JP7128792B2 - ハイスループットなレセプター：リガンド同定の方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１１日出願の米国特許仮出願第６１／７３５，７９１号及び２０１３年６月１１日出願の同第６１／８３３，５８８号の利益を主張するものであり、それらの各内容は、参照により本明細書に取り込まれる。

政府による後援の表明
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号３Ｕ５４ＧＭ０９４６６２－０２、５Ｕ０１ＧＭ０９４６６５－０２及びＡＩ０５７１５８の下、米国連邦政府による後援を受けてなされた。連邦政府は、本発明において特定の権利を有する。

発明の背景
本出願全体を通して、様々な発行物が、括弧内に参照される。これらの参考資料の全ての引用を、明細書の最終部分に見出すことができる。これらの発行物、並びに本明細書で参照される全ての特許、特許出願刊行物及び書物は全体として、表題の発明が所属する技術分野をより完全に記載する表題の出願に、参照により取り込まれる。

細胞表面のレセプター及び接着分子は、正常な生理及び病理の中心となる発達工程、形態発生工程及び環境工程をはじめとする細胞機能の門番である。これらの分子は、最も主要な治療ターゲットである。これらの複合体の高分解能構造の特性が、これらの相互作用及びその関連のシグナル伝達経路を細胞全体の生理に統合するのに重要となるレセプター：リガンド特異性、親和性、オリゴマー状態、結合価及び全体的な構造特性の基礎となる化学的及び物理的決定因子を定義する。これらの特色全ては、複雑な細胞工程を指揮して治療的介入に特有の機会を提供する根本的メカニズムを理解する上で不可欠である。残念なことに現在のところ、ほとんどではないにしろ多くのレセプター：リガンド対は定義されておらず、つまり構造的に特徴づけることができないため、これらの重要な複合体の系統的構造特性（即ち、セクレトームの構造ゲノミクス）は、非現実的な目標である。

本発明は、ヒトの生理、疾患及び医薬に関連するレセプター：リガンド相互作用のレパートリーの効率的かつ系統的な同定のための技術を提供することにより、この要求に取り組んでいる。

（ｉ）第一の所定の異種分泌タンパク質、異種膜タンパク質又は異種細胞表面タンパク質、及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、（ｉｉ）第二の所定の異種分泌タンパク質又は第二の異種タンパク質、及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と、を含む細胞マイクロアレイであって、
該第一及び第二の複数の細胞が、マイクロアレイの固体表面に接着されていて、該第一と第二の複数の細胞が、固体表面の空間的に別個の位置に存在する、細胞マイクロアレイが提供される。

（ｉ）（ａ）第一の所定の異種タンパク質、及び（ｂ）第一の蛍光タンパク質、を発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、（ｉｉ）（ａ）第二の所定の異種タンパク質、及び（ｂ）第二の蛍光タンパク質、を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と、を含む細胞マイクロアレイであって、
該第一及び第二の複数の細胞が、マイクロアレイの固体表面に接着されていて、該第一と第二の複数の細胞が、固体表面の空間的に別個の位置に存在する、細胞マイクロアレイが提供される。

本明細書に記載された細胞マイクロアレイを作製する工程であって、第一の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに第二の異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、該貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置の固体表面でマイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに細胞を固体表面に接着させるように、そしてそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部に各発現構築物によるトランスフェクションを起こさせるために、トランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させること、を含む、工程が提供される。

候補タンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第二のタンパク質を本明細書に記載された細胞マイクロアレイの異種タンパク質として発現させること、細胞マイクロアレイを第三の蛍光タンパク質又はペプチドに貼付された候補タンパク質又はペプチドと接触させること、候補タンパク質又はペプチドと接触された細胞マイクロアレイを洗浄して、非結合候補タンパク質又はペプチドを除去すること、及び洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定すること、を含み、第一の異種タンパク質で形質転換された細胞に対応する第一の空間的位置に洗浄後の細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質が存在すれば、候補タンパク質又はペプチドが第一の異種タンパク質に結合していることが示され、洗浄後の第一の空間的位置に細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在しなければ、候補タンパク質又はペプチドが異種タンパク質に結合していないことが示される、方法も提供される。

（ｉ）マイクロアレイの固体表面、及び、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するようにかつ第一のＣ－末端細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株と、
（ｉｉ）少なくとも（ａ）所定の異種タンパク質を細胞表面で発現するようにかつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、第二の複数の細胞、又は（ｂ）異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズと
を含むシステムであって、（ａ）又は（ｂ）が、マイクロアレイの固体表面に貼付されている、システムも提供される。先のものに必要な変更を加えたシステムであって、候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の複数の形質転換された細胞又は複数のマイクロビーズ上で発現され、異種タンパク質が形質転換された浮遊培養適合細胞株の細胞表面で発現される、システムも提供される。

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、本発明のシステムの浮遊培養適合細胞株の複数において候補リガンドタンパク質又はペプチド及び第一の蛍光タンパク質を発現させること、並びにその細胞株の複数を、（ａ）異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第二の複数の細胞、又は（ｂ）異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を表面に貼付させた複数のマイクロビーズ、と接触させること、並びに洗浄して非結合候補リガンドタンパク質又はペプチドを除去すること、並びにＦＡＣＳ分析により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定すること、を含み、空間的に別個の位置で細胞が第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、第一のタンパク質又はペプチドが空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合していることが示される、方法。

細胞表面で第一の異種タンパク質を発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種タンパク質に対する独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を含み、該独特配列が１つ以上のユニバーサルプライマー（複数可）により鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種タンパク質に対する別の独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、（ｉ）細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は（ｉｉ）表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の所定のタンパク質に結合するかどうかを決定する方法であって、第二の所定のタンパク質を本発明のシステムの異種タンパク質として発現させて、（ｉ）細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は（ｉｉ）表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズ、の候補リガンドタンパク質又はペプチドと接触させること；
該第二の複数の細胞の１つ以上に、又は該複数の磁気マイクロビーズに結合された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞のいずれかを、磁気引力により分離すること；
そのような分離された細胞間又は細胞－マイクロビーズコンジュゲートからＤＮＡを得て、存在するならばＤＮＡ中の独特な配列を、ユニバーサルプライマーを用いて増幅させること；
該独特な配列の複数のコピーをシークエンシングして独特な配列の存在を確認すること；
そのように同定された独特な配列（複数可）をデータベースに対して比較して、独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を特異的異種タンパク質又はペプチドに相関させ、それによりそのように相関された任意の異種タンパク質又はペプチド結合を同定し、それにより特異的異種タンパク質又はペプチドを候補タンパク質又はペプチドに結合しているとして同定すること、
を含む方法も提供される。

（ｉ）（ａ）細胞表面で異種タンパク質を発現するように、かつ（ｂ）第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが発現された異種タンパク質に対する独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を含むことで、該第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞が少なくとも２つの異なるタイプの第一の異種タンパク質を発現する、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、（ｉｉ）細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換されており、単一タイプの第二の異種タンパク質を発現する、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、を含むシステム。一実施形態において、第一の複数の細胞の任意の各細胞は、細胞表面の唯一の異種タンパク質を発現する。一実施形態において、第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質の異なるタイプのいずれも、第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質と同じ配列を有さない。

候補リガンドタンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質を第二の異種タンパク質に結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本明細書に記載されたシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、第二のタンパク質又はペプチドを本明細書に記載されたシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させること、任意で洗浄して非結合の第一の異種タンパク質をいずれも除去すること、その後、第一及び第二の異種タンパク質が両者とも共存する細胞を回収すること、回収された細胞から核酸を得ること、核酸をシークエンシングして、それに含まれる独特な１５～３５ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合した独特な１５～３５ヌクレオチド配列に対応する候補リガンドタンパク質又はペプチドを同定すること、を含む、方法も提供される。

第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合に及ぼす、第一のタンパク質の所定のアミノ酸残基の影響を決定する方法であって、第一のタンパク質に対して１つ以上の点突然変異により変異されたタンパク質を、本明細書に記載されたシステムの第一の浮遊培養適合細胞株の複数の中の複数の異なるタイプの異種タンパク質として発現させること、該細胞株の複数を、該第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された本明細書に記載されたシステムの第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質の形態の該第二のタンパク質と接触させること、第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞を回収すること、回収された細胞から核酸を得ること、核酸をシークエンシングしてそれに含まれる独特な１５～３５ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合された第一のタンパク質を同定すること、並びに第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルを、所定の参照レベルと比較すること、を含み、
第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも多ければ、該タンパク質中で変異された１つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を増大させていることが示され、第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも少なければ、該タンパク質中で変異された１つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を阻害していることが示される、方法も提供される。

（ｉ）細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、（ｉｉ）表面に標的タンパク質、ペプチド又は抗体を貼付させた複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムも提供される。

２つの候補リガンドタンパク質又はペプチドの１つ以上が標的タンパク質、ペプチド又は抗体に結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質及び第二の異種タンパク質を標的タンパク質、ペプチド又は抗体に結合させる条件下で、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明のシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明のシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させること、第一の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された、そして／又は第二の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された任意のマイクロビーズを回収すること、並びに該複合体中の候補リガンドタンパク質を同定すること、を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞又は第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、それぞれ第一の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないこと、及び第二の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、方法も提供される。

（ｉ）細胞表面で第一の異種標的タンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された１つ以上の第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、（ｉｉ）表面に、候補リガンドタンパク質若しくはペプチドのいずれかに対する抗体、又は標的タンパク質又はペプチドに対する抗体を貼付させた複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、候補リガンドタンパク質又はペプチドと標的タンパク質又はペプチドを結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本発明のシステムにおいて第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質として発現させ、そして標的タンパク質又はペプチドを本発明のシステムのシステムにおいて第一の異種タンパク質として発現させること、並びに第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方と複合体化された任意のマイクロビーズを回収すること、を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、方法も提供される。
[本発明1001]
（ｉ）（ａ）第一の所定の異種タンパク質、及び（ｂ）第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、
（ｉｉ）（ａ）第二の所定の異種タンパク質、及び（ｂ）第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と
を含む細胞マイクロアレイであって、
第一及び第二の複数の細胞が、該マイクロアレイの固体表面に接着されており、第一と第二の複数の細胞が、該固体表面の空間的に別個の位置に存在する、前記細胞マイクロアレイ。
[本発明1002]
（ｉ）異種タンパク質の1つのための候補タンパク質若しくはペプチドリガンドと、（ｉｉ）異種タンパク質の1つに結合した第三の蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質をさらに含むか、又は異種タンパク質の1つのためのペプチド若しくはタンパク質リガンドを含む化合物をさらに含む、前記細胞マイクロアレイであって、
該化合物が、非ペプチド結合により結合された第三の蛍光タンパク質を有し、細胞マイクロアレイの異種タンパク質の1つに結合されている、本発明1001の細胞マイクロアレイ。
[本発明1003]
第三の複数の細胞を対照としてさらに含む、前記細胞マイクロアレイであって、第三の複数の細胞が、第一の蛍光タンパク質を発現するように任意で形質転換されているが、第一又は第二の所定の異種タンパク質では形質転換されていない、本発明1001又は1002の細胞マイクロアレイ。
[本発明1004]
前記複数の細胞がそれぞれ、複数の哺乳動物細胞である、本発明1001、1002又は1003の細胞マイクロアレイ。
[本発明1005]
哺乳動物細胞が、単離されたヒト細胞である、本発明1001、1002、1003又は1004の細胞マイクロアレイ。
[本発明1006]
前記細胞が、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株の細胞である、本発明1001、1002、1003又は1004の細胞マイクロアレイ。
[本発明1007]
前記細胞が、ＨＥＫ293細胞株の細胞である、本発明1001、1002、1003、1004又は1006の細胞マイクロアレイ。
[本発明1008]
前記マイクロアレイが、少なくとも10の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞がそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質が、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる、本発明1001～1007のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1009]
前記マイクロアレイが、少なくとも100の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞がそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質が、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる、本発明1001～1008のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1010]
第一のタンパク質及び／又は蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質である、本発明1001～1009のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1011]
第三の蛍光タンパク質が、赤色蛍光タンパク質である、本発明1002～1010のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1012]
前記複数の細胞がそれぞれ、第一の所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されているに過ぎず、任意の他の異種タンパク質を発現するようには形質転換されていない、本発明1001～1011のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1013]
第一の所定の異種タンパク質が、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、前記複数の細胞が、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている、本発明1001～1011のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1014]
第一の所定の異種タンパク質が、発現される際に、Ｃ末端を介して第一の蛍光タンパク質に付着される、本発明1001～1013のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1015]
第一の所定の異種タンパク質が、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される、本発明1001～1013のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1016]
第一の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに第二の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置の固体表面で、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びにトランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させ、それにより各発現構築物によるそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部のトランスフェクションを可能にすること
により、前記細胞マイクロアレイが、組み立てられる、本発明1001～1015のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1017]
発現構築物が、ｐＥＧＦＰ－Ｎ1発現構築物を含む、本発明1016の細胞マイクロアレイ。
[本発明1018]
発現構築物が、ＣＭＶプロモータを含む、本発明1016又は1017の細胞マイクロアレイ。
[本発明1019]
前記細胞が、昆虫細胞である、本発明1001、1002、1003、又は1008～1018のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1020]
前記細胞が、ショウジョウバエＳ2細胞である、本発明1019の細胞マイクロアレイ。
[本発明1021]
第一及び／又は第二の異種タンパク質が、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、ＴＮＦレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である、本発明1001～1020のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1022]
第一及び／又は第二の異種タンパク質が、Ｔｏｌｌ様レセプター、ＴＮＦレセプター、ＧＰＣＲ、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである、本発明1001～1020のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1023]
第一及び／又は第二の異種タンパク質が、哺乳動物のものである、本発明1001～1022のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1024]
第一及び／又は第二の異種タンパク質が、細胞膜に局在化した位置に発現される、本発明1001～1022のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1025]
第一及び／又は第二の所定の異種タンパク質が、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、又は細胞表面タンパク質である、本発明1001～1024のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1026]
前記細胞マイクロアレイが、異種タンパク質を発現するように形質転換された、500以上の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞がそれぞれ、他の複数の形質転換細胞により発現された異種タンパク質と互いに異なる異種タンパク質を発現する、本発明1001～1025のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1027]
異種タンパク質が、分泌タンパク質であり、膜貫通へリックスに融合されて発現される、本発明1001～1026のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1028]
第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質が、同じタイプであり、第三の蛍光タンパク質が、異なるタイプのものである、本発明1001～1027のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1029]
第一の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付する段階、並びに
第二の異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置でマイクロアレイの固体表面に貼付する段階、並びに
細胞を固体表面に接着させるように、かつそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部に各発現構築物によるトランスフェクションを起こさせるために、トランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させる段階
を含む、本発明1001～1028のいずれかの細胞マイクロアレイを作製するための方法。
[本発明1030]
ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）を用いて、発現構築物を調製する、本発明1029の方法。
[本発明1031]
候補タンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、
第二のタンパク質を本発明1001～1028のいずれかの細胞マイクロアレイの異種タンパク質として発現させる段階、及び細胞マイクロアレイを第三の蛍光タンパク質又はペプチドに貼付された候補タンパク質又はペプチドと接触させる段階、候補タンパク質又はペプチドと接触させた細胞マイクロアレイを洗浄して、非結合候補タンパク質又はペプチドを除去する段階、及び洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定する段階を含み、
第一の異種タンパク質で形質転換された細胞に対応する第一の空間的位置に洗浄後の細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在すれば、候補タンパク質又はペプチドが第一の異種タンパク質に結合していることが示され、洗浄後の第一の空間的位置に細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在しなければ、候補タンパク質又はペプチドが異種タンパク質に結合していないことが示される、前記方法。
[本発明1032]
洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定する段階が、第三の蛍光タンパク質の蛍光を測定すること、及び細胞マイクロアレイでの位置を決定することにより実行され、
第三の蛍光タンパク質と、第一又は第二の蛍光タンパク質が空間的に別個の位置に共存することにより、第一のタンパク質又はペプチドが、空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合されていることが示される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
（ｉ）マイクロアレイの固体表面、及び、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一のＣ－末端細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、浮遊培養適合細胞株と、
（ｉｉ）少なくとも（ａ）所定の異種タンパク質を細胞表面で発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、第二の複数の細胞、又は（ｂ）異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズと
を含むシステムであって、（ａ）又は（ｂ）が、前記マイクロアレイの固体表面に貼付されている、前記システム。
[本発明1034]
（ｃ）異なる所定の異種タンパク質を細胞表面で発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の細胞、又は
（ｄ）異なる所定の異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、1つ以上のさらなる複数のマイクロビーズ
をさらに含み、（ｃ）又は（ｄ）が、複数の（ａ）及び／又は（ｂ）とは空間的に別個の位置でマイクロアレイ固体表面に貼付されている、本発明1033のシステム。
[本発明1035]
異種タンパク質が、プロテインＡ分子を介してマイクロビーズに貼付されている、本発明1033又は1034のシステム。
[本発明1036]
細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株が、候補リガンドタンパク質又はペプチドをコードする核酸構築物で一過性にトランスフェクトされている、本発明1033、1034又は1035のシステム。
[本発明1037]
異種タンパク質が、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付されている、本発明1033～1036のいずれかのシステム。
[本発明1038]
第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質が、異なる色である、本発明1033～1037のいずれかのシステム。
[本発明1039]
一方の蛍光タンパク質が、緑色であり、他方の蛍光タンパク質が、赤色である、本発明1038のシステム。
[本発明1040]
前記複数の細胞が、複数の哺乳動物細胞である、本発明1033～1039のいずれかのシステム。
[本発明1041]
前記細胞が、単離されたヒト細胞である、本発明1033～1040のいずれかのシステム。
[本発明1042]
前記細胞が、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株の細胞である、本発明1033～1041のいずれかのシステム。
[本発明1043]
前記細胞が、ＨＥＫ293細胞株の細胞である、本発明1033～1042のいずれかのシステム。
[本発明1044]
所定の異種タンパク質が、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、前記複数の細胞が、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている、本発明1033～1043のいずれかのシステム。
[本発明1045]
所定の異種タンパク質が、分泌タンパク質、膜タンパク質、又は細胞表面タンパク質である、本発明1033～1044のいずれかのシステム。
[本発明1046]
所定の異種タンパク質が、発現される際に、Ｃ末端を介して蛍光タンパク質に付着される、本発明1033～1045のいずれかのシステム。
[本発明1047]
所定の異種タンパク質が、分泌タンパク質であり、発現される際に、膜貫通アンカーペプチド又はタンパク質に付着される、本発明1033～1046のいずれかのシステム。
[本発明1048]
発現構築物が、ｐＥＧＦＰ－Ｎ1発現構築物及び／又はＣＭＶプロモータを含む、本発明1033～1047のいずれかのシステム。
[本発明1049]
異種タンパク質が、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、ＴＮＦレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である、本発明1033～1048のいずれかのシステム。
[本発明1050]
異種タンパク質が、Ｔｏｌｌ様レセプター、ＴＮＦレセプター、ＧＰＣＲ、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである、本発明1033～1049のいずれかのシステム。
[本発明1051]
異種タンパク質が、哺乳動物のものである、本発明1033～1050のいずれかのシステム。
[本発明1052]
異種タンパク質が、細胞膜に局在化した位置で発現される、本発明1033～1051のいずれかのシステム。
[本発明1053]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、
本発明1033～1052のいずれかのシステムの浮遊培養適合細胞株の複数において候補リガンドタンパク質又はペプチド及び第一の蛍光タンパク質を発現させる段階、並びに
前記細胞株の複数を、（ａ）異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第二の複数の細胞、又は（ｂ）異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を表面に貼付させた複数のマイクロビーズ、と接触させる段階、並びに
洗浄して非結合候補リガンドタンパク質又はペプチドを除去する段階、並びに
ＦＡＣＳ分析又は磁気分離により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定する段階
を含み、
細胞が空間的に別個の位置の第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、第一のタンパク質又はペプチドが空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合していることが示される、前記方法。
[本発明1054]
第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存が、ＦＡＣＳ分析により決定される、本発明1053の方法。
[本発明1055]
細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する独特な所定の15～35ヌクレオチド配列を含み、独特な配列が1つ以上のユニバーサルプライマーにより鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する別の独特な所定の15～35ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
（ｉ）細胞表面でレセプタータンパク質若しくはペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は（ｉｉ）表面にレセプタータンパク質を貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと
を含むシステム。
[本発明1056]
細胞表面で第一の異種タンパク質を発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種タンパク質に対する独特な所定の15～35ヌクレオチド配列を含み、独特な配列が1つ以上のユニバーサルプライマーにより鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種タンパク質に対する別の独特な所定の15～35ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
（ｉ）細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は（ｉｉ）表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと
を含むシステム。
[本発明1057]
ユニバーサルプライマーが、Ｔ7フォワード及びリバースユニバーサルプライマーを含む、本発明1055又は1056のシステム。
[本発明1058]
ペプチド細胞表面エピトープが、ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）である、本発明1055、1056又は1057のシステム。
[本発明1059]
磁気分子物質を含む抗ＦＬＡＧエピトープ抗体をさらに含み、該抗体がＦＬＡＧエピトープに結合されている、本発明1058のシステム。
[本発明1060]
磁気分子物質が、超常磁性鉄含浸ビーズである、本発明1059のシステム。
[本発明1061]
独特な所定の15～35ヌクレオチド配列が、28ヌクレオチド長である、本発明1055～1060のいずれかのシステム。
[本発明1062]
表面に候補リガンドタンパク質又はペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズを含む、本発明1055～1061のいずれかのシステム。
[本発明1063]
細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上の更なる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞を含み、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、本発明1055～1061のいずれかのシステム。
[本発明1064]
表面に候補リガンドタンパク質又はペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズを、少なくとも1つのウェルが含み、表面に異なる候補リガンドタンパク質又はペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、異なる複数の磁気マイクロビーズを、第二のウェルが含む、マルチウェルプレート
を含む、本発明1056～1063のいずれかのシステム。
[本発明1065]
細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、更なる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞を、少なくとも1つのウェルが含み、更なる複数の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含み、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、異なる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞を、第二のウェルが含み、異なる複数の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、マルチウェルプレート
を含む、本発明1055～1063のいずれかのシステム。
[本発明1061]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の所定のタンパク質に結合するかどうかを決定する方法であって、
第二の所定のタンパク質を本発明1055～1060のいずれかのシステムの異種タンパク質として発現させる段階、及び
（ｉ）細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は
（ｉｉ）表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズ
の候補リガンドタンパク質又はペプチドと接触させる段階；
第二の複数の細胞の1つ以上に又は複数の磁気マイクロビーズに結合された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞のいずれかを、磁気引力により分離する段階；
そのような分離された細胞間又は細胞－マイクロビーズのコンジュゲートからＤＮＡを得て、存在するならばＤＮＡ中の独特な配列を、ユニバーサルプライマーを用いて増幅させる段階；
独特な配列の複数のコピーをシークエンシングして独特な配列の存在を確認する段階；
そのように同定された独特な配列をデータベースに対して比較して、独特な所定の15～35ヌクレオチド配列を特異的異種タンパク質又はペプチドに相関させ、それによりそのように相関された任意の異種タンパク質又はペプチド結合を同定し、それにより特異的異種タンパク質又はペプチドを、候補タンパク質又はペプチドに結合しているとして同定する段階
を含む、前記方法。
[本発明1062]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが、プロテインＡ分子を介してマイクロビーズに貼付されている、本発明1061の方法。
[本発明1063]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付されている、本発明1061又は1062の方法。
[本発明1064]
第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質が、異なる色である、本発明1061～1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
一方の蛍光タンパク質が、緑色であり、他方の蛍光タンパク質が、赤色である、本発明1061～1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記複数の細胞が、複数の哺乳動物細胞である、本発明1061～1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
哺乳動物細胞が、単離されたヒト細胞である、本発明1061～1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株の細胞である、本発明1061～1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
哺乳動物細胞が、ＨＥＫ293細胞株の細胞である、本発明1068の方法。
[本発明1070]
所定の異種タンパク質が、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、前記複数の細胞が、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている、本発明1061～1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
所定の異種タンパク質が、発現される際に、Ｃ末端を介して蛍光タンパク質に付着される、本発明1061～1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
所定の異種分泌タンパク質が、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される、本発明1061～1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
異種タンパク質が、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、ＴＮＦレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である、本発明1061～1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
異種タンパク質が、Ｔｏｌｌ様レセプター、ＴＮＦレセプター、ＧＰＣＲ、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである、本発明1061～1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
異種タンパク質が、哺乳動物のものである、本発明1061～1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
異種タンパク質が、細胞膜に局在化した位置で発現される、本発明1061～1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
（ｉ）マイクロアレイの固体表面と、
（ｉｉ）（ａ）複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1～25アミノ酸残基の点突然変異により複数のタンパク質の他のタイプそれぞれと異なる、複数の異なる第一の異種タンパク質のうちの単一タイプを、複数の細胞の細胞表面で、および
（ｂ）第一の細胞質発現蛍光タンパク質を
発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株の複数の細胞と、
（ｉｉｉ）少なくとも（1）所定の第二の異種タンパク質を細胞表面で発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、第二の複数の細胞、又は（2）浮遊培養適合細胞株に関して異種の第二のタンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズと
を含み、（1）又は（2）が、前記マイクロアレイの固体表面に貼付されている、システム。
[本発明1078]
前記複数の第一の異種タンパク質の異なるタイプが、野生型タンパク質の各突然変異体である、本発明1077のシステム。
[本発明1079]
第二の異種タンパク質が、野生型タンパク質である、本発明1078のシステム。
[本発明1080]
複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1、2、3、4又は5アミノ酸残基の点突然変異により複数のタンパク質の互いのタイプと異なっている、本発明1077、1078又は1079のシステム。
[本発明1081]
複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1アミノ酸残基の点突然変異により複数のタンパク質の互いのタイプと異なっている、本発明1077、1078又は1079のシステム。
[本発明1082]
第一又は第二の蛍光タンパク質が、緑色である、本発明1077～1081のいずれかのシステム。
[本発明1083]
他の蛍光タンパク質が、赤色である、本発明1077～1082のいずれかのシステム。
[本発明1084]
野生型タンパク質中の残基を、野生型タンパク質と第二のタンパク質との物理的相互作用に影響を及ぼすものであると決定する方法であって、
野生型タンパク質に関して変異されたタンパク質を、本発明1077～1083のいずれかのシステムの浮遊培養適合細胞株の複数のうちの異なる複数として発現させる段階、並びに
前記複数を、第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された本発明1077～1083のいずれかのシステムの第二の複数の細胞の形態の第二のタンパク質と、又は（ｂ）表面に第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を貼付させた複数のマイクロビーズと、接触させる段階、並びに
洗浄して非結合細胞を除去する段階、並びに
ＦＡＣＳ分析により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定する段階
を含み、空間的に別個の位置において細胞が第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、空間的に別個の位置に対応する共存する浮遊培養適合細胞株の細胞上のタンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、野生型タンパク質と第二のタンパク質との物理的相互作用に必要でないことが示される、前記方法。
[本発明1085]
野生型タンパク質及び第二のタンパク質が、互いに物理的に相互作用することが公知である、本発明1084の方法。
[本発明1086]
第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存が、ＦＡＣＳ分析により決定される、本発明1085の方法。
[本発明1087]
（ｉ）（ａ）細胞表面で異種タンパク質を発現するように、かつ（ｂ）第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが発現された異種タンパク質に対する独特な所定の15～35ヌクレオチド配列を含むことで、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞が少なくとも2つの異なるタイプの第一の異種タンパク質を発現する、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
（ｉｉ）細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、かつ第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換されており、単一タイプの第二の異種タンパク質を発現する、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と
を含むシステム。
[本発明1088]
第一の複数の細胞の任意の個々の細胞が、細胞表面の唯一の異種タンパク質を発現する、本発明1087のシステム。
[本発明1089]
第二の異種タンパク質が、膜レセプターである、本発明1087又は1088のシステム。
[本発明1090]
第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞中で発現された異種タンパク質のそれぞれが、分泌されたペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である、本発明1087、1088又は1089のシステム。
[本発明1091]
複数の第一の異種タンパク質の異なるタイプが、所定の野生型タンパク質の各突然変異体である、本発明1087、1088、1089又は1090のシステム。
[本発明1092]
第二の異種タンパク質が、野生型タンパク質である、本発明1087～1091のいずれかのシステム。
[本発明1093]
第一の複数の異なるタンパク質の異種タンパク質の各タイプが、1、2、3、4又は5アミノ酸残基の点突然変異により複数の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている、本発明1087～1092のいずれかのシステム。
[本発明1094]
複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1アミノ酸残基の点突然変異により複数の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている、本発明1087～1093のいずれかのシステム。
[本発明1095]
独特な配列が、1つ以上のユニバーサルプライマーにより鎖延長することが可能である、本発明1087～1094のいずれかのシステム。
[本発明1096]
第一又は第二の蛍光タンパク質が、緑色である、本発明1087～1095のいずれかのシステム。
[本発明1097]
他の蛍光タンパク質が、赤色である、本発明1096のシステム。
[本発明1098]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、
第一の異種タンパク質を第二の異種タンパク質に結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本発明1087～1097のいずれかのシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、かつ第二のタンパク質又はペプチドを本発明1087～1097のいずれかのシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させる段階、並びに
任意で洗浄して非結合の第一の異種タンパク質をいずれも除去する段階、
その後、第一及び第二の異種タンパク質が両方とも共存する細胞を回収する段階、
回収された細胞から核酸を得る段階、及び核酸をシークエンシングして、それに含まれる独特な15～35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合した独特な15～35ヌクレオチドに対応する候補リガンドタンパク質又はペプチドを同定する段階
を含む、前記方法。
[本発明1099]
第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合に及ぼす、第一のタンパク質の所定のアミノ酸残基の影響を決定する方法であって、
第一のタンパク質に対して1つ以上の点突然変異により変異されたタンパク質を、本発明1087～1097のシステムの第一の浮遊培養適合細胞株の複数の中の複数の異なるタイプの異種タンパク質として発現させる段階、並びに
該複数を、第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された本発明1087～1097のシステムの第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質の形態の第二のタンパク質と接触させる段階、並びに
第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞を回収する段階、
回収された細胞から核酸を得る段階、及び核酸をシークエンシングしてそれに含まれる独特な15～35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合された第一のタンパク質を同定する段階、並びに
第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルを、所定の参照レベルと比較する段階
を含み、
第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも多ければ、タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を増大させていることが示され、第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも少なければ、タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を阻害していることが示される、前記方法。
[本発明1100]
所定のレベルが、対照である、本発明1099の方法。
[本発明1101]
所定のレベルが、第二のタンパク質に結合する未変異の第一のタンパク質のレベルをアッセイすることにより得られる、本発明1099の方法。
[本発明1102]
第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞が、ＦＡＣＳ分析により回収される、本発明1098～1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
（ｉ）細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と
（ｉｉ）表面に標的タンパク質、ペプチド、又は抗体を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと
を含む、システム。
[本発明1104]
2つの候補リガンドタンパク質又はペプチドの1つ以上が標的タンパク質、ペプチド、又は抗体に結合するかどうかを決定する方法であって、
第一の異種タンパク質及び第二の異種タンパク質を、標的タンパク質、ペプチド、又は抗体に結合させる条件下で、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明1103のシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、かつ第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明1103のシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させる段階、並びに
第一の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化されかつ／又は第二の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された任意のマイクロビーズを回収する段階、並びに
複合体中の候補リガンドタンパク質を同定する段階
を含み、
第一の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞又は第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、それぞれ第一の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないこと、及び第二の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、前記方法。
[本発明1105]
（ｉ）細胞表面で第一の異種標的タンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、1つ以上の第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
（ｉｉ）候補リガンドタンパク質若しくはペプチドのいずれかに対する抗体又は標的タンパク質若しくはペプチドに対する抗体を表面に貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと
を含むシステム。
[本発明1106]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、
候補リガンドタンパク質又はペプチドと標的タンパク質又はペプチドを結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本発明1105のシステムにおいて第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質として発現させ、かつ標的タンパク質又はペプチドを本発明1105のシステムにおいて第一の異種タンパク質として発現させる段階、並びに
第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方と複合体化された任意のマイクロビーズを回収する段階
を含み、
第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、前記方法。

Ｔ細胞と抗原提示細胞の間に形成された免疫シナプスの結晶学的図。免疫シナプスの中枢領域のＴＣＲ:ＭＨＣ複合体及び共刺激レセプター：リガンド複合体の複合体モデル。ＴＣＲ:ＭＨＣ（ＰＤＢコード １Ｇ６Ｒ）、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１（３ＢＩＫ）、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ２（３ＢＰ５）及びＣＴＬＡ－４：Ｂ７－１（１Ｉ８Ｌ）の複合体は、既存の結晶構造の代表であり、一価ＣＤ２８：Ｂ７－１複合体のモデルは、ＣＤ２８モノマー（１ＹＪＤ）及びＣＴＬＡ－４：Ｂ７－１構造に基づいている。該複合体のおおよその寸法（即ち、長さ）と、構成されたＩｇドメインを膜に結合させる残基の数が示されている。免疫シナプス内の細胞膜の間のおよそ１４０Ａ°の距離も、留意されたい。レセプター：リガンド・エクトドメインの間の相互作用により課された局在化及び組織化を採用する細胞質シグナル伝達及びスカフォールティングタンパク質を、略図として（即ち、幾何学記号で）示している。この図により、細胞表面レセプター及びリガンドに関する機能の重要な決定因子である基本的特色（例えば、オリゴマー状態、結合価、リガンド特異性）及び全体的な組織的原理を定義する上で、レセプター：リガンド構造の重要性が強調される［４５］。 レセプター：リガンド構造の活用。左：ネズミＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ２複合体の構造。右：親和性が増大し、特異性が変化した、ＰＤ－１レセプターをもたらす点突然変異の位置。 細胞マイクロアレイプラットフォーム。左：細胞マイクロアレイを作製に関する略図。右：例として、ＧＦＰ発現構築物（即ち、プラスミド）を、発現アレイを作製するためにガラス表面に「固定した」。ＨＥＫ２９３細胞をプリントされたｃＤＮＡの上に播種し、続いてトランスフェクトされるようになり、生存する細胞アレイが得られた。この２０００スポットグリッドは、カスタマイズされたマイクロアレイプリンターを利用して構築された。各スポットは、細胞５０～８０個のクラスターである。 図４Ａ～４Ｃは、細胞マイクロアレイプラットフォームを用いた、Ｔ細胞リガンドとレセプターの結合の検出を示す。（Ａ）細胞質ＧＦＰ又は形質膜に埋入されたＰＤ－Ｌ１－ＧＦＰのいずれかを発現するＨＥＫ細胞の交互の列を含む高密度細胞マイクロアレイ（略図）。（Ｂ）アレクサ（Alexa）５９４二次抗体（赤色）と予め混合された精製ＰＤ－１ ＩｇＧによりアレイを処理して、アキソン（Axon）４０００Ｂマイクロアレイスキャナーで画像化した。ＰＤ－Ｌ１エクトドメインを提示する細胞のみが、染色を示し；細胞質ＧＦＰを発現する細胞は、染色を示さず、陰性対照として働く。（Ｃ）マージングされた画像から、標識されたＰＤ－１－Ｉｇ融合タンパク質とＰＤ－Ｌ１ ＧＦＰの共存が示されるが、細胞質ＧＦＰの構築物は示されない。これらの結果から、マイクロアレイの特異性が実証される。ＰＤ－Ｌ１と対照（ＧＦＰのみ）とのＧＦＰ蛍光強度の差が、発現方法により明示される。 Ｉｇスーパーファミリーの異なるメンバーの間の特異的結合を示す３つの細胞マイクロアレイ。スライドには、ＰＤ－１、Ｂ７－１及びＣＤ２００ＲのＧＦＰ融合構築物、又はＧＦＰのみをコードしたプラスミドＤＮＡの交互の列がプリントされた。３つのプリントされたスライドを、１０ｃｍ^２ペトリ皿に入れ、トランスフェクション試薬で処理し、その後、ＨＥＫ細胞を播種した。トランスフェクションの３日後に、スライドを洗浄し、続いてＰＤ－Ｌ２（スライド１）、ＣＴＬＡ－４（スライド２）又はＣＤ２００（スライド３）のＩｇ融合物で処理し、検出のためにＩｇ融合物をＣｙ７二次抗体とプレインキュベートした。プリントされた列は全て、トランスフェクトに成功しており、ＧＦＰ陽性であった（データは示さない）。画像は、Ｃｙ７チャネルのみからの蛍光シグナルを示している。各アレイでは、Ｉｇ融合物の顕著な結合が、コグネイトレセプター又はリガンドが存在する列のみで検出された。例えば、レセプターＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ２のみが、ＰＤ－１ ＧＦＰがプリントされた列で結合している。各スライドは、明瞭にするために疑似色を付されており、オーバーレイにより結合の特異的パターンが明らかである。 Ｉｇスーパーファミリーの哺乳動物発現ライブラリの作製。略図（上）で、Ｉ型分泌タンパク質の迅速かつ効率的クローニングのために特異的に操作されたライゲーション非依存性ベクターを示している。Ｉｇスーパーファミリーの２８３のメンバーをクローニングして、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによる発現をテストした。蛍光顕微鏡検査を利用すると、クローンのうち２４０（約８５％の成功）がバックグランドを超えて発現し、正しい膜局在性を示した。２４０の発現ライブラリメンバーのうち２４の代表的組み合わせについて、ＧＦＰ蛍光画像を示している。各発現構築物の予備検証が、さらなる「救済努力」を必要とするそれらのタンパク質を強調しており、それは完全に特徴づけられたロバストなプラットフォームのために不可欠である。 細胞マイクロアレイ形式でのコトランスフェクション。左）細胞質ＧＦＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞。中）細胞質ｍＣｈｅｒｒｙでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞。右）細胞質ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙでコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞。緑色及び赤色蛍光体によるコトランスフェクションは、黄色蛍光をもたらす。このことから、細胞マイクロアレイ形式での機能的な多成分レセプター（multicomponent receptors）を実現する上で必要となる複数のポリペプチドを発現させるための原理証明がもたらされる。 図８Ａ～８Ｃは、高結合活性のマイクロビーズによるリセプタ：リガンド発見の戦略を示す。Ａ）浮遊培養適合ＨＥＫ２９３細胞を、細胞質ｍＣＨＥＲＲＹに結合された、選択された細胞表面で一過性にトランスフェクトする（例えば、ＰＤ－Ｌ１；赤色の細胞）。Ｂ）５０ｎｍプロテインＡでコーティングされたＧＦＰタグのあるマイクロビーズを、ＰＤ－１ Ｉｇ又はＢ７－１ Ｉｇ融合タンパク質のいずれかで修飾する（緑色のビーズ）。Ｃ）赤色の細胞及び緑色のマイクロビーズをインキュベートすると、赤色：緑色コンジュゲートが得られる。Ｄ）フローサイトメトリーにより、レセプター：リガンド相互作用の検出及び定量が可能になる。Ｙ軸に沿って、赤色の非結合トランスフェクト細胞；Ｘ軸に沿って非結合の緑色マイクロビーズ；対角線に沿ってレセプター：リガンド相互作用を報告する赤色：緑色の細胞：マイクロビーズコンジュゲートとなる。 ＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１：Ｂ７－１相互作用のマイクロビーズを基にした実証。プロテインＡマイクロビーズを、１：４比のＦＩＴＣ－ＩｇＧ対Ｉｇ－融合物（即ち、ＰＤ－1又はＢ７－１）中でプレミックスされたＩｇＧで飽和させ、ペレット化させ、続いてＰＢＳに再懸濁させた。コンジュゲートされたマイクロビーズを、ｍＣｈｅｒｒｙ単独又はＰＤ－Ｌ１ ｍＣｈｅｒｒｙ融合物のいずれかを発現するＨＥＫ細胞と共にインキュベートして、結合の度合いをフローサイトメトリーにより決定した。これらのデータから、ＰＤ－１コンジュゲート、及びＢ７－１コンジュゲートされたマイクロビーズが、ＰＤ－Ｌ１のみを発現するＨＥＫ細胞に結合することが実証され、リガンドの結合活性上昇で実験的に測定され得る潜在的レセプター－リガンド相互作用のダイナミックレンジを改善するという戦略が裏づけられる。 フローサイトメトリーによる特異的に操作された細胞間相互作用の検出。ＨＥＫ２９３細胞を、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＰＤ－ＬＩ ｍＣｈｅｒｒｙ又はＰＤ－１ ＧＦＰでトランスフェクトした。細胞を２％ＢＳＡを含む氷冷ＤＭＥＭに再懸濁させて、細胞株を１：１化学量論比で一緒に混合した。個々の集団及び混合されたバイナリーペアを、４℃で２時間インキュベートした。赤色及び緑色蛍光イベント（event）（即ち、コンジュゲート）の数の有意な増加（約６０倍）が、リガンド及びレセプターが両者とも存在する場合のみで観察される。 フローサイトメトリーによるＣＤ２００：ＣＤ２００－レセプター相互作用の検出。ＨＥＫ２９３細胞を、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＤ２００ ｍＣｈｅｒｒｙ、又はＣＤ２００－レセプターＧＦＰでトランスフェクトした。細胞を図１０の通り処理して、分析した。赤色：緑色蛍光イベント（即ち、コンジュゲート）の数の有意な増加が、リガンド及びレセプターの両者を個別に発現する細胞が存在する場合のみで観察される。 高度に選択性の機能を有するＰＤ－Ｌ１突然変異体を同定するためのマイクロビーズ及び細胞間ＦＡＣＳアッセイの利用。Ａ）１００を超える組み合わせのＰＤ－Ｌ１ ｍＣｈｅｒｒｙ突然変異体構築物を、ＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。これらの細胞株を、その後、ＰＤ－１のＩｇ融合物を予め飽和させたマイクロビーズで（橙色のマイクロビーズデータ）、又は別の組の実験ではＰＤ－１ ＧＦＰを一過性に発現する細胞で（青色の細胞間データ）チャレンジした。各実験において、ＦＡＣＳ分析により決定された結合率％を、野生型結合に対して標準化した。データから、マイクロビーズ又は細胞間法のいずれかを利用して観察された平均結合率の直接比較が示される。明瞭にするために、データのサブセットのみを示している。ＰＤ－Ｌ１突然変異体を、ＰＤ－Ｌ１の他の公知リガンドであるＢ７－1によりチャレンジする類似の実験組も実施した（データは示さない）。Ｂ）ＰＤ－Ｌ１突然変異体のスクリーニングにより、ＰＤ－１、Ｂ７－１又はそれらの両方のいずれかへの結合欠損を示す複数の突然変異体を生成した。これらの結果をさらに検証するために、ＰＤ－Ｌ１突然変異体のうちの７つをＩｇ融合物として発現させた。精製されたＰＤ－Ｌ１突然変異体を、検出のためにアレクサ５９４二次Ａｂ（赤色）と共にプレインキュベートして、ＰＤ－１ ＧＦＰ又はＢ７－１ ＧＦＰ（緑色）のいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞に添加した。ＦＡＣＳデータにより、ＧＦＰの蛍光（Ｘ軸）とアレクサ５９４の蛍光（Ｙ軸）の対比が示される。精製されたタンパク質を利用して観察された結合の程度は、スクリーニング法の両方で観察された結合の程度を反映しているが、データは、細胞間結合法により得られた結果とより密接に相関するように見える。 図１３Ａ～１３Ｅは、細胞表面のタンパク質間相互の並行同定のための戦略を示す。Ａ）バーコード化されたライブラリを、バーコード化ライブラリベクター（ＢＣ－Ｌベクター。ユニバーサルＴ７フォワード及びリバースプライマー部位により挟まれたＧＦＰレポーター及び２８ヌクレオチドの独特なコアバーコード（unique core barcode）を作製する）へのＬＩＣクローニングにより作製する。ライブラリをプールして、一緒に浮遊培養適合ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。Ｂ）別の反応において、単一のクエリーレセプターを、ｍＣｈｅｒｒｙ及び細胞表面提示ＦＬＡＧエピトープも標識されたＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、磁気捕捉／分離を可能にする。Ｃ）プールされたライブラリをクエリー発現細胞と混合して（１：１）、コグネイトレセプターの間の生成的相互作用を可能にする。Ｄ）陽性相互作用（即ち、コンジュゲート）を、クエリーレセプター細胞の磁気捕捉（「選別」）により発現プールから回収する。Ｅ）プラスミドＤＮＡを抽出して、バーコードのＰＣＲ増幅をユニバーサルプライマーにより実施する。Ｆ）大規模並行次世代シークエンシングを利用して、各ＰＣＲ産物の配列を得る。独特なバーコードのシグネーチャは、クエリーレセプターとの複合体中のリガンドを特有なやり方で同定する。注目すべきこととして、このプロトコルは、多数のクエリータンパク質で先のステップを実施し、得られたコンジュゲートをマルチウェルプレート形式（例えば、２４ウェルプレート）で個別に捕捉して、ステップＥにおいてプライマーに「ウェル特異性」同定物質（独特な８ヌクレオチドバーコード）を付加することにより、多重化することができる。これらのアンプリコンは、その後、１つの次世代シークエンシング試料にプールされて、シークエンシング後にデコンボリュートされ、各反応のコストを削減することができる。 図１４Ａおよび１４Ｂ：磁気マイクロビーズを用いて、特異的な細胞間結合イベントを捕捉及び単離することができる。Ａ）ＰＤ－Ｌ１ ｍＣｈｅｒｒｙ融合物を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＧＦＰ又はＰＤ－１ ＧＦＰ融合物を一過性発現する細胞と、１：１比（総細胞数４×１０^６個）で混合した。ＰＤ－Ｌ１抗体で修飾されたプロテインＡコーティング磁気マイクロビーズ（ミルテニー）を添加して、試料を取り出した（総量；これは出発混合物の組成を表す）。混合物を磁気細胞分離カラムにアプライして、結合した細胞を洗浄し、溶出させた。「総量」の試料及び「結合」の試料を、ＦＡＣＳにより分析して、ＧＦＰ陽性細胞のパーセント率を決定した。ＰＤ－Ｌ１発現細胞が磁気ビーズにより捕捉され、ＧＦＰのみを発現する細胞よりもＰＤ－１ ＧＦＰ融合物を発現する細胞が有意に多く単離されており、コグネイトレセプター：リガンドコンジュゲートが明確かつ特異的な濃縮が実証された。Ｂ）ハイスループットスクリーニングにおいて遭遇するであろう「レア」イベントを単離する能力を実証するために、１０^６個のＰＤ－Ｌ１ ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を、ＰＤ－１ ＧＦＰ融合物又はＧＦＰのいずれかを発現する細胞０．１×１０^６個と、そして５×１０^６個の非トランスフェクト細胞（疑似ライブラリを模倣するため）と混合した。この実験では、ＧＦＰ陽性細胞は、総細胞数の約１．５％となる。２時間後に、抗ＰＤ－Ｌ１コーティングマイクロビーズを添加して、「総量」の試料を取り出して、結合画分をＡに記載された通り単離した。データから、磁気捕捉されたＰＤ－Ｌ１発現細胞による、ＰＤ－１ ＧＦＰ融合物発現細胞の有意な濃縮が示される。 模擬信号雑音比：ＦＡＣＳ選別と組み合わせた細胞間結合による、プールからの「レア」レセプターの濃縮。Ａ）発現ライブラリを模擬するために、ＧＦＰを一過性に発現する１０^７個のＨＥＫ２９３細胞を、ＰＤ－１ ＧＦＰ融合物を発現する細胞０．０２×１０^６個（ＧＦＰ陽性細胞の０．２％）と混合した。この「ライブラリ」を、その後、ｍＣｈｅｒｒｙ（陰性対照）又はＰＤ－Ｌ１ ｍＣｈｅｒｒｙ融合物を一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞１０^６個でチャレンジした。データは、３×１０^６個のイベント総数のフローサイトメトリー分析を示している。ゲートを、ＧＦＰ「ライブラリ」、ｍＣｈｅｒｒｙ又はＰＤ－Ｌ１ ｍＣｈｅｒｒｙ融合物のみでの１０，０００イベントの読み取りに基づいて設定した。Ｂ）ＰＤ－１ ＧＦＰ融合物の濃縮を検証するために用いられたプライマーの位置を示す略図。Ｃ）ＰＤ－Ｌ１ ｍＣｈｅｒｒｙチャレンジ（Ａの右パネル）のために、陽性結合イベント（Ｑ２）を選別して、１０，０００のイベントを回収した。比較のために、選別の前に１０，０００個の細胞も細胞混合物から回収した（選別前試料）。ＰＤ－１ ＧＦＰ融合物のＰＣＲ対照が、左のレーンである。選別前及び選別後のＰＣＲ産物の比較から、選別された陽性結合イベントでＰＤ－１ ＧＦＰが濃縮されたことが検証される。 細胞間ＦＡＣＳアッセイの多重化：分泌タンパク質の哺乳動物発現ライブラリを、特有にバーコード化された各発現構築物を用いて作製した（３'末端の下流にある発現プラスミド上の可変性の約２０塩基対配列）。これらの構築物は、ＧＦＰ蛍光タンパク質マーカで発現される。「チャレンジャー」である非コード化の分泌タンパク質発現構築物も、例えばｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質マーカを用いて作製される。ライブラリ構築物及び「チャレンジャー」構築物は、哺乳動物細胞内で別個に発現される。「ライブラリ」及び「チャレンジャー」の細胞集団を、一緒に混合する。その後、細胞間相互作用を、非相互作用細胞から選別する。選別を、蛍光により（即ち、全ての二重陽性イベント、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＦＰ）又は磁気ビーズを用いて磁気的に実施して、「チャレンジャー」細胞を任意の結合ライブラリパートナーにより捕捉することができる。細胞試料を、選別の前及び後に取り出し、溶解して、上清を発現プラスミドのＰＣＲ増幅に用いる。プールされたＰＣＲ試料を、ディープシークエンシングに進めて、存在する特定のバーコードのコピー数の定量的評価を得る。本発明者らの実験において、バックグランドを超える特定のバーコードの濃縮が、特異的なタンパク質間相互作用の指標となろう。本発明者らは、その後、特異的なバーコード配列を利用して、ライブラリから得られたタンパク質を同定することができた。 細胞間「レアイベント」のアッセイ：多重化アプローチにより、該当するタンパク質がライブラリ全体に比較して相対的にレアとなっていれば、ライブラリからその特異的結合相互作用を取り出すことができる。例えば、１００の遺伝子のライブラリを有し、それらを哺乳動物細胞内で別個に発現させて、それらの１００の発現集団を互いに等量で混合する場合、発現された任意の一遺伝子は、ライブラリ全体の１／１００を表すことになる。この実験から、該当する遺伝子、この場合ＰＤ－１が、ＧＦＰ陽性細胞の全集団の１／１００の場合でも、本明細書に記載された技術を利用すればＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を濃縮し得ることが実証される。ディープシークエンシングアプローチの初期テストとして、これまで特徴づけられたＰＤ－Ｌ１突然変異体の組み合わせを利用した。各ＰＤ－Ｌ１突然変異体配列は、本来、異なるため、理想は、「バーコード」として突然変異体配列を使用することであった。これらの突然変異体の幾つかは、ＰＤ－１への結合の減少を示し、多重化されたディープシークエンシングアプローチを利用してそれらの同じ突然変異体を同定することが可能であった。 ＰＤ－Ｌ１突然変異体：被験物質の例：示された配列は、マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子の一部についてである。強調されたアミノ酸は、独特な点突然変異の位置を示している。緑色は、突然変異を受けた場合にＰＤ－１への結合に影響がないことを示す残基である。赤色の残基は、突然変異を受けた場合に、ＰＤ－１への結合の大きな欠損を示す残基であり、黄色の残基は、ＰＤ－１への結合のより少量の欠損を示している。青色で強調されたＤＮＡ配列は、選別前及び後の両方で、プールされたＰＤ－Ｌ１ライブラリをＰＣＲ増幅するために用いられたプライマーの位置を示す。ＦＡＣＳのパネルは、ＰＤ－Ｌ１突然変異体ライブラリをチャレンジするためにＧＦＰを利用した陰性対照の模擬選別、及びその実験的ＰＤ－１チャレンジの選別を示している。実験では、２０，０００個の細胞を、選別の前（選別前）に、そして選別された集団Ｑ２から（選別後）回収し、上記の通り強調されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。下の右側のアガロースゲルの画像は、選別前及び選別後の試料から得られたＰＣＲ産物を示している。これらの試料は、その後、ディープシークエンシング分析に進めた。 ディープシークエンシングの結果を分析して、独特なＰＤ－Ｌ１配列それぞれが同定された回数を決定した（発生数の合計）。その後、選別前の試料と選別後の試料の間の発生において、濃縮比を計算した。例えば選別前の試料では１０の野生型ＰＤ－Ｌ１配列がカウントされ、選別後の試料では１００がカウントされた場合、野生型ＰＤ－Ｌ１の１０倍濃縮が観察された（１００÷１０）。特定のＰＤ－Ｌ１突然変異体、例えばＤ１２２Ａが、ＰＤ－１に結合していない場合、本発明者らは、それでも選別前試料の１０のＤ１２２Ａ配列をカウントし得たが、選別後の試料では５の配列のみをカウントし得た。これにより、０．５の濃縮比が得られる（５÷１０）。伝統的なＦＡＣＳ結合法を利用して得られたデータを比較するために（淡青色のバー）、データの全てを野生型ＰＤ－Ｌ１結合に対して標準化した。データから、これまで不十分なＰＤ－１バインダとして同定されたそれらの突然変異体が、多重化されたディープシークエンシングアプローチを利用することで同様に同定されることが明白に実証される。 Ｔ細胞リガンドの検出。本明細書に記載された細胞マイクロアレイプラットフォームを利用したレセプター結合を用いて、複数のＩｇＳＦレセプター／リガンド対を検査した。結合は、特異的である。 ＰＤ－Ｌ１突然変異体を選択的機能により同定するためのマイクロビーズプラットフォームの使用。 ガラススライドに、プラスミドＤＮＡコード、野生型ＰＤ－Ｌ１、ｍＣｈｅｒｒｙ単独、又は一連のＰＤ－Ｌ１突然変異体をプリントした。各プリントされた構築物の位置は、図では最も右側に示されている。ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｙ３）レーザからの蛍光シグナルから、各プリントされた構築物の発現レベルが示される。アレクサ６４７（Ｃｙ５）レーザは、ＰＤ－Ｌ１発現細胞に対するＰＤ－１（上パネル）又はＢ７－１（下パネル）のいずれかのＦｃ融合タンパク質の結合を示している。それゆえ、Ｃｙ５チャネル内で蛍光のないスポットは、結合を示さない。右へのグリッドは、マイクロビーズの結合実験を利用して観察された結合を示すために色分けされている。緑色の構築物は、野生型と同様の結合を示した。黄色の突然変異体は、結合低下を示し、赤色の突然変異体は、ほとんど又は全く結合を示さなかった。同一の結合パターンが、マイクロアレイで観察される。 細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した９６ウェルプレート形式への拡張。Ａ）１６の対照細胞試料を二本ずつ、３種の異なる総細胞濃度に設定して、９６ディープウェルブロックにおいて４℃で２時間インキュベートした。コグネイトリガンド：レセプター対を含み、それゆえ有意な結合を実証するはずである細胞間混合物を、緑色で強調している（表Ａの下側の２列）。インキュベーション後に、細胞のアリコットを９６ウェル丸底プレートに移し、ＢＤアキュリ（Accuri）サイトメータに連結されたインテリサイト（Intellicyt） ＨＴＦＣ連続フローシステムを利用して分析した。 細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した９６ウェルプレート形式への拡張。Ｂ）使用された代表的な９６ウェルプレートからのウェルファインダーの表示。各ピークは、１つのウェルから回収されたイベントを表す。識別子は、９６ウェルプレートの各列の最後を標識している。ピークのサイズが、ウェル内の細胞濃度を表していて、３つの異なる細胞濃度を明確に識別可能にしていることに留意されたい。 細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した９６ウェルプレート形式への拡張。Ｃ）９６ウェルプレート全体の単一細胞全てを、ＧＦＰ蛍光、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光、又はそれらの両方（二重陽性の「ヒット」（Double Positive "Hits"））についてゲーティングした。 細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した９６ウェルプレート形式への拡張。Ｄ）「二重陽性のヒット」を全ての単一細胞イベントのパーセント率として示したヒートマップ。 細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した９６ウェルプレート形式への拡張。Ｅ）グラフは、二重陽性（ヒット）を、テストされた細胞濃度それぞれでの１６の対照細胞試料の全てに関する単一細胞イベント全体のパーセント率として示している。細胞間結合のパーセント率が、総細胞濃度の低下に伴って低下するが、陰性対と陽性対の間の倍率差が、１×１０^６細胞／ｍＬの約６倍から０．２×１０^６細胞／ｍＬの約１０倍に改善していることに留意されたい。データは、２つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を示している。 Ｉｇスーパーファミリーの細胞マイクロアレイ発現メンバー。Ａ）ポリ－１－リシンコーティングガラススライドに、ＩｇＧスーパーファミリー内の１４４のヒト遺伝子に関する発現構築物をプリントした。各構築物は、一列に４つずつプリントして、合計で４×１４４スポットのアレイを得た。トランスフェクション後に、プリントされた各構築物の発現を、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を介して直接観察することができる（模擬着色された緑色。単一チャネルは示さない）。この細胞アレイを、続いてアレクサ６４７標識抗ヒトＩｇＧとプレインキュベートされた組換えＰＤ－Ｌ１ Ｆｃで処理して洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定した（模擬着色された赤色。単一チャネルは示さない）。データは、緑色と赤色がオーバーレイされた模擬着色画像を示しており、結合は緑色蛍光シグナルと赤色蛍光シグナルのマージングにより生じる黄／橙色として観察される。Ａ及びＢと標識された列は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１（Ａ）及びＢ７－１（Ｂ）の２つの既知の結合ターゲットを含む。Ｂ）ＰＤ－１及びＢ７－１に結合したＰＤ－Ｌ１に関して観察された陽性シグナルを、周囲のスポットで観察されたシグナルと比較して示した、Ａで強調された列の１０倍画像。

（ｉ）第一の所定の異種分泌タンパク質、異種膜タンパク質、又は異種細胞表面タンパク質、及び第一の蛍光タンパク質とを発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、（ｉｉ）第二の所定の異種分泌タンパク質又は第二の異種タンパク質、及び第二の蛍光タンパク質とを発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と、を含む細胞マイクロアレイであって、
該第一及び第二の複数の細胞が、マイクロアレイの固体表面に接着されていて、該第一と第二の複数の細胞が、固体表面の空間的に別個の位置に存在する、細胞マイクロアレイが提供される。

（ｉ）（ａ）第一の所定の異種タンパク質、及び（ｂ）第一の蛍光タンパク質、を発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、（ｉｉ）（ａ）第二の所定のタンパク質、及び（ｂ）第二の蛍光タンパク質、を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と、を含む細胞マイクロアレイであって、
該第一及び第二の複数の細胞が、マイクロアレイの固体表面に接着されていて、該第一と第二の複数の細胞が、固体表面の空間的に別個の位置に存在する、細胞マイクロアレイが提供される。

一実施形態において、第一又は第二の所定のタンパク質は、古典的に分泌されたタンパク質である。一実施形態において、第一又は第二の所定のタンパク質は、非古典的に分泌されたタンパク質である。非古典的分泌としては、明確な非古典的分泌経路を有するＦＧＦ２などのタンパク質、及び細胞溶解／細胞死により放出される細胞質タンパク質が挙げられる。

一実施形態において、該細胞マイクロアレイは、（ｉ）異種タンパク質の１つのための候補タンパク質若しくはペプチドリガンドと、（ｉｉ）異種タンパク質の１つに結合した第三の蛍光タンパク質と、を含む融合タンパク質をさらに含むか、又は異種タンパク質の１つのためのペプチド若しくはタンパク質リガンドを含む化合物をさらに含み、該化合物は、非ペプチド結合により結合された第三の蛍光タンパク質を有し、細胞マイクロアレイの異種タンパク質の１つに結合されている。

一実施形態において、該細胞マイクロアレイは、第三の複数の細胞を対照としてさら含み、該第三の複数の細胞は、第一の蛍光タンパク質を発現するように任意で形質転換されているが、第一又は第二の所定の異種タンパク質では形質転換されていない。

一実施形態において、複数の細胞はそれぞれ、複数の哺乳動物細胞である。

一実施形態において、該哺乳動物細胞は、単離されたヒト細胞である。

一実施形態において、該哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株の細胞である。

一実施形態において、該哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞株の細胞である。

一実施形態において、マイクロアレイは、少なくとも１０の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質は、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる。

一実施形態において、マイクロアレイは、少なくとも１００の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質は、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる。

一実施形態において、第一のタンパク質及び／又は蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質である。

一実施形態において、第三の蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質である。

一実施形態において、複数の細胞はそれぞれ、第一の所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されているに過ぎず、任意の他の異種タンパク質を発現するように形質転換されていない。

一実施形態において、第一の所定の異種タンパク質は、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、該複数の細胞は、マルチサブユニット異種タンパク質の１つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている。

一実施形態において、第一の所定の異種タンパク質は、発現される際に、Ｃ末端を介して第一の蛍光タンパク質に付着される。

一実施形態において、第一の所定の異種タンパク質は、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される。

一実施形態において、細胞マイクロアレイは、第一の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに第二の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、該貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置の固体表面で、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びにトランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させ、それにより各発現構築物によるそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部のトランスフェクションを可能にすること、により組み立てられる。

一実施形態において、該発現構築物は、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１発現構築物を含む。一実施形態において、該発現構築物は、ＣＭＶプロモータを含む。

一実施形態において、該細胞は、昆虫細胞である。一実施形態において、該細胞は、ショウジョウバエＳ２細胞である。

一実施形態において、該第一又は第二の所定の異種タンパク質は、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、ＴＮＦレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、１型膜貫通レセプタータンパク質、２型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である。

一実施形態において、本明細書に記載された第一又は第二の所定の異種タンパク質は、１）ヒトのセクレトーム全体（即ち、ＧＰＣＲＣをはじめとする、約８０００の分泌タンパク質及び内在性膜タンパク質）；２）ヒト／マウスの非古典的分泌タンパク質;３）細胞表面若しくは分泌タンパク質への結合を介して細胞外機能を示す細胞質タンパク質；又は４）病原性分泌タンパク質又は内在性膜タンパク質、である。

一実施形態において、第一又は第二の所定の異種タンパク質は、Ｔｏｌｌ様レセプター、ＴＮＦレセプター、ＧＰＣＲ、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである。

一実施形態において、第一又は第二の所定の異種タンパク質は、哺乳動物のものである。

一実施形態において、第一又は第二の所定の異種タンパク質は、形質膜に局在化した位置に発現される。一実施形態において、第一及び／又は第二の異種タンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、又は細胞表面タンパク質である。一実施形態において、細胞マイクロアレイは、異種タンパク質を発現するように形質転換された、１００、２００、３００、４００又は５００又はそれを超える異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、他の複数の形質転換細胞により発現された異種タンパク質と互いに異なる異種タンパク質を発現する。一実施形態において、細胞マイクロアレイは、異種タンパク質を発現するように形質転換された、７５０又はそれを超える異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、他の複数の形質転換細胞により発現された異種タンパク質と互いに異なる異種タンパク質を発現する。一実施形態において、細胞マイクロアレイは、異種タンパク質を発現するように形質転換された、１０００又はそれを超える異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、他の複数の形質転換細胞により発現された異種タンパク質と互いに異なる異種タンパク質を発現する。

一実施形態において、異種タンパク質は、分泌タンパク質であり、膜貫通へリックスに融合されて発現される。

一実施形態において、第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質は、同じタイプであり、第三の蛍光タンパク質は、異なるタイプのものである。

一実施形態において、複数の細胞はそれぞれ、多数の細胞のスポットに分別され、多数の細胞はそれぞれ、該複数の細胞の総数よりも少なく、各スポットは、別の複数の細胞のスポットに対してよりも同じ複数の細胞の別のスポットに対して接近するように配置される。

本明細書に記載された細胞マイクロアレイを作製する工程であって、第一の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに第二の異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、該貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置でマイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに細胞を固体表面に接着させるように、そしてそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部に各発現構築物によるトランスフェクションを起こさせるために、トランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させること、を含む、工程が提供される。

一実施形態において、該発現構築物は、異種タンパク質及び蛍光タンパク質を、単一の共有結合的に融合されたポリペプチドとして含む融合タンパク質の単一の転写物をコードすることができる。一実施形態において、該発現構築物は、異種タンパク質及び蛍光タンパク質を、２つの異なるポリペプチドとして（例えば、ＩＲＥＳ構築物）コードすることができる。一実施形態において、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）を用いて、発現構築物を調製する。一実施形態において、伝統的な制限部位クローニングが、利用される。

候補タンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第二のタンパク質を本明細書に記載された細胞マイクロアレイの異種タンパク質として発現させること、細胞マイクロアレイを第三の蛍光タンパク質又はペプチドに貼付された候補タンパク質又はペプチドと接触させること、候補タンパク質又はペプチドと接触された細胞マイクロアレイを洗浄して、非結合候補タンパク質又はペプチドを除去すること、及び洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定すること、を含み、第一の異種タンパク質で形質転換された細胞に対応する第一の空間的位置に洗浄後の細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質が存在すれば、候補タンパク質又はペプチドが第一の異種タンパク質に結合していることが示され、洗浄後の第一の空間的位置に細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在しなければ、候補タンパク質又はペプチドが異種タンパク質に結合していないことが示される、方法も提供される。

一実施形態において、洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかの決定が、第三の蛍光タンパク質の蛍光を測定すること、及び細胞マイクロアレイでの位置を決定すること、により実行され、第三の蛍光タンパク質と、第一又は第二の蛍光タンパク質が空間的に別個の位置に共存することにより、第一のタンパク質又はペプチドが、その空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合されていることが示される。

（ｉ）マイクロアレイの固体表面、及び細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを、及び第一のＣ－末端細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株と、（ｉｉ）少なくとも（ａ）所定の異種タンパク質を細胞表面で、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第二の複数の細胞、又は（ｂ）異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズと、を含むシステムであって、（ａ）又は（ｂ）が、マイクロアレイの固体表面に貼付されている、システムも提供される。先のものに必要な変更を加えたシステムであって、候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の複数の形質転換された細胞又は複数のマイクロビーズ上で発現され、異種タンパク質が形質転換された浮遊培養適合細胞株の細胞表面で発現される、システムも提供される。

マイクロアレイ上の細胞を、（１）蛍光標識されたプローブタンパク質；（２）蛍光マイクロビーズ上に提示されたプローブタンパク質；及び／又は（３）プローブ分子を表面で発現する細胞、でプローブすることができる。

一実施形態において、該システムは、（ｃ）細胞表面の異なる所定の異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された１つ以上のさらなる複数の細胞、又は（ｄ）異なる所定の異種タンパク質を表面に貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、１つ以上のさらなる複数のマイクロビーズ、をさらに含み、（ｃ）又は（ｄ）は、複数の（ａ）及び／又は（ｂ）とは空間的に別個の位置でマイクロアレイ固体表面に貼付される。

一実施形態において、該異種タンパク質は、プロテインＡ分子を介してマイクロビーズに貼付される。

一実施形態において、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株は、候補リガンドタンパク質又はペプチドをコードする核酸構築物で一過性にトランスフェクトされている。一実施形態において、異種タンパク質は、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付される。一実施形態において、第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質は、異なる色である。一実施形態において、一方の蛍光タンパク質は、緑色であり、他方の蛍光タンパク質は、赤色である。非限定的例としては、緑色蛍光タンパク質及びｍＣｈｅｒｒｙ（商標）が挙げられる。

一実施形態において、該複数の細胞は、複数の哺乳動物細胞である。一実施形態において、該哺乳動物細胞は、単離されたヒト細胞である。一実施形態において、該哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株の細胞である。一実施形態において、該哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞株の細胞である。

一実施形態において、所定の異種タンパク質は、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、該複数の細胞は、マルチサブユニット異種タンパク質の１つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞表面タンパク質である。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、発現される際に、Ｃ末端を介して蛍光タンパク質に付着される。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、分泌タンパク質であり、発現される際に、膜貫通アンカーペプチド又はタンパク質に付着される。一実施形態において、該発現構築物は、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１発現構築物及び／又はＣＭＶプロモータを含む。一実施形態において、該異種タンパク質は、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、ＴＮＦレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、１型膜貫通レセプタータンパク質、２型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である。一実施形態において、該異種タンパク質は、Ｔｏｌｌ様レセプター、ＴＮＦレセプター、ＧＰＣＲ、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである。一実施形態において、該異種タンパク質は、哺乳動物のものである。一実施形態において、該異種タンパク質は、細胞膜に局在化した位置で発現される。

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、本発明のシステムの浮遊培養適合細胞株の複数において候補リガンドタンパク質又はペプチド及び第一の蛍光タンパク質を発現させること、並びにその細胞株の複数を、（ａ）異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第二の複数の細胞、又は（ｂ）異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を表面に貼付させた複数のマイクロビーズ、と接触させること、並びに洗浄して非結合候補リガンドタンパク質又はペプチドを除去すること、並びにＦＡＣＳ分析により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定すること、を含み、空間的に別個の位置で細胞が第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、第一のタンパク質又はペプチドが空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合していることが示される、方法。

一実施形態において、第一及び第二の蛍光タンパク質の両者の共存は、ＦＡＣＳ分析により決定される。

血友病性相互作用の特定の実施形態において、候補リガンドタンパク質又はペプチドと、第二のタンパク質又はペプチドは、同じ配列を有する。

細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を含み、該独特な配列が１つ以上のユニバーサルプライマー（複数可）により鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する別の独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、（ｉ）細胞表面でレセプタータンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は（ｉｉ）表面にレセプタータンパク質を貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。

一実施形態において、該レセプタータンパク質は、古典的に認識されたレセプターであり得る。一実施形態において、該レセプタータンパク質は、古典的に認識されたレセプターではあり得ず、単にリガンドの受容タンパク質である。

細胞表面で第一の異種タンパク質を発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種タンパク質に対する独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を含み、該独特な配列が１つ以上のユニバーサルプライマー（複数可）により鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種タンパク質に対する別の独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、（ｉ）細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は（ｉｉ）表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。

一実施形態において、該ユニバーサルプライマーは、Ｔ７フォワード及びリバースユニバーサルプライマーを含む。

一実施形態において、該ペプチド細胞表面エピトープは、ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ｌ）である。一実施形態において、該システムは、磁気分子物質を含む抗ＦＬＡＧエピトープ抗体をさらに含み、該抗体は、ＦＬＡＧエピトープに結合されている。

一実施形態において、該磁気分子物質は、超常磁性鉄含浸ビーズである。一実施形態において、該独特な所定の２０～３５ヌクレオチド配列は、２８ヌクレオチド長である。

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の所定のタンパク質に結合するかどうかを決定する方法であって、第二の所定のタンパク質を本発明のシステムの異種タンパク質として発現させて、（ｉ）細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、１つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は（ｉｉ）表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズ、の候補リガンドタンパク質又はペプチドと接触させること；
該第二の複数の細胞の１つ以上に、又は該複数の磁気マイクロビーズに結合された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞のいずれかを、磁気引力により分離すること；
そのような分離された細胞間又は細胞－マイクロビーズコンジュゲートからＤＮＡを得て、存在するならばＤＮＡ中の独特な配列を、ユニバーサルプライマーを用いて増幅させること；
該独特な配列の複数のコピーをシークエンシングして独特な配列の存在を確認すること；
そのように同定された独特な配列（複数可）をデータベースに対して比較して、独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を特異的異種タンパク質又はペプチドに相関させ、それによりそのように相関された任意の異種タンパク質又はペプチド結合を同定し、それにより特異的異種タンパク質又はペプチドを候補タンパク質又はペプチドに結合しているとして同定すること、
を含む方法も提供される。

一実施形態において、該候補リガンドタンパク質又はペプチドは、プロテインＡ分子を介してマイクロビーズに貼付される。一実施形態において、該候補リガンドタンパク質又はペプチドは、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付される。一実施形態において、第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質は、異なる色である。一実施形態において、一方の蛍光タンパク質は、緑色であり、他方の蛍光タンパク質は、赤色である。そのような蛍光タンパク質の非限定的例は、上記に示されている。一実施形態において、該複数の細胞は、複数である。一実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株の細胞である。一実施形態において、該哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞株の細胞である。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、該複数の細胞は、マルチサブユニット異種タンパク質の１つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、発現される際に、Ｃ末端を介して蛍光タンパク質に付着される。一実施形態において、所定の異種分泌タンパク質は、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される。一実施形態において、該異種タンパク質は、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、ＴＮＦレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、１型膜貫通レセプタータンパク質、２型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である。一実施形態において、該異種タンパク質は、Ｔｏｌｌ様レセプター、ＴＮＦレセプター、ＧＰＣＲ、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである。一実施形態において、該異種タンパク質は、哺乳動物のものである。一実施形態において、該異種タンパク質は、細胞膜に局在化した位置で発現される。

（ｉ）（ａ）細胞表面で異種タンパク質を発現するように、そして（ｂ）第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換されている第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが発現された異種タンパク質に対する独特な所定の１５～３５ヌクレオチド配列を含むことで、該第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞が少なくとも２つの異なるタイプの第一の異種タンパク質を発現する、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、（ｉｉ）細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換されており、単一タイプの第二の異種タンパク質を発現する、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、を含むシステム。一実施形態において、第一の複数の細胞の任意の各細胞は、細胞表面で唯一の異種タンパク質を発現する。一実施形態において、第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質の異なるタイプのいずれも、第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質と同じ配列を有さない。

一実施形態において、該第二の異種タンパク質は、膜レセプターである。一実施形態において、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞において発現された該異種タンパク質のそれぞれは、分泌されたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である。一実施形態において、該複数の細胞の第一の異種タンパク質の異なるタイプは、所定の野生型タンパク質の各突然変異体である。一実施形態において、該第二の異種タンパク質は、野生型タンパク質である。一実施形態において、該第一の複数の異なるタンパク質の異種タンパク質の各タイプは、１、２、３、４又は５アミノ酸残基の点突然変異により該複数の細胞の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている。一実施形態において、該複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプは、１つのアミノ酸残基の点突然変異により複数の細胞の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている。

一実施形態において、該独特な配列は、１つ以上のユニバーサルプライマー（複数可）により鎖延長することが可能である。一実施形態において、該独特な配列は、１５～３５ヌクレオチドである。一実施形態において、該第一又は第二の蛍光タンパク質は、緑色である。一実施形態において、他の蛍光タンパク質は、赤色である。

候補リガンドタンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質を第二の異種タンパク質に結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本明細書に記載されたシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、第二のタンパク質又はペプチドを本明細書に記載されたシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させること、任意で洗浄して非結合の第一の異種タンパク質をいずれも除去すること、その後、第一及び第二の異種タンパク質が両者とも共存する細胞を回収すること、回収された細胞から核酸を得ること、核酸をシークエンシングして、それに含まれる独特な１５～３５ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合した独特な１５～３５ヌクレオチド配列に対応する候補リガンドタンパク質又はペプチドを同定すること、を含む、方法も提供される。

第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合に及ぼす、第一のタンパク質の所定のアミノ酸残基の影響を決定する方法であって、第一のタンパク質に対して１つ以上の点突然変異により変異されたタンパク質を、本明細書に記載されたシステムの第一の浮遊培養適合細胞株の複数の中の複数の異なるタイプの異種タンパク質として発現させること、及び該細胞株の複数を、該第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された本明細書に記載されたシステムの第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質の形態の該第二のタンパク質と接触させること、第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞を回収すること、回収された細胞から核酸を得ること、核酸をシークエンシングしてそれに含まれる独特な１５～３５ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合された第一のタンパク質を同定すること、並びに第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルを、所定の参照レベルと比較すること、を含み、
第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも多ければ、該タンパク質中で変異された１つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を増大させていることが示され、第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも少なければ、該タンパク質中で変異された１つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を阻害していることが示される、方法も提供される。

一実施形態において、該所定のレベルは、対照である。一実施形態において、該所定のレベルは、第二のタンパク質に結合する未変異の第一のタンパク質のレベルをアッセイすることにより得られる。該方法の一実施形態において、第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞は、ＦＡＣＳ分析により回収される。

（ｉ）細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、（ｉｉ）表面に標的タンパク質、ペプチド又は抗体を貼付させた複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムも提供される。

２つの候補リガンドタンパク質又はペプチドの１つ以上が標的タンパク質、ペプチド又は抗体に結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質及び第二の異種タンパク質を標的タンパク質、ペプチド又は抗体に結合させる条件下で、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明のシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明のシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させること、第一の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された、そして／又は第二の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された任意のマイクロビーズを回収すること、並びに該複合体中の候補リガンドタンパク質を同定すること、を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞又は第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、それぞれ第一の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないこと、及び第二の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、方法も提供される。

（ｉ）細胞表面で第一の異種標的タンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された１つ以上の第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、（ｉｉ）表面に、候補リガンドタンパク質若しくはペプチドのいずれかに対する抗体、又は標的タンパク質又はペプチドに対する抗体を貼付させた複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、候補リガンドタンパク質又はペプチドと標的タンパク質又はペプチドを結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本発明のシステムにおいて第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質として発現させ、そして標的タンパク質又はペプチドを本発明のシステムのシステムにおいて第一の異種タンパク質として発現させること、並びに第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方と複合体化された任意のマイクロビーズを回収すること、を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、方法も提供される。

該方法の一実施形態において、第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞は、磁気的に選別される。第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞が同定される際に、ビーズなどの磁気物質を第二の複数の細胞に付着させて、磁気分離を実行することができる。したがって本明細書に記載された方法及びシステムは、第二の複数の細胞のうちの細胞に付着された、磁気マイクロビーズなどの磁気物質を含んでいてもよく、第二の複数の細胞のうちの細胞に付着された、磁気マイクロビーズなどの磁気物質を付着させることを含んでいてもよい。

一実施形態において、該異種タンパク質又はペプチドは、タンパク質の供給源に関し、発現される細胞に対して異種である（例えば、別の細胞型又は別の種のもの）。一実施形態において、該異種タンパク質又はペプチドは、位置に関し、発現される細胞に対して異種であり、例えば該タンパク質は、正常な生理学的条件（例えば、インビボ）の下でその位置（例えば、細胞表面）では発現されない。

該方法の一実施形態において、ＰＣＲが、独特な１５～３５ヌクレオチド配列で実施される。一実施形態において、ディープシークエンシングが、プールされたＰＣＲ産物で実施されて、独特な１５～３５ヌクレオチド配列を同定する。該方法の一実施形態において、該方法は、独特な１５～３５ヌクレオチド配列が選別前（又は回収前）に対比して選別後（又は回収後）に濃縮されているかどうかを決定することを含む。

本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、２０～３５ヌクレオチドである。本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、２０～３０ヌクレオチドである。本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、２５～３０ヌクレオチドである。本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、２０ヌクレオチド長である。本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、２８ヌクレオチド長である。

本明細書に記載された方法の実施形態において、共存する細胞又は回収された細胞は、溶解され、シークエンシングが、その上清の内容物について実施される。

本明細書に記載された方法のさらなる実施形態において、該方法は、マルチウェルディッシュにおいて、各ウェルのアプリコンが残りのウェルのアプリコンと異なるように実施される。一実施形態において、マルチウェルディッシュの異なるウェルは、異なるレセプタータンパク質を含む。

他に断りがなければ、又は文脈により明確に矛盾していなければ、本明細書に記載された様々な要素の全ての組み合わせが、本発明の範囲内である。

本発明は、以下に示す実験的詳細からよりよく理解されよう。しかし、議論された具体的方法及び結果が本明細書の例示に過ぎず、以後に示される特許請求の範囲においてより完全に記載されることは、当業者に即座に認識されよう。

実験的詳細
レセプター：リガンド複合体の連続した構造的特徴づけの必要性。イムノグロブリン（Ｉｇ）のメンバー、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ、ＧＰＣＲ、ケモカイン及びレセプターキナーゼスーパーファミリーをはじめとする広範囲の生体分子が、セクレトームの系統的な構造的特徴づけの中心的な到達目標である。以下に、最適なＴ細胞機能の基本的シグナルを提供するイムノグロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のサブセットであるＣＤ２８レセプターファミリー（即ち、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ及びＰＤ－１）［４１～４３］を、記載する。これらのシグナル伝達レセプターは、構造的特色を共有し、関連の細胞表面リガンド（例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＰＤ－Ｌｌ及びＰＤ－Ｌ２)を類似の相互作用様式で認識する（図１）［４４、４５］。例えばＣＤ２８とＢ７－１及びＢ７－２のエンゲージメントは、Ｔ細胞の活性化を誘導し、ＣＴＬＡ－４による同じＢ７リガンドのエンゲージメントは、阻害性のシグナルをもたらす。誘導性共刺激レセプター（ＩＣＯＳ）は、ＩＣＯＳ－Ｌを結合させる際にさらなる重要な陽性シグナル（即ち、共刺激）をもたらし、ＰＤ－１と、２つのＢ７様リガンド、つまりＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２のいずれかとのエンゲージメントは、さらなる阻害性経路を始動させる（即ち、共抑制）。この実験室から得られた幾つかを含むこれらの分子及び複合体の構造は［２８、３５、４６－４８］、図１に要約した通り、根本的なメカニズム特性（例えば、オリゴマー状態、結合価、リガンド特異性など）、並びに共刺激及び共抑制シグナルに必要となる全体的組織的原理を定義する上で手助けとなった［４５］。

これらの構造は、基本的な生物生理学的及び組織的特色を定義すること以上に、新規な生化学的試薬及び特有のメカニズム情報のモデルシステムを生成するための基礎をもたらす。例えば、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ２複合体の本明細書に開示された構造により誘導されて［３５］、野生型の親和性により突然変異体ネズミＰＤ－Ｌ２に結合するがＰＤ－Ｌ１とは相互作用を示さない突然変異体ネズミＰＤ－１レセプターを作製した。これらの知見に基づいて、正常な生理作用及び疾患における２つのリガンド関連シグナル伝達経路のメカニズム上の役割を精査する前例のない機会を提供する得るＩｇ融合タンパク質及びノックインマウスモデルの作製を、本明細書に開示している（図２）。同じく、この複合体の構造に基づき、ヒトＰＤ－１レセプターの単一の点突然変異体を、それぞれヒトＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２に関して５０倍及び３０倍高い親和性により作製した（非公開のデータ）。この試薬は、特有の治療機会を提示し得る新規な高親和性の化学種となる（以下参照）。これらの例から、そのようなレセプター：リガンド構造の標準をはるかに超える値と、生物学的見識及び新しい治療機会のために活用され得る手法が強調される。

新しい重大なレセプター：リガンド相互作用は、なおも定義づけされている。非常に多くの研究が行われたレセプターのＣＤ２８ファミリーの中でもこの適用に特に関連するさらに重要な相互作用は、ごく最近になってようやく発見された。Ｂ７－１は、ＰＤ－Ｌ１に結合して、二方向性の阻害シグナルをもたらすことが実証されたが、ＩＣＯＳ－Ｌは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４の両方に結合し、ＣＤ２８：ＩＣＯＳ－Ｌ相互作用がヒトＴ細胞活性化に必須であることが実証された［４９、５０］。これらの交差的及び競合的相互作用により、シグナル伝達経路の非常に複雑なネットワークが得られる。単一の新しいレセプター：リガンド対の発見でさえも、Ｔ細胞機能、ヒトの生理学的作用及び疾患に関連するシグナル伝達経路のメカニズムの理解に著しい影響を及ぼし得るため、これらの例から、レセプター：リガンド相互作用の全レパートリーを系統的に定義する価値が強調される。

レセプター：リガンド複合体の治療的関連性。重要なこととして、多くの細胞表面分子及びそれらに関連する結合パートナーは、広範囲のヒト疾患を処置するためのシグナル伝達経路を意図的に調整するための実に優れたターゲットである。細胞表面の免疫レセプター及びリガンドをターゲットとする機能阻害抗体は、免疫反応を操作して感染疾患、自己免疫疾患、及び悪性腫瘍を処置するタンパク質治療薬の重要な分類である。最も主要な例としては、包括的な免疫刺激をもたらすＣＴＬＡ－４阻害性レセプターへの機能阻害ｍＡｂであり、２０１１年３月に末期メラノーマの処置のためにＦＤＡ認可を受けている、ヤーボイ（Yervoy）（商標）（ブリストル・マイヤー・スクイブ（Bristol Myers Squibb））が挙げられる［５１］。これらの免疫レセプターは、ターゲットであるだけでなく、それ自体が強力な治療薬である。例えばオレンシア（Orencia）（商標）（ＢＭＳ）として販売されるＣＴＬＡ－４の可溶性のタイプは、Ｂ７リガンドへの結合をめぐってＣＤ２８と競合し、ＣＤ２８関連刺激経路を阻害する。ＣＤ２８刺激の阻害は、包括的免疫抑制をもたらすため、オレンシアは、関節リウマチをはじめとする自己免疫疾患のための先進的処置となった［５２］。特に注目されるのは、２つの点突然変異を有するオレンシアの可溶性ＣＴＬＡ－４変異体であるベラタセプト（Belatacept）（商標）（ＢＭＳ）である。ベラタセプトは、急性腎移植片拒絶の予防用に２０１１年１１月にＦＤＡに認可されており、既存の処置と同等の効能を示し、突然変異の結果、副作用及び毒性を大幅に低減している。とりわけベラタセプトは、Ｂ７リガンドへの結合活性において２倍の上昇しか有さないが、その生物学的能力においては１０倍の増強を示す［２６、５３］。そのような知見から、新規な治療薬の開発を支援する分子的洞察を増進するために、一次共刺激分子及びそのコグネイト複合体の構造的及び生化学的分析を行うための継続的役割が支援される。これらの原理を、セクレトーム全体に概括することができる。

提案されたハイスループット技術の実現は、例えばヒトセクレトームに関連する相互作用において、使用のための強力な研究ツールをもたらし、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫疾患に関連する細胞外宿主：病原相互作用の範囲を定義し（例えば［５４］）、宿主：病原相互作用を同定する。加えて近年の証明から、多数の「表面上の」細胞質タンパク質もまた、細胞外機能を有することが示唆されている［５５～５９］。非古典的な分泌メカニズム（即ち、シグナル配列非依存性分泌）は、継続して記載されており、考慮すべき研究対象である［６０、６１］。注目すべきこととして、これらの非古典的分泌タンパク質の多くの細胞表面レセプターは、同定されていない。

哺乳動物セクレトームに関連する相互作用を定義することの大きな価値は、古くから認識されていて、小規模な生体工学団体、大規模な製薬団体及び学術的機関から少なからぬ注目を集めてきた。学術機関の検査室から始まった試みは、非常に小規模に実施されており［６２、６３］、最も卓越／発展した例には、表面プラズモン共鳴技術を利用して直接結合分析のために１０００を超えるＩｇ融合タンパク質のライブラリを作製する相当な量の供給源を開拓したジーンテック（Genetech）、ファイブ・プライム・セラピューティクス・インコーポレーション（Five Prime Therapeutics, Inc.）及びジェネンテック（Genentech）の貢献がある。これらの努力により、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーの新しいリガンドであるＢＴＬＡ及びＴＩＧＩＴが発見された［６４、６５］。個々のターゲット（例えば、ＴＩＧＩＴ）がライブラリの各メンバーに対して個別にスクリーニングされる必要があるという条件があるならば、このアプローチは、真のハイスループットな実現に求められる特色が欠けている。ジーンテックは、近年に、その中で約７００の分泌タンパク質が固体支持体上に個別に固定されたタンパク質アレイを記載しており、このアレイは、続いて、多価試薬を用いてスクリーニングされて、約９０のヒトＩｇ融合タンパク質を個別に表示する［６６］。このプラットフォームは、Ｂ７－１とＮＧＦＲとの予想外の相互作用をはじめとし、新しく意外なレセプター：リガンド相互作用の発見を裏づけた。

これらの「アレイによる」アプローチとは異なり、ファイブ・プライム・セラピューティクス・インコーポレーションは、より「総当たり的な」アプローチを採り入れて、分泌タンパク質の約３４００の構築物と、膜貫通タンパク質のエクトドメインを、２９３のＴ細胞内で個別に発現させた［６７］。これらのタンパク質を、広範囲の細胞株において、免疫及び心臓血管機能だけでなく癌の増殖に関連する代謝、転写及び増殖反応を調査する３０の別個のＨＴＰアッセイで検査した。これらの功績により、それまで特徴づけられていなかったタンパク質ＩＬ－３４が、（表面上は）はっきりとした特徴のあるコロニー刺激因子１レセプターのリガンドであるという実証が得られた。この研究は、分子（例えば、ＩＬ－３４）をデオーファナイズするための要件の最も重要な例であり、十分に特徴付けされた細胞表面分子でさえ、思いもよらぬ相互作用を有し得るという事実を明示している。

レセプター：リガンド相互を同定するためのこれらのハイスループットなアプローチは、新しい基本的な生体メカニズムを発見して新しい治療戦略を得るための潜在能力を含むことから、生物科学において最もエキサイティングな最新開発の一部である。しかし幾つかの理由から、これらの研究は、望まれるであろう広範囲の影響を実現しない可能性がある。第一に、これらのアッセイに求められる莫大な数の分泌タンパク質／Ｉｇ融合物を作製する能力が、プロテイン・ストラクチャー・イニシエーティブ（Protein Structure Initiative）により後援された機関など、最も意欲的な学術的検査室の能力さえも超えている。さらに、タンパク質を精製できない例、貯蔵及びその後の操作の間に不安定性を示す例、又は非好適な溶解挙動（例えば、一般にはＩｇ融合タンパク質を悩ます凝集）を示す例では、これらのアプローチの全てが実現不能である。ファイブ・プライム・セラピューティクスのスクリーニングの場合、選択された細胞系スクリーニングに含まれない生物学的機能を有するタンパク質（又はコグネイト結合タンパク質）は、相互作用を生じないことになる。特に注意すべきこととして、これらのアプローチの全てが、ＧＰＣＲ、トランスポーター及びチャネルをはじめとする内在性膜タンパク質の最も重要な分類の一部と適合性がなく、それはこれらのタンパク質が一般に、機能的に活性の材料のハイスループット精製と適合性がなく、アレイ作製の物理的工程に耐容できないためである。最後に、そしておそらく最も重要なこととして、これらの商業的業績から報告された結果は、一般大衆への販売に許容され得ると思われる相互作用のみを表すが、大多数の「非科学的」要因がこれらの決定に影響を及ぼしていて、これらの重要なデータの実質的割合が決してパブリックドメインにならないことは、ほぼ確実である。

高分解能構造の発見、生化学的分析及び創薬のために、例えば哺乳動物セクレトームを含む相互作用の入手可能な効率的ハイスループット同定のための３種の技術を、本明細書に開示している。開示された技術は、既存の方法を超える数多くの利点を示し、１）細胞マイクロアレイ形式での発現によりタンパク質の全分類（ＧＰＣＲ及びトランスポーターなどのマルチスパン型内在性膜タンパク質に加え、インテグリンなどの多成分レセプターなど）の系統的発現が可能であり；２）細胞マイクロアレイの発現は、ＤＮＡのみ（即ち、発現ベクター）を必要とし、精製タンパク質そのものを必要としないため、取り扱い性が高く；３）その技術は、全てが直接の物理的相互作用の検出に基づいており、そのため生物学的機能の任意の知識を必要とせず；４）フローサイトメトリーに基づく方法は、ベイトとプレイの両方を独立した識別可能な細胞の表面で発現させることができ、こうして精製タンパク質の全ての要件が排除され；５）分泌タンパク質発現細胞のディープシークエンシング及びバーコード化ライブラリと連結した磁気分離を実行することで、潜在的レセプターのパネル全体に対する多くの（全ての）リガンドの大量に並行したインターロゲーションが得られる。

細胞表面のタンパク質間相互作用のハイスループット同定のための細胞マイクロアレイの開発：細胞マイクロアレイ技術は、単一のクエリーリガンドに対する細胞表面レセプター（即ち、セクレトーム）のパンゲノムライブラリを系統的にスクリーニングするようになっている。このアプローチは、精密なアレイ形式で、生存する宿主細胞の環境下にあるレセプターを大多数に示す。潜在的なレセプター構築物のライブラリを効率的にスクリーニングするために、細胞マイクロアレイ技術［６８、６９］を適合させることに成功した。各発現構築物（例えば、ＣＭＶプロモータを介した発現を誘導するｐＥＧＦＰ－Ｎ１バックボーン及び他の蛍光変異体に基づくプラスミド）を、ガラス表面に個別に「固定」して、ライブラリ分子の発現アレイを作製する。哺乳動物細胞は、トランスフェクション試薬（例えば、脂質を基にした試薬）の存在下でプリントされたｃＤＮＡの上に播種されると、トランスフェクトされるようになり、個々のクラスターがライブラリの異なるメンバーを発現する生存細胞アレイが得られる（図３）。（プリントされたｃＤＮＡの間で成長する細胞は、トランスフェクトされず、「黒色」のままである。）これらの発現アレイは、その後、精製された蛍光タグのあるクエリータンパク質でチャレンジされる。洗浄して非結合リガンドを除去した後、陽性の相互作用を、蛍光の関数としてスコアする。各構築物は、マイクロアレイの既知の位置に「固定」されるため、陽性の「ヒット」を、直ちに相互作用パートナーに相関させることができる。

細胞マイクロアレイのプラットフォームを、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を利用して検証した（Ｋｄ約５．５μＭ）。ＰＤ－Ｌ１のＧＦＰ融合物又はＧＦＰのみのいずれかを発現する細胞の交互の列からなる生存する細胞マイクロアレイを、作製した（図４Ａ）。図に示す通り（図４の左端）、ＧＦＰ対照は、細胞質内で発現され（緑色の丸）、ＰＤ－Ｌ１に融合されたＧＦＰ（緑色の輪）は、膜に配置されている（細胞質ＧＦＰ構築物の発現レベルが高いため、ＰＤ－Ｌ１－ＧＦＰではより低い絶対ＧＦＰ蛍光が観察される）。これらのアレイを、ＰＤ－１エクトドメインの赤色アレクサ５９４結合二価Ｉｇ融合物（即ち、Ｆｃ融合物）でチャレンジすることにより、コグネイトＰＤ－Ｌ１リガンドを特異的に発現するスポットが、正しく同定された（図４Ｂ／Ｃ）。これらの実験から、レセプター：リガンド複合体の同定に関する細胞マイクロアレイ技術が、明確に実証される。図５に、異なるタンパク質相互作用（ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４：Ｂ７－１及びＣＤ２００Ｒ：ＣＤ２００）の範囲に関する細胞マイクロアレイ技術が示され、これらの結果から、細胞マイクロアレイのプラットフォームの広範囲での適用性がさらに確証され、このアプローチの信号雑音比及び特異性が強調される。

Ｉｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）に属するネクチン／ネクチン様ファミリーの１４のメンバーを、同様に検討した。これらのタンパク質の少なくとも１０種が、同種親和性相互作用を示し、ネクチンファミリーのメンバーの間には、少なくとも２０種の異種親和性相互作用が存在する［７０～７２］。ヒトＩｇＳＦの全体を含む約５００のエクトドメイン及び分泌タンパク質もまた、このシステムに供試した。これらの実験において、ＩｇＳＦの各メンバーの発現ベクターをプリントして、マイクロアレイを作製し（即ち、各スポットはＩｇＳＦの１つのメンバーを表す）、特異的なＩｇＳＦメンバーのＩｇ融合構築物でプローブする。ＩｇＳＦメンバーの大部分は、ＩｇＳＦの他のメンバーと結合するため、これにより、ＩｇＳＦ内で新しいレセプター：リガンド相互作用を定義するための絶好の機会が得られる。癌の生物学及び自己免疫疾患におけるそれらの顕著なメカニズム的及び治療的重要性に基づけば、ＩｇＳＦメンバーであるＢ７－Ｈ４［７３～８０］、ＶＩＳＴＡ［８１］、Ｂ７－Ｈ３［７４、７９、８２～８５］、ＬＡＧ－３［８６－９０］及びブチロフィリンファミリーの１０種のメンバー［９１～９４］のリガンドの同定も、保証される。広範囲のＢ７の他のメンバー、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）［９５］及び白血球レセプター複合体［９６］ファミリーをはじめとするＩｇＳＦの他のメンバーが、候補となるターゲットである。ＩｇＳＦを多く含む画分の発現試薬を、作製及び検証することに成功した（図６）。

ＴＮＦ及びＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーの全てが、このプラットフォームの一部になることができ、これらのタンパク質の全てが、重要なメカニズム及び治療のターゲットであり、ＩＩ型膜タンパク質（即ち、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー）である。その技術は、ＧＰＣＲ、Ｔｏｌｌ様レセプター、増殖因子レセプター、インターロイキン、インターロイキンレセプター、イオンチャネルなどをはじめとするセクレトーム全体に適用可能である。

クローニング：必要となるクローニングテンプレートの多数へのアクセスを、利用することができる。例えば、ＮＹＳＧＲＣは、オープンバイオシステムズ（OpenBiosystems）から得たヒト哺乳動物ゲノムコレクション（ＭＧＣ）ｃＤＮＡセットの全体を管理しており、これらのクローニングテンプレートは、自由に入手することができる。好ましい実施形態において、高効率のライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）［９７］が、発現ライブラリの作製に用いられ、該当する遺伝子が挿入された後、膜貫通アンカーが続き、そのＣ末端（Ｉ型膜タンパク質）で細胞質局在化ＧＦＰ発現レポーターに共有結合的に融合される（図４及び６）。近年になり、ＬＩＣクローニングを実行することで、大規模な構造的ゲノム（ｎｙｓｇｒｃオーガニゼーション（nysgrc.org））及び機能的ゲノム（エンザイムファンクション・オーガニゼーション（enzymefunction.org））のプログラムのために過去１８ヶ月にわたり１５，０００を超える配列検証された構築物の作製が支援された。その方法は、上記のライブラリを迅速に作製するために必要となるハイスループットな分子生物学のための自動化された液体処理ロボット、例えばバイオメックＦｘＰ（Biomek FxP）リキッドハンドラー及びパーキン・エルマーＥＰ３（Perkin-Elmer EP3）ロボットにより補助されている。必要となる発現ベクターの全てが、即座に作製される（図６）。

クエリータンパク質の高品質なＩｇ融合構築物の作製：ハイスループットな一過性トランスフェクション及びレンチウイルス誘導性プラットフォームが、分泌タンパク質、及び特にＩｇ融合タンパク質の作製のために樹立された。図１２に、近年作製された多数の突然変異体ＰＤ－Ｌ１ Ｉｇ融合構築物が示されている。このプラットフォームは、デイダラス（Daedelus）システム［９８］に基づいており、１週間あたり４８のレンチウイルスを作製する能力を有する。さらに無数の分泌タンパク質及びエクトドメインが、効果的に作製されて、メカニズムの研究［２１～２３］及び治療用途［２４～２７］に関して可溶性Ｉｇ融合タンパク質として用いられている。この卓越した文献により、非ネイティブドメインへの共有結合的融合が有害作用を有さず、広範囲の分泌タンパク質及びエクトドメインと適合性があることが実証される。

細胞マイクロアレイにおける機能的な形質膜局在化ＧＦＰ融合物の発現：天然の内在性膜タンパク質は、細胞マイクロアレイスクリーニングの環境下で、ネイティブの膜貫通要素を利用して内在性膜タンパク質のＩ型とＩＩ型を識別する問題を回避する。重要なこととして、Ｉｇのメンバー、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ［ｌ－３］、ＧＰＣＲ［４－６］、インテグリン［７］及びトランスポーター［８］スーパーファミリーをはじめとし、生物学的に関連する蛍光タンパク質融合物（例えば、ＧＦＰ融合物）の数多くの例が、報告されている。細胞マイクロアレイについては、分泌タンパク質が、続くプロービングのために細胞表面に固定される膜貫通へリックスを添加することにより、内在性膜タンパク質中に効果的に遺伝子操作することができる。選択的スプライシング及び／又はシェディング（即ち、タンパク質分解）により生物学的に重要な膜固定及び分泌形態を有する数多くのファミリー由来の数多くのタンパク質の存在を基にすれば［９～１９］、繋ぎ留めることは問題にならない。さらに、多数の分泌タンパク質（例えば，ＩＬ－２及びＧＭ－ＣＳＦ）を、シングルスパンの内在性膜タンパク質として意図的に操作して、新規な治療戦略（例えば、ワクチンの設計）を得た［２０］。

幾つかのレセプターは、コグネイトリガンド（例えば、Ｔ細胞レセプター、インテグリン）への結合活性を示すために、複数の成分を必要とする。適宜、これらのより複雑化したレセプターは、細胞マイクロアレイの１つの位置で複数の成分を同時発現させることにより、取り組まれている（図７）。

マイクロアレイの提示用に選択された細胞株：細胞マイクロアレイ技術は、ＨＥＫ２９３細胞により確固として樹立された。ＨＥＫ２９３細胞により内在的に発現される細胞表面タンパク質に結合するクエリータンパク質を識別する場合、全てのマイクロアレイ中に存在する非トランスフェクトの対照細胞（即ち、形質膜局在化タンパク質についてコードしている発現ベクターを受容していないそれらの細胞）への結合は、簡便な対照として働く。しかしほとんどの例では、強力なＣＭＶプロモータにより誘導された過剰発現のレベルを飽和させることが、細胞表面発現の低い内在レベルを圧倒するであろう。その上、適切な統計方法で、シグナル結合イベントを統計的に同定することができる。これらの統計解析を補助するために、全ての発現ベクターを、細胞マイクロアレイにおいて二重にプリントすることができる。重要なこととして、広範囲の代替的細胞株を、マイクロアレイにおいて「レスキュー宿主株」として利用することも可能である。例えばショウジョウバエＳ２細胞は、Sabatiniにより、マイクロアレイ形式でのゲノム規模の機能欠失型試験に用いられた［９９、１００］。

結合活性及びダイナミックレンジ：二価Ｉｇ融合物は、中等度の親和性（即ち、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１；Ｋｄ＝５．５μＭ）での相互作用の同定に効果的であった。ＰＤ－Ｌ１発現細胞をより高い結合価のＢ７－１修飾マイクロビーズでチャレンジすることで、フローサイトメトリーを基にした実験において、レセプター：リガンド結合の旺盛な動員（robust recruitment）及び特異的な同定が可能になる（図９）。この比較により、リガンドの結合活性上昇が実験的に測定可能な潜在的レセプター：リガンド相互作用のダイナミックレンジを拡大して、プリントされた細胞マイクロアレイへの結合を検出する能力が改善する、という見解が裏づけられる。親和性が低い場合、マイクロアレイを、例えばＩｇ融合タンパク質などで修飾された結合活性の高い多価マイクロビーズでプローブすることが、有用となる。

一過性にトランスフェクトされた細胞とのより高い結合活性：先に記載された実験は、生存する細胞アレイを精製されたクエリーリガンドでプローブして、最終的には実験の負担を押し分けてクエリータンパク質の生成及び標識に向かわせることを含む。容易さ、プラットフォームの有用性及びスループットを促すために、クエリータンパク質を細胞表面で発現する接着性の低い浮遊培養適合哺乳動物細胞株（即ち、ＨＥＫ２９３フリースタイル（Freestyle）（インビトロジェン（Invitrogen））［１０１］）を用いて、細胞質Ｃ末端ｍＣｈｅｒｒｙレポータータンパク質（又は他の適切な蛍光タンパク質）と融合された単一膜貫通へリックスにより固定することができる。ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）浮遊細胞は、その後、固定された緑色の「レセプター」細胞をアレイ上でチャレンジするために用いられる。ＧＦＰ（例えば、マイクロアレイに配置されたレセプター）及びｍＣｈｅｒｒｙ（例えば、浮遊するクエリーリガンド）の両方を含む共存細胞のスポットにより、正のスコアが得られる。細胞環境でクエリーリガンドを発現させれば、クエリーリガンドの精製及び標識の負担が取り除かれ、ＧＰＣＲなどのタンパク質に不可欠のネイティブ状態により近い環境にクエリータンパク質を維持するという追加の利点を有する。非特異的結合及びバックグランドに取り組むためには、以下のことに留意する。細胞マイクロアレイでの各「スポット」は、単層の非トランスフェクト細胞のうちの定義された遺伝子産物を過剰発現する細胞のクラスターを表している。観察されたバックグランドは、マイクロアレイの単層の非トランスフェクト細胞との非特異的相互作用から生じており、蛍光検出の前にマイクロアレイを激しく洗浄するという一般的な不可能を伴う。洗浄の困難に抵抗するために単層の接着を高めること、又は細胞を明確な境界により特別に画定されたエリアに空間的に制限して堆積させることが、これらの問題を緩和する可能性がある。マイクロアレイの環境でスポットされた細胞の局在的接着を改善するために、機能的な細胞表面常在性の単鎖アビジン（ｓｃＡｖｉｄｉｎ）を安定発現するＨＥＫ２９３細胞株を、非古典的分泌システムを利用して遺伝子操作して、ｓｃＡｖｉｄｉｎを形質膜外層内に誘導して固定することに成功した（データは示さない）［１０２］。この安定した細胞株は、非細胞透過性アレクサ５９４を標識したビオチンに特異的に結合し、この戦略は、より困難な洗浄ステップが望ましい場合に細胞をアレイ全体に固定するのに用いることができ、又はビオチンコンジュゲートの部位特異性プリンティングを介して細胞を画定されたエリアに特異的に繋ぎ留めるのに用いることができる。両者のシナリオは共に、バックグランドシグナルを低減することになる。

細胞マイクロアレイの統計解析：高度に有意な相互作用は、肉眼で即座に識別できるが（例えば、図４及び６）、統計的に有意なより弱い相互作用を同定するためには、好ましくは適切な統計基準を適合させる。

細胞表面のタンパク質間相互作用のハイスループット同定のための自動フローサイトメトリー技術。フローサイトメトリーを利用した特異的レセプター：リガンド相互作用を決定するための強力な代替法も、開示する。このプラットフォームにより、広範囲の結合活性を有する親和性プローブ（即ち、二価Ｉｇ融合物、高結合活性のマイクロビーズ及び非常に高い結合活性で一過性にトランスフェクトされた細胞）の容易な検査が可能になる。Ｉｇ融合タンパク質の使用は、先に記載された実験と概念が類似している。新しいレセプター：リガンド相互作用の発見へのマイクロビーズ及び一過性トランスフェクト細胞の有用性を、以下により完全に記載する。

マイクロビーズに基づくアプローチを、先に記載されたのと同じＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用により実証して、ＰＤ－Ｌ１：Ｂ７－１相互作用を含めることにより拡大する。図８は、マイクロビーズ実験の全体的戦略を示している。図９は、ＰＤ－１又はＢ７－１ Ｉｇ融合タンパク質のいずれかを負荷されたマイクロビーズと、形質膜に局在化するＰＤ－Ｌ１：ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞との高度に特異的な相互作用を示している。これらの実験から、複数のタンパク質（例えば、ＰＤ－１及びＢ７－１）がマイクロビーズの提示に向けて修正可能であり、予測され得る高い信号雑音比を実証することが示された（即ち、細胞質ＧＦＰのみを発現する細胞により検出される非常に低いバックグランド結合が存在する）。これらの原理証明実験により、レセプター：リガンド相互作用を定義するためのフローサイトメトリー分析と連結したマイクロビーズ提示の有用性及び能力が強調される。細胞－マイクロビーズアプローチに関して記載されたのと同じＰＤ－Ｌ１相互作用を利用して、細胞間フローサイトメトリーアプローチをさらに示す。マイクロビーズ提示は、Ｉｇ融合タンパク質に対して高い結合活性を与え、真核細胞の形質膜上でのクエリータンパク質の発現は、弱いレセプター：リガンド相互作用を検出するためのより大きなレセプター密度、有意に高い結合活性、及びダイナミックレンジの拡大を提供する。

以下のものを、浮遊培養適合ＨＥＫ２９３細胞において個別に発現させた：１）ｍＣｈｅｒｒｙ融合物としての全長ＰＤ－Ｌ１、２）ＧＦＰ融合物としての全長ＰＤ－１、３）細胞質ｍＣｈｅｒｒｙ、及び４）細胞質ＧＦＰ。個別及び混合集団のフローサイトメトリー分析から、ＰＤ－１を発現する細胞及びＰＤ－Ｌ１を発現する細胞が両者とも存在する場合のみで、特異的細胞間相互作用を提示するシグナルの有意な増加（約６０倍）が明確に実証された（図１０）。さらなる陰性対照として、ＰＤ－１もまたｍＣｈｅｒｒｙ融合物として発現させ、予測通りＰＤ－１は、それ自体では相互作用しなかった（データは示さない）。マイクロビーズ分析と同様に、細胞間アプローチは、一過性発現されたＨＥＫ２９３細胞からのＰＤ－Ｌ１－ｍＣｈｅｒｒｙとＢ７－１－ＧＦＰの相互作用も実証した（データは示さない）。このアプローチは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－１タンパク質ファミリーとは無関係のＣＤ２００とＣＤ２００－レセプター（ＣＤ２００Ｒ）の予測された相互作用も明確に解明したため（図１１）、概ね有用性があると思われる。

これらのフローサイトメトリーアプローチは、先に記載されたネクチンファミリー内の同種親和性及び異種親和性相互作用をはじめとし、他の公知Ｔ細胞共刺激レセプター：リガンド対に適用可能である（図５）。マイクロビーズと一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞は両者とも、公知の免疫レセプターを使用して、Ｉｇスーパーファミリー、ＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリー全体に及ぶ結合を探査する方法にチャレンジして、究極的にはこれらの実験をセクレトーム全体の探査に拡張するのに用いることができる。

生化学的機能の精査：多数の突然変異体分子をスクリーニングすることにより、マイクロビーズ－細胞及び細胞間相互作用を、複雑な生化学的機能の精査に用いることができる。これらの可能性は、ＰＤ－１及びＢ７－１に関して広範囲の親和性を示すＰＤ－Ｌ１点突然変異体と、ＰＤ－１又はＢ７－１のいずれかに専ら結合する特に重要なＰＤ－Ｌ１点突然変異体を作製することにより実証された。これらの研究は、多数の（即ち、＞１００の）ＰＤ－Ｌ１突然変異体－ｍＣｈｅｒｒｙ融合物で個別に一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株の作製を利用した。これらの細胞を、野生型ＰＤ－１ Ｉｇ融合タンパク質若しくは野生型Ｂ７－１ Ｉｇ融合タンパク質で修飾されたＧＦＰ負荷マイクロビーズ、又は形質膜に局在化された野生型ＰＤ－１－ＧＦＰ若しくはＢ７－１－ＧＦＰ融合物で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のいずれかに結合する能力について、フローサイトメトリーにより探査した。特に留意されることは、マイクロビーズアッセイにおいて結合がない複数の突然変異体が、細胞間形式の環境下で有意な結合を示す、という観察であった（例えば、Ｋ１２４Ａ及びＫ１２５Ａ）（図１２）。この差異は、細胞表面発現に関連する高い結合価／結合活性に直接寄与する可能性があり、一定範囲の結合活性を有するマルチプルプラットフォームの価値を際立たせている。これらの研究により、ＰＤ－１（Ｇ１１９Ａ、Ｇ１２０Ａ）又はＢ７－１（Ｄ１２２Ａ、Ｙ１２３Ａ）のいずれかに特異的に結合する突然変異体ＰＤ－Ｌ１ Ｉｇ融合タンパク質の作製が得られ（図１２）、ＰＤ－１及びＢ７－１の認識を担う、別個であるが重複したＰＤ－Ｌ１表面のマッピングを提供し（図示しない）、これらの特有の試薬により、哺乳動物の免疫性へのＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１：Ｂ７－１相互作用の異なる寄与を定義することができた。これらの結果により、マイクロビーズ－細胞及び細胞間相互作用プラットフォームの選択性、有用性及び相補性が強調される。さらに、これらのＰＤ－Ｌ１突然変異体相互作用でのＫｄの継続的定量測定（例えば、表面プラズモン共鳴）が、結合親和性に関連して、これらのマイクロビーズ－細胞及び細胞間のプラットフォームだけでなく、細胞マイクロアレイのプラットフォームの感受性を評価する際の支援となるであろう。

スループットの増大。上記の通り実施された研究は、ユーザーによる一定した注意が必要となる「ワンオフ」形式で、１分あたりおよそ１試料という高くないスループットを支援するＢＤ ＦａｃｓＡｒｉａ ＩＩＩを利用して実施された。これらの方法は、ハイスループットなスクリーニング利用、例えばインテリサイト（Intellicyt）ＴＭ ＨＴＦＣシステムを支援する、９６／３８４ウェルプレート形式などの他のシステムで実施することができる。インテリサイトＴＭは、ハンズフリー方式で９４ウェルプレートを３分間／３８４ウェルを１２分間のスループットで支援する。このフローサイトメトリーを基にした方法は、マルチウェルでのサイトメータ及び完全自動化組織培養ロボットを利用して実施される場合には、大規模レセプターデオーファニング実験に必要となるハイスループットを提供する。該方法で使用可能なシステムの他の例としては、パーキンエルマー（Perkin Elmer）のセル：：エクスプローラ（Cell::Explorer）、完全自動化された組織培養によるリキッドハンドラー、ジェイナスワークステーション（Janus workstation）、リコニック（Liconic）振とうインキュベータ、エンビジョン（Envision）プレートリーダーが挙げられ、それらの全てが、例えば滅菌性を確保するためにＢＳＬ－２バイオセイフティーフード内に含まれる六軸ロボットアームを介して利用可能である。細胞の成長、培地交換、トランスフェクションなどを含む、完全実施されている自動化組織培養の能力が、効率を補助する。マルチウェル形式のプラットフォームは、任意で、立証された相互作用対（ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１：Ｂ７－１、ＣＴＬＡ－４：Ｂ７、ＣＤ２００Ｒ：ＣＤ２００； 図４、６、１０、１１）に加え、ＰＤ－Ｌ１突然変異のパネル全体に対しても評価することができる（図１２）。これは、先に記載されたＩｇスーパーファミリーの全てのメンバー、及び究極的にはセクレトーム全体に拡張することができる。多くの検査室が、細胞間の相互作用がＦＡＣＳ分析により即座に検査され得ることを示してきたが（図１０及び１１）、これらの業績が全てロースループットな性質であり、本明細書に記載された利点を付与する専用のスクリーニングに容易に移行し得ないことに留意することが重要である。

細胞表面のタンパク質間相互作用の高多重化同定のための磁気捕捉技術及び次世代シークエンシングの適合：本明細書に記載された別のプラットフォームは、特異的レセプター：リガンド相互作用［１０３］及び大規模に並行する次世代シークエンシング（例えばイルミナ（Illumina）／４５４［１０４－１０６］）の結果、形成された細胞－マイクロビーズ（又は細胞間）コンジュゲートを迅速に濃縮して、得られたプールをデコンボリュートする（例えば、［１０７～１１０］）磁気捕捉技術を利用している。このプラットフォームは、「ユニバーサルプライマー」を用いて増幅され、ディープシークエンシングにより即座に同定され得る独特なヌクレオチドバーコード（実施例では２８ヌクレオチドであるが、他の範囲を利用してもよい）を含む発現ライブラリの各メンバーについてタグを付けた発現ベクターを活用している（図１３）［１０７～１１０］。バーコード化されたベクターのライブラリをプールして、浮遊培養適合ＨＥＫ２９３細胞にひとまとめにトランスフェクトすることができる。プールされた発現ライブラリをクエリータンパク質と混合して（マイクロビーズ又は細胞表面提示の環境下で）、コンジュゲートを形成し、それをマルチウェル磁気分離により回収する（例えば、３０分未満で２４の並行した分離を実施する）。クエリータンパク質は、プールされたライブラリ中に存在するが、磁気クエリータンパク質は（マイクロビーズ又は細胞表面提示の環境下で）、大過剰に存在し、そのためプールされたライブラリ成分からの競合が排除される。濃縮されたプールメンバーからのバーコードが増幅されて、次世代ディープシークエンシング（例えば、７５のヌクレオチドそれぞれの最大１０，０００，０００の読み取り）に供されて、捕捉工程により濃縮されたバーコードを同定する。これらの濃縮されたバーコードは、次のインビトロ生化学的アプローチによる検証（ＳＰＲ、ＩＴＣ、ＳＥＣ、ＦＡＣＳ）のために、潜在的なレセプター：リガンド相互作用を直接同定する。その方策により、単一クエリータンパク質の結合パートナーの迅速な同定が可能になるが、スループットを大幅に上昇させてコストを削減するように即座に多重化することができる。例えば組織培養の自動化を利用して、ＩｇＳＦの５００のメンバーのそれぞれを個別にクエリーとして使用し、各クエリーから捕捉されたコンジュゲートを、マルチウェルプレートの別個のウェルに回収することができる。各クエリータンパク質の候補となる相互作用物質をこのように物理的に分離することで、「複合体」プライマーを増幅ステップで使用することができる（即ち、各ウェルが独特なプライマーセットを受容し、そこでその２つの「ユニバーサルＴ７プライミング配列」が、さらなる８つの独特なウェル特異性ヌクレオチドに挟まれる）。複合体プライマーの使用により、特定のウェルに対応するクエリータンパク質との相互作用により濃縮されたそれらのライブラリメンバー（２８のヌクレオチドコアバーコード）の特異的同定が可能になる（さらなるウェル特異性ヌクレオチドバーコード、例えば８つのヌクレオチド）（図１３）。これらの複合体プライマーを用いた各ウェルの別個の増幅の後、アンプリコンをプールして、単一のディープシークエンシングを行ってデコンボリュートする。これにより、ＩｇＳＦの各メンバーに割り付けられた独特なヌクレオチドバーコードに基づき、ライブラリの相互作用メンバーが同定される。これらの相互作用物質は、各ウェルに特異的な特有の（例えば、８つのヌクレオチドの）バーコードにより特異的クエリータンパク質の結合パートナーとして同定される。

磁気捕捉／濃縮：細胞－マイクロビーズコンジュゲートの環境下では、細胞濃縮でミルテニー（Miltenyi）システムを使用することが、正攻法である［１０３］。細胞濃縮のために５０ｎｍ磁気ビーズを使用することが好ましいが、制約がある。図１４に、コグネイトレセプター：リガンド相互作用の結果、形成された特異的細胞間コンジュゲートを分離／濃縮するための磁気マイクロビーズの使用が実証されている。磁気分離により細胞間コンジュゲートのハイスループット捕捉に向けてこのアプローチを作製するために、膜貫通固定タグ（例えば、ＦＬＡＧ）を表面で安定発現する細胞株の中でクエリータンパク質を発現させて、抗ＦＬＡＧを負荷した磁気ビーズにより捕捉を可能にする。この方策は、マイクロビーズが結合した捕捉試薬（例えば抗ＦＬＡＧ）が特異的レセプター：リガンド複合体と干渉するのを防ぐ。そうすれば、これらの変数が選択の収率及びストリンジェンシーに影響を及ぼすため、ライブラリプール：クエリー細胞の反応速度範囲を検査して、用いられる磁気ビーズの量を変動させることが可能である。重要なこととして、磁気マイクロビーズの捕捉は、大規模な洗浄ステップを可能にし、バックグランドを低下させる。細胞間コンジュゲートの形成に関連する非常に高い多価相互作用の強度は、相対的に穏やかな磁気分離技術と完全に適合性がある。このアプローチは、「結合」及び「非結合」イベントを決定する蛍光シグナルの測定に依存せず、ゲーティング、レーザ設定などの混乱を取り除く。

信号雑音比：非特異的結合は、クエリー発現細胞株と「オフ・ターゲット」（即ち、コグネイトリガンドを発現しない細胞）の間に起こり得る。図１４Ｂは、「レアイベント」を特異的に濃縮する磁気捕捉技術の能力を実証している（即ち、全ての可能な相互作用のうちの１．５％）。図１５は、バーコードアプローチがより多くのレアイベントを検出し得るという証拠を示している。集団がコグネイトレセプター：リガンド対（例えば、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ）を発現する細胞の１：１混合物で構成された、典型的なバイナリー細胞間アッセイの場合、１０～３０％のイベントが、典型的には陽性結合相互作用としてスコアされる（図１０及び１１参照）。陰性対照（例えば、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）では、典型的には約０．２～０．５％のイベントが、結合としてスコアされる（ここでの「結合」は、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの両方が陽性となるイベントの数として定義される）（即ち、図１５Ａの四分区画の２番目）。

発現ライブラリの環境下でコグネイトの相互作用を同定することに関連してチャレンジを特異的に評価するために、ＧＦＰを一過性に発現する１０７個のＨＥＫ２９３細胞を、ＰＤ－１ ＧＦＰ融合物を発現する細胞０．０２×１０６個（ＧＦＰ陽性細胞の０．２％、全てが同じ効率でトランスフェクトされる場合には、ＩｇＳＦの１つのメンバーを表す）と混合することにより、バックグランドをシミュレートした。このライブラリを、１０６個のｍＣｈｅｒｒｙ（陰性対照）又はＰＤ－Ｌ１ ｍＣｈｅｒｒｙ融合物を一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞でチャレンジした。図１５は、特異的なＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用により、ＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙコンジュゲートの明確な濃縮が実証される（四分区画の２番目）。重要なこととして、ＰＤ－１発現細胞の濃縮のＰＣＲによる検証は、プールされたアンプリコンをデコンボリュートするように実行されるバーコード化戦略と完全に類似している（即ち、ＰＤ－１コード配列は、本来のバーコードとして働く）。重要なこととして、図１４及び１５で実現された濃縮レベルは、用いられた次世代ディープシークエンシングアプローチの検出限界に完全に含まれる［１１３］。

ヒトＩｇＳＦに属する５００の遺伝子は、２つの発現ベクターのそれぞれに組み込まれ得るため（即ち、５００のレセプター、５００のリガンド）、ＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１：Ｂ７－１相互作用を、図１３に記載された独特なバーコードアプローチで検査して、相互作用スクリーニングに供することができる。このシステムは、潜在的レセプターのパネル全体に対する多くのリガンドの同時クエリーを実行させて、大きなクエリーリストの同時の効率的かつ費用効果のあるインターロゲーションを可能にする。このアプローチは、セクレトーム全体に及ぶことができる。

本発明のさらなる態様、及びその検証を、図１６～２４に実証する。

参考資料

Claims (9)

1. D28Aアミノ酸置換を含み、
   (i)野生型のPD-L1と比較して、低下したPD-1に対する結合親和性を示し、かつ
   (ii)B7-1に対する少なくとも部分的な結合親和性を保持している、
   変異体PD-L1ポリペプチド。
2. 固体支持体に固定されている、請求項1に記載の変異体PD-L1ポリペプチド。
3. 固体支持体がマイクロビーズである、請求項2に記載の変異体PD-L1ポリペプチド。
4. 請求項1に記載の変異体PD-L1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸。
5. 蛍光ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項4に記載の組換え核酸。
6. 請求項4または5に記載の組換え核酸を含むインビトロ細胞。
7. (a)請求項1～3のいずれか一項に記載の変異体PD-L1ポリペプチド、および
   (b)融合パートナーポリペプチド
   を含む、融合ポリペプチド。
8. 融合パートナーポリペプチドが蛍光ポリペプチドである、請求項7に記載の融合ポリペプチド。
9. 融合パートナーポリペプチドがイムノグロブリンFcポリペプチドである、請求項7に記載の融合ポリペプチド。

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