KR20150138554A

KR20150138554A - Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자, TRAIL 유전자 및 Bcl-xL 의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터

Info

Publication number: KR20150138554A
Application number: KR1020140065431A
Authority: KR
Inventors: 송재진; 김주항; 강수진
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2015-12-10
Also published as: KR101683964B1

Abstract

본 발명은 RNA 간섭에 의하여 Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한, Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자, TRAIL을 코딩하는 염기서열 및 Bcl-xL 의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이를 포함하는 항종양 조성물 및 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 아데노바이러스에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 Daxx shRNA에 의하여 Daxx의 발현을 억제하여, 세포 사멸 효과를 증대시킬 뿐만 아니라 아데노바이러스의 복제율을 향상시킬 수 있으며, Bcl-xL shRNA에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하여 TRAIL에 의한 세포 사멸 효과를 증대시켜, 항종양 효과를 극대화할 수 있다.

Description

Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자, TRAIL 유전자 및 Bcl-xL 의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 {An expression vector comprising nucleic acid downregulating Daxx, TRAIL gene and nucleic acid downregulating Bcl-xL}

본 발명은 RNA 간섭에 의하여 Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한, Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자, TRAIL을 코딩하는 염기서열 및 Bcl-xL 의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이를 포함하는 항종양 조성물 및 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 아데노바이러스에 관한 것이다.

닥스(Daxx) 단백질은 매우 잘 보존되고, 여러 조직에서 고르게 발현되는 핵단백질로 잘 알려져 있다. Daxx 단백질은 핵 안에서는 전사억제인자로 작용하고, 세포질로 이동한 경우에는 세포 사멸(apoptosis)을 증가시키는데 기여하는 것으로 처음 보고되었다 (Cell 27: 1067 by Yang et al., 1997; Science 281: 1860 by Chang et al., 1998). 그러나 그 이후 Daxx의 역할이 오히려 다양한 세포 사멸(apoptosis) 경로에 반작용(counteraction)을 한다는 보고가 많이 있었다. 특히, Daxx 사일런싱(silencing)이 Fas나 스트레스에 의해 유도되는 세포 사멸 경로를 민감하게 한다는 보고가 있었다 (Mol. Cell Biol. 23: 7108 by Chen and Chen, 2003).

한편, 트레일(TRAIL; Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand)은 정상세포에는 손상을 주지 않고 다양한 종류의 암세포의 사멸을 선택적으로 유도하는 단백질로, 트레일 단백질을 이용한 암을 치료 기술이 개발되고 있다. 트레일 단백질은 혈장 내 반감기가 짧기 때문에 항암 효과를 유도하기 위하여 고용량을 반복적으로 투여하여야 하는 불편함이 존재하였다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 아데노바이러스를 이용하여 트레일 유전자를 생체 내에 전달하는 기술이 개발되었다. 그러나, 이 경우에도 반복투여에 기인한 내성 문제가 여전히 남아있었다.

이에, 본 발명자들은 트레일에 의한 세포 사멸 효과가 진행되는 동안 획득되는 내성을 감소시키기 위하여 연구하였고, 그 결과 트레일 유전자의 도입과 함께 Bcl-xL 발현 저하를 유도함으로써 트레일에 의해 유도되는 내성 문제가 해결될 수 있음을 밝힌 바 있다(Journal of Biological Chemistry 282: 319, Song et al., 2007). Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large)은 종양발생 및 종양 진행에 매우 중요한 항-세포 사멸 분자로 Bcl-xL의 발현은 STAT, Rel/NF-κB 혹은 Ras 활성화에 의해서도 조절된다고 알려져 있다. Bcl-xL의 항-세포 사멸 작용은 TRAIL에 의해 유도되는 세포 사멸 효과에 반대되는 작용을 하게 된다. 따라서, Bcl-xL에 대한 siRNA의 RNA 간섭 작용에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제함으로써, 트레일에 의한 세포 사멸 효과를 증가시킬 수 있다.

그러나 Bcl-xL의 발현 억제를 통한 트레일의 세포 사멸 효과의 증대에도 불구하고, 많은 종양들은 여분의 신호전달경로나 보상신호경로를 가지기 때문에, 효과적인 종양 제거를 위한 기술 개발의 필요성이 여전히 존재한다.

Journal of Biological Chemistry 282: 319, Song et al., 2007 Mol. Cell Biol. 23: 7108 by Chen and Chen, 2003

따라서, 본 발명은 항종양 효과가 우수한 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는 항종양 조성물 및 상기 재조합 발현 벡터를 도입한 아데노바이러스를 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고, RNA 간섭에 의하여 Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 분자를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, TRAIL을 코딩하는 염기서열을 추가로 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 11로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고, RNA 간섭에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하는 핵산 분자를 코딩하는 염기 서열을 추가로 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터를 도입한 아데노바이러스를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 3으로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고, RNA 간섭에 의하여 Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자; TRAIL을 코딩하는 염기서열; 및 서열번호 11로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고, RNA 간섭에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면 Daxx shRNA에 의하여 Daxx의 발현을 억제하여, 세포 사멸 효과를 증대시킬 뿐만 아니라 아데노바이러스의 복제율을 향상시킬 수 있으며, Bcl-xL shRNA에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하여 TRAIL에 의한 세포 사멸 효과를 증대시켜, 항종양 효과를 극대화할 수 있다.

도 1은 Daxx shRNA 발현 벡터 제작 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 Daxx shRNA 발현 복제불능 아데노바이러스 제작 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 BJ5183 대장균에서 상동재조합된 콜로니의 HindIII 패턴에 이은 PacI 절단(cleavage)에 의한 스크리닝 과정을 보여준다.
도 4는 Daxx shRNA를 발현하는 복제불능 아데노바이러스에서, Daxx shRNA에 의한 Daxx발현 감소 효과를 보여준다.
도 5는 Daxx shRNA를 발현하는 종양선택적 복제가능 아데노바이러스의 상동재조합 여부를 확인한 결과 보여준다 (왼쪽은 HinIII 패턴을, 오른쪽은 PacI 절단 밴드를 나타냄).
도 6은 Daxx shRNA를 발현하는 종양선택적 복제가능 아데노바이러스에서, Daxx발현의 하향-조절이 바이러스 복제율에 미치는 영향을 보여준다.
도 7은 Daxx shRNA에 의한 Daxx 발현 억제가 세포 주기에 미치는 영향을 보여준다.
도 8은 Daxx shRNA에 의한 Daxx 발현 억제가 TRAIL에 의해 유도된 세포 사멸 효과에 미치는 영향을 보여준다.
도 9는 Bcl-xL shRNA 발현하는 복제불능 아데노바이러스에서, Bcl-xL shRNA에 의한 Bcl-xL 발현 감소 효과 및 TRAIL에 의해 유도된 세포 사멸 증진 효과를 보여준다.
도 10은 흑색종 세포인 A375 및 DU-145에서, Bcl-xL shRNA에 의한 Bcl-xL 발현 감소가 TRAIL에 의해 유도된 세포 사멸 효과를 증진하는 지 여부를, 현미경을 통해서 관찰한 결과를 보여준다.
도11은 pSP72△E3/H1-shDaxx 벡터의 제작 과정을 보여주는 모식도이다.
도 12는 shBcl-xL과 shDaxx를 동시에 발현하는 셔틀 벡터의 제작 과정을 보여주는 모식도이다.
도 13은 TRAIL 및 Bcl-xL shRNA를 동시에 발현하는 복제불능 아데노바이러스에서, Bcl-xL shRNA에 의한 Bcl-xL 발현 감소가 TRAIL에 의해 유도된 세포 사멸 효과에 미치는 영향을 보여준다.
도 14는 Daxx shRNA, Bcl-xL shRNA 및 TRAIL 발현 아데노바이러스를 제조하기 위하여, pCA14-CMV-3484-ΔE1B55 셔틀벡터를 제작하는 과정을 보여준다.
도 15는 제작된 dl324-BstB1-ΔE3-U6-Bcl-xL-H1-shDaxx 벡터의 상동재조합 여부를 확인한 결과를 보여준다.
도 16은 복제불능 pCA14--ΔE1B-E1R-CMV-TRAIL의 상동재조합 여부를 확인한 결과를 보여준다.
도 17은 TRAIL 발현하는 복제불능 아데노바이러스에 의하여, TRAIL 단백질이 잘 발현하는 지 확인한 ELISA 결과를 보여준다.
도 18은 TRAIL 발현하는 복제불능 아데노바이러스에 의하여, TRAIL 단백질이 잘 발현하는 지 확인한 현미경 관찰 결과를 보여준다.
도 19는 TRAIL발현을 유도하고 Bcl-xL 및 Daxx발현을 억제하는 shRNA를 포함하는 종양선택적 아데노바이러스 상동재조합 과정을 보여주는 모식도이다.
도 20은 TRAIL발현을 유도하고 Bcl-xL 및 Daxx발현을 억제하는 shRNA를 포함하는 종양선택적 아데노바이러스 상동재조합 여부를 확인한 결과를 보여준다.
도 21은 상동재조합된 TRAIL발현을 유도하고 Bcl-xL 및 Daxx발현을 억제하는 shRNA를 포함하는 종양선택적 아데노바이러스 게놈 DNA(viral genomic DNA)안에 shBclxL과 shDaxx 핵산서열이 삽입되어 있음을 보여준다.
도 22는 TRAIL발현을 유도하고 Bcl-xL 및 Daxx발현을 억제하는 shRNA 아데노바이러스에 의한 항종양 효과를 실험한 결과를 보여준다.

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 표적 유전자의 발현을 선택적으로 억제하는 천연의 메커니즘이다. 일반적으로, RNA 간섭은 표적 유전자의 mRNA 서열의 일부와 상동인 서열로 이루어진 센스 siRNA 및 이에 상보적인 서열로 이루어진 안티센스 siRNA로부터 형성된 dsRNA로 이루어진 siRNA(small interfering RNA)를 세포에 투여하여, 세포 내에서 siRNA가 센스 siRNA 및 안티센스 siRNA로 분리되고 표적 유전자 mRNA와 안티센스 siRNA가 이중 가닥을 형성한 다음, 형성된 dsRNA가 다이서에 의해 분해되어 표적 유전자의 발현이 억제되는 현상이다. RNA 간섭법은, siRNA를 세포 내로 도입하는 것 외에, siRNA의 전구체가 되는 비교적 긴 사슬의 dsRNA 또는 헤어핀 shRNA (short hairpin RNA)를 세포 내에 도입하거나, siRNA 또는 그의 전구체를 발현하는 벡터를 도입하여 siRNA와 마찬가지로 표적 유전자의 발현을 억제하는 것도 가능하다. 또한, 인 비보(in vivo)에서, siRNA에 의하여 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법도 알려져 있다.

본 발명은 Daxx의 발현을 억제하는 핵산분자에 관한 것이다. 본 발명에서, Daxx의 발현을 억제하는 핵산분자는, siRNA 또는 shRNA일 수 있다. Daxx의 발현을 억제하는 siRNA 또는 shRNA는 Daxx 유전자의 일부에 상보적인 서열을 가지고, Daxx 유전자의 mRNA를 분해하거나, 번역을 억제할 수 있다. 상보성이 80 내지 90%인 경우에는 mRNA의 번역을 억제할 수 있고, 100%인 경우에는 mRNA를 분해할 수 있다.

한 구체예에서, Daxx의 발현을 억제하는 핵산분자는 서열번호 3으로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고, RNA 간섭에 의하여 Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자일 수 있다.

서열번호 3: 5'-GCTACAAGCTGGAGAATGAGAAGCT-3'

한 구체예에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 8로 표시되는 핵산서열로 이루어지는 siRNA일 수 있다.

서열번호 8: 5'-AGCUUCUCAUUCUCCAGCUUGUAGC- 3'

siRNA는 유전자의 센스 서열(sense strand)과 세포 내에서 실제 유전자 억제효과를 나타내는 안티-센스 서열(anti-sense strand)을 함께 합성한 후 이중리보핵산쇄로 결합시켜 세포내로 도입될 수 있다. 본 발명에 있어서, siRNA 서열은 별도로 언급이 없는 한, 편의상 유전자의 안티센스 서열을 의미한다.

한 구체예에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 9로 표시되는 핵산서열 또는 서열번호 10으로 표시되는 핵산서열로부터 유래된 mRNA 서열에 해당하는 핵산서열을 포함하는 shRNA일 수 있다.

서열번호 9: 5'-gatcc GCTACAAGCTGGAGAATGAGAAGCT tctc AGCTTCTCATTCTCCAGCTTGTAGC tttttt a-3'

서열번호 10: 5'-agctt aaaaaa GCTACAAGCTGGAGAATGAGAAGCT gaga AGCTTCTCATTCTCCAGCTTGTAGC g-3'

shRNA는 siRNA의 전구체로서, 세포 내에서 궁극적으로 siRNA를 생성하는 것으로, 센스 RNA 및 안티센스 RNA를 연결하는 스페이서가 루프를 형성하여 그 전후의 RNA 서열을 어닐링하고 2 가닥을 형성하는 RNA를 의미한다. 상기 스페이서의 길이는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 3 내지 23 개의 염기일 수 있다. 예를 들어, 상기 스페이서는 TCTC일 수 있다. 가능한 스페이서의 종류는 업계에 잘 알려져 있다.

본 발명에 있어서, siRNA, shRNA 등의 핵산 분자는, 예를 들어, 화학적 인 비트로(in vitro) 합성계, 파지 RNA 중합효소를 이용한 인 비트로 전사법, 또는 복제한 cDNA를 주형으로 하여 전사 회합된 긴 dsRNA를 RNase III 또는 다이서에 의하여 절단하는 방법 등에 따라 적절히 합성할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 분자를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. Daxx siRNA 또는 shRNA를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 구축하고 이를 세포 내에 도입하여, 세포 내에서 Daxx siRNA 또는 shRNA를 발현시킬 수 있다. 한 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 9로 표시되는 탑 스트랜드와 서열번호 10으로 표시되는 바텀 스트랜드를 포함하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터일 수 있다.

Daxx siRNA 또는 shRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터를 세포에 도입하여 세포 내에서 siRNA 또는 shRNA 등의 핵산 분자를 생성할 수 있다. 이러한 발현 벡터에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다. 상기 발현 벡터의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 이미 의약으로서 사용되고 있는 발현 벡터가 바람직하며, 통상적으로 유전자 요법에서 사용되는 모든 벡터, 플라스미드 및 리포좀 등을 포함한다. 공지의 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector) 또는 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터(minus-strand RNA viral vectors) 등의 바이러스 벡터, 및 플라스미드 등의 비-바이러스 벡터 등이 이용 가능하다. 구체적으로는, 목적한 RNA 서열을 코딩하는 DNA를 공지의 다양한 발현 벡터에 적절히 삽입하여 구축할 수 있다.

본 발명에서 Daxx의 발현을 억제하는 shRNA는 전달된 세포에서 적절히 전사되기 위하여 적어도 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 상기 프로모터는 진핵세포에서 기능할 수 있는 프로모터라면 어떤 것이든지 무방하나, U6 프로모터가 RNA 중합효소 Ⅲ로서 small size RNA를 생성하는데 유리한 이유로 특히 바람직하다. Daxx 발현을 억제하는 shRNA의 효율적인 전사를 위하여 필요에 따라 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 인핸서(enhancer), 업스트림(upstream) 활성화 서열, 시그날 펩타이드 서열 및 전사 종결인자를 비롯한 조절 서열을 추가로 포함할 수 도 있다.

본 발명에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"이란 핵산 서열간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다. 임의의 핵산서열이 작동 가능하게 연결된 경우는 임의의 핵산서열이 다른 핵산서열과 기능적으로 관련성을 가지도록 위치해 있는 경우이다. 본 발명에 있어서, 임의의 전사 조절서열이 shRNA의 전사에 영향을 미치는 경우, 상기 전사 조절서열이 상기 shRNA와 작동 가능하게 연결되어 있다고 말한다.

하기 실시예에서는 Daxx의 shRNA, 이를 발현하는 재조합 발현 벡터 및 아데노바이러스를 제작하고, Daxx shRNA에 의한 Daxx의 발현 감소 효과를 확인하였다. 또한, shRNA에 의한 Daxx의 발현 감소가 아데노바이러스의 복제율을 증가시킨다는 것을 확인하였고, 암세포의 세포 주기에 영향을 미쳐, 전반적인 세포 독성 증가를 유도하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 또한, 상기 Daxx 발현을 저하시키는 핵산 분자를 코딩하는 염기 서열 및 TRAIL을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. Daxx siRNA 또는 shRNA를 발현하는 핵산 서열에 더하여, TRAIL을 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현 벡터를 아데노바이러스에 도입하는 경우, Daxx 발현 감소에 의한 아데노바이러스의 복제율 증가에 기인하여 TRAIL에 의한 세포 사멸 효과를 증진시킬 수 있을 뿐 아니라, Daxx 발현 감소에 의한 직접적인 세포 독성 효과를 기대할 수 있다.

한 구체예에서, TRAIL을 코딩하는 염기서열은 서열번호 15의 염기서열일 수 있다.

서열번호 15: atg gccatgatgg aggtccaggg gggacccagcctgggacaga cctgcgtgct gatcgtgatc ttcacagtgc tcctgcagtc tctctgtgtggctgtaactt acgtgtactt taccaacgag ctgaagcaga tgcaggacaa gtactccaaaagtggcattg cttgtttctt aaaagaagat gacagttatt gggaccccaa tgacgaagagagtatgaaca gcccctgctg gcaagtcaag tggcaactcc gtcagctcgt tagaaagatgattttgagaa cctctgagga aaccatttct acagttcaag aaaagcaaca aaatatttctcccctagtga gagaaagagg tcctcagaga gtagcagctc acataactgg gaccagaggaagaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaataaactcctggg aatcatcaag gagtgggcat tcattcctga gcaacttgca cttgaggaatggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt tactacatct attcccaaac atactttcgatttcaggagg aaataaaaga aaacacaaag aacgacaaac aaatggtcca atatatttacaaatacacaa gttatcctga ccctatattg ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttggtctaaagatg cagaatatgg actctattcc atctatcaag ggggaatatt tgagcttaaggaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca aatgagcact tgatagacat ggaccatgaagccagttttt tcggggcctt tttagttggc taa

본 발명은 또한, 상기의 Daxx 발현을 저하시키는 핵산 분자를 코딩하는 염기 서열, TRAIL을 코딩하는 염기서열 및 서열번호 11로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고 RNA 간섭에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하는 핵산 분자를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

서열번호 11: 5'-AGGATACAGCTGGAGTCAG-3'

한 구체예에서, RNA 간섭에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하는 핵산 분자를 발현하기 위하여, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 13으로 표시되는 탑 스트랜드와 서열번호 14로 표시되는 바텀 스트랜드를 포함하는 DNA를 포함할 수 있다.

한 구체예에서, RNA 간섭에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하는 핵산 분자는 서열번호 12로 표시되는 핵산서열로 이루어지는 siRNA일 수 있다.

서열번호 12: 5'-CUGACUCCAGCUGUAUCCU -3'

한 구체예에서, RNA 간섭에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하는 핵산 분자는 서열번호 13으로 표시되는 핵산서열 또는 서열번호 14로 표시되는 핵산서열로부터 유래된 mRNA 서열에 해당하는 핵산서열을 포함하는 shRNA일 수 있다.

서열번호 13: 5'-GATCCAGGATACAGCTGGAGTCAGTTCAAGAGACTGACTCCAGCTGTATCCTTTTTTTGGAAA-3'

서열번호 14: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAAGGATACAGCTGGAGTCAGTCTCTTGAACTGACTCCAGCTGTATCCT-3'

하기 실시예에서, Daxx shRNA, Bcl-xL shRNA 및 TRAIL 단백질을 동시에 발현하는 재조합 벡터를 제작하고, 이의 항종양 효과를 확인하였다. 그 결과, TRAIL과 Bcl-xL shRNA 과 Daxx shRNA 유전자가 동시에 발현되는 경우, 항종양 효과가 가장 우수함을 확인할 수 있었다. 즉 이는, Daxx shRNA, Bcl-xL shRNA 및 TRAIL을 코딩하는 염기서열의 도입에 의하여, 암을 효과적으로 치료할 수 있음을 의미한다.

따라서, 본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명의 항종양 조성물의 투여경로는 특별히 한정되지 않고, 경구 투여 또는 비경구 투여(예를 들면, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 점막 투여, 직장내 투여, 질내 투여, 환자에의 국소 투여, 피부투여 등)의 어느 하나의 투여경로에 의해 투여하여도 좋다. 경구 투여에 적당한 제제 형태로서는 고형 또는 액체의 형태가 가능하고, 비경구 투여의 적당한 제제 형태로서는 주사제, 점적제, 좌제, 외용제, 점안제, 점비제 등의 형태가 가능하다. 본 발명의 항종양 조성물은 그 제제형태에 의해, 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 함유하여도 좋다. 약학적으로 허용 가능한 첨가제의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 항산화제, 보존제, 안정화제, 등장화제, 착색제, 교미제, 희석제, 유화제, 현탁화제, 용매, 충진제, 증량제, 완충제, 송달 담체, 캐리어, 부형제 및/또는 약학적 어쥬번트 등을 들 수 있다.

경구용 고형제제 형태의 항종양 조성물로서는, 예를 들면, 유효성분에 부형제를 가하고, 아울러, 필요에 따라서, 결합제, 붕해제, 활택제, 착색제 또는 교미제 등의 제제용 첨가물을 가한 후, 통상의 방법에 따라, 정제, 과립제, 산제, 캡슐제로서 조제할 수 있다. 경구용 액체 제제형태의 항종양 조성물로서는, 유효성분에, 교미제, 안정화제, 또는 보존제 등의 제제용 첨가물 1종 또 는 2종 이상을 가하고, 통상의 방법에 따라, 내복액제, 시럽제, 엘릭실제 등으로서 조제할 수 있다.

본 발명의 항종양 조성물을 액체 제제로서 처방하기 위하여 사용되는 용매로서는, 수성 또는 비수성의 어느 것도 무방하다. 액체제제는 당해 분야에 주지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 예를 들면, 주사제는 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 멸균수 등의 용제에 용해시킨 후, 여과지 등으로 여과멸균하고, 이어서 멸균용기(예를 들면, 앰플 등)에 충진하여 조제할 수 있다. 이 주사제에는 필요에 따라, 관용의 약학적 캐리어를 포함하여도 무방하다.

또한, 비침습적인 카테터를 이용하는 투여방법을 사용하여도 좋다. 본 발명에서 사용할 수 있는 캐리어로서는, 중성, 완충화 생리식염수, 또는 혈청알부민을 포함하는 생리식염수 등을 들 수 있다.

본 발명의 항종양 조성물은 TRAIL에 의한 세포 사멸 효과를 향상시키고, 아데노바이러스의 복제율을 증가시키므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 암, 구체적으로 뇌암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 식도암, 췌장암, 방광암, 전립선암, 대장암, 결장암 및 자궁경부암 등의 예방 및 치료에 이용될 수 있다. 본 발명에서 용어 "치료"는 (i) 종양 세포 형성의 예방; (ii) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (iii) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터를 도입한 아데노바이러스를 제공한다. 본 발명에서 RNAi를 위한 핵산 분자를 전달하기에 유용한 바이러스 (또는 바이러스 벡터)로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노부속바이러스 등이 있으며, 종양에서와 같이 한시적인 발현 유도가 필요한 이유로 아데노바이러스가 바람직하다.

이하에서, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] Daxx shRNA 발현 아데노바이러스

[ 실시예 1-1] Daxx shRNA 제조 및 Daxx shRNA 발현 셔틀 벡터 제작

Daxx의 사일런싱(silencing)을 유도하기 위하여 센스 25 mer/안티센스 25 mer (4 개 염기를 가지는 루프 포함) 에 근거하여 shRNA및 이의 셔틀벡터를 제작하였다. shRNA Daxx의 특이성 검증을 위하여 스크램블드 shRNA를 가지는 셔틀벡터도 동시에 제작하였다.

인간 Daxx의 shRNA의 최소 10 nM에서 90% 이상 억제 효과가 있는 siRNA를 실시간 PCR을 통해 확보하였다. 실시간 RT-PCR을 위하여 제작한 프라이머는 인간 Daxx의 하향-조절을 유도하는 타겟을 발굴하기 위하여 포워드 프라이머(서열번호 1): 5'- GACGGACATTTCCTCTTCCA-3' 및 리버스 프라이머(서열번호 2): 5'-TCTCATGCACTGACCTTTGC- 3'로 다음의 5가지 종류의 후보 타겟을 스크리닝하였다:

서열번호 3(Daxx sh1): 5'-GCTACAAGCTGGAGAATGAGAAGCT-3'

서열번호 4(Daxx sh2): 5'-GAAGAGTTCCTTGAACTTTGTAAGA-3'

서열번호 5(Daxx sh3): 5'-GCTCTATGTCTACATCAATGAGCTC-3'

서열번호 6(Daxx sh4): 5'-GACTATGTGAGCTGAAAGACTGCTC-3'

서열번호 7(Daxx sh5): 5'-CATAGATGCTGAAAGCAATGGAGAA-3'

반응조건은 다음과 같았다:

1 단계: 역전사 (42 ℃ 5 분, 95℃ 10 초)

2 단계: PCR 반응 (95 ℃ 5 초, 60℃ 20 초) 40 사이클

3 단계: 60℃ → 95℃ 로 분리.

상기 표 1에서 Ct는 사이클 문턱값, 즉 포화에 도달되는데 걸리는 사이클 수를 의미하고, 작을수록 원래 mRNA 양이 많음을 의미한다. ΔCt는 Daxx용 ct에서 액틴용 ct를 뺀 값을 의미하고, ΔΔCt는 Daxx shRNA 처리 샘플의 Δct에서 대조군의 Daxx Δct를 뺀 값을 의미한다. 2-ΔΔCt는 2의 마이너스 지수 ΔΔct 값을, 발현 억제율 (Reduction)은 2-ΔΔct를 백분율로 표시한 것이다.

실험결과에 근거하여 발현 억제율이 90% 이상인 서열번호 3의 염기 서열로 표시되는 Daxx sh1을 표적서열로 선정하였다. 다음의 두 가닥 DNA 가닥을 제작하여 Daxx sh1의 shRNA를 제작하였다.

서열번호 9 (탑 스트랜드): 5'-gatcc GCTACAAGCTGGAGAATGAGAAGCT tctc AGCTTCTCATTCTCCAGCTTGTAGC tttttt a-3'

서열번호 10 (바텀 스트랜드): 5'-agctt aaaaaa GCTACAAGCTGGAGAATGAGAAGCT gaga AGCTTCTCATTCTCCAGCTTGTAGC g-3'

또한, 도 1에 도시한 바와 같이, 제작된 shRNA를 탑재한 pSP72△E3-H1-hshDaxx 셔틀벡터를 제작하였다.

[ 실시예 1-2] Daxx shRNA 발현 복제불능 아데노바이러스

복제가능 아데노바이러스에 shRNA를 제작하는 경우, shRNA에 의한 발현 억제 효과와 세포 라이시스(lysis) 효과가 혼재되어 있으므로, shRNA에 의한 억제 효과만을 명확하게 확인하기 위하여 복제불능 아데노바이러스를 제작하였다. 도 2에 복제불능 아데노바이러스 제작 과정을 모식도로 나타내었다. pSP72△E3-H1-hshDaxx 셔틀벡터에 Daxx shRNA를 서브클로닝한 후, 아데노바이러스 백본(backbone)인 dl324-IX와 상동재조합하였다(dl324-IX-△E3-H1-hshDaxx). 대장균 BJ5138 에 형질전환시킨 후, 상동재조합이 제대로 이루어졌는지를 확인하기 위하여, 콜로니 PCR을 수행하였다. PCR로 분별한 것을 다시 접종(inoculation)한 후, DNA를 추출하고, HindIII의 패턴을 확인하였다. 최종적으로 서열 분석하여 상동재조합 유무를 확인한 후, 확인된 플라스미드들을 PacI으로 절단한 뒤 293 세포주에 형질 전환하여 shRNA Daxx를 발현하는 복제불능 아데노바이러스를 제작하였다 (도 3). 이 아데노바이러스는 293 세포주에서 증식시켜 CsCl 변화도(gradient)로 농축하여 한계 희석배양법(limiting dilution) 또는 용균반검사(plaque assay)로 바이러스의 역가를 결정하였다. 최종 바이러스 역가(virus titer)는 한계 희석 적정법(limiting dilution titration)에 의해 6.32 × 10⁹pfu/ml 이었다.

Daxx shRNA에 의하여 Daxx의 발현이 억제되는지 확인하기 위하여, 제작된 Daxx shRNA 발현 복제불능 아데노바이러스를 Daxx가 많이 발현되는 것으로 알려진 HeLa 암세포에 감염시켜, Daxx의 발현 정도를 분석하였다. 그 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, Daxx shRNA 발현 아데노바이러스에 의하여 Daxx의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 1-3] Daxx shRNA 발현 종양 선택적 복제가능 아데노바이러스

pSP72△E3-H1-hshDaxx를 IX 유전자가 없는 dl324-BstBI와 1차로 상동재조합한 후 pCA4-3484 셔틀벡터와 2차 상동재조합시켜 dl324-3484-CMV promoter-△E3-H1-hshDaxx의 종양선택적 복제가능 아데노바이러스를 생성하였다.

실시예 1-2와 동일한 방법으로 얻은 최종 바이러스 역가(virus titer)는 5 x 10⁸ PFU/ml 이었다. 도 5의 왼쪽은 상동재조합 여부를 HindIII 패턴으로 확인한 것이고 오른쪽은 PacI 패턴을 최종 확인하여 판정한 것이다.

[ 실시예 1-4] Daxx shRNA 발현 종양 선택적 복제가능 아데노바이러스에서 , Daxx 발현 감소 및 바이러스 복제율 증가 확인

Daxx shRNA에 의하여 Daxx의 발현이 억제되는 것을 확인하고, Daxx 발현 억제가 바이러스 복제율에 미치는 영향을 분석하였다. 먼저 Daxx shRNA 발현 종양 선택적 복제가능 아데노바이러스에 의해 바이러스 유전자 발현패턴에 변화가 있는지를 Daxx, late gene products, E1A 및 액틴(actin)을 이용하여 확인하였다. 복제 불능 아데노바이러스(dl324-shNC)와 음성 shRNA를 발현하는 종양 선택적 복제가능 아데노바이러스(oncolytic-NC; scrambled siRNA을 발현하는 군) 및 Daxx shRNA를 발현하는 복제가능 아데노바이러스(oncolytic-shDaxx) 를 50 MOI로 DU145 암세포에 감염시키고, 감염 2일 후에 세포 용해물(lysate)을 웨스턴 블러팅으로 확인하였다. 그 결과, 도 6에 도시한 바와 같이, Daxx shRNA에 의하여 Daxx 발현 저하가 유도되며, 아데노바이러스E1A 발현이 증가함을 확인할 수 있었다 (왼쪽). 바이러스의 복제에 관여하는 유전자인 E1A의 증가는 바이러스의 복제증가를 의미한다.

또한, 동결-융해(freezing-thawing)한 상청액(supernatant)로부터 바이러스 적정(virus titration)을 실시하였다. 그 결과, Daxx 발현저하 시 Daxx shRNA를 발현하는 종양선택적 복제가능 아데노바이러스(Ad-3484-shDaxx)의 바이러스 복제율이 대조군(Ad-NC; siRNA 서열이 스크램블드(scrambled) 서열인 음성 대조군(negative control)을 발현하는 복제불능 아데노바이러스, Ad-3448-NC; 음성 대조군을 발현하는 종양선택적 복제가능 아데노바이러스)에 비하여 2.5배정도 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (오른쪽).

즉, 이는 Daxx shRNA에 의하여 재조합 아데노바이러스에서 Daxx의 발현이 억제되며, Daxx 발현 억제로 인하여 아데노바이러스의 바이러스 복제율이 향상됨을 의미한다.

[ 실시예 1-5] Daxx shRNA 에 의한 Daxx 발현 감소가 종양 세포에 미치는 영향 확인

Daxx shRNA에 의한 Daxx 발현 감소가 종양 세포에 직접적으로 미치는 영향을 알아보기 위하여, 웨스턴 블러팅을 수행하였다. DU145세포를 NC(negative control; scrambled siRNA을 발현하는 군)와 Daxx shRNA를 발현하는 복제불능 아데노바이러스를 50 MOI로 각각 감염시키고, 48시간 후 감염된 세포를 라이시스(lysis)시켜 PARP, p53, p21, 또는 Daxx 에 대한 항체를 사용하여 각각의 발현 수준을 측정하였다.

그 결과, 도 7에 도시한 바와 같이, Daxx 발현 억제 시 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 유도하는 p21이 축적되고 있음을 알 수 있었다.

또한, NC를 발현하는 복제불능 아데노바이러스, shDaxx를 발현하는 복제불능 아데노바이러스를 50 MOI로DU145 전립선암세포에 감염시간을 달리하여 감염시켰다. 아넥신 V(Annexin V) 와 PI 염색을 통하여 FACS 분석을 하였다. 분석한 결과, Daxx shRNA에 의한 Daxx 발현 감소는, TRAIL 처리한 경우, PARP 절단(cleavage)이 증가하는 세포 고사방식에 의한 세포사멸보다는 세포 괴사(necrosis)증가를 포함하는 전반적인 세포독성증가를 유도하는 것으로 확인되었다 (도 8).

이러한 결과는, Daxx 발현 억제가 세포 사멸 효과가 있음을 의미한다.

[ 실시예 2] Bcl - xL shRNA 에 의한 Bcl - xL 의 발현 억제가 TRAIL 에 의한 세포 사멸 효과에 미치는 영향

Bcl-xL shRNA에 의한 Bcl-xL 발현 억제가 TRAIL의 세포 사멸 효과에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Bcl-xL shRNA 발현 벡터를 제조하고, 전립선압세포인 DU-145에서 TRAIL에 의해 유도되는 세포 사멸 효과를 분석하였다.

서열번호 11(표적 서열): 5'-AGGATACAGCTGGAGTCAG-3'

서열번호 13(탑 스트랜드): 5'-GATCCAGGATACAGCTGGAGTCAGTTCAAGAGACTGACTCCAGCTGTATCCTTTTTTTGGAAA-3'

서열번호 14(바텀 스트랜드): 5'-AGCTTTTCCAAAAAAAGGATACAGCTGGAGTCAGTCTCTTGAACTGACTCCAGCTGTATCCT-3'

상기의 탑 스트랜드와 바텀 스트랜드의 Bcl-xL shRNA 용 스트랜드를 어닐링(annealing) 시킨 후 BamHI과 HindIII로 자른 pSP72?E3-U6, E3 셔틀 벡터에 삽입시켰다. 이렇게 제조된 아데노바이러스 셔틀 벡터 pSP72 E3-U6-sh-Bcl-xL을 Xmn I 으로 자르고, 아데노바이러스 벡터인 dl324-IX 을 Spe I 으로 잘라 선형화한 후, 이 두 개의 선형화된 벡터들을 E. coli BJ5183 에 형질전환(transformation)하여 상동재조합 하였다. 그 결과 상동재조합된 l324-IX-E3-U6-NC 또는 dl324-IX-E3-U6-shBcl-xL을 Pac I으로 자른 후, HEK-293 세포에 트랜스펙션(transfection) 하여 복제불능 아데노바이러스를 생성하였다.

그리고 나서, 전립선암세포인 DU-145세포만 처리한 군, 상기 DU-145 세포에 Dl324-IX-△E3-U6-NC을 처리한 군 및 상기 DU-145 세포에 Dl324-IX-△E3-U6-hshBcl-xL을 처리한 군에 TRAIL 처리 유무에 따른 PARP, Bcl-xL 및 액틴의 발현 정도를 분석하였다. 그 결과, 도 9에 도시한 바와 같이, Bcl-xL shRNA 발현하는 복제불능 아데노바이러스 감염에 의해 Bcl-xL의 발현이 감소되며, TRAIL에 의해 유도되는 세포 사멸 효과 (PARP cleavage)가 증가함을 알 수 있었다.

또한, 이를 현미경으로 관찰한 결과, 도 10에 도시한 바와 같이, 흑색종 세포인 A375(왼쪽) 및 DU-145 (오른쪽)에서 Bcl-xL shRNA 발현하는 복제불능 아데노바이러스 감염에 의해 TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸이 증가함을 확인하였다.

이는, Bcl-xL shRNA에 의한 Bcl-xL 발현 감소에 의하여, TRAIL에 의해 유도되는 세포 사멸효과가 촉진됨을 의미한다.

[ 실시예 3] Daxx shRNA 및 Bcl - xL shRNA 발현 재조합 벡터

Daxx shRNA 및 Bcl-xL shRNA를 동시에 발현하는 재조합 벡터를 제작하기 위하여, 도 11에 도시한 바와 같이, 이미 제작한 pSP72△E3/H1-shTGFβ2를 BamHI과 HindIII로 잘라 shTGFβ2를 제거하고 어닐링(annealing)된 shDaxx를 삽입하였다.

도 12에 도시한 바와 같이, Bcl shRNA 서열을 생성하기 위한 상기의 DNA 서열을 셔틀벡터에 서브클로닝하여 Bcl shRNA 벡터를 제작하였다 (J. Biol. Chem. 282: 319, 2007).

HindIII 및 블런팅(blunting) 후, KpnI를 처리하여 SV40 poly A 부위를 제거하였다. 그 후, pSP72△E3/H1-human shDaxx 에서 SphI 블런팅 후, KpnI 처리하여 H1 프로모터-shDaxx-SV40 poly A를 빼내어 HindIII (blunt)/KpnI 처리한 pSP72△E3/shBcl-xL와 연결하였다. 그 결과 Daxx shRNA 및 Bcl-xL shRNA가 함께 도입된 pSP72△E3/U6-shBcl-xL+H1-shDaxx 의 셔틀벡터를 제작하였다.

[ 실시예 4] TRAIL 및 Bcl - xL shRNA 발현 아데노바이러스

Bcl-xL shRNA에 의한 Bcl-xL 발현 억제가 TRAIL 유도된 세포 사멸효과에 미치는 영향을 알아보고자, TRAIL 및 Bcl-xL shRNA를 동시에 발현하는 복제불능 아데노바이러스를 제작하였다.

TRAIL은 하기 서열번호 15의 염기 서열로 표시된다.

IX 유전자가 없는 아데노바이러스 벡터인 dl324-BstBI-E3-U6-hshBcl-xL를 Bsp1191으로 선형화하였다. 셔틀벡터인pCA14-Full TRAIL을 Fsp I로 선형화한 후, 이 두 벡터를 E. coli BJ5183 세포에 형질전환(transformation)하여 상동재조합을 유도하였다.

TRAIL 과 Bcl-xL shRNA 를 동시에 발현하는 종양선택적 복제가능 아데노바이러스를 생성하기 위하여, dl324-BstB I-E3-U6-hshBcl-xL을 Bsp1191으로 선형화하고, pCA14-3484-E1B55-TRAIL 을 Drd I으로 선형화하였다.

제작된 아데노바이러스에 의한 세포 사멸 효과를 분석한 결과, 도 13에 도시한 바와 같이, DU145 세포를 대조군 바이러스로dl324-IX-E3-U6-NC (Ad-NC) 또는 TRAIL만을 발현하는 dl324-IX-TRAIL-E3-U6-NC (Ad-TRAIL) 또는 TRAIL과 Bcl-xL shRNA 를 동시에 발현하는dl324-IX-TRAI E3-U6-shBcl-xL (Ad-TRAIL-shBcl-xL), 각각 50 MOI로 감염시킨 후 48시간 후에 세포사멸에 의한 형태적 변화를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, TRAIL 단독 처리군에 비하여, TRAIL과 Bcl-xL shRNA를 동시에 발현하는 복제불능 아데노바이러스에 의한 세포 사멸 효과가 우수함을 알 수 있었다. 이는, Bcl-xL shRNA에 의한 Bcl-xL 감소가 TRAIL에 의한 세포 사멸 효과를 증대시킴을 의미한다.

[ 실시예 5] Daxx shRNA , Bcl - xL shRNA 및 TRAIL 발현 아데노바이러스

I) pCA14-CMV-3484-ΔE1B55 셔틀벡터 제작

종양 선택적 복제 가능한 아데노바이러스를 만들기에 앞서 아데노바이러스의 E1A부분에 여러 유전자를 넣을 수 있는 셔틀벡터를 제작하고자 pBSKII 플라스미드[Stratagene, USA]에E1A와 E1B55kDa 유전자를 포함하며 다양한 효소 부위(Enzyme site)를 포함하는 pBSKⅡ-3484 합성 유전자를 제작하였다(도 14a). 상동재조합 확인을 용이하게 하기 위하여, 합성된 유전자를 pCA14 셔틀벡터에 도입하기 위한 형태로 바꾸기 위하여 pBSKⅡ-3484를 PCR하여 FspⅠ으로 제한효소를 처리하였다. 그 후, 블런팅(blunting) 효소로 블런트 엔드(blunt end)를 만들고 다시 BamHⅠ으로 처리하였다. pCA14[Microbix BiosystemsInc, Canada]는 SspⅠ으로 제한효소를 이용하여 자른 후 블런팅 효소를 이용하여 블런트 엔드를 만든 후, BglⅡ를 처리하여 동일전달제한효소(Isoschizomer)인 BamHⅠ과 BglⅡ 그리고 양끝의 블런트 엔드를 통해 합성된 유전자를 삽입하여 셔틀 벡터 pCA14-3484를 제작하였다(도 14b). 그 후 CMV 프로모터 유전자를 KpnⅠ과 XhoⅠ으로 pCA14-3484에 삽입하여 pCA14-CMV-3484를 제작하였다(도 14c). 그리고 나서, pCA14-CMV-3484에서 EcoRI과 SalI 제한효소의 의해 E1B55kDa부분을 자르고 블런팅(blunting)한 후 다시 연결(ligation)된 pCA14-CMV-3484-ΔE1B55를 얻었다(도 14d).

II) dl324-BstB1-ΔE3-U6-Bcl-xL-H1-shDaxx 제작

실시예 2-1의 pSP72△E3/U6-shBcl-xL+H1-shDaxx 셔틀벡터를 Spe I으로 자르고 IX 유전자가 없는 dl324-BstBⅠ는 XmnI으로 자른 후 BJ5183 박테리아에 동시에 형질전환시켜 상동재조합을 유도하여, dl324-BstB1-ΔE3-U6-Bcl-xL-H1-shDaxx를 제작하였다. 상동재조합 여부를 확인하기 위하여, HindIII 패턴을 확인하였다 (도 15).

III) dl324-BstB1-ΔE3-U6-Bcl-xL-H1-shDaxx + pCA14-3484-CMV-ΔE1B-E1R--TRAIL 상동재조합

1) 복제불능 pCA14--ΔE1B-E1R-CMV-TRAIL제작

EcoRI-SmaI 으로 자른 pEGFP-TRAIL (Addgene) 결과 얻어진 TRAIL을 코딩하는 염기서열을 HindIII로 절단한 후, 블런팅하고, EcoRI으로 다시 자른 pCA14에 서브클로닝하였다.

상동재조합이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 Hind III패턴변화 및 Pac I 절단후 2 kb 정도의 절단 DNA여부를 확인하는 방법으로 수행하였다. 그 결과, 도 16에 도시한 바와 같이, 2번 샘플 DNA가 제대로 상동재조합이 된 것을 알 수 있었다.

또한, 상기 TRAIL 발현하는 복제불능 아데노바이러스가 TRAIL를 잘 발현하는지 확인하기 위하여, 아데노바이러스를 DU-145암세포에 감염시킨 후, 배지 내로 방출되는 TRAIL 단백질을 ELISA로 검출하였다. 그 결과, 도 17에 도시한 바와 같이, 아데노바이러스에 삽입된 TRAIL을 코딩하는 염기서열에 의하여 TRAIL 단백질이 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한, 도 18에 도시한 바와 같이, 현미경 관찰 결과에서도 동일한 결과를 확인할 수 있었다.

2) 종양선택적 복제가능 pCA14-3484-CMV-ΔE1B-E1R-TRAIL 제작

TRAIL을 코딩하는 염기서열만을 PCR로 증폭하여 삽입하였다. 다음의 PCR 프라이머를 사용하였다:

서열번호 16 (센스 프라이머): 5'-ccg caa ttg cta att ccc tgg cat tat gcc c-3'(5' 말단에 Mfe I 가짐)

서열번호 17 (안티센스 프라이머): 5'-gga aga tct tcg atg cta gac g-3' (5' 말단에 Bgl II 가짐)

증폭한 후(PCR 반응 조건; 95 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 72℃ 1 분 - 30 사이클, 72℃ 5 분), Mfe I-Bgl II 으로 절단후 EcoR I-Bgl II로 절단한 후에 pCA14-3484-CMV-ΔE1B55KDa를 연결(ligation) 시켜 복제불능 pCA14--ΔE1B-E1R-CMV-TRAIL를 얻었다.

3) TRAIL발현을 유도하고 Bcl-xL 및 Daxx발현을 억제하는 shRNA를 포함하는 종양선택적 아데노바이러스 상동재조합

도 19에 도시한 바와 같이, 종양선택적 복제가능 아데노바이러스를 상동재조합하였다. 상동재조합이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 Hind III 패턴변화 및 Pac I 절단후 2 kb 정도의 절단 DNA여부를 확인하는 방법으로 수행하였다. 그 결과, 도 20에 도시한 바와 같이, 1, 2, 3,10, 12,13, 14, 15, 16, 20, 22번 샘플 DNA가 제대로 상동재조합이 된 것을 알 수 있었다.

도 21은 상동재조합된 바이러스 게놈 DNA(viral genomic DNA)안에 shBclxL과 shDaxx 핵산서열이 삽입되어 있음을 보여준다.

[ 실시예 6] Daxx shRNA , Bcl - xL shRNA 및 TRAIL 발현 아데노바이러스에 의한 항종양 효과

Daxx shRNA, Bcl-xL shRNA 및 TRAIL을 동시에 발현하는 아데노바이러스의 항종양 효과를 확인하기 위하여, 아데노바이러스를 마우스에 주입한 후, 종양 크기를 분석하였다. BALB/c Nude 마우스에 1 x 10⁶세포/100 μl 의 DU-145 전립선 암세포를 복벽에 주입하고 종양크기가 25 mm³ 에 이르렀을 때 이틀 간격으로 3번 (1x10⁹ pfu/100 μl), PBS 처리군, E1용 셔틀 벡터 또는 E3용 셔틀 벡터에 어떠한 삽입도 포함되지 않은 대조군 아데노바이러스(oncolytic control), TRAIL을 코딩하는 염기서열을 발현하는 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스(oncolytic TRAIL), TRAIL과 Bcl-xL shRNA 를 발현하는 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스(oncolytic TRAIL-shBclxl) 및 TRAIL과 Bcl-xL shRNA 과 Daxx shRNA 를 동시에 발현하는 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스 (onclytic-TRAIL-shBclxl-shDaxx)를 종양내 주입(intratumoral injection)으로 감염시켰다. 각 실험군 당 마우스를 6마리씩을 사용하였다.

그 결과, 도 22에 도시한 바와 같이, 항종양 효과는 TRAIL과 Bcl-xL shRNA 과 Daxx shRNA 유전자가 동시에 발현되는 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스 에서 가장 우수하였으며, 그 다음으로는 TRAIL과 Bcl-xL shRNA 유전자가 발현되는 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스에서 우수하였다.

<110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> An expression vector comprising nucleic acid downregulating Daxx, TRAIL gene and nucleic acid downregulating Bcl-xL <130> P14U18C0222 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for targetting of Daxx shRNA <400> 1 gacggacatt tcctcttcca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for targetting of Daxx shRNA <400> 2 tctcatgcac tgacctttgc 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate target sequence 1 of Daxx silencing (Daxx sh1) <400> 3 gctacaagct ggagaatgag aagct 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate target sequence 2 of Daxx silencing (Daxx sh2) <400> 4 gaagagttcc ttgaactttg taaga 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate target sequence 3 of Daxx silencing (Daxx sh3) <400> 5 gctctatgtc tacatcaatg agctc 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate target sequence 4 of Daxx silencing (Daxx sh4) <400> 6 gactatgtga gctgaaagac tgctc 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate target sequence 5 of Daxx silencing (Daxx sh5) <400> 7 catagatgct gaaagcaatg gagaa 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence of Daxx siRNA <400> 8 agcuucucau ucuccagcuu guagc 25 <210> 9 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand for Daxx shRNA <400> 9 gatccgctac aagctggaga atgagaagct tctcagcttc tcattctcca gcttgtagct 60 ttttt 65 <210> 10 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand for Daxx shRNA <400> 10 agcttaaaaa agctacaagc tggagaatga gaagctgaga agcttctcat tctccagctt 60 gtagcg 66 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence of Bcl-xL silencing <400> 11 tctcatgcac tgacctttgc 20 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence of Bcl-xL siRNA <400> 12 aggatacagc tggagtcag 19 <210> 13 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand for Bcl-xL shRNA <400> 13 gatccaggat acagctggag tcagttcaag agactgactc cagctgtatc ctttttttgg 60 aaa 63 <210> 14 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand for Bcl-xL shRNA <400> 14 agcttttcca aaaaaaggat acagctggag tcagtctctt gaactgactc cagctgtatc 60 ct 62 <210> 15 <211> 846 <212> DNA <213> human TRAIL <400> 15 atggccatga tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 60 atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac 120 gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa 180 gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc 240 aagtggcaac tccgtcagct cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt 300 tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtcctcag 360 agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac 420 tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg 480 cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg 540 ttttactaca tctattccca aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca 600 aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata 660 ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata tggactctat 720 tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta 780 acaaatgagc acttgataga catggaccat gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt 840 ggctaa 846 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for TRAIL <400> 16 ccgcaattgc taattccctg gcattatgcc c 31 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for TRAIL <400> 17 ggaagatctt cgatgctaga cg 22

Claims

서열번호 3으로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고, RNA 간섭에 의하여 Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 핵산 분자는
서열번호 8로 표시되는 핵산서열로 이루어지는 siRNA인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 핵산 분자는
서열번호 9로 표시되는 핵산서열 또는 서열번호 10으로 표시되는 핵산서열로부터 유래된 mRNA 서열에 해당하는 핵산서열을 포함하는 shRNA인 핵산 분자.
제 1항의 핵산 분자를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제4항에 있어서, 서열번호 9로 표시되는 탑 스트랜드와 서열번호 10으로 표시되는 바텀 스트랜드를 포함하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제4항에 있어서,
TRAIL을 코딩하는 염기서열을 추가로 포함하는 재조합 발현 벡터.
제6항에 있어서,
TRAIL을 코딩하는 염기서열은 서열번호 15로 표시되는 염기서열인 재조합 발현 벡터.
제6항에 있어서,
서열번호 11로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고, RNA 간섭에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하는 핵산 분자를 코딩하는 염기 서열을 추가로 포함하는 재조합 발현 벡터.
제8항에 있어서, 핵산 분자는
서열번호 12로 표시되는 핵산서열로 이루어지는 siRNA인 재조합 발현 벡터.
제8항에 있어서, 핵산 분자는
서열번호 13으로 표시되는 핵산서열 또는 서열번호 14로 표시되는 핵산서열로부터 유래된 mRNA 서열에 해당하는 핵산서열을 포함하는 shRNA인 재조합 발현 벡터.
제8항에 있어서, 서열번호 13으로 표시되는 탑 스트랜드와 서열번호 14로 표시되는 바텀 스트랜드를 포함하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제8항의 재조합 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 항종양 조성물.
제4항, 제6항 또는 제8항의 재조합 발현 벡터를 도입한 아데노바이러스.
서열번호 3으로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고, RNA 간섭에 의하여 Daxx의 발현을 억제하는 핵산 분자; TRAIL을 코딩하는 염기서열; 및 서열번호 11로 표시되는 핵산서열을 표적서열로 하고, RNA 간섭에 의하여 Bcl-xL의 발현을 억제하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 항종양 조성물.