CN102321656A - 谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，公开了一种融合蛋白表达载体。将谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)C端与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的N端相连，构建在真核生物表达载体pBK-CMV(Δ[1098-1300])上，得到谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体。通过这种载体，可用激光共聚焦电子显微镜和利用GFP抗体通过蛋白免疫印记技术(Western blot)检测SNAT2在哺乳动物细胞(如HEK293T细胞)膜上的表达、定位及定量的方法。

Description

谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，为融合蛋白载体构建和表达检测技术，公开了一种谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

融合蛋白载体构建技术是常用的重要的分子生物学方法之一。主要是通过基因工程的方法使两种不同蛋白基因融合构建于同一表达载体上，在特定活细胞内进行表达，获得新的融合蛋白的过程。

加强型绿色荧光蛋白(EGFP)常做为一种自发荧光的融合蛋白标签与目的蛋白融合表达，用于目的蛋白在活细胞内的定位，运动等研究。

丙氨酸、谷氨酰胺等小的脂肪族类中性氨基酸是人体重要的氮源来源，其中谷氨酰胺是中枢神经系统中最重要的氨基酸之一，其直接参与了神经元中谷氨酸-谷氨酰胺相互转变的过程，是刺激性神经递质-谷氨酸合成的底物(Hussinger.1990；Daikhin and Yudkoff.2000；Young andAjami.2001；Rothman.2003)。因此这些氨基酸的跨膜转运对物质代谢十分重要。谷氨酰胺等中性氨基酸的跨膜转运由谷氨酰胺转运蛋白(neutral amino acidtransporter，SNAT)负责，其功能紊乱可以引起神经退行性疾病，如老年痴呆症、帕金森综合症等。SNAT2是SNAT家族的第二个成员，以丙氨酸(alanine)为最佳转运底物，归于System A，它是家族中在哺乳动物中分布最为广泛的谷氨酰胺转运蛋白，甚至在心脏中也能检测出其mRNA，因此目前被人们研究的比较多(Yao，D.et al.2000；Sugawara et al.2000；Hatanaka et al.2000；Varoqui，H.etal.2000；Mackenzie and Erickson.2004)。SNAT2被预测含有11个跨膜区域，其N端在细胞内，C端在细胞外(Hyde，R.et al.2007)。SNAT2在跨膜转运一个中性氨基酸的同时协同转运1个Na+进入细胞，因此转运过程产生1个正电荷进入细胞而产生电流(Yao，D.et al.2000；Chaudhry FA.et al.2002)。SNAT2能介导阴离子渗漏电流；跨膜区域1(TMD1)的天冬酰胺N82和TMD8的苏氨酸T384与Na+的结合有关，其C端通过电压依赖性过程调节氨基酸的转运。(Zhou Zhang and ChristofGrewer.2007；Zhou Zhang.et al.2008；Zhou Zhang et al.2010)。由于SNAT2是一个内在膜蛋白，其分离纯化结晶过程既复杂又有难度，目前还没有关于SNAT2晶体结构解析的报道。

由于检测膜蛋白的有效抗体制备比较困难，现在越来越多的科学家将膜蛋白与一些tag或荧光蛋白如GFP等构建在一起作为融合蛋白共同表达，取得了很好的效果。2000年，Christine Saunders等在人多巴胺转运蛋白(hDAT)的N末端加上FLAG标签，用以检测多巴胺转运蛋白的表达；2005年，Zhan-Yun Guo等在人胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)的C末端加上HA标签，通过抗HA抗体来检测HA，间接地定性和定量人胆固醇酰基转移酶1的表达。Madlen Dorn等在人质子依赖的氨基酸转运蛋白1(PAT1)的N末端加上HA标签，用以检测质子依赖的氨基酸转运蛋白1的表达；2010年，Zhou Zhang等将大鼠谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)的N-端连接在pAcGFP上，获得了pAcGFP-SNAT2表达载体，用以检测谷氨酰胺转运蛋白2在细胞膜上的表达及定位。

绿色荧光蛋白(GFP)来源于维多利亚水母，是一种能够自发荧光大小为27kDa的多肽。它能够吸收紫外光或蓝光发射出绿光。GFP不依赖于外源的基底物质或除了氧气以外的辅助因子(Prasher et al.1992)。因此，自1992年被克隆以后，GFP在体内常常作为一种融合分子标签被用作在活细胞内定位蛋白质，追踪它们的运动及这些蛋白质定位于亚细胞器的动力学(Chalfie et al.1994；Prasher.1995)。因为野生型GFP在不同细胞内表达的效率较低，发色团突变后的加强型绿色荧光蛋白(EGFP)增加了荧光强度，并且优化的密码子适用于在酵母菌，植物，绿色水藻和哺乳动物体内表达(Chiu et al.1996；Haas et al.1996；Yang etal.1996；Cormack et al.1997；Fuhrmann et al.1999)。EGFP基因的第65个氨基酸发生了Ser-Thr的替代突变(S65T)，可以激发出最大值为488nm的激发光并并且发射出最大值为507nm的发射光(Cormack et al.1996)。另外，EGFP基因中190个沉默碱基的突变有利于哺乳动物系统中人类优化密码子的高表达水平(Yang etal.1996)

由于膜蛋白的有效抗体制备十分困难，目前针对SNAT2的抗体十分昂贵，并且效果并不理想。由于GFP单克隆抗体已经商业化，价格便宜效果可靠，同时利用EGFP在细胞膜上能够发光的特点，发明一种利用EGFP作为融合分子标签来追踪SNAT2在细胞膜上的表达与定位的有效方法是十分重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体(pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组体)。

本发明还提供上述载体的制备方法和应用。

具体地说是将谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)C端与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的N-端相连，构建在真核生物表达载体pBK-CMV(Δ[1098-1300])(简写为pBK-CMVΔ)上，用激光共聚焦电子显微镜(LSM)和利用GFP抗体通过蛋白免疫印记技术(Western blot)检测SNAT2在哺乳动物细胞(如HEK293T细胞)膜上的表达、定位及定量的方法。

这种谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体是检测大鼠谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)在真核细胞膜上的表达、定位和定量的有效方法，使之能应用于SNAT2的结构与功能的研究中。

本发明首次在真核细胞表达载体pBK-CMVΔ-SNAT2的C端加入了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)构成融合蛋白共同表达，通过激光共聚焦电子显微镜(LSM)和利用GFP抗体通过蛋白免疫印记(Western blot)技术可以检测SNAT2-EGFP在哺乳动物细胞膜上的表达与定位，并且能够根据Western blot条带的深浅对SNAT2的表达进行定量分析。本发明方法解决了检测大鼠SNAT2在细胞膜上表达、定位和定量的难题，为进一步研究SNAT2的N-端在SNAT2在细胞膜上的定位作用及系统的研究SNAT2的结构与功能提供了有效手段和工具。

这项技术主要是利用加强型绿色荧光蛋白(EGFP)与目的蛋白谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)融合构建的理想模式：载体pBK-CMVΔ-SNAT2的多克隆位点含有SNAT2的整个开放阅读框序列，载体pMD-19T-EGFP的多克隆位点含有EGFP的整个开放阅读框序列，使用聚合酶链式反应(PCR)的方法分别获取SNAT2与EGFP基因片段，并通过设计引物的方法在PCR获取EGFP基因时，在EGFP基因起始密码子前加了三个甘氨酸铰链，使SNAT2开放阅读框的最后一个密码子与EGFP起始密码子前的第一个甘氨酸密码子通过酶切位点相连接，此融合基因片段再与pBK-CMVΔ-SNAT2-myc特定酶切所得的载体大片段连接，最终获得重组载体pBK-CMV(Δ[1098-1300])-SNAT2-EGFP，并在人胚胎肾细胞(HEK293T/17)中表达用以检测SNAT2在哺乳动物细胞膜上的表达和定位。

本发明的目的是这样实现的：

将谷氨酰胺转运蛋白(SNAT2)的C-端与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的N-端连接在一起，构建在真核表达载体pBK-CMVΔ上，在人胚胎肾细胞(HEK293T/17，ATCC number CRL 11268)中瞬时表达，通过激光共聚焦显微镜和利用GFP抗体通过Western blot技术检测SNAT2在细胞膜上的表达与定位。

构建方法包括如下步骤：

(1)PCR扩增并纯化回收SNAT2和EGFP基因片段，SNAT2基因片段用XbaI酶和BlpI酶进行酶切，EGFP基因片段用BlpI酶和NotI酶进行酶切；

用XbaI酶和NotI酶酶切含有SNAT2基因片段的真核表达载体质粒pBK-CMVΔ-SNAT2-myc；并回收pBK-CMVΔ载体大片段；

(2)用T4DNA连接酶将酶切纯化的SNAT2基因片段、EGFP基因片段和pBK-CMVΔ载体大片段在15～18℃下恒温保持14～18小时进行连接；

(3)用连接产物转化感受态细胞，卡那霉素筛选，挑取重组体单菌落培养并鉴定。

步骤(3)中，鉴定方法为PCR扩增电泳检测、酶切鉴定和DNA测序鉴定。

步骤(1)中，以含有SNAT2基因片段和CMV启动子的原始真核表达载体质粒pBK-CMV(Δ[1098-1300])-SNAT2-myc为模板扩增获得SNAT2基因；PCR条件为：94℃，2min；94℃，30s，67.5℃，30s，72℃，90s，31个循环；72℃，20min；引物为SNAT2-P1：5’-GCTCTAGAgatccctcgacctcgag-3’，下划线部分表示XbaI酶切位点序列；

SNAT2-P2：5’-atgagtGCTAAGCcatgtccgcctgcagaggcatc-3’，下划线部分表示BlpI酶切位点序列。

以含有EGFP基因的载体质粒pMD-19T-EGFP为模板扩增获得EGFP基因；PCR条件为：94℃，2min；94℃，30s，66.1℃，30s，72℃，60s，33个循环；72℃，20min；

扩增和检测的引物为EGFP-P1：5’-catggGCTTAGCt

atggtg-3’，下划线部分表示BlpI酶切位点序列，方框中的序列是加入的三个甘氨酸铰链；

EGFP-P2：5’-aaggaaaaGCGGCCGCttacttgtacagctcgtc-3’下划线部分表示NotI酶切位点序列。

上述方法所制备得到的融合蛋白真核表达载体，是pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组质粒，含有CMV启动子，谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达，在SNAT2的最后一个氨基酸H和EGFP的第一个氨基酸M之间有3个Gly形成的铰链。

上述融合蛋白真核表达载体，可用于检测SNAT2的表达和定位。

本发明的要点是在真核细胞表达载体pBK-CMVΔ-SNAT2的C端加入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)构成融合蛋白共同表达，并通过激光共聚焦电子显微镜(LSM)和蛋白免疫印记(Western blot)技术检测SNAT2-EGFP的表达与定位的实施方法。

本发明证明了在真核细胞表达载体pBK-CMVΔ-SNAT2的C端加入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)后，可以通过激光共聚焦电子显微镜(LSM)清楚的观察到SNAT2-EGFP在细胞膜的表达和定位；利用GFP抗体通过蛋白免疫印记(Westernblot)技术可以检测到SNAT2-EGFP细胞膜上的表达并根据条带的深浅对SNAT2定量。这种结果在研究SNAT2的结构与功能研究中单纯用SNAT2的抗体检测是很难以做到的。

本发明提供了一个在真核细胞表达载体pBK-CMVΔ-SNAT2的C端加入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组真核表达载体pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP。

在本发明中，真核表达载体质粒pBK-CMVΔ、SNAT2和EGFP，它们的核苷酸序列和蛋白序列均是已知的，其基因库(NCBI GenBank)序列号分别是U37573.1，AF173682，CAP60684.1。原始载体质粒pBK-CMV(Δ[1098-1300])-SNAT2-myc，pMD-19T-EGFP质粒为本实验室所有，它们的核苷酸序列也已知。本领域的技术人员可以通过该基因序列中的数据信息进行检索得到pBK-CMVΔ，SNAT2，EGFP的信息。在本发明的具体实例中，获取SNAT2基因和EGFP基因的PCR引物分别合成于生物公司，本发明的具体实例中是合成于上海生工公司。可选择地、利用已有的含有SNAT2或EGFP基因的质粒中获取该目的基因。

在本发明中，表达载体除了上面特别提到SNAT2基因和EGFP基因外，还包括原核细胞复制子ColE1/复制子f1(-)/复制子SV40，多克隆位点MCS，用于蓝白斑筛选的表达启动子Lac启动子和LacZ基因，用于抗生素筛选的新霉素或卡那霉素抗性基因；真核细胞表达启动子CMV启动子/T7启动子、终止子SV40poly(A)，多克隆位点MCS，抗性筛选基因G418等。这些都是在原核细胞大肠杆菌DH5α和真核细胞HEK293T细胞中常用的基因表达原件。在本发明的具体实例中，用于把含有SNAT2和EGFP融合基因筛选出来和大量复制的载体原件包括用于大量复制融合基因的ColE1复制子，用于筛选的卡那霉素抗性基因；用于SNAT2和EGFP融合基因表达的载体原件包括CMV启动子，SV40 poly(A)终止子。

本发明提供的真核表达细胞，启动子，终止子和用于筛选目的融合基因的抗性基因种类不受限制，只要能够使SNAT2和EGFP融合基因在真核细胞内表达就可以。

本发明指的转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-，M-)。将对数期生长的细菌(受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的感受态细胞。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)。在本发明的具体实例中，导入的外源DNA分子是连接后的含有SNAT2-EGFP融合基因的载体质粒。使用的受体细胞是大肠杆菌DH5α感受态细胞，购买于TIANGEN公司。

本发明通过抗生素的选择性筛选出含有SNAT2-EGFP融合基因载体质粒的大肠杆菌DH5α单克隆。

本发明转染理解为将带有外源基因的重组载体转入到哺乳动物细胞中进行表达的过程。这意味着包括引入所有对熟练工作人员所公知信息的方法，例如物理转染法(显微注射，电穿孔和基因枪法)和化学转染法(DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法和人工脂质体法)。本发明的具体实例中采用的是脂质体瞬时转染法：人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内。采用脂质体瞬时转染的方法即外源DNA不整合到宿主染色体中但存在多个拷贝数，产生高水平的表达，持续几天时间。我们在超螺旋质粒DNA转染HEK293T细胞后24-72小时内进行检测融合蛋白SNAT2-EGFP的表达。在本发明的具体实例中，脂质体试剂lipofectamine^TM2000购买于Invitrogen公司。

本发明表达理解为将起始DNA或RNA的遗传信息转移至基因产物多肽或蛋白质中，即本发明中SNAT2-EGFP融合蛋白。

本发明通过在真核细胞表达载体pBK-CMVΔ-SNAT2的C端加入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)使SNAT2和EGFP融合表达以达到检测标签蛋白EGFP即可检测到SNAT2的目的。

本发明所述的在人胚胎肾细胞(HEK293T细胞)中表达的重组载体质粒为pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP。

本发明所述的重组载体质粒pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP瞬时转染的HEK293T细胞，在转染24小时时于荧光显微镜下观察，内质网及细胞膜上清晰可见绿色荧光的表达。

本发明所述的重组载体质粒pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP与原始质粒pBK-CMVΔ-SNAT2-myc相比，可以通过荧光显微镜肉眼可见EGFP发出的绿色荧光，可见荧光定位于内质网和细胞膜上，由此直接接地显示出SNAT2的表达和定位；运用蛋白免疫印记(Western blot)检测EGFP间接地检测出SNAT2。

本发明所述的方法也适用于包括谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)在内的其他膜蛋白的EGFP融合蛋白构建与表达检测。

本发明的创造性在于世界上首次通过融合蛋白载体构建技术使加强型绿色荧光蛋白(EGFP)加在了谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)的C端，并构建在真核表达载体pBK-CMV(Δ[1098-1300])上。

本发明目的生物体是SNAT2-EGFP融合表达的HEK293T细胞。

本发明目的基因是具有更多医药、生物能源、环境保护等特殊用途的外源基因。

本发明首次在真核表达载体pBK-CMV(Δ[1098-1300])-SNAT2的C端加入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，使得通过荧光显微镜肉眼可见EGFP发出的绿色荧光定位于内质网和细胞膜上，由此直接地显示出SNAT2的表达和定位；运用蛋白免疫印记(Western blot)检测EGFP的表达间接地检测出SNAT2的表达。具有创造性和实用性。本发明方法是检测细胞膜蛋白表达与定位的成功范例；是研究膜蛋白结构与功能的基础；本发明对未来的神经退行性疾病，如老年痴呆症、帕金森综合症等疾病研究，以及生物技术、医药技术的发展都具有重要意义。

本发明具有如下优点：

1、提供了检测谷氨酰胺转运蛋白(SNAT2)表达与定位的有效工具。

2、本发明方法适用于多种膜蛋白表达与定位的研究。

附图说明

图1为pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组质粒图，CMV启动子启动转录，谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达，在SNAT2的最后一个氨基酸(H)和EGFP的第一个氨基酸(M)之间有3个Gly形成的铰链。

图2为谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白表达载体pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP阳性克隆的菌液PCR鉴定图。1为DNA分子Marker DL10000；2是以EGFP-P1和EGFP-P2为上下游引物，菌液PCR产物；3是以SNAT-P1和SNAT-P2为上下游引物，菌液PCR产物；4是以SNAT2-P1和EGFP-P2为上下游引物，菌液PCR产物；5为DL5000DNA分子Marker。

图3为谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白表达载体pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP的酶切鉴定电泳图。图中：1为DNA分子Marker DL10000；2为pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP的XbaI/BlpI/NotI-HF三酶切产物；3为pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP的XbaI/BlpI双酶切产物；4为pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP的BlpI/NotI-HF双酶切产物；5为pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP的XbaI/NotI-HF双酶切产物；6为pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组质粒。

图4为用激光共聚焦显微镜(LSM)观察分别转染pBK-CMVΔ-SNAT2和pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP的HEK293T细胞。A为转染pBK-CMVΔ-SNAT2-myc的HEK293T细胞，无荧光显示；B为转染pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP的HEK293T细胞，可见有绿色荧光显示。

图5为对HEK293T细胞转染pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP的蛋白印记杂交(Western Blot)检测图。1为对照(pBK-CMVΔ-SNAT2-myc转染的HEK293T)总蛋白；2为对照(pBK-CMVΔ-SNAT2-myc转染的HEK293T)膜蛋白；3为pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组体总蛋白；4为pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组体膜蛋白。

具体实施方式

实施例1

含有SNAT2基因原始真核表达载体质粒和含有EGFP基因载体质粒的大量获取：

含有大鼠谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)基因原始真核表达载体质粒为pBK-CMV(Δ[1098-1300])-SNAT2-myc，含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因载体质粒为pMD-19T-EGFP。

分别向100μl DH5α感受态细胞(TIANGEN公司)中加入1ng pBK-CMV(Δ[1098-1300])-SNAT2或pMD-19T-EGFP质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30min。将离心管至于42度冰浴中放置60-90s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。向每个离心管中加入900μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后至于37度摇床振荡培养45min(150转/分钟)，混匀内容物，轻轻涂板含有卡那霉素(30mg/ml)的固体LB琼脂平板，倒置平板，37度恒温培养箱培养12-16小时。挑取单克隆菌落，在含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃摇菌12-16小时至浑浊。送于上海杰李测序公司测序。

测序鉴定正确后，参照分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著)SDS碱裂解法大量制备质粒DNA的方法制备pBK-CMVΔ-SNAT2，pMD-19T-EGFP，用于下一步SNAT2基因和EGFP基因的扩增和载体大片段的获取。

将3ml pBK-CMVΔ-SNAT2-myc或pMD-19T-EGFP菌液以1∶50体积的比例接种到含卡那霉素的150ml液体培养基中，37度振荡培养过夜至对数生长晚期。将菌液倒入合适的离心管中，4000rpm离心5分钟，弃上清，并在吸水纸上倒置离心管使上清全部流尽。将细菌沉淀重悬于10ml溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-Cl，PH8.0，10mM EDTA，PH8.0)中，Vortex；加2mL新配置的溶菌酶(10mg/ml)，使终浓度为2mg/ml；加15ml的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，颠倒几下；加12ml用冰遇冷的溶液III(3M乙酸钾，5M冰乙酸)，轻微振荡混匀，4度12000g离心15min；弃沉淀，转移上清，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置5min，25度12000g离心15min，弃上清，沉淀溶解于5mlTE中，加入50ul的RNnase，颠倒混匀，37度静置10min；加入1/2体积的Tris饱和酚，1/2体积的氯仿-异戊醇(24∶1)混合液，Vortex剧烈震荡混匀，4度离心，12000g离心30秒，将上层转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿，再12000g离心5min，小心吸取上层液体；加入等体积的13％PEG8000-1.6mol/lNacl混合液，颠倒混匀，冰上静置0.5-2小时；4度12000g离心15min，弃上清，DNA沉淀用70％乙醇洗涤，4度离心10分钟，空气中晾10-15min，将沉淀或液体溶解于适量无菌去离子水中，用于SNAT2基因和EGFP基因的扩增。

实施例2SNAT2基因和EGFP基因的扩增：

以实施例1获取的质粒pBK-CMVΔ-SNAT2-myc为模板，进行聚合酶链式反应扩增SNAT2基因。反应条件：94℃，2min，一个循环；94℃变性30s，67.5℃退火30s，72℃延伸90s，共31个循环；72℃延伸，20min；反应产物纯化回收，用于测序鉴定和下一步融合蛋白SNAT2-EGFP载体的构建。

以实施例1获取的质粒pMD-19T-EGFP为模板，进行聚合酶链式反应，扩增EGFP基因；反应条件：94℃，2min，一个循环；94℃，变性30s，66.1℃退火30s，72℃延伸60s，共33个循环；72℃延伸20min。反应产物纯化回收，用于测序鉴定和下一步融合蛋白SNAT2-EGFP载体的构建；

用于PCR扩增、测序鉴定的特异性引物：

SNAT2基因的特异性引物为：

SNAT2-P1：5’-GCTCTAGAgatccctcgacctcgag-3’，下划线部分表示XbaI酶切位点序列；

SNAT2-P2：5’-atgagtGCTAAGCcatgtccgcctgcagaggcatc-3’，下划线部分表示BlpI酶切位点序列；

EGFP基因的特异性引物为：

EGFP-P1：5’-catggGCTTAGCt

atggtg-3’，下划线部分表示BlpI酶切位点序列，方框中的序列是加入的三个甘氨酸铰链；

EGFP-P2：5’-aaggaaaaGCGGCCGCttacttgtacagctcgtc-3’，下划线部分表示NotI酶切位点序列。

实施例3pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组体的构建：

(1)pBK-CMVΔ-SNAT2载体质粒，SNAT2和EGFP基因片段的酶切回收：

取实施例1中获取的5.8μg pBK-CMVΔ-SNAT2-myc载体质粒，进行XbaI和NotI双酶切反应，37℃温育4小时，回收pBK-CMVΔ大片段；

取实施例2中获取的6.6ug PCR扩增并纯化回收的SNAT2基因片段，进行XbaI和BlpI双酶切反应，37℃温育6小时后回收SNAT2基因片段；

取3.35ugPCR扩增并纯化回收的EGFP基因片段，进行BlpI和NotI双酶切反应，37℃温育10小时后回收EGFP片段；

(2)用T4DNA连接酶连接SNAT2、EGFP与pBK-CMVΔ-SNAT2载体大片段：

将酶切纯化好的SNAT2，EGFP与pBK-CMVΔ载体大片段按照摩尔比为3∶3∶1进行连接，连接条件为16℃恒温15个小时。SNAT2通过BlpI酶切位点用T4DNA连接酶与EGFP相连；SNAT2和EGFP融合基因通过两端的XbaI和NotI用T4DNA连接酶与pBK-CMVΔ-SNAT2载体大片段相连接。

所得到的载体pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组质粒如图1所示，CMV启动子启动转录，谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达，在SNAT2的最后一个氨基酸(H)和EGFP的第一个氨基酸(M)之间有3个Gly形成的铰链。

(3)将连接产物转化入DH5α感受态细胞：

将10ul连接产物转化入100ul DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2-3min，再加入已预热的LB培养基890ul，放入37℃摇床150转，复苏45min。将离心管内已经转化好的感受态液体涂布具有卡那霉素(30mg/ml)抗性的LB平板后置于37℃恒温培养箱中培养12-16小时，长出菌落即可。

实施例4pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组体的鉴定：

挑取转化平板上的大肠杆菌单克隆菌斑，加入卡那霉素(30mg/ml)抗性的LB培养基中37℃摇菌12-16小时。

1、菌液PCR进行初步鉴定：

10ul反应体系中重组体菌液1ul，TaqMix 5ul，SNAT2-P1和SNAT2-P2各0.4ul，H2O 3.2ul扩增SNAT2基因。同样的体系，替换引物为EGFP-P1和EGFP-P2扩增EGFP基因，替换引物为SNAT2-P1和EGFP-P2扩增SNAT2-GFP融合基因。扩增产物在1％琼脂糖凝胶(0.5μg/ml溴化乙啶)中电泳检测。

结果如图2，以EGFP-P1和EGFP-P2为上下游引物，重组体菌液PCR反应后，得到一条长度为750bp左右的片段(泳道1)，与EGFP基因长度符合；以SNAT2-P1和SNAT2-P2为上下游引物，扩增得到长度为1870bp左右的片段(泳道2)，与SNAT2基因片段符合；以SNAT2-P1和EGFP-P2为上下游引物，扩增得到长度为2600左右的片段(泳道3)，与SNAT2-EGFP长度符合。这个结果表明SNAT2、EGFP片段已经连接到了pBK-CMVΔ载体上。

2、酶切鉴定pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组体：

分别进行XbaI和BlpI双酶切，BlpI和NotI-HF双酶切，XbaI和NotI-HF双酶切，XbaI，BlpI和NotI-HF三酶切，酶切产物在1％琼脂糖凝胶(0.5μg/ml溴化乙啶)中电泳检测。

结果如图3，(1)XbaI，BlpI和NotI-HF同时酶切重组质粒，得到三个片段，长度分别与载体大片段(4358bp)，SNAT2(1875bp)，EGFP(758bp)相符合(泳道2)；(2)用XbaI和BlpI同时酶切重组质粒，得到1850bp左右的小片段，与SNAT2基因长度符合(泳道3)；(3)用BlpI和NotI-HF同时酶切重组质粒，得到750bp左右的小片段，与EGFP基因长度符合(泳道4)；(4)用XbaI和NotI-HF同时酶切重组质粒，得到2600bp左右的片段，与SNAT2和EGFP的长度总和相符合(泳道5)。泳道6显示了酶切前的重组质粒pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP。

初步鉴定正确的重组体进行DNA测序鉴定。

实施例5pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组体表达的鉴定

1、用激光共聚焦显微镜检测pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组体的表达：

取鉴定为阳性的pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP质粒以脂质体转染的方法瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T/17)。转染前12小时常规培养HEK293T细胞(DMEM+10％FBS，37℃，5％CO2)。转染时细胞密度以80％-90％为宜，质粒DNA与脂质体Lipo2000的比例为1μl∶3μl，转染24小时后，利用激光共聚焦显微镜(LSM)于400倍油镜下观察荧光并拍照。如图4，在细胞内质网中和细胞膜上清楚可见绿色荧光，即SNAT2-EGFP的表达；转染pBK-CMVΔ-SNAT2-myc的HEK293T细胞，无荧光显示。

2、用蛋白免疫印记方法(Western blot)检测pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组体的表达：

参照Luba Aleksandrov等(JBC，2001，276(16)：12918-12923)的方法提取HEK293T细胞的总蛋白和膜蛋白并进行Western blot检测。

(a)细胞总蛋白与膜蛋白的制备

收集用pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP质粒DNA转染36小时的HEK293T细胞，pBK-CMVΔ-SNAT2转染的HEK293T细胞作为对照；用PBS(0.1mM CaCl₂，1mMMgCl₂)室温润洗2-3次；加入1ml含蛋白质抑制剂(Rocheg公司)的PBS(BestBio公司)，用细胞刮(Corning公司)将细胞刮下移入1.5ml EP管中；放入-20度冰箱30min，拿出放入37度水浴至融化，涡旋几下，如此反复冻融3次；再4度1000g离心15分钟，取上清，再离心10分钟，取上清，即为总蛋白。总蛋白4度35000rpm离心30min，弃上清，用重悬液(40mM TrisCl，pH7.6，5mM MgCl²，0.4mMEGTA)重悬沉淀即为膜蛋白。使用Pierce BCAProteinAssay Kit(Thermo，USA)分别测定总蛋白和膜蛋白的浓度，操作步骤按产品说明书。

(b)SDS-PAGE电泳和Western印记

分别取10μg的总蛋白和膜蛋白液加上SDS-PAGE上样缓冲液(北京康为世纪生物科技有限公司)于10％的分离胶和5％的浓缩胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF膜(Millipore，USA)，电压10V转移过夜。将转移好的PVDF膜放入含5％牛奶的TBST溶液(0.01M Tris·HCl，pH7.5，0.15M NaCl，0.05％Tween20)中封闭60min，接着用兔源抗GFP标签多克隆抗体(上海中科蛋白抗体制备公司)以1∶6500的比例与膜孵育60min，用TBST润洗3次；再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(H+L)抗体以1∶5500的比例与膜孵育60min，用TBST润洗3次；最后HRP(Millipore，USA)作用1min，曝光显影定影，结果见图5。

结果表明，在泳道3和4，分别是pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP质粒DNA转染的HEK293T细胞所提取的总蛋白和膜蛋白样品，分子量80KD左右处杂交出了一条带，与融合蛋白SNAT2-EGFP的分子量81KD相符。因此，通过Western blot杂交EGFP，可以间接的对SNAT2进行定量。

对于蛋白质的定量和SDS-PAGE凝胶电泳以及western blot实验中的转膜、封闭、杂交、洗膜、显影等操作技术均为本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambrook等，Molecular Cloning.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press.1998)或按照试剂盒制造商说明书(Bio-Rad Bradford kit和GE Healthcare)操作。

上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)PCR扩增并纯化回收谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)基因片段和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因片段，SNAT2基因片段用XbaI酶和BlpI酶进行酶切，EGFP基因片段用BlpI酶和NotI酶进行酶切；

用XbaI酶和NotI酶酶切含有SNAT2基因片段的真核表达载体质粒pBK-CMVΔ-SNAT2-myc；并回收pBK-CMVΔ载体大片段；

(2)用T4DNA连接酶将酶切纯化的SNAT2基因片段、EGFP基因片段和pBK-CMVΔ载体大片段在15～18℃下恒温保持14～18小时进行连接；

(3)用连接产物转化感受态细胞，卡那霉素筛选，挑取重组体单菌落培养并鉴定。

2.权利要求1所述谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，鉴定方法为PCR扩增电泳检测、酶切鉴定和DNA测序鉴定。

3.权利要求1所述谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，以含有SNAT2基因片段和CMV启动子的原始真核表达载体质粒pBK-CMV(Δ[1098-1300])-SNAT2-myc为模板扩增获得SNAT2基因；PCR条件为：94℃，2min；94℃，30s，67.5℃，30s，72℃，90s，31个循环；72℃，20min；

引物为SNAT2-P 1：5’-gctctagagatccctcgacctcgag-3’，

SNAT2-P2：5’-atgagtgctaagccatgtccgcctgcagaggcatc-3’。

4.权利要求1所述谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，以含有EGFP基因的载体质粒pMD-19T-EGFP为模板扩增获得EGFP基因；PCR条件为：94℃，2min；94℃，30s，66.1℃，30s，72℃，60s，33个循环；72℃，20min；

引物为EGFP-P1：5’-catgggcttagctggaggaggaatggtg-3’，

EGFP-P2：5’-aaggaaaagcggccgcttacttgtacagctcgtc-3’。

5.谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于，通过权利要求1～4任一项所述方法制备，是pBK-CMVΔ-SNAT2-EGFP重组质粒，含有CMV启动子，谷氨酰胺转运蛋白2和增强型绿色荧光蛋白融合表达，在谷氨酰胺转运蛋白2的最后一个氨基酸H和增强型绿色荧光蛋白的第一个氨基酸M之间有3个Gly形成的铰链。

6.权利要求5所述谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体应用于检测谷氨酰胺转运蛋白2的表达和定位。

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