CN116287428A - 特异性探针、基因芯片、核酸杂交组件以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别非洲猪瘟(ASF)野毒株和基因缺失株的特异性探针、基因芯片、核酸杂交组件以及试剂盒，将至少1种鉴别非洲猪瘟病毒的探针结合至少2种鉴别非洲猪瘟毒株基因缺失的探针，一次性对大量序列样品进行检测和分析。本发明进一步将所述探针应用在基因芯片技术上，具有高通量、快速、特异性好等优势，为创建非洲猪瘟无疫小区和贯彻落实非洲猪瘟常态化防控提供新的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及动物传染病病原体分子检测技术领域，尤其涉及鉴别诊断非洲猪瘟野病毒株和基因缺失株的特异性探针、基因芯片、核酸杂交组件以及试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、热性和高度致死性传染病。病死率可高达100％，为世界动物卫生组织(OIE)规定的须通报动物疫病，也是我国重点防范的一类动物疫病。
以目前国内外ASF疫苗的研究进展看，灭活疫苗和亚单位疫苗无法对免疫动物提供完全保护，减毒疫苗理论上更具可行性；由于ASFV只感染并致死猪，体外只能在猪原代巨噬细胞正常增殖，难以通过常规的传代致弱途径获得安全有效减毒疫苗；通过精准敲除ASFV毒力相关基因和免疫逃逸基因，获得安全有效ASF减毒疫苗是目前相对可行的技术路线。
目前国内外基因缺失减毒活疫苗的研究方向主要集中在B119L、DP96R、CD2v、I177L、MGF360和MGF505/530基因的敲除。国内部分猪场急于防控ASF，委托兽用疫苗生产企业、高等院校、科研机构为其非法生产ASF基因缺失减毒活疫苗，这些基因缺失毒株不仅不能保护猪群，反而会污染猪场和周边环境，转变成为我国ASF疫情防控中面临的新污染源和传播源，大大加剧了我国ASF防控的复杂性。在缺少疫苗保护的形况下，ASF目前的防控主要还是依靠严格的生物安全管理体系。精准可靠的检测方法是生物安全管理体系的重要环节，然而目前市面上的非洲猪瘟病毒检测方法大多是基于B646L单个基因建立的，检测能力有限，无法区分ASFV野毒株和不同类型的基因缺失毒株。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鉴别诊断非洲猪瘟野病毒株和基因缺失株的特异性探针、基因芯片、核酸杂交组件以及试剂盒，可以准确鉴别ASFV野毒株和基因缺失毒株。
本发明第一方面提供了一组检测非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的特异性探针，该特异性探针的核苷酸序列包括：
B646L探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
CD2v探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
MGF360-12L探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
MGF505-3R探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；以及
I177L探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在本发明的优选技术方案中，该特异性探针在5’端经过T15臂氨基化(NH2(T)15)修饰。
本发明第二方面提供了一种鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的基因芯片，该基因芯片包含固相载体以及前述特异性探针固定在固相载体上的核苷酸探针。
本发明第三方面提供了一种非洲猪瘟病毒鉴别检测的核酸杂交组件，包含前述基因芯片和用于核酸杂交的试剂。
本发明第四方面还提供了一种非洲猪瘟病毒鉴别检测试剂盒，包含前述基因芯片。
在本发明优选的技术方案中，该试剂盒包含下述用于扩增目标基因片段的引物组：
用于扩增B646L的目标基因片段的引物组1：上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
用于扩增CD2v的目标基因片段的引物组2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
用于扩增MGF360-12L的目标基因片段的引物组3：上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
用于扩增MGF505-3R的目标基因片段的引物组4：上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；以及
用于扩增I177L的目标基因片段的引物组5：上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在本发明优选的技术方案中，上述引物组1-5中的各个下游引物的5'端经生物素标记。
根据本发明，针对ASFV常用检测基因B646L和常见缺失基因CD2v、MGF360-12L、MGF505-3R、I177L基因设计引物和探针，通过对反应体系的优化，建立了一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失毒株的基因芯片检测方法。该基因芯片检测方法特异性强，灵敏度高且重复性好。
附图说明
图1所示为基因芯片阵列点样分布图，其中0为质控探针，1为B646L探针，2为CD2v探针，3为MGF360-12L探针，4为MGF505-3R探针，5为I177L探针，6为CYTB探针，7为GAPDH探针，8为pUC-57探针，9为空白。
图2所示为基因芯片单靶点准确性与特异性检测结果，其中(a)为B646L靶点检测结果；(b)为CD2v靶点检测结果；(c)为MGF360-12L靶点检测结果；(d)为MGF505-3R靶点检测结果；(e)为I177L靶点检测结果。
图3所示为基因芯片多靶点准确性与特异性检测结果。
图4所示为基因芯片特异性试验结果，其中(a)是模板为PRV的基因芯片检测结果；(b)是模板为PCV2的基因芯片检测结果；(c)是模板为PPV的基因芯片检测结果；(d)是模板为CSFV的基因芯片检测结果；(e)是模板为PRRSV的基因芯片检测结果；(f)是模板为pUC57质粒的基因芯片检测。
图5所示为基因芯片稳定性的试验结果。
图6所示为ASFV核酸检测试剂盒检测结果，其中1表示ASFV核酸样本-1；2表示ASFV核酸样本-2；3-17表示猪抗凝血样本DNA。
图7所示为ASFV基因芯片方法检测结果，其中(a)为ASFV核酸样本-1；(b)为ASFV核酸样本-2。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明的范围。
实施例1-制备试剂盒
1.基因芯片的制备
表1.引物、探针序列表
图1为基因芯片示意图，本发明将点样阵列设置为5行9列，前3列为标识列样点，后6列为靶序列样点，使用百傲芯片点样系统V2在醛基修饰基片上进行点样，各探针样点间距为370μm，每个靶基因设置3个重复样点。
更具体地，如图1所示，0为质控探针；1为检测ASFV探针即B646L探针；2-5为常见缺失基因探针，其中，2为CD2v探针，3为MGF360-12L探针，4为MGF505-3R探针，5为I177L探针；6-7为样本内参探针，其中，6为CYTB探针，7为GAPDH探针；8为PCR内参探针：pUC-57探针；9为空白。
实施例2-芯片单靶点准确性与特异性验证
为了保证PCR结果的准确性，防止非特异PCR扩增和污染，本发明使用热启动Taq酶和UNG酶配制扩增体系。利用本发明所设计的引物，按上游引物：下游引物为1:3的浓度配制单重扩增液，具体配制方法见表2，其中TMS溶液为上海百傲科技股份有限公司生产的防腐液；分别以稀释度为10-4的pUC57-ASFV-B646L、pUC57-ASFV-CD2v、pUC57-ASFV-MGF360-12L、pUC57-ASFV-MGF505-3R、pUC57-ASFVI177L质粒参考品为模板，配制引物不对称PCR反应体系，扩增得到大量带有Biotin标记的ssDNA，具体PCR反应体系配制方法见表3。
表2.单重扩增液配制体系
表3.不对称PCR反应系统
| 成分 | 剂量(μL) |
| 扩增液 | 18 |
| Taq HSB酶 | 1 |
| UNG酶 | 1 |
| 模板 | 5 |
| 总计 | 25 |
PCR扩增反应条件为：50℃UNG酶反应5min，95℃预变性3min；95℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物放4℃保存。
接着进行基因芯片杂交染色。采用上海百傲科技股份有限公司生产的免疫显色试剂盒和反应液B，按照试剂盒说明书进行操作，将上述PCR反应产物加入到八连条管相应的孔位，并做好标记。按标记顺序将八连排管放置到核酸分子杂交仪对应位置，并打开芯片反应舱盖子，将基因检测芯片按八连排管位置一一对应放置于杂交反应舱内，扣紧反应舱盖子，并做好标记。在控制程序中，加载42℃标准杂交程序，请见表4，确认无误后，运行杂交程序进行杂交试验。
表4.42℃标准杂交程序
杂交完成后，取出已杂交完成的基因检测芯片，将芯片显色区用ddH2O轻微冲洗、晾干。打开BE-3.0芯片识读仪的扫描窗，将已干燥的基因检测芯片放置于对应位置，合上扫描窗盖板，进行芯片的识读与扫描；完成扫描后，获得的芯片杂交结果图像用基因芯片图像分析软件Arraydoctor3.0提取各点的信号强度，设定阳性判断值(Cut-off)的信号强度为50，将试验结果进行整理分析。
结果请见图2，本实施例分别以稀释度为10-4的pUC57-ASFV-B646L、pUC57-ASFV-CD2v、pUC57-ASFV-MGF360-12L、pUC57-ASFV-MGF505-3R、pUC57-ASFV-I177L质粒参考品为模板，验证单靶点的准确性与特异性。试验结果显示，靶点B646L的信号值为222，靶点CD2v的信号值为204，靶点MGF360-12L的信号值为229，靶点MGF505-3R的信号值为229，靶点I177L的信号值为198.5，靶点PC的信号值为201；各靶点对应探针的杂交信号亮度值均大于Cut-off值，可以准确区分每个靶基因，靶点之间无交叉反应，质控探针杂交正常，试验成立，说明单个靶点具有良好的准确性与特异性。
实施例3-多靶点准确性与特异性验证
利用本发明所设计的所有引物，按上游引物：下游引物为1:3的浓度配制引物混合液，具体配制方法见表5；使用上述引物混合液配制多重扩增液，具体配制方法见表6；将稀释度为10-3的pUC57-ASFV-B646L、pUC57-ASFV-CD2v、pUC57-ASFV-MGF505-3R、pUC57-ASFV-MGF360-12L、pUC57-ASFV-I177L质粒参考品等体积混合，然后将混合质粒加入到等量的ddH2O中制成质粒混合液，以质粒混合液为模板，按表3配制引物不对称PCR反应体系，扩增得到大量带有Biotin标记的ssDNA。
表5、引物混合液配制体系
表6、多重扩增液配制体系
| 成分 | 剂量(μL)) |
| 5x PCR Buffer | 5 |
| 引物混合液 | 2.5 |
| dATP(10mmol/L) | 0.5 |
| dGTP(10mmol/L) | 0.5 |
| dCTP(10mmol/L) | 0.5 |
| dTTP(10mmol/L) | 0.25 |
| dUTP(10mmol/L) | 0.25 |
| TMS溶液 | 0.72 |
| Tris | 7.78 |
| 总计 | 18 |
基因芯片杂交显色与基因芯片扫描及扫描结果分析同实施例2，本实施例不再赘述。
实施例3结果请见图3，使用本发明所设计的引物配制多重扩增液，以每种ASFV阳性质粒最终稀释度为10-4的质粒混合液为模板，验证多靶点的准确性与特异性。试验结果显示靶点B646L、CD2v、MGF360-12L、MGF505-3R、I177L、PC的信号值依次为198、209.5、190、196、222、194；所有靶点对应探针的杂交信号亮度值均大于相应探针的Cut-off值，各靶点的杂交信号亮度值总体来说稍弱于单重靶点验证的信号亮度值，质控探针杂交正常，试验成立，说明多靶点准确性与特异性良好，各靶点之间几乎不存在相互抑制或相互竞争。
实施例4-基因芯片杂交程序的优化
本发明确定最佳反应条件，杂交温度选择38℃、40℃、42℃、44℃、46℃，其中B646L靶点的最适杂交温度为44℃；MGF360-12L靶点的最适杂交温度为38℃；MGF505-3R靶点、CD2v靶点和I177L靶点的最适杂交温度为40℃；因此本发明最终选择40℃作为该基因芯片的最适杂交温度。杂交时间选择15min、20min、25min、30min，其中靶点B646L的最适杂交时间为25min，其余靶点的最适杂交时间为30min。因此本发明最适杂交时间选择30min。抗体反应时间选择5min、10min、15min，其中靶点B646L的最佳抗体反应时间为15min，靶点MGF505-3R的最佳抗体反应时间为10min，其余靶点的最佳抗体反应时间均为5min。因此本发明抗体反应时间选择5min。显色时间选择5min、10min、15min，其中15min时所有靶点的信号值最大。
实施例5-基因芯片性能试验
特异性试验
本实施例分别以武汉中元牧康检测技术服务有限公司提供的猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)核酸、猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type 2,PCV2)核酸、豬細小病毒病(porcine parvovirus infection，PPI)核酸、猪瘟病毒(CSFV)核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV)核酸为模板，同时设置pUC57质粒为模板的阳性对照，进行引物不对称PCR扩增，将PCR扩增产物按以优化好的反应体系进行基因芯片杂交及显色，通过BE-3.0芯片识读仪对基因芯片进行识读与扫描，完成扫描后，利用基因芯片图像分析软件Arraydoctor 3.0提取各点的信号强度，验证基因芯片的特异性。
结果请见图4，以PRV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV核酸为模板的CYTB靶点和GAPDH靶点均有很强的信号值，以PCV2、CSFV、PRRSV核酸为模板的空白对照也有信号值，但均小于Cut-off值，判定为阴性，其他靶点均无信号值检出；以PC为扩增模板的阳性对照在基因芯片相应的靶点有信号值，质控探针信号正常，试验成立。试验结果表明，该方法与PRV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV基因组无交叉反应，具有良好的特异性。
灵敏度试验
将稀释度为10-2的pUC57-ASFV-B646L、pUC57-ASFV-CD2v、pUC57-ASFVMGF505-3R、pUC57-ASFV-MGF360-12L、pUC57-ASFV-I177L质粒参考品等体积混合，然后将混合质粒加入到等量的ddH2O中制成质粒混合液，将上述质粒混合液再进行10倍倍比稀释，以每种质粒最终稀释度为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的质粒混合物为模板，进行多重引物不对称PCR扩增，将PCR扩增产物按照优化好的条件同时进行基因芯片杂交及显色，通过BE-3.0芯片识读仪对基因芯片进行识读与扫描，完成扫描后，利用基因芯片图像分析软件Arraydoctor 3.0提取各点的信号强度，验证基因芯片的灵敏度。
结果各个靶点的灵敏度由于探针的不同而不同，根据阳性克隆质粒拷贝数的计算公式((6.02x1023)x(ng/μLx10-9)/(DNA lengthx660)＝copies/μL)中的拷贝数计算方法计算各个靶点的最低检出限，B646L靶点的检出限为9.44x102copies/μL，CD2v靶点的检出限为8.67x102copies/μL，MGF360-12L靶点的检出限为1.01x103copies/μL，MGF505-3R靶点的检出限为8.43x102copies/μL，I177L靶点的检出限为8.53x102copies/μL，表明该方法灵敏度高。
重复性试验
将稀释度为10-3的pUC57-ASFV-B646L、pUC57-ASFV-CD2v、pUC57-ASFVMGF505-3R、pUC57-ASFV-MGF360-12L、pUC57-ASFV-I177L质粒等体积混合，然后将混合质粒加入到等量的ddH2O中制成质粒混合液，以质粒混合液为模板，选取5个不同批次的基因芯片，每个批次随机选取1张基因芯片进行检测，验证基因芯片的批间重复性；随机选取同一批次的5张基因进行检测，验证基因芯片的批内重复性。检测完成后，通过统计各靶点的信号强度计算批间和批内的变异系数，验证基因芯片的重复性。
结果请见表7、8，根据检测结果的信号值计算出批内变异系数为2.59％～7.21％(表7)，批内变异系数为2.71％～4.71％(表8)。批内及批间差异均小于8％，表明该方法重复性较好。
表7.基因芯片批内重复性
表8.基因芯片批间重复性
稳定性试验
取同一批次制备的9张基因芯片，随机分为三组，将三组芯片同时放入-20℃冰箱保存，每隔30天取出一组基因芯片对同一浓度模板进行检测，取每组基因芯片检测信号的中位值进行统计分析，以验证基因芯片在-20℃条件下放置30天、60天、90天的稳定性。
结果请见图5所示，本基因芯片在-20℃保存30天、60天、90天后对同一浓度模板进行检测的信号值相差不大，表明该基因芯片在-20℃的保存条件下具有较好的稳定性。
实施例6-ASFV核酸检测试剂盒检测
本实施例对临床猪的样本进行ASFV检测，将本发明试剂盒同时与商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒(北京森康生物技术开发有限公司，非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒)进行对比试验，初步验证本方法检测并鉴别ASFV野毒株与基因缺失毒株的可行性。血液基因组DNA提取试剂盒为上海百傲科技股份有限公司产品，其余试剂同实施例2-5。试验样本为武汉中元牧康检测技术服务有限公司提供的15份送检的猪抗凝血和2份ASFV核酸。
本实施例分别以17份核酸样品为模板，利用北京森康ASFV核酸检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书配制反应体系，反应体系中包括：荧光PCR反应液20μL，Tap酶0.5μL，样本模板5μL；荧光PCR反应的循环条件：第一阶段，50℃反应2min；第二阶段，95℃预变性3min；第三阶段，95℃变性15s，60℃退火延伸30s，40个循环。荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。反应完成后按照说明书的判定标准对试验结果进行判定。
ASFV核酸检测试剂盒检测结果请见图6，1为ASFV核酸样本-1；2为ASFV核酸样本-2；3-17为猪抗凝血样本DNA，2份ASFV核酸样品的CT值分别为26.94和27.25，呈阳性，但无法判断是野毒株还是基因缺失毒株的核酸样品；15份抗凝血样品均无CT值，呈阴性。阳性对照CT值为23.24，阴性对照无CT值，说明试验成立。
本实施例检测使用实施例1-5建立的ASFV基因芯片检测方法，分别对17份核酸样品进行基因芯片检测，检测结果显示ASFV核酸样本-1的B646L、CD2v、MGF360-12L、MGF505-3R、I177L、CYTB、GAPDH靶点的信号值分别为174.5、165、156、148、184、81.5、176.5；ASFV核酸样本-2的B646L、CD2v、MGF360-12L、MGF505-3R、I177L、CYTB、GAPDH靶点的信号值分别为165、164.5、150.5、155、167、87.5、149.5；15份抗凝血样品B646L、CD2v、MGF360-12L、MGF505-3R、I177L靶点均无信号值，CYTB、GAPDH靶点信号值正常；所有空白靶点的信号值均为0，试验成立。最终检测结果为2份ASFV核酸样品ASFV检测结果呈阳性，且为野毒株核酸样品；15份猪抗凝血样品ASFV检测结果为阴性。阳性结果请见图7。
核酸样品检测及对比试验
按照《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》，统计3.3.2中利用本发明建立的ASFV基因芯片检测方法和ASFV核酸检测试剂盒检测方法对17份样品的检出结果，计算二者的ASFV阳性检出符合率。计算结果显示，本发明建立的ASFV基因芯片检测方法和ASFV核酸检测试剂盒检测方法的ASFV阳性检出符合率为100％。统计结果见表9。
表9、基因芯片法和荧光PCR检测试剂盒对17份样品的检测结果
本发明针对ASFV常用检测基因B646L和常见缺失基因CD2v、MGF360-12L、MGF505-3R、I177L基因设计引物和探针，通过对反应体系的优化，建立了一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失毒株的基因芯片检测方法。该基因芯片检测方法特异性强，与PRV、PCV-2、PPV、CSFV、PRRSV均无交叉反应；该方法灵敏度高，对五种ASFV阳性重组质粒的检出限低至8.43x102copies/μL；该方法重复性好，重复性试验的变异系数均小于8％；该方法稳定性好，基因芯片在-20℃条件下保存90天，对同一模板的检测信号值无明显变化。该基因芯片检测方法与ASFV荧光检测PCR检测试剂盒对17份临床样品DNA进行对比检测，两种检测方法的阳性符合率为100％。基因芯片检测方法可以判断检出商品化ASFV荧光检测试剂盒无法鉴别的阳性样品为ASFV野毒株核酸样品。
Claims (7)
1.一组检测非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的特异性探针，其特征在于，所述特异性探针的核苷酸序列包括：
B646L探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
CD2v探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
MGF360-12L探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
MGF505-3R探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；以及
I177L探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针在5’端经过T15臂氨基化(NH2(T)15)修饰。
3.一种鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包含固相载体，以及权利要求1所述探针固定在所述固相载体上的核苷酸探针。
4.一种非洲猪瘟病毒鉴别检测的核酸杂交组件，其特征在于，包含权利要求3所述的基因芯片和用于核酸杂交的试剂。
5.一种非洲猪瘟病毒鉴别检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的基因芯片。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包含下述用于扩增目标基因片段的引物组：
用于扩增B646L的目标基因片段的引物组1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
用于扩增CD2v的目标基因片段的引物组2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
用于扩增MGF360-12L的目标基因片段的引物组3：上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
用于扩增MGF505-3R的目标基因片段的引物组4：上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；以及
用于扩增I177L的目标基因片段的引物组5：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组1-5中的各个下游引物的5'端经生物素标记。
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|---|---|---|---|---|
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