CN114214458A - 同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量pcr引物和探针及其方法 - Google Patents

同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量pcr引物和探针及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其方法，包括针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2‑cap、PCV3‑cap、PPV‑NS1和PRV‑gE的保守片段的引物和探针。本发明检测方法具有较高的特异性和敏感性，可较好地适配于多通道荧光PCR仪，能有效应用于四种猪繁殖障碍相关病原的检测与分析，能在较短的时间内完成疾病的诊断检测，以为科学合理地制定防控措施提供有效工具。

Description

同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探 针及其方法
技术领域
本发明属于动物疫病的检测方法技术领域，具体涉及一种同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其方法。
背景技术
近年来，随着中国养猪业规模化、集约化发展，猪传染性疾病的发生和流行对生猪养殖的危害日趋加重，且多病原混合感染已成为当前猪群疫病流行的主要形式与特点。在生猪养殖过程中猪繁殖障碍类疾病是兽医临床中发病率较高的一类疾病，而引起这类疾病的病因非常复杂，通常由多种因素影响。可将其分为传染性猪繁殖障碍疾病和非传染性猪繁殖障碍疾病两类，规模化生猪养殖过程中主要受到传染性猪繁殖障碍疾病的侵害，例如猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)等，其症状有母猪不孕不育、流产、早产、产畸形胎、死胎、木乃伊，产弱仔，母猪发情异常，公猪出现睾丸炎、睾丸萎缩等。
值得注意的是，猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪伪狂犬病毒在临床诊断过程中具有比较相似的临床症状而较难确诊，常常导致无法及时发现疫病的传播。现有技术中公开了大量检测上述病毒的方法，如中国专利(申请公布号CN108265126A)公开了一种同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的PCR方法，其分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计两对特异性引物，建立了二重PCR检测方法，以实现对猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型快速准确检测并鉴定的目的。
如中国专利(申请公布号CN102071258A)公开了一种猪细小病毒与猪伪狂犬病毒二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，其能同时检测猪细小病毒与猪伪狂犬病毒两种病毒，不能检测出猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒，具有较好的特异性、重复性和敏感性，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒病的鉴别与诊断。
如中国专利(申请公布号CN102071257A)公开了一种猪细小病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性。
如中国专利(申请公布号CN102071256A)公开了猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，其能够同时检测PC V2、PRV两种DNA病毒，能最少检测180拷贝猪伪狂犬病毒质粒和215拷贝猪圆环病毒2型质粒，具有较好的敏感性、重复性与稳定性，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒病的鉴别与诊断。
如中国专利(申请公布号CN112553372A)公开了一种猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒3型双重荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒及方法，其提供的引物探针、扩增试剂和方法对猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒3型的检测具有良好的敏感性、特异性、重复性和稳定性。
如中国专利(申请公布号CN102382902A)公开了一种CSFV、PCV2与PP V多重SYBRGreen I实时荧光PCR引物及其检测方法，其能够同时检测CSF V、PRV和PCV2三种DNA病毒，能最少检测183拷贝猪瘟病毒、231拷贝猪伪狂犬病毒和203拷贝猪圆环病毒2型。
如中国专利(申请公布号CN102071259A)公开了一种猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重实时荧光PCR检测引物及方法，其能最少检测出189拷贝猪伪狂犬病毒质粒203拷贝猪细小病毒质粒和173拷贝猪圆环病毒2型质粒，具有的较好敏感性、重复性和稳定性，为PRV、PPV、PCV2的检测提供了一种新的方法可作为规模化猪场PRV、PPV、PCV2的净化检测方法。
再如中国专利(申请公布号CN106957925A)公开了一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测试剂盒及引物和探针，其可实现一次采样，一次分析，可同时检测和区分3种重要猪病的目的，减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防治赢得时间。
上述针对猪繁殖障碍相关病原的检测技术中，现有的荧光PCR检测方法一般都是针对一种或两种病原，较少同时针对三种相关病原，极少同时针对四种相关病原。目前，多种病原的检测成本高，步骤繁琐，且大多数为SYBR-Green法，SYBR-Green法对引物特异性要求极高，容易与非特异性双链DNA结合产生假阳性，检测方法的特异性有待进一步提高。并且，现有的双重或多重荧光PCR检测方法，大多使用的是不同质粒混合作为阳性模板的方式，对检测结果的灵敏度可能构成影响，且不能对不同病毒进行准确定量分析和比较。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其方法，具有较高的特异性和敏感性，可较好地适配于多通道荧光PCR仪，能有效应用于四种猪繁殖障碍相关病原的检测与分析，能在较短的时间内完成疾病的诊断检测，以为科学合理地制定防控措施提供有效工具。
本发明通过下述技术方案实现。
同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针，其包括：针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1和PRV-gE的保守片段的引物和探针，具体的包括：
检测猪圆环病毒2型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
SEQ ID NO.1：5’-TGTTTTCGAACGCAGTGC-3’
SEQ ID NO.2：5’-ACTACTCCTCCCGCCATA-3’
SEQ ID NO.3：FAM-5'-CCAGCCCTTCTCCTACCACTCCC-3’-Tamra；
检测猪圆环病毒3型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
SEQ ID NO.4：5'-TGGTAGTTCCCGCCAGAA-3’
SEQ ID NO.5：5'-TACGGGCACACAGCCATA-3’
SEQ ID NO.6：VIC-5'-GACGGCGCCTGGACCACAAACA-3’-Tamra；
检测猪细小病毒的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
SEQ ID NO.7：5'-CAACTACGCAGCAACTCC-3’
SEQ ID NO.8：5'-CGTATTGCTGAATCTGGC-3’
SEQ ID NO.9：ROX-5'-TGGCTCGCTCCACGGCTCC-3’-BHQ2；
检测猪伪狂犬病毒的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
SEQ ID NO.10：5'-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’
SEQ ID NO.11：5'-TACACCGGKGAGAGCATG-3’
SEQ ID NO.12：Cy5-5'-CGCGTCGGCACCCGGAA-3’-BHQ3。
同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法，其包括如下步骤：
(1)DNA提取：提取待检测样品的总DNA，作为反应模板；
(2)预混体系配制：配制所需的预混体系，所述预混体系中含有上述引物和探针；
(3)反应组分配制：于预混体系中分别加入阴性对照物、阳性对照物和待检测样品，得到阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组；
(4)扩增：将阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组放入荧光PCR仪器中进行扩增，采集FAM、VIC、ROX及Cy5四个通道的荧光信号；
(5)结果有效性分析；
(6)待检测样品的结果判定。
作为具体技术方案，所述步骤(3)中，将猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因(PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1和PRV-gE)串联入克隆载体构建成一个独立的重组质粒作为阳性对照物。
作为具体技术方案，所述阳性对照物含有PCV2-cap基因片段、PCV3-cap基因片段、PPV-NS1基因片段、PRV-gE基因片段；所述PCV2-cap基因片段的序列如SEQ ID NO.13所示，所述PCV3-cap基因片段的序列如SEQ ID NO.14所示，所述PPV-NS1基因片段的序列如SEQID NO.15所示，所述PRV-gE基因片段的序列如SEQ ID NO.16所示。
作为具体技术方案，所述步骤(4)中，扩增的参数为，首先95℃预变性5min；再进行45个循环：95℃下变性10s，60℃下退火延伸30s。
作为具体技术方案，所述步骤(5)中，根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果的有效性，当满足以下条件：
四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5下的阳性对照的Ct值均小于30，且四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5下的阴性对照的Ct值大于38或无Ct值，则结果有效；否则结果无效，需要重复样品的检测。
作为具体技术方案，所述步骤(6)待检测样品的结果判定具体为：
当样品的四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5的Ct值至少有一个小于等于38，且出现典型的扩增曲线，则样品为相关病毒阳性，表明样品中存在相关病毒的单一或混合感染；
当样品的四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5的Ct值均大于38或/和无扩增曲线，则表明样品中无四种相关病毒感染。
本发明的有益效果：
(1)本发明的检测试剂选用了针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因(PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1、PRV-gE)的保守片段的引物和探针，与常规的PCR及现有的荧光PCR检测技术相比较，具有更高的特异性和敏感性，能同时检测大量样品，为科学合理地防控猪繁殖障碍相关疾病提供有效的工具，保障养猪业的健康发展。
(2)本发明的试剂可对样品中低含量的猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒，阴性感染或持续带毒的宿主进行精准检测，对细胞培养物、血液、组织等多种样品DNA中的病毒进行快速检测，该发明适用范围广，生物安全性高，临床指导作用强，能为猪繁殖障碍相关疾病的检测提供便利，促进养猪业的正常发展。
(3)本发明通过将猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1和PRV-gE串联入克隆载体构建成一个独立的重组质粒作为阳性对照物，进一步优化了荧光PCR快速检测的体系成分和反应条件，可提高实验的特异性和灵敏度。
附图说明
图1是本发明的猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒及猪伪狂犬病毒的四个基因(PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1及PRV-gE)DNA假病毒表达质粒的构建；
图2是本发明的多重荧光定量PCR检测的标准曲线结果图；
图3是本发明的多重荧光定量PCR检测的特异性试验结果图；
图4是本发明的多重荧光定量PCR检测的敏感性试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针，本发明所设计的引物和探针组合是针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因(PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1、PRV-gE)的保守片段为靶目标，具体的包括：
检测猪圆环病毒2型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
SEQ ID NO.1：5’-TGTTTTCGAACGCAGTGC-3’
SEQ ID NO.2：5’-ACTACTCCTCCCGCCATA-3’
SEQ ID NO.3：FAM-5'-CCAGCCCTTCTCCTACCACTCCC-3’-Tamra；
检测猪圆环病毒3型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
SEQ ID NO.4：5'-TGGTAGTTCCCGCCAGAA-3’
SEQ ID NO.5：5'-TACGGGCACACAGCCATA-3’
SEQ ID NO.6：VIC-5'-GACGGCGCCTGGACCACAAACA-3’-Tamra；
检测猪细小病毒的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
SEQ ID NO.7：5'-CAACTACGCAGCAACTCC-3’
SEQ ID NO.8：5'-CGTATTGCTGAATCTGGC-3’
SEQ ID NO.9：ROX-5'-TGGCTCGCTCCACGGCTCC-3’-BHQ2；
检测猪伪狂犬病毒的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
SEQ ID NO.10：5'-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’
SEQ ID NO.11：5'-TACACCGGKGAGAGCATG-3’
SEQ ID NO.12：Cy5-5'-CGCGTCGGCACCCGGAA-3’-BHQ3。
实施例2
荧光PCR快速检测的体系中阳性对照物的设置优化。
1、阳性对照物的设置
常规阳性对照物：将PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1、PRV-gE基因的四种重组质粒等比例混合作为阳性对照物；
本发明阳性对照物：依次将PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1、PRV-gE基因串联入克隆载体构建成一个独立的重组质粒作为阳性对照物：(1)利用酶切位点(XhoⅠ和HindⅢ)将扩增的PCV2 cap基因片段连入pSP72克隆载体，得到含有PCV2 cap基因片段的重组质粒p01；(2)利用酶切位点(HindⅢ和BamHⅠ)将扩增的PCV3 cap基因片段连入重组质粒p01，得到同时含有PCV2 cap基因片段和PCV3 cap基因片段的重组质粒p02；(3)利用酶切位点(BamHⅠ和KpnⅠ)将扩增的PPV NS1基因片段连入重组质粒p02，得到同时含有PCV2 cap基因片段、PCV3cap基因片段和PPV NS1基因片段的重组质粒p03；(4)利用酶切位点(KpnⅠ和SacⅠ)将扩增的PRV gE基因片段连入重组质粒p03，得到同时含有四个病原基因片段的重组质粒p04(见图1)，作为反应体系中的阳性对照物，阳性对照物含有PCV2-cap基因片段、PCV3-cap基因片段、PPV-NS1基因片段、PRV-gE基因片段；其中，
所述PCV2-cap基因片段的序列信息(如SEQ ID NO.13所示)为：TTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAAATTCTCTGAATTGTACATACATGGTTACACGGATATTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGCAGTGCCGAGGCCTACGTGGTCTACATTTCCAGTAGTTTGTAGTCTCAGCCACAGCTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGGAAGTAATCAATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTGGGGGTAAAGTAGCGGGAGTGGTAGGAGAAGGGCTGGGTTATGGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTGAGGGCTGTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCACTGGAGCCCACTCCCCTGTCACCCTGGGTGATCGGGGAGCAGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTT
所述PCV3-cap基因片段的序列信息(如SEQ ID NO.14所示)为：AAAGCAGTGCTCCCCATTGAACGGTGGGGTCATATGTGTTGAGCCATGGGGTGGGTCTGGAGAAAAAGAAGAGGCTTTGTCCTGGGTGAGCGCTGGTAGTTCCCGCCAGAATTGGTTTGGGGGTGAAGTAACGGCTGTGTTTTTTTTTAGAAGTCATAACTTTACGAGTGGAACTTTCCGCATAAGGGTCGTCTAGGAGCCAAGTGTTTGTGGTCCAGGCGCCGTCTAGATCTATGGCTGTGTGCCCGTACATAGTTTTTGTTTGCTGAGCCGGAGAAATTACAGGGCTGAGTGTAACTCTCATCTTTAGTATCTTATAATATTCAAAGCTAATTGCAGTTTCCCATTCGTTTAGGCGGGTAATGAAGTGGTTGGCGTGCCAGGGCTTGTTATTCTGAGGGGTTCCAACGG
所述PPV-NS1基因片段的序列信息(如SEQ ID NO.15所示)为：AAAGCAGTGCTCCCCATTGAACGGTGGGGTCATATGTGTTGAGCCATGGGGTGGGTCT GGAGAAAAAGAAGAGGCTTTGTCCTGGGTGAGCGCTGGTAGTTCCCGCCAGAATTGGTTTGGGGGTGAAGTAACGGCTGTGTTTTTTTTTAGAAGTCATAACTTTACGAGTGGAACTTTCCGCATAAGGGTCGTCTAGGAGCCAAGTGTTTGTGGTCCAGGCGCCGTCTAGATCTATGGCTGTGTGCCCGTACATAGTTTTTGTTTGCTGAGCCGGAGAAATTACAGGGCTGAGTGTAACTCTCATCTTTAGTATCTTATAATATTCAAAGCTAATTGCAGTTTCCCATTCGTTTAGGCGGGTAATGAAGTGGTTGGCGTGCCAGGGCTTGTTATTCTGAGGGGTTCCAACGG
所述PRV-gE基因片段的序列信息(如SEQ ID NO.16所示)为：GTCACGGTCATCAAGGAGCTGACGGCCCCGGCCCGGGCCCCGGGCACCCCGTGGGGCCCCGGCGGCGGCGACGACCCGATCTACGTGGACGGCGTCACGACGCCGGCGCCGCCCGCGCGCCCGTGGAACCCGTACGGCCGGACGACGCCCGGGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTGGGCTCCTTCGTGATGACGTGCGTCGTCGGGGGGGCCGTCTGGCTCTGCGTGCTGTGCTCCCGGCGCCGGGCGGCCTCGCGGCCGTTCCGGGTGCCGACGCGGGCGCGGACGCACATGCTCTCTCCGGTGTACACCAGCCTGCCCACGCACGAGGACTACTACGACGGCGACGACGA
2、两种阳性对照物的设置方式对检测结果的影响
分别以两种阳性对照物(常规阳性对照物、本发明阳性对照物)在3个不同拷贝数下进行实验，结果如下表所示：
Figure BDA0003419021670000081
Figure BDA0003419021670000091
3、结果分析
为保证结果中阳性对照物的准确性，本发明将常规的方案即PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1、PRV-gE基因的四种重组质粒等比例混合作为阳性对照物的方式，改变为将PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1、PRV-gE基因串联入克隆载体构建成一个独立的重组质粒作为阳性对照物，可提高实验的特异性和灵敏度；对照两种方式获得的检测结果，采用本发明阳性对照物的质粒具有更好的效果。
实施例3
同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)DNA提取：提取待检测样品(组织、血液、饲料等)的总DNA，作为反应模板；
(2)预混体系配制：根据检测样品数(含阴性对照和阳性对照各1个)，加入荧光PCR混合液、实施例1所示的引物和探针组合、以及DEPC-H2O，配制所需的预混体系，混合后再分装成相应管数后，每管9μL，反应体系如下表所示：
Figure BDA0003419021670000092
(3)反应组分配制：于预混体系中分别加入阴性对照物、阳性对照物和待检测样品各1μL，得到阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组；上样顺序(阴性组和阳性对照组的位置固定)，具体如下表(以8孔道为例)所示：
NC PC Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test
(4)扩增：将阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组放入荧光PCR仪器中进行扩增，首先95℃预变性5min；再进行45个循环：95℃下变性10sec，60℃下退火延伸30sec；采集FAM、VIC、ROX及Cy5四个通道的荧光信号；
(5)结果有效性分析：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果的有效性，当满足以下条件：四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5下的阳性对照的Ct值均小于30，且四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5下的阴性对照的Ct值大于38或无Ct值，则结果有效；否则结果无效，需要重复样品的检测；
(6)待检测样品的结果判定：当样品的四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5的Ct值至少有一个小于等于38，且出现典型的扩增曲线，则样品为相关病毒阳性，表明样品中存在相关病毒的单一或混合感染；当样品的四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5的Ct值均大于38或/和无扩增曲线，则表明样品中无四种相关病毒感染。
实施例4
本发明检测同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其检测方法的评价。
1)检测方法的建立和测试
所建立的多重荧光定量PCR检测方法，确定能得到扩增曲线后，使用阴性对照物和不同浓度的阳性标准质粒(100，101，102，103，104，105，106)的测试，结果见图2及下表：
Figure BDA0003419021670000101
结合试验结果所取得的标准曲线，该方法建立的方法最小检测量可以达到10个拷贝数，但是为了保证实验结果的准确性，鉴定的阳性判定标准设置为：CT值小于38。
2)特异性比较检测试验
用本发明对灭活的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)以及健康SPF猪组织按照本发明建立的反应体系扩增后进行特异性比较检测，结果见图3及下表所示：
PCV2 PCV3 PPV PRV PEDV PRRSV PK15细胞
CT值(FAM) 22.36 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
CT值(VIC) N/A 23.19 N/A N/A N/A N/A N/A
CT值(ROX) N/A N/A 22.61 N/A N/A N/A N/A
CT值(Cy5) N/A N/A N/A 24.24 N/A N/A N/A
相关病毒样品的检测结果显示，四个基因检测到的CT值分别为PCV2：22.36；PCV3：23.19；PPV：22.61；PRV：24.24，根据样品判定标准，结果为阳性；而其他样品的检测结果显示，未探测到CT值，根据样品判定标准，结果为阴性，试验结果表明本发明构建的检测方法特异性强，只针对PCV2、PCV3、PPV、PRV四种病原存在典型的扩增曲线。
3)敏感性分析试验
使用阴性对照物和不同浓度的阳性标准质粒(100，101，102，103，104，105，106)作为模板，结果见图4；由图4可知，PCV2最小可检测出1copies/μL，PCV2最小可检测出10copies/μL，PCV3最小可检测出10copies/μL，PPV最小可检测出10copies/μL，PRV最小可检测出10copies/μL。由此可知，本发明所构建的多重荧光定量PCR检测方法相较于大多数已知的试剂盒，具有更高的灵敏度。
4)稳定性分析试验
为了评价检测方法的重复性和稳定性，将标准阳性质粒稀释成三种不同浓度，即106～104copies/μL，每个模板做三个重复，进行组内重复试验，每隔24h做一次，每次做三个重复，计算平均值，进行组间重复试验，计算最终变异系数CV，结果如下表所示：
Figure BDA0003419021670000111
Figure BDA0003419021670000121
由上表可知，用已建立的多重荧光PCR方法对PCV2、PCV3、PPV和PRV进行组内和组间重复试验，计算最终变异系数CV，整体平均CV值低于2％，表明本发明所建立的多重荧光PCR方法有很好的重复性和稳定性。
5)不同qPCR仪器适用性比对分析试验
使用4个标准阳性样品(103，104，105，106)作为模板，同一条件下，不同仪器同时进行实验，以验证本发明的适用性，结果如下表所示：
Figure BDA0003419021670000122
Figure BDA0003419021670000131
由上表可知，本发明构建的检测方法在不同仪器上所检测出的CT值差异性较低，说明本发明构建的多重荧光定量PCR检测方法能适配于大多数多荧光通道仪器。
(6)临床检测初步应用
将湖南省动物疫病预防控制中心提供的来自湖南省不同地区的50份样品进行4种病原检测，结果表明PCV2、PCV3、PPV和PRV等4种病原均有检出，其中PCV2阳性率为56％、PCV3阳性率为12％、PPV阳性率为28％、PRV阳性率为12％，有混合感染情况，PCV2和PPV混合感染比较常见。所检测的样品与单重荧光定量PCR检测试剂盒相比，符合率如下表：
Figure BDA0003419021670000132
由上表可知，本发明构建的检测方法能应用于临床检测中，且与单重检测试剂盒检测方法相比符合率为100％，可真正实现一次采样、一次检测，同时区分4种重要猪繁殖障碍相关猪病原，减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防治赢得时间。
Figure BDA0003419021670000141
Figure BDA0003419021670000151
Figure BDA0003419021670000161
Figure BDA0003419021670000171
Figure BDA0003419021670000181
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其方法
<130> 1
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tgttttcgaa cgcagtgc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
actactcctc ccgccata 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccagcccttc tcctaccact ccc 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tggtagttcc cgccagaa 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tacgggcaca cagccata 18
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gacggcgcct ggaccacaaa ca 22
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
caactacgca gcaactcc 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
cgtattgctg aatctggc 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tggctcgctc cacggctcc 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ctccttcgtg atgacgtg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
tacaccggkg agagcatg 18
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
cgcgtcggca cccggaa 17
<210> 13
<211> 436
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 13
tttatcactt cgtaatggtt tttattattc attaagggtt aagtgggggg tctttaagat 60
taaattctct gaattgtaca tacatggtta cacggatatt gtattcctgg tcgtatatac 120
tgttttcgaa cgcagtgccg aggcctacgt ggtctacatt tccagtagtt tgtagtctca 180
gccacagctg atttcttttg ttgtttggtt ggaagtaatc aatagtggaa tctaggacag 240
gtttgggggt aaagtagcgg gagtggtagg agaagggctg ggttatggta tggcgggagg 300
agtagtttac ataggggtca taggtgaggg ctgtggcctt tgttacaaag ttatcatcta 360
gaataacagc actggagccc actcccctgt caccctgggt gatcggggag cagggccaga 420
attcaacctt aacctt 436
<210> 14
<211> 411
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 14
aaagcagtgc tccccattga acggtggggt catatgtgtt gagccatggg gtgggtctgg 60
agaaaaagaa gaggctttgt cctgggtgag cgctggtagt tcccgccaga attggtttgg 120
gggtgaagta acggctgtgt ttttttttag aagtcataac tttacgagtg gaactttccg 180
cataagggtc gtctaggagc caagtgtttg tggtccaggc gccgtctaga tctatggctg 240
tgtgcccgta catagttttt gtttgctgag ccggagaaat tacagggctg agtgtaactc 300
tcatctttag tatcttataa tattcaaagc taattgcagt ttcccattcg tttaggcggg 360
taatgaagtg gttggcgtgc cagggcttgt tattctgagg ggttccaacg g 411
<210> 15
<211> 284
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 15
aaaaatgcaa accccaataa atacaccaac agactcacag atttccacat cagtgaaaac 60
ttcgccagcg gacaacaact acgcagcaac tccaatacag gaggacctgg atttagcttt 120
agccttggag ccgtggagcg agccaacaac accaactttc accaacctgc acttaactcc 180
aacaccgcca gattcagcaa tacggacacc aagtccaact tggtcggaaa tagaaaccga 240
cataagagcc tgctttggtg aaaactgtgc acccacaaca aacc 284
<210> 16
<211> 350
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 16
gtcacggtca tcaaggagct gacggccccg gcccgggccc cgggcacccc gtggggcccc 60
ggcggcggcg acgacccgat ctacgtggac ggcgtcacga cgccggcgcc gcccgcgcgc 120
ccgtggaacc cgtacggccg gacgacgccc gggcggctgt ttgtgctggc gctgggctcc 180
ttcgtgatga cgtgcgtcgt cgggggggcc gtctggctct gcgtgctgtg ctcccggcgc 240
cgggcggcct cgcggccgtt ccgggtgccg acgcgggcgc ggacgcacat gctctctccg 300
gtgtacacca gcctgcccac gcacgaggac tactacgacg gcgacgacga 350

Claims (7)

1.同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针，其特征在于包括：针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1和PRV-gE的保守片段的引物和探针，具体的包括：
检测猪圆环病毒2型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
5’-TGTTTTCGAACGCAGTGC-3’
5’-ACTACTCCTCCCGCCATA -3’
FAM-5'-CCAGCCCTTCTCCTACCACTCCC-3’-Tamra；
检测猪圆环病毒3型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
5'-TGGTAGTTCCCGCCAGAA-3’
5'-TACGGGCACACAGCCATA-3’
VIC-5'-GACGGCGCCTGGACCACAAACA-3’-Tamra；
检测猪细小病毒的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
5'-CAACTACGCAGCAACTCC-3’
5'-CGTATTGCTGAATCTGGC-3’
ROX-5'-TGGCTCGCTCCACGGCTCC-3’-BHQ2；
检测猪伪狂犬病毒的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
5'-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’
5'-TACACCGGKGAGAGCATG-3’
Cy5-5'-CGCGTCGGCACCCGGAA-3’-BHQ3。
2.同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)DNA提取：提取待检测样品的总DNA，作为反应模板；
(2)预混体系配制：配制所需的预混体系，所述预混体系中含有权利要求1所述的引物和探针；
(3)反应组分配制：于预混体系中分别加入阴性对照物、阳性对照物和待检测样品，得到阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组；
(4)扩增：将阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组放入荧光PCR仪器中进行扩增，采集FAM、VIC、ROX及Cy5四个通道的荧光信号；
(5)结果有效性分析；
(6)待检测样品的结果判定。
3.如权利要求2所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述步骤(3)中，将猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2-cap、PCV3-cap、PPV-NS1和PRV-gE串联入克隆载体构建成一个独立的重组质粒作为阳性对照物。
4.如权利要求3所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述阳性对照物含有PCV2-cap基因片段、PCV3-cap基因片段、PPV-NS1基因片段、PRV-gE基因片段；所述PCV2-cap基因片段的序列如SEQ ID NO.13所示，所述PCV3-cap基因片段的序列如SEQ ID NO.14所示，所述PPV-NS1基因片段的序列如SEQ ID NO.15所示，所述PRV-gE基因片段的序列如SEQ ID NO.16所示。
5.如权利要求2所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述步骤(4)中，扩增的参数为，首先95℃预变性5min；再进行45个循环：95℃下变性10s，60℃下退火延伸30s。
6.如权利要求2所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述步骤(5)中，根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果的有效性，当满足以下条件：
四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5下的阳性对照的Ct值均小于30，且四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5下的阴性对照的Ct值大于38或无Ct值，则结果有效；否则结果无效，需要重复样品的检测。
7.如权利要求6所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述步骤(6)待检测样品的结果判定具体为：
当样品的四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5的Ct值至少有一个小于等于38，且出现典型的扩增曲线，则样品为相关病毒阳性，表明样品中存在相关病毒的单一或混合感染；
当样品的四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5的Ct值均大于38或/和无扩增曲线，则表明样品中无四种相关病毒感染。
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