JP2016512691A5 - - Google Patents

Claims (29)

1. 細胞におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる方法であって、前記細胞と、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡとを接触させることを含む、方法。
2. 細胞内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域に切断を誘発する方法であって、
   Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ニッカーゼと、
   二本鎖ＤＮＡ分子の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡと
   を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
3. 細胞内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域を修飾する方法であって、
   ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）と、
   選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡと
   を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
4. 前記ガイドＲＮＡが、
   （ｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含む単一ガイドＲＮＡまたは
   （ｉｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ
   である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ガイドＲＮＡが、
   （Ｘ_{１７〜１８}またはＸ_{１７〜１９}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
   （Ｘ_{１７〜１８}またはＸ_{１７〜１９}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）；または
   （Ｘ_{１７〜１８}またはＸ_{１７〜１９}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）；
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ_Ｎ）（配列番号１）、
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（Ｘ_Ｎ）（配列番号２）、
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（Ｘ_Ｎ）（配列番号３）、
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ_Ｎ）（配列番号４）、
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）
   からなる群より選択されるリボ核酸であるか、これを含み、
   Ｘ_{１７〜１８}が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な相補性領域であり、Ｘ_Ｎが、前記リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり、Ｎが０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
6. １７〜１８ヌクレオチドの標的相補性領域を有する、ガイドＲＮＡ分子。
7. 前記標的相補性領域が１７〜１８ヌクレオチドからなる、請求項６に記載のｇＲＮＡ。
8. 前記標的相補性領域が１７〜１８ヌクレオチドの標的相補性からなる、請求項６に記載のｇＲＮＡ。
9. 以下の配列
   （Ｘ_{１７〜１８}またはＸ_{１７〜１９}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
   （Ｘ_{１７〜１８}またはＸ_{１７〜１９}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）；または
   （Ｘ_{１７〜１８}またはＸ_{１７〜１９}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）；
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ_Ｎ）（配列番号１）、
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（Ｘ_Ｎ）（配列番号２）、
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（Ｘ_Ｎ）（配列番号３）、
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ_Ｎ）（配列番号４）、
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
   （Ｘ_{１７〜１８}）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）
   からなり、
   Ｘ_{１７〜１８}が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な配列であり、Ｘ_Ｎが、前記リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり、Ｎが０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る、
   請求項６に記載のｇＲＮＡ。
10. 前記リボ核酸が、前記分子の３’末端に１つまたは複数のＵを含む、請求項５に記載の方法または請求項６に記載のリボ核酸。
11. 前記リボ核酸が、前記ＲＮＡ分子の５’末端に前記標的配列に相補的ではない１つまたは複数の追加のヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法または請求項６に記載のリボ核酸。
12. 前記リボ核酸が、前記ＲＮＡ分子の５’末端に前記標的配列に相補的ではない１つ、２つまたは３つの追加のヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法または請求項６に記載のリボ核酸。
13. 前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する１７ヌクレオチドに相補的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または請求項６〜１２のいずれか一項に記載のリボ核酸。
14. 前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する１８ヌクレオチドに相補的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または請求項６〜１２のいずれか一項に記載のリボ核酸。
15. 請求項６〜１４のいずれか一項に記載のリボ核酸をコードする、ＤＮＡ分子。
16. 請求項１５に記載のＤＮＡ分子を含む、ベクター。
17. 請求項１６に記載のベクターを発現する、宿主細胞。
18. 前記標的領域が標的ゲノム配列内にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または請求項６〜１２のいずれか一項に記載のリボ核酸。
19. 前記標的ゲノム配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または請求項６〜１２のいずれか一項に記載のリボ核酸。
20. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、以下の配列
    ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）もしくはその活性部分；
    ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）もしくはその活性部分；
    ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０７）もしくはその活性部分；
    ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０９）もしくはその活性部分；
    ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧ（配列番号２４１０）もしくはその活性部分；
    ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ（配列番号２４１１）もしくはその活性部分；または
    ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号２４１２）もしくはその活性部分
    からなる、請求項４に記載の方法。
21. 前記ｃＲＮＡが（Ｘ_{１７〜１８}またはＸ_{１７〜１９}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）であるか；前記ｃＲＮＡが（Ｘ_{１７〜１８}またはＸ_{１７〜１９}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）であるか；または前記ｃＲＮＡが（Ｘ_{１７〜１８}またはＸ_{１７〜１９}）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０６）である、請求項４に記載の方法。
22. 前記ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）が、遺伝子発現、ヒストンまたはＤＮＡを修飾するＨＦＤを含む、請求項３に記載の方法。
23. 前記異種機能ドメインが、転写活性化ドメイン、ＤＮＡ脱メチル化を触媒する酵素、ヒストン修飾を触媒する酵素、または転写サイレンシングドメインである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４またはＮＦ−κＢ ｐ６５由来のものである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ヒストン修飾を触媒する酵素が、ＬＳＤ１、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＮＭＴ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）またはヒストンデメチラーゼである、請求項２３に記載の方法。
26. 前記転写サイレンシングドメインが、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えばＨＰ１αまたはＨＰ１β由来のものである、請求項２３に記載の方法。
27. 前記選択される標的ゲノム配列に挿入欠失変異または配列変化を生じさせる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
28. 前記細胞が真核細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
29. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の方法。