(宝生物(大连)工程公司))，嵌合基因psaA为921bp，质粒pET32a为5.9kb，嵌合基因psaA的BamH I和Hind III双酶切产物的分子量约为900bp，经BamH I和Hind III双酶切后的pET32a呈开环状态，因此泳动速度较慢，位于分子量Marker的8023bp处，酶切鉴定结果与预期结果相符。再用测序的方法对阳性克隆质粒做进一步鉴定，测序结果表明获得了插入序列及位置均正确的含有嵌合基因psaA的原核表达载体，命名为pET32a-psaA，将转化有pET32a-psaA的重组大肠杆菌命名为E.coli BL21/psaA。

3、rPsaA的小规模发酵表达及SDS-PAGE检测

将步骤2构建的转化有pET32a-psaA的重组大肠杆菌E.coli BL21/psaA接种于含100μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中，在37℃、250rpm下培养至菌液OD₆₀₀为0.7-0.9时，添加IPTG至终浓度为1mM，然后在相同条件下继续培养5h，离心集菌，将菌体沉淀用TE裂解液(10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)悬浮，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，室温作用30min，超声破碎菌体，12000rpm离心20min，取沉淀、上清各1mL，12000rpm离心，用50μl纯水悬浮沉淀，加50μl 2×SDS凝胶加样缓冲液(100mmol/L Tris·HCl，200mmol/L DTT，4％ SDS，0.2％溴分蓝，20％甘油，pH6.8)，煮沸5min，离心后各取5μl进行SDS-PAGE检测。检测结果如图4所示(泳道1为蛋白分子量Marker，泳道2为超声破碎菌体沉淀，泳道3为上清液)，经IPTG诱导后，分子量约为52kD的重组PsaA(rPsaA)获得高效表达，且沉淀、上清中均有rPsaA，而rPsaA以存在于上清中的可溶性表达为主，包涵体形式表达较少，用Bandscan5.0软件分析表达量约为60％。天然PsaA的信号肽对于PsaA在大肠杆菌中的大量表达是低效的，用相同方法构建的含有930bp全长psaA基因的重组大肠杆菌的PsaA表达量仅为40％(Sampson JS，O’Connor SP，Stinson AP，et al.Cloning andnucleotide sequence analysis of psaA，the Streptococcus pneumoniae geneencoding a 37-kilodalton protein homologous to previously reportedStreptocuccus sp.adhesins[J].Infect Immun 1994，62：319-324.)。用OspA的信号肽基因序列替换PsaA的信号肽编码序列进行表达后，rPsaA的表达量明显提高，表明OspA的信号肽对PsaA的大量表达是非常有效的，分析原因可能是PsaA的信号肽多了3个疏水氨基酸残基，因而疏水性较强，使其在翻译后蛋白转运中不能有效的发挥作用(De BK，Sampsom JS，Ade EW，et al.Baculovirus expression，purification and evaluation of recombinant pneumococcal surface adhesion Aof Streptococcus pneumoniae[J].Pathobiology 1999，67：115-122.)。用PIERCE公司的镍螯合琼脂糖凝胶纯化试剂盒并按照试剂盒说明书对表达的rPsaA进行纯化。

4、rPsaA抗原活性的Western blot鉴定

1)甲醛灭活肺炎球菌免疫兔血清的制备

制备甲醛灭活肺炎球菌免疫兔血清，方法为：以0.5％甲醛灭活肺炎球菌010075株，配制成菌浓度为3×10⁸个菌/mL的菌液备用。选用体重约1.5kg健康雌性大耳白兔(购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心)，首次用福氏完全佐剂与菌液混合乳化后皮下少量多点注射，1mL/只，然后分别于初次免疫后第20日、第30日、第40日、第50天用不完全佐剂免疫追加免疫1针，追加剂量和途径与初次免疫相同，末次免疫后7天耳缘静脉采血进行凝集试验，结果2只大耳白兔的效价分别为1∶64、1∶128，颈动脉采血，离心收集抗血清，所得兔血清-20℃冻存备用。

2)rPsaA的Western blot检测

以步骤1)制备的甲醛灭活肺炎球菌免疫兔血清为一抗，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)为二抗对步骤3经纯化的rPsaA进行Western blot检测，同时以野生型大肠杆菌BL21破碎菌体和转化有pET32a空载体的重组大肠杆菌破碎菌体为对照，最后用DAB底物液(TIANGEN公司)显色并拍照。检测结果如图5所示(泳道1为野生型大肠杆菌BL21破碎菌体，泳道2为转化有pET32a空载体的重组大肠杆菌破碎菌体，泳道3为表达后未纯化的rPsaA，泳道4为纯化的rPsaA，泳道5为蛋白分子量Marker(Fermentas公司))，重组表达的rPsaA可特异地和甲醛灭活肺炎球菌免疫兔血清发生反应，表明所表达的rPsaA具有较好的抗原性，可和肺炎球菌抗体特异性结合。用上述方法构建的重组菌E.coli BL21/psaA可购自军事医学科学院微生物菌种保藏中心(保藏号：BL21/psaA)。

5、rPsaA的大量制备

可按下述方法大量制备肺炎球菌rPsaA抗原：

1)发酵

将含有rPsaA基因的工程菌(E.coli BL21/rPsaA)菌种接种在含95μg/mL(90-100μg/mL均可)氨苄青霉素的LB抗性平板上，在37℃普通孵箱中培养20-24小时，挑取平板上长出的单个典型菌落接种于10mL LB液体培养基中，在37℃、250-300rpm下振荡培养10-12小时，然后按1∶10的比例进行扩大培养(如将10mL菌液接种于100mL LB液体培养基中)，直至进入发酵反应器。发酵培养基为LB液体培养基中(每升含Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，pH7.0)，发酵时按1∶50比例进行接种，发酵中控制温度为(37±1)℃，搅拌转数350-500rpm，通气量1L培养基1L/min空气，发酵反应器用1M NaOH和30％(V/V)NaH₂PO₄溶液自动调节发酵液的pH值约为7.0，同时记录发酵液550nm处的吸光度(A值)，当发酵液A值约为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，搅拌转数和通气量不变，诱导3-4小时后，发酵结束。

2)肺炎球菌rPsaA抗原的粗提

将步骤1)获得的发酵液以8000-9000rpm离心10-15分钟收集菌体沉淀，按每g湿重菌体加1mL纯化水的比例放入匀浆机中，使菌体在低渗环境下匀浆(12±1kpa/cm²)破碎，收集匀浆液，即为粗制rPsaA抗原。取粗制rPsaA抗原100μl按常规法进行SDS-PAGE检测，结果在52Kd处有一条明显的蛋白带，与预期结果一致，表明经表达获得了rPsaA，且rPsaA蛋白含量约占总蛋白量60％以上。

3)肺炎球菌rPsaA抗原的纯化

取步骤2)获得的粗制rPsaA抗原，在4℃、8000-9000rpm下离心10-15分钟，弃沉淀，收集上清，再将上清于4℃、10000-12000rpm离心10-15分钟，弃沉淀包涵体，收集上清，对上清用固态硫酸铵法分级分离，方法为：根据硫酸铵浓度表计算加入固态硫酸铵的量，先向上清中加入固态硫酸铵至浓度为45％(m/V)，于4℃静置4-5小时后8000rpm离心15分钟，去除沉淀中的杂蛋白，再加固态硫酸铵至浓度65％(m/V)，于4℃静置4-5小时，8000rpm离心15分钟，使目的蛋白沉淀，弃上清，收集沉淀，将rPsaA置于透析袋中，用PBS(0.01M，pH7.0)透析液1000mL透析，间隔6小时更换透析液，直至达到平衡，最后4℃、10000-12000rpm离心10-15分钟，收集沉淀，沉淀即为纯化后的rPsaA抗原。

二、制备免疫胶体金探针及金标垫

1、制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针

用下述方法制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针：

1)制备胶体金溶液

采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl₄(购自Sigma公司，1g/瓶包装)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.7mL(1.6-1.8mL均可)的1％柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸10-15分钟，待液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液。为弥补因加热蒸发损失的水分，可用水将胶体金溶液恢复至原体积。取制作好的胶体金溶液1滴，附在有Formvar膜的铜网上，随后用滤纸吸走多余的液体，空气中自然干燥，于透射电镜下观察，胶体金颗粒呈圆形或椭圆形，大小均匀一致，计数100个金颗粒，颗粒直径约为25nm，符合实验设计要求。

2)确定胶体金偶联抗体饱和浓度

用0.2M K₂CO₃调节步骤1)制备的胶体金溶液的pH值至6.0-6.5，准备5支洁净试管，分别加入1mL胶体金溶液。将金黄色葡萄球菌蛋白A稀释为1mg/mL，分别向4支试管中加入5μl、10μl、15μl、25μl，另一支为空白对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置5-10分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量即为稳定1mL胶体金溶液所需抗体的最适浓度，以此为基础增加20％抗体量即为胶体金偶联抗体饱和浓度。结果：维持胶体金溶液颜色不变的抗体量为8-12μl，即8-12μg/mL，故选择偶联抗体浓度为8-12μg/mL。

3)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针

取50mL胶体金溶液，用0.2M K₂CO₃调pH值为6.0-6.5，按10μg/mL加入金黄色葡萄球菌蛋白A，得到50mL含有浓度为10μg/mL(8-12μg/mL均可)金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液，搅拌20-30分钟，然后加入2mL(1-3mL均可)10％PEG20000，继续搅拌20-30分钟，在9000-13000rpm下离心25-35分钟，弃上清，沉淀即为金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针。用0.25-0.4％的四硼酸钠溶液洗涤沉淀，并将其保存于0.25-0.4％的四硼酸钠溶液中，得到终浓度为10％的金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液。

2、制备金标垫

取金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液5mL，加入0.5g(0.25-0.5g均可)蔗糖，充分溶解后均匀加在玻璃纤维膜上，-40℃(-20℃至-50℃均可)冷冻7小时(5-8小时均可)，冻干机抽干，得到金标垫。

三、检测肺炎球菌的免疫层析试纸的制备

如图1所示(图中a为检测肺炎球菌的免疫层析试纸的正面结构图，图中b为检测肺炎球菌的免疫层析试纸的纵截面结构图)，检测肺炎球菌的免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维素膜(NC膜)3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上设有检测线5和质控线6，该试纸的制备方法包括以下步骤：

1)NC膜3的包被

肺炎球菌rPsaA抗原和质控金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的包被：用0.01M pH7.2 PB稀释肺炎球菌rPsaA抗原至终浓度为2mg/mL(2.0-4.0mg/mL均可)，用于包被检测线。用0.01M pH7.2的PBS稀释金黄色葡萄球菌蛋白A抗体至终浓度为4mg/mL(2.0-4.0mg/mL均可)，用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜3上，形成相互分离的检测线5和质控线6，37℃干燥2.5小时(2-4小时均可)。

2)检测肺炎球菌的免疫层析试纸的制备

将用吸水滤纸(购自Millipore公司)制的吸水垫4用双面胶粘贴于步骤1)得到的设有有检测线5和质控线6的NC膜3靠近质控线6的一端；将在步骤2中制备的金标垫2用双面胶粘贴于NC膜3靠近检测线5的一端；再在金标垫2的上用双面胶粘贴玻璃纤维膜样品垫(购自Millipore公司)1，得到检测肺炎球菌的免疫层析试纸，可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。

4、检测肺炎球菌的免疫层析试剂盒的制备

为了方便使用，将步骤3制备的检测肺炎球菌的免疫层析试纸的下面再紧密连接一塑料背板，再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

5、检测肺炎球菌的免疫层析试纸的使用方法和原理

测定时将试纸条样品垫1浸入液体标本中，样品垫1即吸取液体向上端移动，流经金标垫2时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中有待测特异抗原，其可与免疫金复合物的抗体结合，此抗原抗体复合物流至检测线5即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控线6与固相二抗结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。

Claims (10)

1、一种检测肺炎球菌的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线含有肺炎球菌表面粘附素A，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体。

2、根据权利要求1所述的检测肺炎球菌的免疫层析试纸，其特征在于：所述肺炎球菌表面粘附素A为野生型肺炎球菌表面粘附素A或经发酵表达的重组肺炎球菌表面粘附素A；所述检测线含有的肺炎球菌表面粘附素A的浓度为2.0-4.0mg/mL，所述质控线含有的能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度为2.0-4.0mg/mL。

3、根据权利要求1或2所述的检测肺炎球菌的免疫层析试纸，其特征在于：所述免疫层析试纸紧密连接有背板。

4、一种制备权利要求1或2或3所述的检测肺炎球菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)将肺炎球菌表面粘附素A溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述检测线的一端；

2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；

3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测肺炎球菌的免疫层析试纸。

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中肺炎球菌表面粘附素A为野生型肺炎球菌表面粘附素A或经发酵表达的重组肺炎球菌表面粘附素A；所述检测线含有的肺炎球菌表面粘附素A的浓度为2.0-4.0mg/mL，所述质控线含有的能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度为2.0-4.0mg/mL；将喷有肺炎球菌表面粘附素A溶液和金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体溶液的纤维素膜先在37℃下干燥2-4小时，再粘贴吸水垫。

6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述重组肺炎球菌表面粘附素A的表达方法为：构建5’端融合伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列的重组肺炎球菌表面粘附素A基因，再将该基因导入宿主细胞，培养宿主细胞使重组肺炎球菌表面粘附素A基因表达；所述5’端融合伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA信号肽编码序列的重组肺炎球菌表面粘附素A基因通过含有该融合基因的重组表达载体导入宿主细胞；用于构建所述重组表达载体的出发载体为pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a；以pET-32a为出发载体，构建的含有HR2抗病毒抑制子模拟蛋白基因的重组表达载体为pET32a-psaA；所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌；所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)plys、E.coli BLR(DE3)或E.coli B834；培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.1-5mmol/L，优选为1mmol/L，诱导温度为33-40℃，优选为37℃，诱导时间为3-7小时，优选为5小时。

7、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：向所述步骤2)中的金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；将金标垫在-20℃至-50℃冷冻5-8小时，并将其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴。

8、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液的制备方法，包括以下步骤：

1)将质量百分浓度为0.01％的氯化金水溶液加热煮沸，并将每100mL 0.01％HAuCl₄溶液进行如下操作：搅动下加入1.6-1.8mL质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；

2)将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至6-6.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为8-12μg/mL的金黄色葡萄球菌蛋白A，搅拌20-30分钟，然后加入1-3mL 10％PEG20000，继续搅拌20-30分钟，在9000-13000rpm下离心25-35分钟，弃上清，沉淀即为金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针；

3)将金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针保存于质量百分浓度0.25-0.4％的四硼酸钠溶液中，得到金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液。

9、根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针的制备方法的步骤1)中加入1％的柠檬酸三钠水溶液后再继续煮沸10-15分钟即得到胶体金溶液；步骤2)中用浓度为0.1-0.3M的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值；向胶体金溶液中添加的金黄色葡萄球菌蛋白A的终浓度为10μg/mL，10％PEG20000的添加量为2mL；步骤3)中金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液中金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针的终浓度为10％。

10、根据权利要求4-9任一项所述的制备方法，其特征在于：将所述步骤3)获得得的检测肺炎球菌的免疫层析试纸背面粘贴一背板；所述纤维素膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述吸水垫为吸水纸；所述样品垫为玻璃纤维膜。