CN110042166A - 用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于双重PCR检测猪Foxp3、IL‑10基因的引物、试剂盒及其应用。用于双重PCR检测猪Foxp3、IL‑10基因的引物组，由核苷酸序列如SEQ ID NO.1，2，5和6所示的引物组成。用于猪Foxp3、IL‑10基因的TaqMan实时荧光定量PCR检测的试剂，包含所述引物组以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7和8所示的荧光探针。本发明的试剂和方法具有检测快速、敏感性高、特异性好、检测结果稳定可靠的优点，可实现对大规模样品的快速定量检测，对于评价猪体的免疫应答水平和免疫稳态具有重要意义。

Description

用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于免疫调控分子猪Fxop3和IL-10的双重PCR检测的引物、试剂盒及其应用。
背景技术
调节性T淋巴细胞(Regulatory T Cell,Treg)是体内针对自身和外来抗原下调抗原特异性T淋巴细胞应答、抑制免疫病理损伤的CD4+T淋巴细胞亚群，在免疫应答调控和维持机体免疫稳态中发挥重要作用。Treg细胞根据活化方式和膜标志分子不同，分为nTreg(天然性Treg,natural Regulatory T Cell)和iTreg(诱导性Treg,induced Regulatory TCell)，其中，nTreg在胸腺内分化、发育和成熟，在外周血中占CD4+T细胞总数的5-10％，nTreg限制免疫效应应答的强度，维持机体对感染的适度性应答，nTreg数量的变化直接反映机体的免疫状态和感染的进展，是临床免疫功能监测的重要指标。
Foxp3(forkhead box P3 protein，Foxp3)是叉头状转录因子成员，特异性表达于Treg细胞表面，在Treg发育和功能上是必须的，Foxp3的高表达通过多种机制赋予Treg细胞的免疫抑制功能。
白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)，可由T细胞、巨噬细胞、DC细胞和B细胞等多种免疫细胞分泌，是Treg发挥免疫负调控的重要细胞因子，可同时介导Th1和Th2的免疫应答负反馈调控。
现有的检测Foxp3和IL-10的方法主要集中在人类和小鼠上，对猪的相关因子检测还没有成熟的试剂盒产品，因此开发能同时、一步法检测猪Foxp3和IL-10的定量检测试剂盒，实时检测因子动态变化，能对猪体内的免疫状态评价和疫苗推广使用提供良好的数据支撑。
发明内容
为满足上述领域的需求，本发明提供用于双重PCR检测猪Treg标志分子Foxp3和功能因子IL-10的引物组、试剂、试剂盒及其应用，可实现对Foxp3、IL-10的同步、快速、定量检测。
本发明的一个目的是提供用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物组，其特征在于，包含如下引物：
Foxp3–F：5′-GGCATCATCTGACAAGGGTT-3′；
Foxp3-R：5′-TTGTGAAAGAAATCTGGGAA-3′；
IL-10-F：5′-GCGACTTGTTGCTGACCG-3′；
IL-10-R：5′-CCATCACTCTCTGCCTTC-3′。
本发明的另一个目的是提供用于猪Foxp3、IL-10基因TaqMan实时荧光定量双重PCR检测的试剂，其特征在于，包含所述引物组，以及如下荧光探针：
Foxp3-荧光探针：核苷酸序列为5′-GTATTGTAGCCACTGGCACC-3′，其5′末端连接第一荧光基团，3′连接第一淬灭基团；
IL-10-荧光探针：核苷酸序列为5′-CTGCTGGAGGACTTTAAGG-3′，其5′末端连接第二荧光基团，3′连接第二淬灭基团；
所述第一荧光基团与所述第二荧光基团发射的荧光信号不同。
优选地，所述第一荧光基团为荧光基团FAM；所述第二荧光基团为荧光基团CY3；所述第一淬灭基团和所述第二淬灭基团均为淬灭基团TAMRA。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，其特征在于，包含所述引物组或所述试剂；其中，引物Foxp3-F、Foxp3-R、IL-10-F、IL-10-R、Foxp3-荧光探针和IL-10-荧光探针独立包装或混装在一起。
所述试剂盒可以是普通PCR试剂盒，包含上述引物组，用于对猪Foxp3、IL-10基因进行双重PCR检测。优选所述引物Foxp3-F，Foxp3-R，IL-10-F和IL-10-R的浓度为5～20μmol/L，优选5μmol/L。所述试剂盒也可以是TaqMan的实时荧光定量双重一步法RT-PCR试剂盒，包含任一所述的试剂，经过一次实时荧光定量RT-PCR反应即可同时定量待测样品中猪Foxp3、IL-10基因的转录水平。优选所述Foxp3-荧光探针和IL-10-荧光探针的浓度为10～50μmol/L，优选15μmol/L。
优选地，所述引物Foxp3-F、Foxp3-R、IL-10-F、IL-10-R、Foxp3-荧光探针和IL-10-荧光探针混装在一起，其摩尔比为1:1:1:1:6:6。
优选地，所述试剂盒还包括标准阳性对照、标准阴性对照和PCR扩增反应液；所述标准阳性对照为含Fxop3和IL-10基因的重组质粒18-T-Fxop3-IL-10，其中Foxp3和IL-10串联重组，定向插入18-T的多克隆位点；所述标准阴性对照为RNase FreedH2O；所述PCR扩增反应液包括：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ、Ex Taq HS、PrimeScriptRT Enzyme Mix Ⅱ、RNase Free dH2O和RNase Inhibitor。在一些实施例中，将所述PCR扩增反应液分装于100μL八连管中，规格为27μL/管，密封后4℃条件保存。使用时，只需分别加入提取的RNA模板3.0μL、阳性对照和阴性对照各3.0μL。
本发明的另一个目的是提供所述引物组或所述试剂或所述试剂盒在猪Foxp3、IL-10基因双重PCR检测中的应用。
本发明还有一个目的是提供一种TaqMan实时荧光定量PCR检测猪Foxp3、IL-10基因转录水平的方法，其特征在于，采用所述试剂或试剂盒进行检测，包括如下步骤：
(1)以含Fxop3和IL-10基因的重组质粒为模板，利用所述试剂或试剂盒中的引物和荧光探针进行实时荧光定量双重PCR反应，以基因拷贝数的log[10]对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程式；
(2)提取待测样品的总RNA，利用所述试剂或试剂盒中的引物和荧光探针进行实时荧光定量双重RT-PCR反应，获得Foxp3和IL-10基因的Ct值；
(3)将Foxp3和IL-10基因的Ct值分别代入各自的标准曲线方程式，计算得到猪Foxp3和IL-10基因的拷贝数，其代表了待测样品中猪Foxp3和IL-10基因的转录水平。
优选地，所述PCR反应体系为：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 15.0μL、Ex TaqHS 0.5μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL、5μmol/L Foxp3-F/R各0.5μL、5μmol/LIL-10F/R各0.5μL、15μmol/L Foxp3-荧光探针1.0μL、15μmol/L IL-10-荧光探针1.0μL、RNase Free dH2O 6.0μL、RNase Inhibitor 1.0μL和RNA模板3.0μL；
所述PCR反应程序为：42℃8min；94℃30s；94℃15s，62℃10s，40个循环；
优选地，所述Foxp3基因的标准曲线方程式为Y＝-3.235X+40.938；所述IL-10基因的标准曲线方程式为Y＝-3.426X+40.190；其中，X代表基因拷贝数的log[10]对数值，Y代表Ct值。
双重实时荧光定量PCR由于其在一个反应管中同时进行2个基因的同步定量扩增，存在荧光信号干扰，各引物组和探针组Tm值差异过大，引物和探针相互干扰等问题。在引物、探针设计时，Tm值应尽量一致，一般上下不超过5℃，其次在探针荧光基团选择需要尽量降低其信号的干扰，一般选择其吸收波长差异明显的荧光基团。在同一反应体系中包含两组引物和探针，如果引物和探针的组合、浓度及配比不合理，将导致非特异性条带的产生或靶标条带无法扩增。需要对引物浓度、探针浓度以及引物与探针的配比等进行系列优化，以确定最佳的反应体系。此外，由于反应液组分复杂，还需要优化反应程序中各步骤的反应温度、反应时间，以减少非特异性反应，降低各组分间的干扰，获得准确的定量检测结果。
本发明提供了用于猪Foxp3、IL-10基因的TaqMan实时荧光定量PCR检测的试剂、试剂盒及检测方法，可通过一步法双重RT-PCR，同步对Foxp3和IL-10基因转录的mRNA进行检测，操作简便易行，提高了检测效率。本发明筛选的两组引物和两对探针，能够特异性地结合同一反应体系中两个基因的目的片段，相互之间不发生交叉反应。优化后的Foxp3和IL-10双重荧光定量PCR检测方法，阴性对照无Ct值，阳性对照Ct值均小于30，扩增曲线呈现典型的“S”型扩增曲线。本发明有效提高了检测结果的特异性、敏感性和稳定性，实现了对猪Treg标注分子Foxp3和分泌性效应因子IL-10的快速准确定量，对于判定猪群的免疫应答状态和指导临床疫苗免疫具有重要意义。
附图说明
图1.Foxp3、IL-10双重RT-PCR扩增结果；其中M：DNA Marker DL2000；1-2：Foxp3、IL-10双重PCR阳性扩增，Foxp3目的片段大小为165bp，IL-10目的片段大小为121bp；3：阴性对照。
图2.Foxp3、IL-10双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线；其中横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度，1：Foxp3扩增曲线；2：IL-10扩增曲线；3：阴性对照。
图3.Foxp3、IL-10双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR标准曲线绘制；其中横坐标为基因拷贝数的log[10]对数值，纵坐标为Ct值。
图4.Foxp3、IL-10双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒特异性检测；其中横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度，1：Foxp3阳性扩增；2：IL-10阳性扩增；3-9：分别为TGF-β、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17核酸和阴性对照扩增。
具体实施方式
主要试剂与仪器
动物组织RNA提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒均购于北京百泰克生物科技有限公司；Oligo dT、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker、RNase Inhibitor、2×one step RT-PCRbuffer III、ExTaq HS、Prime Script RT Enzyme Mix II、RNase Free dH2O、18-T载体等购自TakaRa公司；质粒提取试剂盒购于BioDev-Tech.Co.Ltd；大肠杆菌DH5α购于北京全式金生物技术有限公司；NanoDrop2000超微量核酸蛋白检测仪购自Thermo公司；LightCycler 480荧光PCR仪购自美国罗氏公司。
本发明的下述实施例中，未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可；未特别说明的实验方法，均为本领域常规实验方法，例如，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或制造厂商提供的说明书。
实施例1.Foxp3、IL-10双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
1.引物与探针设计
根据GenBank数据库中猪Foxp3(GenBank序列号：AM999538.1)和IL-10(GenBank序列号：L20001.1)的基因序列，使用Premier 5.0软件设计引物和探针并进行筛选，获得了能够用于双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测的特异性引物和探针组合(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。
表1.荧光定量PCR引物与探针
2.标准模板制备
根据动物组织RNA提取试剂盒的说明书，提取猪脾脏的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，25.0μL体系中加入2×one step RT-PCR buffer III 12.5μL，ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL，上下游引物(10μmol/L)各1.0μL，模板2.0μL，RNaseFree dH2O补充至25.0μL。反应条件为：51℃10min，93℃2min；93℃15s、57℃20s、72℃15s，30个循环；72℃5min。Foxp3和IL-10的目的片段长度分别为165bp和121bp。
利用PCR产物回收试剂盒回收纯化Foxp3 PCR产物，用Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ内切酶酶切后，连接于18-T载体的多克隆位点，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并使用质粒提取试剂盒提取重组质粒Foxp3-T。将IL-10 PCR产物回收纯化后连接到构建的Foxp3-T重组质粒T末端，构建Foxp3和IL-10串联重组体。测定重组质粒浓度，并根据拷贝数计算公式换算成拷贝数。按10-1～10-8梯度倍比稀释阳性重组质粒，保存于-20℃备用。
结果如图1所示，获得了与预期大小相同的目的基因片段。经检测，构建的重组质粒浓度为537ng/μL，换算DNA拷贝数为1.28×1011copy/μL，DNA测序结果，经Blast比较，同GenBank中已发表的猪Foxp3和IL-10的序列同源性均为100％。
3.Foxp3、IL-10双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR反应条件的优化
PCR反应体系：总体积30μL，包括2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 15.0μL、Ex TaqHS 0.5μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5μL、Foxp3-F/R、IL-10F/R、Foxp3/IL-10-荧光探针、RNase Inhibitor 1.0μL和RNA模板3.0μL，RNase Free dH2O补足30.0μL。
上述反应体系中，将Foxp3–F/R的浓度设为5μmol/L，体积分别设为0.25μL、0.5μL、1.0μL；将IL-10F/R的浓度设为5μmol/L，体积分别设为0.25μL、0.5μL、1.0μL；将Foxp3-荧光探针的浓度设为15μmol/L，体积分别设为0.5μL、0.75μL、1.0μL、1.25μL和1.5μL；将IL-10-荧光探针的浓度设为15μmol/L，体积分别设为0.5μL、0.75μL、1.0μL、1.25μL和1.5μL；将Foxp3-F/R引物和Foxp3-荧光探针的摩尔比分别设为2∶3，1∶3，2∶9和1∶6；将IL-10F/R引物和IL-10-荧光探针的摩尔比分别设为2∶3，1∶3，2∶9和1∶6。分别进行PCR反应，筛选最佳反应体系。
PCR反应程序：42℃8min；94℃30s；94℃15s，54～62℃10s，40个循环，进行退火温度优化。
经优化，确定的反应体系为：总体积30μL，2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 15.0μL、Ex Taq HS 0.5μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL、5μmol/L Foxp3-F/R各0.5μL、5μmol/L IL-10F/R各0.5μL、15μmol/L Foxp3-荧光探针1.0μL、15μmol/L IL-10-荧光探针1.0μL、RNase Free dH2O 6.0μL、RNase Inhibitor 1.0μL和RNA模板3.0μL。反应程序为：42℃8min；94℃30s；94℃15s，62℃10s，40个循环。
经优化后的Foxp3和IL-10双重荧光定量PCR检测方法，阴性对照无Ct值，Foxp3和IL-10阳性对照Ct值均小于30，扩增曲线呈现典型的“S”型扩增曲线(图2)。
4.标准曲线绘制
按10-1～10-8梯度倍比稀释阳性重组质粒，得到101～108拷贝/μL的8个梯度标准品质粒，作为标准模板，设置阴性对照孔，阴性对照采用经2次蒸馏处理的RNase Free dH2O，用优化的荧光定量PCR程序进行扩增，生成熔解曲线，绘制标准曲线，计算样品扩增Ct值。标准曲线Y轴为Ct值，X轴为标准品拷贝数的log[10]对数值。
PCR体系：总体系30μL，2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 15.0μL、Ex Taq HS 0.5μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL、5μmol/L Foxp3-F/R各0.5μL、5μmol/L IL-10F/R各0.5μL、15μmol/L Foxp3-荧光探针1.0μL、15μmol/L IL-10-荧光探针1.0μL、RNase FreedH2O 6.0μL、RNase Inhibitor 1.0μL和RNA模板3.0μL。
PCR程序为：42℃8min；94℃30s；94℃15s，62℃10s，40个循环。
结果如图3所示，在101～108拷贝/μL时，Ct值与浓度之间有较好的线性关系，其回归方程分别为，Foxp3：Y＝-3.235X+40.938；IL-10：Y＝-3.426X+40.190，且R2≥0.99，效率分别为97.5和96.8，均在90％～110％，说明误差较小，可信度较高。因此可以根据所检测临床样品的Ct值，并参照标准曲线对临床样品进行检测。
实施例2.Foxp3、IL-10双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒研制
1.主要试验材料
引物组、探针组、标准阳性对照、标准阴性对照、PCR扩增反应液同实施例1。动物组织RNA提取试剂盒、RNase Inhibition、M-MLV、PCR产物回收试剂盒均购于北京百泰克生物科技有限公司。PCR八连管购于美国罗氏公司。
2.试剂盒组成及组装
按照优化后的反应体系和扩增程序，确定各反应组份，组装成试剂盒。
试剂盒主要包括：引物组、探针组、标准阳性对照、标准阴性对照和PCR扩增反应液。其中，引物组包括Foxp3-F、Foxp3-R和IL-10-F、IL-10-R，浓度为5μmol/L，其在30μL反应体系中各添加0.5μL，体积比为1:1:1:1。探针组由Foxp3-荧光探针和IL-10-荧光探针组成，浓度为15μmol/L，按1:1的体积比在30μL反应体系中各添加1.0μL。PCR反应液包括：2×OneStep RT-PCR Buffer Ⅲ、Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ、RNase Free dH2O和RNase Inhibitor，在30μL反应体系中的添加量同实施例1。其中引物组、探针组和PCR反应液按比例混合后分装入100μL八连管中，27μL/管。标准阳性对照、标准阴性对照分装1mL冻存管中，50μL/管。其中，标准阳性对照为实施例1获得的阳性重组质粒18-T-Fxop3-IL-10，浓度为537ng/μL；标准阴性对照为经2次蒸馏处理的RNase Free dH2O。
组装的试剂盒规格分为40T/盒和80T/盒2种，存储条件为4℃或-20℃。
3.试剂盒特异性检测
核酸制备：根据GenBank数据库中已知的TGF-β，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6和IL-17基因序列，选取其高度保守编码区基因片段，送上海生工进行人工合成其核苷酸序列，获得对应的标准核酸模板，其对应的GenBank号、位置和产物大小如表2所示。
表2
基因名称 GenBank号 基因片段的位置 片段大小(bp)
TGF-β AF461808.1 112－1284bp 1173
IFN-γ DQ902588.1 2－588bp 587
IL-2 EU249805.1 1－465bp 465
IL-4 AB174765.1 121－522bp 402
IL-6 AF518322.1 1－639bp 639
IL-17 AB102693.1 58－759bp 702
利用组装的试剂盒对TGF-β，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6和IL-17核酸进行荧光定量RT-PCR扩增，同时设置分离活化的CD4+CD25+的Tregs细胞总RNA为阳性对照，阴性对照采用经2次蒸馏处理的RNase Free dH2O，每个样品设置2个重复，检测试剂盒的特异性。反应体系和反应程序同实施例1中优化的体系和程序。
特异性检测结果如图4所示，仅含Foxp3和IL-10核酸的模板出现特异性扩增曲线，且Ct值均小于30，而其它核酸模板和阴性对照均无扩增曲线，呈阴性，表明所建立的方法具有较好的特异性。
4.试剂盒敏感性检测
利用研制的试剂盒，以101拷贝/μL～108拷贝/μL 8个稀释度的Foxp3和IL-10基因重组质粒标准品为模板进行双重荧光定量PCR扩增，每个稀释度做3次重复。确定Taq Man双重荧光定量PCR方法的敏感性，同时设立阴性对照，阴性对照采用经2次蒸馏处理的RNaseFree dH2O。反应体系和反应程序同实施例1中优化的体系和程序。
敏感性检测结果显示，试剂盒在30μL体系中添加1μL体积的10倍比稀释的Foxp3和IL-10基因重组质粒的最低检测模板浓度为101拷贝/μL，表明试剂盒具有良好的敏感性。
5.试剂盒重复性检测
利用研制的试剂盒，以103拷贝/μL～106拷贝/μL 4个稀释度的Foxp3和IL-10基因重组质粒标准品为模板，分别进行3次重复扩增，进行批间、批内重复性检测，利用公式计算变异系数。同时设立阴性对照，阴性对照采用经2次蒸馏处理的RNase Free dH2O。反应体系和反应程序同实施例1中优化的体系和程序。
结果如表3所示，试剂盒批内变异系数为0.87％，批间变异系数1.84％，均小于2％，具有较高的检测重复性。
表3.试剂盒重复性检测结果
实施例3.Foxp3、IL-10双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒的临床应用
1.主要试验材料
PCV2抗原、抗体阴性的28日龄断奶健康仔猪由山东绿都生物科技有限公司实验动物中心提供。PCV2毒株：PCV2-LVDU-2016株，由山东省绿都生物科技有限公司提供。动物组织RNA提取试剂盒、RNase Inhibition、M-MLV、PCR产物回收试剂盒均购于北京百泰克生物科技有限公司。猪外周血淋巴细胞分离液(200mL/盒)购于北京Solarbio科技有限公司。弗氏不完全佐剂、钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA)为SIGMA公司产品，巯基乙酸培养基购自OXODI公司。CD4+CD25+调节性T细胞分选试剂盒购自Miltenyi Biotec公司、RPMI1640完全培养液为Gibco公司产品、预先包被anti-CD3/CD28抗体的24孔板购于Invitrogen公司。
2.PCV2感染与攻毒
取PCV2抗原、抗体阴性的28日龄断奶健康仔猪10头，5头攻毒实验组，5头空白对照组。攻毒实验组以PCV2-LVDU-2016株含106.0TCID50/mL，每头猪肌肉注射1mL，滴鼻1mL，攻毒后第7天分别在前腋下和后腿肌肉分点注射弗氏不完全佐剂乳化的KLH，0.2mL/头，同时，腹腔注射灭菌的巯基乙酸盐培养基0.5mL/头，攻毒后第10、20天后再次腹腔注射灭菌的巯基乙酸盐培养基0.5mL/头，空白对照仅注射相同剂量生理盐水，各组隔离饲养，观察临床症状。分别于攻毒后0、4、7、14、28和42天前腔静脉采集抗凝血待检。
通过PCV2强毒攻毒试验组仔猪成功复制了特征性的PCVD临床病症，主要表现为日增重减少，体温升高，PCV2病毒血症和组织核酸载量升高，部分猪只出现皮疹和耳部发绀。
3.样品采集与制备
取新鲜抗凝全血，用等体积的全血及组织稀释液稀释全血。在离心管中加入适量分离液，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。室温，水平转子500～1000g，离心20～30min，小心的吸取白膜层淋巴细胞到15mL洁净的离心管中，10mLPBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心10min。弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。弃上清，细胞重悬，计数，调整细胞密度至106/mL备用。
Tregs细胞分选，用CD4+CD25调节性T细胞分选试剂盒，采用阴性分选和阳性富集分选获得猪Tregs淋巴细胞。分选获得的Tregs细胞重悬于RPMI1640完全培养液中，以106/mL细胞密度接种预先包被anti-CD3/CD28抗体的24孔板中，37℃5％CO2培养48小时。同时设置阴性对照，阴性对照为PCV2抗原、抗体阴性猪外周血淋巴细胞。
4.外周血Tregs细胞Foxp3、IL-10mRNA转录水平检测
收获培养的活化的Tregs细胞，提取T细胞总RNA，利用研制的Foxp3、IL-10双重定量实时荧光RT-PCR试剂盒进行mRNA含量检测。反应体系和反应程序同实施例1中优化的体系和程序。
使用试剂盒对PCV2攻毒后仔猪外周血Tregs细胞中免疫抑制性因子Foxp3和IL-10mRNA进行定量检测，结果如表4所示，攻毒试验组仔猪外周血Tregs细胞中Foxp3和IL-10mRNA相对对照组均出现了明显升高，其中Foxp3mRNA在攻毒后第4天到达峰值，IL-10mRNA在攻毒后第7天到达峰值，随后开始降低，到攻毒后28天基本恢复正常水平，对照组仔猪外周血Tregs细胞、Foxp3和IL-10mRNA定量在试验期间均无明显变化。检测结果表明，PCV2感染导致Tregs细胞免疫负调控机能激活，使得免疫应答呈现一定程度的抑制性，且可持续3周左右，这对PCV2疫苗免疫和疫病预防提供了基础数据支撑。
表4.猪外周血Tregs细胞Foxp3、IL-10 mRNA含量检测(拷贝/μL)
注：a为差异显著，b为差异极显著。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院
<120> 用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物、试剂盒及其应用
<130> P1930085CN-CN-BZX-CQ-TXH
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物Foxp3-F
<400> 1
ggcatcatct gacaagggtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物Foxp3-R
<400> 2
ttgtgaaaga aatctgggaa 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 带XbaⅠ酶切位点的引物Foxp3-F
<400> 3
gctctagagg catcatctga caagggtt 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 带KpnⅠ酶切位点的引物Foxp3-R
<400> 4
ggggtacctt gtgaaagaaa tctgggaa 28
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物IL-10-F
<400> 5
gcgacttgtt gctgaccg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物IL-10-R
<400> 6
ccatcactct ctgccttc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Foxp3-荧光探针
<400> 7
gtattgtagc cactggcacc 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-10-荧光探针
<400> 8
ctgctggagg actttaagg 19

Claims (10)

1.用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物组，其特征在于，包含如下引物：
Foxp3–F：5′-GGCATCATCTGACAAGGGTT-3′；
Foxp3-R：5′-TTGTGAAAGAAATCTGGGAA-3′；
IL-10-F：5′-GCGACTTGTTGCTGACCG-3′；
IL-10-R：5′-CCATCACTCTCTGCCTTC-3′。
2.用于猪Foxp3、IL-10基因TaqMan实时荧光定量双重PCR检测的试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组，以及如下荧光探针：
Foxp3-荧光探针：核苷酸序列为5′-GTATTGTAGCCACTGGCACC-3′，其5′末端连接第一荧光基团，3′连接第一淬灭基团；
IL-10-荧光探针：核苷酸序列为5′-CTGCTGGAGGACTTTAAGG-3′，其5′末端连接第二荧光基团，3′连接第二淬灭基团；
所述第一荧光基团与所述第二荧光基团发射的荧光信号不同。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述第一荧光基团为FAM；所述第二荧光基团为CY3；所述第一淬灭基团和所述第二淬灭基团均为TAMRA。
4.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂；其中，引物Foxp3-F、Foxp3-R、IL-10-F、IL-10-R、Foxp3-荧光探针和IL-10-荧光探针独立包装或混装在一起。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物Foxp3-F、Foxp3-R、IL-10-F、IL-10-R、Foxp3-荧光探针和IL-10-荧光探针混装在一起，其摩尔比为1:1:1:1:6:6。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准阳性对照、标准阴性对照和PCR扩增反应液；所述标准阳性对照为含Fxop3和IL-10基因的重组质粒18-T-Fxop3-IL-10，其中Foxp3和IL-10串联重组，定向插入18-T的多克隆位点；所述标准阴性对照为RNase Free dH2O；所述PCR扩增反应液包括：2×One Step RT-PCR BufferⅢ、Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ、RNase Free dH2O和RNase Inhibitor。
7.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4-6任一所述的试剂盒在猪Foxp3、IL-10基因双重PCR检测中的应用。
8.一种TaqMan实时荧光定量PCR检测猪Foxp3、IL-10基因转录水平的方法，其特征在于，采用权利要求2或3所述的试剂或权利要求4-6任一所述的试剂盒进行检测，包括如下步骤：
(1)以含Fxop3和IL-10基因的重组质粒为模板，利用所述试剂或试剂盒中的引物和荧光探针进行实时荧光定量双重PCR反应，以基因拷贝数的log[10]对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程式；
(2)提取待测样品的总RNA，利用所述试剂或试剂盒中的引物和荧光探针进行实时荧光定量双重RT-PCR反应，获得Foxp3和IL-10基因的Ct值；
(3)将Foxp3和IL-10基因的Ct值分别代入各自的标准曲线方程式，计算得到猪Foxp3和IL-10基因的拷贝数，其代表了待测样品中猪Foxp3和IL-10基因的转录水平。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述PCR反应体系为：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 15.0μL、Ex Taq HS 0.5μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5μL、5μmol/L Foxp3-F/R各0.5μL、5μmol/L IL-10F/R各0.5μL、15μmol/L Foxp3-荧光探针1.0μL、15μmol/L IL-10-荧光探针1.0μL、RNase FreedH2O 6.0μL、RNase Inhibitor 1.0μL和RNA模板3.0μL；
所述PCR反应程序为：42℃ 8min；94℃ 30s；94℃ 15s，62℃ 10s，40个循环。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Foxp3基因的标准曲线方程式为Y＝-3.235X+40.938；所述IL-10基因的标准曲线方程式为Y＝-3.426X+40.190；其中，X代表基因拷贝数的log[10]对数值，Y代表Ct值。
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