KR100635447B1 - 종양 특이적 자살유전자 발현 카세트 및 이를 포함하는아데노바이러스 발현 벡터 - Google Patents

종양 특이적 자살유전자 발현 카세트 및 이를 포함하는아데노바이러스 발현 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 발생과 관련 있는 텔로머라제 프로모터와 MMRE, SV40 인핸서를 갖는 아데노바이러스 및 이를 항암 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 90 % 이상 종양에서 그 활성이 보고되는 텔로머라제의 활성을 이용해 증가된 활성을 갖는 텔로머라제 프로모터에 의해 종양 특이적으로 자살 유전자를 발현하는 아데노바이러스 벡터와 그의 응용방법에 관한 것으로서, 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh 는 각종 종양에만 작용하며 정상 세포에는 영향을 미치지 않는 종양 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
텔로머라제 프로모터, MMRE, SV40 인핸서, 아데노바이러스, 종양 유전자 치료

Description

종양 특이적 자살유전자 발현 카세트 및 이를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 {Cancer-specific suicide gene expression cassette and adenovirus expression vector comprising the same}
도 1a는 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하는데 사용된 pGL3-Control 벡터 (미 프로메가사 제품, E1741)의 유전자 지도이다.
도 1b는 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하는데 사용된 pShuttle (Q-bio 사 제품, AES1020)의 유전자 지도이다.
도 1c는 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-hT-TK-enh의 유전자 지도이다.
도 2는 Myc-Max response elements (MMRE) 구조를 나타낸 도면이다. Myc-Max heterodimers가 결합하는 core sequence (CACGTG)는 볼드체와 밑줄로 표시된다.
도 3a는 자살 유전자 HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase)의 염기서열을 나타낸다. 추가된 HindIII 및 XbaI 부위가 볼드체와 밑줄로 표시된다.
도 3b는 본 발명의 자살 유전자 HSV-TK의 클로닝에 사용된 pXCMVTK (생명공학연구소 김동수 박사 제공)의 유전자 지도이다.
도 4는 본 발명의 아데노바이러스 클론을 제조하는데 사용된 모체 벡터 pAdEasy-1(미 Quantum 사 제품, AES1010)의 유전자 지도이다.
도 5는 pS-hT-TK, pS-hT-TK-enh, pS-MMRE-hT-TK-enh의 구조를 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 6은 hTERT promoter를 갖는 pGL3-hT 플라스미드에 의한 각 세포의 텔로머라제 프로모터의 활성도를 루시퍼라제 유전자 발현 양상에 따라 나타낸 그래프이다. 정상인간 섬유 아세포 (Wi-38), 소세포 폐암 세포주 (NCI-H417), 텔로머라제 양성 콘트롤 세포주 (QBI-293A) 세포주를 사용하였음. pGL3-Promoter 플라스미드 (미 프로메가사 제품, E1761)를 양성 대조군으로 사용하여 각 세포주 에서의 발현 정도를 100%로 하여 측정.
도 7은 pGL3-Con, pGL3-hT, pGL3-hT-enh, pGL3-MMRE-hT-enh plasmids 를 텔로머라제 양성 대조 세포주 (도 7a; QBI-293A) 와 정상 섬유 아세포 (도 7b; Wi-38)에 transfection후 루시퍼라제 발현 정도를 측정한 그래프이다. c-Myc에 의한 hTERT 프로모터 및 MMRE활성 증가 효과를 알아보기 위해 c-Myc expression plasmid를 각 세포주에 transfection후 24시간 후 pGL3-MMRE-hT-enh plasmid를 다시 transfection 함 (c-Myc+mmhTenh). Control plasmid로 pGL3-Control를 사용. (Con; pGL3-Control, hT; pGL3-hT, hT-enh; pGL3-hT-enh, mm-hT-enh; pGL3-MMRE-hT-enh, c-Myc; pCMV-c-myc).
도 8은 SCLC인 NCI-H417 세포에 pGL3-Con, pGL3-hT, pGL3-hT-enh, pGL3-MMRE-hT-enh plasmids 를 transfection 후 루시퍼라제 발현 정도를 측정한 그래프이다. (Con; pGL3-Control, hT; pGL3-hT, hT-enh; pGL3-hT-enh, mm-hT-enh; pGL3- MMRE-hT-enh).
도 9는 Wi-38과 NCI-H417 에 Ad-hT-TK, Ad-hT-TK-enh, Ad-MMRE-hT-TK-enh 각 50 moi 와 GCV (50 M) 처리 후 6일 후 trypan blue exclusion 으로 세포 사멸도를 측정한 그래프이다.
도 10은 Ad-MMRE-hT-TK-enh에 의한 NCI-H417 세포의 아폽토시스 여부를 ELISA 방법을 이용하여 나타낸 결과 그래프이다.
본 발명은 종양 발생과 관련 있다고 보고되는 텔로머라제 프로모터 및 MMRE, SV40 인핸서를 이용해 종양 특이적으로 자살 유전자, 예컨대 HSV-TK를 생산하는 종양 특이적 발현 카세트, 이를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 및 이를 항암 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
세포에 원래 존재하는 thymidine kinase 는 DNA 합성시 salvage pathway 에 이용되는 효소인데 HSV-tk 는 thymidine 뿐만 아니라 nucleoside analogs 이면서 항바이러스제제로 쓰이는 acyclovir, GCV 도 인산화시키는 능력을 가지고 있다. DNA 합성 과정중 deoxy- guanosine tri-phosphate 대신에 tri-phosphorylated GCV 가 들어가 DNA polymerase 에 의한 chain elongation 을 중단시켜 DNA 합성을 억제, 세포 살상능을 나타내게 되는데 이 점 을 이용하여 암세포에 HSV-tk 유전자를 투입하고 GCV 를 투여하여 암세포를 죽이는 것이다. 대부분의 암세포주에서의 실험 결과를 보면 HSV-tk 유전자의 발현을 보이는 세포주는 대조 세포주에 비해 GCV 에 대한 감수성을 1000배 정도 증가시키는 효과를 나타낸다. rat, mice 등을 이용한 in-vivo model 에서도 HSV-tk/GCV 의 투입으로 종양에 대한 뚜렷한 치료 효과를 나타내고 있다. 이 전략의 중요한 장점은 HSV-tk 유전자가 투입되지 않은 주위의 암세포도 같이 죽이는 "bystander effect" 를 나타낸다는 것인데 현재 암치료를 위한 유전자요법의 가장 큰 문제점, 즉 모든 암세포에 일일이 유전자를 투입할 수 없다는 결점을 부분적으로 보완할 수 있다는 점에서 중요한 의미를 갖는다. Bystander effect 는 인산화된 GCV 가 인접 세포사이에 형성된 gap junction 을 통해 전달되거나 HSV-tk 와 GCV 처리에 의해 죽어가는 암세포의 apoptotic vesicle 을 주위 암세포가 endocytosis 함으로서 이루어지는 것으로 이해되고 있다.
텔로미어 (Telomeres)는 진핵 생물의 염색체 말단에 존재하는 특이 구조로 짧은 DNA 조각 (척추 동물의 경우 TTAGGG)이 100 kb 이상 반복되는 형태를 띠고 있다. 이들은 단백질과 결합된 형태로 여러 가지 기능을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 첫째, 이들은 염색체 끝 사이의 재결합, 융합 (interchromosomal fusion), 붕괴를 막아 염색체를 보호한다. 두 번째, 체세포 또는 생식 세포 분열 시 염색체 이동을 돕는다. 셋째, 직선을 이루는 진핵 세포 염색체에서 자연적으로 일어나는 말단 복제 문제 (end-replication problem) 를 막는 역할을 한다. 즉, 복제의 끝 무렵 지체가닥 (lagging strand) DNA 합성 시 제거되는 RNA 시발체 (primer) 부분을 DNA 복제 효소가 합성 할 수 없어, 그 부위는 영구히 사라지는데 텔로미어가 있음으로 해서 손상되지 않고 보존된다. 암세포 및 생식 세포에서는 텔로머라제 (telomerase) 라는 효소가 존재해 TTAGGG 반복 부위를 염색체 끝에 계속 합성하는데 비해 체세포에서는 이러한 텔로머라제 활성이 없어서 매 세포주기 마다 텔로미어가 짧아져 결국은 사멸하게 된다 (David et al., 1997, nature 389, 551-552). 텔로머라제 프로모터를 갖는 아데노바이러스를 유전자 치료에 사용하려는 시도는 몇 가지 사례 (Koga et al., 2000, Human gene ther 11,1397-1406; Gu et al., Cancer Res 60, 5395-5364. 2000; Majumdar et al., Gene Ther 8. 568-578, 2001)가 있으나 텔로머라제 프로모터 자체의 활성이 낮아 임상실험에는 부적당하므로 그 활성을 높이려는 시도가 필요하다.
소세포 폐암 (small cell lung cancer; SCLC)는 전체 폐암 중 15-30 %를 차지하나 매우 빠르게 자라며 침윤성도 크고 쉽게 전이되며 수술이 어렵다. 대략 80-90% 소세포폐암세포에서 텔로머라제 프로모터의 활성이 관찰된다. 또한, SCLC의 83% 에서 종양 발암유전자인 myc family가 과발현되며 이러한 MYC 단백질들은 MAX 단백질들과 결합해 Myc-Max complex를 이루며 CACGTG 서열(Myc-Max response element; MMRE)에 결합해 전사를 촉진시킴으로써 유전자 치료에 사용될 수 있음이 밝혀졌다 (Cancer Research 56, 354-358, 1996) . 따라서 이 MMRE 부위를 텔로머라제 프로모터 앞 부위에 삽입한다면 myc family가 과발현되는 각종 암, 특히 SCLC 특이 유전자 치료 시 높은 살상 효과를 얻을 수 있을 것이며 정상세포에는 그 영향이 없는 새로운 형태의 유전자 치료제 개발이 가능할 것이다.
따라서, 본 발명자는 Myc-Max response element (MMRE), hTERT promoter와 SV40 enhancer, 자살 유전자인 HSV-TK 로 구성되는 아데노바이러스 벡터는 텔로머 라제 프로모터에 의한 종양 특이적 발현을 유지하면서 MMRE, SV40 enhancer 에 의한 HSV-TK 발현 양을 증가 시켜서 myc family가 과발현되는 암의 치료에 효과적인 유전자 치료 벡터가 되리라고 생각에 착안하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 90 % 이상 종양에서 그 활성이 보고되는 텔로머라제 활성을 이용해 종양의 특이적 억제가 가능한 아데노바이러스 벡터와 그의 응용 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh 는 종양 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 더 구체적으로는 본 발명의 목표는 증가된 텔로머라제 활성 프로모터를 갖는 아데노바이러스를 이용하여 이를 소세포폐암 유전자 치료에 응용하는데 있다. 80~90 % 소세포폐암세포에서 그 활성이 관찰되는 텔로머라제 프로모터의 활성도를 증가시킨 아데노바이러스를 이용해 자살 유전자 등을 종양세포에서만 발현시켜 종양 세포만을 공격함으로써 잔여 폐암 세포들을 제거할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 이중의 종양 특이적 특성을 갖는 자살유전자를 발현시키기 위한 종양 특이적 발현 카세트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 종양 특이적 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포에서 증식시킨 아데노바이러스 클론을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 아데노바이럿 클론을 유효성분으로 함유 하는 항암 유전자요법 치료제를 제공하는 데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 종양 특이적으로 발현되는 텔로머라제 활성 및 c-Myc 과발현을 이용해서 암세포에만 특이적으로 작용하는 아데노바이러스 벡터를 개발하는데 있다. 즉, 역전사 효소의 활성을 갖는 hTERT 부위의 프로모터를 이용해 자살 유전자인 HSV-TK 유전자를 삽입해 암세포에만 특이적으로 작용하는 아데노바이러스 벡터를 개발함에 있다. 본 발명에서는 이러한 hTERT promoter 의 종양 특이적 특성은 유지하면서 좀 더 강력한 promoter 활성을 얻기 위해 MMRE와 SV40 virus의 transcription enhancer를 삽입하여 유전자 치료에 이용하고자 한다.
본 발명에 제공되는 아데노바이러스는 바이러스 증식에 관여하는 E1, E3 유전자 부위를 포함하지 않고 암세포 내에서만 자살 유전자 HSV-TK 를 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 인간 텔로머라제 활성부위인 hTERT의 프로모터, MMRE, HSV-TK 및 SV40 후 아데닌 다중화 신호 (late polyadenylation signal) 및 SV40 인핸서로 구성되는 발현 카세트를 이용하여 자살 유전자를 발현할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-hTERT-TK-enh 를 제공한다. 또한, 본 발명은 암세포내에서만 자살 유전자인 HSV-TK 를 발현하여 종양 특이적 항암 유전자 요법에 사용될 수 있는 아데노바이러스 클론을 제공함에 그 목적이 있다. 이 때, 아데노바이러스가 증식하는데 필요한 유전자를 포함하는 아데노바이러스 모체 벡터로는 아데노바이러스 벡터 pAd-Easy-1을 사용하여 아데노바이러스 재조합 대장균인 BJ5183에서 재조합한 후 패키징 세포인 QBI-293A 세포를 사용하여 증식시켰다. 또한, 본 발명은 상기 아데노바이러스 클론을 암의 치료에 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로, 본 발명은 상기 아데노바이러스 클론을 인체내에 암이 생긴 부위에 감염시켜 암이 진행되는 것을 억제하거나 암세포만을 사멸시켜 암을 치료하는 항암 유전자 요법을 제공할 수 있다.
상기 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 MMRE (Myc-Max response element), 인간 텔로머라제 hTERT 프로모터, 자살 유전자, SV40 후 아데닌 다중화신호 및 SV40 인핸서가 전사방향으로 연결되어 구성된 종양 특이적 자살 유전자 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 종양 특이적 자살유전자 발현 카세트에 있어서, 상기 MMRE는 MYC 단백질과 MAX 단백질이 결합된 Myc-Max complex가 결합되어 전사를 촉진시키는 부위로서 CACGTG 서열을 포함하며, 바람직하게는 양끝에 MYC-MAX 결합을 용이하게 하기위한 스페이스(space)를 포함하는 서열번호1의 염기서열이 4번 반복된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 종양 특이적 자살유전자 발현 카세트에 있어서, 상기 인간 텔로머라제 hTERT 프로머터는 암세포에서 염색체 끝에 TTAGGG 반복 부위를 계속 합성하는 텔로머라제(telomerase) 효소를 암호화하는 hTERT 유전자의 전사를 개시하는 프로모터 부위로서, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 종양 특이적 자살유전자 발현 카세트에 있어서, 상기 자살 유전자는 암의 억제나 세포의 사멸(cell death)를 유발할 수 있는 단백질을 암호화하는 어떤 유전자, 예컨대 p53 등의 종양 억제 유전자, IL-2, IL-4, IL-12, 종양 괴사인자 (TNF) 등의 면역 관련 유전자나 단순 포진 바이러스의 티미딘 인산화 효소 (HSV-TK) 유전자와 ganciclovir, 대장균의 사이토신 탈아미노효소 (CD)유전자와 5-fluorocytosine (5-FC) (Gene therapy of Cancer, Edmund C.Lattime 외 1인, Academic press)도 가능하나, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase) 유전자, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 종양 특이적 자살유전자 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터는, 바람직하게는 상기 종양 특이적 자살유전자 발현 카세트를 아데노바이러스 재조합 벡터인 pShuttle의 KpnI/SalI 부위에 삽입하여 제조되는 도 1c의 개열지도를 갖는 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-hT-TK-enh인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포에서 증식시켜 얻은 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh를 제공한다.
본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh는 바람직하게는 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 바이러스 증식을 위한 아데노바이러스 모체 벡터 pAdEasy-1와 함께 아데노바이러스 재조합 대장균 BJ5183에 공동 형질 전환시킨 후 여기서 추출된 재조합 아데노바이러스 DNA를 패키징 세포 QBI-293A에 형질감염한 후 증식하여 얻은 것을 특징으로 하는 수탁번호 (KCCM-10573)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh 를 유효성분으로 함유하는 항암 유전자 요법 치료제를 제공한다.
본 발명의 항암 유전자 요법 치료제는 바람직하게는 myc family가 과발현되는 암, 예컨대 피부암, 유방암, 전립선암, 버킷 림포마 등 (Nesbit et al., Oncogene 18, 2004-3016 참조) 의 치료, 더욱 바람직하게는 소세포 폐암(small cell lung cancer; SCLC)의 치료에 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항암 유전자요법 치료제는 본 발명의 유효성분인 아데노바이러스 클론 외에 생물제제에 통상 사용되는 안정화제 및 담체, HSV-TK, CD, IL-2 등의 보조 활성성분 등을 더 포함할 수 있으며, 암의 치료를 위해 주사제 형태로 인체에 투여될 수 있다. 이 때 환자에게 투여될 아데노바이러스 클론 입자의 적정 수는 환자의 중한 상태에 따라 다르나 바람직하게는 체중 kg당 500~2000 MOI 정도이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 텔로머라제 프로모터 MMRE, SV40 인핸서에 의해 자살 유전자를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 아데노바이러스를 제조하기 위하여, 아데노바이러스의 게놈 DNA에서 E1 유전자 부위를 제거하고 그 자리에 MMRE, hTERT 프로모터, 자살유전자 HSV-TK, SV40 후 아데닌 다중화 신호 및 SV40 인핸서로 구성되는 발현 카세트를 대신 삽입함으로써 종양 특이적 자살유전자 발현 아데 노바이러스 벡터를 제조한다.
구체적으로, 본 발명은 루시퍼라제 발현 벡터인 pGL3-Control 벡터 (미 프로메가사 제품, E1741)의 시미언 바이러스 (simian virus; SV40) 의 최전 프로모터(immediate early promoter)를 제거 하고, 인간 텔로머라제 hTERT 프로모터를 삽입한 후, 루시퍼라제 유전자를 제거하고 HSV-tk 유전자를 삽입하였다. MMRE 부위는 (CACGTG)X4 로 구성되는 MMRE oligomer 쌍을 상보 결합시켜 hTERT promoter 앞 쪽의 KpnI/BglII 부위에 cloning한 후에 KpnI/SalI 카세트를 아데노바이러스 발현 벡터인 pShuttle의 KpnI/SalI 부위에 삽입하여 인간 텔로머라제 hTERT 프로모터, 자살유전자 HSV-TK, SV40 의 후 아데닌 다중화 신호 및 SV40 인핸서로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 pS-hTERT-TK-enh 를 제조한다. 텔로머라제 hTERT 프로모터는 두 시발체 (서열번호 5, 6)를 이용하여 NCI-H358 게노믹 DNA로부터 PCR 방법을 이용하여 분리하였고, 루시퍼라제 발현 벡터 pGL3-control 의 BglII 와 Hind III 제한효소 부위에 삽입하였다.
본 발명의 아데노바이러스 클론을 제조하기 위하여, 아데노바이러스가 증식하는데 필요한 유전자를 포함하는 아데노바이러스 모체 벡터로는 아데노바이러스 벡터 pAd-Easy-1을 사용하여 아데노바이러스 재조합 대장균인 BJ5183에서 재조합한 후 패키징 세포인 QBI-293A 세포를 사용하여 증식시켰다. 본 발명에서 선별한 아데노바이러스 클론을 Ad-MMRE-hT-TK-enh 로 명명하고 이를 2004년 5월 17일에 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KCCM-10573).
본 발명의 상기 아데노바이러스 클론이 종양 세포에만 특이적으로 작용하는 지 조사하기 위하여, 상기 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh를 소세포폐암(SCLC) 및 정상 섬유 아세포에 감염시켜 종양세포의 특이적 사멸 및 세포 성장 억제 효과를 확인한다 (도 9, 도 10). 구체적으로 본 발명은 암 세포주로 소세포 폐암에서 유래한 NCI-H417 세포주를 사용한다. 또, 정상 세포주에 미치는 영향을 살펴보기 위해 정상 섬유 아세포 (fibroblast)인 Wi-38을 대조군으로 사용한다.
본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh 가 세포 성장에 미치는 효과는 트리판 블루 염색법 (cell exclusion assay)으로 측정한다.이 때 대조군으로 어떤 유전자도 발현하지 않는 아데노바이러스 Ad-CMV null 과 SV40 인핸서를 갖지 않는 Ad-hT-TK, SV40 인핸서를 갖는 Ad-hT-TK-enh 로 세포를 감염시킨다. 그 결과 NCI-H417 세포에서 세포수가 감소하는 현상을 관찰했으나, 정상 피브로브라스트(fibroblast) 세포는 거의 영향을 받지 않음을 확인한다 (도 9).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 각 세포주의 배양 및 텔로머라제 발현 여부 확인
본 발명에 사용된 소세포 폐암 세포주 NCI-H417(한국 세포주 은행, KCLB-90417)와 대조군인 인간 정상피부 피브로브라스트 세포인 Wi-38(한국 세포주 은행, KCLB-10075) 등은 10% 소태아 혈청을 포함하는 배지 RPMI1640 에서 배양하여 사용하였다. 세포주들은 모두 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 텔로머라제 활성 양성 대조군인 QBI-293A 세포주(Q-bio 사 제품, AES 0503) 는 미 퀀텀사에서 구입하였다.
SCLC와 정상 섬유아세포에서의 텔로머라제 프로모터의 활성 정도를 알아보기위해 루시퍼라제 리포터 플라스미드의 트랜스팩션을 시행하였다. 이 경우 pGL3-Promoter (미 프로메가사 제품, E1761)에 의한 발현 정도를 100으로 하여 시행하였다. SCLC의 경우 pGL3-Promoter에 비해 텔로머라제의 프로모터를 갖는 pGL3-hT의 루시퍼라제 발현 정도는 138%로 나타난대 비해 정상 섬유아세포의 경우는 발현이 거의 되지 않는다 (도 6).
다음은 MMRE와 SV40 enhancer에 의한 hTERT promoter 증가 효과를 알아 보기 위해 SV40 enhancer를 갖는 pGL3-Control 벡터와 SV40 enhancer를 갖지 않는 pGL3-Promoter vector의 SV40 promoter 부위를 제거하고 BglII/HindIII 부위에 hTERT promoter 삽입하여 텔로머라제 프로모터와 루시퍼라제 유전자로 구성되는 reporter 벡터를 제조하였다 (pGL3-hT-enh, pGL3-hT). MMRE 부위는 (CACGTG)X4 로 구성되는 MMRE oligomer 쌍을 합성 한 후 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA 버퍼에서 80 ℃, 30 분간 방치하여 상보 결합시켜 제조하였다 (도 2). hTERT promoter 앞 쪽의 KpnI/BglII 부위에 cloning하였다 (pGL3-MMRE-hT-enh). QBI-293A 세포주에서 MMRE 와 SV40 enhancer 를 갖는 pGL3-MMRE-hT-enh 경우 pGL3-hT 에 비해 4배나 많은 루시퍼라제의 발현 정도를 보였으며 단지 enhancer 만을 갖는 pGL3-hT-enh 경우 pGL3-hT에 비해 약 2배의 발현 증가를 보였다(도 7a). 그러나 정상 섬유세포아세포 Wi-38의 경우 MMRE와 SV40 enhancer에 의한 텔로머라제 프로모터의 증가 효과는 미미했다 (도 7b). c-Myc 과발현에 의한 MMRE의 텔로머라제 프로모터의 활성 증가 정도를 알아보기 위해 QBI-293A 세포주에 c-Myc 발현 플라스미드 (pCMV-c-myc)를 트 랜스팩션 후, 다음날 pGL3-MMRE-hT-enh 플라스미드를 트랜스팩션 시켰다. 그 결과 약 2배의 루시퍼라제 발현 증가 효과를 관찰함으로써 MMRE의 텔로머라제 프로모터 발현 증가 효과는 c-Myc 단백질에 의함을 확인한다 (도 7a 레인 5). 최근 c-Myc 이 정상 섬유아세포에서 텔로머라제 프로모터 활성도를 증가시킴이 관찰되었는데 (Schreiber et al., Nucleic Acids Res 17:6419, 1989), 본 발명에서도 c-Myc의 발현 증가로 텔로머라제 프로모터의 활성이 증가됨을 확인한다 (도 7b 레인 5). NCI-H417 SCLC cells 은 c-Myc protein 이 과발현되는 세포주로서 (Barr et al., Cancer Res 60:143-149, 2000). 도 8에서 보듯 MMRE 와 SV 40 enhancer 에 의해 텔로머라제 프로모터의 활성이 4배 이상 증가함을 확인한다. 이러한 결과는 소세포폐암에서 MMRE와 SV40 enhancer 가 hTERT 프로모터의 활성을 증가시키고 정상 세포에서는 그 영향이 미미함을 확인한다.
실시예 2 MMRE , 텔로머라제 프로모터, 자살유전자 및 SV 40 인핸서를 포함하는 발현 카세트 및 아데노바이러스 발현 벡터의 제조
본 발명은 MMRE, 텔로머라제 프로모터와 자살유전자를 포함하는 발현 카세트 및 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하기 위하여, NCI-H358 (한국 세포주 은행, KCLB 25807) 게노믹 DNA 추출후 서열번호 5과 서열번호 6 를 프라이머로 이용하여 hTERT 프로모터를 PCR 증폭한 후 Bgl II 와 Hind III 처리 한 후, 같은 제한 효소로 SV40 프로모터를 제거한 pGL3-Control 벡터(미 프로메가사 제품, 도 1a)에 삽입하여 pGL3-hT-enh 벡터를 제조하였다. 이 벡터를 HindIII/XbaI으로 처리하여 시미언 바이러스 (simian virus; SV40) 의 최전 프로모터(immediate early promoter) 뒤의 루시퍼라제 유전자를 제거하고 자살 유전자인 HSV-TK 유전자를 삽입하였다. 이때 HSV-TK 유전자 (도 3a) 는 pXCMVTK (도 3b, 한국생명공학연구소 김동수 박사 제공) 플라스미드로부터 서열번호 7, 8을 사용하여 PCR 기법을 이용하여 분리하였다. MMRE 부위는 (CACGTG)X4 로 구성되는 MMRE oligomer 쌍을 상보 결합시켜 제조한 후(도 2), hTERT promoter 앞 쪽의 KpnI/BglII 부위에 cloning하였다. 그 후 KpnI/SalI로 처리하여 MMRE 부위 앞의 KpnI 과 SV40 인핸서 뒤의 SalI 사이의 KpnI/SalI 발현 카세트를 제조하였다(도 1c). 다음 제조된 KpnI/SalI 발현 카세트를 아데노바이러스 재조합벡터인 pShuttle(Q-bio 사 제품 AES1020, 도 1b)의 KpnI/SalI 부위에 삽입하여 MMRE, 인간 텔로머라제 hTERT 프로모터, 자살 유전자 HSV-TK, SV40 후 아데닌다중화 신호 및 SV40 인핸서로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 pS-MMRE-hT-TK-enh를 제조하였다 (도1c 참조).
실시예 3 MMRE, 텔로머라제 프로모터 및 SV40 인핸서에 의해 종양 세포내에서 자살 유전자를 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론의 제조
종양 세포에 감염되어 자살 유전자 HSV-TK 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론을 제조하기 위하여, 본 발명의 아데노바이러스 발현벡터 pS-MMRE-hT-TK-enh 를 아데노바이러스 재조합 대장균 (E.coli) 인 BJ5183 (Q-bio 사 제품, AES1005K)에 아데노바이러스 모체 벡터 pAdEasy-1 (Q-bio 사 제품, AES1010, 미국, 도 4) 와 함께 공동 형질감염 시킨 후, 40개의 후보 클론을 선별하여 그들에서 추출한 아데노바이러스 DNA를 패키징 세포주인 QBI-293A 세포(Q-bio 사 제품, AES 0503)에 리포좀 (로쉬 사 제품, FuGENE 6)을 이용하여 형질감염시켰다. 이 때 형질감염 (transfection)은 24-웰 플레이트를 사용하여 수행하였고, 그 결과 35개의 웰에서 바이러스에 의한 플라크가 생성됨을 확인하였다. 모든 과정은 미국 Q-bio 사의 재조합 아데노바이러스 제조 kit인 AdEasyTM의 방법을 사용하였다. 이렇게 제조된 아데노바이러스 클론을 Ad-MMRE-apoptin-enh 로 명명하고 이를 2004년 5월 24일에 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KCCM-10574). Enhancer와 MMRE를 갖지않는 control 아데노바이러스 Ad-hT-Tk, Ad-hT-Tk-enh는 위와 같은 방법으로 pGL3-Promoter, pGL3-Control (미 프로메가 사 제품) 이용해 제조하였다(도 5).
실시예 4 아데노바이러스 Ad- MMRE - hT - TK - enh 의 항암 효과
본 발명의 아데노바이러스 클론을 항암 유전자 요법에 효과적으로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, 종양 세포주에 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh 를 처리한 후 GCV (ganciclovir, 미 시그마사 제품)를 50 M 처리하여 이로부터 항암 효과를 조사한다. 본 발명의 아데노바이러스 Ad-MMRE-hT-TK-enh의 감염이 세포 성장에 미치는 효과는 트리판 블루 염색법 (trypan blue dye exclusion assay) 으로 측정한다. 대략 5×104 개의 세포를 60 mm 디시에 심어 하루 배양 후, 아데노바이러스 Ad-MMRE-hT-TK-enh, Ad-hT-TK-enh, Ad-hT-TK 또는 음성조절인자 (negative control)로 Ad-CMV null 을 50 pfu/세포의 농도와 GCV 50 M 처리한 후 6일 후 세포 수를 측정한다. 그 결과, 종양 세포 NCI-H417 에서 Ad-MMRE-hT-TK-enh 에 의한 세포사멸효과가 Ad-hT-TK-enh, Ad-hT-TK 보다 각 약 24 %, 약 44% 정도 더 높았다. 정상 세포 Wi-38 에는 별다른 영향이 없음을 확인한다 (도 9). Ad-MMRE-hT-TK-enh 에 의한 아폽토시스 세포사멸 시 생성되는 세포질 히스톤 연관 DNA 절편은 Cell Death Detection ELISA PLUS (독일 로쉬 사 제품)에 의해 측정되었다. 즉, Ad-CMV, Ad-hT-TK, Ad-hT-TK-enh, Ad-MMRE-hT-TK-enh 감염 세포를 streptavidin - coated micro plate에 올려 놓고 Anti-histone-biotin, Anti-DNA-POD 복합체를 넣어 15~25 ℃ 에서 2시간 배양 후 비결합 항체를 제거 후 POD 를 405 nm 에서 ABTS 를 기질로 하여 ELISA reader 로 읽은 결과 Ad-hT-TK, Ad-hT-TK-enh 에 비해 Ad-MMRE-hT-TK-enh가 각 2.5 배, 1.6 배 이상 높은 세포 사멸 효과를 보임을 알았다 (도 10).
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-hT-TK-enh 및 이로부터 얻은 바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh 는 암세포를 사멸시키거나 성장을 억제시키는데 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 Ad-MMRE-hT-TK-enh 는 텔로머라제 활성을 갖는 종양세포에만 특이적으로 작용하고 정상 세포에는 영향을 주지 않으므로, 독성이나 부작용이 적은 장점을 갖는 것으로 생각되어 항암 유전자 요법에 사용할 경우 매우 우수한 안전성과 강한 항암 효과를 나타내게 된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호1의 염기서열이 4번 반복된 MMRE(Myc-Max response element), 인간 텔로머라제 hTERT 프로모터, HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase) 유전자, SV40후 아데닌다중화신호 및 SV40 인핸서가 전사방향으로 연결되어 구성된 종양특이적 HSV-TK 유전자 발현 카세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 HSV-TK 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 HSV-TK 유전자 발현 카세트.
  4. 제1항의 종양 특이적 HSV-TK 유전자 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 종양 특이적 HSV-TK 유전자 발현 카세트를 아데노바이러스 재조합 벡터인 pShuttle의 KpnI/SalI 부위에 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 도 1의 개열지도를 갖는 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-hT-TK-enh.
  6. 제4항의 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포에서 증식시켜 얻은 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh.
  7. 제6항에 있어서, 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 바이러스 증식을 위한 아 데노바이러스 모체 벡터 pAdEasy-1와 함께 아데노바이러스 재조합 대장균 BJ5183에 공동형질감염시킨 후 여기서 추출된 재조합 아데노바이러스 DNA를 패키징 세포 QBI-293A에 형질감염한 후 증식하여 얻은 것을 특징으로 하는 수탁번호 (KCCM -10573 )의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh.
  8. 제6항의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-hT-TK-enh 를 유효성분으로 함유하는 항암 유전자 요법 치료제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 myc family가 과발현되는 암의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항암 유전자 요법 치료제.
  10. 제9항에 있어서, 소세포 폐암(small cell lung cancer; SCLC)의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항암 유전자 요법 치료제.
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