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Bez.: "Prüfverfahren"
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PRÜFVERFAHREN Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Prüfverfahren
gegenüber antigenen oder potentiell antigenen Stoffen bzw. Substanzen, wie beispielsweise
Proteinhormonen, Steroide oder Arzneimittel. Ein Antigen ist eine Substanz, die
in der Lage ist, sich speziell an einen Antikörper zu binden.
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Ein Immunotest ist eine Methode zur Bestimmung der Anteilsmenge einer
bestimmten Substanz innerhalb einer Probe, wie beispielsweise einer Blut- oder Urinprobe.
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Die Verfahrenstechnik ist dabei sowohl sehr empfindlich (so können
beispielsweise Picogramm-Mengen an Steroiden mühelos erfaßt werden) als auch spezifisch.
Eine genaue Messung kleinerer Menge, während der Endstufe der Methode verleiht Empfindlichkeit,
während die Auswahl einer immunologischen Reagenz (Antikörper) Spezifität verleiht.
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Um im Hinblick auf ein spezifisches Antigen einen Immuntest durchzuführen,
benötigt man einen Antikörper zu diesem Antigen, wie auch ein reines indiziertes
Antigen als Markierungselement. Die Indizierung kann in der Weise erfolgen, daß
man das radioaktive Atom (die radioaktiven Atome) durch ein nicht-radioaktives Atom
(nichtradioaktive Atome) in dem Antigen ersetzt (das heißt, Tritium wird durch Wasserstoff
ersetzt oder Kohlenstoff 14 durch Kohlenstoff 12); andererseits kann eine solche
Indizierung durch Hinzugabe eines radioaktiven Atoms (beispielsweise Iodin-125)
oder durch Ergänzung des Antigens durch ein solches Material, das anhand einer definierten
quantifizierbaren Eigenschaft (beispielsweise
eines Enzyms) nachgewiesen
werden kann.
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Im Rahmen der Durchführung des Verfahrens wird eine bekannte Menge
des indizierten Antigens mit dem entsprechenden Antikörper und mit dem nicht-indizierten
Antigen vermischt, dessen Anteilsmenge bestimmt werden soll.- Sobald ein Gleichgewicht
hergestellt worden ist, bindet sich ein Anteil der indizierten Antigenmoleküle an
die Antikörpermoleküle und ein Anteil der nicht-indizierten Antigenmoleküle gleichfalls
an die Antikörpermoleküle. Der jeweilige Anteil einer jeden an den Antikörper gebundenen
Antigen-Art oder -Spezies, bzw. der verbliebene Restanteil einer jeden nicht an
den Antikörper gebundenen Spezies, ist kennzeichnend für die ursprünglich vorhandene-Menge
an nicht-indiziertem Antigen. Es ist deshalb erforderlich, die ungebundenen (freien)
Antigene von den gebundenen Antigenen zu trennen, wonach eine Messung des indizierten
in einem oder beiden getrennten Fraktionen vorhandenen Antigens die Möglichkeit
gibt., die Anteilsmenge des ursprünglich vorhandenen nicht-indizierten Antigens
zu bestimmen.
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Bei den bekannten Verfahrenstechniken, die der Durchführung des Immuntests
zugrunde liegen, gibt es eine Reihe spezieller Erfordernisse und Voraussetzungen
zu beachten. So gibt es zum einen die Voraussetzung einer bestimmten Inkubationszeit
und außerdem die Notwendigkeit der Durchführung einer Methode, in deren Rahmen freies
Antigen von antikörpergebundenem Antigen getrennt werden muß.
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Diesbezüglich gibt es eine Reihe verschiedener Trennungsmethoden,
wie beispielsweise die Adsorption der freien Fraktion durch Aktivkohle, die Verwendung
einer Doppel-Antikörper-Technik (bei der ein weiterer Antikörper verwendet wird,
der die Aufgabe hat, sich mit den gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexen zu verbinden)
oder eine Festphasen-Technik.
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Ein Beispiel für diese letztgenannte Verfahrensweise besteht in einer
Methode, bei der- der Antikör-per an der Innenseite von Kunststoffröhren an das
Antigen fixiert wird. Nach einer bestimmten Inkubationszeit kann die freie ungebundene
Antigen-Fraktion abgezogen und quantifiziert werden.
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Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Immuntest-M-ethode
zu entwickeln, bei dQr auf die oben erwähnte zeitintensive und anlagenabhängige
Phase verzichtet werden kann und -die vielmehr auf der Grundlage verhäl-tnismäßig
einfacher schneller un-d unkomplizierter Verfahren durchgeführt werden kann.
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Ausgehend von dieser Zielsetzung bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf eine Methode zur Durchführung des Immuntests eines Antikorperss in dessen Rahmen
ein Flüssigkeitsgemisch,-bestehend aus: a) einer bekannten Menge (die auch gleich-
null ein kann) an indiziertem Antigen, zusammen mit b) dem zu testenden nicht-indizierten
Antigen veranlaßt wird über bzw. durch eine Trägersubstanz, Grundmasse oder ein
Substrat zu fließen, in dem Antikörper des Antigens immobilisiert sind, so daß sowohl
die indizierten als auch die nicht-indizierten Antigene durch eine Verbindung mit
den Antikörpern ausgeschieden werden, wonach dann anschließend die Strecke bestimmt
wird, die das indizierte Antigen innerhalb des besagten Gemischs zuruckgeSegt hat,
um auf diese Art und Weise eine quantitative Indikation bezüglich des nicht-indizierten
Antigen-Anteils innerhalb des besagten Gemischs zu erhalten.
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- Die Intensität9 mit der das indizierte und deshalb nachweisbare
Antigen ausgeschieden wird, hängt von der Anteilmenge des nicht-indizierten Antigens
ab, wobei es
einleuchtet, daß deren Bewegung dem des Gesamtantigens
nahekommt, wodurch es möglich ist, die jeweiligen Anteilsmengen in dem ursprünglichen
Gemisch rechnerisch zu bestimmen.
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Bei der der Erfindung zugrunde liegenden Methode kann das Antigen
so indiziert werden, wie dies in der Einführung zu der vorliegenden Spezifikation
beschrieben wird.
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Die Fließbewegung des Gemischs aus indiziertem und nichtindiziertem
Antigen kann durch ein chromatographisches Verfahren herbeigeführt werden, bei dem
das Gemisch durch schmale Streifen, beispielsweise aus Papier fließt, auf dem die
spezifischen Antikörper des Antigens immobilisiert sind. Nach der Chromatographie
kann die Verteilung des indizierten Antigens entlang der schmalen Streifen bestimmt
werden, so daß die ursprüngliche Anteilsmenge des nicht-indizierten Antigens rechnerisch
ermittelt werden kann.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß
zum Zwecke der Durchführung des Immuntests an einem Antigen ein Komplex entwickelt
wird, der eine Grundsubstanz, ein Trägermaterial oder Substrat umfaßt, in dem Antikörper
immobilisiert sind, die für das Anti gen spezifisch sind, zusammen mit entsprechenden
Mitteln, die es ermöglichen, daß ein flüssiges Medium, das sowohl indizierte als
auch nicht-indizierte Antigene enthält, über bzw. durch das besagte Grundmaterial,
Grundsubstanz oder Substrat geführt wird.
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Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher
erläutert: Nehmen wir an, daß es sich bei dem zu testenden Antigen um Oestriol-16C(-Glukuronid
(E3Gr handelt. Hiebei handelt es sich um ein Steroid, dessen Anteile während einer
normalen menschlichen Schwangerschaft gesteigert werden'. Veränderungen dieser Konzentrationsanteile
sind
dabei ein Indiz für das Befinden des Foetus.
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Als spezifischer Antikörper zu dem E3G wird Anti-Oestriol-160S-Glukuronid
(Titer 1:200) verwendet, das auf der Grundlage immunologischer Standardmethoden
hergestellt wird. Diese Substanz wird über einem Grundmaterial, einer Grundsubstanz
oder einem Substrat in Form eines schmalen Streifens aus Papier immobilisiert, Um
dies zu bewirken, wird das Papier zunächst aktiviert, um den Antikörper aufzunehmen.
Bei dem verwendeten Papier handelt es sich um Whatman-Filterpapier, während die
Aktivierung durch Zyanbromid bewerkstelligt wird.
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Das Papier wird in Streifen von beispielsweise 8 cm Länge und 1 cm
Breite geschnitten. Diese Streifen werden an Halterungen befestigt, die parallel
verlaufende voneinander getrennte Schrauben aus geeignetem Kunststoffmaterial enthalten,
deren Schäfte durch entsprechende Löcher in jedem Streifen hindurchführen. Die Streifen
selbst werden dabei durch Unterlegscheiben bzw. Distanzscheiben auf den Schäften
voneinander getrennt gehalten.
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In dieser Anordnung wurden die Papierstreifen in ein Gefäß gegeben,
das ein 2 M-Karbonat-Puffergemisch (pH-Wert 11,0) enthielt, das durch ein Gemisch
aus Eis und Wasser auf einer Temperatur von 4 - 6°C gehalten wurde. Danach wurde
das Zyanbromid, das in einem Minivolumen von N-Methyl-2-Pyrrolidon aufgelöst worden
war, tropfenweise auf das Papier beaufschlagt, so daß es zu keiner merklichen Temperaturerhöhung
kam.
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Dann ließ man das Papier in dem Gemisch aus Puffermaterial/Aktivator
etwa 15 Minuten lang bei gelegentlichem Umrühren, ehe man das Papier in einen gekühlten
Sintertrichter einführte und wechselweise mit einem gekühlten Aceton/Wasser-Gemiscfi
(5 Volumenprozente) bzw. einer O,lM-Natrium-Bikarbonat-Pufferlösung (pH-Wert 0,5)
nachwusch.
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Der Anti-Oestriol-16ce-Glukuronid-Antikörper wurde mit der O,lM-Natrium-Bikarbonat-Pufferlösung
(5 Liter -pH-Wert 9,5) vermischt und solange auf eine Temperatur von 40C eingestellt
bis das aktivierte Läuterpapier dort eingetaucht war. Nachdem es wieder aus der
Antikörperlösung herausgenommen worden war (die Lösung selbst wurde abgezogen und
zum Zwecke der Wiederverwendung abgestellt), wurde das Papier mit Hilfe einer geeigneten
Pufferlösung erschöpfend ausgewaschen, (das heißt solange bis man nach kräftigem
Mischen keine Schaumbildung mehr feststellen konnte) um auf diese Art und Weise
das nicht-kovalent absorbierte Protein auszuschalten. Das Papier ließ man dann be-i
Raumtemperaturen trocknen, um es dann in getrocknetem Zustand in einer Schraubflasche
aufzubewahren bis es für den praktischen Einsatz benötigt wurde.
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Danach teilte man jeden Papierstreifen so auf, daß jeder Streifen
zwei schmale Streifen voh jeweils 8 cm Länge und 0,5 cm Breite ergab. Ein jeder
dieser schmalen Streifen wurde in Längsrichtung in Abständen von 0,5 cm markiert.
Diese Streifen besaßen natürlich jeweils den auf ihm immobilisierten Antikörper.
In der Praxis würden solche schmalen Streifen natürlich vorbereitend präpsriert
werden und als Bestandteile eines Bausatzes geliefert werden, der zur Durchführung
der der Erfindung zugrunde liegenden Methode verwendet werden kann.
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Es wurde dann eine Lösung aus indiziertem E3G hergestellt, beispielsweise
durch Auflösung von mit Tritium behandeltem Oestriol-16C<-Glukuronid in Methanol,
so daß Sul ca. 1.000 Teilchen pro Minute enthielten (entsprechend'v14 pg Steroid)
und somit Tritium als die Markierung in diesem Antigen enthalten ist. Diese Lö-Lösung
wurde dann zusammen mit einer im voraus festgelegten Quantität des getesteten Antigens
auf einem der
beschriebenen schmalen Streifen zur Einwirkung gebracht,
und zwar entweder als Gemisch oder für sich getrennt, das heißt durch Tüpfeln, was
in jeder Reihenfolge vorgenommen werden kann, ohne daß dadurch die Endergebnisse
beeinflußt werden.
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Nunmehr wird der schmale Streifen vertikal ausgerichtet und ein geeignetes
Lösungsmittel, beispielsweise Elycorol und Wasser, die zu gleichen Teilen miteinander
vermischt wurden, appliziert, und zwar in der Weise, daß es durch Kapillarwirkung
von der Unterseite des schmalen Streifens aus nach oben ansteigen kann. Danach wird
der schmale Streifen wieder entfernt und getrocknet, wonach man davon ausgehen kann,
daß die Verteilung des indizierten E30's in dem schmalen Streifen ein Maß für die
zuvor vorhandene nicht-indizierte E3G-Menge ist. Diese Bestimmung konnte auf einfache
Art und Weise in der Form vorgenommen werden, daß man den schmalen Streifen erneut
durch eine geeignete Pufferlösung zog. Danach erfolgt eine chromatographische Bestimmung
in einem Zählröhrcheneinsatz, was etwa 5 bis 10 Minuten in Anspruch nimmt. Nachdem
der schmale Streifen wieder aus dem Röhrchen herausgenommen worden war, wurde er
in 2 Stücke von 0,5 cm zerschnitten und nach Zugabe von Scintillationsflüssigkeit
NE 260 (4ml) die Radioaktivität eines jeden dieser Stücke gemessen. Die Gesamtzahl
an Teilchen, die zunächst appliziert wurde, wurde als die Summe der Teilchen in
den getrennten Abschnitten bestimmt. Der Prozentsatz der in jedem Stück vorhandenen
Teilchenzahl wurde dann errechnet und in Abhängigkeit von der Position innerhalb
des ursprünglichen schmalen Streifens aufgezeichnet.
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Man erkennt auf diese Art und Weise, daß, indem das Lösungsgemiach
aus indiziertem und nicht-indiziertem E3G (die, falls gewünscht, zuvor mit dem Lösungsmittel
aus Glyzerol und Wasser vermischt worden sein konnte, anstatt,
wie
oben beschrieben, betüpfelt zu werden) durch das Lösungsmittel getragen, den schmalen
Streifen durchdringt, sowohl das indizierte als auch das nicht-indizierte E3G durch
Verbindung mit den immobilisierten Antikörpern aus der Lösung ausgeschieden wird
und daß der Anteil an ausgeschiedenen indizierten E3G-Molekülen abhängig ist von
der Anzahl vorhandener nichtindizierter E3G-Moleküle. Bei unterschiedlichen Anteilsmengen
an nicht-indiziertem E3G wird eine bestimmte Menge an indiziertem E3G ein verändertes
Verteilungsbild entlang dem schmalen Streifen zeigen. Bei der beschriebenen Verfahrenstechnik
handelt es sich um eine sehr einfache, schnelle und bequeme Methode zur Prüfung
des Antigens. Dank dieser Methode erübrigt sich die Notwendigkeit der Berücksichtigung
einer Inkubationszeit und die Notwendigkeit einer Trennung zwischen freien und gebundenen
Antigenen. Didse Phasen werden durch die beschriebene Chromatographie ersetzt.
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Die der Erfindung zugrunde liegende Methode kann in Verbindung mit
einem weiten Bereich von Antigenen, wie beispielsweise Steroiden, Progesteronen,
Hormonen und Insulin angewandt werden. Im Gegensatz zu Elektrophorese-Methoden kann
das Verfahren mit elektrisch nicht-aufgeladenen Antigenen sowie mit kleinen Antigenen
durchgeführt werden. Dank ihrer Einfachheit und insbesondere der Möglichkeit, auf
die Trennung freier von gebundenen Antigenen in jeder Verfahrensstufe verzichten
zu können, liefert diese Erfindung eine Methode, die leicht auch automatisiert werden
kann. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß es eine einfache Sache ist, verschiedene
Tests im Hinblick auf verschiedene Antigene zu einem einzigen gemeinsamen Vorgang
zu vereinen. Bei dieser zuletzt genannten Methode könnte beispielsweise ein einziger
schmaler Streifen mit verschiedenen Abschnitten verwendet werden, der mit Antikörpern
je nach den einzelnen unterschiedlichen Tests bestückt ist. Dabei ist zu beachten,
daß es sich bei dem zu messenden Parameter
nicht um die Enzym-Tätigkeit,
Radioaktivität oder um andere qualitative Eigenschaften handelt, die sich aus der
Versetzung mit Radioisotopen ergeben. Vielmehr handelt es sich bei dem zu messenden
Parameter um die Strecke, die auf der Grundmasse zurückgelegt wird.
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Was die praktische Durchführung der Erfindung betrifft, so kann die
Beaufschlagung des indizierten Antigens mit Radioisotopen auch in anderer Form als
durch eine Behandlung mit Tritium erfolgen. So könnte es beispielsweise mit einem
Enzym oder einem lichtimitierenden Enzym, wie zum Beispiel Luciferase oder mit einem
fluoreszierenden Mittel, gekoppelt werden, so daß eine Bewertung auf photometrischem
Wege durchgeführt werden könnte. Es kann sogar möglich sein, einen elektronischen
Sensor einzubauen, der in der Lage ist, in der Grundmasse eingebettete Transistoren
oder Gatter zu schalten, so daß die Ergebnisse unmittelbar aus der Grundmasse abgeleitet
werden können. Aber auch andere Variationen sind möglich.
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Wenngleich die der Erfindung zugrunde liegende Methode in der Weise
beschrieben wurde, daß zu deren Durchführung ein schmaler Streifen verwendet werden
muß, können auch andere Vorrichtungen, so beispielsweise ein Streifen oder ein Röhrchen,
die mit einer geeigneten polymeren Substanz beschichtet worden sind, als Grundsubstanz
für die Immobilisierung der Antikörper verwendet werden.